CN103509117B - 抗人her2和人igf-ir的双特异性抗体及其制备方法和用途 - Google Patents

抗人her2和人igf-ir的双特异性抗体及其制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种抗人HER2和人IGF-IR的双特异性抗体,包含特异性结合HER2的第一抗原结合域和特异性结合IGF-IR的第二抗原结合域,第一和第二抗原结合域都由一对抗体重链可变结构域(VH)和抗体轻链可变结构域(VL)组成;第一抗原结合域为可与HER2特异性结合的抗体可变区结构域;第二抗原结合域为可与IGF-IR特异性结合的抗体可变区结构域。制备方法主要包括:合成编码所述抗体的cDNA序列;将cDNA序列插入工具载体,构建表达载体;将表达载体在宿主细胞中表达和分离纯化表达的双特异性抗体。本发明用于制备治疗人类癌症尤其是人类乳腺癌的药品。

Description

抗人HER2和人IGF-IR的双特异性抗体及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及生物制药技术领域,具体涉及一种抗人类表皮生长因子受体2(HER2)和人胰岛素样生长因子-1受体(IGF-IR或IFG-1R)的双特异性抗体及其制备方法和用途。
背景技术
细胞表皮生长因子(epidermalgrowthfactor,EGF)酪氨酸激酶受体家族共有四种受体,包括erbB1(EGFR或HER1)、erbB2(HER2/neu)、erbB3(HER3)和erbB4(HER4)。这类受体是一种跨膜受体,其细胞外片段与配体结合后(除HER2以外)形成同源性二聚体或异源性二聚体而被激活,其细胞内片段具有酪氨酸激酶活性。细胞外片段有四个区域,I区和III区与配体结合,而富含半胱氨酸的II区与IV区参与受体的二聚化(HynesNE&LaneHA.NatRevCancer.2005;5(5):341-54.)。HER2的表达状况直接影响上皮细胞的增殖、分化和存活。已有的临床研究发现在正常乳腺组织中HER2呈低表达,但是约有20%~30%人类乳腺癌患者伴有HER2的过度表达。过度表达的HER2向细胞核发送很强的生长刺激信号,肿瘤中HER2越多,肿瘤的侵袭性越强。
赫赛汀(Herceptin,trastuzumab)是美国Genentech公司和UCLA联合研发的HER2蛋白的人源化单克隆抗体,1998年9月FDA批准上市用于治疗HER2阳性的转移性乳腺癌。Herceptin能结合到HER2/neu受体的细胞外片段参与受体二聚化的第四区域,它通过与HER2特异性结合,阻断受体激活后的细胞信号传递,进而抑制依赖HER2过度扩增的肿瘤细胞生长甚至使肿瘤消退(Nahtaetal.CurrPharmacogenomicsPersonMed.2009;7:263-274.)。Herceptin的早期临床研究显示,它能把晚期(转移性)乳腺癌的总体存活率从20.3个月增加到25.1个月。可是,虽然Herceptin对HER2有很大的亲和性,而且Herceptin毒性小可以大剂量使用,但是60-70%的HER2阳性病人对单一Herceptin不起作用(Luetal.JNatlCancerInst.2001;93(24):1852-7.;Vogeletal.JClinOncol.2002;20(3):719-26.)。事实上,几乎所有的乳腺癌病人在接受Herceptin治疗一年内都会对Herceptin产生耐药性,使得肿瘤极具侵袭性而且更可能在全身扩散(BaselgaJ.EurJCancer.2001;37(Suppll):18-24.)。耐药的机理有多种,包括磷酸酶和张力蛋白同系物PTEN(phosphataseandtensionhomolog)失活,或者存在变异的HER2(p95HER2,没有细胞外区域),或者通过激活其他酪氨酸激酶受体,例如IGF-IR。
胰岛素样生长因子(insulin-likegrowthfactor-I,IGF-I或IFG-1)信号途径不仅在乳腺的正常发育中起到一定作用,也能调节乳腺癌的发生、存活、发展和转移以及药物耐受性(Carbonietal.CancerRes.2005;65(9):3781-7;Dunnetal.CancerRes.1998;58(15):3353-61;Nahtaetal.CancerRes.2005;65(23):11118-28;Luetal.JNatlCancerInst.2001;93(24):1852-7.)。胰岛素样生长因子受体(IGF-IR或IFG-1R)也是一种酪氨酸激酶受体,是一种由两条多肽链组成的四聚体受体,每条肽链由细胞外的α-亚基和跨膜的β-亚基组成,胞外的α-亚基与配体结合,而胞内部分的的β-亚基具有酪氨酸激酶功能,α-亚基之间以及α-亚基与β-亚基之间有二硫键连接(Ullrichetal.EMBOJ.1986;5(10):2503-12.)。与其配体IGF-I结合后,IGF-IR引起胰岛素受体底物1(IRS-1)磷酸化,从而介导激活多种下游的信号网络,包括促进细胞分裂的信号通路(Ras/Raf/MAPK)和抗细胞凋亡/生存通路(PI3K-Akt/mTOR)。这些信号通路的激活具有促进细胞分裂、分化和防止细胞凋亡的作用,还能促进血管新生和肿瘤细胞的侵润,在多种癌症如乳腺癌、前列腺癌和肺癌的发病机理过程中起着很重要的作用。同时IGF-IR的抗细胞凋亡作用使得癌症细胞能抵抗化疗药物或者放疗的杀肿瘤细胞作用。在乳腺癌方面,IGF-IR的高表达发生在大约40%的病人中;当用了EGFR抑制剂如erlotinib或者HER2抗体Herceptin来抑制EGFR/HER2的信号通路以后,IGF-IR参与形成异源性二聚体,允许EGFR/HER2信号通路在存在EGFR/HER2抑制剂的情况下重新被激活,从而使肿瘤细胞对EGFR/HER2抑制剂产生抗药,这个过程被称之为HER和IGF-IR之间的串话(cross-talk)(Jin&Esteva.JMammaryGlandBiolNeoplasia.2008;13(4):485-98.)。Lu等利用两种人乳腺癌细胞系MCF-7/HER2-18和SKBR3,证明了IGF-IR在Herceptin耐药性中的重要作用。在共同过度表达HER2/neu受体和IGF-IR的MCF-7/HER2-18细胞上,Herceptin只有在IGF-IR信号传导被抑制的情况下才有明显的抑制细胞生长作用。而在主要过度表达HER2/neu受体但很少表达IGF-IR的SKBR3细胞上,Herceptin的抑制细胞生长作用非常明显,且不受IGF-I浓度的影响。当SKBR3细胞的基因被改变而高表达IGF-IR,并且与IGF-I一起培养时,Herceptin则失去了抑制细胞生长的作用。培养液中加入IGF-结合蛋白-3后,Herceptin又恢复了抑制作用(Luetal.JNatlCancerInst.2001;93(24):1852-7.)。因此IGF信号途径的抑制已逐渐成为乳腺癌治疗的一个重要靶点,这些药物可以直接用来治疗乳腺癌,也可以帮助逆转Herceptin的耐药性,如辉瑞研发的一种抗IGF-IR的单克隆抗体Figitumumab(也叫CP-751871),被开发用于治疗多种癌症例如肾上腺皮质癌和非小细胞型肺癌(NSCLC)(GualbertoA&KarpDD.Clinicallungcancer2009;10(4):273-80.),和Amgen研发的IGF-IR单克隆抗体ganitumab(AMG479)(Tapetal.JournalofClinicalOncology,2012;30:1849-1856.),目前也在临床试验中与Herceptin合用治疗HER2阳性的转移性乳腺癌;ImClone研发的Cixutumumab(IMC-A12)与lapatinib在临床试验中联合使用用于治疗转移性乳腺癌;Merck研发的Dalotuzumab(MK-0646,h7C10)也是一个IGF-IR单克隆抗体,也在不同的临床试验中。所以可以用抗IGF-IR的抗体和Herceptin结合使用来克服Herceptin的耐药性。
同时靶向IGF-IR和HER2是一种很有希望的改善抗HER2药物用于治疗HER2阳性的晚期乳腺癌疗效的策略。(1)IGF-IR能与HER2相互作用并激活HER2,IGF-IR信号系统的增强与Herceptin的耐药性有关(Luetal.JNatlCancerInst.2001;93(24):1852-7.)。(2)在耐受trastuzumab和gefitinib的乳腺癌细胞上有IGF-IR和HER2的异源性二聚体的存在(Jonesetal.EndocrRelatCancer.2004;11(4):793-814.;Nahtaetal.CancerRes.2005;65(23):11118-28.)。(3)抗IGF-IR药物如TKI(AG538)能恢复耐受trastuzumab细胞对trastuzumab的敏感性,并减少活力(Nahtaetal.CancerRes.2005;65(23):11118-28.)。(4)IGF-结合蛋白3(IGFBP3)通过阻断IGF-I介导的IGF-IR的激活,而抑制耐受trastuzumab的细胞的生长(Luetal.JNatlCancerInst.2001;93(24):1852-7.),IGFBP3也能恢复耐受trastuzumab的细胞对trastuzumab的敏感性(Jeromeetal.CancerRes.2006;66(14):7245-52.)。(5)联合使用trastuzumab和转染显性阴性IGF-IR能协同抑制MCF7/HER18细胞的生长,这种细胞同时高表达HER2和IGF-IR(Camirandetal.MedSciMonit.2002;8(12):BR521-6.)。(6)抗IGF-IR单克隆抗体alpha-IR3能破坏HER2/IGF-IR的相互作用,恢复耐受trastuzumab的细胞对trastuzumab的敏感性(Nahtaetal.CancerRes.2005;65(23):11118-28.)。(7)去甲二氢化愈创木酸(Nordihydroguaiareticacid,NDGA),一种从石炭酸灌木中提取的强抗氧化剂,是一种IGF-IR和HER2的双重抑制剂(Youngrenetal.BreastCancerResTreat.2005;94(1):37-46.),NDGA能引起MCF-7/neo细胞和高表达HER2的MCF-7/HER2-18细胞的细胞周期停止,生长抑制和凋亡(Zavodovskayaetal.JCellBiochem.2008;103(2):624-35.),也能引起对trastuzumab敏感的细胞和耐受trastuzumab的细胞的凋亡,同时使用NDGA和trastuzumab恢复耐受trastuzumab的细胞对trastuzumab的敏感性(Roweetal.MolCancerTher.2008;7(7):1900-8.)。
所以把IGF-IR的单克隆抗体和HER2单克隆抗体Herceptin结合,进行双抗体结合治疗,可以有效降低Herceptin耐药性,显著提高Herceptin对乳腺癌的疗效。新近(2012年6月)FDA批准的由罗氏制药公司开发的帕妥珠单抗(Perjeta)与曲妥珠单抗合用用于治疗HER2阳性转移性乳腺癌,就是一个双抗体结合治疗成功的例子。但是双抗体结合治疗将会价格昂贵,也受限于两种抗体的供应和更为复杂、漫长和和代价大的审批过程,难以在临床上普及应用。
发明内容
本发明的目的是:克服现有技术的不足,提供一种抗人HER2和人IGF-IR的双特异性抗体,并提供其制备方法,以用于制备治疗人类癌症特别是人类治疗乳腺癌的药品。抗HER2和IGF-IR的双特异性抗体国内外未见报道。
本发明的技术方案是:本发明的抗HER2和IGF-IR的双特异性抗体,包含特异性结合HER2的第一抗原结合域和特异性结合IGF-IR的第二抗原结合域,其结构特点是:
上述第一抗原结合域和第二抗原结合域都由一对抗体重链可变结构域VH和抗体轻链可变结构域VL组成;
上述的第一抗原结合域为可与HER2特异性结合的抗体可变区结构域;第二抗原结合域为可与IGF-IR特异性结合的抗体可变区结构域。
进一步的方案是:上述的第一抗原结合域为序列SEQIDNO:1和SEQIDNO:2中的任一序列。
进一步的方案是:上述的第二抗原结合域为序列SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9以及SEQIDNO:10中的任一序列。
进一步的方案是:上述的第一抗原结合域的序列为已经公开的其它任何可与HER2特异性结合的抗体的可变区结构域的序列,如CN200680029687.5中列出的序列;第二抗原结合域的序列为已经公开的其它任何可与IGF-IR特异性结合的抗体的可变区结构域的序列。
一种上述的抗HER2和IGF-IR的双特异性抗体的制备方法,包括以下步骤:
①合成编码上述抗体的cDNA序列;
②将cDNA序列插入工具载体,构建可在宿主细胞中表达的表达载体;
③将上述的表达载体在宿主细胞中表达;
④分离纯化表达的双特异性抗体。
进一步的方案是:上述的步骤②中的工具载体为市售商业化载体或自行构建的可供表达的载体。
进一步的方案是:上述的步骤②和步骤③中的宿主细胞为如大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞、植物细胞、昆虫细胞的常见表达宿主。
一种上述的抗HER2和IGF-IR的双特异性抗体,用于制备治疗人类癌症尤其是人类乳腺癌的药品。
本发明的积极效果:本发明与单一的抗HER2抗体或者抗IGF-IR抗体相比有以下优点:本发明将特异性识别HER2和IGF-IR的抗体可变区域构建在同一抗体分子中,使其具有能同时特异性结合两个抗原的特性,该双特异性抗体能同时阻断这两种抗原介导的细胞信号传递,抑制依赖HER2的肿瘤细胞生长,使肿瘤消退,同时消除IGF-I引发的耐药性,有效降低乳腺癌的侵袭性和全身扩散;本发明的抗HER2和IGF-IR的双特异性抗体,可用于制备治疗人类癌症特别是治疗人类乳腺癌的药品。
附图说明
图1-1至图1-8为本发明的scFv结构类型的特异性识别HER2和IGF-IR的双特异性抗体的结构示意图,图中抗原1为HER2,相应地抗原2则为IGF-IR,其中:
图1-1:连接方式:VL1-接头-VH1-接头-VL2-接头-VH2;
图1-2:连接方式:VH1-接头-VL1-接头-VH2-接头-VL2;
图1-3:连接方式:VL2-接头-VH2-接头-VL1-接头-VH1;
图1-4:连接方式:VH2-接头-VL2-接头-VH1-接头-VL1;
图1-5:连接方式:VL1-接头-VH2-接头-VL2-接头-VH1;
图1-6:连接方式:VH1-接头-VL2-接头-VH2-接头-VL1;
图1-7:连接方式:VL2-接头-VH1-接头-VL1-接头-VH2;
图1-8:连接方式:VH2-接头-VL1-接头-VH1-接头-VL2;
图2-1至图2-4为本发明的scFab结构类型的特异性识别HER2和IGF-IR的双特异性抗体的结构示意图,图中抗原1为HER2,相应地抗原2则为IGF-IR,其中:
图2-1:[VL-CL-接头-VH-CH1]抗原1-接头-[VL-CL-接头-VH-CH1]抗原2;
图2-2:[VH-CHI-接头-VL-CL]抗原1-接头-[VH-CH1-接头-VL-CL]抗原2;
图2-3:[VL-CL-接头-VH-CH1]抗原2-接头-[VL-CL-接头-VH-CH1]抗原1;
图2-4:[VH-CHI-接头-VL-CL]抗原2-接头-[VH-CH1-接头-VL-CL]抗原1;
图3-1至图3-4为本发明的具全长抗体并含有额外的scFv的四价的特异性识别HER2和IGF-IR的双特异性抗体的结构示意图,图中抗原1为HER2,相应地抗原2则为IGF-IR,其中:
图3-1:结合IGF-IR的scFv连接到全长抗HER2抗体的轻链C端;
图3-2:结合IGF-IR的scFv连接到全长抗HER2抗体的Fc的C端;
图3-3:结合HER2的scFv连接到全长抗IGF-IR抗体的轻链的C端;
图3-4:结合HER2的scFv连接到全长抗IGF-IR抗体的Fc的C端;
图4-1至图4-4为本发明的具全长抗体并含有额外的scFab的四价的特异性识别HER2和IGF-IR的双特异性抗体的结构示意图,图中抗原1为HER2,相应地抗原2则为IGF-IR,其中:
图4-1:结合IGF-IR的scFab连接到全长抗HER2抗体的轻链的C端;
图4-2:结合IGF-IR的scFab连接到全长抗HER2抗体的Fc的C端;
图4-3:结合HER2的scFab连接到全长抗IGF-IR抗体的轻链的C端;
图4-4:结合HER2的scFab连接到全长抗IGF-IR抗体的Fc的C端。
氨基酸序列描述
SEQIDNO:1针对HER2的抗体结合可变区域1
SEQIDNO:2针对HER2的抗体结合可变区域2
SEQIDNO:3针对IGF-IR的抗体结合可变区域1
SEQIDNO:4针对IGF-IR的抗体结合可变区域2
SEQIDNO:5针对IGF-IR的抗体结合可变区域3
SEQIDNO:6针对IGF-IR的抗体结合可变区域4
SEQIDNO:7针对IGF-IR的抗体结合可变区域5
SEQIDNO:8针对IGF-IR的抗体结合可变区域6
SEQIDNO:9针对IGF-IR的抗体结合可变区域7
SEQIDNO:10针对IGF-IR的抗体结合可变区域8
SEQIDNO:11针对IGF-IR的抗体结合可变区域9
SEQIDNO:12针对IGF-IR的抗体结合可变区域10。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的描述。
(实施例1)
见图1-1至图4-4,本实施例的抗人HER2和人IGF-IR的双特异性抗体,至少包含结合人HER2的第一抗原结合域和结合人IGF-IR的第二抗原结合域,前述每个抗原结合域又包含一对功能性的抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域。
前述针对人HER2和人IGF-IR的双特异性抗体分子组成包含但不限于结合HER2的第一抗原结合域和结合IGF-IR的第二抗原结合域,还包括有助于前述双特异性抗体维持空间结构以实现正常功能或增强抗体功能的其它肽段或分子。
术语“价”指结合位点在抗体分子上存在的具体数量。比如:术语“二价”,“四价”,和“六价”指在抗体分子上分别存在两个结合位点,四个结合位点,六个结合位点。根据本实施例的双特异性抗体至少是“二价”的,并且可以是“多价”的(例如“三价”,“四价”等)。优选地,本实施例的双特异性抗体是二价的,四价的。对于具有超过两个抗原结合域的抗体,有些结合域可以是相同的,只要前述抗体至少具有对于两种抗原HER2和IGF-IR的两个特异性结合域。
优选地,本实施例的双价的双特异性抗体结构类型包括scFv型和scFab型。scFv是由抗体重链可变结构域(VH)和抗体轻链可变结构域(VL)和肽段接头组成的多肽。具体的,前述scFv型双特异性抗体(如附图1所示)具有从N端到C端方向的下列顺序之一:
(1)VLHER-2-接头-VHHER-2-接头VLIGF-IR-接头-VHIGF-IR
(2)VHHER-2-接头-VLHER-2-接头VHIGF-IR-接头-VLIGF-IR
(3)VLIGF-IR-接头-VHIGF-IR-接头-VLHER-2-接头-VHHER-2
(4)VHIGF-IR-接头-VLIGF-IR-接头VHHER-2-接头-VLHER-2
(5)VLHER-2-接头-VHIGF-IR-接头-VLIGF-IR-接头-VHHER-2
(6)VHHER-2-接头-VLIGF-IR-接头-VHIGF-IR-接头-VLHER-2
(7)VLIGF-IR-接头-VHHER-2-接头-VLHER-2-接头-VHIGF-IR,或
(8)VHIGF-IR-接头-VLHER-2-接头-VHHER-2-接头-VLIGF-IR
scFab是由抗体重链可变结构域(VH),抗体重链恒定结构域1(CH1),抗体轻链可变结构域(VL)和抗体轻链恒定区(CL)和肽段接头组成的多肽,前述scFab型双特异性抗体(如附图2所示)具有从N端到C端方向的下列顺序之一:
(1)[VL-CL-接头-VH-CH1]HER-2-接头-[VL-CL-接头-VH-CH1]IGF-IR
(2)[VH-CH1-接头-VL-CL]HER-2-接头-[VH-CH1-接头-VL-CL]IGF-IR
(3)[VL-CL-接头-VH-CH1]IGF-IR-接头-[VL-CL-接头-VH-CH1]HER-2,或
(4)[VH-CH1-接头-VL-CL]IGF-IR-接头-[VH-CH1-接头-VL-CL]HER-2
本实施例的采用scFv结构的双特异性抗体中,第一和第二抗原结合域之间以及每个抗原结合域内部的VH和VL之间的肽段接头为(Gly4Ser)n,n应满足最大程度保证抗体分子的正确装配以实现结合抗原的功能,优选地,n在1-6之间。本实施例的采用scFab结构的双特异性抗体中,第一和第二抗原结合域之间以及每个抗原结合域内部的重链和轻链之间均由肽段接头(Gly4Ser)n或(Gly4Ser)nGm连接,n和m应满足最大程度保证抗体分子的正确装配以实现抗原结合的功能,优选地,n在1-6之间,m在1-4之间。
优选地,本实施例的四价的双特异性抗体结构包括在抗HER2全长抗体的两个轻链C端各自连接一个抗IGF-IR的scFv或scFab结构域(如附图3-1、附图4-1所示),或者在抗IGF-IR全长抗体的两个轻链C端各自连接一个抗HER2的scFv或者scFab结构域(如附图3-3、附图4-3所示);还包括在抗HER2全长抗体Fc部分的两个C末端各自连接一个抗IGF-IR的scFv或scFab结构域(如附图3-2、附图4-2所示),或者在抗IGF-IR全长抗体Fc部分的两个C末端各自连接一个抗HER2的scFv或scFab结构域(如附图3-4、附图4-4所示)。因此前述的四价的双特异性抗体均包含两个HER2特异性结合域和两个IGF-IR特异性结合域。
本实施例的四价的双特异性抗体结构中,全长抗体和Fab之间以及Fab内部重链和轻链之间也采用肽段接头(Gly4Ser)n或(Gly4Ser)nGm连接,n和m应满足最大程度保证抗体分子的正确装配以实现抗原结合的功能,优选地,n在1-6之间,m在1-4之间。
本实施例的四价的双特异性抗体,因具有人类来源的IgG,优选地IgG1亚类的恒定区域,因而除可封闭HER2和IGF-IR介导的信号传递之外,还可激发抗体依赖性的细胞毒作用(ADCC)和/或补体依赖的细胞毒性(CDC)。
本实施例的各种结构类型的抗人HER2和人IGF-IR的双特异性抗体的设计与制备如下述。
1、scFv结构类型的识别HER2和IGF-IR的双特异性抗体如(VLHER2-Linker1-VHIGF-IR-Linker2-VLIGF-IR-linker3-VHHER2)的设计与制备:
①抗HER2和IGF-IR的双特异性抗体的核酸序列设计与合成:
获得分别特异性结合HER2和IGF-IR的抗体的氨基酸序列,截取VL和VH序列,按照VLHER2-Linker1-VHIGF-IR-Linker2-VLIGF-IR-linker3-VHER2[如图1-5,按N端至C端方向排列,其中linker1和linker3序列都为(Gly4Ser)1,linker2序列为(Gly4Ser)3]方式连接,为便于纯化在N端引入6×His标签,并在6×His标签和抗体分子之间插入肠激酶切割位点(DDDDK),得到分子A。然后将分子A融合到人IgG1信号肽C端,得到分子B,再在分子B编码序列的5’和3’端分别引入酶切位点EcoRI和XbaI,得到分子C,将分子C的序列委托南京金斯瑞公司进行序列密码子优化获得易于在CHO细胞中表达的核酸序列,并合成。
②表达载体的构建、转化及稳定表达株筛选:
将测序正确的序列通过双酶切EcoRI和XbaI双酶切连接到pCIneo载体中,经DNA测序分析,与设计完全一致。然后按照Invitrogen操作手册的方法转染CHO-DG44贴壁细胞。添加G418加压,并通过有限稀释方法分离稳定表达株。通过Western方法筛选到产量较高的细胞,产量>5mg/L。
③双特异性抗体的分离与纯化:
收集培养液上清,按顺序用两次Ni-NTA亲和层析和一次DEAE-SepharoseFF(GE产品)离子交换层析进行分离。具体的说,将培养基上清800g离心10min,留上清。然后上样到用溶液I(20mM磷酸盐缓冲液+200mMNaCl,pH8.0)预平衡的Ni-NTA亲和层析柱,以溶液I洗涤5-10个柱体积,然后以溶液II(20mM磷酸盐缓冲液+200mMNaCl+200mM咪唑,pH8.0)梯度洗脱,收集洗脱峰。按肠激酶说明书方法将洗脱液采用肠激酶酶切以去除组氨酸标签,切割后样品以溶液I稀释10倍后上Ni-NTA层析柱,肠激酶因和未被切割的抗体分子结合到层析柱上,而被切除组氨酸标签的抗体分子直接流穿。然后收集流穿部分,将其以上样至溶液III(50mM磷酸盐缓冲液,pH8.0)预处理过的DEAE-SepharoseFF层析柱,再用溶液IV(500mMNaCl+50mM磷酸盐缓冲液,pH8.0)梯度洗脱,收集目的流出峰。BCA方法进行定量。SDS-PAGE检测纯度>95%。
2、scFab结构类型的识别人HER2和人IGF-IR的双特异性抗体如(LHER2-Linker1--HHER2-Linker2-LIGF-IR-linker3-HIGF-IR)的设计与制备:
①获得分别特异性结合HER2和IGF-IR的抗体的氨基酸序列,截取Fab区序列,按照LHER2-Linker1-HHER2-Linker2-LIGF-IR-linker3-HIGF-IR[按N端至C端方向排列,其中linker1和linker3序列都为(Gly4Ser)6GG,linker2序列为(Gly4Ser)4]方式连接,为便于纯化在N端引入6×His标签,并在组氨酸标签和抗体分子之间插入肠激酶切割位点(DDDDK),得到分子D。然后将分子D融合到人IgG1信号肽C端,得到分子E,再在分子E编码序列的5’和3’端分别引入酶切位点EcoRI和XbaI,得到分子F,将分子F的序列委托南京金斯瑞公司进行序列密码子优化获得易于在CHO细胞中表达的核酸序列,并合成。
②表达载体的构建、转化及稳定表达株筛选:
将测序正确的序列通过双酶切EcoRI和XbaI双酶切连接到pCIneo载体中,经DNA测序分析,与设计完全一致。然后按照Invitrogen操作手册的方法转染CHO-DG44贴壁细胞。添加G418加压,并通过有限稀释方法分离稳定表达株。通过Western方法筛选到产量较高的株细胞,产量>3mg/L。
③双特异性抗体的分离与纯化:
收集培养液上清,按顺序用两次Ni-NTA亲和层析和一次DEAE-SepharoseFF(GE产品)离子交换层析进行分离。具体的说,将培养基上清800g离心10min,留上清。然后上样到用溶液A(20mMTris-Cl+200mMNaCl,pH8.5)预平衡的Ni-NTA亲和层析柱,以溶液A洗涤5-10个柱体积,然后以溶液B(20mMTris-Cl+200mMNaCl+200mM咪唑,pH8.5)洗脱,收集洗脱峰。按肠激酶说明书方法将洗脱液采用肠激酶酶切以去除组氨酸标签,切割后样品以溶液A稀释20倍后上Ni-NTA,肠激酶因和未被切割的抗体分子结合到层析柱上,而被切割的抗体分子直接流穿。然后收集流穿部分,将其以上样至溶液C(50mMTri-Cl,pH8.5)预处理过的DEAE-SepharoseFF层析柱,以溶液C洗涤5-10个柱体积,再用溶液D(600mMNaCl+50mMTris-Cl,pH8.5)梯度洗脱,收集目的流出峰。BCA方法进行定量。SDS-PAGE检测纯度>95%。
3、四价结构类型的识别IGF-IR的全长抗体重链C端连接识别HER2的scFv的双特异性抗体:
①获得分别特异性结合HER2和IGF-IR的抗体的氨基酸序列,设计结合HER2的单价scFv分子VLHER2-Linker1-VHHER2[按N端至C端方向排列,其中linker1序列为(Gly4Ser)3],将其N端通过(Gly4Ser)3连接到IGF-IR全长抗体的重链的C端,然后将其融合到人IgG1信号肽C端,再在所得融合蛋白编码序列的5’和3’端分别引入酶切位点EcoRI和XbaI,将所设计分子的序列委托南京金斯瑞公司进行序列密码子优化获得易于在CHO细胞中表达的核酸序列,并合成。
另将IGF-IR抗体轻链部分融合到人IgG1信号肽3’端,再在5’和3’端分别引入酶切位点EcoRI和XbaI,将设计的分子的编码序列委托南京金斯瑞公司进行序列密码子优化获得易于在CHO细胞中表达的核酸序列,并合成。
②表达载体的构建、转化及稳定表达株筛选:
将测序正确的两段序列通过双酶切EcoRI和XbaI双酶切各自连接到pCIneo载体中,经DNA测序分析,与设计完全一致。然后按照Invitrogen操作手册的方法,将两个载体按1∶1比例共转染CHO-DG44贴壁细胞。添加G418加压,并通过有限稀释方法分离稳定表达株。通过Western方法筛选到产量较高的株细胞,产量>5.5mg/L。
③双特异性抗体的分离与纯化:
收集培养液上清,按顺序用ProteinA亲和层析和S-200(GE产品)排阻层析进行分离。具体的说,将培养基上清800g离心10min,留上清。然后上样到用平衡溶液(20mMTris-Cl+250mMNaCl,pH8.0)预平衡的ProteinA亲和层析柱,以平衡溶液洗涤5-10个柱体积,然后以洗脱液(0.1M柠檬酸盐缓冲液,pH2.8)洗脱,将包含蛋白的收集液用1MTris-Cl,pH8.0中和。用Millipore超滤装置(截留分子量30kD)将其浓缩,并上样到用平衡液(20mM组氨酸,150mMNaCl,pH6.0)平衡的S-200层析柱。将双特异性抗体部分收集。BCA方法进行定量。SDS-PAGE检测纯度>95%。
4、四价结构类型的识别IGF-IR的全长抗体重链C端连接识别HER2的scFab的双特异性抗体:
①获得分别特异性结合HER2和IGF-IR的抗体的氨基酸序列,设计结合HER2的单价scFab分子VLHER2-CL-Linker1-VHHER2-CH1[按N端至C端方向排列,其中linker1序列为(Gly4Ser)6GG],将其N端通过(Gly4Ser)3连接到IGF-IR全长抗体的重链的C端,然后将其融合到人IgG1信号肽C端,再在所得融合蛋白编码序列的5’和3’端分别引入酶切位点EcoRI和XbaI,将所设计分子的序列委托南京金斯瑞公司进行序列密码子优化获得易于在CHO细胞中表达的核酸序列,并合成。
另将IGF-IR抗体轻链部分融合到人IgG1信号肽3’端,再在5’和3’端分别引入酶切位点EcoRI和XbaI,将设计的分子的编码序列委托南京金斯瑞公司进行序列密码子优化获得易于在CHO细胞中表达的核酸序列,并合成。
②表达载体的构建、转化及稳定表达株筛选:
将测序正确的两段序列通过双酶切EcoRI和XbaI双酶切各自连接到pCIneo载体中,经DNA测序分析,与设计完全一致。然后按照Invitrogen操作手册的方法,将两个载体按1∶1比例共转染CHO-DG44贴壁细胞。添加G418加压,并通过有限稀释方法分离稳定表达株。通过Western方法筛选到产量较高的株细胞,产量>2.8mg/L。
③双特异性抗体的分离与纯化:
收集培养液上清,按顺序用ProteinA亲和层析和S-200(GE产品)排阻层析进行分离。具体的说,将培养基上清800g离心10min,留上清。然后上样到用平衡溶液(20mMTris-Cl+250mMNaCl,pH8.0)预平衡的ProteinA亲和层析柱,以平衡溶液洗涤5-10个柱体积,然后以洗脱液(0.1M柠檬酸盐缓冲液,pH2.8)洗脱,将包含蛋白的收集液用1MTris-Cl,pH8.0中和。用Millipore超滤装置(截留分子量30kD)将其浓缩,并上样到用平衡液(20mM组氨酸,150mMNaCl,pH6.0)平衡的S-200层析柱。将双特异性抗体部分收集。BCA方法进行定量。SDS-PAGE检测纯度>96%。
本实施例的识别HER2和IGF-IR双特异性抗体的初步活性检测:
分别用前述4种方法所获得的4种结构的双特异性抗体与HER2阳性细胞系、IGF-IR阳性细胞系和HER2/IGF-IR双阳性细胞,以及HER2/IGF-IR双阴性细胞系进行相互作用分析,结果表明上述三种HER2/IGF-IR双特异性抗体都能与HER2阳性细胞系,IGF-IR阳性细胞系和HER2/IGF-IR双阳性细胞结合,而不与HER2/IGF-IR双阴性细胞系结合,说明HER2/IGF-IR双特异性抗体具有与HER2和IGF-IR特异性结合的能力。
本实施例的各种结构类型的抗人HER2和人IGF-IR的双特异性抗体通过药学可接受的载体用于人类,合适的药物载体为本领域熟知,包括但不限于生理盐水、磷酸缓冲液、水、脂质体、纳米载体等。含有此类载体的双特异性抗体或抗体组合物通过众所周知的常规方法制备。
本实施例的各种结构类型的抗人HER2和人IGF-IR的双特异性抗体可以通过各种给药途径用于人类,给药途径包括但不限于静脉注射、静脉滴注、肌肉注射、皮下注射、口服、舌下给药、喷雾等。
本实施例的各种结构类型的抗人HER2和人IGF-IR的双特异性抗体可以应用上述的药物载体,通过上述的给药途径单独使用或者与其它药物合用或者与其它药物偶联后用于人类。所述的药物包括但不限于细胞毒素、放射性同位素、脂质体、抗体等。
综上,本实施例将特异性识别人HER2和人IGF-IR的抗体可变区域构建在同一抗体分子中,使其具有能同时特异性结合两个抗原的特性,该双特异性抗体能同时阻断这两种抗原介导的细胞信号传递,抑制依赖HER2的肿瘤细胞生长,使肿瘤消退,同时消除IGF-I引发的耐药性,有效降低乳腺癌的侵袭性和全身扩散;本实施例的抗HER2和IGF-IR的双特异性抗体,可用于制备治疗人类癌症特别是治疗人类乳腺癌的药品。
以上实施例是对本发明的具体实施方式的说明,而非对本发明的限制,有关技术领域的技术人员在不脱离本发明的精神和范围的情况下,还可以做出各种变换和变化而得到相对应的等同的技术方案,因此所有等同的技术方案均应该归入本发明的专利保护范围。

Claims (6)

1.一种抗人HER2和人IGF-IR的双特异性抗体,是由SEQIDNO:1表示的特异性结合HER2的第一抗原结合域和由SEQIDNO:5表示的特异性结合IGF-IR的第二抗原结合域,以从N端到C端的氨基酸序列“VLHER2—接头—VHHER2—接头—VLIGF-IR—接头—VHIGF-IR”表示的scFv结构类型的双特异性抗体,其中,第一抗原结合域与第二抗原结合域之间的接头为肽段Gly4Ser,每个抗原结合域内部的重链可变区结构域VH和轻链可变结构域VL之间的接头为肽段(Gly4Ser)3
2.根据权利要求1所述抗人HER2和人IGF-IR的双特异性抗体,其特征在于,所述第一抗原结合域和第二抗原结合域为通过将鼠来源的抗体人源化获得或完全人源获得。
3.根据权利要求1所述抗人HER2和人IGF-IR的双特异性抗体,其特征在于,所述抗体是二价的。
4.一种权利要求1所述抗人HER2和人IGF-IR的双特异性抗体的制备方法,包括以下步骤:
1)合成编码所述双特异性抗体的cDNA序列:分别获得由SEQIDNO:1表示的特异性结合HER2的第一抗原结合域和由SEQIDNO:5表示的特异性结合IGF-IR的第二抗原结合域,截取各自的VH和VL序列,按照所述scFv结构类型连接,经合成得到编码所述双特异性抗体的cDNA序列;
2)将cDNA序列插入工具载体,构建可在宿主细胞中表达的表达载体;
3)将所述表达载体在宿主细胞中表达;
4)分离纯化表达的双特异性抗体。
5.根据权利要求4所述制备方法,其特征在于,所述宿主细胞为大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞、植物细胞或昆虫细胞。
6.权利要求1所述抗人HER2和人IGF-IR的双特异性抗体在制备治疗乳腺癌的药物中的应用。
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