CN102369219A - 针对人tweak的抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

结合于TWEAK的抗体，其特征在于结合TWEAK，其特征在于包含选自由SEQ ID NO：8，16或24组成的组的CDR3H作为重链可变结构域。

Description

针对人TWEAK的抗体及其应用
本发明涉及针对人TWEAK的抗体(TWEAK抗体)，用于制备它们的方法，包含所述抗体的药物组合物，及其应用。
发明背景
人TWEAK(UniProtKB O43508，程序性细胞死亡的TNF-相关弱诱导物)是一种细胞表面相关的II型跨膜蛋白质。在Chicheportiche，Y.等，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)272(1997)32401-32410；Marsters，S.A.等，Curr.Biol.(目前生物学)8(1998)525-528；Lynch，C.N等，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)274(1999)8455-8459中对TWEAK进行了描述。TWEAK的活性形式是可溶的同源三聚体。人和鼠TWEAK在受体结合结构域中显示93％的序列同一性。TWEAK受体Fn14(成纤维细胞生长因子可诱导的14kDa蛋白)是129个氨基酸的I型跨膜蛋白，其由在配体结合结构域中的一个单一富含半胱氨酸的结构域组成。TWEAK的信号传导通过NF-KB途径激活发生。TWEAK mRNA在多种组织中表达并且在大多数重要器官如心脏、脑、骨骼肌和胰腺，与免疫系统相关的组织如脾、淋巴结和胸腺中都有发现。已经在心脏、脑、肺、胎盘、血管EC和平滑肌细胞中检测到Fn14mRNA。无TWEAK和无Fn14-的敲除小鼠是有活力的，健康的和能育的，具有更多天然杀伤细胞，并且显示增强的先天炎性反应。TWEAK涉及程序性细胞死亡、增殖、血管发生、缺血半影区(ischemic penumbra)、脑水肿、多发性硬化。
抗-TWEAK抗体在WO 1998/005783，WO 2000/042073，WO 2003/086311，WO 2006/130429，WO 2006/130374，WO 2006/122187，WO 2006/089095，WO 2006/088890，WO 2006/052926中提及。
发明概述
本发明包括结合于人TWEAK的抗体，其特征在于包含选自由SEQ IDNO：8，16或24组成的组中的CDR3区(CDR3H)作为重链可变结构域。
本发明包括包含SEQ ID NO：1的可变轻链和SEQ ID NO：5的可变重链的抗体的嵌合的、人源化的或T细胞表位缺失变体，含有SEQ ID NO：9的可变轻链和SEQ ID NO：13的可变重链的抗体的嵌合的、人源化的或T细胞表位缺失变体，或含有SEQ ID NO：17的可变轻链和SEQ ID NO：21的可变重链的抗体的嵌合的、人源化的或T细胞表位缺失变体。
优选地，所述抗体特征在于包含SEQ ID NO：6的CDR1H，SEQ IDNO：7的CDR2H和SEQ ID NO：8的CDR3H。
优选地，所述抗体特征在于包含SEQ ID NO：14的CDR1H，SEQ IDNO：15的CDR2H和SEQ ID NO：16的CDR3H。
优选地，所述抗体特征在于包含SEQ ID NO：22的CDR1H，SEQ IDNO：23的CDR2H和SEQ ID NO：24的CDR3H。
优选地，所述抗体特征在于包含SEQ ID NO：22的CDR1H，SEQ IDNO：74的CDR2H和SEQ ID NO：24的CDR3H。
优选地，所述抗体特征在于包含SEQ ID NO：22的CDR1H，SEQ IDNO：75的CDR2H和SEQ ID NO：24的CDR3H。
优选地，所述抗体特征在于包含SEQ ID NO：6的CDR1H，SEQ IDNO：7的CDR2H，SEQ ID NO：8的CDR3H和SEQ ID NO：2的CDR1L，SEQID NO：3的CDR2L，SEQ ID NO：4的CDR3L。
优选地，所述抗体特征在于包含SEQ ID NO：14的CDR1H，SEQ IDNO：15的CDR2H，SEQ ID NO：16的CDR3H和SEQ ID NO：10的CDR1L，SEQ ID NO：11的CDR2L，SEQ ID NO：12的CDR3L。
优选地，所述抗体特征在于包含SEQ ID NO：22的CDR1H，SEQ IDNO：23的CDR2H，SEQ ID NO：24的CDR3H和SEQ ID NO：18的CDR1L，SEQ ID NO：19的CDR2L，SEQ ID NO：20的CDR3L。
优选地，所述抗体特征在于包含SEQ ID NO：22的CDR1H，SEQ IDNO：74的CDR2H，SEQ ID NO：24的CDR3H和SEQ ID NO：18的CDR1L，SEQ ID NO：19的CDR2L，SEQ ID NO：20的CDR3L。
优选地，所述抗体特征在于包含SEQ ID NO：22的CDR1H，SEQ IDNO：75的CDR2H，SEQ ID NO：24的CDR3H和SEQ ID NO：18的CDR1L，SEQ ID NO：19的CDR2L，SEQ ID NO：20的CDR3L。
优选地，所述抗体特征在于包含选自由SEQ ID NO：1，9，17，32，33，34，35，44，45，46，47，55，56，57，58，59，或60组成的组中的序列作为轻链可变结构域序列。
优选地，所述抗体特征在于包含选自由SEQ ID NO：5，13，21，36，37，38，39，40，41，42，43，48，49，50，51，52，53，54，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，或73组成的组中的序列作为重链可变结构域序列。
优选地，所述抗体特征在于包含选自由SEQ ID NO：1，32，33，34，35组成的组的序列作为轻链可变结构域序列和选自由SEQ ID NO：5，36，37，38，39，40，41，42，43组成的组的序列作为重链可变结构域序列。
优选地，所述抗体特征在于包含选自由SEQ ID NO：9，44，45，46，47组成的组的序列作为轻链可变结构域序列，和选自由SEQ ID NO：13，48，49，50，51，52，53，54组成的组的序列作为重链可变结构域序列。
优选地，所述抗体特征在于包含选自由SEQ ID NO：17，55，56，57，58，59，60组成的组中的序列作为轻链可变结构域序列，和选自由SEQ IDNO：21，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73组成的组中的序列作为重链可变结构域序列。
优选的是选自由下列各项组成的组的轻链和重链可变链的组合：1/5，1/36，1/37，1/381/39，1/40，1/41，1/42，1/43，32/5，32/36，32/37，32/38，32/39，32/40，32/41，32/42，32/43，33/5，33/36，33/37，33/38，33/39，33/40，33/41，33/42，33/43，34/5，34/36，34/37，34/3834/39，34/40，34/41，34/42，34/43，35/5，35/36，35/37，35/38，35/39，35/40，35/41，35/42，35/43；9/13，9/48，9/49；9/50，9/51，9/52，9/53，9/54，44/13，44/48，44/49；44/50，44/51，44/52，44/53，44/54，45/13，45/48，45/49；45/50，45/51，45/52，45/53，45/54，46/13，46/48，46/49；46/50，46/51，46/52，46/53，46/54，47/13，47/48，47/49；47/50，47/51，47/52，47/53，47/54；17/21，17/61，17/62，17/63，17/64，17/65，17/66，17/67，17/68，17/69，17/70，17/71，17/72，17/73，55/21，55/61，55/62，55/63，55/64，55/65，55/66，55/67，55/68，55/69，55/70，55/71，55/72，55/73，56/21，56/61，56/62，56/63，56/64，56/65，56/66，56/67，56/68，56/69，56/70，56/71，56/72，56/73，57/21，57/61，57/62，57/63，57/64，57/65，57/66，57/67，57/68，57/69，57/70，57/71，57/72，57/73，58/21，58/61，58/62，58/63，58/64，58/65，58/66，58/67，58/68，58/69，58/70，58/71，58/72，58/73，59/21，59/61，59/62，59/63，59/64，59/65，59/66，59/67，59/68，59/69，59/70，59/71，59/72，59/73，60/21，60/61，60/62，60/63，60/64，60/65，60/66，60/67，60/68，60/69，60/70，60/71，60/72，60/73(例如，47/52意为包含SEQ ID NO：47的可变轻链和SEQ ID NO：52的可变重链的抗体)。
尤其优选的是根据本发明的抗体，其包含选自由下列各项组成的组中的可变链组合：SEQ ID NO：57和SEQ ID NO：68的轻链可变链和重链可变链，SEQ ID NO：57和SEQ ID NO：69的轻链可变链和重链可变链，SEQ IDNO：57和SEQ ID NO：70的轻链可变链和重链可变链，SEQ ID NO：57和SEQ ID NO：71的轻链可变链和重链可变链，SEQ ID NO：57和SEQ IDNO：72的轻链可变链和重链可变链，SEQ ID NO：57和SEQID NO：73的轻链可变链和重链可变链，SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：68的轻链可变链和重链可变链，SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：69的轻链可变链和重链可变链，SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：70的轻链可变链和重链可变链，SEQ IDNO：58和SEQ ID NO：71的轻链可变链和重链可变链；SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：72的轻链可变链和重链可变链，SEQ ID NO：58和SEQ IDNO：73的轻链可变链和重链可变链。
本发明的另一个实施方案是选自由SEQ ID NO：32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73的可变重链或轻链组成的组中的可变重链或轻链。将所述可变重链或轻链用作产生根据本发明的抗体的中间体。
优选地，结合TWEAK并且特征在于上述氨基酸序列和氨基酸序列片段的抗体是人IgG1同种型。
根据本发明所述的抗体显示通过Biacore测量的，在25℃，可溶性人TWEAK(氨基酸99-249)和抗体之间的复合物的半衰期为53分钟以下(优选地，20分钟以下，尤其优选地，10-20分钟)。尤其优选将显示这样的低半衰期的抗-TWEAK抗体用于治疗肿瘤疾病。
根据本发明的抗体特异性结合于人TWEAK并且抑制人TWEAK和Fn14之间的相互作用，IC50值为15ng/ml以下。所述抗体优选地是人IgG1同种型。优选地，所述抗体是人源化的抗体或人抗体。用于本文时，IC50意为阻断人TWEAK和Fn14之间50％的相互作用的抗体的量。
根据本发明的抗体优选地显示通过Biacore测量的，在25℃，可溶性鼠TWEAK(氨基酸81-225)和抗体之间的复合物的半衰期为70分钟以下(优选地40-70分钟)，结合鼠TWEAK，并且抑制鼠TWEAK和Fn14之间的相互作用，IC50值为40ng/ml以下。
本发明的另一个实施方案是包含本发明所述的抗体的药物组合物。
本发明的另一个实施方案是本发明所述的抗体用于制备药物组合物的应用。
本发明的另一个实施方案是将本发明所述的抗体用于治疗癌症，优选地用于治疗结肠癌、肺癌或胰腺癌的应用。
本发明的另一个实施方案是用于制备包含根据本发明的抗体的药物组合物的方法。
本发明的另一个实施方案是编码根据本发明的抗体的重链可变结构域和/或轻链可变结构域的核酸。
本发明还提供包含本发明的核酸的表达载体，其能够在原核宿主细胞或真核宿主细胞中表达所述核酸，以及包含所述载体用于重组产生所述抗体的宿主细胞。
本发明还包括含有本发明的载体的原核宿主细胞或真核宿主细胞。
本发明还包括用于生产根据本发明的重组人抗体或人源化抗体的方法，其特征在于在原核宿主细胞或真核宿主细胞中表达根据本发明的核酸并且从所述细胞或细胞培养上清液中回收所述抗体。本发明还包括可通过所述重组方法获得的抗体。
根据本发明的抗体对于需要TWEAK靶向治疗的患者显示益处。根据本发明的抗体具有新的和创造性的性质，导致对于患有肿瘤疾病的患者，尤其是患有结肠癌、肺癌或胰腺癌的患者的益处。
本发明还提供用于治疗患有癌症，尤其是结肠癌、肺癌或胰腺癌的患者的方法，所述方法包括向诊断患有所述疾病(并且因此需要所述疗法)的患者施用有效量的结合根据本发明的TWEAK的抗体。所述抗体优选地在药物组合物中进行施用。
本发明的另一个实施方案是用于治疗患有癌症的患者，尤其是患有结肠癌、肺癌或胰腺癌的患者的方法，所述方法特征在于向患者施用根据本发明的抗体。
本发明还包括根据本发明的抗体用于治疗患有癌症，尤其是患有结肠癌、肺癌或胰腺癌的患者的应用，和用于制备根据本发明的药物组合物的应用。此外，本发明包括用于制备根据本发明的药物组合物的方法。
本发明还包括药物组合物，所述药物组合物包含根据本发明的抗体，其任选地与用于配制药用目的的抗体的缓冲剂和/或佐剂一起。
本发明还提供在药用载体中包含根据本发明的抗体的药物组合物。在一个实施方案中，所述药物组合物可以包含在制品或试剂盒中。
发明详述
术语“抗体”涵盖抗体结构的各种形式，包括但不限于，完整的抗体，双特异性抗体和抗体片段。根据本发明所述的抗体优选地是人源化的抗体、嵌合抗体或进一步遗传改造的抗体，只要其仍旧保留了根据本发明的抗体的特征性性质。
“抗体片段”包括全长抗体的部分，优选地包括其可变结构域，或至少其抗原结合位点。抗体片段的实例包括双抗体、单链抗体分子和形成自抗体片段的多特异性抗体。scFv抗体例如描述在Houston，J.S.，Methods inEnzymol(酶学方法).203(1991)46-88中。此外，抗体片段包括具有VH结构域特征的单链多肽，即能够与VL结构域组装在一起形成功能性抗原结合位点，或结合于TWEAK的VL结构域的特征的单链多肽，即能够与VH结构域组装在一起形成功能性抗原结合位点。
术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”用于本文时指单氨基酸组成的抗体分子的制剂。
术语“人源化抗体”指这样的抗体，其中与母体免疫球蛋白相比，构架和/或“互补决定区”(CDR)已经被修饰为包括不同物种的免疫球蛋白的CDR。在优选的实施方案中，将仓鼠CDR移植到人抗体的构架区中以制备“人源化的抗体”。见，例如Riechmann，L.，等，Nature(自然)332(1988)323-327；和Neuberger，M.S.，等，Nature(自然)314(1985)268-270。
术语“嵌合抗体”指一种单克隆抗体，其包括来自小鼠的可变区，即结合区，以及源自不同来源或物种的恒定区的至少一部分，其通常通过重组DNA技术进行制备。嵌合抗体包括例如小鼠可变区和人恒定区。所述小鼠/人嵌合抗体是被表达的免疫球蛋白基因的产物，所述基因包含编码大鼠免疫球蛋白可变区的DNA区段和编码人免疫球蛋白恒定区的DNA区段。本发明包括的20种“嵌合抗体”的其他形式是其中类别或亚类已经从初始抗体进行修饰或改变的那些抗体。也将这种“嵌合”抗体称作“类别转换抗体”。制备嵌合抗体的方法包括目前在本领域众所周知的常规重组DNA和基因转染技术。见，例如，25 Morrison，S.L.，等，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad Sci.USA)81(1984)6851-6855；美国专利号5,202,238和5,204,244。
术语“T细胞表位缺失抗体”指这样的抗体，其已经通过去除人T细胞表位(蛋白质中的肽序列，具有结合II类MHC分子的能力)被修饰去除或减少了免疫原性。通过这种方法，鉴定了肽的氨基酸侧链和具有II类MHC结合槽的特异性结合袋之间的相互作用。将鉴定的免疫原性区进行突变以消除免疫原性。将这样的方法一般描述在例如WO 98/52976中。
“可变结构域”(轻链(VL)的可变结构域，重链(VH)的可变结构域)用于本文中时，表示直接参与抗体与抗原结合的每对轻链和重链结构域对。可变轻链和重链的结构域具有相同的一般结构且每个结构域包括4个构架(FR)区，所述构架区的序列普遍保守，其通过3个“高变区”(或互补性决定区，CDRs)相连接。构架区采用β-折叠构象且CDR可以形成连接β-折叠结构的环。每条链中的CDR通过构架区以其三维结构保持并与来自另一条链的CDR一起形成抗原结合位点。抗体重链和轻链CDR3区在按照本发明的抗体的结合特异性/亲和力方面发挥特别重要的作用并因此提供本发明的另一个目的。
用于本文时，术语“抗体的抗原结合部分”指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。抗体的抗原结合部分包括来自“互补决定区”或“CDRs”的氨基酸残基。“构架”或“FR”区是除本文中定义的高变区残基之外的那些可变结构域区域。因此，抗体的轻链和重链可变结构域从N端到C端包括结构域FR1，CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。特别地，重链的CDR3是最有助于抗原结合的区域并且限定抗体的性质。CDR和FR区域按照Kabat等，免疫目的的蛋白质序列(Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest)，第5版，公众健康服务，国家健康研究所(Public Health Service，National Institutes of Health)，Bethesda，MD.(1991))的标准定义确定和/或是来自“高变环”的那些残基。
术语“CDR1H”指根据Kabat计算的重链可变区的CDR1区域。CDR2L，CDR3H等意为来自重链(H)或轻链(L)的各个区域。例如特征在于包含SEQID NO：6的CDR1H的抗体意为在其可变重链中包含该氨基酸序列作为重链可变链CDR1区域的抗体。例如，特征在于包含SEQ ID NO：6的CDR1H，SEQ ID NO：7的CDR2H，SEQ ID NO：8的CDR3H的抗体意为在其重链中包含SEQ ID NO：6作为CDR1的序列，包含SEQ ID NO：7作为CDR2序列和包含SEQ ID NO：8作为CDR3序列的抗体。
术语“核酸”或“核酸分子”用于本文时意欲包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链的或双链的，但优选地是双链DNA。
用在本申请中的术语“氨基酸”指天然存在的羧基α-氨基酸的组，其包括丙氨酸(三字母代码ala，一字母代码：A)，精氨酸(arg，R)，天冬酰胺(asn，N)，天冬氨酸(asp，D)，半胱氨酸(cys，C)，谷氨酰胺(gln，Q)，谷氨酸(glu，E)，甘氨酸(gly，G)，组氨酸(his，H)，异亮氨酸(ile，I)，亮氨酸(leu，L)，赖氨酸(lys，K)，甲硫氨酸(met，M)，苯丙氨酸(phe，F)，脯氨酸(pro，P)，丝氨酸(ser，S)，苏氨酸(thr，T)，色氨酸(trp，W)，酪氨酸(tyr，Y)和缬氨酸(val，V)。
当核酸在被置于与另一个核酸的功能关系中，是“可操作地连接的”。例如，前序列或分泌前导序列的DNA与多肽的DNA可操作地连接，条件是其表达为参与多肽分泌的前蛋白；启动子或增强子与编码序列可操作地连接，条件是其影响序列的转录；或核糖体结合位点与编码序列可操作地连接，条件是其被定位为促进翻译。一般地，“可操作地连接的”意指被连接的DNA序列是共线性的，且在分泌前导序列的情形中，是连续的且在可读框中。然而，增强子不必须是连续的。连接通过在方便的限制性位点处的连接来实现。如果所述位点不存在，则合成的寡核苷酸适体或接头根据常规实践使用。
用于本文中时，表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可交替使用，且全部这些名称都包括子代。因此，词语“转化体”和“转化的细胞”包括原代受试细胞和由其来源的培养物，而不考虑转移的次数。还理解所有的子代的DNA含量可能不精确一致，这归因于有意或无意的突变。包括在最初转化的细胞中筛选的具有相同功能或生物学活性的变异子代。
抗体的“Fc部分”不直接参与抗体与抗原的结合，但是显示不同的效应子功能。“抗体的Fc部分”是技术人员众所周知的术语并且基于抗体的木瓜蛋白酶裂解而限定。取决于它们重链的恒定区的氨基酸序列，抗体或免疫球蛋白被分为下列种类：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，其中一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1，IgG2，IgG3和IgG4，IgA1和IgA2。根据重链恒定区，将免疫球蛋白的不同种类分别称为α、δ、ε、γ和μ。抗体的Fc部分直接参与ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用)和基于补体激活的CDC(补体依赖的细胞毒性)，C1q结合和Fc受体结合。补体激活(CDC)由补体因子C1q与大多数IgG抗体亚类Fc部分结合而起始。因为抗体对于补体系统的影响依赖于某些条件，因此抗体与C1q的结合由Fc部分中的限定的结合位点所导致。所述结合位点是现有技术中已知的，并例如由Boakle，R.J.等.，Nature(自然)282(1979)742-743；Lukas，T.J.等，J.Immunol(免疫学杂志).127(1981)2555-2560；Brunhouse，R.和Cebra，J.J.，Mol.Immunol(分子免疫学).16(1979)907-917；Burton，D.R等，Nature(自然)288(1980)338-344；Thommesen，J.E.等，Mol.Immunol(分子免疫学).37(2000)995-1004；Idusogie，E.E.等，J.Immunol(免疫学杂志).164(2000)4178-4184；Hezareh，M等，J.Virology(病毒学杂志)75(2001)12161-12168；Morgan，A.等，Immunology(免疫学)86(1995)319-324；EP 0307434进行描述。所述结合位点例如是L234，L235，D270，N297，E318，K320，K322，P331和P329(根据Kabat的EU索引进行编号，见下)。亚类IgG1，IgG2和IgG3的抗体通常显示补体激活和C1q和C3结合，而IgG4不激活补体系统，并且不结合于C1q和C3。
根据本发明的抗体优选地包括人起源的Fc部分，其是IgG1亚类的人抗体的Fc部分。
根据本发明的抗体特征在于恒定链是人起源的。所述恒定链是现有技术中公知的，并且例如由Kabat描述(见例如Johnson，G.和Wu，T.T.，Nucleic Acids Res(核酸研究).28(2000)214-218)。例如，有效的人重链恒定区包含SEQ ID NO：27或28的氨基酸序列。例如，有效的人轻链恒定区包含SEQ ID NO：25的κ-轻链恒定区的氨基酸序列。还优选仓鼠起源的抗体，其包含根据Kabat的仓鼠抗体的抗体可变序列构架(见，例如Sequencesof Proteins of Immunological Interest(免疫目的蛋白序列)，Kabat，E.A.等，第5版，DIANE出版(1992))。
本发明包括用于治疗需要所述治疗的患者的方法，其特征在于向所述患者施用治疗有效量的根据本发明的抗体。
本发明包括根据本发明的抗体用于治疗的应用。
本发明包括根据本发明的抗体用于制备治疗癌症的药物的应用。
本发明包括根据本发明的抗体用于治疗炎性疾病的应用，优选地用于治疗癌症，尤其是结肠癌、肺癌或胰腺癌的应用。
本发明的另一个实施方案是用于产生针对TWEAK的抗体的方法，其特征在于将编码根据本发明的抗体的重链的核酸序列和编码所述抗体的轻链的核酸序列插入一个或两个表达载体中，所述载体被插入真核宿主细胞中，所述编码的抗体被表达并且从所述宿主细胞或上清液中回收。
根据本发明所述的抗体优选地由重组方式产生。所述方法是现有技术中广泛已知的并且包含在原核细胞和真核细胞中的蛋白表达，以及随后的抗体多肽分离和通常纯化为药用纯度。对于蛋白表达，将编码轻链和重链或其片段的核酸通过标准方法插入表达载体中。在适合的原核或真核宿主细胞如CHO细胞，NS0细胞，SP2/0细胞，HEK293细胞，COS细胞，酵母，或大肠杆菌细胞中进行表达，并且将所述抗体从细胞(上清液或裂解后的细胞)中回收。
重组生产抗体是现有技术中公知的，并且例如在Makrides，S.C.，Protein Expr.Purif.17(1999)183-202；Geisse，S.，等，Protein Expr.Purif.8(1996)271-282；Kaufman，R.J.，分子生物技术(Mol.Biotechnol.)16(2000)151-160；Werner，R.G.，Drug Res(药物研究).48(1998)870-880的综述文章中描述。
抗体可以存在于完整细胞中，细胞裂解物中，或以部分纯化形式，或基本纯化形式存在。通过标准技术，包括碱/SDS处理，CsCl分级(CsClbanding)，柱层析法，琼脂糖凝胶电泳，和其它本领域公知的技术，进行纯化从而消除其他细胞成分或其它污染物，例如其它细胞核酸或蛋白。见Ausubel，F.，等，编辑，现代分子生物学中的方法(Current Protocols inMolecular Biology)，Greene Publishing和Wiley Interscience，New York(1987)。
在NS0细胞中的表达记述在，例如，Barnes，L.M.，等.，细胞技术学(Cytotechnology)32(2000)109-123；Barnes，L.M.，等.，生物技术和生物工程(Biotech.Bioeng.)73(2001)261-270中。瞬时表达记述在，例如，Durocher，Y.，等.，核酸研究(Nucl.Acids.Res.)30(2002)E9中。可变结构域的克隆记述在Orlandi，R.，等.，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86(1989)3833-3837；Carter，P.，等.，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)89(1992)4285-4289；和Norderhaug，L.，等.，免疫学方法杂志(J.Immunol.Method)204(1997)77-87中。优选的瞬时表达系统(HEK 293)记述在Schlaeger，E.-J.，和Christensen，K.，在细胞技术学(Cytotechnology)30(1999)71-83中和Schlaeger，E.-J.，在免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods)194(1996)191-199中。
单克隆抗体适当地从培养基中通过常规免疫球蛋白纯化方法分离，所述纯化方法如，例如蛋白A-琼脂糖，羟基磷灰石层析法，透析或亲和层析法。编码所述单克隆抗体的DNA和RNA容易地使用常规方法进行分离和测序。杂交瘤细胞可以充当所述DNA和RNA的来源。一旦被分离，可以将DNA插入表达载体中，所述表达载体接着被转染到不另外产生免疫球蛋白的宿主细胞如HEK 293细胞，CHO细胞，或骨髓瘤细胞中，从而在宿主细胞中获得重组单克隆抗体的合成。
编码抗-TWEAK抗体的氨基酸序列变体的核酸分子通过现有技术中已知的多种方法进行制备。这些方法包括，但不限于：从天然来源分离(在天然存在的氨基酸序列变体的情形中)，或通过寡核苷酸-介导的(或位点定向)的诱变，PCR诱变和人源化的抗-TWEAK抗体的早期制备的变体或非变体形式的盒诱变进行制备。
根据本发明的重链和轻链可变结构域与启动子序列、翻译起始序列、恒定区序列、3′未翻译区序列、聚腺苷酸化序列和转录终止序列组合以形成表达载体构建体。可以将重链和轻链表达构建体组合在单一载体中，共同转染，连续转染，或分别转染到随后将融合形成表达两条链的单一宿主细胞的宿主细胞中。
在另一方面中，本发明提供组合物，例如药物组合物，其包含与药物载体一起配制的本发明的单克隆抗体或其抗原结合部分的一种或组合。
用于本文时，“药物载体”包括生理相容的任何和所有的溶剂、分散介质、涂层、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗试剂和吸附/再吸收延缓试剂等。优选地，所述载体适合注射或输注。
本发明的组合物可以通过本领域已知的多种方法进行施用。如技术人员所理解的，施用的路径和/或方式取决于需要的结果是可变的。
药物载体包括无菌水溶液或分散体和用于制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。这些介质和药剂用于药物活性物质的应用是本领域已知的。除了水之外，所述载体可以例如是等渗的缓冲盐溶液。
不管所选择的施用路径为何，可以以适合的水合形式使用的本发明的化合物，和/或本发明的药物组合物通过本领域技术人员已知的常规方式配制到药用剂型中。
在本发明的药物组合物中的活性成分的实际剂量水平可以变化从而获得这样的活性成分的量，其对于特定的患者、组合物和施用方式有效获得需要的治疗反应，而不会对于患者具有毒性(有效量)。选定的剂量水平将取决于多种药物代谢动力学因素包括所用的本发明的特定组合物的活性、或其酯、其盐或其酰胺、施用路径、施用时间、使用的特定化合物的排泄速率、与所用的特定组合物组合使用的其它药物、化合物和/或材料、待治疗的患者的年龄、性别、体重、病症、一般健康和以前的医疗病史，以及医疗领域已知的类似因素。
本发明包括根据本发明的抗体用于治疗患有癌症、尤其是结肠癌、肺癌或胰腺癌的患者的应用。
本发明还包括用于治疗患有所述疾病的患者的方法。
本发明还提供用于制备药物组合物的方法，所述药物组合物包含有效量的根据本发明的抗体以及药物载体，和根据本发明的抗体用于所述方法的应用。
本发明还提供有效量的根据本发明的抗体，优选地与药物载体一起用于制备药剂的应用，所述药剂用于治疗患有癌症，尤其是结肠癌、肺癌或胰腺癌的患者。
本发明还提供有效量的根据本发明的抗体，优选地与药物载体一起用于制备药剂的应用，所述药剂用于治疗患有癌症，尤其是结肠癌、肺癌或胰腺癌的患者。
序列描述
表1：
Figure BPA00001444858000131
表2：
Figure BPA00001444858000141
表3：
Figure BPA00001444858000142
Figure BPA00001444858000151
表4：
Figure BPA00001444858000152
Figure BPA00001444858000161
提供下面的实施例，序列表和附图来辅助理解本发明，在后附的权利要求中涵盖的真实范围。要理解在不背离本发明的精神的前提下，可以对提及的方法进行改进。
附图描述
图1.抗-TWEAK抗体对Panc1人胰腺癌异种移植物生长的作用
图2.抗-TWEAK抗体对ACHN人肾癌异种移植物生长的作用
实施例1
免疫描述
用人/鼠TWEAK免疫亚美尼亚仓鼠
如下对亚美尼亚仓鼠进行免疫：在第0天用50μg重组人可溶性TWEAK(氨基酸99-249)与完全弗氏佐剂一起，在第28天和第56天(都与不完全弗氏佐剂一起)，并且在第84天用50μg重组小鼠可溶性TWEAK(氨基酸81-225)与不完全弗氏佐剂一起进行腹膜内注射。在第108天和91天取血，并且制备血清，将其用于通过ELISA进行滴度测定(见下)。选择具有最高滴度的动物用于在第112天通过静脉内注射50μg的重组小鼠可溶性TWEAK进行加强并基于它们结合人和小鼠TWEAK(实施例2)，中和人和小鼠TWEAK-Fn14相互作用(实施例4和5)，并抑制IL8分泌(实施例6)的能力进行选择。此外，研究了抗体-TWEAK复合物的半衰期(实施例3)。在Panc1人胰腺癌异种移植物和ACHN肾癌异种移植物中测试抗体的抗肿瘤功效。
实施例2
结合人和小鼠TWEAK(ELISA)
通过ELISA确定抗-TWEAK抗体与人和小鼠TWEAK的结合。将人或小鼠重组TWEAK以1μg/ml，25μl/孔，通过在2-8℃温育过夜固定在384-孔的Nunc Maxisorp板的0.5M pH 9.5的碳酸盐包被缓冲液中。用PBS/1％BSA在室温将所述板封闭1小时，随后进行2次洗涤步骤(在PBS中的0.1％20)，并用在封闭缓冲液中的不同浓度的抗-TWEAK抗体或所述抗体的杂交瘤上清液在室温温育1小时。在进一步洗涤4次后，用在封闭缓冲液中稀释1∶5000的抗-仓鼠-HRP抗体在室温1小时来检测抗体。在进一步洗涤4次步骤后，通过加入
Figure BPA00001444858000172
(Roche DiagnosticsGmbH)10-30分钟来使信号显影。在405nm读取吸光度。
实施例3
使用Biacore确定抗体-TWEAK复合物的半衰期
使用Biacore 2000仪器，其中将Biacore链霉抗生物素蛋白包被的传感器设置于系统中。以100μl/min的流速使用系统缓冲液HBS-ET(10mMHEPES pH 7.4，150mM NaCl，1mM EDTA，0.05％20)。样品缓冲液是系统缓冲液。将生物素化的人可溶性TWEAK和生物素化的鼠可溶性TWEAK固定在SA传感器上的不同的流动室中，每个室150RU。将流动室FC1用作空白参照室。将100nM的每种抗体以100μl/min注射到系统中作为分析物，缔合时间为2分钟。监测免疫复合物的解离，持续5分钟。用HBS-ET洗涤传感器表面达10秒，并使用10mM甘氨酸pH 2.25进行2x2分钟注射来进行再生。在25℃进行这一程序。用间隔[240s-300s]的复合物解离阶段的动力学限速步骤来计算解离率kd[1/s](Biacore评估软件(Biacore Evaluation Software)4.0)。根据等式t1/2diss＝ln(2)/(60x kd)，计算免疫复合物的半衰期，单位为分钟。将结果显示在表5和6b中。
表5：
Figure BPA00001444858000174
Figure BPA00001444858000181
1)：人κ轻链SEQ ID NO：25和人IgG1SEQ ID NO：27
实施例4
中和TWEAK-Fn14相互作用(人)
通过受体相互作用ELISA来显示对人TWEAK/人Fn14相互作用的封闭。将96-孔
Figure BPA00001444858000182
板(Nunc)的每孔用PBS中的100μl 1μg/ml人Fn14:Fc(与人IgG1的Fc部分融合的人Fn14的细胞外结构域(氨基酸1-75))在室温包被1.5小时，并在摇动下，将所述板用在PBS中的5％FBS溶液在室温封闭30分钟。同时，在摇动下，将在封闭溶液中的2.5ng/ml的人Flag-标记的可溶性TWEAK(氨基酸106-249)用不同浓度的抗-TWEAK抗体或杂交瘤上清液在室温温育2小时。在用洗涤缓冲液(在PBS中的0.1％
Figure BPA00001444858000183
20)洗涤Fn14-包被的板1次后，将100μl的TWEAK-抗体溶液转移到每孔中，并将所述板在室温温育1小时，随后用洗涤缓冲液洗涤4次。将孔用100μl在封闭缓冲液中稀释1∶5000的抗-FLAG-HRP检测抗体填充，并在室温温育1小时。再进行4个洗涤步骤后，通过加入100μl 3，3，5，5-四甲基联苯胺(TMB)溶液来显影信号约10分钟。通过加入100μl1N HCl终止反应，并且在450nm测量吸光度(参照波长620nm)。将结果显示在表6中。
实施例5
中和TWEAK-Fn14相互作用(小鼠)
小鼠TWEAK/小鼠Fn14相互作用ELISA遵循关于人蛋白所述的类似原则，但是使用不同的检测系统，因为小鼠的可溶性TWEAK没有被标记。简言之，将Maxisorp板如上面关于人Fn14:Fc所述用小鼠Fn14:Fc(与人IgG1的Fc部分融合的小鼠Fn14的细胞外结构域(氨基酸1-75))进行包被，随后进行封闭和洗涤。将4ng/ml的小鼠可溶性TWEAK用封闭缓冲液中的抗-TWEAK-抗体或杂交瘤上清液进行预先温育，并将100μl的混合物加入Fn14-包被的板的每个孔中。在室温温育1小时并洗涤4次后，将在封闭缓冲液中125ng/ml的生物素化的抗-小鼠TWEAK抗体在室温加入，历时1小时，随后再进行4个洗涤步骤。通过用在封闭缓冲液中稀释1∶5000的链霉-抗生物素蛋白-HRP在室温温育30分钟来检测TWEAK抗体。如上述对信号进行显影并测量吸光度。结果显示在表6中。
实施例6
IL-8分泌ELISA
使用A375黑素瘤细胞在IL-8分泌测定法中显示抗-TWEAK抗体在细胞系统中对TWEAK活性的封闭。将10,000个A375细胞(ATCC#CRL1619)接种在96-孔细胞培养板每孔中的100μl生长培养基(DMEM，含有4.5g/L葡萄糖，含有丙酮酸盐和GlutaMAXTM/10％FBS)中，并在37℃/5％CO2中温育48小时。在室温，将300ng/ml的人重组可溶性TWEAK与在生长培养基中的不同浓度的抗-TWEAK抗体进行预先温育，历时30分钟。接着，将50μl的混合物加入细胞板的每个孔中，随后再进行48小时的温育从而允许IL-8分泌。在200xg将所述板离心5分钟后，去除20μl的细胞上清液，并将其与来自“CXCL8 Quantikine ELISA”试剂盒(R&DSystems)的980μl RD5P校正稀释剂混合。根据生产商的说明，通过ELISA检测IL-8。将结果显示在表6中。
表6a：
Figure BPA00001444858000191
Figure BPA00001444858000201
表6b：
表6c：
  抗体  可变轻链序列   可变重链序列
  15  SEQ ID NO：57   SEQ ID NO：68
  16  SEQ ID NO：57   SEQ ID NO：69
  17  SEQ ID NO：57   SEQ ID NO：70
  18  SEQ ID NO：57   SEQ IDNO：71
  19  SEQ ID NO：57   SEQ ID NO：72
  20  SEQ ID NO：57   SEQ ID NO：73
  21  SEQ ID NO：58   SEQ ID NO：68
  22  SEQ ID NO：58  SEQ ID NO：69
  23  SEQ ID NO：58  SEQ ID NO：70
  24  SEQ ID NO：58  SEQ ID NO：71
  25  SEQ ID NO：58  SEQ ID NO：72
  26  SEQ ID NO：58  SEQ ID NO：73
实施例7
抗-TWEAK抗体针对Panc1人胰腺癌异种移植物生长的抗肿瘤功效
研究设计：在研究的第0天，将Panc1细胞(1x 107细胞/小鼠)用基质胶(1∶1)sc植入SCID-米色鼠中。植入后第15天开始处理。在第56天结束研究。
组
·赋形剂ip，2x/wk，n＝10
·20mg/kg TW202，ip，2x/wk，n＝10
·20mg/kg TW205，ip，2x/wk，n＝10
·20mg/kg TW212，ip，2x/wk，n＝10
在研究结束时，对每个肿瘤进行称重。将结果显示在表7中。
表7：
Figure BPA00001444858000211
将肿瘤体积对比肿瘤细胞植入后天数显示在图1中。
实施例8
抗-TWEAK抗体对ACHN肾癌异种移植物生长的作用
研究设计：在研究的第0天，用基质胶(1∶1)将ACHN细胞(1x107细胞/小鼠)sc植入无胸腺裸鼠中。在植入后第10天开始处理。在第40天结束研究。
组：
·赋形剂ip，2x/wk，n＝10
·TW202(20mg/kg)ip，2x/wk，n＝10
·TW205(20mg/kg)，ip，2x/wk，n＝10
·TW212(20mg/kg)ip，2x/wk，n＝10
在研究结束的时候，对肿瘤的平均体积进行称重。将结果显示在表8中。
表8：
Figure BPA00001444858000221
将肿瘤体积对比肿瘤细胞植入后天数显示在图2中。
Figure IPA00001444857500011
Figure IPA00001444857500021
Figure IPA00001444857500031
Figure IPA00001444857500041
Figure IPA00001444857500051
Figure IPA00001444857500061
Figure IPA00001444857500071
Figure IPA00001444857500081
Figure IPA00001444857500091
Figure IPA00001444857500101
Figure IPA00001444857500111
Figure IPA00001444857500121
Figure IPA00001444857500131
Figure IPA00001444857500141
Figure IPA00001444857500151
Figure IPA00001444857500161
Figure IPA00001444857500171
Figure IPA00001444857500181
Figure IPA00001444857500191
Figure IPA00001444857500211
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Claims (16)

1.结合于人TWEAK的抗体，所述抗体特征在于包含选自由SEQ IDNO：8，16或24组成的组中的CDR3H作为重链可变结构域。
2.下述抗体的嵌合的、人源化的或T-细胞表位缺失的变体：包含SEQID NO：1的可变轻链和SEQ ID NO：5的可变重链的抗体，包含SEQ IDNO：9的可变轻链和SEQ ID NO：13的可变重链的抗体或包含SEQ IDNO：17的可变轻链和SEQ ID NO：21的可变重链的抗体。
3.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于包含SEQ ID NO：6的CDR1H，SEQ ID NO：7的CDR2H，SEQ ID NO：8的CDR3H和SEQ ID NO：2的CDR1L，SEQ ID NO：3的CDR2L，SEQ ID NO：4的CDR3L，或特征在于包含SEQ ID NO：14的CDR1H，SEQ ID NO：15的CDR2H，SEQ ID NO：16的CDR3H和SEQ ID NO：10的CDR1L，SEQ ID NO：11的CDR2L，SEQ IDNO：12的CDR3L，或特征在于包含SEQ ID NO：22的CDR1H，SEQ IDNO：23的CDR2H，SEQ ID NO：24的CDR3H和SEQ ID NO：18的CDR1L，SEQ ID NO：19的CDR2L，SEQ ID NO：20的CDR3L，或特征在于包含SEQID NO：22的CDR1H，SEQ ID NO：74的CDR2H，SEQ ID NO：24的CDR3H和SEQ ID NO：18的CDR1L，SEQ ID NO：19的CDR2L，SEQ ID NO：20的CDR3L，或特征在于包含SEQ ID NO：22的CDR1H，SEQ ID NO：75的CDR2H，SEQ ID NO：24的CDR3H和SEQ ID NO：18的CDR1L，SEQ IDNO：19的CDR2L，SEQ ID NO：20的CDR3L。
4.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于选自由下列各项组成的组的可变轻链序列/可变重链序列的组合：
SEQ ID NO：1/SEQ ID NO：5，1/36，1/37，1/381/39，1/40，1/41，1/42，1/43，32/5，32/36，32/37，32/38，32/39，32/40，32/41，32/42，32/43，33/5，33/36，33/37，33/38，33/39，33/40，33/41，33/42，33/43，34/5，34/36，34/37，34/3834/39，34/40，34/41，34/42，34/43，35/5，35/36，35/37，35/38，35/39，35/40，35/41，35/42，35/43；9/13，9/48，9/49；9/50，9/51，9/52，9/53，9/54，44/13，44/48，44/49；44/50，44/51，44/52，44/53，44/54，45/13，45/48，45/49；45/50，45/51，45/52，45/53，45/54，46/13，46/48，46/49；46/50，46/51，46/52，46/53，46/54，47/13，47/48，47/49；47/50，47/51，47/52，47/53，47/54；17/21，17/61，17/62，17/63，17/64，17/65，17/66，17/67，17/68，17/69，17/70，17/71，17/72，17/73，55/21，55/61，55/62，55/63，55/64，55/65，55/66，55/67，55/68，55/69，55/70，55/71，55/72，55/73，56/21，56/61，56/62，56/63，56/64，56/65，56/66，56/67，56/68，56/69，56/70，56/71，56/72，56/73，57/21，57/61，57/62，57/63，57/64，57/65，57/66，57/67，57/68，57/69，57/70，57/71，57/72，57/73，58/21，58/61，58/62，58/63，58/64，58/65，58/66，58/67，58/68，58/69，58/70，58/71，58/72，58/73，59/21，59/61，59/62，59/63，59/64，59/65，59/66，59/67，59/68，59/69，59/70，59/71，59/72，59/73，60/21，60/61，60/62，60/63，60/64，60/65，60/66，60/67，60/68，60/69，60/70，60/71，60/72，60/73。
5.可变重链或可变轻链，其选自由下列各项组成的组中：SEQ ID NO：32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73的可变重链或可变轻链。
6.药物组合物，其特征在于包含根据权利要求1-4的抗体。
7.根据权利要求1-4的抗体用于制备药物组合物的应用。
8.根据权利要求1-4的抗体用于治疗癌症的应用。
9.根据权利要求1-4的抗体用于治疗结肠癌、肺癌或胰腺癌的应用。
10.编码结合于TWEAK的抗体的重链的核酸，其特征在于所述抗体包含根据权利要求1的重链CDR3区。
11.表达载体，所述表达载体特征在于包含根据权利要求10的核酸，其用于在原核宿主细胞或真核宿主细胞中表达结合TWEAK的抗体。
12.原核宿主细胞或真核宿主细胞，其包含根据权利要求11的载体。
13.用于生产根据权利要求1-4的重组抗体的方法，所述方法特征在于在原核宿主细胞或真核宿主细胞中表达根据权利要求10的核酸并且从所述细胞或细胞培养上清液中回收所述抗体。
14.用于治疗患有癌症的患者的方法，其特征在于向所述患者施用根据权利要求1-4的抗体。
15.权利要求3的抗体，所述抗体包含具有SEQ ID NO：22的氨基酸序列的CDR1H，具有SEQ ID NO：23的氨基酸序列的CDR2H，具有SEQ IDNO：24的氨基酸序列的CDR3H，具有SEQ ID NO：18的氨基酸序列的CDR1L，具有SEQ ID NO：19的氨基酸序列的CDR2L和具有SEQ IDNO：20的氨基酸序列的CDR3L。
16.权利要求3的抗体，所述抗体包含具有SEQ ID NO：14的氨基酸序列的CDR1H，具有SEQ ID NO：15的氨基酸序列的CDR2H，具有SEQ IDNO：16的氨基酸序列的CDR3H，具有SEQ ID NO：10的氨基酸序列的CDR1L，具有SEQ ID NO：11的氨基酸序列的CDR2L和具有SEQ IDNO：12的氨基酸序列的CDR3L。
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