TW201708253A - 用以治療腫瘤的分子構建體 - Google Patents

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Abstract

本揭示內容提出了多種分子構建體，這些分子構建體具有一標的元件與一效應元件。此處亦揭示了利用所述分子構建體來治療多種疾病的方法。

Description

用以治療腫瘤的分子構建體
本揭示內容是關於藥學領域；更明確地說，是關於多功能的分子構建體，譬如具有標的元件與效應元件以將效應元件(如治療藥物)遞送至標的部位的分子構建體。
近年來，本領域發展出多種篩檢與選擇以抗原為標的之單株抗體(monoclonal antibodies，mAbs)的方法，進而帶動許多治療用抗體的研發，為一些不久前還被認為是不治之症的疾病帶來曙光。根據治療性抗體資料庫(Therapeutic Antibody Database)的統計，有多達2,800種左右的抗體已經或即將投入人體臨床試驗研發，而由政府藥物管理機構核准可用於臨床治療的抗體則約有80種。從與抗體療效相關的大量數據中可知抗體是基於何種藥理機制而發揮療效。
以抗體作為治療藥劑時，其主要的藥理機制是以抗體來中和或誘捕造成疾病的介質；所述介質可能是存在於血液循環、間質空間(interstitial space)或淋巴結中的細胞介素或免疫成分。中和所述介質的活性可抑制造成疾病的介質和其受體之間的互動。此外，可將細胞介素的可溶性受體或受體的細胞外部分和免疫球蛋白IgG的Fc部分製成融合蛋白，此種融合蛋白可利用類似中和抗體的機制來中和上述細胞介素或免疫因子；因此目前也開發出多種融合蛋白治療劑。
另外，某些取得臨床使用許可或正在進行臨床研究的治療性抗體則是採用了與上述主要抗體機制不同的機制，來發揮其藥理作用，譬如可藉由和受體結合以阻斷這些受體和其配體之間的互動。對此類抗體藥物來說，其主要的藥理機制並非由Fc-介導的機制(如抗體依賴性細胞毒性(antibody-dependent cellular cytotoxicity，ADCC)或是補體介導的細胞溶解(complement-mediated cytolysis，CMC)等)。
另一些治療性抗體可和目標細胞上的某些表面抗原結合，並藉此在目標細胞上發揮Fc介導的功能以及其他機制。最重要的Fc介導的機制為抗體依賴性細胞毒性(ADCC)以及補體介導的細胞溶解(CMC)，這兩種機制都會將與抗體結合的目標細胞溶解。這些抗體和特定的細胞表面抗原結合後，可使得與其結合的目標細胞發生細胞凋亡。
有些抗體也可以作為載體，用來攜帶細胞毒性分子或其他治療藥劑，而抗體本身則沒有顯著的治療效果。一般來說，此類抗體可結合至目標細胞上的「腫瘤相關」抗原，但其本身不會使細胞溶解。本領域已知有多種對B淋巴瘤上的CD19與CD22專一的抗體。在過去許多年間，大半的研究著重於探究如何以這些抗體作為載體來攜帶細胞毒性藥物，包括半衰期極短的放射性核種，如90 Y、131 I以及177 Lu。某些抗體也可作為載藥微脂體的標的藥劑，上述載藥微脂體載有細胞毒性藥物，如阿黴素(doxorubicin)、紫衫醇(paclitaxel)以及兩性黴素B (amphotericin B)。近年來，抗體藥物複合體(antibody drug conjugate，ADC)的研發成長快速，這主要可歸因於具有極高細胞毒性的藥物(如奧里斯他汀(auristatin)、美登木素(maytansine)、卡奇黴素(calicheamicin)以及喜樹鹼(camptothecin)等)、以及將細胞毒性分子複合至抗體分子上的方法等的發展。這些ADC經過設計可標的至表現一或多種獨特的CD標記的血液、淋巴系統與骨髓中的擴散性(或液態)腫瘤，包括多種類型的淋巴瘤與白血病。也有某些針對固態腫瘤所開發出的ADC。此類新一代的抗體藥物複合體中，已有少數經核准可用於臨床治療，也有許多ADC正在進行臨床試驗。
然而，在第一代ADC中，細胞毒性藥物分子是透過非選擇性的方式連接到抗體中的半胱胺酸(cysteine，C)或離胺酸(lysine，K)殘基，因此會得到異質性的ADC混合物，其中每一個ADC分子所攜帶的藥物分子數可能不同。此一現象會導致安全性與有效性上的疑慮。舉例來說，美國食品暨藥物管理局(US Food and Drug Administration，FDA)核准的首例ADC—吉妥單抗奧佐米星(gemtuzumab ozogamicin)—可用以治療急性骨髓性白血病，但在上市後卻因毒性過高而在FDA的要求下退出市場。
製備具有雙重專一性的抗體的概念與方法，早在三十年前就已萌芽。近年來，隨著重組抗體工程方法的進步、以及對於更好藥物的需求驅使下，發展出多種具有不同結構構形的雙專一性抗體。
舉例來說，雙價或多價抗體可能帶有二或更多種抗原結合位。已知有多種方法可用以製備多價抗體，這些方法通常利用連接結構將三或四種抗原結合片段(antigen-binding fragment，Fab)共價連接在一起。舉例來說，已透過重組工程製備出能表現三或四個串聯(tandem)的Fab重複片段的抗體。
此外，利用合成的交聯物(crosslinker)，透過化學方法將不同的抗體或結合部位連接在一起，以製造出多價抗體的方法也是本領域公知的技術。其中一種方式是利用不同的接合物(linker)，將三、四或更多個分離的Fab片段，透過化學交聯的方式彼此接合。另一種方式是先製備一個具有多個Fab的構建體，將這些Fab組裝成一維的DNA支架(one-dimensional DNA scaffold)。這些經設計可和目標分子結合的各種多價抗體構建體彼此的尺寸、半衰期、構形彈性以及調節免疫系統的能力各不相同。
基於以上說明，已有部分研究著眼於製備效應元件數目固定的分子構建體或具有二或更多種不同功能性元件(譬如至少一標的元件與至少一效應元件)的分子構建體。然而，通常很難利用化學合成或重組技術等方法，來建立具有特定標的與效應元件組合的分子構建體。因此，本領域亟需一種新穎的分子平台，其可用以建構適用於多種疾病的各種分子。
發明內容旨在提供本揭示內容的簡化摘要，以使閱讀者對本揭示內容具備基本的理解。此發明內容並非本揭示內容的完整概述，且其用意並非在指出本發明具體實施例的重要/關鍵元件或界定本發明的範圍。發明內容的唯一目的在於對此處揭示的某些概念提供簡化的說明，以利理解後文所述的實施方式。
本揭示內容的第一種態樣是關於一種Fc型分子構建體，此種Fc型分子構建體具有直接或間接地連接到免疫球蛋白的CH2-CH3區域的至少一標的元件與至少一效應元件。藉由選擇本發明Fc型分子構建體的效應元件與標的元件，所述分子構建體可用於治療多種細胞增殖疾病，包括液態腫瘤及固態腫瘤。在某些實施方式中，本揭示內容的優點還包括使用了本揭示內容多個實施方式所述的接合單元，因而提供了一種能夠輕易控制處提出的Fc型分子構建體的藥物(譬如細胞毒性藥物)有效負載(payload)量的方法。在此處，將攜帶了多個藥物分子的接合單元稱為載藥束(drug bundle)。可在將載藥束和抗體分子耦接之前先單獨製備此種載藥束，因而能夠避免在嚴苛的化學條件下將藥物分子直接與抗體分子接合的問題。
根據本揭示內容多種實施方式，所述Fc型分子構建體包含一對IgG.Fc的CH2-CH3區段、第一對效應元件及第一對標的元件。
在根據本態樣第一類Fc型的分子構建體中，第一對效應元件的每一個效應元件是一個載藥束，而第一對標的元件的每一標的元件是對細胞表面抗原專一的抗體片段。在這些情形中，第一對效應元件連接於成對CH2-CH3區段的C-端，而第一對標的元件則連接於成對CH2-CH3區段的N-端。根據本揭示內容多種實施方式，載藥束包含複數個細胞毒性藥物分子，譬如奧里斯他汀(auristatin)、美登木素(maytansine)、阿黴素(doxorubicin)、卡奇黴素(calicheamicin)以及喜樹鹼(camptothecin)；這些Fc型分子構建體可標的到以下細胞表面抗原：CD5、CD19、CD20、CD22、CD23、CD30、CD33、CD34、CD37、CD38、CD43、CD78、CD79a、CD79b、CD138或CD319。作為例示而非限制，這些Fc型分子構建體可用於治療多種液態腫瘤。
在根據本態樣第二類Fc型的分子構建體中，第一對效應元件的每一個效應元件是一個載藥束，而第一對標的元件的每一標的元件是對腫瘤相關抗原專一的抗體片段。在這些情形中，第一對效應元件連接於成對CH2-CH3區段的C-端，而第一對標的元件則連接於成對CH2-CH3區段的N-端。根據本揭示內容多種實施方式，載藥束包含複數個細胞毒性藥物分子、類鐸受體(toll-like receptor，TLR)促效劑分子或與放射性核種複合的螯合劑分子；這些Fc型分子構建體可標的到以下腫瘤相關抗原：人類上皮生長因子受體1(human epidermal growth factor receptor-1，HER1)、HER2、HER3、HER4、醣類抗原19-9 (carbohydrate antigen 19-9，CA 19-9)、醣類抗原125 (CA 125)、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)、細胞表面相關黏蛋白1 (cell surface-associated mucin 1，MUC 1)、黑色素瘤相關抗原(melanoma-associated antigen，MAGE)、前列腺專一膜抗原(prostate-specific membrane antigen，PSMA)、前列腺幹細胞抗原(prostate stem cell antigen，PSCA)、黏蛋白關聯Tn抗原、唾液酸Tn抗原(Sialyl Tn)、Globo H、階段專一性胚胎抗原(stage-specific embryonic antigen-4，SSEA-4)、神經節苷脂GD2或上皮細胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)。作為例示而非限制，這些Fc型分子構建體可用於治療多種固態腫瘤，包括惡性和/或轉移性固態腫瘤。
在根據本態樣第三類Fc型的分子構建體中，第一對效應元件的每一個效應元件是一個載藥束、或對細胞表面抗原、生長因子或半抗原專一的抗體片段；而第一對標的元件的每一標的元件是生長因子或肽類激素。當效應元件為載藥束時，第一對效應元件分別連接於成對CH2-CH3區段的C-端，而標的元件分別連接於成對CH2-CH3區段的N-端。或者是，當效應元件是抗體片段時，效應元件分別連接於成對CH2-CH3區段的N-端，而標的元件分別連接於成對CH2-CH3區段的C-端，反之亦然。
藉由選擇效應元件與標的元件，所述第三類的Fc型分子構建體亦可用於治療多種固態腫瘤，包括惡性和/或轉移性固態腫瘤；然而，本揭示內容不限於此。
根據本揭示內容的實施方式，適合作為效應元件的細胞毒性藥物可以是為奧里斯他汀、美登木素、阿黴素、卡奇黴素或喜樹鹼。TLR促效劑的例示性實施例包括：脂多醣(lipopolysaccharide，LPS)、單磷醯脂A (monophosphoryl lipid A)、莫托立莫特(motolimod)、咪喹莫特(imiquimod)、瑞西喹莫特(resiquimod)、加德喹莫特(gardiquimod)、CpG寡聚去氧核苷酸(CpG oligodeoxynucleotide，CpG DON)、脂磷壁酸(lipoteichoic acid)、β-葡聚糖(β-glucan)以及酵母聚糖(zymosan)。適用於此處的螯合劑包括，但不限於：1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四乙酸(1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid，DOTA)、1,4,7-三氮雜環壬烷-1,4,7-三乙酸(1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacetic acid，NOTA)、1,4,7-三氮雜環壬烷-1,4-二乙酸(1,4,7-triazacyclononane-1,4-diacetic acid，NODA)與二乙烯三胺五乙酸(diethylenetriaminepentaacetic acid，DTPA)。能夠和上述螯合劑複合的放射性核種的非限制性實施例可以是90 Y、111 In或177 Lu。
某些可作為效應元件的抗體片段是對細胞表面抗原專一的抗體片段，上述細胞表面抗原如程序性細胞死亡因子1 (programmed cell death 1，PD-1)、程序性細胞死亡因子1配體1 (programmed cell death 1 ligand 1，PD-L1)、細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4，CTLA-4)、CD3、CD16a、CD28以及CD134。另一類例子是對生長因子專一的抗體片段，上述生長因子如上皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)、突變型EGF、表皮調節素(epiregulin)、肝素結合上皮生長因子(heparin-binding epidermal growth factor，HB-EGF)、血管內皮生長因子A (vascular endothelial growth factor，VEGF-A)、鹼性纖維母細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)以及肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)。此處亦可使用對半抗原專一的抗體片段，而半抗原的例示性實施例包括：二硝苯酚(dinitrophenol，DNP)、三硝苯酚(trinitropheno，TNP)、丹磺醯(dansyl)、盤尼西林、對胺苯甲酸以及具有序列編號：20所示胺基酸序列的多肽。
適用於本類Fc型分子構建體的標的元件可以是生長因子，如EGF、突變型EGF、表皮調節素、HB-EGF、VEGF-A、bFGF以及HGF。或者是，所述標的元件可以是肽類激素，如膽囊收縮素(cholecystokinin，CCK)、體抑素(somastatin)與促甲狀腺素(thyroid-stimulating hormone，TSH)。
根據本揭示內容此一態樣的各種Fc型分子構建體間有一些共通的特徵，下文先討論這些共通特徵。
於一些實施方式中，上述成對的CH2-CH3區段是衍生自人類IgG重鏈γ4或人類IgG重鏈γ1。
在某些例子中，第一對效應元件(譬如用於上述第三類Fc型分子構建體中的元件)或第一對標的元件(譬如用於第一與第二類Fc型分子構建體中的元件)形成抗原結合片段(antigen-binding fragment，Fab)的構形(即，包含VH -CH1區域以及VL -Cκ區域)；此一Fab片段連接於第一與第二重鏈的N-端，而使得Fc型分子構建體形成IgG構形。在這些情形中，未採用Fab構形的另一對元件則連接於成對CH2-CH3區段的C-端。
根據某些實施方式，本發明Fc型分子構建體更包含一多肽延伸段及一耦合臂。具體來說，多肽延伸段的序列為(G2-4 S)2-8 C，且連接於成對CH2-CH3區段其中之一的C-端。在這種情形中，耦合臂透過硫氫-順丁烯二醯亞胺反應而連接於多肽延伸段的C-端。此外，在和載藥束耦接之前，耦合臂的自由端(即，未連接於多肽延伸段的半胱胺酸殘基的一端)經修飾帶有炔基、疊氮基、高應力炔基或四嗪基，而使得載藥束可透過逆電子需求狄爾斯-阿德(inverse electron demand Diels–Alder，iEDDA)反應、應力促進的疊氮化物-炔羥鏈接化學(strain-promoted azide-alkyne click chemistry，SPAAC)反應或銅催化的疊氮化物-炔羥環加成(copper catalyzed azide-alkyne cycloaddition，CuAAC)反應而與耦合臂耦接。
當效應元件是載藥束時，可利用本揭示內容多個實施方式所述的接合單元作為載藥束。具體來說，載藥束包含一中心核、複數個第一連接臂以及視需要而加入的一第二連接臂。根據本揭示內容多種實施方式，中心核可以是具有複數個氨基的化合物或包含複數個離胺酸(K)殘基的多肽。每一第一連接臂的一端藉由和化合物核的氨基或多肽核的K殘基反應，而與中心核連接。第一連接臂在其自由端帶有順丁烯二醯亞胺基，而每一藥物分子(譬如細胞毒性藥物、TLR 促效劑或螯合劑/放射性核種複合物的分子)則藉由和順丁烯二醯亞胺基反應以透過第一連接臂而與中心核連接。
在中心核是多肽核的情形中，位於中心核N-或C-端的胺基酸殘基是半胱胺酸殘基或帶有疊氮基或炔基。
當多肽中心核的末端胺基酸殘基帶有疊氮基或炔基時，載藥束可以透過發生於上述末端殘基與耦合臂C-端之間的CuAAC反應而和耦合臂連接。
當多肽中心核的末端殘基是半胱胺酸或中心核是化合物核時，載藥束更包含第二連接臂。第二連接臂的一端藉由和多肽核的半胱胺酸殘基反應或和化合物核的一氨基反應，而與中心核連接。第二連接臂的自由端亦帶有炔基、疊氮基、四嗪基或高應力炔基，而使得載藥束可透過CuAAC反應或iEDDA反應而連接到耦合臂的C-端。
根據本揭示內容某些視需要而實施的實施方式，上述Fc型分子構建體可更包含第二對效應元件或第二對標的元件。
對於第二類的Fc型分子構建體，第二對標的元件可分別連接於第一對標的元件。舉例來說，於一些實施方式中，第一對效應元件的每一效應元件是包含複數個細胞毒性藥物分子的載藥束，第一對標的元件的每一標的元件是對HER2專一的scFv，而第二對標的元件的每一標的元件則是對HER1專一的scFv。
對於第三類的Fc型分子構建體，在成對CH2-CH3區段的N-端已有一對元件，此時，第二對效應元件可以用串聯雙抗體(tandem)或雙抗體(diabody)的構形連接到上述位於N-端的該對元件的N-端，因而形成連接於成對CH2-CH3區段的N-端的一對雙專一性scFv。或者是，第三類的Fc型分子構建體可更包含第二對標的元件，第二對標的元件以串聯雙抗體(tandem)或雙抗體(diabody)的構形連接到位於成對CH2-CH3區段N-端的該對元件的N-端，因而形成連接於成對CH2-CH3區段的N-端的一對雙專一性scFv。
本揭示內容的第二種態樣是關於治療多種細胞增殖性疾病的方法。一般來說，上述方法涉及了對需要此一治療的個體投予治療有效量的Fc型分子構建體，所述Fc型分子構建體可以是根據本揭示內容第一態樣與相關實施方式的任一種Fc型分子構建體。
於一些實施方式中，本發明方法是關於液態腫瘤的治療方法，如B淋巴細胞衍生的淋巴瘤或白血病、漿細胞瘤、多發性骨髓瘤、衍生自T細胞的淋巴瘤或白血病以及骨髓性白血病。如上文所述，本揭示內容第一態樣所述的第一類Fc型分子構建體可用於治療液態腫瘤。附隨的申請專利範圍以及下文會進一步舉例說明用以治療特定液態腫瘤的Fc型分子構建體所標的的細胞表面抗原。
如上文所述，本發明方法亦適用於治療個體的固態腫瘤。固態腫瘤的實施例包括，但不限於：黑色素瘤、食道癌、胃癌、腦瘤、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、乳癌、胰臟癌、腎癌、肝細胞癌、卵巢癌、前列腺癌、甲狀腺癌、睪丸癌以及頭頸部鱗狀細胞癌。如上文所述，根據本揭示內容第一態樣的第二與第三類Fc型分子構建體可用於治療固態腫瘤。附隨的申請專利範圍以及下文會進一步說明用以治療治療固態腫瘤的一些例示性的效應元件與標的元件的組合。
根據本揭示內容某些視需要而實施的實施方式，在治療固態腫瘤時，所述方法包含以下步驟：(a)對該個體進行血液透析程序，此程序使用對一或多種腫瘤相關抗原專一的抗體，以移除由腫瘤脫落並進入個體循環中的上述一或多種腫瘤相關抗原；以及(b)投予本發明用以治療固態腫瘤的分子構建體。
當所述Fc型分子構建體使用對半抗原專一的抗體片段作為效應元件時，本發明方法更包含下步驟：在投予本發明Fc型分子構建體之後，對所述個體投予經相同半抗原標記的一免疫調節效應物。上述免疫調節效應物的非限制性實施例為IFN-α、IL-2、TNF-α或IFN-γ、或對PD-1、PD-L1、CTLA-4或CD3專一的IgG抗體。
根據本揭示內容某些實施方式，腫瘤相關抗原會由個體的惡性腫瘤脫落而進入其循環系統中。在這些情形中，本發明方法更包含在投予本發明Fc型分子構建體之前，對該個體進行血液透析程序，此程序使用對一或多種腫瘤相關抗原專一的抗體，以移除由惡性腫瘤脫落並進入個體循環中的上述一或多種腫瘤相關抗原。
為了使本揭示內容的敘述更加詳盡與完備，下文針對了本發明的實施態樣與具體實施例提出了說明性的描述；但這並非實施或運用本發明具體實施例的唯一形式。實施方式中涵蓋了多個具體實施例的特徵以及用以建構與操作這些具體實施例的方法步驟與其順序。然而，亦可利用其他具體實施例來達成相同或均等的功能與步驟順序。
為了便於說明，此處整理了說明書、實施例與附隨申請專利範圍中所用的某些詞彙。除非本說明書另有定義，此處所用的科學與技術詞彙的含義與本發明所屬技術領域中具有通常知識者所理解與慣用的意義相同。
在不和上下文衝突的情形下，本說明書所用的單數名詞涵蓋該名詞的複數型；而所用的複數名詞時亦涵蓋該名詞的單數型。此外，在本說明書與申請專利範圍中，「至少一」與「一或更多」等表述方式的意義相同，兩者都代表包含了一、二、三或更多。更有甚者，在本說明書與申請專利範圍中，「A、B及C其中至少一者」、「A、B或C其中至少一者」以及「A、B和/或C其中至少一者」係指涵蓋了僅有A、僅有B、僅有C、A與B兩者、B與C兩者、與C兩者、以及A、B與C三者。
雖然用以界定本發明較廣範圍的數值範圍與參數皆是約略的數值，此處已盡可能精確地呈現具體實施例中的相關數值。然而，任何數值本質上不可避免地含有因個別測試方法所致的標準偏差。在此處，「約」通常係指實際數值在一特定數值或範圍的正負10%、5%、1%或0.5%之內。或者是，「約」一詞代表實際數值落在平均值的可接受標準誤差之內，視本發明所屬技術領域中具有通常知識者的考量而定。當可理解，除了實驗例之外，或除非另有明確的說明，此處所用的所有範圍、數量、數值與百分比(例如用以描述材料用量、時間長短、溫度、操作條件、數量比例及其他相似者)均經過「約」的修飾。因此，除非另有相反的說明，本說明書與附隨申請專利範圍所揭示的數值參數皆為約略的數值，且可視需求而更動。至少應將這些數值參數理解為所指出的有效位數與套用一般進位法所得到的數值。在此處，將數值範圍表示成由一端點至另一端點或介於二端點之間；除非另有說明，此處所述的數值範圍皆包含端點。
本揭示內容一般係關於多種分子構建體，其中每一分子構建體包含一標的元件(T)與一效應元件(E)，在本說明書中有時將這些分子構建體稱為「T-E分子」、「T-E藥物」或「T-E藥品」。
在此處，「標的元件(targeting element)」一詞係指分子構建體能夠直接或間接結合到一目標標的(如，一細胞表面上的受體或一組織中的蛋白質)的部分，因而能夠協助將本發明分子構建體遞送到目標標的。在某些例子中，標的元件可將所述分子構建體導引至鄰近目標細胞處。在其他情形中，標的元件可專一地結合到目標細胞表面上的分子；或標的元件可和第二分子專一地結合，而此一第二分子能夠專一地結合到目標細胞表面上的分子。在某些例子中，一旦標的元件與目標標的接合之後，標的元件可將本發明分子構建體內化，而使其移動到目標細胞的細胞質內。標的元件可以是細胞表面受體的抗體或配體；或者是可和上述抗體或配體結合的分子，因而能夠間接地將本發明分子構建體標的到目標部位(譬如所選定的細胞表面)。相較於沒有標的功能的治療藥物，利用本發明分子構建體能夠加強或有利於效應元件(治療藥劑)在疾病部位的局部化(localization)。上述局部化是一種程度或相對的比例，而不是讓效應元件在疾病部位絕對或完全的局部化。
根據本發明，「效應元件(effector element)」一詞係指一旦分子構建體到達目標部位後，所述分子構建體中能夠發揮生物活性(譬如，誘發免疫反應、發揮細胞毒性及與其相似者)或其他功能活性(譬如招募其他經半抗原標記的治療用分子)的部分。「效應」可指治療性或診斷性的效果。效應元件包含能夠和細胞和/或細胞外免疫調節因子結合的元件。上述效應元件包含如蛋白質、核酸、脂質、碳水化合物、醣蛋白、藥物部分(包含小分子藥與生物製劑)、化合物元素及同位素等物質，也包含上述物質的片段。
雖然在此處利用「第一」、「第二、「第三」等詞彙來描述多種元件、部件、區域和/或區段，這些元件(以及部件、區域和/或區段)不受上述修飾詞的限制。此外，除非上下文有明示的說明，使用這些序數並未隱含序列或順序。反之，這些詞彙僅是用來區分各元件。因此，亦可將下文所述的第一元件命名為第二元件，而不會悖離例示性實施方式所揭示的內容。
在此處，「連接(link)」、「耦接(couple)」以及「複合(conjugate)」等詞可互換使用，且都是用來指稱透過直接或間接的連接關係，將兩個元件連接在一起。
「多肽(polypeptide)」一詞在此係指具有至少兩個胺基酸殘基的聚合物。一般來說，多肽包含2到200個胺基酸殘基；在較佳的情形中，是2到50個殘基。在本說明書中所提及的胺基酸序列涵蓋了此種序列的L-、D-或β-胺基酸等形式。多肽亦包括胺基酸聚合物，其中有一或多個胺基酸殘基是與一天然胺基酸相應的人工化學類似物，當然也包括天然產生的胺基酸聚合物。此外，此一詞彙亦涵蓋以多肽鏈或其他方式連接的胺基酸，上述其他方式如經修飾的連接(modified linkage)，譬如以α-酯(α-ester)、β-酯(β-ester)、硫醯胺(thioamide)、磷醯胺(phosphoramide)、氨基甲酸酯(carbomate)、羥基酯(hydroxylate)鍵、以及與其相似者來取代多肽鍵。
於一些實施方式中，本發明範圍亦涵蓋了其他相較於所述序列具有保守性置換的蛋白。於多種實施方式中，有一、二、三、四或五個不同的殘基經過置換。在此處，「保守性置換(conservative substitution)」一詞是指所述胺基酸置換不會明顯地改變分子活性(譬如生物或功能活性和/或專一性)。一般來說，保守性胺基酸置換是利用另一種具有相似化學性質(如電荷或疏水性)的胺基酸來取代某一胺基酸。某些保守性置換包括「類似物置換」，亦即以非標準(如罕見或合成等)胺基酸來取代標準胺基酸，而上述非標準胺基酸和被取代的原有胺基酸之間的差異極小。可由標準胺基酸經人工修飾而在不會大幅改變原有胺基酸結構的前提下，得到所述的胺基酸類似物，譬如異構物或代謝前驅物等皆屬之。
於一些實施方式中，本案的範圍亦涵蓋和任何所述序列具有至少80%序列相似度的任何序列，上述序列相似度較佳為至少85%或90%、更佳為至少95%或98%。
此處針對多肽序列所述的「胺基酸序列相似度百分比(Percentage (%) amino acid sequence identity)」係指候選序列的胺基酸殘基與參考多肽序列的胺基酸殘基完全相同的百分比；於進行上述比對時，可將所述的候選多肽片段與所述的特定多肽片段並排，並於必要時引入間隙，以使二序列形成最高的序列相似度；在計算相似度時，保守性置換的胺基酸殘基視為不同的殘基。相關領域已有多種方法可用以進行上述並排，譬如可公開取得的軟體如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign (DNASTAR)等。本發明所屬技術領域中具有通常知識者在進行並排時，可選擇適當的參數與計算方式，以得到最佳的排列方式。在本說明書中，二多肽序列間的序列比較是採用美國國家生物科技資訊中心(Nation Center for Biotechnology Information，NCBI)所提供的蛋白質-蛋白質BLAST分析資料庫Blastp來進行。候選多肽序列A相較於參考多肽序列B的胺基酸序列相似度(在本說明書中亦稱之為多肽序列A與多肽序列B具有特定百分比(%)的胺基酸序列相似度)的計算方式如下：% 其中X是利用BLAST序列並排程式對序列A、B進行排列後所得到的相同胺基酸殘基數目(identical matches)，而Y是A、B二序列中較短者的胺基酸殘基總數。
「聚乙二醇化胺基酸(PEGylated amino acid)」一詞在此係指帶有一個胺基(amino group)與一個羧基(carboxyl group)的聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)鏈。一般來說，聚乙二醇化胺基酸的結構式為NH2 -(CH2 CH2 O)n -COOH。在本揭示內容中，n值介於1到20之間；較佳是介於2至12。
在此處一多肽的「端」係指位於該多肽N-或C-端點的胺基酸殘基。在描述一聚合物(譬如此處所述的聚乙二醇)的組成單元時，「端」則是指在聚合物骨架末端的部分。在本說明書與申請專利範圍中，「自由端」一詞是用來指稱並未與另一個分子形成化學鍵結的末端胺基酸殘基或構成單元。
「抗原(antigen或Ag)」一詞係指能夠導致免疫反應的分子。此種免疫反應可能涉及分泌性(secretory)、荷爾蒙性(humoral)和/或細胞級(cellular)的抗原專一反應。在本揭示內容中，「抗原」一詞係指蛋白質、多肽(包括其突變株或具有生物活性的片段)、多醣、醣蛋白、醣脂質、核酸或上述之組合。
在本說明書與申請專利範圍中，「抗體(antibody)」一詞應以廣義方式解釋，且包含完整組裝的抗體、可和抗原結合的抗體片段，譬如抗原結合片段(Fab/Fab’)、F(ab’)2 片段(具有彼此以雙硫鍵連接的兩個Fab部分)、可變片段(variable fragment，Fv)、單鏈可變片段(scFv)、雙單一性單鏈可變片段(bi-scFv)、奈米抗體(nanobodies)、單抗體(unibodies)以及雙體抗體(diabodies)。「抗體片段」包含完整抗體的一部分，較佳為包括完整抗體的抗原結合區域或可變區域。在典型的例子中，「抗體」係指實質上由免疫球蛋白基因或其片段所編碼的一或多種多肽所組成的蛋白質。習知的免疫球蛋白基因包括κ (kappa)、λ (lambda)、α (alpha)、γ (gamma)、δ (gamma)、ε (epsilon)與μ (mu)等恆定區基因(constant region gene)、以及無數的免疫球蛋白可變區基因(variable region genes)。輕鏈通常歸類為κ (kappa)或λ (lambda)。重鏈通常歸類為γ (gamma)、μ (mu)、α (alpha)、δ (gamma)或ε (epsilon)，基於這些結構，定義出了以下類型的免疫球蛋白：IgG、IgM、IgA、IgD以及IgE。典型的免疫球蛋白抗體結構是一種四聚物(tetramer)。每一個四聚物是由兩條相同的多肽鏈所組成，且每一對分別有一「輕」鏈(約25 kDa)與一「重」鏈(約50-70 kDa)。每一鏈的N-端界定了一個可變區域，包含約100至110個或更多的胺基酸，其主要負責抗原辨識。可變輕鏈(variable light chain，VL )與可變重鏈(variable heavu chain，VH )等詞就是分別指上述的輕鏈與重鏈。根據本揭示內容的實施方式，可藉由改變天然抗體或利用重組DNA方式重新合成上述抗體片段。於本揭示內容一些實施方式中，上述抗體和/或抗體片段可具有雙專一性，且可有多種不同的構形。舉例來說，雙專一性抗體可包含二個不同的抗原結合部位(可變區域)。於多種實施方式中，可利用融合瘤技術或重組DNA技術來製備雙專一性抗體。於一些實施方式中，雙專一性抗體對至少兩種不同的表位(epitope)有結合專一性。
「專一地結合(specifically bind)」一詞在此處係指抗體或其抗原結合片段能夠和抗原結合的能力，上述結合的解離常數(dissociation constant，Kd)小於約1×10− 6 M、1×10− 7 M、1×10− 8 M、1×10− 9 M、1×10− 10 M、1×10− 11 M或1×10− 12 M；或者是或額外地，相較於其對於非專一性抗原的結合親和力，上述抗體或其抗原結合片段與抗原結合的親和力為兩倍以上。
「腫瘤(tumor)」一詞在此係指所有腫瘤性的細胞生長(neoplastic cell growth)與增殖(proliferation)，不論是惡性還是良性的，也涵蓋所有癌前期(pre-cancerous)與癌細胞與組織。在本說明書與申請專利範圍中，「腫瘤」一詞涵蓋包含固態腫瘤與液態腫瘤。
「固態腫瘤(solid tumor)」一詞是通常不含囊腫或液體區域的不正常組織團塊。各種類型的固態腫瘤通常是以形成腫瘤的細胞來命名。固態腫瘤的例子包括，但不限於：肉瘤(sarcomas)與癌(carcinomas)。一般來說，「肉瘤」是源自於結締組織或支持組織(如骨頭或肌肉)的腫瘤。「癌」則是源自於腺體細胞與位於身體組織邊襯的上皮細胞的腫瘤。
「液態腫瘤(diffused tumor)」一詞在此係指白血病和/或血液方面的疾病，此類疾病通常源自造血細胞(hematopoietic cells)以及受到影響的血液、骨髓或淋巴結。液態腫瘤的例子包括，但不限於：急性淋巴細胞性白血病(acute lymphocytic leukemia，ALL)、慢性淋巴細胞性白血病(chronic lymphocytic leukemia，CLL)、急性骨髓性白血病(acute myelogenous leukemia，AML)、慢性骨髓性白血病(chronic myelogenous leukemia，CML)、霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin lymphoma)、非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma)以及骨髓瘤(myeloma)。
「腫瘤相關抗原(tumor-associated antigen，TAA)」一詞係指任何相關領域已知的抗原，且包括在癌細胞表面上發現的抗原，也包括從癌細胞表面脫落而變成可溶性的抗原(即，可溶性癌抗原)。許多位在腫瘤或正常細胞上的細胞表面抗原也有可溶性的對應物。此種抗原包括，但不限於：在癌相關纖維母細胞(cancer-associated fibroblast，CAF)、腫瘤內皮細胞(tumor endothelial cell，TEC)以及腫瘤相關巨噬細胞(tumor-associated macrophages，TAM)上發現的抗原。
「治療(treatment)」一詞係指預防性(如，預防用藥)、療癒性或緩和性的處置，藉以達到所欲的藥學和/或生理學效果；而治療的行為在此包括上述預防性、療癒性或緩和性的處置。具體來說，治療在此係指對於可能患有一醫療疾患、症狀、疾病或與疾患相關的異常、或易於罹患一疾患的個體施用或投予本發明分子構建體或包含此分子構建體的藥學組合物，，以期能部分地或完全地緩和、改善、減輕特定異常和/或病症的一或多種症狀或特徵，或是延緩其發生、阻礙其進展、減輕其嚴重性和/或減低發生率。亦可對尚未表出現疾病、異常和/或病症徵兆的個體和/或出現早期徵兆的個體進行治療，以期降低發展出與該疾病、異常和/或病症相關的病理變化的風險。
在此處，「有效量(effective amount)」一詞係指本發明分子構建體的用量足以招致所欲的治療反應。藥劑的有效量不必然能夠治癒疾病或病症，但能夠延緩、阻礙或防止該疾病或病症的發生，或是可緩減與疾病或病症相關的病徵。可將治療有效量可分成一、二或更多劑，而以適當的劑型在指定期間內施用一次、二次或更多次。具體的治療有效量取決於多種因素，例如欲治療的特定狀況、個體的生理條件(如，個體體重、年齡或性別)、接受治療的個體類型、治療持續時間、併行治療(如果有的話)的本質以及所用的具體配方和化合物或其衍生物的結構。舉例來說，可將治療有效量表示成活性成分的總重量，譬如以克、毫克或微克來表示；或表示成活性成分重量相對於體重的比例，譬如表示為每公斤體重多少毫克(mg/kg)。
所述「施用(application)」與「投予(administration)」等詞在此可交替使用，其係指將本發明之分子構建體或藥學組合物提供給需要治療的個體。
「個體(subject)」或「患者(patient)」等詞在此可交互使用，且是指可接受本揭示內容之分子構建體、藥學組合物和/或方法處置的動物(包含人類)。除非另有指明，「個體」或「患者」一般包含雄性與雌性。「個體」或「患者」包含任何可因本揭示內容的處置而獲益的哺乳類動物。所述「個體」或「患者」的例示包含，但不限於：人類、大鼠、小鼠、天竺鼠、猴子、豬、山羊、牛、馬、狗、貓、鳥和禽類。在一實例中，所述患者為人類。所述哺乳類動物涵蓋哺乳動物綱的所有成員，包括人類、靈長類動物、家畜和農畜(如兔子、豬、綿羊和牛)、動物園動物或競賽用動物、寵物，以及齧齒類動物(如，小鼠和大鼠)。「非人類哺乳動物」一詞則涵蓋除了人類以外的所有哺乳動物綱成員。
本揭示內容至少部分是基於建構出了T–E藥物，此種T-E藥物可被遞送至目標細胞、目標組織或器官，且其在這些部位的比例相對高於在血液循環、淋巴系統以及其他細胞、組織和器官中的比例。當實現上述情境時，即可提升T-E藥物的療效，且其副作用與毒性的數目和嚴重性都會降低。相較於不含標的元件的藥物，以T-E分子的形式來投遞藥物時，發揮療效的效應物所用的濃度可能較低。因此，可在較低的劑量下施用治療用的效應物而不會減損其有效性，但卻能同時降低其副作用與毒性。
可因較佳藥物標的而獲益的疾病
若是可將藥物標的到疾病部位，亦即若是可使藥物在疾病部位(相對於在正常組織或器官)局部化或有較優勢的濃度，就能夠改善用以治療許多疾病的藥物，使其具備較佳的療效與安全性。下文提出一些主要的例示性疾病，若是能使得這些疾病所用藥物在疾病部位或細胞有較佳的分布比例，就可以改善這些藥物。
目前已針對不同臨床階段的惡性腫瘤(包括液態與固態腫瘤以及原發或轉移性腫瘤)開發出多種不同類型的治療劑，其中有些已用於動物模型實驗，另外有些則正在進行人體臨床試驗；還有一些已經取得政府主管機關的核准而可用於治療患者。上述治療劑包括(1)多種化合物，這些化合物主要針對重要的細胞調控路徑或結構元件，或可破壞DNA或重要的細胞機器(cellular machinery)；(2)對某些類型的細胞的表面抗原專一的抗體或對某些腫瘤相關抗原專一的抗體，且上述抗體可介導標的細胞的細胞凋亡、抗體依賴性細胞毒性(ADCC)或補體介導的細胞溶解(CMC)；(3)對某些腫瘤相關抗原專一的抗體，其可和強力細胞毒性藥物複合；(4)免疫調節性細胞介素，如干擾素-α (interferon-α，IFN-α)、介白素-2 (IL-2)或IFN-γ，其能夠活化免疫系統以對抗惡性細胞；(5)標的至B、T淋巴細胞某些細胞表面標記的抗體，譬如抗CD20抗體—立妥昔單抗(rituximab)；(6)標的至生長因子受體的抗體，譬如抗HER2/Neu抗體—曲妥珠單抗以及抗EGFR抗體—西妥昔單抗(cetuximab)；(7)標的至血管內皮生長因子-A (VEGF-A)以抑制血管新生的抗體，譬如貝伐單抗(bevacizumab)；以及(8)結合至免疫檢查點(immune checkpoint)的抗體，譬如抗PD-1 (CD279)抗體—如尼伏魯單抗(nivolumab)、抗PD-L1 (CD274)抗體—如MPDL3280A、抗CTLA4 (CD152)抗體—如伊匹木單抗(ipilimumab)，這類抗體可抑制免疫反應的負向反饋，且能夠讓進行中的免疫反應保持持續活化的狀態。
用來治療癌症以及多種其他疾病的治療劑的療效常常受限於治療劑本身的毒性，因為這些藥劑也可能在正常細胞上發會某種程度的效果。因此，許多治療劑的治療窗口(therapeutic windows)非常有限，而為了要控制藥物的毒性，許多患者僅能接受次優劑量(suboptimal doses)的治療；就藥物療效的角度而言，這種次優劑量無法達到令人滿意的治療效果。
目前本領域正積極研究以抗體藥物複合體的方式來治療這些疾病，採用此種方式時，利用標的抗體來辨識表現腫瘤相關抗原的細胞，且需使標的抗體連同其所攜帶的細胞毒性藥物一起內化進入上述細胞內。此一條件使得抗體藥物複合體的應用受到了限制，因為一個腫瘤內的各個細胞所表現的腫瘤相關抗原密度可能不同；而在治療過程中，目前的抗體藥物複合體可能無法毒殺表現量較低的細胞，而一旦治療停止後，這些細胞就會再次生長。
I 液態腫瘤
I-(i)  以源自於白血球的癌細胞為標的
在所有類型的癌症中，有相當高比例是因淋巴樣與骨髓樣細胞系的細胞發生惡性轉化所衍生的癌症。一般來說，此類腫瘤是擴散性的，而不是固態腫瘤。因此，要標的由白血球衍生的腫瘤時，需要針對個別的腫瘤細胞進行標的。因此，對於由白血球衍生的腫瘤，關鍵之一在於找出腫瘤細胞上表現的細胞表面抗原。
一般可將衍生自白血球細胞(白血球)的腫瘤分成三類：(1)發生在血液與骨髓中的白血病、(2)發生在淋巴系統中的淋巴瘤、以及(3)發生在骨髓許多部分中以及血液中的骨髓瘤。
白血病又有四大類：(1)急性淋巴細胞性白血病(ALL)、(2)慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、(3)急性骨髓性白血病(AML)、以及(4)慢性骨髓性白血病(CML)。然而，隨著檢驗與分析法的進步，又出現的新的白血病類型，譬如目前已知有B細胞CLL、T細胞CLL、B細胞前淋巴細胞性白血病(prolymphocytic leukemia)、多毛細胞白血病(Hairy cell leukemia)以及其他類型。
淋巴瘤則可分為兩類：(1)霍奇金氏淋巴瘤以及(2)非霍奇金氏淋巴瘤。罹患淋巴瘤的患者約有12%是霍奇金氏淋巴瘤患者，而其他則屬於非霍奇金氏淋巴瘤患者。非霍奇金氏淋巴瘤大多是衍生自B細胞，且因此有許多B細胞非霍奇金氏淋巴瘤亞型。其他的非霍奇金氏淋巴瘤則是T細胞淋巴瘤。
骨髓瘤是衍生自可產生抗體的漿細胞，故亦稱為漿細胞瘤。骨髓瘤細胞可見於骨髓中，也可能進入血液循環並在骨頭的許多部分中開始生長，所以骨髓瘤亦稱為多發性骨髓瘤。
雖然白血病、淋巴瘤以及骨髓瘤是衍生自骨髓樣細胞、淋巴樣細胞以及漿細胞，腫瘤類型的診斷卻非常複雜，通常要檢視組織與細胞，並對採樣的腫瘤細胞進行組織學、免疫組織學、型態學以及細胞標記等分析。由於骨髓樣細胞系以及淋巴樣細胞系屬於多能幹細胞，前者可分化成顆粒細胞(如嗜中性白血球(neutrophils)、嗜酸性白血球(eosinophils)和嗜鹼性白血球(basophils))、單核球(monocytes)與巨噬細胞(macrophages)、以及血小板；而後者則可分化為B細胞與T細胞；這些細胞會經過許多分化與成熟步驟，而在任一個分化過程中都可能發生惡性轉化。此外，癌性轉化可能會助長或新增某些性狀，也可能減輕或失去某些性狀。
在先天性與後天性免疫的研究中，要辨別多種白血球細胞與免疫細胞時，常常會運用或必須用到各種表面標記或分化抗原，特別是被指派了分化叢集(cluster of differentiation，CD)編號的標記或抗原。在多數情形中，會使用一組標記來辨識一特定的細胞類型。
在運用抗體來治療源於白血球細胞的癌症時，需要辨識欲標的之腫瘤的表面標記。然而，即便是在經診斷罹患同一類腫瘤的患者間，表面標記的密度也可能有極大的差異。
I-(ii) 衍生自 B 細胞的淋巴性白血病與淋巴瘤上的表面標記
ALL和CLL都不是固態腫瘤。ALL是衍生自淋巴母細胞、前驅B細胞、前驅T細胞或B細胞。ALL是由以下免疫表型亞型所組成：(1)前驅B細胞急性淋巴母細胞性白血病與前驅T細胞急性淋巴母細胞性白血病，前者會表現與B細胞前驅細胞相關的細胞表面標記，而後者則會表現前驅T細胞的標記；(2)伯基特氏淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma)，此種淋巴瘤是衍生自生發中心(germinal center)的B細胞，且會表現與B細胞相關的細胞表面標記；以及(3)急性雙表型白血病(acute biphenotypic lymphoma)，此種白血病會表現淋巴樣以及骨髓樣細胞兩者的標記。
CLL亦稱為B細胞CLL (B-CLL)，因為CLL大多衍生自B細胞。因此，ALL和CLL間在細胞起源上的主要差異為ALL是衍生自淋巴母細胞(淋巴母細胞是B細胞與T細胞間的共同前驅細胞)，而CLL則是衍生自B細胞。一患者體內所有的CLL都是源自於可表現特定VH 與VL 的單一個B細胞。CLL細胞可表現CD19與CD20，且特別是CD5與CD23。
霍奇金氏淋巴瘤的特徵之一是里德-史登堡氏細胞(Reed-Sternberg cells)，此類細胞是衍生自B細胞的多核巨型細胞。基於里德-史登堡氏細胞的型態以及淋巴結生物檢體樣本中反應性細胞浸潤的組成，可將霍奇金氏淋巴瘤分成以下四種亞型：(1)結節硬化型(nodular sclerosing)、(2)混合細胞型(mixed-cellularity)、(3)淋巴細胞優勢型(lymphocyte-rich or lymphocytic predominance)以及(4)淋巴細胞削減型(lymphocyte depleted)。已知霍奇金氏淋巴瘤是衍生自成熟B細胞。隨著免疫表型的不同，霍奇金氏淋巴瘤細胞可表現以下一或多種分化叢集標記：CD15、CD20、CD30、CD79a與CD138。非霍奇金氏淋巴瘤絕大多數是衍生自B細胞。已知有至少14種B-細胞非霍奇金氏淋巴瘤亞型。
B淋巴細胞是抗原-專一抗體的來源，也是後天免疫系統抵抗感染性病原的關鍵之一。然而，B細胞也可能導致多種疾病。B細胞產生不需要的免疫球蛋白會造成自體免疫與過敏性疾病；而當B細胞的增殖失控時則會導致淋巴瘤或白血病。已證實可利用B細胞作為標的，來治療多種自體免疫疾病以及B-細胞系相關的癌症。許多研究採用削減B-細胞的策略來治療B細胞疾病和抗體誘發的疾病，其中有些已取得初步成果或正在積極進行相關試驗。舉例來說，有些治療性抗體可標的到人類B-細胞表面抗原，如CD19、CD20、CD22、CD37、CD79a/CD79b和對同型專一的Ig受體(isotype-specific Ig receptor)。這類抗體中有一些能夠造成B細胞溶解，另外還有一些抗體和細胞毒性藥物複合後會導致B細胞溶解。
多發性骨髓瘤亦稱為漿細胞骨髓瘤，是排在非霍奇金氏淋巴瘤後第二常見的血液疾病，其發生率佔所有癌症的1%，死亡率則佔所有癌症的2%。多發性骨髓瘤會產生大量的骨髓瘤蛋白並佔據骨髓而導致一連串的症狀，包括骨頭疼痛、貧血、腎衰竭、感染以及神經方面的問題。多發性骨髓瘤是衍生自惡性轉化的漿細胞，而漿細胞又是從B淋巴細胞分化而來。然而，多發性骨髓瘤細胞卻不會表現最常見的B細胞標記，如CD19、CD20與CD22等。
目前已有一些實驗性或已核准的療法與藥物可用以治療多發性骨髓瘤；包括皮質類固醇、化療、蛋白酶體抑制劑與免疫調節化合物等。
I-(iii) 以獨特 B 細胞抗原 Igα 、 Igβ 與 migis-δ 作為抗體標的
成組的Igα (CD79a)/Igβ (CD79b)表現在B-細胞系的細胞表面上，以形成B細胞受體(B cell receptor，BCR)複合體。Igα/Igβ是一種異二聚體穿膜蛋白，它是由兩條不同的Igα與Igβ鏈所組成，兩者間以雙硫鍵形成穩定的結構。Igα/Igβ會和BCR形成複合體，而當BCR複合體識別抗原之後，就會產生訊號。在B細胞成熟的發展過程中，在前-B細胞期中就會表現Igα/Igβ，這個時間點比和B-細胞系上表現型態相關的CD20的表現來得早。由於Igα/Igβ是在B細胞上表現，且也會在大多數非霍奇金氏淋巴瘤上表現，本領域已將Igα/Igβ視為使用B細胞削減療法來治療非霍奇金氏淋巴瘤的理想標的。
mIgD與mIgM會共同表現在成熟B細胞的表面上並可作為BCR的一部分。mIgD帶有獨特的migis-δ胜肽區段(27個胺基酸)，這是mIgD膜錨定區段的細胞外部分，且位於CH3區域和穿膜區段之間。某些研究指出migis-δ多肽提供了一種抗原部位，可用以標的表現mIgD的B細胞。此部位僅見於表現mIgD的B細胞，而不會出現在分泌的IgD上。
I-(iv)  T 細胞腫瘤
各種類型的T淋巴細胞藉由其表面分子與分泌因子而介導非常複雜的免疫調節活動，這些免疫調節活動所構成的網絡影響了諸多荷爾蒙性與細胞級免疫功能，包括製造不同類型的抗體、分泌多種細胞介素以及產生細胞毒性T細胞與其他細胞溶解性細胞。許多自體免疫疾病的根源來自T細胞針對自身成分或細胞的異常反應。以第I型糖尿病為例，自體免疫T細胞會攻擊胰臟蘭氏小島中負責產生胰島素的β細胞並導致細胞死亡。破壞性較強的自體免疫疾病主要是由T細胞所造成的，上述疾病如全身性紅斑狼瘡、多發性硬化與發炎性腸症。另外，對於器官或組織移植的排斥反應主要也是由T細胞所造成。
另外還有一些T細胞相關的疾患形式。因此，也有些研究著重於透過調節T細胞活性或移除T細胞來研發藥物。目前在動物模型或人類臨床試驗中，已運用多種針對T細胞表面抗原(包括CD3、CD4、CD8、CD25與CD28)的抗體及其修飾物來治療多種上述人類疾病。有些抗體單獨或和細胞毒性藥物複合後可造成特定類型的目標T細胞溶解。另外則有些抗體可導致T細胞進入閒置、不活動的狀態，而不會溶解細胞。
T淋巴細胞對於調控先天性與後天性免疫反應中多種免疫細胞與多種其他細胞類型非常重要。在針對目標淋巴細胞開發治療藥劑時，以T細胞為標的而成功開發出來的藥劑少於以B細胞為標的的藥物。然而，已研發出越來越多以不同T細胞表面抗原為標的之治療性抗體。可利用針對T細胞表面抗原進行標的之抗體來治療衍生自T細胞的惡性腫瘤。也可以利用抗體來抑制或促進T細胞活性來進行調控。
I-(v)  骨髓性白血病
急性骨髓性白血病(AML)是衍生自骨髓樣幹細胞骨髓性母細胞，此類細胞是成熟顆粒細胞以及單核細胞的前驅細胞。有許多AML亞型都是突變劑所造成的，這些突變劑會導致某些基因區段的轉位或缺失。衍生自不同分化階段的AML細胞會表現一或多種下列表面標記：CD13、CD14、CD15、CD33、CD34、CD36、CD41、CD61、CD64、CD65與CD11c。衍生自早期前驅骨髓樣階段的AML細胞會表現CD34與CD33，這兩種標記分別是多能幹細胞的表面標記以及未成熟骨髓樣細胞的標記。衍生自多種骨髓樣分化階段的AML細胞會表現CD15，這是成熟母髓樣細胞的標記。CML是純系骨髓幹細胞(clonal bone marrow stem cell)疾病，這是由幹細胞或骨髓樣幹細胞的惡性轉化所造成的，此類惡性轉化通常和染色體易位(又稱為費城染色體易位)有關。
II) 固態腫瘤
II-(i) 固態腫瘤與腫瘤相關抗原
相較於正常細胞，不同類型的腫瘤細胞在其細胞表面會大量表現某些抗原。這些抗原稱為腫瘤相關抗原。舉例來說，胰臟癌患者和多種消化道癌症(包括大腸結腸癌、食道癌與肝細胞癌)患者的血清樣本中含有CA19-9抗原(醣類抗原19-9，又稱Sialyl LewisA 抗原)。此類腫瘤細胞會在細胞表面上的細胞外基質表現CA19-9。相似地，卵巢癌、子宮內膜癌、輸卵管癌與其他癌症患者的血清樣本中會有高量的CA125 (醣類抗原125，又稱黏蛋白16)，而這些腫瘤細胞會表現CA125。與細胞表面相關的醣蛋白黏蛋白1 (MUC1)的過度表現通常和結腸癌、乳癌、肺癌和胰臟癌有關。
衍生自神經外胚層的腫瘤與肉瘤會大量表現神經節苷脂GD2，此類腫瘤包括神經母細胞瘤、視網膜母細胞瘤、黑色素瘤、小細胞肺癌、腦瘤，骨肉瘤、橫紋肌肉瘤、兒童與青少年的尤英氏肉瘤(Ewing’s sarcoma)以及纖維肉瘤、平滑肌肉瘤與其他成人的軟組織肉瘤。
雖然正常間皮細胞上也會表現間皮素(mesothelin)，在多種人類癌症患者的腫瘤細胞也會表現間皮素；上述癌症如間皮瘤、胰臟癌、卵巢癌、肺癌與胃癌、膽管癌與三陰性乳癌。
Tn抗原是醣蛋白上的結構成分，其中的N-乙醯半乳胺糖(N-acetylgalactosamine，GalNAc)會透過醣苷鍵而連接到絲胺酸或蘇胺酸而形成O-聚糖。在此類抗原上加入單一個單醣基團即可得到雙醣抗原；譬如以半乳糖取代為(Gal(b1-3)GalNAc)，可得到湯姆森-弗里德里基抗原(Thomsen-Friedenreich antigen，又稱TF抗原或T抗原)；以唾液酸取代為(Neu5Ac(a2-6)GalNAc則得到唾液酸-Tn抗原(STn抗原)。TN與唾液酸通常不會出現在健康的細胞表面，但會出現在癌細胞上。
目前有許多研究著重於以腫瘤相關抗原作為腫瘤標記或免疫療法的標的，這些腫瘤相關抗原包括(1)上皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)，如人類上皮生長因子1 (EGFR或HER1)、HER2、HER3、HER4或其變異株；(2)醣蛋白，如CA19-9 (帶有Sialyl LewisA 抗原)、CA125 (帶有黏蛋白16或MUC 16)、細胞表面相關黏蛋白1 (MUC1)或癌胚抗原、黑色素瘤相關抗原(MAGE)、前列腺專一膜抗原(PSMA)、前列腺幹細胞抗原(PSCA)或間皮素；(3)黏蛋白關聯Tn或唾液酸Tn抗原(Sialyl Tn)；(4)血型Lewis相關LewisY 、Sialyl LewisY 、Sialyl LewisA 或LewisX ；(5)醣神經脂質，如Globo H或階段專一性胚胎抗原(SSEA-4)；或(6)神經節苷脂，如GD2、GD3、GM2、岩藻糖基化GM1或Neu5GcGM3。
II-(ii) 以生長因子、肽類激素與細胞介素作為過度表現受體之細胞的標的劑
許多生長因子、肽類激素與調控性細胞介素可調控人體內一些重要的生理作用。這些物質藉由和不同類型T細胞上的受體互動而發揮作用。其中最重要的是位於器官、身體部位或帶有特定功能受體的器官中的內分泌與外分泌細胞，這些細胞可對生長因子、荷爾蒙或細胞介素做出回應。舉例來說，胰臟的外分泌細胞帶有特定受體，在進食與消化過程中，這些受體可對來自十二指腸與胃部的胰泌素、胃泌素與膽囊收縮素做出反應。
當帶有受體的細胞發生惡性轉化時，腫瘤細胞仍會表現這些受體。事實上，在許多情形中，由於細胞發生某些突變，可能會導致受體大量表現，而在正常細胞中則不會表現如此大量的受體。因此，受影響的細胞會發生惡性轉化。腫瘤細胞上的受體過度表現(譬如在大多數的神經內分泌腫瘤上會表現大量的體抑素受體)以及利用這些受體來進行治療與診斷(譬如放射性顯影)都是相關領域研究的重點之一。神經內分泌腫瘤通常較罕見，但其範圍涵蓋非常多種源自不同細胞的腫瘤，包括胃腸胰神經內分泌腫瘤、甲狀腺腫瘤、默克細胞癌(Merkel cell carcinoma)、腎上腺髓質腫瘤以及許多其他腫瘤。
此一領域的研發方向很多，多項研究證實上皮生長因子受體(EGFR)家族會過度表現在乳癌、肺癌、結腸癌以及多種其他上皮癌(carcinoma)細胞上。舉例來說，對HER2/Neu受體專一的單株抗體—曲妥珠單抗已廣泛地用於治療HER2-陽性乳癌。對EGFR專一的西妥昔單抗則已用於治療轉移性結腸癌、轉移性非小細胞肺癌以及頭頸部癌。小分子抑制劑，諸如吉非替尼(gefitinib)與厄羅替尼(erlotinib)，可以擾亂EGFR中的酪胺酸激酶區域，因此可以用來治療多種類型的癌症。
胰臟癌是最難纏的癌症。雖然胰管上皮細胞僅佔了所有胰臟細胞的10%，但衍生自外分泌細胞的胰腺(胰管或侵略性的)癌佔了各類型胰臟癌中的85%。外分泌細胞可表現肽類激素受體，例如由胃部與十二指腸細胞分泌的胃泌素、胰泌素或膽囊收縮素；上述外分泌細胞會回應這些荷爾蒙，並分泌碳酸氫根離子與消化酵素。針對胰臟癌以及其他許多癌症，可利用CCK與胃泌素受體的過量表現作為放射性顯影標的。目前的研究重點還包括其他荷爾蒙與受體，譬如體抑素與釋放胃泌素的多肽。在這類放射性顯影方法中，會將CCK或胃泌素的多肽類似物和作為放射性核種的螯合基團複合。由於原位或轉移性腫瘤會帶有可表現相應受體的細胞，於顯影過程中，顯影劑會和這些細胞結合。目前也有一些實驗將帶有放射性核種(如177 Lu、90 Yt或111 In)的肽類激素或其類似物用於腫瘤治療。
II-(iii) 以免疫檢查點作為標的
CTLA-4是一種可向下調控免疫系統的蛋白受體。CTLA-4存在於T細胞表面，而當其和帶有CD80 (B7-1)或CD86 (B7-2)等表面抗原的細胞結合時，就無法和負責活化免疫反應的CD28結合，因此可「關閉」免疫反應。對CTLA-4專一的人類IgG1抗體—伊匹木單抗已經核准可用於治療黑色素細胞瘤，目前也有一些臨床試驗將其用於治療其他類型的癌症。由於伊匹木單抗會促進T細胞活性與增殖，已知伊匹木單抗療法會引發一些嚴重且可能致命的免疫副作用。
活化的T細胞表面上會表現PD-1。當PD-1和其配體PD-L1結合後，T細胞會失去活性。這是身體調控免疫系統，以防止過度免疫反應的機制。許多癌細胞會產生PD-L1，且因而使T細胞失效進而使T細胞無法攻擊癌細胞。已有兩種抗PD-1的人類抗體(派姆單抗(pembrolizumab)與尼伏魯單抗)取得上市許可，能夠用於治療對其他藥物沒有反應且無法切除或轉移性的黑色素母細胞瘤與非小細胞肺癌。MPDL3280A也是抗PD-L1抗體，目前正在進行治療三陰性乳癌、轉移性非小細胞肺癌、膀胱癌與腎細胞癌的二期或三期臨床試驗。目前正在研發或進行早期臨床試驗的抗PD-1與抗PD-L1抗體數目也非常多。
許多研究人員也在探索其他標的，以期能夠使失去活性的T細胞再度發揮功用，上述標的譬如經活化T細胞上的OX40、CD137與CD27及其相應的配體，如OX40L、CD137L與帶有CD137抗原的細胞或腫瘤細胞。一般認為這些路徑對T-細胞活化的強度低於CTLA-4與PD-1等路徑。
雖然對PD-1或PD-L1專一的抗體似乎可以用來治療多種癌症，目前的臨床研發顯示這些抗體需要搭配化療、其他抗體或標靶治療。此外，這些抗體也會導致許多嚴重的副作用。本案發明人認為，若可將對免疫檢查點專一的抗體攜帶至標的腫瘤位置，可以達到較佳的療效且副作用也會減少。
II-(iv) 以血管內皮生長因子作為標的
當腫瘤生長時，需要血管內皮生長因子A (VEGF-A)才能進行血管生成作用(angiogenesis)。氧氣與養分的供應、廢棄物排出以及多種其他生理功能都需要血液循環。對VEGF-A專一的抗體(如貝伐單抗)可單獨用於治療某些癌症，或可和化療併用。然而，貝伐單抗會產生多種副作用，包括高血壓以及高出血風險、腸穿孔與壞死性筋膜炎。
II-(v) 以免疫調節細胞介素作為癌症治療劑
在本說明書中，免疫調節細胞介素係指已知能夠刺激或驅動免疫反應的成分。所述的細胞介素包括 (IL-2、IFN-α)、IFN-γ與TNF-α；其中IFN-α是一種較強的T細胞活化物，IFN-α已取得核准可用於治療多毛細胞白血病、與後天免疫不全症候群相關的卡波西氏肉瘤(AIDS-related Kaposi's sarcoma)、濾泡淋巴瘤、慢性骨髓樣白血病以及黑色素母細胞瘤。然而，目前並沒有臨床試驗結果顯示這些免疫調節細胞介素能有效治療固態腫瘤，這主要是因為當全身性給藥時，這些細胞介素的給藥劑量會受限於細胞介素的副作用。一般來說，細胞介素主要會在淋巴樣系統的微環境中作用
第一節 用以治療腫瘤的分子構建體
以廣義的Fc構形來看，可利用免疫球蛋白抗體作為一標的或效應元件的基礎，並將與其搭配的效應或標的元件以scFv區域的形式引入其兩條γ重鏈的C-端。以傳統的「Fc」構形來看，可利用雙鏈IgG.Fc作為分子平台的基礎。每一多肽鏈可和一或兩個標的元件以及一或兩個效應元件融合，使得每一鏈共帶有二至三個元件。具有Fc構形的T-E分子總計可帶有四至六個元件(譬如scFv，生長因子或細胞介素)。在可任選的實施方式中，所述分子構建體的Fc部分亦帶有Fc介導的效應功能，如ADCC和/或補體介導的活化作用。然而在某些其他應用中，不會出現此種Fc介導的效應功能。
本揭示內容的第一態樣是關於一種Fc型分子構建體，其包括直接或間接連接到免疫球蛋白的CH2-CH3區域的至少一對標的元件以及至少一對效應元件。藉由選擇本發明Fc型分子構建體的T-E元件，所述分子構建體可用於治療多種細胞增生疾病，包括液態腫瘤與固態腫瘤。本揭示內容的優點在於，在某些實施方式中，可利用根據本揭示內容多個實施方式所述的接合單元，因而提供了一種簡便的方式能夠控制本發明Fc型分子構建體的細胞毒性藥物負載，下文將分別討論之。
(i) 以抗體作為標的元件並以載藥束作為效應元件的分子構建體
根據本揭示內容某些實施方式，第一對效應元件的每一效應元件為一載藥束，而第一對標的元件的每一標的元件是對細胞表面抗原或腫瘤相關抗原專一的抗體片段。在這些情形中，用以治療腫瘤的Fc型分子構建體的構形如第1A圖的分子構建體1000A或第1B圖的分子構建體1000B所示。如第1A圖所示，效應元件E1 (如載藥束)係連接於成對CH2-CH3區段1010的C-端，而標的元件T1 (在本例中，如scFv)則是連接於成對CH2-CH3區段1010的N-端。根據替代性的實施方式，所述分子構建體1000B (參見第1B圖)中成對的標的元件T1形成了Fab 1030的形式。具體來說，Fab構形1030包含VH -CH1區域1020以及VL -Cκ區域1025，此種Fab構形1030連接於成對CH2-CH3區段1010的N-端，而使得Fc型分子構建體1000A具有IgG構形。在本例中，成對的效應元件E1則連接到成對的CH2-CH3鏈1010的C-端。
在某些實施方式中，CH2-CH3鏈是來自人類免疫球蛋白γ1或γ4。一般來說，當想要發揮Fc介導的功能(如抗體依賴性細胞毒性(ADCC)以及補體介導活性(發炎活化或目標細胞溶解))時，可以選擇γ1。當不想要發揮Fc介導的功能時，可以選用γ4來建構本發明Fc型分子構建體。
可將載藥束製備為本揭示內容某些實施方式所述的接合單元(例如，參見下文第4A圖至第4C圖)。簡單來說，載藥束可包含一中心核、複數個連接臂以及視需要而加入的耦合臂。根據本揭示內容多種實施方式，中心核可以是帶有複數個氨基的化合物或包含複數個離胺酸(K)殘基的多肽。每一 連接臂的一端藉由和化合物核的胺基或多肽核K殘基的氨基側鏈反應而連接於中心核。連接臂的自由端上帶有順丁烯二醯亞胺基，其中每一分子(譬如此處所用的細胞毒性藥物分子，和/或下文所述的TLR促效劑或螯合劑/放射性核種複合物分子)藉由和順丁烯二醯亞胺基反應，以透過連接臂而與中心核連接。根據本揭示內容視需要而實施的實施方式，每一效應元件E1為帶有3至5個細胞毒性分子的載藥束。
當中心核是多肽核的時候，位於中心核N-或C-端的胺基酸殘基可以是半胱胺酸殘基、或可具有疊氮基或炔基。根據某些實施方式，當多肽中心核的末端胺基酸殘基帶有疊氮基時，載藥束可透過所述末端殘基和耦合臂C-端之間發生的SPAAC反應或CuAAC反應，而與耦合臂相連接。或者是，當多肽中心核的末端胺基酸殘基帶有炔基時，載藥束則透過所述末端殘基和耦合臂C-端之間發生的CuAAC反應，而與耦合臂相連接。又或者是，當多肽中心核的末端殘基為半胱胺酸時，或當採用化合物核時，載藥束更包含一第二連接臂。具體來說，第二連接臂的一端藉由和多肽核的半胱胺酸殘基或化合物核中的一個氨基反應，而與中心核相連接。所述第二連接臂的自由端亦帶有炔基、疊氮基、四嗪基或高應力炔基，而使得載藥束的第二連接臂和耦合臂的C-端可透過發生於兩者間的iEDDA反應(對於帶有四嗪基或環辛烯基的耦合臂)、SPAAC(對於帶有疊氮基或環辛炔基的耦合臂)反應或CuAAC反應(對於帶有炔基或疊氮基的耦合臂)，而彼此連接。
根據某些實施方式，本發明用以治療腫瘤的Fc型分子構建體更包含一對多肽延伸段1050 (參見第1A圖與1B圖)，其序列為(G2-4 S)2-8 C。如圖所示，成對的多肽延伸段1050連接到成對CH2-CH3區段1010的C-端。多肽延伸段C-端的半胱胺酸殘基透過硫氫-順丁烯二醯亞胺反應而和耦合臂1055相連接。此外，在將其和效應元件E1 (此處為一載藥束)耦合之前，耦合臂的自由端(即，並未和半胱胺酸殘基相連的一端)經過炔基、疊氮基、高應力炔基或四嗪基的修飾，而使得載藥束可透過iEDDA反應、SPAAC或CUAAC反應而與其相連。
舉例來說，在第1A圖中，效應元件E1 (此處為一載藥束)的第二連接臂1040透過iEDDA反應而連接於CH2-CH3區段1010。第1A圖所示的橢圓點1045代表耦合臂1055與效應元件E1的第二連接臂1040間，因為iEDDA反應而產生的化學鍵結。當可理解，iEDDA反應通常發生於四嗪基與環辛烯基(如反式-環辛烯(transcyclooctene，TCO)基)之間。
或者是，在第1B圖中，效應元件E1透過SPAAC反應而連接到CH2-CH3區段1010。第1B圖所示的菱形點1045代表耦合臂1055與效應元件E1的第二連接臂1040間，因為SPAAC反應而產生的化學鍵結。具體來說，SPAAC反應通常發生在疊氮基與高應力炔基(如，環辛炔基，包括：二苯并環辛炔(dibenzocyclooctyne，DBCO)、二氟化環辛炔(difluorinated cyclooctyne，DIFO)、二環壬炔(bicyclononyne，BCN)以及二苯并環辛炔(dibenzocyclooctyne，DICO)基)之間。
根據本揭示內容某些視需要而實施的實施方式，用以治療腫瘤的Fc型分子構建體可進一步包含第二對標的元件。舉例來說，第1C圖所示的分子構建體1000C包含第一對標的元件T1、第二對標的元件T2、以及效應元件E1。具體來說，標的元件T1連接到成對CH2-CH3區段1010的N-端，而第二對標的元件T2則是以串聯雙抗體(tandem)或雙抗體(diabody)的構形連接到T1的N-端，因而形成了連接於成對CH2-CH3區段1010的N-端的雙專一性scFv。此外，成對的效應元件E1則是藉由耦合臂1055與效應元件E1的第二連接臂1040間的iEDDA反應，連接到CH2-CH3區段1010。然而，本揭示內容不限於此；事實上，在其他實施方式中，效應元件E1也可透過SPAAC反應或CuAAC反應而連接於CH2-CH3區段1010。
根據本揭示內容多種實施方式，具有第1A圖至第1C圖所示構形的Fc型分子構建體可用於治療液態腫瘤。舉例來說，此種Fc型分子構建體的載藥束包含複數個細胞毒性藥物分子，譬如奧里斯他汀、美登木素、阿黴素、卡奇黴素以及喜樹鹼。此外，此種Fc型分子構建體的標的元件可以是對細胞表面抗原專一的抗體片段(譬如scFv、Fab或與其相似者)；上述細胞表面抗原係選自CD5、CD19、CD20、CD22、CD23、CD30、CD33、CD34、CD37、CD38、CD43、CD78、CD79a、CD79b、CD138與CD319所組成的群組。
根據本揭示內容其他實施方式，具有第1A圖至第1C圖所示構形的Fc型分子構建體可用於治療固態腫瘤，包括惡性和/或轉移性固態腫瘤。在某些例子中，適合作為效應元件的載藥束可包含複數個細胞毒性藥物分子，譬如奧里斯他汀、美登木素、阿黴素、卡奇黴素以及喜樹鹼。或者是，所述載藥束可包含複數個TLR促效劑分子，譬如LPS、單磷醯脂A、莫托立莫特、咪喹莫特、瑞西喹莫特、加德喹莫特、CpG DON、脂磷壁酸、β-葡聚糖以及酵母聚糖。又或者是，載藥束可包含複數個由螯合劑(如DOTA、NOTA、NODA與DTPA)和放射性核種(譬如90 Y、111 In與177 Lu)所形成的複合分子。另一方面，此種Fc型分子構建體的標的元件可以是對HER1、HER2、HER3、HER4、CA19-9、CA125、CEA、MUC1、MAGE、PSMA、PSCA、黏蛋白關聯Tn、唾液酸Tn抗原、Globo H、SSEA-4、神經節苷脂GD2或EpCAM專一的抗體片段(譬如scFv、Fab或與其相似者)。
當Fc型分子構建體具有第二對標的元件時，第一對效應元件的效應元件是包含複數個細胞毒性藥物分子的載藥束，而第一與第二對標的元件分別是對HER2專一的scFv以及對HER1專一的scFv。
(ii) 以生長因子 / 肽類激素作為標的元件並以載藥束作為效應元件的分子構建體
根據本揭示內容某些實施方式，第一對效應元件的每一效應元件為載藥束，而第一對標的元件的每一標的元件則是生長因子或肽類激素。在這些情形中，適用於治療固態腫瘤(包括惡性和/或轉移性固態腫瘤)的Fc型分子構建體可具有第2圖所示的分子構建體1100的構形。如第2圖所示，效應元件E1連接到成對CH2-CH3區段1110的C-端，而標的元件T1則連接到成對CH2-CH3區段1110的N-端。
本發明分子構建體1100和與Fc型分子構建體1000A或1000B相似；亦即，更包含一對多肽延伸段1150；此多肽延伸段連接於成對CH2-CH3區段1110的C-端，且其序列為(G2-4 S)2-8 C。相似地，為了便於和載藥束耦合，多肽延伸段中的半胱胺酸殘基可和耦合臂1155連接，而載藥束就可以透過發生於其間的iEDDA反應、SPAAC反應或CuAAC反應而和耦合臂1155相連接(請參見上文第1A圖的相關說明)。舉例來說，在第2圖中，效應元件E1的耦合臂1140透過iEDDA反應而和耦合臂1155相連接，其中橢圓點1145代表耦合臂1155和效應元件E1之間因為iEDDA反應而產生的化學鍵結。然而，本揭示內容不限於此；事實上，在其他實施方式中，效應元件E1可透過SPAAC反應或CuAAC反應而連接到CH2-CH3區段1110。
當可理解，上文第第(i)點關於Fc型分子構建體的Fc區域與載藥束的相關描述亦適用於本態樣，為求簡潔，此處不再贅述。
由於本發明分子構建體(譬如所述分子構建體1100)可用於治療固態腫瘤，根據某些實施方式，適合作為效應元件的載藥束可包含複數個細胞毒性藥物分子，譬如奧里斯他汀、美登木素、阿黴素、卡奇黴素以及喜樹鹼。或者是，所述載藥束可包含複數個TLR促效劑分子，譬如LPS、單磷醯脂A、莫托立莫特、咪喹莫特、瑞西喹莫特、加德喹莫特、CpG DON、脂磷壁酸、β-葡聚糖以及酵母聚糖。又或者是，載藥束可包含複數個由螯合劑(如DOTA、NOTA、NODA與DTPA)和放射性核種(譬如90 Y、111 In與177 Lu)所形成的複合分子。
另一方面，可採用生長因子作為標的元件，以搭配上述載藥束；適當的生長因子包括但不限於：EGF、突變型EGF、表皮調節素、HB-EGF、VEGF-A、bFGF與HGF。肽類激素也可作為標的元件，並與上述載藥束搭配使用；肽類激素的例示性實施例包括CCK、體抑素與TSH。
(iii) 以生長因子 / 肽類激素作為標的元件並以抗體作為效應元件的分子構建體
根據本揭示內容其他實施方式，Fc型分子構建體可包含一抗體片段以作為效應元件，並包含一生長因子或肽類激素以作為標的元件。此種分子構建體可用於治療固態腫瘤(包括惡性和/或轉移性固態腫瘤)。
在第3A圖繪示的Fc型分子構建體1200A中，成對的效應元件E1 (此處為scFv)連接到成對CH2-CH3區段1210的N-端，而成對的標的元件T1則是連接到成對CH2-CH3區段1210的C-端。至於第3B圖所示的Fc型分子構建體1200B，其效應元件E1與標的元件T1則分別連接到成對CH2-CH3區段1210的C-端與N-端。
當可理解，根據本揭示內容某些實施方式，所述的抗體片段也可採用Fab的形式。舉例來說，第3C圖的Fc型分子構建體1200C包含一對效應元件E1，其形式為Fab構形1230。具體來說，Fab構形1230包含VH -CH1區域1220以及VL -Cκ區域1225；Fab構形1230係連接於成對CH2-CH3區段1210的N-端，而使得Fc型分子構建體1200C具有IgG構形。在本例中，成對的標的元件T1則連接到成對的CH2-CH3鏈1210的C-端。
根據本揭示內容多種實施方式，適合作為效應元件的抗體片段是對細胞表面抗原具有專一性的抗體片段；上述細胞表面抗原如PD-1、PD-L1、CTLA-4、CD3、CD16a、CD28與CD134。另一類的效應元件是對生長因子專一的抗體片段；所述生長因子如EGF、突變型EGF、表皮調節素、HB-EGF、VEGF-A、bFGF與HGF。也可使用對半抗原專一的抗體片段作為效應元件；例示性的半抗原包括DNP、TNP、丹磺醯、盤尼西林、對胺苯甲酸以及如序列編號：20所示的多肽。
至於適用於本系列Fc型分子構建體的標的元件，其可以是如EGF、突變型EGF、表皮調節素、HB-EGF、VEGF-A、bFGF與HGF等生長因子。或者是，所述標的元件可以是如CCK、體抑素與TSH等肽類激素。
本發明的精髓在於採用特定標的與效應元件的組合或搭配。在較佳的實施方式中，所述分子構建體採用了Fc融合構形。本發明所屬技術領域具有通常知識者當可想見，亦可利用其他分子平台來連接此處提出的標的與效應元件的組合；上述分子平台諸如多肽、蛋白質(譬如白蛋白)、聚醣、聚乙二醇以及其他類型的聚合物，只要其能夠作為連接多個分子元件的結構基礎即可。
第二節 用以治療腫瘤的分子構建體的用途
藉由選擇一或多種效應元件與標的元件，上文第一節所述的Fc型分子構建體可用於治療多種腫瘤，包括液態腫瘤與固態腫瘤。有鑑於此，本揭示內容亦涵蓋了利用第一節所述的Fc型分子構建體來治療腫瘤的方法。根據本揭示內容的實施方式，所述方法包含對需要治療的個體投予有效量的本發明Fc型分子構建體或包含此Fc型分子構建體的藥物。
對於以腫瘤細胞為標的對象的分子構建體標，譬如以EGFR、HER2/neu或CD20為目標者，其藥理學目的在於使表現這些抗原的目標細胞溶解。一般來說，此類分子構建體較佳應具有Fc介導的功能，如ADCC或補體介導的細胞溶解。然而，若可將所述分子構建體和能夠引發強烈免疫破壞作用的效應元件(如對CD3或CD16a專一的scFv)或具有免疫調節功能的效應元件(如對PD-1、PD-L1、CTLA-4專一的scFv)相連，此種Fc介導的功能可能就並非關鍵。IgG分子兩條重鏈的末端可以接上由細胞毒性分子、LPS分子或與放射性核種複合的螯合基形成的載藥束。
人類IgG1的Fc區域(成對的CH2-CH3區域)可介導抗體依賴性細胞毒性(ADCC)以及補體介導的細胞溶解(CMC)。本發明體認到，可以維持此類Fc介導的功能，並提升抗體結合的結合親和力。已知腫瘤中會有一定比例的細胞對於標的抗原的表現量較低，故對標靶治療抗體產生抗性。舉例來說，曲妥珠單抗或立妥昔單抗可能無法殺滅乳癌腫瘤中HER2/Neu表現量較低的細胞或B細胞淋巴瘤中CD20表現量較低的細胞。本發明提出的分子耦合物具有明顯較高的結合親和力，因此能夠有效率且強力地和這些細胞結合，並能介導這些細胞的細胞溶解機制。
針對不同亞型的IgG的各種Fc受體位於不同類別的效應細胞上，這些受體搭配特定IgG亞型能夠介導不同類別的免疫機制。FcγRI (CD64)、FcγRIIa (CD32)與FcγRIIIb (CD16b)位於巨噬細胞、嗜中性白血球以及嗜酸性白血球上，並可介導覆有IgG的粒子與微生物的吞噬作用(phagocytosis)。FcγRIIIa (CD16a)主要位於NK細胞上，也會出現在某些組織中的巨噬細胞上，其可介導ADCC。當NK細胞上的FcγRIIIa和IgG1結合後並聚集成群，NK細胞會分泌細胞毒性顆粒與致死因子，以使得與IgG結合的細胞溶解。根據本發明較佳的實施方式，可將對FcγRIIIa專一的scFv抗體接合到多臂接合物上，再將其和針對多種抗原目標(如CD20、EGFR)以及表現於多種細胞標的上的腫瘤相關抗原的scFv耦接。近來有研究指出，對HER2/Neu專一的Fab雙專一性抗體以及對FcγRIIIa專一的Fab，對於HER2抗原表現量較低的腫瘤細胞的細胞溶解效果優於抗HER2/Neu抗體(曲妥珠單抗)。本發明所述的分子構建體對於HER2/Neu兩者皆有較佳的結合親和力，且對於HER2/Neu表現量非常低的腫瘤細胞應有較佳的細胞溶解活性。
對於液態腫瘤(如B淋巴細胞衍生的淋巴瘤或白血病、漿細胞瘤、多發性骨髓瘤、衍生自T細胞的淋巴瘤或白血病以及骨髓性白血病)的治療，所使用的Fc型分子構建體可利用包含複數個細胞毒性藥物分子的載藥束作為效應元件，並利用對適當細胞表面抗原專一的抗體片段作為標的元件。
根據某些實施方式，本發明方法可用以治療B淋巴細胞衍生的淋巴瘤或白血病。在這些情形中，所用的Fc型分子構建體是以人類B淋巴細胞上的細胞表面抗原為標的；譬如CD5、CD19、CD20、CD22、CD23、CD30、CD37、CD43、CD79a與CD79b。
在其他實施方式中，本發明方法可用以治療如漿細胞瘤或多發性骨髓瘤等液態腫瘤；在這些情形中，可利用人類漿細胞上的細胞表面抗原(包括CD38、CD78、CD138與CD319)作為標的。
或者是，本發明方法可用以治療衍生自T細胞的淋巴瘤或白血病，所用的分子構建體可以利用人類T細胞上的細胞表面抗原(如CD5、CD30與CD43)作為標的。
根據某些實施方式，當用於治療骨髓性白血病時，所使用的分子構建體可以利用人類骨髓細胞系淋巴細胞上的細胞表面抗原(如CD33與CD34)作為標的。
根據某些實施方式，本發明Fc型分子構建體使用載藥束作為效應元件，並使用對適當腫瘤相關抗原專一的抗體片段作為標的元件，其可用以治療例如以下的固態腫瘤：黑色素瘤、食道癌、胃癌、腦瘤、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、乳癌、胰臟癌、結腸癌、大腸癌、大腸結腸癌、腎癌、肝細胞癌、卵巢癌、前列腺癌、甲狀腺癌、睪丸癌以及頭頸部鱗狀細胞癌。在這些實施方式中，所述分子構建體可具有下文第三節所述的構形。
根據某些視需要而實施的實施方式，用以治療固態腫瘤的方法更包含以下步驟：在投予所述分子構建體之前，對所述個體進行血液透析程序，上述程序使用對一或多種腫瘤相關抗原專一的抗體片段，以移除從腫瘤進入個體血液循環中的腫瘤相關抗原。
或者是，用以治療固態腫瘤的方法所用的Fc型分子構建體是以載藥束或對細胞表面抗原、生長因子或半抗原專一的抗體片段作為效應元件，並以生長因子或肽類激素作為標的元件。此種分子構建體的例示性實施例包括上文第一節第(iii)點所述者。可利用這些分子構建體來治療的固態腫瘤有黑色素瘤、食道癌、胃癌、腦瘤、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、乳癌、胰臟癌、結腸癌、大腸癌、大腸結腸癌、腎癌、肝細胞癌、卵巢癌、前列腺癌、甲狀腺癌、睪丸癌或頭頸部鱗狀細胞癌。
根據某些實施方式，所述分子構建體使用含細胞毒性藥物分子的載藥束作為效應元件，並使用EGF或其突變株作為標的元件。
根據其他實施方式，所述分子構建體使用對CD3、CD16a、PD-1或VEGF專一的scFv作為效應元件，並使用EGF或其突變株作為標的元件。
根據某些實施方式，所述的效應元件是對半抗原專一的抗體片段。在這些情形中，上述方法更包含以下步驟：在投予所述分子構建體之後，對該個體投予以相同半抗原標記的免疫調節效應物。舉例來說，上述免疫調節效應物可以是IFN-α、IL-2、TNF-α、IFN-γ、以及對PD-1、PD-L1、CTLA-4或CD3專一的IgG抗體。
在某些實施方式中，成對的CH2-CH3區段是衍生自人類IgG重鏈γ1，且所述分子構建體使用含細胞毒性藥物分子或LPS分子的載藥束作為效應元件，並使用EGF或其突變株、表皮調節素、HB-EGF、VEGF-A、FGF、HGF、CCK、體抑素或TSH作為標的元件。
在某些實施方式中，成對的CH2-CH3區段是衍生自人類IgG重鏈γ1，且所述分子構建體使用對人類CD3、CD16a、PD-1，PD-L1或VEGF-A專一的scFv作為效應元件，並使用EGF或其突變株、表皮調節素、HB-EGF、VEGF-A、FGF、HGF、CCK、體抑素或TSH作為標的元件。
第三節 基於多臂接合物的載藥束
本揭示內容的多個實施方式是關於帶有複數個藥物分子的接合單元；為了便於瞭解本發明，在本說明書中有時將此種接合單元稱為「載藥束」。欲建構用以治療腫瘤的T-E構建體時，可將此種載藥束(作為效應元件)與上文第一節所述的Fc型分子構建體(作為標的元件)複合。
根據本發明實施態樣，所述接合單元是一種多臂接合物，其包含：(1)一中心核，其包含2-15個離胺酸(K)殘基；以及(2) 2-15個連接臂，分別連接於中心核的各K殘基。本發明中心核的特徵在於其N-或C-端帶有疊氮基、炔基、四嗪基或高應力炔基。
在製備本發明接合單元時，將一端帶有N-羥基琥珀醯亞胺(N-hydroxysuccinimydil，NHS)基且另一端帶有順丁烯二醯亞胺基的PEG鏈連接到K殘基上；具體來說，利用上述NHS基和K殘基上的氨基形成醯胺鍵，進而將PEG鏈連接到中心核上。在本揭示內容中，將連接到K殘基之後的PEG鏈稱為連接臂，此連接臂的自由端帶有順丁烯二醯亞胺基。
根據本揭示內容的實施方式，上述中心核是多肽核，其長度為8-120個胺基酸殘基，且包含2至15個離胺酸(K)殘基，其中每一個K殘基和下一個K殘基之間以一填充序列隔開。
根據本揭示內容的實施方式，填充序列包含甘胺酸(glycine，G)與與絲胺酸(serine，S)殘基；在較佳的情形中，填充序列是由選自G、S及其組合的2-15個殘基所組成。舉例來說，填充序列可以是： GS、 GGS、 GSG、 GGGS (序列編號：1), GSGS (序列編號：2)、 GGSG (序列編號：3)、 GSGGS (序列編號：4)、 SGGSG (序列編號：5)、 GGGGS (序列編號：6)、 GGSGGS (序列編號：7)、 GGSGGSG (序列編號：8)、 SGSGGSGS (序列編號：9)、 GSGGSGSGS (序列編號：10)、 SGGSGGSGSG (序列編號：11)、 GGSGGSGGSGS (序列編號：12)、 SGGSGGSGSGGS (序列編號：13)、 GGGGSGGSGGGGS (序列編號：14)、 GGGSGSGSGSGGGS (序列編號：15)或 SGSGGGGGSGGSGSG (序列編號：16)。
兩個離胺酸殘基之間的填充序列可以由各種長度和組合的甘胺酸與絲胺酸殘基所組成。在離胺酸殘基數目較少的多肽核中，可使用較長的填充序列；在離胺酸殘基數目較多的多肽核中，則可使用較短的填充序列。除了甘胺酸與絲胺酸之外，可在填充序列中加入親水性胺基酸殘基，如天冬胺酸與組胺酸。除了由甘胺酸與絲胺酸殘基組成的填充序列之外，也可使用其他填充序列，譬如可使用常見人類血清蛋白(如白蛋白與免疫球蛋白)中的可撓性、可溶性環。
根據本揭示內容某些較佳的實施方式，中心核包含2-15個單元的G1-5 SK序列。或者是，此多肽核的序列為(GSK)2-15 ；即，多肽包含至少兩個連續的GSK單元。舉例來說，本發明中心核可包含下列胺基酸序列： Ac-CGGSGGSGGSKGSGSK (序列編號：17)、 Ac-CGGSGGSGGSKGSGSKGSK (序列編號：18)或 Ac-CGSKGSKGSKGSKGSKGSKGSKGSKGSKGSK (序列編號：19)， 其中Ac代表乙醯基。
根據本揭示內容某些實施方式，中心核是序列為(Xaa -K)n 的多肽核，其中Xaa 是聚乙二醇化胺基酸，其具有2至12個乙二醇(EG)重複單元，且n是2至15的整數。
如上文所述，本發明中心核的特徵在於其N-或C-端帶有疊氮基、炔基、四嗪基或高應力炔基。根據本揭示內容某些實施方式，本發明中心核的N-或C-端胺基酸殘基帶有疊氮基或炔基。帶有疊氮基的胺基酸殘基可以是：L-疊氮高丙胺酸(AHA)、4-疊氮-L-苯丙胺酸、4-疊氮-D-苯丙胺酸、3-疊氮-L-丙胺酸、3-疊氮-D-丙胺酸、4-疊氮-L-高丙胺酸、4-疊氮-D-高丙胺酸、5-疊氮-L-烏胺酸、5-疊氮-D-烏胺酸、6-疊氮-L-離胺酸或6-疊氮-D-離胺酸。舉例來說，本發明中心核可具有以下序列： Ac-(GSK)2-7 -(G2-4 S)1-8 -AAH 、 Ac-AAH -(SG2-4 )1-8 -(GSK)2-7 、 Ac-AAH -(SG2-4 )0-7 -(GSK)2-6 -(G2-4 S)1-8 -C、 Ac-C-(SG2-4 )0-7 -(GSK)2-6 -(G2-4 S)1-8 -AAH 、 Ac-K-(Xaa 2-12 -K)2-4 -Xaa 2-12 -AAH 、 Ac-AAH -Xaa 2-12 -K-(Xaa 2-12 -K)2-4 、 Ac-AAH -Xaa 2-12 -K-(Xaa 2-12 -K)1-3 -Xaa 2-12 -C或 Ac-C-Xaa 2-12 -K-(Xaa 2-12 -K)1-3 -Xaa 2-12 -AAH ， 其中Xaa 是帶有所述數目的EG重複單元的聚乙二醇化胺基酸，Ac代表乙醯基，而AAH 代表AHA殘基。
帶有炔基的胺基酸的例子包括，但不限於：L-高炔丙基甘胺酸(L-HPG)、D-高炔丙基甘胺酸(D-HPG)、或β-高炔丙基甘胺酸(β-HPG)。在本例中，本發明中心核可具有以下序列： Ac-(GSK)2-7 -(G2-4 S)1-8 -GHP 、 Ac-GHP -(SG2-4 )1-8 -(GSK)2-7 、 Ac-GHP -(SG2-4 )0-7 -(GSK)2-6 -(G2-4 S)1-8 -C、 Ac-C-(SG2-4 )0-7 -(GSK)2-6 -(G2-4 S)1-8 -GHP 、 Ac-K-(Xaa 2-12 -K)2-4 -Xaa 2-12 -GHP 、 Ac-GHP -Xaa 2-12 -K-(Xaa 2-12 -K)2-4 、 Ac-GHP -Xaa 2-12 -K-(Xaa 2-12 -K)1-3 -Xaa 2-12 -C或 Ac-C-Xaa 2-12 -K-(Xaa 2-12 -K)1-3 -Xaa 2-12 -GHP ， 其中Xaa 是帶有所述數目的EG重複單元的聚乙二醇化胺基酸，Ac代表乙醯基，而GHP 代表HPG殘基。
當可理解，目前已可透過商業管道取得多種側鏈帶有疊氮基或炔基的胺基酸與聚乙二醇化胺基酸，這些胺基酸可以帶有保護基團，如叔-丁氧羰基(tert-butyloxycarbonyl，t-boc)或茀甲氧羰基(9-fluorenylmethyloxycarbonyl，Fmoc)，故可輕易用於固態多肽合成。
根據本揭示內容某些實驗例，所用的中心核可包含以下序列： Ac-GHP GGSGGSGGSKGSGSK (序列編號：21)、 Ac-GHP GGSGGSGGSKGSGSKGSK (序列編號：22)、 Ac-AAH GGSGGSGGSKGSGSKGSK (序列編號：23)、 Ac-GHP GGSGGSGGSKGSGSKGSGSC (序列編號：24)、 Ac-C-Xaa 2 -K-Xaa 2 -K-Xaa 2 -K (序列編號：25)或 Ac-C-Xaa 6 -K-Xaa 6 -K-Xaa 6 -K-Xaa 6 -K-Xaa 6 -K (序列編號：26)、 其中Xaa 為帶有指定數目的EG重複單元的聚乙二醇化胺基酸、Ac代表乙醯基、AAH 代表AHA殘基且GHP 代表HPG殘基。
或者是，本發明中心核可和耦合臂連接，此耦合臂的自由端(即，未和中心核連接的一端)帶有一官能基(如，疊氮基、炔基、四嗪基或高應力炔基)。在這些情形中，本發明中心核的N-或C-端為半胱胺酸殘基。在製備與耦合臂連接的接合單元時，將一端帶有順丁烯二醯亞胺基且另一端帶有上述官能基的PEG鏈與上述半胱胺酸殘基連接；具體來說，可透過PEG鏈的順丁烯二醯亞胺基和半胱胺酸殘基的硫氫基之間的硫氫-順丁烯二醯亞胺反應將兩者連接在一起。在本揭示內容中，連接到中心核末端半胱胺酸殘基上的PEG鏈稱為耦合臂，且其自由端帶有上述官能基。
在較佳的情形中，耦合臂的自由端帶有四嗪基或高應力炔基。這些耦合臂具有2-12個EG單元。根據本揭示內容的實施方式，上述四嗪基為1,2,3,4-四嗪、1,2,3,5-四嗪1,2,4,5-四嗪或其衍生物。高應力炔基的實施例包括，但不限於：反式-環辛烯(TCO)、二苯并環辛炔(DBCO)、二氟化環辛炔(DIFO)、二環壬炔(BCN)與二苯并環辛炔(DICO)。根據本揭示內容某些實施方式，四嗪基為6-甲基-四嗪。
根據多種實施例，與耦合臂連接後的中心核包括，但不限於： Ac-(GSK)2-7 -(G2-4 S)1-8 -C-Xaa 2-12 -四嗪、 Ac-(GSK)2-7 -(G2-4 S)1-8 -C-Xaa 2-12 -高應力炔基、 Ac-K-(Xaa 2-12 -K)2-4 -Xaa 2-12 -C-Xaa 2-12 -四嗪、 Ac-K-(Xaa 2-12 -K)2-4 -Xaa 2-12 -C-Xaa 2-12 -高應力炔基、 四嗪基-Xaa 2-12 -C(Ac)-(SG2-4 )1-8 -(GSK)2-7 、 高應力炔基-Xaa 2-12 -C(Ac)-(SG2-4 )1-8 -(GSK)2-7 、 四嗪基-Xaa 2-12 -C(Ac)-Xaa 2-12 -K-(Xaa 2-12 -K)2-4 以及 高應力炔基-Xaa 2-12 -C(Ac)-Xaa 2-12 -K-(Xaa 2-12 -K)2-4 。
或者是，中心核的一端帶有疊氮基或炔基，而另一端則接上了帶有四嗪基或高應力炔基的耦合臂，茲舉例如下： Ac-AAH -(SG2-4 )0-7 -(GSK)2-6 -(G2-4 S)1-8 -C-Xaa 2-12 -四嗪、 Ac-AAH -(SG2-4 )0-7 -(GSK)2-6 -(G2-4 S)1-8 -C-Xaa 2-12 -高應力炔基、 四嗪基-Xaa 2-12 -C(Ac)-(SG2-4 )0-7 -(GSK)2-6 -(G2-4 S)1-8 -AAH 、 高應力炔基-Xaa 2-12 -C(Ac)-(SG2-4 )0-7 -(GSK)2-6 -(G2-4 S)1-8 -AAH 、 Ac-AAH -Xaa 2-12 -K-(Xaa 2-12 -K)1-3 -Xaa 2-12 -C-Xaa 2-12 -四嗪、 Ac-AAH -Xaa 2-12 -K-(Xaa 2-12 -K)1-3 -Xaa 2-12 -C-Xaa 2-12 -高應力炔基、 四嗪基-Xaa 2-12 -C(Ac)-Xaa 2-12 -K-(Xaa 2-12 -K)1-3 -Xaa 2-12 -AAH 、 高應力炔基-Xaa 2-12 -C(Ac)-Xaa 2-12 -K-(Xaa 2-12 -K)1-3 -Xaa 2-12 -AAH 、 Ac-GHP -(SG2-4 )0-7 -(GSK)2-6 -(G2-4 S)1-8 -C-Xaa 2-12 -四嗪、 Ac-GHP -(SG2-4 )0-7 -(GSK)2-6 -(G2-4 S)1-8 -C-Xaa 2-12 -高應力炔基、 四嗪基-Xaa 2-12 -C(Ac)-(SG2-4 )0-7 -(GSK)2-6 -(G2-4 S)1-8 -GHP 、 高應力炔基-Xaa 2-12 -C(AC)-(SG2-4 )0-7 -(GSK)2-6 -(G2-4 S)1-8 -GHP 、 Ac-GHP -Xaa 2-12 -K-(Xaa 2-12 -K)1-3 -Xaa 2-12 -C-Xaa 2-12 -四嗪、 Ac-GHP -Xaa 2-12 -K-(Xaa 2-12 -K)1-3 -Xaa 2-12 -C-Xaa 2-12 -高應力炔基、 四嗪基-Xaa 2-12 -C(Ac)-Xaa 2-12 -K-(Xaa 2-12 -K)1-3 -Xaa 2-12 -GHP 以及 高應力炔基-Xaa 2-12 -C(Ac)-Xaa 2-12 -K-(Xaa 2-12 -K)1-3 -Xaa 2-12 -GHP 。
也可利用重組技術來合成上述多肽，再利用細菌或哺乳類宿主細胞來表現指定的基因區段。如果多肽核的離胺酸殘基數目較多且長度較長，利用重組蛋白技術較佳。這是因為當多肽長度變長時，使用固態合成法發生錯誤的機率會增加，且其純度和/或產量會降低。要運用細菌或哺乳類宿主細胞來產生多肽核時，可在兩個K殘基之間插入長度為2至20個胺基酸殘基的填充序列。此外，由於AHA和HPG並非可由遺傳密碼子編碼的天然胺基酸，這些重組多肽的N-端或C-端殘基可以是半胱胺酸。在表現出重組蛋白並將其純化之後，可使末端的半胱胺酸殘基和短的雙功交聯物反應；上述雙功交聯物的一端帶有可和半胱胺酸殘基的SH基反應的順丁烯二醯亞胺基，另一端則帶有炔基、疊氮基、四嗪基或高應力炔基。
相較於利用常規胺基酸(如甘胺酸與絲胺酸殘基)來合成多肽核，使用聚乙二醇化胺基酸來合成多肽核的步驟較少。此外，可採用不同長度的聚乙二醇化胺基酸(即，帶有不同EG重複單元者)，一方面可提供可撓性與水溶性，另一方面亦可在相鄰的離胺酸殘基之間提供間隔。除了聚乙二醇化胺基酸之外，中心核也可包含人工胺基酸，如D-構形胺基酸、高胺基酸、N-甲基胺基酸等。在較佳的情形中，可使用帶有不同長度聚乙二醇(PEG)的聚乙二醇化胺基酸來建構中心核，因為胺基分子中所含的PEG部分可提供構形上的可撓性，並在用以接合的基團間提供了適當的間隔，還可以提升其水溶性；另外，一般來說，PEG的免疫源性較低。合成帶有聚乙二醇化胺基酸的中心核的方法和合成常規多肽相似。
視需要，本發明中心核可更帶有一乙醯基，以保護位於N端的胺基酸殘基，進而提升其穩定性。
當可理解，連接於中心核的連接臂的數目主要取決於連接於中心核中所含離胺酸殘基的數目。由於本發明中心核包含至少兩個離胺酸殘基，所述接合單元可包含複數個連接臂。
參照第4A圖。如圖所示，接合單元10A包含中心核11a，其帶有一個HPG (GHP )殘基以及四個離胺酸(K)殘基，其間分別以填充序列(以下各圖式中以「···」表示)隔開。HPG殘基和K殘基之間或任兩個K殘基之間的填充序列可以是相同或不同的胺基酸序列。在本實施例中，四個連接臂20a-20d藉由NHS基和離胺酸殘基的氨基間所形成的醯胺鍵而連接到各個離胺酸殘基。當可理解，本說明書所述的多種接合單元間可能有一些共通的特徵，因此針對上述接合單元10A或下述各接合單元所述的某些或全部特徵可能也適用於下文提出的實施例，除非其明顯有悖於特定實施方式的脈絡。為求簡潔，下文可能不會重複說明這些共通特徵。
第4B圖繪示了根據本揭示內容另一種實施方式的接合單元10B。中心核11b有一個半胱胺酸(C)殘基以及六個離胺酸(K)殘基，這些殘基之間分別以填充序列隔開。在本實施例中，接合單元10B包含連接到各個離胺酸殘基的六個連接臂20a-20f。根據本揭示內容的實施方式，連接臂是具有2至20個EG重複單元的PEG鏈。
接合單元10B與第4A圖的接合單元10A不同之處在於接合單元10B更包含耦合臂60。如上文所述，可利用一端帶有順丁烯二醯亞胺基而另一端帶有一特殊官能基的PEG鏈來形成耦合臂60。如此一來，耦合臂60可透過硫氫–順丁烯二醯亞胺反應而連接到中心核11b的半胱胺酸殘基。在本實施例中，耦合臂60的自由端帶有的特殊官能基是四嗪基72。根據本揭示內容的實施方式，耦合臂是具有2至12個EG重複單元的PEG鏈。
當需要在標的部位釋放效應元件時，可以在連接臂中加入一個可裂解鍵；上述裂解鍵可經酸/鹼水解、還原/氧化或酵素作用而裂解。舉例來說，可利用NHS-PEG2-20 -S-S-順丁烯二醯亞胺作為此處所述的耦合臂，這是一種可裂解PEG鏈，其中的S-S雙硫鍵會被緩慢的還原，而NHS基可用來和中心核的氨基接合，進而將PEG鏈連接到中心核上。另外，可利用疊氮基、炔基、四嗪基或高應力炔基來取代位在連接臂自由端的順丁烯二醯亞胺基。
根據本揭示內容某些實施方式，連接到中心核的K殘基的連接臂在自由端帶有順丁烯二醯亞胺基。如此一來，帶有硫氫基的功能性元件(譬如、標的元件或效應元件)就可以和連接臂的順丁烯二醯亞胺基進行硫氫–順丁烯二醯亞胺反應，進而將功能性元件連接於連接臂。為了方便說明，和連接臂相連的功能性元件稱為第一元件。當可理解，本發明接合單元可攜帶的第一元件的數目取決於中心核的K殘基的數目(且因此，取決於連接臂的數目)。因此，本發明所屬技術領域具有通常知識者可調整所述接合單元中第一元件的數目，以達到所欲的標的或治療效果。
第4C圖繪示了帶有第一元件的接合單元10C。除了下文所述的特徵之外，第4C圖和第4B圖非常相似。首先，中心核11d帶有五個K殘基，且因此有五個連接臂20a-20e分別與這些K殘基相連。其次，接合單元10C有五個第一元件30a-30e，分別連接於各個連接臂20a-20e。如下文所述，視需要加入的四嗪基72使得所述接合單元可和一額外的功能性元件或另一個分子構建體(如上文所述者)複合。具體來說，第一元件為用以治療腫瘤的效應元件，如載藥束。適用於本揭示內容實施方式的藥物分子包括但不限於上文參照第一節所述者。
為了要進一步增加所需的效果(如，療效)，本發明接合單元除了第一元件之外還可以包含第二元件。在本揭示內容可任選的實施方式中，第一元件是效應元件，而第二元件可以是另一種效應元件，兩者可以累加地或加乘地作用，亦可獨立作用。或者是，第一元件是效應元件，而第二元件則能夠改善接合單元的藥動學特性，如水溶性、清除作用(clearance)、半衰期(half-life)與生物可用率(bioavailability)。
根據本揭示內容的替代性實施方式，第一元件是效應元件且第二元件是標的元件。舉例來說，在治療自體免疫疾病時，本發明接合單元可包含一個標的元件與複數個效應元件，其中標的元件能夠專一標的到組織相關細胞外基質蛋白(譬如α-蛋白聚糖、第I型膠原蛋白、第II型膠原蛋白、第III型膠原蛋白、第V型膠原蛋白、第VII型膠原蛋白、第IX型膠原蛋白與第XI型膠原蛋白)，而效應元件可在病灶部位發揮治療效果。
在結構上，第二元件可連接到中心核N-或C-端的疊氮基、炔基、四嗪基或高應力炔基。具體來說，當有需要時，可將第二元件和短PEG鏈(較佳為具有2至12個EG重複單元)複合，之後再將其連接到位在N-或C-端的帶有疊氮基或炔基的胺基酸殘基(譬如AHA殘基或HPG殘基)。或者是，當有需要時，可將第二元件和短PEG鏈複合，且之後再將其連接於中心核的耦合臂。
根據本揭示內容某些實施方式，中心核的N-或C-端是帶有疊氮基(譬如AHA殘基)的胺基酸殘基；且因此，帶有炔基的第二元件就可以透過「銅催化的疊氮化物-炔羥環加成反應」(copper catalyzed azide-alkyne cycloaddition，CuAAC，又稱為鏈接反應(click reaction)而連接到中心核的N-或C-端。根據本揭示內容其他實施方式，上述中心核的N-或C-端是帶有炔基(譬如HPG殘基)的胺基酸殘基；而帶有疊氮基的第二元件就可以透過CuAAC反應而連接到中心核的N-或C-端。CuAAC反應如反應式1所示。＜＜ 反應式 1  CuAAC 反應 ＞＞
CuAAC反應會產生1,5-二取代1,2,3-三唑(1,5-disubstituted 1,2,3-triazole)。炔基和疊氮基之間的反應選擇性極高，且天然生物分子不含炔基和疊氮基。再者，上述反應快速且對pH值不敏感。已知除了利用一價銅(如溴化銅(I)或碘化銅(I))來催化鏈接反應之外，較佳可使用二價銅和還原劑(如抗壞血酸鈉)的混合物以在反應系統中原位(in situ )產生一價銅。或者是，可利用不含銅的反應，將第二元件連接到中心核的N-或C-端，此反應可利用環戊烷基環戊二烯基氯化釕複合物(pentamethylcyclopentadienyl ruthenium chloride complex)作為催化劑，以催化疊氮基-炔環加成反應。
第4D圖繪示根據本發明實施例的另一種接合單元10D，其攜帶了複數個第一元件與一個第二元件。在本實施例中，中心核11c包含一個HPG (GHP )殘基以及五個離胺酸(K)殘基。五個連接臂20a-20e分別連接到中心核11c的五個K殘基；而五個第一元件30a-30e則透過硫氫-順丁烯二醯亞胺反應連接到各個連接臂20a-20e。除了第一元件之外，所述接合單元10D更包含一個第二元件，即Fc型分子構建體50(如上文第一節所述者)，其係連接於短PEG鏈62的一端。在和中心核11c複合之前，短PEG鏈62的另一端帶有疊氮基。如此一來，疊氮基可和帶有炔基的HPG殘基進行CuAAC反應，而使得Fc型分子構建體50連接至中心核11c。第4D圖所示的實心圓點40代表HPG殘基和疊氮基間因為CuAAC反應所形成的化學鍵結。
或者是，第二元件透過耦合臂而和中心核連接。根據本揭示內容某些實施方式，耦合臂帶有四嗪基，因此可透過逆電子需求狄爾斯-阿德(inverse electron demand Diels–Alder，iEDDA)反應(參見反應式2)而有效率地連接到帶有TCO的第二元件。根據本揭示內容其他實施方式，耦合臂帶有TCO基，而第二元件可帶有四嗪基，故兩者可透過iEDDA反應而互相連接。相較於位在端點的炔基，iEDDA反應中所採用的應變環辛烯基的活化能明顯較低，且因此iEDDA反應不需使用額外催化劑。＜＜ 反應式 2  iEDDA 反應 ＞＞
接著參照第4E圖，其中接合單元10E的中心核11d包含位於N端的半胱胺酸(C)殘基和五個離胺酸(K)殘基。如第4E圖所示，這五個連接臂20a-20e分別連接到中心核11d的五個K殘基，而五個第一元件30a-30e則透過硫氫-順丁烯二醯亞胺反應而分別連接到五個連接臂20a-20e。半胱胺酸殘基連接於耦合臂60；在接上Fc型分子構建體50之前，耦合臂60的自由端帶有四嗪基或TCO基。在本實施例中，第二元件50可和帶有相應TCO或四嗪基的短PEG鏈62連接，再透過iEDDA反應而連接到耦合臂60。第4E圖所示的橢圓點70代表耦合臂60和短PEG鏈62間進行iEDDA反應所產生的化學鍵結。
根據本揭示內容其他實施方式，在和第二元件接合之前，耦合臂帶有疊氮基；當第二元件和自由端帶有高應力炔基(譬如DBCO、DIFO、BCN或DICO基)的短PEG鏈連接時，耦合臂和第二元件就可以透過SPAAC反應(參見反應式3)而連接，反之亦然。＜＜ 反應式 3  SPAAC 反應 ＞＞
接著參照第4F圖，其中接合單元10F的結構和第4E圖的接合單元10E相近，不同之處在於耦合臂60帶有疊氮基或高應力炔基(譬如DBCO、DIFO、BCN或DICO基)而不是四嗪基或TCO基。因此，第二元件50要和帶有相應高應力炔基(譬如DBCO、DIFO、BCN或DICO)或疊氮基的短PEG鏈62連接，而使得Fc型分子構建體50和耦合臂60可透過SPAAC反應而連接。第4F圖所示的菱形點90代表耦合臂60與短PEG鏈62之間因為SPAAC反應所形成的化學鍵結。
聚乙二醇化(PEGylation)是將PEG鏈附接或連接到分子(如，藥物或蛋白)的方法。聚乙二醇化可以改善多種重要的藥理學特性，譬如提升水溶性、延長生命週期以及減少蛋白質分解降解。根據本揭示內容一實施方式，第二元件是PEG鏈，其分子量約為20,000到50,000道耳頓。
第4G圖繪示了另一種例示性的接合單元10G，其中五個第一元件30分別透過連接臂20連接到離胺酸殘基，且中心核11e的HPG (GHP )殘基透過CuAAC反應與PEG鏈80連接。第4G圖所示的實心圓點40代表AHA殘基與PEG鏈80間因為CuAAC反應所形成的化學鍵結。
第4H圖是本揭示內容的另一種實施例，接合單元10H的中心核11d的N-端是與耦合臂60相連接的半胱胺酸殘基。可透過iEDDA反應而有效率地將PEG鏈80連接到耦合臂60。接合單元10H的橢圓點70代表耦合臂60與PEG鏈80之間因為iEDDA反應所形成的化學鍵結。
第4I圖是本發明接合單元的另一種實施例，所示的接合單元10I結構與第4H圖的接合單元10H相似，不同之處在於PEG鏈80是透過SPAAC反應連接到耦合臂60。第4I圖所繪示的菱形點90代表耦合臂60與PEG鏈80之間因為SPAAC反應所形成的化學鍵結。
根據本揭示內容某些實施方式，除了第一與第二元件之外，本發明接合單元更包含第三元件。在此種實施例中，中心核的N-或C-端是帶有疊氮基或炔基的胺基酸殘基，而另一端是半胱胺酸殘基。中心核的離胺酸殘基分別和連接臂相連接，且每一條連接臂的自由端帶有順丁烯二醯亞胺基；而中心核的半胱胺酸殘基則和自由端帶有四嗪基或高應力炔基的耦合臂相連。如此一來，第一元件可透過硫氫-順丁烯二醯亞胺反應連接於連接臂，而第二元件則可透過iEDDA反應和耦合臂相連接。另外，第三元件則是透過CuAAC反應或SPAAC反應而連接到帶有疊氮基或炔基的末端胺基酸殘基。
第一、第二與第三元件可以彼此相同或不同，端視設計者的需求。根據本揭示內容一實施方式，所述接合單元可帶有兩種不同的標的元件與一種效應元件、兩種不同的效應元件與一種標的元件；或是一種標的元件、一種效應元件和一種能夠提升接合單元藥動學特性(水溶性、清除作用、半衰期與生物可用率)的元件。
接著參照第4J圖的接合單元10J，其中心核11f的N-端為HPG (GHP )殘基，而C-端是半胱胺酸殘基。連接臂20和耦合臂60分別連接到中心核11f的離胺酸(K)殘基以及半胱胺酸(C)殘基。此外，五個第一元件30分別連接到五個連接臂20，第二元件(即，PEG鏈)80和耦合臂60連接，而第三元件(即，Fc型分子構建體) 50則透過短PEG鏈62連接到HPG殘基。實心圓點40代表HPG殘基和短PEG鏈62之間因為CuAAC反應所形成的化學鍵結；而橢圓點70代表耦合臂60與PEG鏈80之間因為iEDDA反應所形成的化學鍵結。
第4K圖繪示了本揭示內容的另一種實施方式；接合單元10K的結構與第4J圖所示的接合單元10J相似，不同之處在於短PEG鏈62是透過SPAAC反應而連接到HPG殘基，而非透過iEDDA反應。第4K圖的菱形點90代表短PEG鏈62和HPG殘基之間因為SPAAC反應所形成的化學鍵結。
在本揭示內容較佳的實施方式中，連接臂的自由端帶有順丁烯二醯亞胺基，以便和帶有硫氫基的第一元件透過硫氫-順丁烯二醯亞胺反應而連接。此外，多肽核的一端可以是半胱胺酸殘基或帶有疊氮基或炔基的胺基酸殘基，以供和耦合臂接合，進而連接第二元件。
除了上文所述的述接合單元之外，此處亦揭示了另一種接合單元，其使用化合物(而非多肽)作為中心核。具體來說，所述化合物可以是苯-1,3,5-三胺、2-(胺甲基)-2-甲基丙烷-1,3-二胺、三(2-胺乙基)胺、苯-1,2,4,5-四胺、3,3’,5,5’-四胺-1,1’-聯苯、四(2-胺乙基)甲烷、四(乙胺)肼、N,N,N’,N’,-四(胺乙基)乙二胺、苯-1,2,3,4,5,6-六胺、1-N,1-N,3-N,3-N,5-N,5-N-六(甲胺)-苯-1,3,5-三胺、1-N,1-N,2-N,2-N,4-N,4-N,5-N,5-N,-八(甲胺)-苯-1,2,4,5-三胺、苯-1,2,3,4,5,6-六胺或N,N-二[(1-胺基-3,3-二胺乙基)戊基]甲烷二胺。上述化合物均帶有至少三個相等或對稱構形的氨基。因此，當一化合物的其中一個氨基與一耦合臂複合時，所有由該化合物形成的分子都具有相同的構形。
此處所述的化合物和上文所述的接合單元相似，都分別包含複數個氨基，且因此，可將複數個帶有NHS基的PEG鏈透過氨基和NHS基之間所形成的醯胺鍵而連接到化合物核上；利用此方式接上來的PEG鏈即為本案所述的連接臂，此連接臂的自由端帶有順丁烯二醯亞胺基。同時，所述化合物核有至少一個氨基連接到另一PEG鏈，此PEG鏈一端帶有NHS基且另一端帶有一特殊官能基(如，疊氮基、炔基、四嗪基或高應力炔基)；化合物核與此種PEG鏈同樣透過醯胺鍵結來連接，接上後的此一PEG鏈稱為耦合臂，其自由端帶有上述特殊官能基。
因此，可透過硫氫-順丁烯二醯亞胺反應將一種元件連接到連接臂上，並透過CuAAC反應、SPAAC反應或iEDDA反應將另一種元件連接到耦合臂上，進而將兩種不同的元件分別連接到連接臂和/或耦合臂上。
根據本揭示內容某些實施方式，連接臂是具有2至20個EG重複單元的PEG鏈，而耦合臂則是具有2至12個EG重複單元的PEG鏈。在一實施方式中，連接臂和耦合臂都具有12個EG重複單元，其中在接合前，耦合臂的一端是NHS基，而另一端是炔基。
反應式4、5分別繪示了中心核和連接臂之間以及中心核和耦合臂之間的連接關係，其中NHS代表NHS酯類、Mal代表順丁烯二醯亞胺基、azide代表疊氮基且alkyne代表炔基。＜＜ 反應式 4 將分別帶有順丁烯二醯亞胺基與疊氮基的連接臂與耦合臂連接到中心核 ＞＞ ＜＜ 反應式 5 將分別帶有順丁烯二醯亞胺基與炔基的連接臂與耦合臂連接到中心核 ＞＞
作為中心核的化合物應有多對稱且有相同方向的胺基，其理由如下：當利用其中一個胺基來連接一個雙功接合臂(即，一端帶有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)酯基且另一端帶有炔基、疊氮基、四嗪基或高應力炔基)時，可以得到均質的產物(也就是接有耦合臂的中心核，且耦合臂帶有炔基、疊氮基、四嗪基或高應力炔基)，故可輕易將其純化。之後可利用此種產物來製備多臂接合單元，將剩餘的胺基都接上自由端帶有順丁烯二醯亞胺基或其他耦合基團的連接臂。若帶有多個胺基的化合物是不對稱的化合物，此種化合物和雙功接合臂/耦合臂接合後所得到的產物就不是均質的產物。
可進一步修飾上述對稱化合物，以使得其可和更多的連接臂/耦合臂連接。舉例來說，四(2-胺乙基)甲烷是可從一般化合物合成或商業購得的化合物，可利用此種化合物來建構連接了四個連接臂/耦合臂的接合單元。將四(2-胺乙基)甲烷和雙硫代琥珀醯亞胺辛二酸酯(bis(sulfosuccinimidyl)suberate)進行縮合反應，所得到的產物是N,N-二[(1-胺基-3,3-二胺乙基)戊基]甲烷二胺，此一產物有兩個四(2-胺乙基)甲烷單元，並可用以連接六個連接臂/耦合臂。此處所述的接合單元分別帶有三個、四個與六個連接臂/耦合臂，對於建構具有標的/效應分子的聯合接合物(joint-linker)來說，上述連接臂/耦合臂的數目應相當充足。
當可理解，連接臂和/或耦合臂的數目還有與其連接的元件數目都取決於中心核中所含的氨基數目。在某些較佳的實施方式中，連接臂/耦合臂的數目還有與其連接的元件數目是1到7個。
參照第5圖，其中繪示了帶有四個氨基的苯-1,2,4,5-四胺；其中三個氨基分別和連接臂20相連，而另一個氨基則和耦合臂60相連，且耦合臂60的自由端帶有疊氮基。之後，透過硫氫-順丁烯二醯亞胺反應將三個第一元件30分別連接到三個連接臂20上，並透過CuAAC反應將一個Fc型分子構建體50連接到耦合臂60上。第5圖中所示的實心圓點40代表耦合臂60與Fc型分子構建體50之間因為CuAAC反應所形成的化學鍵結。
本發明所屬技術領域具有通常知識者當可想見，可對上述結構進行各種修改。舉例來說，在連接臂的自由端可採用順丁烯二醯亞胺基以外的官能基(譬如疊氮基、炔基、四嗪基或高應力炔基)，以便透過CuAAC、iEDDA或SPAAC反應來連接第一元件。此外，半胱胺酸殘基(或帶有疊氮基或炔基的胺基酸殘基) 可以位在多肽核N-或C-端以外的位置。更有甚者，可在多肽核中加入二或更多個上述殘基，以供接合多個耦合臂，並進一步連接多個第二元件。
與其他治療性構建體相較之下，本發明分子構建體至少有以下三種優點： (1)可以視需求和/或用途來調整功能性元件的數目。根據不同用途的需求，本發明接合單元可包含二種元件(即，第一與第二元件)或三種元件(即，第一、第二與第三元件)，上述需求包括欲治療的疾病、接合單元的給藥方法、接合單元所攜抗體的結合力與親和力等等。舉例來說，當要將接合單元直接投遞到特定組織/器官(譬如，治療眼睛)時，可以只使用一種元件作為效應元件，而不需加入標的元件。然而，當透過周邊給藥途徑來投遞接合單元時，譬如經口服、腸胃道、鼻腔、局部或黏膜給藥、或以肌肉內、靜脈內或腹膜內注射，本發明接合單元就需要包含標的元件，以便將接合單元專一地標的到病灶部位；此外，接合單元還應該包含效應元件，以便在病灶部位發揮治療效果。為了要提高接合單元的標的或治療效果或提升其穩定度，本發明接合單元還可進一步包含第三元件；所述的第三元件可以是第二種標的元件、第二種效應元件或PEG鏈。 (2)第一元件是以成束(bundle)的形式存在。如本揭示內容第一節所述，第一元件的數目取決於中心核所包含的離胺酸殘基的數目。如果中心核中離胺酸殘基的數目是2到15，則每一接合單元可帶有至少兩個第一元件。因此，相較於傳統治療性構建體僅能攜帶單一個分子(譬如單一個細胞毒性藥物或抗體分子)，本發明接合單元可同時提供更多的功能性元件(不論是標的元件或效應元件)，進而可大幅提升療效。
實驗例
實驗例 1 ：合成作為多肽核的多肽 1 ( 序列編號： 17) 、多肽 2 ( 序列編號： 18) 以及多肽 3 ( 序列編號： 19) ，並將半胱胺酸殘基的 SH 基和順丁烯二醯亞胺 -PEG3 - 反式 - 環辛烯 (TCO) 複合以作為耦合臂
利用固態多肽合成法來合成多肽1-3，並利用反相高效液相層析(HPLC)純化以得到至少95%的純度。反相HPLC使用Shimadzu Nexera-i LC-2040C 3D HPLC系統與Kromasil 100-5C18管柱(250 mm X 4.6 mm；5 μm)，流動相使用乙腈與0.1%三氟乙酸、乙腈線性梯度為10%至45%、15分鐘，流速1.0 mL/min、管柱溫度25°C。
將純化的多肽溶解於100 mM磷酸鈉緩衝液(pH 7.0；含50 mM NaCl與5 mM EDTA)，最終濃度2 mM。利用1 mM三(2-羧乙基)膦(tris (2-carboxyethyl)phosphine，簡稱TCEP)使溶解的多肽還原，反應溫度25°C、時間2小時。將多肽和順丁烯二醯亞胺-PEG3 -TCO (Conju-probe Inc., San Diego, USA)以1/10的比例混合，並在pH 7.0、25°C的條件下反應24小時，以使半胱胺酸殘基的SH基和順丁烯二醯亞胺-PEG3 -TCO複合而帶有功能性連接基團TCO。利用反相HPLC來純化TCO-多肽複合物；使用Supelco C18管柱(250 mm X 10 mm；5 μm)，流動相使用乙腈與0.1%三氟乙酸、線性梯度為0%至100%乙腈、30分鐘，流速1.0 mL/min、管柱溫度25°C。第6圖為純化TCO-多肽2的反相HPLC溶析曲線圖；圖中以箭頭標示TCO-多肽2的峰值。
以MALDI-TOF質譜分析來確認所合成的三種TCO-多肽(如下所示)。由中央研究院分子生物研究所(臺灣臺北)的核心設施單位進行質譜分析。以Bruker Autoflex III MALDI-TOF/TOF質譜分析儀(Bruker Daltonics, Bremen, Germany)進行測量。
所述TCO-多肽1 (如下所示)的分子量為1,807.0道耳頓。
所述TCO-多肽2 (如下所示)的分子量為2,078.9道耳頓。
所述TCO-多肽3 (如下所示)的分子量為3,380.8道耳頓。
實驗例 2 ：合成作為多肽核的多肽 1 以及多肽 2 ，並將半胱胺酸殘基的 SH 基和順丁烯二醯亞胺 -PEG4 - 四嗪複合以作為耦合臂
利用實驗例1所製備的多肽1與多肽2，將其溶解於100 mM磷酸鈉緩衝液(pH 7.0；含50 mM NaCl與5 mM EDTA)，最終濃度2 mM。利用1 mM TCEP使溶解的多肽還原，反應溫度25°C、時間2小時。將多肽和順丁烯二醯亞胺-PEG4 -四嗪(Conju-probe Inc.)以1/5的比例混合，並在pH 7.0、4°C的條件下反應24小時，以使半胱胺酸殘基的SH基和順丁烯二醯亞胺-PEG4 -四嗪複合而帶有功能性連接基團四嗪基。利用反相HPLC來純化四嗪基-多肽複合物；使用Supelco C18管柱(250 mm X 10 mm；5 μm)，流動相使用乙腈與0.1%三氟乙酸、線性梯度為0%至100%乙腈、30分鐘，流速1.0 mL/min、管柱溫度25°C。利用上文實施例所述的方式，以MALDI-TOF質譜分析來確認所合成的兩種四嗪基-多肽。
所述四嗪基-多肽1 (如下所示)的分子量為1,912.7道耳頓。
所述四嗪基-多肽2 (如下所示)的分子量為2,185.2道耳頓。
實驗例 3 ：合成作為多肽核的多肽 1 以及多肽 2 ，並將半胱胺酸殘基的 SH 基和順丁烯二醯亞胺 -PEG5 -DBCO 複合以作為耦合臂
利用上文實驗例所製備的多肽1與多肽2，將其溶解於100 mM磷酸鈉緩衝液(pH 7.0；含50 mM NaCl與5 mM EDTA)，最終濃度2 mM。利用1 mM TCEP使溶解的多肽還原，反應溫度25°C、時間2小時。
將多肽和順丁烯二醯亞胺-PEG5 -DBCO (Conju-probe Inc.)以1/5的比例混合，並在pH 7.0、室溫下反應24小時，以使半胱胺酸殘基的SH基和順丁烯二醯亞胺-PEG5 -DBCO複合而帶有功能性連接基團DBCO基。利用反相HPLC來純化DBCO-多肽複合物；使用Supelco C18管柱(250 mm X 10 mm；5 μm)，流動相使用乙腈與0.1%三氟乙酸、線性梯度為0%至100%乙腈、30分鐘，流速1.0 mL/min、管柱溫度25°C。利用上文實施例所述的方式，以MALDI-TOF質譜分析來確認所合成的兩種DBCO-多肽。
所述DBCO-多肽1 (如下所示)的分子量為1,941.8道耳頓。
所述DBCO-多肽2 (如下所示)的分子量為2,213.9道耳頓。
實驗例 4 ：合成作為多肽中心核的多肽 4 ( 序列編號： 21) 、多肽 5 ( 序列編號： 22) 以及多肽 6 ( 序列編號： 23)
利用固態多肽合成法來合成多肽4-6，並利用反相HPLC純化以得到至少95%的純度。高炔丙基甘胺酸(GHP )與疊氮高丙胺酸(AAH )等非天然胺基酸分別帶有炔基與疊氮基。反相HPLC使用Supelco C18管柱(250 mm X 4.6 mm；5 μm)，流動相使用乙腈與0.1%三氟乙酸、乙腈線性梯度為2%至90%、30分鐘，流速1.0 mL/min、管柱溫度25°C。
利用MALDI-TOF質譜分析來確認所合成的三種多肽。所述多肽4 (Ac-GHP GGSGGSGGSKGSGSK；序列編號：21)的分子量為1,317.0道耳頓；所述多肽5 (Ac-GHP GGSGGSGGSKGSGSKGSK；序列編號：22)的分子量為1,589.9道耳頓；而所述多肽6 (Ac-AAH GGSGGSGGSKGSGSKGSK；序列編號：23)的分子量為1,634.66道耳頓。
實驗例 5 ：合成作為多肽核的多肽 7 ( 序列編號： 24) ，並將半胱胺酸殘基的 SH 基和順丁烯二醯亞胺 -PEG3 -TCO 或順丁烯二醯亞胺 -PEG4 - 四嗪複合以作為耦合臂
利用上文實驗例所述方法合成多肽7 (Ac-GHP GGSGGSGGSKGSGSKGSGSC；序列編號：24)，並使其和交聯物複合。利用MALDI-TOF來確認所合成的TCO-多肽7與四嗪基-多肽7。
所述TCO-多肽7 (如下所示)的分子量為1,736.78道耳頓。
所述四嗪基-多肽7 (如下所示)的分子量為1,820.62道耳頓。
實驗例 6 ：合成作為多肽核的多肽 8 ( 序列編號： 25) ，並將半胱胺酸殘基的 SH 基和順丁烯二醯亞胺 -PEG3 -TCO 、順丁烯二醯亞胺 -PEG4 - 四嗪或順丁烯二醯亞胺 -PEG5 -DBCO 複合以作為耦合臂
利用固態多肽合成法來合成多肽8 (Ac-C-Xaa -K-Xaa -K-Xaa -K；其中Xaa 為具有兩個EG單元的聚乙二醇化胺基酸；序列編號：25)，並利用反相HPLC純化以得到至少95%的純度。反相HPLC使用Kromasil 100-5C18管柱(250 mm X 4.6 mm；5 μm)，流動相使用水與0.1% TFA、乙腈線性梯度為10%至40%、12分鐘，流速1.0 mL/min、管柱溫度25°C。
利用質譜分析ESI-MS來確認所合成的多肽8。利用LTQ Orbitrap XL ETD質譜分析儀(Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA)並搭配標準ESI離子源，進行高解析度與高質量精度實驗。由中央研究院(臺灣臺北)基因體研究中心的核心設施單位進行質譜ESI-TOF分析。所合成的多肽樣本在981.9有較強的分子離子峰，與[M-H]- 相應，表示PEG化多肽的實際分子量為983.0道耳頓。
利用上文實驗例的方法使多肽和交聯物複合，並利用質譜分析ESI-MS來確認產物(如下所示，其中Xaa2 表示有兩個EG單元的聚乙二醇化胺基酸)。
所述TCO-多肽8 (如下所示)的分子量為1,478.87道耳頓。
所述四嗪基-多肽8 (如下所示)的分子量為1,584.92道耳頓。
本發明DBCO-多肽8 (如下所示)的分子量為1,613.8道耳頓
實驗例 7 ：合成作為多肽核的多肽 9 ( 序列編號： 26) ，並將半胱胺酸殘基的 SH 基和順丁烯二醯亞胺 -PEG3 -TCO 複合以作為耦合臂
利用上文實驗例所述的方法製備多肽9 (Ac-C-Xaa -K-Xaa -K-Xaa -K-Xaa -K-Xaa -K；其中Xaa 為具有六個EG單元的聚乙二醇化胺基酸；序列編號：26)。利用質譜分析ESI-MS來確認所合成的多肽9。所合成的多肽樣本在828.0有較強的分子離子峰，與[M+3H]3+ 相應，表示PEG化多肽的實際分子量為2,480.7道耳頓。
利用上文實驗例的方法使多肽和交聯物複合，並利用質譜分析ESI-MS來確認產物。所述TCO-多肽9 (如下所示)的分子量為2,975道耳頓。
實驗例 8 ：將 NHS-PEG12 - 順丁烯二醯亞胺和 TCO- 多肽 1 及 TCO- 多肽 2 的氨基複合以合成接合單元
將兩個PEG12 -順丁烯二醯亞胺連接臂連接到多肽核TCO-多肽1；並將三個PEG12 -順丁烯二醯亞胺連接臂連接到多肽核TCO-多肽2。交聯物NHS-PEG12 -順丁烯二醯亞胺(琥珀醯亞胺-[(N-順丁烯二醯亞胺基-丙醯胺基)-十二乙二醇]酯；succinimidyl-[(N-maleimido-propionamido)-dodecaethyleneglycol] ester)係購自Thermo Fisher Scientific Inc. (Waltham, USA)。根據製造商的指示進行接合；將帶有離胺酸殘基的多肽溶解於複合緩衝液(磷酸鹽緩衝液(PBS)、pH 7.5)中，濃度100 mM。在溶解的多肽中加入NHS-PEG12 -順丁烯二醯亞胺交聯物，最終濃度1 mM (比起0.1 mM多肽溶液，莫耳數過量20倍)。使反應混合物在室溫下反應18小時。以反相HPLC純化(PEG12 -順丁烯二醯亞胺)-(TCO-多肽1)複合物與(PEG12 -順丁烯二醯亞胺)-(TCO-多肽2)複合物；使用Supelco C18管柱(250 mm X 4.6 mm；5 μm)，流動相使用乙腈與0.1%三氟乙酸、線性梯度為0%至100%乙腈、30分鐘，流速1.0 mL/min、管柱溫度25°C。第7圖為純化(PEG12 -順丁烯二醯亞胺)-(TCO-多肽2)複合物的反相HPLC曲線圖；圖中以箭頭標示峰值。
利用MALDI-TOF質譜分析來確認所合成的(PEG12 -順丁烯二醯亞胺)-(TCO-多肽1)複合物以及(PEG12 -順丁烯二醯亞胺)-(TCO-多肽2)複合物。
上述(PEG12 -順丁烯二醯亞胺)-(TCO-多肽1)複合物 (如下所示)是一種採用多肽核的接合單元，其上接有一條帶有TCO基的耦合臂以及兩條帶有順丁烯二醯亞胺基的PEG連接臂。MALDI-TOF質譜分析的結果顯示上述分子構建體的分子量為3,330.7道耳頓。
上述(PEG12 -順丁烯二醯亞胺)-(TCO-多肽2)複合物 (如下所示)是一種採用多肽核的接合單元，其上接有一條帶有TCO基的耦合臂以及三條帶有順丁烯二醯亞胺基的PEG連接臂。第8圖為其MALDI-TOF質譜分析結果，圖中資料顯示上述分子構建體的分子量為4,332道耳頓((ESI-TOF) m/z (z=4): [M + 4H]+ ; calculated for C185 H313 N31 O83 S1 1083.7829; found 1083.7833), corresponding to [M+Na]+ )。
實驗例 9 ：將 NHS-PEG12 - 順丁烯二醯亞胺和四嗪基 - 多肽 2 以及 DBCO- 多肽 1 的氨基複合以合成接合單元
將三條PEG12 -順丁烯二醯亞胺連接臂連接到四嗪基-多肽2，並將兩條上述連接臂連接到DBCO-多肽1。NHS-PEG12 -順丁烯二醯亞胺和多肽中心核中離胺酸殘基的氨基之間的複合方式，如上文實驗例所述，並利用MALDI-TOF質譜分析來確認產物。
如下所示，上述(PEG12 -順丁烯二醯亞胺)-(四嗪基-多肽2)複合物上接有一條帶有四嗪基的耦合臂以及三條帶有順丁烯二醯亞胺基的PEG連接臂。第9A圖為MALDI-TOF質譜分析結果，圖中顯示此構建體的分子量為4,461道耳頓。
如下所示，上述(PEG12 -順丁烯二醯亞胺)-(DBCO-多肽1)複合物上接有一條帶有DBCO基的連接臂以及兩條帶有順丁烯二醯亞胺基的PEG連接臂。第9B圖為MALDI-TOF質譜分析結果，結果顯示此構建體的分子量為3,445道耳頓。
實驗例 10 ：將 NHS-PEG12 - 順丁烯二醯亞胺和多肽 4 至多肽 6 的氨基複合以合成接合單元
將兩條PEG12 -順丁烯二醯亞胺連接臂連接到多肽4；並將三條PEG12 -順丁烯二醯亞胺連接臂連接到多肽5與多肽6。NHS-PEG12 -順丁烯二醯亞胺和多肽中心核中離胺酸殘基的氨基之間的複合方式，如上文實驗例所述，並利用MALDI-TOF質譜分析來確認產物。
上述(PEG12 -順丁烯二醯亞胺)-多肽4複合物(如下所示)的分子量為2,817.3道耳頓；此分子構建體是以多肽核為基礎的接合單元，帶有一個炔基與兩條帶有順丁烯二醯亞胺基的PEG連接臂。
上述(PEG12 -順丁烯二醯亞胺)-多肽5複合物(如下所示)的分子量為3,839.2道耳頓；此分子構建體是以多肽核為基礎的接合單元，帶有一個炔基與三條帶有順丁烯二醯亞胺基的PEG連接臂。
(PEG12 -順丁烯二醯亞胺)-多肽6複合物(如下所示)的分子量為3,811.5道耳頓；此分子構建體是以多肽核為基礎的接合單元，帶有一個疊氮基與三條帶有順丁烯二醯亞胺基的PEG連接臂。
實驗例 11 ：將 NHS-PEG12 - 順丁烯二醯亞胺和 TCO- 多肽 7 以及四嗪基 - 多肽 7 的氨基複合以合成接合單元
將兩條PEG12 -順丁烯二醯亞胺連接臂接到上文實驗例製備的多肽7上。NHS-PEG12 -順丁烯二醯亞胺和多肽中心核中離胺酸殘基的氨基之間的複合方式，如上文實驗例所述，並利用MALDI-TOF質譜分析來確認產物。
上述(PEG12 -順丁烯二醯亞胺)-(TCO-多肽7)複合物(如下所示)的分子量為3,237.63道耳頓；此分子構建體是以多肽核為基礎的接合單元，帶有一個炔基、一條帶有TCO基的耦合臂、以及兩條帶有順丁烯二醯亞胺基的PEG連接臂。
上述(PEG12 -順丁烯二醯亞胺)-(四嗪基-多肽7)複合物(如下所示)的分子量為3,342.98道耳頓；此分子構建體是以多肽核為基礎的接合單元，帶有一個炔基、一條帶有四嗪基的耦合臂、以及兩條帶有順丁烯二醯亞胺基的PEG連接臂。
實驗例 12 ：將 NHS-PEG12 - 順丁烯二醯亞胺和 TCO- 多肽 8 以及四嗪基 - 多肽 8 的氨基複合以合成接合單元
將三條PEG12 -順丁烯二醯亞胺連接臂連接到作為多肽核的TCO-多肽8與四嗪基-多肽8上。NHS-PEG12 -順丁烯二醯亞胺和多肽中心核中離胺酸殘基的氨基之間的複合方式，如上文實驗例8所述，並利用MALDI-TOF質譜分析來確認產物。
上述(PEG12 -順丁烯二醯亞胺)-(TCO-多肽8)複合物(如下所示)的分子量為3,774.9道耳頓；此分子構建體是以聚乙二醇化胺基酸與離胺酸為基礎的接合單元；其上接有一條帶有TCO基的耦合臂、以及三條帶有順丁烯二醯亞胺基的PEG連接臂。
上述(PEG12 -順丁烯二醯亞胺)-(四嗪基-多肽8)複合物 (如下所示)的分子量為3,856.94道耳頓，參見第10圖((ESI-TOF) m/z (z=4): [M + 4H]+ Calculated for C171 H287 N23 O71 S1 H3 Na 964.7363; Found 964.7324)；此分子構建體是以聚乙二醇化胺基酸與離胺酸為基礎的接合單元；其上接有一條帶有四嗪基的耦合臂、以及三條帶有順丁烯二醯亞胺基的PEG連接臂。
實驗例 13 ：將 NHS-PEG6 - 順丁烯二醯亞胺和 TCO- 多肽 9 的氨基複合以合成接合單元
將五條PEG6 -順丁烯二醯亞胺連接臂連接到作為多肽核的TCO-多肽9上。NHS-PEG12 -順丁烯二醯亞胺和多肽中心核中離胺酸殘基的氨基之間的複合方式，如上文實驗例8所述，並利用MALDI-TOF質譜分析來確認產物。
(PEG6 -順丁烯二醯亞胺)-(TCO-多肽9)複合物 (如下所示)的分子量為5,543.78道耳頓，參見第11圖((ESI-TOF) m/z (z=6): [M + 6H]+ Calculated for C244 H421 N29 O101 S1 Na 924.297; Found 924.299)；此分子構建體是以聚乙二醇化胺基酸與離胺酸為基礎的接合單元；其上接有一條帶有TCO基的耦合臂、以及五條帶有順丁烯二醯亞胺基的PEG 連接臂。
實驗例 14 ：將 1,3,5- 三苯胺和一條 NHS-PEG12 - 炔連接臂與兩條 NHS-PEG12 - 順丁烯二醯亞胺基連接臂複合以合成接合單元
1,3,5-三苯胺購自BOC Sciences (Creative Dynamics Inc., NY, USA)，而NHS-PEG12 -炔連接臂與NHS-PEG12 -順丁烯二醯亞胺則是購自Thermo Fisher Scientific Inc. (Waltham, MA, USA)。採用反應式6所述的兩步法將連接臂彼此複合。在步驟(i)，將1,3,5-三苯胺溶解於接合緩衝液(磷酸鹽緩衝液(PBS)、pH 7.2)、濃度1 mM，並將NHS-PEG12 -炔交聯物以1 mM的最終濃度加入1,3,5-三苯胺溶液(以莫耳比1：1比例混合)中。其後，將4 μl的250 mM NHS-PEG12 -炔的儲備原液加入1 ml的1,3,5-三苯胺溶液中。使反應混合物在室溫下反應1小時。在步驟(ii)，將NHS-PEG12 -順丁烯二醯亞胺交聯物以10 mM的最終濃度加入至步驟(i)的反應溶液(以莫耳比1：30比例混合)中。其後，將30 μl、250 mM的NHS-PEG12 -順丁烯二醯亞胺儲備原液加入125毫升的反應溶液中；接著再加入845 μl接合緩衝液，使最終溶液體積達到1 ml。使反應混合物在室溫下反應2小時。＜＜ 反應式 6  1,3,5- 三苯胺和一條 NHS-PEG12 - 炔連接臂與兩條 NHS-PEG12 - 順丁烯二醯亞胺基連接臂複合所用的兩步合成法 ＞＞
使反應混合物通過反相HPLC管柱並收集含有所述接合單元的部分，以純化反應產物並得接有一條NHS-PEG12 -炔基耦合臂以及兩條NHS-PEG12 -順丁烯二醯亞胺基連接臂的1,3,5-三苯胺。以ESI質譜技術來分析產物，參見第12圖((ESI-TOF) m/z: [M+H]+ - calculated for C104 H180 N7 O46 2263.1955; Found 2263.1920)。在MS圖譜中，可在2264.1934、2265.1938與2266.1927觀察到三個同位素峰，分別對應於[M+H+1]+ 、[M+H+2]+ 與[M+H+3]+ 。
實驗例 15 ：將五個 DM1-SMCC 分子複合至 TCO- 多肽 9
DM1-SMCC是經過琥珀醯亞胺-4-(N-順丁烯二醯亞胺基-甲基)環己烷羧酸酯(succinimidyl-4-(N-maleimido-methyl) cyclohexan-1-carboxylate，簡稱SMCC)接合物修飾的N2 ’-脫乙醯基-N2 ’-(3-巰基-1-氧代丙基)-美登木素(N2 ’-Deacetyl-N2 ’-(3-mercapto-1-oxopropyl)-maytansine，簡稱DM1)；本實驗例所用的DM1-SMCC係購自ALB Technology Inc. (Hong Kong, China)。將帶有自由胺基的TCO-多肽9溶解於100 mM磷酸鈉緩衝液(pH 7.5)中。在每毫升帶有NH2 基的TCO-多肽9溶液中，加入4 μl的250 mM DM1-SMCC，並使DM1-SMCC的最終濃度為1 mM，混合液中DM1-SMCC和TCO-多肽9 (0.04 mM)的莫耳比為25：1。使反應混合物在室溫下反應24小時。利用HPLC分離反應產物並將其凍乾。利用反相HPLC來純化帶有五個DM1-SMCC分子的TCO-多肽9；使用Supelco C18管柱(250 mm X 4.6 mm；5 μm)，流動相使用乙腈與0.1%三氟乙酸，乙腈線性梯度為30%至100%、30分鐘，流速1.0 mL/min、管柱溫度25°C。
第13圖為純化帶有五個DM1-SMCC分子的TCO-多肽9 (亦稱為載藥束)的反相HPLC曲線圖；圖中以箭頭標示其峰值。對所合成的載藥束進行質譜分析，結果如第14圖所示，所述分子構建體的分子量為7,803道耳頓。
上述載藥束(如下所示)係由帶有一個自由TCO官能基和一組五個DM1分子(作為效應元件)的接合單元所組成。
實驗例 16 ：將 LPS 分子複合至 TCO- 多肽 1
在ÄKTA Explorer FPLC系統中，利用Superdex 200 10/300 Tricon管柱(HR, GE Healthcare)以層析法純化來自腸道沙門氏菌(Salmonella enterica sv. Minnesota )的LPS (購自Sigma，型錄編號L2137)。沖提緩衝液為50 mM HEPES (pH7.5)。將樣本以0.5 mL/min速率注入管柱進行等度沖提(eluted isocratically)，並收集成1-mL的沖提餾分。之後使用3500 MWCO膜，將含有LPS的沖提餾分在MilliQ水中於4°C下透析一晚。凍乾透析所得的LPS，以供後續使用。
在接合前，利用以下方法活化純化的LPS。將1 ml的LPS水溶液 (2 mg/ml)震盪3分鐘，並在25°C下以音波處理15分鐘。之後，加入1 ml的4.5 mM脫氧膽酸鈉(sodium deoxycholate，簡稱NaDC)；再加入100 μl的2.5 mM EDTA溶液。在37°C下將混合物攪拌30分鐘、音波處理15分鐘，之後再於37°C下攪拌30分鐘。加入40 μl的100 mg/ml四氟硼酸1-氰-4-二甲基胺基吡啶(dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate，簡稱CDAP) (於乙腈中)。30秒後，加入40 μl的0.2M三乙胺(triethylamine，簡稱TEA)水溶液。將混和物保持在25°C下並攪拌150秒，以使得CDAP將LPS活化。
將上述LPS和丹磺醯肼反應，以引入肼基，以供後續和接合單元上的氨基反應。簡言之，將1 ml的2.0 mg/ml 丹磺醯肼(於0.1 M 硼酸鈉緩衝液中，pH 9.3)加入經CDAP活化的LPS中。在黑暗中於25°C下攪拌混合物，使其反應一晚。加入100 μl的乙醇胺使反應中止。利用3,500 MWCO透析膜在Milli-Q水中於暗室、4°C下透析24小時，以移除未反應的丹磺醯肼。利用螢光光譜分析來確認產物，測量產物在325 nm下的發射光譜。第15圖的螢光分光光度分析顯示當LPS和丹磺醯肼反應後，其最大發射波長為495 nm。
利用MALDI-TOF質譜分析來確認經純化的LPS以及經丹磺醯肼活化的LPS。經純化的LPS分子量為3,143道耳頓；經丹磺醯肼活化的LPS分子量為3,651道耳頓，顯示一個LPS分子複合了兩個丹磺醯肼分子；一個丹磺醯肼分子的分子量為265道耳頓。
將LPS分子複合到TCO-多肽1中離胺酸殘基的氨基。簡言之，將0.67莫耳經丹磺醯肼活化的LPS和0.067莫耳TCO-多肽1(於0.1 M碳酸氫鈉緩衝液中、pH 9.5)混合，在室溫下反應一晚。
所得到的載藥束(如下所示)是由帶有一個自由TCO官能基以及一組兩個LPS分子(作為效應元件)的接合單元所組成。
實驗例 17 ：將咪喹莫特分子複合至 NHS-PEG6 - 順丁烯二醯亞胺 -(TCO- 多肽 9) 複合物
將咪喹莫特分子和NHS-PEG5 -NHS (Conju-probe Inc.)以1：3.5的莫耳比混合，以使咪喹莫特分子的胺基和上述同型雙官能交聯物反應。質譜分析結果顯示和咪喹莫特接合的PEG5 -NHS的分子量為658.36道耳頓(第16圖)。
利用HPLC純化產物(即，咪喹莫特-PEG5 -NHS)，以移除多餘、未反應的交聯物。之後在100 mM磷酸鈉緩衝液(pH 7.5)中混合TCO-多肽9和咪喹莫特-PEG5 -NHS，並在25°C下反應18小時。質譜分析結果顯示，帶有咪喹莫特的載藥束的分子量為5,135道耳頓。
此一載藥束(如下所示)是由帶有一個自由TCO官能基以及一組五個咪喹莫特分子(IQ，作為效應元件)的接合單元所組成
實驗例 18 ：將 DOTA-NHS 接合至 TCO- 多肽 9
N-羥基琥珀醯亞胺-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四乙酸酯(1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid N-hydroxysuccinimide ester，簡稱DOTA-NHS)係購自Macrocyclics, Inc. (Dallas, USA)。利用反應式7所示的兩步驟法，將DOTA-NHS接合到TCO-多肽9。在第一步中，將TCO-多肽9溶解於接合緩衝液(磷酸延緩衝液(PBS)，含5 mM EDTA、pH 7.0)，濃度為1 mM。將反應混合物在室溫下反應一晚。在第二步中，將DOTA-NHS酯加入反應溶液中，最終濃度為100 mM (以1：100的莫耳比混合或1：20的當量比混合)。由於DOTA-NHS酯帶有TFA而呈酸性，將溶液的pH值調整為8.0，以便活化NHS酯-NH2 的接合反應。使反應混合物在室溫下反應一晚。
由第17A圖的資料可以看出，上述分子構建體的分子量為4907.685 ((ESI-TOF) m/z (z=5): [M + 3H]+ ; Calculated for C214 H38 N39 O86 S1 982.5358; Found 982.5370)。＜＜ 反應式 7  DOTA-NHS 與 TCO- 多肽 9 複合所用的兩步合成法 ＞＞
實驗例 19 ：將釔原子螯合至以 TCO- 多肽 9 為基礎的 DOTA- 複合接合單元
反應式8說明了以DOTA-(TCO-多肽9)複合物和五個Y3+ 離子螯合。在此處，將Y(NO3 )3 溶液以莫耳比1：100的比例加入至反應混合物中，並在室溫下反應2小時。利用NAP-10 Sephadex G-25管柱將來移除反應混合物中游離的DOTA-NHS與Y3+ 離子。＜＜ 反應式 8 以 DOTA-(TCO- 多肽 9) 複合物螯合釔原子 ＞＞
利用MALDI-TOF質譜分析法來分析帶有Y3+ 離子的DOTA-(TCO-多肽9)複合物。質譜分析結果顯示帶有Y3+ 離子的DOTA-(TCO-多肽9)複合物樣本的分子量為5,355道耳頓(第17B圖)。
此一載藥束(如下所示)是由帶有一個自由TCO官能基以及一組五個與Y3+ 離子螯合的DOTA基團(作為效應元件)的接合單元所組成。
實驗例 20 ：製備 CCK 類似物
CCK的胜肽類似物(CGGGGSDY(SO4 H)L(N)GWL(N)DF-NH2 ；序列編號：27)是由含8個胺基酸片段的CCK(其中有三個非天然胺基酸)以及6個胺基酸殘基(CGGGGS)組成的連續N-端延伸段(末端為半胱胺酸殘基)所組成。酪胺酸殘基(Y)芳香環上的OH基經硫酸化，而L(N)是正白胺酸殘基。半胱胺酸殘基上的SH基可和根據本揭示內容的接合單元之PEG-順丁烯二醯亞胺基連接臂複合。此一胜肽類似物是由Kelowna Inc. (Taipei, Taiwan)特製。
實驗例 21 ： LPS 透過連接臂與多肽核複合後的生物活性分析
利用HEK-blueTM 偵測套組(InvivoGen, San Diego, USA)根據製造商的說明進行TLR 4刺激細胞分析，以測試與LPS複合的接合單元中LPS的生物活性。HEK-blueTM hTLR4細胞可表現兩種人類基因—TLR4 與MD-2/CD14 共受體基因、以及分泌性胚胎鹼性磷酸酶(secreted embryonic alkaline phosphatase，簡稱SEAP )報導基因，以供監控核因子(NF)-κB活化。在和TLR4促效劑互動後，TLR4可轉導一訊號以啟動NF-κB的活化，並表現分泌性鹼性磷酸酶，接著利用偵測培養基(HEK-blueTM 偵測，用以對分泌性鹼性磷酸酶進行定性分析的培養基；InvivoGen)偵測其活化，並以分光光度計測量。
簡言之，將HEK-hTLR4細胞以2.5 × 104 細胞的密度播於96孔盤中，並保持在含選擇性抗生素(NORMOCIN™)的完全DMEM培養基中。以不同濃度(由100 μg/ml進行2-倍連續稀釋)的粗LPS、純化LPS、以丹磺醯肼修飾的LPS以及與多肽核複合的LPS來刺激細胞，反應時間18小時。利用分光光度計在620 nm的波長下測量培養基中的SEAP，以分析TLR4的活化。
第18圖的分析結果顯示LPS在經過修之前與之後的活性。將生物活性和粗LPS相近的LPS餾分純化，並進行丹磺醯肼修飾。經丹磺醯肼修飾的LPS以及與多肽核複合的LPS具有相近的部分活性。
實驗例 22 ：咪喹莫特透過連接臂與多肽核複合後的生物活性分析
利用HEK-blueTM 偵測套組(InvivoGen, San Diego, USA)根據製造商的說明進行TLR 7刺激細胞分析，以測試與咪喹莫特複合的PEG5 -NHS的生物活性。HEK-blueTM hTLR7細胞可表現兩種人類基因—TLR7 受體基因以及分泌性胚胎鹼性磷酸酶(SEAP )報導基因，以供監控核因子(NF)-κB活化。在和TLR7促效劑互動後，TLR7可轉導一訊號以啟動NF-κB的活化，並表現分泌性鹼性磷酸酶，接著利用偵測培養基(HEK-blueTM 偵測，用以對分泌性鹼性磷酸酶進行定性分析的培養基；InvivoGen)偵測其活化，並以分光光度計測量。
簡言之，將HEK-hTLR7細胞以4 × 104 細胞的密度播於96孔盤中，並保持在含選擇性抗生素(NORMOCIN™)的完全DMEM培養基中。以不同濃度(由20 μg/ml進行2-倍連續稀釋)的咪喹莫特以及與咪喹莫特複合的PEG5 -NHS來刺激細胞，反應時間18小時。利用分光光度計在620 nm的波長下測量培養基中的SEAP，以分析TLR7的活化。
第19圖的分析結果顯示咪喹莫特在和連接臂複合之前與之後的活性；結果顯示咪喹莫特分子與連接臂複合後的生物活性和未修飾的咪喹莫特相近。
實驗例 23 ：製備帶有 EGF( 作為標的元件 ) 以及細胞毒性分子載藥束 ( 作為效應元件 ) 的雙鏈 IgG1.Fc 融合蛋白分子構建體
建構EGF-CH2-CH3 (人類γ1)重組鏈，以製備如下圖所示的雙鏈IgG1.Fc融合蛋白。透過接合物(ASGGGGSGGGGS)將EGF C-端的53個胺基酸殘基接到CH2的N-端。以GGGDC序列來延伸CH3的C-端。位在C-端的半胱胺酸殘基可用以和帶有細胞毒性藥物負載的載藥束接合單元複合。重組多肽鏈的序列如序列編號：28所示。利用蛋白A親和力層析法在4°C下純化重組蛋白，並利用12% SDS-PAGE進行考瑪斯染色，以分析蛋白純度。第20A圖是帶有C-端延伸與半胱胺酸殘基的雙鏈EGF-CH2-CH3以及雙鏈EGF-CH2-CH3-(scFv α PD1)的SDS-PAGE分析結果；結果顯示帶有C-端延伸與半胱胺酸殘基的雙鏈EGF-CH2-CH3的大小約為38 kDa，而EGF-CH2-CH3-(scFv α PD1)的大小約為60-65 kDa，與預期大小相符。
上述帶有C-端延伸與半胱胺酸殘基的雙鏈EGF-hIgG1.Fc分子構建體的構形如下圖所示。
實驗例 24 ：透過 SPACC 反應將雙鏈 EGF-CH2-CH3 融合蛋白與帶有兩個 LPS 分子的載藥束複合
將四嗪基-PEG4 -Mal複合至雙鏈EGF-CH2-CH3的C-端半胱胺酸殘基。在室溫下，將含0.6莫耳與LPS複合的接合單元的分液和0.06莫耳雙鏈EGF-IgG1.Fc融合蛋白於0.1 M磷酸鈉緩衝液中(pH 7.0)中以10：1的莫耳比混合([接合物]：[蛋白])。位於末端的半胱胺酸的SH基會和順丁烯二醯亞胺-PEG4 -四嗪複合。進行MALDI-TOF質譜分析以確認透過SH-順丁烯二醯亞胺反應而形成了四嗪基-雙鏈IgG1.Fc融合蛋白複合物。質譜分析結果顯示，四嗪基-雙鏈IgG1.Fc融合蛋白複合物的分子量為68,852。
進一步將帶有一個自由TCO基以及兩個LPS分子的載藥束(接合單元)和雙鏈EGF-CH2-CH3的自由四嗪基複合。將100 μl濃度1 mg/ml的載藥束加入至帶有四嗪基-雙鏈EGF-CH2-CH3複合物的溶液中，以2：1 ([四嗪基]：[TCO])的莫耳比混合。將反應混合物在室溫下反應16小時。
第20B圖是雙鏈IgG1.Fc融合蛋白和帶有兩個LPS分子的接合單元的複合物的SDS-PAGE分析結果。電泳條1中的電泳帶為帶有C-端接合物與半胱胺酸殘基的EGF-CH2-CH3，而電泳條2的箭頭所指處為與帶有兩個LPS分以的載藥束複合的EGF-CH2-CH3。
上述與LPS接合單元複合的雙鏈IgG1.Fc融合蛋白的構形如下圖所示。
實驗例 25 ：製備帶有 EGF( 作為標的元件 ) 以及對 PD1 專一的 scFv ( 作為效應元件 ) 的雙鏈 IgG1.Fc 融合蛋白分子構建體
帶有EGF (作為標的元件)以及對PD-1專一的scFv (作為效應元件)的雙鏈IgG1.Fc融合蛋白分子構建體的構形如下所示。藉由建構EGF-CH2-CH3-(scFv α PD1) (人類γ1)重組鏈，以製備雙鏈EGF-hIgG1.Fc-(scFv α PD1) (序列編號：29)雙鏈IgG1.Fc融合蛋白。CH2-CH3係源自人類γ1，且scFv對人類PD1專一。對PD1專一的scFv的VL 與VH 和尼伏魯單抗的VL 與VH 相同。CH3的C-端透過可撓性接合物((GGGGS)3 )而和抗PD1 scFv融合。利用蛋白A親和力層析法在4°C下純化重組蛋白。
對重組雙鏈EGF-IgG1.Fc融合蛋白以及EGF-IgG1Fc-(scFv α PD1)融合蛋白進行ELISA分析，以探究重組雙鏈EGF-IgG1.Fc-(scFv α PD1)融合蛋白對ERBB1的結合能力。以1 μg/mL、2 μg/mL與4μg/mL的重組ERBB1蛋白塗覆於ELISA盤上。西妥昔單抗是抗人類EGFR的人類IgG1抗體，故使用西妥昔單抗scFv作為陽性對照組。第21A圖的ELISA結果顯示，EGF-IgG1.Fc融合蛋白以及EGF-IgG1.Fc-(scFv α PD1)融合蛋白兩者皆可結合至ERBB1胞外區域，且其結合能力和西妥昔單抗scFv不相上下。柱狀圖中每一直條表示兩次重複試驗的平均OD450值。
在ELISA盤上塗覆1 μg/mL的重組人類PD-1蛋白，以探究重組雙鏈EGF-IgG1.Fc-(scFv α PD1)融合蛋白對PD-1的結合能力。曲妥珠單抗(Herceptin)是抗ERBB2的人類IgG1抗體，故使用曲妥珠單抗scFv以作為陰性對照組。柱狀圖中每一直條表示兩次重複試驗的平均OD450值。第21B圖˙ELISA結果顯示EGF-IgG1.Fc-(scFv α PD1)融合蛋白可正向結合至人類PD-1蛋白。
實驗例 26 ：製備帶有 EGF ( 作為標的元件 ) 以及對 CD3 專一的 scFv ( 作為效應元件 ) 的雙鏈 IgG1.Fc 融合分子構建體
在本實施例中，藉由建構EGF-CH2-CH3-(scFv α CD3)重組鏈(序列編號：30)，雙鏈IgG.Fc融合蛋白。CH2-CH3係源自人類γ1，且scFv對人類CD3專一。對CD3專一的scFv的VL 與VH 和替利珠單抗的VL 與VH 相同。CH3的C-端透過可撓性接合物((GGGGS)3 )而和抗CD3 scFv融合。第22A圖為雙鏈EGF-hIgG1.Fc-(scFv α CD3)分子構建體(如下圖所示)的SDS-PAGE分析結果。
進行ELISA分析，以探究f重組雙鏈EGF-hIgG1.Fc-(scFv α CD3)融合蛋白對ERBB1、ERBB2與ERBB3的結合能力。以1 μg/mL、2 μg/mL與4μg/mL的重組ERBB1、ERBB2或ERBB3蛋白塗覆於ELISA盤上。第22B圖的ELISA結果顯示，EGF-IgG1.Fc融合蛋白以及EGF-IgG1.Fc-(scFv α CD3)融合蛋白兩者皆可結合至ERBB1胞外區域，且其結合能力和西妥昔單抗scFv不相上下。柱狀圖中每一直條表示兩次重複試驗的平均OD450值。
上述雙鏈EGF-hIgG1.Fc-(scFv α CD3)的構形如下圖所示。
實驗例 27 ：製備帶有 EGF 突變株 EGF(S2W/D3V) ( 作為標的元件 ) 的雙鏈 EGF(S2W/D3V)-IgG1.Fc 、 EGF(S2W/D3V)-IgG1.Fc-(scFv α PD1) 以及 EGF(S2W/D3V)-IgG1.Fc-(scFv α CD3)
僅需將EGF線性N-端區域中的兩個胺基酸進行置換(Ser-2置換為Trp以及Asp-3置換為Val)，就足以使EGF能夠結合至ERBB2/ERBB3異型二聚體與ERBB3同型二聚體。EGF(S2W/D3V)表示EGF的N-端區域中有兩個胺基酸置換(Ser-2置換為Trp以及Asp-3置換為Val)。製備以下帶有EGF突變型EGF(S2W/D3V)融合蛋白的構建體：雙鏈EGF(S2W/D3V)-IgG1.Fc、EGF(S2W/D3V)-IgG1.Fc-(scFv α PD1)與EGF(S2W/D3V)-IgG1.Fc-(scFv α CD3)；並分析其對ERBB1同型二聚體、ERBB2/ERBB3異型二聚體與ERBB3同型二聚體的結合能力。
重組雙鏈EGF(S2W/D3V)-IgG1.Fc的序列如序列編號：31所示。透過可撓性接合物((GGGGS)3 )，將抗PD-1以及抗CD3 scFv分別連接到EGF(S2W/D3V)-IgG1.Fc的CH3的C-端，以得到如序列編號：32所示的EGF(S2W/D3V)-IgG1.Fc-(scFv α PD1)以及如序列編號：33所示的EGF(S2W/D3V)-IgG1.Fc-(scFv α CD3)。第23A圖是帶有C-端延伸的EGF(S2W/D3V)-IgG1.Fc (電泳條1、3)、EGF(S2W/D3V)-IgG1.Fc-(scFv α PD1) (電泳條2)、以及EGF(S2W/D3V)-IgG1.Fc-(scFv α CD3) (電泳條4)的SDS-PAGE分析結果。各產物的大小與預期相符。第23B與23C圖為EGF(S2W/D3V)-IgG1.Fc-(scFv α PD1)對重組PD-1、ERBB1、ERBB2與ERBB3的結合能力的ELISA分析結果，而第23D與23E圖為EGF(S2W/D3V)-IgG1.Fc-(scFv α CD3)對重組CD3-Fc融合蛋白、ERBB1、ERBB2與ERBB3的結合能力的ELISA分析結果。結果顯示EGF(S2W/D3V)-IgG1.Fc-(scFv α PD1)可結合至重組PD-1、ERBB1與ERBB3，而EGF(S2W/D3V)-IgG1.Fc-(scFv α CD3)可結合至重組CD3、ERBB1與ERBB3。
上述雙鏈EGF(S2W/D3V)- hIgG1.Fc-(scFv α PD-1)的構形如下圖所示。
上述雙鏈EGF(S2W/D3V)- hIgG1.Fc-(scFv α CD3)的構形如下圖所示。
實驗例 28 ：製備帶有體抑素 ( 作為標的元件 ) 的雙鏈 IgG1.Fc 融合蛋白分子構建體
建構體抑素-CH2-CH3 (人類γ1)重組鏈，以製備如下圖所示的雙鏈IgG1.Fc融合蛋白。透過接合物(ASGGGGSGGGGS)將體抑素C-端的14個胺基酸殘基接到CH2的N-端。以GGGDC序列來延伸CH3的C-端。位在C-端的半胱胺酸殘基可用以和載藥束耦合。帶有體抑素與IgG.Fc的重組多肽鏈的序列如序列編號：34所示。亦製備了帶有scFv α PD-1或scFv α CD3的兩種分子構建體。第24圖是體抑素-hIgG1.Fc (電泳條1)、體抑素-hIgG1.Fc-(scFv α CD3) (電泳條2)以及體抑素-hIgG1.Fc-(scFv α PD-1) (電泳條3)的SDS-PAGE (10%)分析結果。結果顯示，這三種構建體的大小和預期相符。
由於體抑素的分子較小，SDS-PAGE分析不適合用於確定Fc-融合蛋白是否加入了體抑素。對經胰蛋白酶分解的雙鏈體抑素-hIgG1.Fc-(scFv α PD-1)與雙鏈體抑素-hIgG1.Fc-(scFv α CD3)進行串聯質譜分析，以確認所述分子構建體中是否帶有體抑素。質譜分析實驗使用Bruker Autoflex III MALDI TOF/TOF質譜分析儀(Bremen, Germany)並配有200 Hz SmartBean Laser，分析採用陽離子反射模式的延遲提取。利用FlexControl 3.4 (Bruker Daltonik)手動獲取資訊，並以Flex-Analysis 3.4 (Bruker Daltonik)進行資料處理。
此處採用Mascot檢索引擎，利用分子量搜尋，在蛋白質資料庫中搜尋蛋白質片段以進行多肽的確認；有一蛋白片段在MS/MS質譜中的m/z值對應於741.37道耳頓，此一大小和體抑素片段的序列(NFFWK)大小相符。另外有兩個蛋白片段在MS/MS質譜中的m/z值分別對應於835.45與1,286.69道耳頓，這和人類IgG Fc區域中的兩個多肽片段的胺基酸序列(分別是DTLMISR與EPQVYTLPPSR)相符。
上述雙鏈體抑素-hIgG1.Fc-(scFv α PD-1) (序列編號：35)的構形如下圖所示。
上述雙鏈體抑素-hIgG1.Fc-(scFv α CD3) (序列編號：36)的構形如下圖所示。
實驗例 29 ：雙鏈 EGF-IgG1.Fc 、雙鏈 EGF-IgG1.Fc-(scFv α PD1) 、雙鏈 EGF-IgG1.Fc-(scFv α CD3) 、雙鏈 EGF(S2W/D3V)-IgG1.Fc-(scFv α PD1) 以及雙鏈 EGF(S2W/D3V)-IgG1.Fc-(scFv α CD3) 融合蛋白和表現 EGFR 的腫瘤細胞系的結合的染色分析
分析上述五種分子構建體和A431腫瘤細胞上的EGFR的結合能力。A431是人類上皮細胞癌細胞系，此種細胞的EGFR表現很高。分析方法如下：將1 x105 個表現EGFR的A431細胞和10 μg/ml的每一種構建體(於PBS中)在1 % BSA於冰浴中反應30分鐘，此處使用西妥昔單抗scFv-FITC作為陽性對照組。清洗細胞後，以FITC-標記山羊抗人類IgG.Fc (Caltag, Buckingham, UK) (以PBS/BSA以1：200的比例稀釋)在4°C下於黑暗中培育20分鐘。利用a20 (對人類與膜結合的IgE的膜錨定區段專一的小鼠單株抗體)以及OKT3 (對人類CD3專一的小鼠單株抗體)作為陰性對照組。以FITC-標記兔抗小鼠IgG或FITC-標記山羊抗人類IgG.Fc將細胞染色，並使用FACSCanto II (BD Biosciences)進行分析。
第25圖是以下五種分子構建體對於表現EGFR的A431細胞的細胞染色分析結果：EGF-IgG1.Fc、EGF-IgG1.Fc-(scFv α PD1)、EGF-IgG1.Fc-(scFv α CD3)、EGF(S2W/D3V)-IgG1.Fc以及EGF(S2W/D3V)-IgG1.Fc-(scFv α CD3)。這五種構建體都可以實質地和A431細胞結合。
實驗例 30 ：雙鏈 EGF-IgG1.Fc 、雙鏈 EGF-IgG1.Fc-(scFv α PD1) 、雙鏈 EGF-IgG1.Fc-(scFv α CD3) 、雙鏈 EGF(S2W/D3V)-IgG1.Fc-(scFv α PD1) 以及雙鏈 EGF(S2W/D3V)-IgG1.Fc-(scFv α CD3) 和人類 T 淋巴細胞的結合的染色分析
利用分級分離的人類周邊血T淋巴細胞來探究多種EGF-IgG.Fc-scFv構建體和表現CD3與PD-1的人類T淋巴細胞結合的能力。利用Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare)密度梯度離心法，從健康捐贈者的血沉棕黃層(buffy coat) (Taiwan Blood Service Foundation)中分離出周邊血單核細胞(peripheral blood mononuclear cell，簡稱PBMC)，並冷凍保存於90% FBS/10% DMSO中。利用人類Pan T cell Isolation kit (Miltenyl Biotech, Auburn, CA, USA)套組，剔除非T細胞(負向選擇)，以製得人類T細胞。將10 μg/ml的EGF-IgG1.Fc、EGF-IgG1.Fc-(scFv α PD1)、EGF-IgG1.Fc-(scFv α CD3)、EGF(S2W/D3V)-IgG1.Fc- (scFv α PD1)以及EGF(S2W/D3V)-IgG1.Fc-(scFv α CD3)和1 x 105 個T細胞(於PBS中)，在1 % BSA、冰浴下培育20分鐘。以抗PD-1抗體與OKT3作為陽性對照組，而EGF-IgG1.Fc與EGF(S2W/D3V)-IgG1.Fc則作為陰性對照組。清洗細胞後，以FITC-標記山羊抗人類IgG.Fc (Caltag)或兔抗小鼠IgG.Fc (AbD Serotec) (以PBS/BSA以1：200的比例稀釋)在4°C下於黑暗中培育20分鐘。使用FACSCanto II (BD Biosciences)分析樣本。第26圖圖框(A)至(C)顯示EGF-IgG1.Fc-(scFv α PD1)與EGF(S2W/D3V)-IgG1.Fc-(scFv α PD1)跟抗PD-1抗體一樣，可與T細胞結合。第26圖圖框(D)至(F)顯示EGF-IgG1.Fc-(scFv α CD3)與EGF(S2W/D3V)-IgG1.Fc- (scFv α CD3)跟OKT3抗體一樣，可與T細胞結合。
實驗例 31 ：雙鏈 EGF(S2W/D3V)-IgG1.Fc-(scFv α CD3) 對 MDA-MB-231 與 A431 種腫瘤細胞系的 T 細胞介導的細胞毒性分析
利用人類周邊血T細胞作為T細胞來源。T細胞的製備方式如上文實施例所述。培養T細胞時，加入10 μ/ml的重組人類IL-2 (PeproTech, Rocky Hill, USA)。使用抗DNP AN02 mAb作為同型匹配對照組。
以重組EGF-hIgG.Fc-Cys、EGF-hIgG.Fc-(scFv α CD3)、EGF(S2W/D3V)-IgG1.Fc-(scFv α CD3)或同型匹配對照組塗覆於5,000個A431目標細胞分量(於100 μl的完全RPMI培養基中)，並在含5%二氧化碳的空氣、37°C下培育30分鐘，之後再以不同的E：T比例(20：1、10：1或5：1)與人類T細胞混合。培育24小時後，使用aCella-Tox kit (Cell Technology, Mountain View, CA)根據製造商的說明測定亮度，以近行細胞毒性分析。利用亮度計(multi-detection microplate reader，購自DS Pharma, Osaka, Japan)來讀取細胞盤。
利用MDA-MB-231腫瘤細胞以及A431腫瘤細胞來探究EGF(S2W/D3V)-hIgG1.Fc-(scFv α CD3)對於表現EGFR的腫瘤細胞所造成的T細胞介導的細胞溶解。MDA-MB-231係源自於欲有胸腔積液轉移的原發浸潤性導管癌，廣泛地用於腫瘤模型研究。於進行此種細胞毒性分析時，T細胞的來源非常重要。選用從第56號與第59號捐贈者所分離的人類T淋巴細胞來探究T細胞介導細胞毒性。將MDA-MB-231細胞和10 μg/mL的EGF(S2W/D3V)-hIgG1.Fc或EGF(S2W/D3V)-hIgG1.Fc-(scFv α CD3)在37°C下培育1小時，之後再和人類T淋巴細胞以不同的E：T比例(20：1、10：1或5：1)混合並培育24小時。使用西妥昔單抗mAb作為對照組。利用aCella-Tox kit來分析細胞溶解。此處所示的資料顯示，攜帶scFv α CD3的EGF(S2W/D3V)-hIgG1.Fc招募效應細胞以展現細胞溶解活性的效率較高。
第27A圖與第27B圖的的結果顯示，表現EGFR的A431細胞經過EGF-hIgG1.Fc-Cys、EGF-hIgG1.Fc-(scFv α CD3)或EGF(S2W/D3V)-IgG1.Fc- (scFv α CD3)處理後的細胞溶解程度；第27C圖與第27D圖的結果顯示，MDA-MB-231在經過EGF(S2W/D3V)-IgG1.Fc-(scFv α CD3)處以後，在來自第56號(第27C圖)與第59號(第27D圖)捐贈者的人類T淋巴細胞的作用下的細胞溶解程度。這些結果顯示，EGF(S2W/D3V)-hIgG1.Fc-(scFv α CD3)在活體外可透過ADCC機制而介導表現EGFR的MDA-MB-231細胞的細胞溶解。
進一步探究A431細胞經EGF(S2W/D3V)-IgG1.Fc-(scFv α CD3)處理後，因人類T淋巴細胞作用而導致的細胞溶解是否具有時間相依性；將A431細胞和10 μg/mL的EGF(S2W/D3V)-hIgG1.Fc、EGF(S2W/D3V)-hIgG1.Fc-(scFv α CD3)或抗HER1 mAb (對照組)在37°C下培育1小時，之後再和分離自人類PBMC的人類T淋巴細胞以不同的E：T比例(20：1、10：1或5：1)混合並培育2小時(第28A圖)、9小時(第28B圖)或24小時(第28C圖)小時。第28A圖至第28C圖的結果指出，經EGF(S2W/D3V)-IgG1.Fc-(scFv α CD3)處理後，人類T淋巴細胞引發的細胞溶解具有時間相依性。
實驗例 32 ：雙鏈 EGF(S2W/D3V)-IgG1.Fc-(scFv α PD-1) 融合蛋白對 A431 腫瘤細胞的 T 細胞介導的細胞毒性分析
EGF(S2W/D3V)-hIgG1.Fc和EGF(S2W/D3V)-hIgG1.Fc-(scFv α PD-1)在活體外可透過ADCC機制而介導表現EGFR的A431細胞的細胞溶解。分析方式和上文實施例所述相同。在37°C下，將A431細胞和10 μg/mL的EGF(S2W/D3V)-hIgG1.Fc、EGF(S2W/D3V)-hIgG1.Fc-(scFv α PD-1)或抗HER1 mAb (對照組)培育1小時，之後再和分離自人類PBMC的人類T淋巴細胞以不同的E：T比例(20：1、10：1或5：1)混合並培育24小時。使用aCella-Tox kit (Cell Technology Inc)來分析ADCC。
第29圖顯示人類PBMC對經雙鏈EGFw2v3-IgG1.Fc-(scFv α PD-1)處理的A431細胞造成的細胞溶解程度。
實驗例 33 ：重組雙鏈 EGFw2v3-IgG1.Fc-(scFv α PD-1) 與 EGFw2v3-IgG1.Fc-(scFv α CD3) 融合蛋白的活體內腫瘤模型
三至四週齡的NOD-SCID小鼠(NOD.CB17-Prkdcscid/IcrCrlBltw)係購自BioLasco (Taipei, Taiwan)。先以腹膜內注射的方式以每隻小鼠1×106 個A431細胞的量將細胞注入小鼠體內，經過兩週後，分別以EGF(S2W/D3V)-hIgG.Fc-Cys、EGF(S2W/D3V)-hIgG.Fc-(scFv α PD-1)、EGF(S2W/D3V)-hIgG.Fc-(scFv α CD3)或同型匹配對照組重組蛋白處理小鼠。每組5隻小鼠，並以腹腔內注射的方式分別注入5 mg/kg的處理蛋白(於50 ml的PBS中)，每週注射三次。在第一次蛋白處理時，對每一小鼠以腹腔內注射給予2×107 個人類PBMC細胞。PBMC的分離方式如下：利用Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare)密度梯度離心法，從健康捐贈者的血沉棕黃層(buffy coat) (Taiwan Blood Service Foundation)中分離出PBMC，並冷凍保存於90% FBS/10% DMSO中。在使用前，將PBMC解凍並以每毫升2x106 個細胞的濃度在IMDM培養基(Invitrogen)中培養一夜；上述培養基含10%熱去活化FBS、4 mM L-麩醯胺酸、25 mM HEPES、50 mg/ml盤尼西林以及100 mg/ml鏈黴素(完全IMDM培養基)。用卡尺每隔三至四天測量腫瘤生長情形。在第35天犧牲小鼠，並將皮下腫瘤腫瘤移除、秤重並進行分析。
當可理解，上文實施方式的說明僅為例示，且本發明所屬技術領域具有通常知識者可對其進行各種修飾。上文的說明、實驗例與資料完整地說明了本發明例示性實施方式的結構與用途。雖然上文實施方式中揭露了本發明的具體實施例，然其並非用以限定本發明，本發明所屬技術領域中具有通常知識者，在不悖離本發明之原理與精神的情形下，當可對其進行各種更動與修飾，因此本發明之保護範圍當以附隨申請專利範圍所界定者為準。
主要元件符號如下：
1000A‧‧‧分子構建體
1010‧‧‧CH2-CH3區段
T1‧‧‧標的元件
E1‧‧‧效應元件
為讓本發明的上述與其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，茲將所附圖式簡單說明如下。
第1A圖至1C圖為根據本揭示內容多種實施方式的Fc型分子構建體的示意圖。
第2圖為根據本揭示內容一實施方式的Fc型分子構建體的示意圖。
第3A圖至3C圖為根據本揭示內容多種實施方式的Fc型分子構建體的示意圖。
第4A至4K圖為根據本發明某些實施方式的連接單元的示意圖。
第6圖為以反相(reverse phase)高效液相層析 (high performance liquid chromatography，HPLC) 分析純化TCO-多肽2的溶析曲線圖；多肽2的序列如序列編號：18所示。
第7圖為以反相HPLC純化(PEG12 -順丁烯二醯亞胺)-(TCO-多肽2)複合物的曲線圖。
第8圖為(PEG12 -順丁烯二醯亞胺)-(TCO-多肽2)複合物的基質輔助雷射脫附飛行時間質譜分析(matrix assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)結果。
第9A圖與9B圖分別為(PEG12 -順丁烯二醯亞胺)-(四嗪基-多肽2)複合物以及(PEG12 -順丁烯二醯亞胺)-(DBCO-多肽2)複合物的MALDI-TOF質譜分析結果。
第10圖為(PEG12 -順丁烯二醯亞胺)-(四嗪基-多肽8)複合物的電噴灑離子化飛行時間質譜分析(electrospray ionization-time of flight mass spectrometry，ESI-TOF)結果。
第11圖為(PEG6 -順丁烯二醯亞胺)-(TCO-多肽9)複合物的ESI-TOF質譜分析結果。
第12圖是帶有一個NHS-PEG12 -炔基耦合臂和兩個NHS-PEG12 -順丁烯二醯亞胺基連接臂的1,3,5-三苯胺的ESI-TOF質譜分析結果。
第13圖為以反相HPLC純化帶有五個DM1-SMCC分子的TCO-多肽9的曲線圖。
第14圖為帶有五個DM1-SMCC分子的TCO-多肽9的質譜分析結果。
第15圖為螢光分光光度分析結果，圖中顯示LPS和丹磺醯肼(dansyl hydrazine)反應後的最大發射波長為495 nm。
第16圖為和咪喹莫特複合的PEG5 -NHS的質譜分析結果。
第17A圖為DOTA-(TCO-多肽9)複合物的ESI-TOF質譜分析結果；第17B圖為與Y3+ -螯合的DOTA-(TCO-多肽9)複合物的質譜分析結果。
第18圖是LPS經丹磺醯肼修飾之前與之後的生物活性分析結果。
第19圖是咪喹莫特與PEG連接臂複合後的生物活性分析結果。
第20A圖是帶有C-端延伸段(末端為半胱胺酸殘基)的雙鏈EGF-CH2-CH3和雙鏈EGF-CH2-CH3-(scFv α PD1)的SDS-PAGE分析結果。第20B圖是上述雙鏈IgG1.Fc融合蛋白和帶有兩個LPS分子的接合單元形成的複合物的SDS-PAGE分析結果。
第21A、21B圖是EGF-IgG1.Fc-(scFv α PD1)對多種PD-1以及ERBB1的結合力的ELISA分析結果。
第22A圖是雙鏈EGF-hIgG1.Fc-(scFv α CD3)分子構建體的SDS-PAGE分析結果。第22B圖是雙鏈EGF-hIgG1.Fc-(scFv α CD3)對ERBB1、ERBB2和ERBB3的結合力的ELISA分析結果。
第23A圖是帶有C-端延伸的EGF(S2W/D3V)-IgG1.Fc、EGF(S2W/D3V)-IgG1.Fc-(scFv α PD1)和EGF(S2W/D3V)-IgG1.Fc-(scFv α CD3)的SDS-PAGE分析結果；第23B-23E圖是EGF(S2W/D3V)-IgG1.Fc-(scFv α PD1)以及EGF(S2W/D3V)-IgG1.Fc-(scFv α CD3)對PD-1或CD3、以及對ERBB1、ERBB2和ERBB3的結合力的ELISA分析結果。
第24圖是體抑素-hIgG1.Fc、體抑素-hIgG1.Fc-(scFv α CD3)以及體抑素-hIgG1.Fc-(scFv α PD-1)的SDS-PAGE分析結果。
第25圖是EGF-IgG1.Fc、EGF-IgG1.Fc-(scFv α PD1)、EGF-IgG1.Fc-(scFv α CD3)、EGF(S2W/D3V)-IgG1.Fc與EGF(S2W/D3V)-IgG1.Fc-(scFv α CD3)在表現EGFR的A431細胞上的細胞染色分析結果。
第26圖是EGF-IgG1.Fc-(scFv α PD1)、EGF(S2W/D3V)-IgG1.Fc-(scFv α PD1)與抗PD-1 mAb (對照組)在T細胞上的細胞染色分析結果(圖框A至C)；以及EGF-IgG1.Fc-(scFv α CD3)、EGF(S2W/D3V)-IgG1.Fc-(scFv α CD3)與抗CD3 mAb (對照組)在T細胞上的細胞染色分析結果(圖框D至F)。
第27A、27B圖呈現了表現EGFR的A431細胞在經過EGF-hIgG.Fc-(scFv α CD3)以及EGF(S2W/D3V)- IgG1.Fc-(scFv α CD3)處理後的T細胞介導的細胞溶解(T cell–mediated cytolysis)；第27C、27D圖呈現了MDA-MB-231細胞在經過EGF(S2W/D3V)-IgG1.Fc-(scFv α CD3)處理後的細胞溶解程度。
第28A-28C圖是A431細胞經EGF(S2W/D3V)-IgG1.Fc-(scFv α CD3)處理後在不同時間點的T細胞介導的細胞溶解程度。
第29圖是A431細胞經雙鏈EGFw2v3-IgG1.Fc-(scFv α PD-1)處理後由人類PBMC引發的細胞溶解程度。
根據慣常的作業方式，圖中各種特徵與元件並未依比例繪製，其繪製方式是為了以最佳的方式呈現與本發明相關的具體特徵與元件。此外，在不同圖式間，儘可能以相同或相似的元件符號來指稱相似的元件/部件。
＜110＞ 免疫功坊股份有限公司   ＜120＞ 用以治療腫瘤的分子構建體   ＜130＞ P2914-TW   ＜140＞ TW 105101333   ＜141＞ 2015/01/18   ＜150＞ US 62/104405   ＜151＞ 2015/01/16   ＜150＞ US 62/114427   ＜151＞ 2015/02/10   ＜150＞ US 62/137737   ＜151＞ 2015/03/24   ＜160＞ 36   ＜170＞ BiSSAP 1.3   ＜210＞ 1 ＜211＞ 4 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ 填充序列-1   ＜400＞ 1 Gly Gly Gly Ser 1                 ＜210＞ 2 ＜211＞ 4 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ 填充序列-2   ＜400＞ 2 Gly Ser Gly Ser 1                 ＜210＞ 3 ＜211＞ 4 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ 填充序列-3   ＜400＞ 3 Gly Gly Ser Gly 1                 ＜210＞ 4 ＜211＞ 5 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ 填充序列-4   ＜400＞ 4 Gly Ser Gly Gly Ser 1               5     ＜210＞ 5 ＜211＞ 5 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ 填充序列-5   ＜400＞ 5 Ser Gly Gly Ser Gly 1               5     ＜210＞ 6 ＜211＞ 5 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ 填充序列-6   ＜400＞ 6 Gly Gly Gly Gly Ser 1               5     ＜210＞ 7 ＜211＞ 6 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ 填充序列-7   ＜400＞ 7 Gly Gly Ser Gly Gly Ser 1               5         ＜210＞ 8 ＜211＞ 7 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ 填充序列-8   ＜400＞ 8 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly 1               5             ＜210＞ 9 ＜211＞ 8 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ 填充序列-9   ＜400＞ 9 Ser Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser 1               5                 ＜210＞ 10 ＜211＞ 9 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ 填充序列-10   ＜400＞ 10 Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser Gly Ser 1               5                     ＜210＞ 11 ＜211＞ 10 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ 填充序列-11   ＜400＞ 11 Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser Gly 1               5                   10    ＜210＞ 12 ＜211＞ 11 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ 填充序列-12   ＜400＞ 12 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser 1               5                   10        ＜210＞ 13 ＜211＞ 12 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ 填充序列-13   ＜400＞ 13 Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ser 1               5                   10            ＜210＞ 14 ＜211＞ 13 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ 填充序列-14   ＜400＞ 14 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1               5                   10                ＜210＞ 15 ＜211＞ 14 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ 填充序列-15   ＜400＞ 15 Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Gly Gly Ser 1               5                   10                    ＜210＞ 16 ＜211＞ 15 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ 填充序列-16   ＜400＞ 16 Ser Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser Gly 1               5                   10                  15    ＜210＞ 17 ＜211＞ 16 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜221＞ MOD_RES ＜222＞ 1 ＜223＞ ACETYLATION   ＜220＞ ＜223＞多肽核-1   ＜400＞ 17 Cys Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Lys Gly Ser Gly Ser Lys 1               5                   10                  15          ＜210＞ 18 ＜211＞ 19 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜221＞ MOD_RES ＜222＞ 1 ＜223＞ ACETYLATION   ＜220＞ ＜223＞ 多肽核-2   ＜400＞ 18 Cys Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Lys Gly Ser Gly Ser Lys 1               5                   10                  15      Gly Ser Lys               ＜210＞ 19 ＜211＞ 31 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜221＞ MOD_RES ＜222＞ 1 ＜223＞ ACETYLATION   ＜220＞ ＜223＞多肽核-3   ＜400＞ 19 Cys Gly Ser Lys Gly Ser Lys Gly Ser Lys Gly Ser Lys Gly Ser Lys 1               5                   10                  15       Gly Ser Lys Gly Ser Lys Gly Ser Lys Gly Ser Lys Gly Ser Lys             20                  25                  30        ＜210＞ 20 ＜211＞ 8 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ 半抗原   ＜400＞ 20 Trp Ala Asp Trp Pro Gly Pro Pro 1               5                 ＜210＞ 21 ＜211＞ 16 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜221＞ MOD_RES ＜222＞ 1 ＜223＞ Xaa是高炔丙基甘胺酸   ＜220＞ ＜221＞ MOD_RES ＜222＞ 1 ＜223＞ ACETYLATION   ＜220＞ ＜223＞多肽核-4   ＜400＞ 21 Xaa Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Lys Gly Ser Gly Ser Lys 1               5                   10                  15            ＜210＞ 22 ＜211＞ 19 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜221＞ MOD_RES ＜222＞ 1 ＜223＞ Xaa是高炔丙基甘胺酸   ＜220＞ ＜221＞ MOD_RES ＜222＞ 1 ＜223＞ ACETYLATION   ＜220＞ ＜223＞多肽核-5   ＜400＞ 22 Xaa Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Lys Gly Ser Gly Ser Lys 1               5                   10                  15      Gly Ser Lys               ＜210＞ 23 ＜211＞ 19 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜221＞ MOD_RES ＜222＞ 1 ＜223＞ Xaa是L-疊氮丙胺酸   ＜220＞ ＜221＞ MOD_RES ＜222＞ 1 ＜223＞ ACETYLATION   ＜220＞ ＜223＞多肽核-6   ＜400＞ 23 Xaa Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Lys Gly Ser Gly Ser Lys 1               5                   10                  15      Gly Ser Lys               ＜210＞ 24 ＜211＞ 21 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜221＞ MOD_RES ＜222＞ 1 ＜223＞ Xaa是高炔丙基甘胺酸   ＜220＞ ＜221＞ MOD_RES ＜222＞ 1 ＜223＞ ACETYLATION   ＜220＞ ＜223＞多肽核-7   ＜400＞ 24 Xaa Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Lys Gly Ser Gly Ser Lys 1               5                   10                  15      Gly Ser Gly Ser Cys             20        ＜210＞ 25 ＜211＞ 7 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜221＞ MOD_RES ＜222＞ 1 ＜223＞ ACETYLATION   ＜220＞ ＜223＞多肽核-8   ＜220＞ ＜221＞ MOD_RES ＜222＞ 2,4,6 ＜223＞ Xaa是聚乙二醇胺基酸，兩個EG單元   ＜400＞ 25 Cys Xaa Lys Xaa Lys Xaa Lys 1               5             ＜210＞ 26 ＜211＞ 11 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜221＞ MOD_RES ＜222＞ 1 ＜223＞ ACETYLATION   ＜220＞ ＜223＞多肽核-9   ＜220＞ ＜221＞ MOD_RES ＜222＞ 2,4,6,8,10 ＜223＞ Xaa是聚乙二醇胺基酸，六個EG單元   ＜400＞ 26 Cys Xaa Lys Xaa Lys Xaa Lys Xaa Lys Xaa Lys 1               5                   10        ＜210＞ 27 ＜211＞ 14 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ CCK類似物   ＜220＞ ＜221＞ MOD_RES ＜222＞ 8 ＜223＞ SO4H modification       SULFATATION   ＜220＞ ＜221＞ MOD_RES ＜222＞ 9,12 ＜223＞ Xaa是正白胺酸   ＜400＞ 27 Cys Gly Gly Gly Gly Ser Asp Tyr Xaa Gly Trp Xaa Asp Phe 1               5                   10                    ＜210＞ 28 ＜211＞ 292 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ 雙鏈EGF-hIgG1.Fc   ＜400＞ 28 Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His 1               5                   10                  15      Asp Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys Asn             20                  25                  30           Cys Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu Lys         35                  40                  45              Trp Trp Glu Leu Arg Ala Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly     50                  55                  60                   Gly Gly Gly Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 65                  70                  75                  80  Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro                 85                  90                  95      Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val             100                 105                 110         Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr         115                 120                 125             Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val     130                 135                 140                 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Asp Tyr Lys Cys 145                 150                 155                 160 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser                 165                 170                 175     Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro             180                 185                 190         Ser Arg Asp Glu Leu Thr Arg Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val         195                 200                 205             Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly     210                 215                 220                 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 225                 230                 235                 240 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp                 245                 250                 255     Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His             260                 265                 270         Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly         275                 280                 285             Gly Gly Asp Cys     290           ＜210＞ 29 ＜211＞ 540 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ 雙鏈EGF-hIgG1.Fc-抗-PD-1   ＜400＞ 29 Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His 1               5                   10                  15      Asp Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys Asn             20                  25                  30           Cys Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu Lys         35                  40                  45              Trp Trp Glu Leu Arg Ala Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly     50                  55                  60                   Gly Gly Gly Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 65                  70                  75                  80  Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro                 85                  90                  95      Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val             100                 105                 110         Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr         115                 120                 125             Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val     130                 135                 140                 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Asp Tyr Lys Cys 145                 150                 155                 160 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser                 165                 170                 175     Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro             180                 185                 190         Ser Arg Asp Glu Leu Thr Arg Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val         195                 200                 205             Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly     210                 215                 220                 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 225                 230                 235                 240 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp                 245                 250                 255     Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His             260                 265                 270         Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly         275                 280                 285             Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val     290                 295                 300                 Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala 305                 310                 315                 320 Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp                 325                 330                 335     Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala             340                 345                 350         Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser         355                 360                 365             Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe     370                 375                 380                 Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg Thr Phe Gly 385                 390                 395                 400 Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly                 405                 410                 415     Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Val Gln Leu Val             420                 425                 430         Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Asp         435                 440                 445             Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser Gly Met His Trp Val     450                 455                 460                 Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr 465                 470                 475                 480 Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr                 485                 490                 495      Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe Leu Gln Met Asn Ser             500                 505                 510         Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Thr Asn Asp Asp         515                 520                 525              Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser     530                 535                 540   ＜210＞ 30 ＜211＞ 545 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ 雙鏈EGF-hIgG1.Fc-抗-CD3   ＜400＞ 30 Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His 1               5                   10                  15      Asp Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys Asn             20                  25                  30          Cys Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu Lys         35                  40                  45              Trp Trp Glu Leu Arg Ala Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly     50                  55                  60                  Gly Gly Gly Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 65                  70                  75                  80  Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro                 85                  90                  95       Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val             100                 105                 110         Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr         115                 120                 125              Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val     130                 135                 140                 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Asp Tyr Lys Cys 145                 150                 155                 160 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser                 165                 170                 175     Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro             180                 185                 190         Ser Arg Asp Glu Leu Thr Arg Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val         195                 200                 205             Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly     210                 215                 220                 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 225                 230                 235                 240 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp                 245                 250                 255     Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His             260                 265                 270         Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly         275                 280                 285             Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln     290                 295                 300                 Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val 305                 310                 315                 320 Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr                 325                 330                 335     Gln Gln Thr Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser             340                 345                 350         Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly         355                 360                 365             Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala     370                 375                 380                 Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr Phe Gly Gln 385                 390                 395                 400 Gly Thr Lys Leu Gln Ile Thr Arg Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys                 405                 410                 415     Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Val Gln Leu Val Gln             420                 425                 430         Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys         435                 440                 445             Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val Arg     450                 455                 460                 Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser 465                 470                 475                 480 Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile                 485                 490                 495     Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Ala Phe Leu Gln Met Asp Ser Leu             500                 505                 510         Arg Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp         515                 520                 525              His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser     530                 535                 540                 Ser 545   ＜210＞ 31 ＜211＞ 292 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ 雙鏈EGF(S2W/D3V)-hIgG1.Fc   ＜400＞ 31 Asn Trp Val Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His 1               5                   10                  15      Asp Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys Asn             20                  25                  30          Cys Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu Lys         35                  40                  45              Trp Trp Glu Leu Arg Ala Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly     50                  55                  60                  Gly Gly Gly Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 65                  70                  75                  80  Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro                 85                  90                  95      Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val             100                 105                 110         Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr         115                 120                 125              Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val     130                 135                 140                 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Asp Tyr Lys Cys 145                 150                 155                 160 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser                 165                 170                 175     Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro             180                 185                 190         Ser Arg Asp Glu Leu Thr Arg Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val         195                 200                 205             Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly     210                 215                 220                  Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 225                 230                 235                 240 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp                 245                 250                 255     Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His             260                 265                 270         Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly         275                 280                 285             Gly Gly Asp Cys     290           ＜210＞ 32 ＜211＞ 540 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ 雙鏈EGF(S2W/D3V)-hIgG1.Fc-抗-PD-1   ＜400＞ 32 Asn Trp Val Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His 1               5                   10                  15      Asp Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys Asn             20                  25                  30          Cys Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu Lys         35                  40                  45              Trp Trp Glu Leu Arg Ala Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly     50                  55                  60                  Gly Gly Gly Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 65                  70                  75                  80  Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro                 85                  90                  95      Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val             100                 105                 110         Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr         115                 120                 125             Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val     130                 135                 140                 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Asp Tyr Lys Cys 145                 150                 155                 160 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser                 165                 170                 175     Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro             180                 185                 190          Ser Arg Asp Glu Leu Thr Arg Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val         195                 200                 205             Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly     210                 215                 220                  Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 225                 230                 235                 240 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp                 245                 250                 255     Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His             260                 265                 270         Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly         275                 280                 285             Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val     290                 295                 300                 Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala 305                 310                 315                 320 Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp                 325                 330                 335     Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala             340                 345                 350         Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser         355                 360                 365             Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe     370                 375                 380                 Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg Thr Phe Gly 385                 390                 395                 400 Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly                 405                 410                 415     Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Val Gln Leu Val             420                 425                 430         Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Asp         435                 440                 445             Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser Gly Met His Trp Val     450                 455                 460                 Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr 465                 470                 475                 480 Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr                 485                 490                 495     Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe Leu Gln Met Asn Ser             500                 505                 510         Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Thr Asn Asp Asp         515                 520                 525             Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser     530                 535                 540   ＜210＞ 33 ＜211＞ 545 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ 雙鏈EGF(S2W/D3V)-hIgG1.Fc-抗-CD3   ＜400＞ 33 Asn Trp Val Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His 1               5                   10                  15      Asp Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys Asn             20                  25                  30          Cys Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu Lys         35                  40                  45              Trp Trp Glu Leu Arg Ala Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly     50                  55                  60                  Gly Gly Gly Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 65                  70                  75                  80  Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro                 85                  90                  95      Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val             100                 105                 110         Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr         115                 120                 125             Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val     130                 135                 140                 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Asp Tyr Lys Cys 145                 150                 155                 160 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser                 165                 170                 175     Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro             180                 185                 190         Ser Arg Asp Glu Leu Thr Arg Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val         195                 200                 205             Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly     210                 215                 220                  Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 225                 230                 235                 240 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp                 245                 250                 255     Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His             260                 265                 270         Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly         275                 280                 285              Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln     290                 295                 300                 Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val 305                 310                 315                 320 Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr                 325                 330                 335     Gln Gln Thr Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser             340                 345                 350         Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly         355                 360                 365             Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala     370                 375                 380                 Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr Phe Gly Gln 385                 390                 395                 400 Gly Thr Lys Leu Gln Ile Thr Arg Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys                 405                 410                 415     Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Val Gln Leu Val Gln             420                 425                 430         Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys         435                 440                 445             Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val Arg     450                 455                 460                 Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser 465                 470                 475                 480 Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile                 485                 490                 495     Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Ala Phe Leu Gln Met Asp Ser Leu             500                 505                 510         Arg Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp         515                 520                 525             His Tyr Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser     530                 535                 540                 Ser 545   ＜210＞ 34 ＜211＞ 253 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ 雙鏈體抑素-hIgG1.Fc   ＜400＞ 34 Ala Gly Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr Ser Cys Ala Ser 1               5                   10                  15      Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ala Pro             20                  25                  30          Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys         35                  40                  45              Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val     50                  55                  60                  Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 65                  70                  75                  80  Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr                 85                  90                  95      Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp             100                 105                 110         Trp Leu Asn Gly Lys Asp Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu         115                 120                 125             Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg     130                 135                 140                 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Arg 145                 150                 155                 160 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp                 165                 170                 175     Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys             180                 185                 190         Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser         195                 200                 205             Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser     210                 215                 220                 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 225                 230                 235                 240 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Asp Cys                 245                 250               ＜210＞ 35 ＜211＞ 501 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ 雙鏈體抑素-hIgG1.Fc-抗-PD-1   ＜400＞ 35 Ala Gly Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr Ser Cys Ala Ser 1               5                   10                  15      Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ala Pro             20                  25                  30          Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys         35                  40                  45              Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val     50                  55                  60                  Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 65                  70                  75                  80  Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr                 85                  90                  95      Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp             100                 105                 110         Trp Leu Asn Gly Lys Asp Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu         115                 120                 125             Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg     130                 135                 140                  Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Arg 145                 150                 155                 160 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp                 165                 170                 175     Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys             180                 185                 190         Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser         195                 200                 205              Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser     210                 215                 220                 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 225                 230                 235                 240 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly                 245                 250                 255     Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr             260                 265                 270         Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser         275                 280                 285             Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln     290                 295                 300                 Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile 305                 310                 315                 320 Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr                 325                 330                 335     Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln             340                 345                 350         Ser Ser Asn Trp Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile         355                 360                 365             Lys Arg Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly     370                 375                 380                 Ser Thr Lys Gly Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val 385                 390                 395                 400 Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr                 405                 410                 415     Phe Ser Asn Ser Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly             420                 425                 430         Leu Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr         435                 440                 445             Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys     450                 455                 460                 Asn Thr Leu Phe Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala 465                 470                 475                 480 Val Tyr Tyr Cys Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu                 485                 490                 495     Val Thr Val Ser Ser             500       ＜210＞ 36 ＜211＞ 506 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ 雙鏈體抑素-hIgG1.Fc-抗-CD3   ＜400＞ 36 Ala Gly Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr Ser Cys Ala Ser 1               5                   10                  15      Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ala Pro             20                  25                  30           Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys         35                  40                  45              Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val     50                  55                  60                   Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 65                  70                  75                  80  Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr                 85                  90                  95      Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp             100                 105                 110         Trp Leu Asn Gly Lys Asp Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu         115                 120                 125             Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg     130                 135                 140                 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Arg 145                 150                 155                 160 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp                 165                 170                 175     Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys             180                 185                 190         Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser         195                 200                 205             Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser     210                 215                 220                 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 225                 230                 235                 240 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly                 245                 250                 255     Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser             260                 265                 270         Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser         275                 280                 285             Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Lys Ala     290                 295                 300                 Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro 305                 310                 315                 320 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile                 325                 330                 335     Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp             340                 345                 350         Ser Ser Asn Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Gln Ile Thr         355                 360                 365             Arg Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser     370                 375                 380                 Thr Lys Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln 385                 390                 395                 400 Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe                 405                 410                 415     Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu             420                 425                 430         Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn         435                 440                 445             Gln Lys Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn     450                 455                 460                  Thr Ala Phe Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Val 465                 470                 475                 480 Tyr Phe Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp                 485                 490                 495     Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser             500                 505
1000A‧‧‧分子構建體
1010‧‧‧CH2-CH3區段
T1‧‧‧標的元件
E1‧‧‧效應元件

Claims (35)

  1. 一種分子構建體，包含： 一對IgG.Fc的CH2-CH3區段； 一第一對效應元件，其中該效應元件為一載藥束，其包含複數個細胞毒性藥物分子，且該第一對效應元件連接於該對CH2-CH3區段的C-端；以及 一第一對標的元件，其中該標的元件為對一細胞表面抗原專一的一抗體片段，其中該細胞表面抗原係選自以下物質所組成的群組：CD5、CD19、CD20、CD22、CD23、CD30、CD33、CD34、CD37、CD38、CD43、CD78、CD79a、CD79b、CD138以及CD319，且該第一對標的元件連接於該對CH2-CH3區段的N-端。
  2. 如請求項1所述的分子構建體，其中該對CH2-CH3區段係衍生自人類γ4或γ1免疫球蛋白。
  3. 如請求項1所述的分子構建體，其中該第一對標的元件為一抗原結合片段(antigen-binding fragment，Fab)的形式，而使得該分子構建體形成一IgG構形。
  4. 如請求項1所述的分子構建體，其中該細胞毒性藥物為奧里斯他汀(auristatin)、美登木素(maytansine)、阿黴素(doxorubicin)、卡奇黴素(calicheamicin)或喜樹鹼(camptothecin)。
  5. 如請求項1所述的分子構建體，更包含具有(G2-4 S)2-8 C序列的一多肽延伸段以及一耦合臂，其中： 該多肽延伸段連接於該對CH2-CH3區段的C-端； 該耦合臂透過硫氫-順丁烯二亞醯胺反應而連接至該多肽延伸段的C-端；以及 該載藥束透過逆電子需求狄爾斯-阿德(inverse electron demand Diels–Alder，iEDDA)反應、應力促進的疊氮化物-炔羥鏈接化學(strain-promoted azide-alkyne click chemistry，SPAAC)反應或銅催化的疊氮化物-炔羥環加成(copper catalyzed azide-alkyne cycloaddition，CuAAC)反應而與該耦合臂連接。
  6. 如請求項5所述的分子構建體，其中該載藥束包含： 一中心核，其為包含複數個氨基的一化合物或包含複數個離胺酸(lysine，K)殘基的一多肽；以及 複數個連接臂，分別藉由和該些氨基或K殘基其中之一反應，而以其一端連接於該中心核，且其自由端有一順丁烯二亞醯胺基，其中每一該些細胞毒性藥物分子藉由與該順丁烯二亞醯胺基反應以透過該連接臂而連接於該中心核。
  7. 一種分子構建體，包含： 一對IgG.Fc的CH2-CH3區段； 一第一對效應元件，其中該效應元件為一載藥束，其包含複數個細胞毒性藥物分子、類鐸受體(toll-like receptor，TLR)促效劑分子或與一放射性核種複合的螯合劑分子，且該第一對效應元件連接於該對CH2-CH3區段的C-端；以及 一第一對標的元件，其中該標的元件為對一腫瘤相關抗原專一的抗體片段，且該第一對標的元件連接於該對CH2-CH3區段的N-端。
  8. 如請求項7所述的分子構建體，其中該對CH2-CH3區段係衍生自人類γ4或γ1免疫球蛋白。
  9. 如請求項7所述的分子構建體，其中該第一對標的元件為一Fab的形式，而使得該分子構建體形成一IgG構形。
  10. 如請求項7所述的分子構建體，更包含具有(G2-4 S)2-8 C序列的一多肽延伸段及一耦合臂，其中： 該多肽延伸段連接於該對CH2-CH3區段的C-端； 該耦合臂透過硫氫-順丁烯二亞醯胺反應而連接至該多肽延伸段的C-端；以及 該載藥束透過iEDDA反應、SPAAC反應或CuAAC反應而與該耦合臂連接。
  11. 如請求項10所述的分子構建體，其中該載藥束包含： 一中心核，其為包含複數個氨基的一化合物或包含複數個離胺酸(lysine，K)殘基的一多肽；以及 複數個連接臂，分別藉由和該些氨基或K殘基其中之一反應，而以其一端連接於該中心核，且其自由端有一順丁烯二亞醯胺基，其中每一該些細胞毒性藥物分子藉由與該順丁烯二亞醯胺基反應以透過該連接臂而連接於該中心核。
  12. 如請求項7所述的分子構建體，更包含一第二對標的元件，其分別以串聯雙抗體或雙抗體的構形連接於該第一對標的元件的N-端，以形成連接於該對CH2-CH3區段N-端的一對雙專一性scFv。
  13. 如請求項7所述的分子構建體，其中該細胞毒性藥物為奧里斯他汀、美登木素、阿黴素、卡奇黴素或喜樹鹼。
  14. 如請求項7所述的分子構建體，其中該TLR促效劑為脂多醣(lipopolysaccharide，LPS)、單磷醯脂A (monophosphoryl lipid A)、莫托立莫特(motolimod)、咪喹莫特(imiquimod)、瑞西喹莫特(resiquimod)、加德喹莫特(gardiquimod)、CpG寡聚去氧核苷酸(CpG oligodeoxynucleotide，CpG DON)、脂磷壁酸(lipoteichoic acid)、β-葡聚糖或酵母聚糖(zymosan)。
  15. 如請求項7所述的分子構建體，其中該螯合劑為1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四乙酸(1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid，DOTA)、1,4,7-三氮雜環壬烷-1,4,7-三乙酸(1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacetic acid，NOTA)、1,4,7-三氮雜環壬烷-1,4-二乙酸(1,4,7-triazacyclononane-1,4-diacetic acid，NODA)或二乙烯三胺五乙酸(diethylenetriaminepenta-acetic acid，DTPA)。
  16. 如請求項7所述的分子構建體，其中該放射性核種為90 Y、111 In或177 Lu。
  17. 如請求項7所述的分子構建體，其中該腫瘤相關抗原為人類上皮生長因子受體(human epidermal growth factor receptor，HER1)、HER2、HER3、HER4、醣類抗原19-9 (carbohydrate antigen 19-9，CA 19-9)、醣類抗原125 (CA 125)、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)、細胞表面相關黏蛋白1 (cell surface-associated mucin 1，MUC 1)、黑色素瘤相關抗原(melanoma-associated antigen，MAGE)、前列腺專一膜抗原(prostate-specific membrane antigen，PSMA)、前列腺幹細胞抗原(prostate stem cell antigen，PSCA)、黏蛋白關聯Tn抗原、唾液酸Tn抗原(Sialyl Tn)、Globo H、階段專一性胚胎抗原(stage-specific embryonic antigen-4，SSEA-4)、神經節苷脂GD2或上皮細胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)。
  18. 如請求項7所述的分子構建體，其中：該效應元件為包含該些細胞毒性藥物分子的載藥束；且該標的元件為對HER2專一的scFv。
  19. 如請求項7所述的分子構建體，更包含一第二對標的元件，分別連接於該第一對標的元件，其中：該第一對效應元件的每一效應元件為包含該些細胞毒性藥物分子的載藥束；該第一對標的元件的每一標的元件為對HER2專一的scFv；以及該第二對標的元件的每一標的元件為對HER1專一的scFv。
  20. 一種分子構建體，包含： 一對IgG.Fc的CH2-CH3區段； 一第一對效應元件，其中該效應元件為一載藥束，其包含複數個細胞毒性藥物分子、TLR促效劑分子或與一放射性核種複合的螯合劑分子；或對一細胞表面抗原、一生長因子或一半抗原專一的抗體片段；以及 一第一對標的元件，其中該標的元件為該生長因子或一肽類激素，其中： 當該效應元件為該載藥束時，該第一對效應元件分別連接於該對CH2-CH3區段的C-端，且該標的元件分別連接於該對CH2-CH3區段的N-端；以及 當該效應元件為該抗體片段時，該效應元件分別連接於該對CH2-CH3區段的N-端，且該標的元件分別連接於該對CH2-CH3區段的C-端，反之亦然。
  21. 如請求項20所述的分子構建體，其中該對CH2-CH3區段係衍生自人類γ4或γ1免疫球蛋白。
  22. 如請求項20所述的分子構建體，其中該第一對標的元件為一Fab的形式，而使得該分子構建體形成一IgG構形。
  23. 如請求項20所述的分子構建體，更包含具有(G2-4 S)2-8 C序列的一多肽延伸段及一耦合臂，其中： 該多肽延伸段連接於該對CH2-CH3區段的C-端； 該耦合臂透過硫氫-順丁烯二亞醯胺反應而連接至該多肽延伸段的C-端；以及 該載藥束透過iEDDA反應、SPAAC反應或CuAAC反應而與該耦合臂連接。
  24. 如請求項23所述的分子構建體，其中該載藥束包含： 一中心核，其為包含複數個氨基的一化合物或包含複數個K殘基的一多肽；以及 複數個連接臂，分別藉由和該些氨基或K殘基其中之一反應，而以其一端連接於該中心核，且其自由端有一順丁烯二亞醯胺基，其中每一該些細胞毒性藥物分子藉由與該順丁烯二亞醯胺基反應以透過該連接臂而連接於該中心核。
  25. 如請求項20所述的分子構建體，更包含一第二對效應元件或一第二對標的元件，其中該第二對效應或標的元件分別以串聯雙抗體或雙抗體的構形連接於連接至該對CH2-CH3區段N-端的該對元件，以形成連接於該對CH2-CH3區段N-端的一對雙專一性scFv。
  26. 如請求項20所述的分子構建體，其中該細胞毒性藥物為奧里斯他汀、美登木素、阿黴素、卡奇黴素或喜樹鹼。
  27. 如請求項20所述的分子構建體，其中該TLR促效劑為脂多醣、單磷醯脂A、莫托立莫特、咪喹莫特、瑞西喹莫特、加德喹莫特、CpG寡聚去氧核苷酸、脂磷壁酸、β-葡聚糖或酵母聚糖。
  28. 如請求項20所述的分子構建體，其中該螯合劑為DOTA、NOTA、NODA或DTPA。
  29. 如請求項20所述的分子構建體，其中該放射性核種為90 Y、111 In或177 Lu。
  30. 如請求項20所述的分子構建體，其中該細胞表面抗原是PD-1、PD-L1、CTLA-4、CD3、CD16a、CD28或CD134。
  31. 如請求項20所述的分子構建體，其中該生長因子為上皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)、突變型EGF、表皮調節素(epiregulin)、肝素結合上皮生長因子(heparin-binding epidermal growth factor，HB-EGF)、VEGF-A、鹼性纖維母細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)或肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)。
  32. 如請求項20所述的分子構建體，其中該半抗原為二硝苯酚(dinitrophenol，DNP)、三硝苯酚(trinitropheno，TNP)、丹磺醯(dansyl)、盤尼西林、對胺苯甲酸或具有序列編號：20所示序列的多肽。
  33. 如請求項20所述的分子構建體，其中該肽類激素為膽囊收縮素(cholecystokinin，CCK)、體抑素或促甲狀腺素(thyroid-stimulating hormone，TSH)。
  34. 如請求項194所述的分子構建體，其中：該效應元件為包含該些細胞毒性藥物分子的載藥束；且該標的元件為EGF。
  35. 如請求項20所述的分子構建體，其中：該效應元件為對CD3、CD16a、PD-1或VEGF專一的scFv；且該標的元件為EGF。
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