ES2757857T3

ES2757857T3 - Anticuerpos de unión a colágeno II humano

Info

Publication number: ES2757857T3
Application number: ES16157460T
Authority: ES
Inventors: John Kehoe; Jennifer Lee; Tatiana Ort; Kristen Picha; Mary Ryan; John Wheeler
Original assignee: Janssen Biotech Inc
Current assignee: Janssen Biotech Inc
Priority date: 2010-09-27
Filing date: 2011-09-26
Publication date: 2020-04-30
Anticipated expiration: 2031-09-26
Also published as: CN103429616B; CA2812389C; IL225397A0; US8394378B2; EP3050899A1; WO2012047583A2; CN103429616A; EP2621950A2; JP6126991B2; JP2013542722A; WO2012047583A3; US20120108795A1; EP2621950A4; CA2812389A1; EP3050899B1

Abstract

Un anticuerpo monoclonal aislado o fragmento del mismo que se une al colágeno II humano, que comprende una región variable de la cadena pesada (región VH) y una región variable de la cadena ligera (región VL), en donde: la región VH comprende las secuencias de la región determinante de complementariedad (CDR) de la cadena pesada 1, 2 y 3 (HCDR1, HCDR2 y HCDR3) como se muestra en las SEQ ID NO: 11, 17 y 30, respectivamente; y la región VL comprende las secuencias de la CDR de la cadena ligera1, 2 y 3 (LCDR1, LCDR2 y LCDR3) como se muestra en las SEQ ID NO: 34, 42 y 47, respectivamente.

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos de unión a colágeno II humano

Campo de la invención

La presente invención se refiere a anticuerpos contra colágeno II humano, polipéptidos y polinucleótidos que codifican anticuerpos contra colágeno II humano o fragmentos de los mismos, y métodos para elaborar y usar lo anterior.

Antecedentes de la invención

Las enfermedades y afecciones que provocan la destrucción del cartílago dentro de las articulaciones plantean un importante problema de salud pública, particularmente en vista de la demografía de una población que envejece. Múltiples mecanismos están implicados en la degradación del cartílago articular en artritis como la artritis reumatoide (AR) y la osteoartritis (OA). La AR es la forma más común de artritis inflamatoria, que afecta al 3% de las mujeres y al 1% de los hombres. La OA, una artritis no inflamatoria, es la forma más común de enfermedad articular, y es superada solo por la enfermedad cardiovascular como causa de jubilación anticipada y discapacidad.

La mayoría de los tratamientos para dolencias articulares son generalmente sistémicos. Dirigir una medicación localmente a una articulación tendría varias ventajas: eficacia aumentada, efectos secundarios reducidos, un mejor programa de dosificación, y un coste reducido de los bienes.

Los tratamientos locales actuales que incluyen glucocorticoides, soluciones de ácido hialurónico inyectables, AINE u otras moléculas pequeñas tienen vidas medias relativamente cortas, así como distribución sistémica una vez inyectadas en la articulación (Gerwin, et al., Adv Drug Deliv Rev, 58:226-42, 2006; Lindenhayn et al., Eur J Clin Chem Biochem, 35:355-63, 1997). La retención articular de un agente terapéutico puede lograrse mediante el acoplamiento del agente terapéutico a un agente de direccionamiento articular (Rothenfluh et al., Nature Materials 7:248-54, 2008; WO05/097073; Patente de Estados Unidos N° 7.067.144). Sin embargo, los tratamientos pueden requerir una inyección intraarticular con vehículos de administración como liposomas, añadiendo una capa de complejidad y posible abrasión de la superficie de la articulación.

La WO2008/135734 divulga composiciones que comprenden un anticuerpo o fragmento del mismo contra Colágeno II oxidado (CII) en las que el anticuerpo o fragmento del mismo se conjuga con una fracción farmacéuticamente activa y el uso de estos anticuerpos en el diagnóstico y terapia de artropatías. Uysal et al. (2008) Molecular Immunology, 45, 8, 2196-2204 trata la estructura cristalina del anticuerpo monoclonal de ratón específico de colágeno patógeno tipo II CIIC1 Fab y acomete una estructura para el análisis funcional. Nandakumar et al. (2003) European Journal of Immunology, 33, 8, 2269-2277 trata la inducción de artritis por anticuerpos anti-colágeno tipo II de IgG monoclonales y la mejora de la artritis en ratones que carecen de FcyRIIB inhibidor. La US2005/0153442 divulga células madre y redes derivadas adiposas. Xu et al. (2004) Molecular Immunology, 41, 4, 411-9 sugiere el uso de dos anticuerpos monoclonales para seleccionar con precisión el mismo epítopo de colágeno tipo II de clones de fago sin reactividad cruzada seleccionados por presentación en fago: implicaciones para la autoinmunidad y la mímica molecular.

Por tanto, existe la necesidad de desarrollar vehículos adicionales para la administración eficiente y la retención posterior de un agente terapéutico en la articulación.

Breve descripción de los dibujos

Fig. 1. Andamiajes humanos para la generación de bibliotecas de novo pIX. Numeración de residuos de acuerdo con Chothia. Las secuencias de CDR están subrayadas.

Fig. 2. Secuencias de las regiones variables de la cadena pesada (VH) y las regiones variables de la cadena ligera (VL) de Fabs que se unen al colágeno II humano. Se indican residuos que difieren del andamiaje humano de tipo salvaje. X denota un residuo eliminado en la secuencia en comparación con el tipo salvaje. Fig. 3. Reactividad cruzada de Fabs contra colágenos humano y de rata I y II.

Fig. 4. Unión de Fabs anti-colágeno II al cartílago humano.

Fig. 5. Retención de Fabs anti-colágeno II en articulaciones osteoartríticas. *P<0,05, **P<0,01; comparación con el control CNTO 4234. Los recuentos a los 10 minutos y 1 hora después de la inyección para CNTO 3631 eran demasiado altos para ser leídos.

Fig. 6. Retención de Fabs anti-colágeno II en líquido sinovial osteoartrítico. *P<0,05; **P <0,01; comparación con el control CNTO 4234.

Sumario de la invención

La invención proporciona un anticuerpo monoclonal aislado o fragmento del mismo que se une al colágeno II humano, que comprende una región VH y una región VL, en donde la región VH comprende las secuencias de HCDR1, HCDR2 y HCDR3 como se muestra en las SEQ ID NO: 11, 17, y 30, respectivamente, y al región VL comprende las secuencias de LCDR1, LCDR2 y LCDR3 como se muestra en las SEQ ID nO: 34, 42 y 47, respectivamente.

Un aspecto de la divulgación es un anticuerpo monoclonal aislado o fragmento del mismo que se une al colágeno II humano, que comprende una región variable de la cadena pesada (región VH) y una región variable de la cadena ligera (región VL), en donde la región VH comprende las secuencias de la región determinante de la complementariedad (CDR) 1,2 y 3 de la cadena pesada (HCDR1, HCDR2 y HCDR3) como se muestra en

i. SEQ ID NO: 8, 14, y 20;

ii. SEQ ID NO: 9, 15, y 21;

iii. SEQ ID NO: 9, 15, y 22;

iv. SEQ ID NO: 9, 15, y 23;

v. SEQ ID NO: 9, 15, y 24;

vi. SEQ ID NO: 9, 15, y 25;

vii. SEQ ID NO: 9, 15, y 26;

viii. SEQ ID NO: 9, 15, y 27;

ix. SEQ ID NO: 9, 15, y 28;

x. SEQ ID NO: 10, 16, y 29;

xi. SEQ ID NO: 11, 17, y 30;

xii. SEQ ID NO: 12, 18, y 31; o

xiii. SEQ ID NO: 13, 19, y 32; y

la región VL comprende las secuencias de las CDR 1, 2 y 3 de cadena ligera (LCDR1, LCDR2, y LCDR3) somo se muestra en

xiv. SEQ ID NO: 33, 42, y 46;

xv. SEQ ID NO: 34, 42, y 47;

xvi. SEQ ID NO: 35, 43, y 48;

xvii. SEQ ID NO: 36, 44, y 49;

xviii. SEQ ID NO: 37, 42, y 50;

xix. SEQ ID NO: 38, 42, y 51;

xx. SEQ ID NO: 35, 44, y 52;

xxi. SEQ ID NO: 39, 42, y 53;

xxii. SEQ ID NO: 40, 45, y 54; o

xxiii. SEQ ID NO: 41,42, y 55.

Otro aspecto de la invención es un anticuerpo monoclonal aislado o un fragmento del mismo que se une al colágeno II humano, que comprende una región VH y una región VL, en donde la región VH comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 66, y la región VL comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 5.

Otro aspecto de la divulgación es un anticuerpo aislado que se une al colágeno II humano, que comprende una región VH y una región VL, en donde la región VH comprende las secuencias de HCDR1, HCDR2 y HCDR3 como se muestra en las SEQ ID N: 9, 15 y 28, y la región VL comprende las secuencias de LCDR1, LCDR2 y LCDR3 como se muestra en las SEQ ID NO: 39, 42 y 53.

Otro aspecto de la divulgación es una región variable de cadena pesada del anticuerpo aislado que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en las SEQ ID N: 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, o 68

Otro aspecto de la divulgación es una región variable de cadena ligera del anticuerpo aislado que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en las SEQ ID NO: 69, 70, 71,72, 73, 74, 75 o 76.

Otro aspecto de la invención es el polinucleótido aislado que codifica un anticuerpo de la invención.

Otro aspecto de la invención es un vector que comprende por lo menos un polinucleótido de la invención. Otro aspecto de la invención es una célula huésped que comprende el vector de la invención.

Otro aspecto de la invención es un método para elaborar un anticuerpo que se une al colágeno II humano, que comprende cultivar la célula huésped de la invención y recuperar el anticuerpo producido por la célula huésped. Descripción detallada de la invención

A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por un experto en la técnica a la que pertenece la invención. En la presente se describen composiciones y métodos ejemplares.

El término "anticuerpo" incluye anticuerpos completos y cualquier fragmento de los mismos. Los fragmentos de anticuerpos comprenden por lo menos una parte de una molécula de inmunoglobulina como una región determinante de complementariedad (CDR), una región variable, una región constante o una región marco de cualquiera de la cadena pesada o ligera del anticuerpo. Un anticuerpo puede ser un Fab, F(ab'), F(ab')², scFv, dsFv o diacuerpo. Un anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal (mAb), un anticuerpo quimérico, humanizado o humano, dimérico, tetramérico o multimérico. Las estructuras de los fragmentos de anticuerpo mencionados anteriormente, y las técnicas para la preparación y uso de los anticuerpos y fragmentos de los mismos son bien conocidas en la técnica (Ausubel, et al., Ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY 1987-2001; Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Edición, Cold Spring Harbor, N^y, 1989; Harlow and Lane, Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, 1989; Colligan, et al., ed., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY 1994-2001; Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, 1997-2001; Kohler et al., Nature, 256:495-497, 1975; Queen et al., Proc Natl Acad Sci, 86:10029-33, 1989; Patente de Estados Unidos N° 4.816.567). Por ejemplo, los mAbs murinos pueden elaborarse mediante el método de hibridoma de Kohler et al., Nature 256:495-497, 1975. Los mAbs quiméricos pueden prepararse mediante el método divulgado en la Patente de Estados Unidos N° 4.816.567. Los mAbs adaptados a humanos que tienen CDR derivadas de una inmunoglobulina de donante no humano (típicamente murino) y las partes derivadas de inmunoglobulina restantes de la molécula que se derivan de una o más inmunoglobulinas humanas pueden prepararse mediante técnicas conocidas por los expertos en la técnica, como las divulgadas en la Patente de Estados Unidos N° 5.225.539. Las secuencias marco humanas útiles para la adaptación humana pueden ser seleccionadas por los expertos en la técnica a partir de bases de datos relevantes. Opcionalmente, los mAbs adaptados a humanos pueden modificarse adicionalmente incorporando residuos de soporte de marco alterados para preservar la afinidad de unión mediante técnicas como las divulgadas en Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 86:10029-10032, 1989 y Hodgson et al., Bio/Technology, 9:421, 1991.

Los mAbs completamente humanos que carecen de cualquier secuencia no humana pueden prepararse a partir de ratones transgénicos de inmunoglobulina humana mediante técnicas referenciadas en, por ejemplo, Lonberg et al., Nature 368:856-859, 1994; Fishwild et al., Nature Biotechnology 14:845-851, 1996; and Mendez et al., Nature Genetics 15:146-156, 1997. Los mAbs humanos también pueden prepararse y optimizarse a partir de bibliotecas de presentación de fagos mediante técnicas referenciadas en, por ejemplo, en Knappik et al., J. Mol. Biol.

296:57-86, 2000; y Krebs et al., J. Immunol. Meth. 254:67-84 2001). Los fragmentos de anticuerpos, por ejemplo, fragmentos Fab, F(ab')2, Fd y dAb pueden producirse mediante la escisión de los anticuerpos o mediante ingeniería recombinante. Por ejemplo, los fragmentos Fab y F(ab')2 pueden generarse tratando los anticuerpos con una enzima como la pepsina.

Las inmunoglobulinas pueden asignarse a cinco clases principales, concretamente IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de la cadena pesada. IgA e IgG se subclasifican además como los isotipos IgA¹, IgA², IgG¹, IgG², IgG3 e IgG4.

Una región variable de anticuerpo consiste de una región "marco" interrumpida por tres "sitios de unión a antígeno". Los sitios de unión a antígeno se definen usando varios términos: (i) Las regiones determinantes de la complementariedad (CDR), tres en la VH (HCDR1, HCDR2, HCDR3) y tres en la VL (LCDR1, LCDR2, LCDR3), se basan en la variabilidad de secuencia Wu y Kabat, J. Exp. Med. 132:211-250, 1970; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991). (ii) Las "regiones hipervariables", "HVR" o "HV", tres en la VH (H1, H2, H3) y tres en la VL (L1, L2, L3), se refieren a las regiones de los dominios variables de un anticuerpo que son hipervariables en estructura como se define por Chothia y Lesk (Chothia y Lesk, Mol. Biol. 196:901-917, 1987). Otros términos incluyen "IMGT-CDR" (Lefranc et al., Dev. Comparat. Immunol. 27:55-77, 2003) y "Uso de residuos determinantes de la especificidad" (SDRU) (Almagro, Mol. Recognit. 17:132-143, 2004). La base de datos International de ImMunoGeneTics (IMGT) (http://www_imgt_org) proporciona una numeración y definición estandarizadas de sitios de unión a antígeno. La correspondencia entre las delineaciones CDR, HV e IMGt se describe en Lefranc et al., Dev. Comparat. Immunol 27: 5-77, 2003.

"Marco" o "secuencias marco" son las secuencias restantes de una región variable distinta de las definidas como sitio de unión a antígeno. El marco se divide típicamente en cuatro regiones, FR1, FR2, FR3 y FR3, que forman un andamiaje para los tres sitios de unión al antígeno en cada región variable. Debido a que el sitio de unión al antígeno puede definirse mediante varios términos como se ha descrito anteriormente, la secuencia de aminoácidos exacta de un marco depende de cómo se definió el sitio de unión al antígeno.

El término "anticuerpo que se une al colágeno II humano" como se usa en la presente se refiere a un anticuerpo que se une al colágeno II humano con una EC50 de 1 pg/ml o menos en un ensayo ELISA usando placas recubiertas con 10 pg/ml de colágeno II humano de acuerdo con el método descrito en el ejemplo 2.

El término "colágeno II humano" o huColII como se usa en la presente se refiere al colágeno humano tipo II aislado del cartílago. El colágeno II humano se sintetiza como cadenas de procolágeno alfa Col2A1 (SEQ ID NO: 79). La molécula de procolágeno se secreta en la matriz extracelular donde forma fibrillas. La formación de fibrillas viene acompañada de la eliminación de los propéptidos C- y N- por proteinasas específicas. El procesamiento del hucolII fibrilar es bien conocido.

El término "vector" significa un polinucleótido capaz de ser duplicado dentro de un sistema biológico o que puede moverse entre tales sistemas. Los polinucleótidos de vector contienen típicamente elementos, como orígenes de replicación, señal de poliadenilación o marcadores de selección, que funcionan para facilitar la duplicación o mantenimiento de estos polinucleótidos en un sistema biológico. Los ejemplos de tales sistemas biológicos pueden incluir una célula, virus, animal, planta, y sistemas biológicos reconstituidos que utilizan componentes biológicos capaces de duplicar un vector. El polinucleótido que comprende un vector puede ser moléculas de ADN o ARN o un híbrido de estas.

El término "vector de expresión" significa un vector que puede utilizarse en un sistema biológico o en un sistema biológico reconstituido para dirigir la traducción de un polipéptido codificado por una secuencia de polinucleótidos presente en el vector de expresión.

El término "polinucleótido" significa una molécula que comprende una cadena de nucleótidos enlazados covalentemente por una estructura principal de azúcar-fosfato u otra química covalente equivalente. Los ADN y ARN de cadena doble y de cadena sencilla son ejemplos típicos de polinucleótidos.

El término "polipéptido" o "proteína" significa una molécula que comprende por lo menos dos residuos de aminoácidos enlazados por un enlace peptídico para formar un polipéptido. Los polipéptidos pequeños de menos de 50 aminoácidos pueden ser referidos como "péptidos".

Los códigos de aminoácidos convencionales de una y tres letras se usan en la presente de la siguiente manera:

Aminoácido Código de tres letras Código de una letra

Alanina ala A

Arginina arg R

Asparagina asn N

Aspartato asp D

Cisteína cys C

Glutamato glu E

Glutamina gln Q

Glicina gly G

Histidina his H

Isoleucina ile I

Leucina leu L

Lisina lys K

Metionina met M

Fenilalanina phe F

Prolina pro P

Serina ser S

Treonina thr T

Triptofano trp W

Tirosina tyr Y

Valina val V

Composiciones del asunto

La presente invención proporciona anticuerpos monoclonales que se unen al colágeno II humano que comprende una región variable de la cadena pesada (región VH) y una región variable de la cadena ligera (región VL), en donde: la región VH comprende las secuencias de la región determinante de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada 1, 2 y 3 (HCDR1, HCDR2 y HCDR3) como se muestra en las SEQ ID NO: 11, 17 y 30, respectivamente; y la región VL comprende las secuencias de la CDR 1, 2 y 3 de la cadena ligera (LCDR1, LCDR2 y LCDR3) como se muestra en las SEQ ID NO: 34, 42 y 47, respectivamente. Estos anticuerpos son útiles como reactivos de investigación, reactivos de diagnóstico, y vehículos para administrar un agente terapéutico, por ejemplo, a una articulación.

La invención proporciona nuevos sitios de unión a antígeno y cadenas de inmunoglobulina derivadas de bibliotecas de genes de inmunoglobulina humana.

En la presente se divulga un anticuerpo monoclonal aislado o un fragmento del mismo que se une al colágeno II humano, que comprende una región variable de la cadena pesada (región VH) y una región variable de la cadena ligera (región VL), en donde la región VH comprende las secuencias de la región determinante de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada 1, 2 y 3 (HCDR1, HCDR2 y HCDR3) y la región VL comprende las secuencias de la región determinante de la complementariedad (CDR) de la cadena ligera 1, 2 y 3 (LCDR1, LCDR2 y LCDR3) como se muestra en la Tabla 1.

Tabla 1.

También se divulga los anticuerpos que tienen sustituciones conservadoras en las secuencias de la cadena pesada y ligera mostradas en la Tabla 1 (SEQ ID NO: 8-76). La sustitución conservadora puede residir en las regiones marco, o en sitios de unión a antígeno, siempre que no afecten negativamente las propiedades del anticuerpo. Pueden hacerse sustituciones para mejorar las propiedades del anticuerpo, por ejemplo, estabilidad o afinidad. Las sustituciones conservadoras producirán moléculas que tienen características funcionales y químicas similares a las moléculas en las que se realizan tales modificaciones. Las sustituciones de aminoácidos ejemplares se muestran en la Tabla 2. Además, cualquier residuo nativo en el polipéptido también puede sustituirse con alanina, como se ha descrito anteriormente para la mutagénesis de exploración de alanina (MacLennan et al., Acta Physiol. Scand. Suplemento. 643:55-67, 1998; Sasaki et al., Adv. Biophys. 35:1-24, 1998). Las sustituciones de aminoácidos pueden realizarse, por ejemplo, mediante mutagénesis por PCR (Patente de Estados Unidos N° 4.683.195). Se pueden generar bibliotecas de variantes usando métodos bien conocidos, por ejemplo, usando codones aleatorios (NNK) o no aleatorios, por ejemplo codones DVK, que codifican 11 aminoácidos (ACDEGKNRSYW). Las variantes resultantes pueden caracterizarse por su unión al colágeno II humano como se describe en los Ejemplos, o por otras propiedades como la estabilidad usando métodos bien conocidos.

Tabla 2.

continuación

En otras realizaciones, la divulgación proporciona un anticuerpo monoclonal aislado o fragmento del mismo que se une al colágeno II humano, que comprende una región VH y una región VL, en donde la región VH comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una secuencia mostrada en las SEQ ID NO: 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67 o 68, y la región VL comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una secuencia mostrada en las SEQ ID NO: 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 5 o 7.

Aunque las realizaciones ilustradas en los Ejemplos comprenden pares de regiones variables, una de una cadena pesada y una de una cadena ligera, un experto en la técnica reconocerá que realizaciones alternativas divulgadas en la presente pueden comprender regiones variables de cadena pesada o ligera individuales. La región variable individual puede usarse para seleccionar una segunda región variable capaz de formar un fragmento de unión al antígeno específico de dos dominios capaz de, por ejemplo, unirse al colágeno II humano. La selección puede lograrse mediante métodos de selección de presentación en fagos usando, por ejemplo, un enfoque combinatorio dual jerárquico divulgado en la Publicación Internacional N° WO92/01047. En este enfoque, se usa una colonia individual que contiene un clon de cadena H o L para infectar una biblioteca completa de clones que codifican la otra cadena (L o H), y el dominio de unión al antígeno específico de dos cadenas resultante se selecciona de acuerdo con las técnicas de presentación de fagos como se describe.

En la presente se divulgan cadenas pesadas y cadenas ligeras de anticuerpos aisladas que comprenden las secuencias de aminoácidos que se muestran en las SEQ ID NO: 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67 o 68 para las pesadas cadenas y las SEQ ID NO: 69, 70, 71,72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 y 79 para las cadenas ligeras.

Otro aspecto de la invención son los polinucleótidos aislados que codifican cualquiera de los anticuerpos de la invención o su complemento. En la presente se divulgan ciertos polinucleótidos ejemplares, sin embargo, otros polinucleótidos que, dada la degeneración del código genético o las preferencias de codones en un sistema de expresión dado, codifican los anticuerpos de la invención también están dentro del alcance de la invención. Los polinucleótidos que codifican los anticuerpos de la invención se preparan mediante métodos bien conocidos. Estos métodos incluyen, pero no están limitados a, el aislamiento a partir de una fuente natural (en el caso de variantes de secuencias de aminoácidos de origen natural) o la preparación mediante mutagénesis mediada por oligonucleótidos (o dirigida al sitio), mutagénesis por PCR, y síntesis química de genes.

Los anticuerpos ejemplares de la invención pueden ser de los isotipos IgG, IgD, IgE, IgA o IgM. Además, los anticuerpos de la invención pueden modificarse postraduccionalmente mediante procesos como glicosilación, isomerización, desglicosilación o modificación covalente de origen no natural, como la adición de fracciones de polietilenglicol (PEG) (pegilación) y lipidación. Tales modificaciones pueden tener lugar in vivo o in vitro. Por ejemplo, los anticuerpos de la invención pueden conjugarse con polietilenglicol (PEGiladrse) para mejorar sus perfiles farmacocinéticos. La conjugación puede llevarse a cabo mediante técnicas conocidas por los expertos en la técnica. Se ha demostrado que la conjugación de anticuerpos terapéuticos con PEG mejora la farmacodinámica sin interferir con la función. (Deckert et al., Int. J. Cancer 87:382-390, 2000; Knight et al., Platelets 15:409-418, 2004; Leong et al., Cytokine 16:106-119, 2001; Yang et al., Protein Eng. 16:761-770, 2003).

Las propiedades farmacocinéticas de los anticuerpos de la invención pueden mejorarse mediante modificaciones de Fc mediante técnicas conocidas por los expertos en la técnica. La "Fc" de un anticuerpo no está implicada directamente en la unión de un anticuerpo a un antígeno, pero muestra varias funciones efectoras. Un anticuerpo "Fc" es un término bien conocido y se define en base a la escisión de la papaína de los anticuerpos. La Fc de un anticuerpo está directamente implicada en la ADCC (citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos) y la CDC (citotoxicidad dependiente del complemento) en base a la activación del complemento, la unión de C1q y la unión del receptor de Fc. La activación del complemento (CDC) se inicia mediante la unión del factor de complemento C1q a la Fc de la mayoría de las subclases de anticuerpos IgG. Aunque la influencia de un anticuerpo sobre el sistema del complemento depende de ciertas condiciones, la unión a C1q está provocada por sitios de unión definidos en la Fc. Tales sitios de unión se conocen en el estado de la técnica y se describen, por ejemplo, en Boakle et al., Nature 282: 742-43, 1979; Lukas et al., J. Immunol. 127: 2555-60, 1981; Brunhouse y Cebra, Mol. Immunol. 16: 907-17, 1979; Burton et al., Nature 288:338-44, 1980; Thommesen et al., Mol. Immunol.

37: 995-1004, 2000; Idusogie et al., J. Immunol. 164:4178-84, 2000; Hezareh et al., J. Virology 75:12161-68, 2001; Morgan et al., Immunology 86:319-24, 1995; EP 0307434. Tales sitios de unión son, por ejemplo, L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331, y P329 (numeración de acuerdo con el índice de Kabat de la EU). Los anticuerpos de las subclases IgG 1, IgG2 e IgG3 muestran generalmente activación del complemento y unión a C1q, mientras que IgG4 no activa el sistema del complemento y no se une a C1q.

Los anticuerpos de la invención se caracterizan porque las cadenas constantes son de origen humano. Tales cadenas constantes son bien conocidas y descritas, por ejemplo, por Kabat (ver, por ejemplo, Johnson y Wu, Nuc Acids Res. 28, 214-18, 2000). Por ejemplo, una región constante de cadena pesada humana útil comprende la SEQ ID NO: 77. Por ejemplo, una región constante de cadena ligera humana útil comprende una secuencia de aminoácidos de una región constante de cadena ligera kappa de la SEQ ID NO: 78.

Los anticuerpos de la invención pueden unirse al colágeno II humano con una Kd menor o igual a aproximadamente 10-6, 10-7, 10-8, 10-9, 10-10, 10-11 o 10-12 M. La afinidad de un anticuerpo con el colágeno II humano puede determinarse experimentalmente usando cualquier método adecuado. Tales métodos pueden utilizar instrumentación Biacore o KinExA, ELISA o ensayos de unión competitiva conocidos por los expertos en la técnica.

Otra realización de la invención es un vector que comprende por lo menos un polinucleótido de la invención. Los dominios variables de la cadena pesada y ligera de la invención se combinan con secuencias de promotor, iniciación de la traducción, región constante, región 3' no traducida, poliadenilación y terminación de la transcripción para formar constructos de vectores de expresión. Los constructos de expresión de la cadena pesada y ligera pueden combinarse en un único vector, cotransfectarse, transfectarse en serie, o transfectarse por separado en células huésped que luego se fusionan para formar una célula huésped individual que expresa ambas cadenas.

Otra realización de la invención es una célula huésped que comprende un vector de la invención. Tales células huésped pueden ser células eucariotas, células bacterianas, células vegetales o células arqueales. Las células eucariotas ejemplares pueden ser de origen mamífero, de insecto, aviar u otro animal. Las células eucariotas de mamíferos incluyen líneas celulares inmortalizadas como hibridomas o líneas celulares de mieloma como SP2/0 (American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, CRL-1581), NS0 (European Collection of Cell Cultures (ECACC), Salisbury, Wiltshire, Reino Unido, ECACC N° 85110503), líneas celulares murinas FO (ATCC CRL-1646) y Ag653 (ATCC ^cRL-1580). Una línea celular de mieloma humano ejemplar es la U266 (ATTC ^cR^l-TIB-196). Otras líneas celulares útiles incluyen las derivadas de células de ovario de hámster chino (CHO) como CHO-K1SV (Lonza Biologics, Walkersville, MD), CHO-K1 (ATCC CRL-61) o DG44.

Otra realización de la invención es un método para elaborar un anticuerpo que se une al colágeno II humano que comprende cultivar una célula huésped de la invención y recuperar el anticuerpo producido por la célula huésped. Los métodos para elaborar anticuerpos y purificarlos son bien conocidos en la técnica.

Usos de la invención

Los anticuerpos de la invención son útiles como agentes de investigación, y como agentes de administración de moléculas terapéuticas a sitios que expresan colágeno II humano, como una articulación.

La artritis, incluyendo la osteoartritis, la artritis reumatoide, las articulaciones artríticas como resultado de una lesión, y similares, son afecciones inflamatorias comunes que se beneficiarían de la administración local y la retención articular de proteínas antiinflamatorias y moléculas terapéuticas.

Las moléculas terapéuticas pueden acoplarse a los anticuerpos de la invención para una retención articular mejorada. Las moléculas terapéuticas pueden ser proteínas o compuestos químicos. Las moléculas terapéuticas ejemplares son los factores de crecimiento, citoquinas y agentes antiinflamatorios, proteínas que inducen el crecimiento y la reparación del colágeno, así como moléculas pequeñas que inhiben la destrucción proteolítica del tejido articular. Las proteínas terapéuticas pueden acoplarse a los anticuerpos anti-colágeno de la invención o fragmentos de los mismos mediante la generación de proteínas de fusión usando métodos recombinantes bien conocidos. Por ejemplo, el extremo N-terminal de la proteína terapéutica puede enlazarse directamente al extremo C-terminal de un anticuerpo de la invención a través de un enlace amida o un conector peptídico. Los constructos de fusión ejemplares se describen, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos N° 5116964, la Patente de Estados Unidos N° 5709859, las Publicaciones Internacionales N° WO04/002417 y WO05/081687. También pueden acoplarse moléculas terapéuticas a los anticuerpos de la invención usando reticulación química bien conocida en la técnica, por ejemplo usando enlace de hidrazona o semicarbazona.

Los anticuerpos de la invención con opcionalmente una molécula terapéutica acoplada pueden prepararse como composiciones farmacéuticas que contienen una cantidad eficaz de la molécula terapéutica como ingrediente activo en un portador farmacéuticamente aceptable. El término "portador" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente, o vehículo con el que se administra el compuesto activo. Tales vehículos farmacéuticos pueden ser líquidos, como agua y aceites, incluyendo los de petróleo, de origen animal, vegetal o sintético, como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. Por ejemplo, se puede usar un 0,4% de solución salina y un 0,3% de glicina. Estas soluciones son estériles y generalmente están libres de partículas. Se pueden esterilizar mediante técnicas de esterilización convencionales bien conocidas (por ejemplo, filtración). Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según se requiera para aproximarse a las condiciones fisiológicas, como agentes de ajuste del pH o de tamponamiento, agentes estabilizantes, espesantes, lubricantes y colorantes, etc. La concentración del agente de la invención en tal formulación farmacéutica puede variar ampliamente, es decir, de menos de aproximadamente un 0,5%, habitualmente de o por lo menos de aproximadamente el 1% hasta tanto como el 15 o el 20% en peso y se seleccionará principalmente en base a la dosis requerida, los volúmenes de fluido, las viscosidades, etc., de acuerdo con el modo particular de administración seleccionado. Los métodos para preparar composiciones administrables parenteralmente son bien conocidos y se describen con más detalle, por ejemplo, en "Remington's Pharmaceutical Science", 15a ed., Mack Publishing Company, Easton, PA.

Los anticuerpos de la invención pueden liofilizarse para almacenamiento y reconstituirse en un portador adecuado antes de su uso. Se ha demostrado que esta técnica es eficaz con inmunoglobulinas y preparaciones de proteínas convencionales y pueden emplearse técnicas de liofilización y reconstitución conocidas en la técnica.

Se describirá ahora la presente invención con referencia a los siguientes ejemplos específicos, no limitativos.

Ejemplo 1

Identificación de mAbs de unión a colágeno II

Los Fab de unión a colágeno II humano se seleccionaron de bibliotecas de presentación de fagos pIX de ^novo (Shi et al., J. Mol. Biol. 397:385-396, 2010; WO2009085462A1; US N° de Serie 12/546850). Las bibliotecas se generaron diversificando los genes VH de la línea germinal humana IGHV1-69*01, IGHV3-23*01 e IGHV5-51*01, y los genes VLkappa de la línea germinal humana 012 (IGKV1-39*01), L6 (IGKV3-11*01), A27 (IGKV3-20*01), y B3 (IGKV4-1*01). Para ensamblar los dominios de VH y VL completos, los genes IGHV se recombinaron con el minigen IGHJ-4 humano a través del giro H3, y los genes IGKV se recombinaron con el minigen IGKJ-1. Se eligieron las posiciones en las regiones variables de la cadena pesada y ligera alrededor de los giros H1, H2, L1, L2 y L3 correspondientes a las posiciones identificadas como que están frecuentemente en contacto con antígenos de proteínas y péptidos para la diversificación. La diversidad de secuencias en las posiciones seleccionadas se limitó a los residuos que se producen en cada posición en las familias de genes de línea germinal IGHV o IGLV de los genes IGHV o IGLV respectivos. La diversidad en el giro H3 se generó utilizando giros sintéticos de tamaño corto a medio de 7-14 aminoácidos. La distribución de aminoácidos en H3 fue diseñada para imitar la variación observada de aminoácidos en anticuerpos humanos. El diseño de la biblioteca se detalla en Shi et al., J. Mol. Biol. 397:385-396, 2010. La diversidad en las bibliotecas generadas para VH H1 y H2 se muestra en la Tabla 4, para H3 en la Tabla 4 y para VL L1, L2 y L3 en la Tabla 5. Los andamiajes utilizados para generar bibliotecas se nombraron de acuerdo con su origen de genes de la línea germinal de VH y VL humana. Las secuencias de los andamiajes de VH y VL construidos usados para la diversificación se muestran en las SEQ ID NO: 1-7. (3-23: SEQ ID NO: 1; 1-69: SEQ ID NO: 2; 5-51: SEQ ID NO: 3; O12: SEQ ID NO: 4; L6: SEQ ID NO: 5; L27: SEQ ID NO: 6; B3: SEQ ID NO: 7) (Figura 1). Las tres bibliotecas de la cadena pesada se combinaron con las cuatro cadenas ligeras de la línea germinal o las bibliotecas de la cadena ligera de la línea germinal para generar 24 combinaciones únicas de VH:VL para la selección.

Tabla 3.

Las bibliotecas se analizaron usando colágeno II humano purificado (Chondrex, N° 2015, tratado con guanidina 3 M, DEAE-celulosa y Na²HPO, solución de 0,5 mg/ml en ácido acético 0,05 M) recubierto en una placa Maxisorp (Nunc) a 10 Mg/ml en 1x tampón de dilución de colágeno (Chondrex). Las bibliotecas se bloquearon durante una hora a temperatura ambiente con 3% de leche en TBST. Se combinaron 100 ql de cada biblioteca mediante una cadena pesada para generar los 6 pares de bibliotecas HV:HL, y se aplicaron a placas recubiertas con colágeno II humano prebloqueado (1 hora en 3% de leche en TBST). Después de 1 h de incubación, los pocillos se lavaron en TBST y en PBS cinco veces en cada uno. Se añadieron 200 ql de células MC1061 F’ (OD⁶⁰⁰~1,0) a los pocillos durante 30 minutos a 37° C, después de lo cual las células infectadas se colocaron en placas sobre placas 2xYT (Carb/Glu) y

Tabl a 4.

continuación

y se colocaron a 37° C durante la noche. Las colonias que habían crecido durante la noche se rasparon de las placas en 2 ml por placa de 2xYT (Carb/Glu/20% de glicerol). Se usaron 50 ml de bacterias resuspendidas para inocular un cultivo de 20 ml en 2xYT (Carb) y el resto de las bacterias se congelaron. Los cultivos se cultivaron a 37° C hasta un OD⁶⁰⁰de 0,5-1,0, después de lo cual se añadió 1 ml de fago auxiliar VCSM13 (Stratagene, N° de Cat.

200251) al cultivo a una multiplicidad de infección de aproximadamente 10:1 y la incubación se llevó a cabo durante 30 minutos a 37° C sin agitación. Se añadieron kanamicina e IPTG al cultivo y se cultivó a 30° C durante la noche. El fago se precipitó con 2% de PEG/NaCl 0,25 M y se resuspendió en 1 ml de PBS. Una quinta parte del fago precipitado con PEG se usó para iniciar la siguiente ronda de adsorción y el fago restante se almacenó a -20° C.

El ciclo de selección se repitió cuatro veces. Después del último ciclo de selección, las colonias se rasparon en 2 ml de 2xYT Carb/Glu/20% de glicerol y se usaron 100 gl de la suspensión celular para aislar el ADN plasmídico. El pIX se escindió mediante digestión con Nhe1/SpeI y auto-ligación del ADN aislado. Después de la ligación, el ADN se sometió a electroporación en células MC1061 F' electrocompetentes y se colocó en placas para colonias individuales en 2xYT Carb/Glu.

Tabl a 5.

Ejemplo 2

Reactividad cruzada de mAb de col II con otros colágenos

Los Fabs de unión a colágeno II humano obtenidos de la adsorción inicial se seleccionaron para reactividad cruzada con colágenos humanos I, IV y V, y colágenos de rata I y II.

Preparación de lisados Fab.

Las colonias se recogieron de las transformaciones escindidas con pIX y se cultivaron en 2xYT Carb. Al día siguiente, se usaron 50 gl de los cultivos saturados para inocular una placa de expresión que contenía 400 gl por pocillo de 2xYT Carb y la placa se cultivó a 37° C durante 6 horas. Se indujo la expresión de Fab con la adición de IPTG 1 mM y la placa se colocó a 30° C durante la noche. Al día siguiente, los cultivos de Fab inducidos se giraron a 2000 rpm durante 10 minutos, y el lisado aclarado se usó en ensayos posteriores.

ELISA

Se recubrieron placas Maxisorp ELISA (Nunc) con 10 gg/ml de colágeno I humano (Chondrex), colágeno II humano (Chondrex), colágeno I de rata (Chondrex), colágeno II de rata (Chondrex) o con 5 gg/ml de colágeno IV humano (Chemicon) o colágeno V humano (Chemicon), o con anti-Fd (el sitio de unión) a 1 gg/ml, todo en PBS, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los pocillos se lavaron tres veces en TBST y se bloquearon durante una hora con 200 gl de leche al 3% en TBST. Se añadieron 100 gl del lisado de Fab a los pocillos de las placas ELISA recubiertas, y se incubaron 1 hora a temperatura ambiente. Los pocillos se lavaron tres veces, seguido de la adición de 100 gl de anti-kappa-HRP (Southern Biotech) a 1:5000 en PBS. Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante una hora, se lavaron tres veces con TBST y se desarrollaron con sustrato de ELISA de quimioluminiscencia BM (Roche Applied Science). Se secuenciaron los clones que se unieron a colágeno II humano y de rata sin unirse a colágeno I, IV o V humano, o colágeno I de rata y se caracterizaron adicionalmente los clones únicos. La Figura 3 muestra los datos de ELISA para los 13 clones elegidos para caracterización adicional. Las secuencias de los Fabs se muestran en la Figura 2 y la Tabla 1.

Ejemplo 3

Los mAbs de Col II se unen a cartílago humano

Purificación de Fab a pequeña escala

Se indujo la expresión de fab en Escherichia coli en 2xYT Carb (excepto que se usó TurboBroth (Athena ES) para la expresión de Fab 551-3) con IPTG 1 mM a 30° C durante la noche. Las bacterias inducidas se sedimentaron 30 minutos a 4500 rpm, los sedimentos celulares se resuspendieron en tampón de lisis (Tris 20 mM, pH 8,5, NaCl 350 mM, imidazol 7,5 mM) con inhibidores de proteasa y se rompieron con dos pases a través de un microfluidizador. El lisado celular se aclaró con dos giros a 10.000 rpm durante 10 minutos. La resina Talon (Clontech) se equilibró con tampón de lisis y se añadieron dos ml al lisado clarificado. Los Fabs unidos se eluyeron con dos incubaciones de 5 minutos cada una usando tampón de elución (EDTA 150 mM, Tris 20 mM, pH 8,5) y se dializaron en Tris 20 mM, pH 8,5. Los Fabs dializados se purificaron adicionalmente usando una resina Q-sepharose Fast Flow (resina QFF; GE Healthcare), y se usaron para experimentos.

Ensayo de unión al cartílago

Se obtuvo cartílago humano de pacientes con osteoartritis (Northland Laboratories). El cartílago se pulverizó primero y se almacenó como una suspensión en PBS con inhibidores de proteasa a 4° C. Para probar la unión del cartílago, se añadieron 2,5 gl de suspensión de cartílago por punto de datos a 97,5 gl de TBST con 3% de leche y la mezcla se rotó a temperatura ambiente durante una hora. La unión de Fabs al cartílago se probó usando una placa MultiScreen HTS (Millipore) usando el colector de vacío. Brevemente, se añadieron 100 gl de la suspensión a una placa MultiScreen prehumedecida, y se aplicó vacío para asentar el cartílago sobre el filtro del pocillo, después de lo cual los pocillos se lavaran dos veces con TBST. Se añadieron 2,4 gg de cada Fab en 100 gl de PBS a los pocillos y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Los pocillos se lavaron tres veces con TBST, y se añadió anti-kappa-HRP (Southern Biotech) a los pocillos. Después de una hora de incubación, los pocillos se lavaron en PBST, se añadió el sustrato de ELISA de quimioluminiscencia BM (Roche Applied Science) y la suspensión resultante de fragmentos de cartílago se transfirió a una placa ELISA de pocillos negros para la detección de luminiscencia. Los 13 Fabs mostraron unión al cartílago (Figura 4).

Ejemplo 4

Afinidades de mAb a Col II

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo monoclonal aislado o fragmento del mismo que se une al colágeno II humano, que comprende una región variable de la cadena pesada (región VH) y una región variable de la cadena ligera (región VL), en donde: la región VH comprende las secuencias de la región determinante de complementariedad (CDR) de la cadena pesada 1, 2 y 3 (HCDR1, HCDR2 y HCDR3) como se muestra en las SEQ ID NO: 11, 17 y 30, respectivamente; y

la región VL comprende las secuencias de la CDR de la cadena ligera1, 2 y 3 (LCDR1, LCDR2 y LCDR3) como se muestra en las SEQ ID NO: 34, 42 y 47, respectivamente.

2. El anticuerpo monoclonal aislado o fragmento de la reivindicación 1, en donde la región VH comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 66, y la región VL comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 5.

3. El anticuerpo aislado de cualquier reivindicación anterior, en donde el anticuerpo comprende un fragmento Fab.

4. Un polinucleótido aislado que codifica un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1.

5. Un vector que comprende por lo menos un polinucleótido de la reivindicación 4.

6. Una célula huésped que comprende el vector de la reivindicación 5.

7. Un método para elaborar un anticuerpo que se une al colágeno II humano, que comprende cultivar la célula huésped de la reivindicación 6 y recuperar el anticuerpo producido por la célula huésped.