KR20170110681A - Pcsk9 항체, 및 약제학적 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

Pcsk9 항체, 및 약제학적 조성물 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 항-PCSK9 항체, 이의 약제학적 조성물 및 사용 방법과 관련된 면역학 및 분자 생물학의 기술분야에 속한다. 특히, 본 발명은 PCSK9와 특이적으로 결합하고, LDLR의 PCSK9와의 연합을 차단하고, 세포 표면 상의 LDLR의 양을 상향조절하고, LDL 콜레스테롤 및/또는 트리글리세라이드의 대사작용을 증가시키고, 및 고콜레스테롤혈증에 의해 야기된 심혈관 질환을 예방하고/치료할 수 있는 단클론성 항체에 관한 것이다.

Description

PCSK9 항체, 및 약제학적 조성물 및 이의 용도
본 발명은 항-PCSK9 항체, 약제학적 조성물 및 이의 사용 방법에 관련된 면역학 및 분자 생물학의 기술분야의 기술분야에 속한다. 특별하게는, 본 발명은 항-PCSK9 단일클론 항체에 관한 것이다.
프로단백질 전환효소 서브틸리신/켁신 유형 9(Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9) (PCSK9)는 전구단백질 전환효소 활성을 갖는 서브틸리신 프로테아제의 유형이다. PCSK9는 간, 소장, 및 신장에서 주로 발현하고, 그러나 피부 및 신경계에서 거의 발현하지 않는다. 간으로부터 혈액 순환으로 분비되는 PCSK9는 결합 및 세포내배출을 통해 세포 표면 상에서의 지질단백질 (LDL) 수용체 (LDLR)를 감소시킬 수 있다. LDLR는 혈장 중의 LDL를 효과적으로 감소시킬 수 있기 때문에, 더 적은 LDLR가 LDL의 축적을 촉진할 것이다. 따라서, PCSK9에 의해 매개되는 감소된 LDLR은 LDL 콜레스테롤 (LDL-C)에서의 증가를 일으킬 것이다. 또한, PCSK9는 아포지질단백질 B의 지질 대사에 참여한다. PCSK9의 분비는 높은 고콜레스테롤혈증이 뒤따르는 소화관에서의 트리글리세라이드 (TG) 수준을 증가시킬 수 있다 (Rashid S., 그외 다수, 프로단백질 전환효소 서브틸리신 켁신 유형 9는 저밀도 지질단백질 수용체-의존적 및 -독립적 메카니즘을 통해 트리글리세라이드-풍부 아포지질단백질 B 지질단백질의 장내 과잉 생산을 촉진한다. 문헌 [Circulation. 2014 Jul 29; 130(5): 431-41.])
고콜레스테롤혈증을 가진 환자의 약 29%는 스타틴을 취하고 있다. 그러나, 고콜레스테롤혈증을 가진 환자의 8.2%는 스타틴을 섭취하지 못하거나 또는 스타틴으로 원하는 콜레스테롤 농도를 달성할 수 없다. 고콜레스테롤혈증을 갖는 총 3억 9천만명의 환자는 중국을 제외하고 상위 7위 최대 의약 시장에서 살아가는 것으로 추정되었다. 2004년 10월 12일에 보건부에서 배포한 보고서 "중국 거주자의 영양 및 건강 상태의 조사"에 따라, 중국의 성인의 18.8%, 전제 국가에서의 총 1억 6천만명의 환자, 1991년에 7천만명 이상이 고혈압을 가졌다. 다수의 이상지질혈증 환자는 또한 1억 6천만명에 달한다.
현재, PCSK9에 특이적으로 결합하고, PCSK9 및 LDLR의 연합을 차단할 수 있고, 이는 결국 세포 표면에서의 LDLR 발현을 상향조절하고, LDL 및 콜레스테롤의 대사를 향상시키고, 고콜레스테롤혈증에 의해 야기되는 심혈관 질환을 예방하고 치료할 것인 신규한 면역요법 항체를 개발하는 것이 필요하다. 또한, 장기 효율로 TG의 대사작용을 향상시키거나 또는 TG 수준을 감소시킬 수 있는 매우 효과적인 PSCK9 항체를 개발하는 것이 필요하다.
본 발명의 요약
심오한 연구 및 창의적인 연구를 통해, 본 발명자들은 항-PCSK9 단일클론 항체를 얻었다. 본 발명자는 놀랍게도 본 발명에서의 단일클론 항체는 PCSK9에 특이적으로 결합하고, PCSK9 및 LDLR의 연합을 효과적으로 차단하고, 세포막에서 발현되는 LDLR의 양을 상향조절하고, LDL 콜레스테롤의 대사작용을 촉진하고, 특히 장기 반감기를 갖는 TG의 수준을 감소시킬 수 있는 것을 밝혀내었다. 따라서, 이러한 항체는 고콜레스테롤혈증에 의해 야기하는 심혈관 질환을 예방하거나 및/또는 치료하는데 사용될 수 있다.
하기는 본 발명의 요약이다:
본 발명은 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 관한 것이고, 이의 중쇄 CDR 영역은 아미노산 서열 서열번호: 5-7로부터 선택되고;
및/또는
이의 경쇄 CDR 영역은 아미노산 서열 서열번호: 8-10로부터 선택된다.
항체 치료제, 특별하게는 단일클론 항체 (MAB)는 수많은 질환의 치료에서 양호한 효능을 나타내었다. 종래에서는, 이러한 치료적 항체는 표적 항원으로 또는 낮은 결합 활성을 갖는 항체의 친화성 성숙(affinity maturation)을 통해 면역화된 동물로부터 수득한다. 그러나, 이러한 방법은 많은 시간 및 노력이 소요되고, 꽤 빈번하게 특정 항원 에피토프를 표적화하지 못할 수 있다.
항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 결합 활성에 영향을 준다. 각 쇄은 3개의 초가변성 영역을 함유한다. 즉, 중쇄 (H)에서의 상보성 결정 영역 (CDR) HCDR1, HCDR2 및 HCDR3, 및 경쇄 (L)에서의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3는 Kabat, 그외 다수의 문헌 ([Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition (1991), volume 1-3, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD])에 정의되어 있다.
본 발명자들은 창의적으로 결합 활성을 향상시키기 위해 특정한 변형을 갖는 6개의 CDR 영역을 고안하였다. CDR 영역에서의 변화를 수용하기 위해, 또한 결합 활성을 유지하고 서열의 최대의 인간화를 보장하기 위해 프레임워크에서의 아미노산을 변형시켰다.
중쇄 가변 영역에서의 3개의 CDR의 아미노산 서열:
HCDR1：GFTFSSYS (서열번호: 5)
HCDR2：ISSSSSYI (서열번호: 6）
HCDR3：EYDFWSAYYDAFDV (서열번호: 7）
경쇄 가변 영역에서의 3 CDR의 아미노산 서열
LCDR1：SRNIGGGND (서열번호: 8）
LCDR2：GVI (서열번호: 9）
LCDR3：QSFDGSLSGSV (서열번호: 10）
특정 구현예에서, 상기 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 아미노산 서열 서열번호: 2로부터 선택되는 중쇄 가변 영역;
및/또는
아미노산 서열 서열번호: 4로부터 선택되는 경쇄 가변 영역을 함유한다.
기술분야에 알려진 기술, 예컨대 국립생물공학정보센터 (NCBI) 웹사이트로부터의 툴을 사용하여, 기재된 단일클론 항체로부터의 중쇄 및 경쇄 가변 영역에서의 CDR은 각각 서열번호: 5-7 및 서열번호: 8-10로 결정되었다. 본 발명에서, 이러한 단일클론 항체는 MAB1으로 명명된다.
특정 구현예에서, 상기 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, dAb, CDR, 단일 쇄 항체 (예를 들면 scFv), 인간화 항체, 키메라 항체, 또는 이중특이성 항체로부터 선택되는 서열 또는 서열의 일부를 함유한다.
특정 구현예에서, 상기 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 바람직하게는 샌드위치 ELISA에 의해 검출되는 대략 100 nM 미만, 특히, 10 nM 미만, 1 nM, 0.9 nM, 0.8 nM, 0.7 nM, 0.6 nM, 0.5 nM, 0.4 nM, 0.3 nM, 0.2 nM, 0.1 nM 이하의 EC50을 갖는 PCSK9 단백질에 결합된다.
특정 구현예에서, 상기 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 대략 10-5 M 미만, 특히, 대략 10-6 M 미만, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M, 10-10 M 이하의 KD를 갖는 PCSK9 단백질에 결합된다.
특정 구현예에서, 상기 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 마우스이외의 종, 예를 들면, 인간으로부터의 비-CDR 영역을 함유한다.
본 발명은 아미노산 서열 서열번호: 5-7로부터의 CDR을 갖는 중쇄 가변 영역; 바람직하게는 서열번호: 2로부터 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역; 더 바람직하게는 서열번호: 1로부터의 뉴클레오티드 서열을 갖는 중쇄 가변 영역에 대해 암호화된 서열을 함유하는 단리된 뉴클레오티드에 관한 것이다.
본 발명은 아미노산 서열 서열번호: 8-10로부터의 CDR을 갖는 경쇄 가변 영역; 서열번호: 4으로부터의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역; 더 바람직하게는, 서열번호: 3으로부터의 뉴클레오티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역에 대해 암호화된 서열을 함유하는 단리된 뉴클레오티드에 관한 것이다.
본 발명은 임의의 단리된 뉴클레오티드를 함유하는 벡터에 관한 것이다.
본 발명은 임의의 단리된 뉴클레오티드, 또는 벡터를 함유하는 숙주 세포에 관한 것이다.
본 발명은 적절한 조건 하에서 숙주 세포주를 성장시키고, 세포 배양물으로부터 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 회수함으로써 상기 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 상기 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 검출가능한 마커로서 콘주게이션 파트너를 포함하는 콘주게이트에 관한 것이다. 바람직하게는, 콘주게이션 파트너는 방사성 동위원소, 플루오레신, 발광성 물질, 채색 물질, 또는 효소이다.
본 발명은 본 발명에 청구된 상기 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 콘주게이트로 구성된 시약 키트에 관한 것이다.
바람직하게는, 시약 키트는 상기 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 특이적으로 인식하는 제2 항체를 함유할 수 있고; 임의로, 이러한 제2 항체는 검출가능한 마커 예컨대 방사성 동위원소, 플루오레신, 발광성 물질, 채색 물질, 또는 효소를 함유할 수 있다.
본 발명은 샘플에서의 PCSK9의 존재 또는 수준의 검출시 사용되는 본 발명에 청구된 상기 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 콘주게이트로 구성되는 시약 키트의 제조에 관한 것이다.
본 발명은 본 발명에 청구된 상기 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 콘주게이트를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 임의로, 이는 또한 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함할 수 있다.
본 발명은 고혈압, 고콜레스테롤혈증, 및 이러한 병태에 의해 야기되는 심혈관 질환의 예방 및/또는 치료에 있어서의 본 발명에 청구된 상기 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 콘주게이트를 갖는 약물의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명은 하기 목적을 갖는 본 발명에 청구된 상기 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 콘주게이트를 갖는 약물의 제조 방법에 관한 것이다:
a) PCSK9와 특이적으로 결합하고,
b) PCSK9의 LDLR과의 연합을 차단하고,
c) 세포 표면 상의 LDLR의 양 또는 혈장에서의 LDLR의 수준을 상향조절하고,
d) 혈장에서의 LDL 또는 LDL-C의 수준을 저하시키고,
e) 혈장에서의 LDL의 축적을 제한하고,
f) LDLR의 PCSK9-매개 저하를 억제하고, 또는
g) LDL 콜레스테롤 및/또는 트리글리세라이드의 대사작용을 증가시킨다.
본 발명자들은 본 발명에서의 항-PCSK9 단일클론 항체가 심지어 에볼로쿠맙의 효과보다 더 장기로 (최대 32일 동안 마우스에서의 혈장 LDL-C의 감소를 유지함) 마우스 및 원숭이에서의 혈장 LDL 및/또는 LDL-C의 수준을 효과적으로 감소시킬 수 있는 것을 증명하였다. 예상 외로, 본 발명에서의 항-PCSK9 단일클론 항체는 주입 이후 최대 13일 동안 원숭이에서의 혈청 TG 수준을 감소시킬 수 있고, 이는 양호한 처리 능력을 의미한다. 현재, 다른 항-PCSK9 항체는 이러한 결과를 나타내지 않았다.
본 발명은 하기 목적을 위해, 유효 용량의 본 발명에 청구된 상기 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 콘주게이트를 적용하는 생체내 또는 시험관내 방법에 관한 것이다:
a) PCSK9와 특이적으로 결합하고,
b) PCSK9의 LDLR과의 연합을 차단하고,
c) 세포 표면 상의 LDLR의 양 또는 혈장에서의 LDLR의 수준을 상향조절하고,
d) 혈장에서의 LDL 또는 LDL-C의 수준을 저하시키고,
e) 혈장에서의 LDL의 축적을 제한하고,
f) LDLR의 PCSK9-매개 저하를 억제하고, 또는
g) LDL 콜레스테롤 및/또는 트리글리세라이드의 대사작용을 증가시킨다.
본 발명은 고혈압, 고콜레스테롤혈증, 및 이러한 병태에 의해 야기되는 심혈관 질환의 예방 및/또는 치료에 있어서 유효 용량의 본 발명에 청구된 상기 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 콘주게이트의 유효량을 적용하는 방법에 관한 것이다.
특정 구현예에서, 본 발명은 고혈압, 고콜레스테롤혈증, 및 이러한 병태에 의해 야기되는 심혈관 질환의 예방 및/또는 치료시의 본 발명에 청구된 상기 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 콘주게이트에 관한 것이다.
특정 구현예에서, 본 발명은 하기 목적을 위한 본 발명에 청구된 상기 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 콘주게이트의 응용에 관한 것이다:
a) PCSK9와 특이적으로 결합하고,
b) PCSK9의 LDLR과의 연합을 차단하고,
c) 세포 표면 상의 LDLR의 양 또는 혈장에서의 LDLR의 수준을 상향조절하고,
d) 혈장에서의 LDL 또는 LDL-C의 수준을 저하시키고,
e) 혈장에서의 LDL의 축적을 제한하고,
f) LDLR의 PCSK9-매개 저하를 억제하고, 또는
g) LDL 콜레스테롤 및/또는 트리글리세라이드의 대사작용을 증가시킨다.
정의
본원에 달리 정의되지 않는 한, 본 발명과 결합하여 사용되는 과학 및 기술 용어는 본 기술분야에 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 또한, 본원에 기재된 세포 및 조직 배양, 분자 유전학, 올리고- 또는 폴리뉴클레오티드 화학, 및 면역학은 본 기술분야에 잘 알려져 있고 일반적으로 사용되는 것이다. 한편, 본 발명을 더 잘 이해하기 위해, 하기 용어는, 달리 나타내지 않는 한, 하기 의미를 가지는 것으로 이해될 것이다:
본 발명에서 사용되는 용어 "PCSK9 (프로단백질 전환효소 서브틸리신/켁신 유형 9)의 아미노산 서열"은 전장의 PCSK9 단백질 (예를 들면, 인간 NP_777596.21, 마우스 NP_705793.1, 또는 원숭이 NP_001106130.1)뿐만 아니라 특히 마우스 또는 인간 IgG의 Fc (mFc 또는 hFc)을 갖는 이의 융향 단편을 지칭한다. 또한, 본 기술분야의 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, PCSK9 단백질의 아미노산 서열은 자연적으로 또는 인공적으로 돌연변이 (비제한적으로 치환, 결실, 및/또는 첨가를 포함)을 가질 수 있고, 이는 이의 생물학적 기능에 영향을 주지 않는다.
본 발명에서 사용되는 용어 "EC50"은 최대 효과의 50%에 대한 농도를 지칭한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "항체"는 통상적으로 2쌍의 폴리펩티드 쇄 (각 쌍은 "경쇄" (L) 및 "중쇄" (H)을 가짐)로 구성되는 면역글로불린 단백질을 지칭한다. 경쇄는 κ 및 λ 경쇄로서 분류된다. 중쇄는 μ, δ, γ, α, 및 ε로서 분류되고, 이는 각각 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE로서 이소형 항체를 정의한다. 경쇄 및 중쇄에 있어서, 가변 영역 및 불변 영역은 약 12개 이상의 아미노산으로 구성되는 "J" 영역에 의해 연결된다. 중쇄는 또한 약 3개 이상의 아미노산을 갖는 "D" 영역을 포함한다. 각 중쇄는 3개의 도메인 (CH1, CH2, 및 CH3)으로 구성된 불변 영역 (CH) 및 가변 영역 (VH)을 함유한다. 각각의 경쇄는 가변 영역 (VL) 및 불변 영역 (CL)을 함유하고, 이는 하나의 도메인 CL로 구성된다. 불변 영역은 면역계에서의 다양한 세포 (예를 들면, 효과기 세포) 및 고전적 보체계에서의 제1 성분 (C1q)을 포함하는 호스트 조직 또는 인자에의 면역 글로불린의 결합을 중재할 수 있다. VH 및 VL은 또한 프레임워크 영역 (FR)로 지칭되는 상대적으로 보전 영역에 의해 분리되는 높은 가변성을 갖는 영역 (상보성 결정 영역(CDR)으로 지칭됨)으로 세분될 수 있다. 아미노 말단으로부터 카복실 말단까지, 각각의 VH 및 VL 은 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, 및 FR4의 순서로 3개의 CDR 및 4 FR로 구성된다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 (VH 및 VL)은 항체 결합 부위를 형성한다. 아미노산의 영역 또는 도메인에의 분포는 문헌 [Kabat in Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health Bethesda, MD (1987 및 1991))] 또는 문헌 [Chothia & Lesk (1987) Mol. Biol., 196:901-917; 또는 Chothia et al. (1989) Nature, 342:878-883]에서의 정의에 따른다. 용어 "항체"는 이를 제조하는 임의의 특정 방법에 제한되지 않는다. 예를 들면, 이는 특히 재조합 항체, 단일클론 항체, 및 다중클론 항체를 포함한다. 항체는 상이한 이소형, 예를 들면, IgG (예컨대 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 하위유형), IgA1, IgA2, IgD, IgE, 또는 IgM 항체일 수 있다.
본 발명에 사용되는 용어 "항원 결합 단편"은 전장 항체의 단편을 함유하고, 동일한 항원에 특이적으로 결합하고, 및/또는 항원에 대해 전장 항체와 경쟁하는 능력을 유지하는 폴리펩티드로 지칭되고, 이는 또한 "항원 결합부"로 지칭된다. 문헌 [Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, W., ed. 2, Raven Press, N. Y. (1989))]을 참조하여, 이의 전체 논문 및 참조문헌은 모든 목적을 위해 본 발명에 포함된다. 항원 결합 단편은 재조합 DNA 기술에 의해 또는 단백분해 효소 또는 화학물질로 무손상 항체를 절단함으로써 생성될 수 있다. 일부 경우에서, 항원 결합 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, dAb, 및 CDR 단편, 단일 쇄 항체 (예를 들면, scFv), 키메라 항체, 및 디아바디를 포함하고, 이는 특정 항원 결합 능력을 부여하기에 충분한 항체의 적어도 일부를 포함한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "Fd 단편"은 VH 및 CH1 도메인으로 구성된 항체 단편을 지칭하고; 용어 "Fv 단편"은 VL 및 VH 도메인으로 구성된 항체 단편을 지칭하고; 용어 "dAb 단편"은 VH 도메인으로 구성된 항체 단편을 지칭하고 (Ward 그외 다수의 문헌 [Nature 341: 544-546 (1989)]); 용어 "Fab 단편"은 VL, VH, CL, 및 CH1 도메인으로 구성된 항체 단편을 지칭하고; 용어 "F(ab')2 단편"은 힌지 영역에서의 이황화물 가교를 통해 연결되는 2개의 Fab 단편으로 구성된 항체 단편을 지칭한다.
일부 경우에서, 항원 결합 단편은 단일 쇄 항체 (scFv, 예를 들면), 함께 연결된 VL 및 VH 도메인으로 구성된 단일 폴리펩티드 쇄이다 (예를 들면, Bird 그외 다수, 문헌 [Science 242: 423-426 (1988)] 및 Huston 그외 다수, 문헌 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883 (1988)]을 참조한다). 이러한 scFv 분자는 하기 일반 구조를 가질 수 있다: NH2-VL-링커-VH-COOH 또는 NH2-VH-링커-VL-COOH. 적절한 링커는 GGGGS의 반복부 또는 이의 변이체일 수 있다. 예를 들면, 아미노산 서열 (GGGGS)4 또는 이의 변이체가 사용될 수 있다 (Holliger 그외 다수, 문헌 [(1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448]). 다른 링커는 Alfthan, 그외 다수, 문헌 [(1995), Protein Eng. 8: 725-731], Choi, 그외 다수, 문헌 [(2001) Eur. J. Immunol. 31: 94-106], Hu, 그외 다수, 문헌 [(1996), Cancer Res. 56: 3055-3061], Kipriyanov 그외 다수, 문헌 [(1999), J. Mol. Biol. 293: 41-56] 및 Roovers, 그외 다수, 문헌 [(2001) Cancer Immunol]에 기재되어 있다.
일부 경우에서, 항원 결합 단편은 2차 항체, 즉, 2합체 항체 단편이고, 이의 VH 및 VL 도메인은 단일 폴리펩티드 쇄 상에서 발현된다. 그러나, 매우 짧은 링커는 동일한 쇄의 2개의 도메인 사이의 쌍형성(pairing), 2개의 항원 결합 부위를 생성하기 위해 다른 쇄 상의 상보적 도메인과 도메인을 쌍형성하는 것을 허용하지 않는다. (예를 들면, Holliger P. 그외 다수, 문헌 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)] 및 Poljak R. J. 그외 다수, 문헌 [Structure 2: 1121-1123 (1994)]을 참조한다).
본 기술분야의 당업자에게 공지된 종래의 기술 (예컨대 재조합 DNA 기술 또는 효소적/화학적 분리)을 사용하여, 항원 결합 단편 (예컨대 상기 항체 단편)은 주어진 항체로부터 얻어지고, 전장 항체에 대해서도 동일한 방식으로 특이성이 선별될 수 있다.
본 발명에서, 달리 상술하지 않는 한, 용어 "항체"는 온전한 항체뿐만 아니라 항체의 항원 결합 단편을 지칭한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "mAb" 및 "단일클론 항체"는 고도의 동종성 항체의 군으로부터, 즉, 자발적으로 일어날 수 있는 돌연변이를 제외하고 동일한 항체 분자의 군으로부터 유도된 항체 또는 항체의 단편을 지칭한다. 단일클론 항체는 항원 상의 단일 에피토프에 대한 높은 특이성을 가진다. 다중클론 항체는 보통 항원 상의 상이한 에피토프를 인식하는 적어도 2개 이상의 상이한 항체를 함유하는 단일클론 항체와 상이하다. 단일클론 항체는 Kohler 그외 다수, 문헌 [(Nature, 256: 495, (1975))]에 최초로 기록된 하이브리도마 기술뿐만 아니라 재조합 DNA 기술을 사용하여 얻을 수 있다 (미국특허 제4,816,567호를 참조한다).
본 발명에서 사용되는 용어 "인간화 항체(humanized antibody)"는 이의 CDR 또는 CDR의 부분이 비-인간 항체 (공여체 항체)의 CDR 영역으로 대체되는 인간 면역글로불린 (수용체 항체)로부터 유도되는 항체 또는 이의 단편을 지칭하고, 여기서 공여체 항체는 예측되는 특이성, 결합 친화성, 또는 반응성을 갖는 비-인간 항체 (예를 들면, 마우스, 랫트, 또는 토끼)일 수 있다. 또한, 수용체 항체 프레임워크 영역 (FR)의 일부 아미노산 잔기는 또한 비-인간 공급원의 상응하는 아미노산 잔기로 대체될 수 있거나, 또는 항체의 성능을 추가로 개선하거나 또는 최적화하기 위해 다른 항체의 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 인간화 항체에 대해 보다 상세하게는, 예를 들면, Jones, 그외 다수, 문헌 [Nature, 321: 522-525 (1986)]; Reichmann 그외 다수, 문헌 [Nature, 332: 323-329 (1988)]; 문헌 [Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 (1992)]; 및 문헌[ Clark, Immunol. Today, 21: 397-402 (2000)]을 참조한다.
본 발명에 사용되는 용어 "에피토프"는 면역글로불린 또는 항체가 특이적으로 결합될 수 있는 항원 상의 부위를 지칭한다. 또한, "에피토프"는 본 기술분야에서 "항원 결정기"로서 알려져 있다. 에피토프 또는 항원 결정기는 보통 분자, 예컨대 아미노산 또는 당 측쇄로 구성되는 화학적 활성 표면으로 이루어지고, 보통 특이적인 3차원 구조 특징뿐만 아니라 특이적 전하 특징을 가진다. 예를 들면, 에피토프는 보통 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15개의 연속적 및 비연속적 아미노산을 포함하는 독특한 공간적 형태이고, 이는 "선형" 또는 "입체적"일 수 있다. 예를 들면, 문헌 [Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, volume 66, G. E. Morris, Ed. (1996)]을 참조한다. 선형 에피토프에서, 단백질 및 상호작용 분자 사이 (예를 들면, 항체)의 상호작용 지점은 단백질의 1차의 아미노산에 따라 선형적으로 존재하고, 여기서 입체적 에피토프에서, 상호작용 지점은 단백질의 1차의 아미노산에 따라 서로 분리되는 아미노산 잔기이다.
본 발명에서 사용되는 용어 "단리하다" 또는 "단리됨"은 자연 상태에서 인공적 수단에 의해 얻어진 것을 의미한다. 자연상태의 특정 종류의 "단리된" 물질 또는 성분이 존재하는 경우, 이는 이의 자연 환경에서의 변화로 인한 것일 수 있거나, 또는 자연 환경으로부터 단리될 수 있거나, 또는 둘 모두일 수 있다. 예를 들면, 살아있는 동물에서의 자연적으로 존재하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 동일한 자연 상태로 고순도로 분리되는 경우 "단리됨"으로 지칭될 것이다. 용어 "단리하다" 또는 "단리됨"은 활성에 영향을 주지 않는 인공적인 또는 합성된 물질, 또는 다른 불순물의 존재를 배제하지 않는다.
본 발명에서 사용되는 용어 "E. 콜리 발현계"은 에세리키아 (균주) 및 벡터로 구성된 발현계를 지칭하고, 여기서 비제한적으로 GI698, ER2566, BL21 (DE3), B834 (DE3), 및 BLR (DE3)를 포함하는 E. 콜리 (균주)는 상업적으로 이용가능하다.
본 발명에서 사용되는 용어 "벡터"는 폴리뉴클레오티드로 삽입될 수 있는 핵산 전달 비히클을 지칭한다. 폴리뉴클레오티드로 삽입되는 경우 단백질을 발현할 수 있는 벡터는 발현 벡터로 지칭된다. 벡터는 전환, 형질도입, 또는 형질감염에 의해 숙주 세포로 삽입될 수 있고, 이로써 운반된 유전적 물질은 숙주세포에서 발현될 수 있다. 벡터는 본 기술분야의 기술자에게 잘 알려져 있고, 이는 비제한적으로 플라스미드; 파스미드; 코스미드; 인공 염색체 예컨대 효모 인공 염색체 (YAC), 박테리아 인공 염색체 (BAC), 또는 P1 유도된 인공 염색체 (PAC); 파아지 예컨대 λ 파아지 또는 M13 파아지 및 동물 바이러스 등을 포함한다. 동물 바이러스는 비제한적으로 역전사효소 바이러스 (렌티바이러스 포함), 아데노바이러스, 아데노-관련된 바이러스, 헤르페스 바이러스 (예를 들면 단순 포진 바이러스), 수두 바이러스, 배큘로바이러스, 유두종 바이러스, 및 파포바 바이러스 (예컨대 SV40)를 포함할 수 있다. 벡터는 발현을 조절하는 다수의 성분을 함유할 수 있고, 이는 비제한적으로 프로모터, 전사 개시 인자, 인핸서, 선별 성분(selection element), 및 리포터 유전자를 포함한다. 게다가, 벡터는 또한 복제 시작 부위를 함유할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "숙주 세포"는 원핵 세포 예컨대 E. 콜리 및 바실러스 서브틸리스, 진균 세포 예컨대 효모 및 아스페르길루스, 곤충 세포 예컨대 S2 드로소필라 세포 및 Sf9, 또는 동물 세포 예컨대 섬유아세포, CHO 세포, COS 세포, NSO 세포, HeLa 세포, BHK 세포, HEK293 세포 또는 인간 세포를 포함하여 벡터를 유입할 수 있는 세포를 지칭한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "특이적 결합"은 2개의 분자들 사이에서의 비-무작위 결합, 예컨대 항체 및 이의 표적 항원 사이의 상호작용을 지칭한다. 일부 구현예에서, 항원에 대한 항체의 특이적 결합은 약 10-5 M 미만, 특히, 10-6 M 미만, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M, 10-10 M 이하의 친화도 (KD)를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "KD"는 항체 및 항원 사이의 결합 친화도를 기술하는 특이적 항체 항원 상호작용에 대한 해리 평형 상수를 지칭한다. 해리 평형 상수가 작을수록 향체는 항원에 더 단단하게 결합하고, 항체 및 항원 사이의 친화도가 높아진다. 통상적으로, 항체는 표면 플라즈마 공명 (SPR)에 의해 BIACORE로 측정된 약 10-5 M 미만, 특히, 10-6 M 미만, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M, 10-10 M 이하의 해리 평형 상수로 항원과 결합한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "단일클론 항체" 및 "mAb"는 동일한 의미를 가지고, 상호교환적으로 사용되고; 용어 "다중클론 항체" 및 "PcAb"는 동일한 의미를 가지고, 상호교환적으로 사용되고; 용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 동일한 의미를 가지고, 상호교환적으로 사용된다. 또한, 본 발명에서, 아미노산은 보통 본 기술분야에 공지된 단일 문자 또는 3개의 문자 약어로 표시될 수 있다. 예를 들면, 알라닌은 A 또는 Ala로서 표시될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "유효 용량"은 환자에서 질환 또는 장애를 부분적으로 또는 완전하게 예방하거나, 또는 저지하는데 충분한 치료제의 양으로 정의된다. 예를 들면, 효과적인 예방 용량은 질환을 예방하거나, 중지하거나, 또는 지연하는 양이고; 효과적인 치료 용량은 투병 중인 환자에서 질환 및 이의 합병증을 치료하거나, 또는 적어도 부분적으로 정지시키는 양이다. 이러한 유효 용량의 결정은 전체적으로 본 기술분야의 기술자의 능력의 범위 내의 것이다. 예를 들면, 유효한 치료 용량은 질환의 중증도, 환자의 자체의 면역계의 전체 상태, 환자의 일반적 배경, 예컨대, 연령, 체중, 및 성별, 약물의 투여, 및 동시의 다른 치료에 좌우될 것이다.
발명의 효과
본 발명의 단일클론 항체 (예를 들면, MAB1)은 연장된 생체내 효능과 함께 PCSK9와 특이적으로 결합되고, LDLR에 대한 PCSK9의 연합을 효과적으로 차단하고, 세포 표면 상에 발현된 LDLR의 양을 상향조절하고, LDL 및 콜레스테롤의 대사작용을 촉진하고, TG의 수준을 감소시키고, 및/또는 고콜레스테롤혈증에 의해 야기되는 심혈관 질환을 예방하고 및/또는 치료할 수 있다.
도 1: 항-PCSK9 항체의 SDS-PAGE의 결과. 좌측으로부터 우측까지: 1 ㎍의 BSA; 10 ㎕의 마커; 감소된 부하량 완충제에서의 1 ㎍의 샘플; 비-감소된 부하량 완충제에서의 1 ㎍의 항-PCSK9 항체.
도 2: MAB1의 결합 약동학.
도 3: 인간, 마우스, 및 원숭이 PCSK9에 대해 결합하는 MAB1의 ELISA 결과.
도 4: LDLR에 대한 인간 PCSK9에 결합되는 MAB1의 경쟁 ELISA 결과.
도 5: 24시간 동안 MAB1와의 배양된 이후의 인간 HepG2 세포 표면 상에서의 LDLR의 FACS 검출.
도 6: 48시간 동안 MAB1와의 배양된 이후의 인간 HepG2 세포 표면 상에서의 LDLR의 FACS 검출.
도 7: 24시간 동안 MAB1와의 배양된 이후의 인간 HepG2 세포 표면 상에서의 LDLR의 SDS-PAGE 결과.
도 8: 마우스 혈청에서의 LDL-C의 농도에 대한 항-PCSK9 항체 MAB1 및 에볼로쿠맙의 효과
도 9: 원숭이 혈청에서의 LDL-C의 농도에 대한 항-PCSK9 항체 MAB1의 효과
도 10: 마우스 혈청에서의 HDL-C의 농도에 대한 항-PCSK9 항체 MAB1 및 에볼로쿠맙의 효과
도 11: 원숭이 혈청에서의 HDL-C의 농도에 대한 항-PCSK9 항체 MAB1의 효과
도 12: 마우스 혈청에서의 TG의 농도에 대한 항-PCSK9 항체 MAB1 및 에볼로쿠맙의 효과
도 13: 원숭이 혈청에서의 TG의 농도에 대한 항-PCSK9 항체 MAB1의 효과
본 발명의 상세할 설명
본 발명은 이하에서 상세하게 기술될 것이다. 본 기술분야의 당업자에 의해 이해될 것인 바와 같이, 하기 실시예는 본 발명의 설명에 대해서만 설명되고, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 여겨지지 않는다. 기술 또는 조건의 특정 설명이 없는 경우는 기술분야의 문헌 (예를 들면, 문헌 [Guide to Molecular Cloning, 저자 J Sambrook, 그외 다수, Peitang Huang, 그외 다수에 의해 번역됨, 제3 개정판, Science Press]에 따라 또는 제품 설명서에 따라 실시된다. 특정 제조자가 없는 시약 또는 장비는 모두 상업적으로 이용가능한 종래의 제품이었다.
본 발명의 실시예에서, BALB/C 마우스는 Guangdong Medical Laboratory Animal Center로부터 구입하였다.
본 발명의 양성 대조군 항체는 Amgen의 에볼로쿠맙(Joyce C.Y. 프로단백질 전환효소 서브틸리신/켁신 유형 9 중화 항체는 마우스 및 비인간 영장류에서 혈청 콜레스테롤을 감소시킨다. 문헌 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2009, 106(24):9820-5]).
실시예 1: 인간, 마우스, 및 원숭이 PCSK9 - TEV - his6 융합 단백질의 제조
1. PCSK9-TEV-his6 의 유전자 합성
인간 (NCBI 참조 서열: NP_777596.21), 마우스 (NCBI 참조 서열: NP_705793.1) 및 원숭이 (NCBI 참조 서열: NP_001106130.1) PSCK9의 아미노산 서열을 TEV-his6의 것과 조합하였다.
인간, 마우스, 및 원숭이 융합 단백질의 상응하는 뉴클레오티드 서열은 각각 GenScript Inc.에 의해 최적화되고 합성된 것이었다.
2. pUC57단순-PCSK9-TEV-his6 의 플라스미드
합성된 PCSK9 - TEV - his6 유전자를 pUC57단순 벡터 (GenScript, Inc.에 의해 제공됨)로 클론화시켜 pUC57단순-PCSK9-TEV-his6 플라스미드를 얻었다.
pcDNA3 - PCSK9 - TEV - his6의 재조합 플라스미드의 작제: 플라스미드 pUC57단순 -PCSK9-TEV-his6을 XbaI 및 BamHI로 절단하였다. 겔 전기영동으로부터의 PCSK9 - TEV -his6의 회수된 유전자 단편을 pcDNA3.1 발현 벡터 (Invitrogen로부터 구입함)로 연결시켜 pcDNA3 .1- PCSK9 - TEV - his6 플라스미드를 얻었고, 이는 설명서에 따라 플레이팅시키기 위해 경쟁적 E. 콜리 세포 DH5α (TIANGEN Biotech Co.로부터 구입함)로 형질감염시켰다. 양성 클론을 제조자의 지시에 따라 시약 키트를 사용하여 대량의 pcDNA3.1-PCSK9-TEV-his6 DNA를 정제하기 위해 선택하여 증식시켰다.
3. PCSK9-TEV-his6의 발현, 정제 및 PCSK9 항원의 제조
293F 세포로의 인간, 마우스 및 원숭이 pcDNA3 .1- PCSK9 - TEV - his6의 재조합 플라스미드를 형질감염하고 7일 이후, 배양 배지를 고속 원심분리 및 미세다공막을 사용한 여과로 처리하였고, 이후 제조자에 의해 제공되는 지시 설명서에 따라 HisTrap 컬럼 (
Figure pct00001
정제기 10, GE)에 의해 정제하여 인간, 마우스 및 원숭이 융합 단백질을 얻었다. 융합 단백질은 TEV 프로테아제를 사용하여 절단하고, 추가로 Ni-NTA 컬럼으로 정제하여 PCSK9 항원을 얻었다.
실시예 2: LDLR 단백질의 발현 및 정제
1. hLDLR -His 플라스미드의 작제
hLDLR -His 유전자 단편을 템플레이트로서 LDLR 인간 cDNA (Origene, Inc.로부터 구입함)를 사용하여 PCR로 증폭시켰고, 일반 DNA 정제 키트 및 겔 전기영동으로 정제시켰다. 회수된 유전자 단편 hLDLR -His를 XbaI 및 HindIII-HF로 절단하고, T4 리가아제에 의해 pcDNA3.1 발현 벡터 (Invitrogen로부터 구입함)로 클론화하여 pcDNA3.1-hLDLR-his6을 얻었고, 이를 Amp+ 한천 플레이트에 시딩하기 위해 경쟁적 E. 콜리 세포 DH5α(TIANGEN Biotech Co.로부터 구입함)로 형질감염시켰다. 양성 클론을 PCR로 확인하였고, LB 액체 배지에서 배양시켰다. 배지를 서열분석을 위해 Invitrogen에 맡기고, 정정된 삽입물을 함유시키기 위해 BLAST에 의해 증명하였다.
2. LDLR 단백질의 발현 및 정제
재조합 플라스미드 pcDNA3.1-hLDLR-his6을 리포펙타민 형질 주입 키트를 사용하여 293F 세포 (Invitrogen)로 형질 주입시켰다. 형질감염 7일 이후, 배양 배지를 고속 원심분리, 농축으로 처리하고, 결합 완충제 A (Binding Buffer A)로 완충제 교환시키고, HisTrap 컬럼 (
Figure pct00002
정제기 10, GE) 상에 적용하였다. 단백질은 용출 완충제 A의 선형 구배로 용출시켰다. 정제된 단백질을 Hitrap 탈염 컬럼을 사용하여 결합 완충제 B로 완충제 교환시켰고, Hitrap Q 컬럼에 부하하였다. 표적 단백질을 용출 완충제 B의 선형 구배로 용출시켰고, PBS로 완충제 교환시켰다. 최종 단백질을 감소된 부하량 완충제에서 SDS-PAGE로 조사하였다.
실시예 3: MAB1의 설계, 발현, 및 정제
1. 항체 설계
단일클론 항체 MAB1을 제조하기 위해, 본 발명자는 창의적으로 아미노산 서열 및 PCSK9 단백질의 3-D 결정 구조에 따라 일련의 항체 서열을 설계하였다. 수많은 선별 및 조사를 통해, PSCK9에 특이적으로 결합하는 MAB1을 최종적으로 수득하였다. MAB1의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 엔코딩된 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열은 서열식별번호: 1-4에 정의되어 있다.
MAB1 (369bp)의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열:
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGAGGAGGCCTGGTGCAGCCCGGAAGATCTCTGAGACTGAGTTGCGCCGCTTCAGGATTCACCTTTAGCTCCTACAGCATGAACTGGGTGCGGCAGGCTCCTGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCCGGAATCTCTAGTTCAAGCTCCTACATTAGCTATGCAGACTCCGTCCAGGGAAGGTTCACCATCTCTCGCGATAACGGCAAGAACAGCCTGTATCTGCAGATGAACAGCCTGCGAGCAGAGGACACAGCCCTGTACTTCTGTGCCAGAGAATATGACTTCTGGTCCGCCTATTACGACGCCTTCGATGTCTGGGGACAGGGGACTATGGTCACTGTCTCAAGC（서열번호: 1)
MAB1 (123aa)의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열:
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSGISSSSSYISYADSVQGRFTISRDNGKNSLYLQMNSLRAEDTALYFCAREYDFWSAYYDAFDVWGQGTMVTVSS
(서열번호: 2)
MAB1 (333bp)의 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열:
CAGAGCGAACTGACTCAGCCAAGAAGCGTCAGTGGATCACCTGGCCAGAGCGTGACAATCTCCTGCACCGGCACAAGCAGGAACATTGGCGGGGGAAATGACGTCCACTGGTACCAGCAGCATCCAGGGAAGGCCCCCAAACTGCTGATCTCCGGAGTGATTGAGCGGAGCTCCGGCGTCCCCGATAGATTCAGCGGGTCCAAGTCTGGAAACACAGCTTCTCTGACTATCAGTGGCCTGCAGGCAGAGGACGAAGCCGATTACTATTGCCAGTCTTTCGACGGCAGTCTGTCAGGGAGCGTGTTTGGCACTGGGACCGATGTGACCGTCCTG (서열번호: 3）
MAB1 (111aa)의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열:
QSELTQPRSVSGSPGQSVTISCTGTSRNIGGGNDVHWYQQHPGKAPKLLISGVIERSSGVPDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCQSFDGSLSGSVFGTGTDVTVL (서열번호: 4)
2. 발현 및 정제
MAB1의 중쇄 (서열번호: 1 Ig 감마-1 쇄 C 영역의 불변 영역을 가짐，수탁: P01857) 및 경쇄 (서열번호: 3 Ig 람다-2 쇄 C 영역의 불변 영역을 가짐; 수탁: P0CG05.1)의 cDNA 서열을 pUC57단순 벡터로 클론화하여 각각 플라스미드 pUC57단순 -MAB1H 및 pUC57단순 - MAB1L을 얻었다.
pUC57단순 - MAB1H 및 pUC57단순 - MAB1L을 개별적으로 HindIII 및 EcoRI을 사용하여 절단하였고, 겔 전기영동로부터 중쇄 및 경쇄의 회수된 유전자 단편을 각각 pcDNA3.1 벡터로 하위클론화하였다. 2개의 재조합 플라스미드를 293F 세포로 공동-형질감염시켰다. 형질감염 7일 후, 배양 배지를 고속 원심분리, 농축으로 처리하고, Hitrap MabSelect SuRe 컬럼 상에 적용하였다. MAB1을 용출 완충제를 사용하여 용출시켰고, PBS로 완충제 교환시켰다.
정제된 MAB1을 감소된 또는 비감소된 부하량 완충제와 함께 비등시킨 후 SDS-PAGE 상에서 조사하였다. 도 1에 나타난 바와 같이, 감소된 MAB1을 45kD (중쇄) 및 30kD (경쇄)에서 나타났고, 한편 비감소된 MAB1 (전체 항체)은 150kD에서 나타났다.
본 실시예에서 얻은 MAB1을 하기 실시예 4 - 9에서 사용한다.
실시예 4: MAB1 및 항원 PCSK9 -his 사이의 결합 약동학
MAB1 및 항원 PCSK9-his 사이의 결합 약동학을 Fortebio Octet 시스템으로 측정하였다.
MAB1 (실시예 3에서 제조함)을 표준 아민 커플링 과정에 의해 AR2G 바이오센서에 고정화하였다. 에탄올아민으로 불필요한 아미노기를 차단하고, PBST에서 평형화시킨 이후, 항원 PCSK9-his에 대한 MAB1의 결합 친화도를 측정하였다. PCSK9의 농도는 PBST에서 411, 205.5, 102.8, 51.4, 25.7, 12.8, 및 0 nM이었다. 항원 및 항체의 해리를 또한 PBST에서 측정하였다.
MAB1 및 항원 PCSK9-his 사이의 결합 약동학은 표 2 및 도 2에 나타나 있다.
[표 2] MAB1의 결합 약동학
Figure pct00003
KD: 해리 상수;
Kon: 항원 및 항체의 결합 속도;
Kdis: 항원 및 항체의 해리 속도;
KD = Kdis/Kon.
분명하게는, 항체 MAB1은 PCSK9와의 양호한 결합 친화도를 가진다.
실시예 5: PCSK9에 대한 MAB1의 결합 활성
1. 샌드위치 ELISA에 의한 마우스, 원숭이, 및 인간 PCSK9 ( 실시예 1에서 제조함)에 대한 MAB1의 결합 활성 측정
마우스 항-his 단일클론 항체 (GenScript，A00186)로 코팅된 마이크로플레이트를 2시간 동안 BSA로 차단한 이후, 마우스, 원숭이, 및 인간 항원 PCSK9를 별도로 첨가하고, 30분 동안 배양하였고, 이후 MAB1을 첨가하고 30분 동안 배양하였다. HRP-표지된 2차 항체 (염소 항-hIgG 항체) (Jackson, 109-035-088)를 각각의 웰에 TMB（Neogen，308177)과 함께 첨가하였고, 5분 동안 현상시키고, 흡광도 값을 450 nm의 파장에서 판독하였다 (도 3에 나타남).
분명하게는, MAB1은 용량-의존적으로 효과적으로 PCSK9에 결합할 수 있다. 흡광도 값은 마우스, 원숭이, 및 인간 항원 PCSK9를 결합하기 위해 상이한 희석된 농도에서 MAB1에 대해 표 3 - 5에 나타나 있다.
[표 3] 샌드위치 ELISA에 의한 마우스 PCSK9에의 MAB1의 결합
Figure pct00004
[표 4] 샌드위치 ELISA에 의한 원숭이 PCSK9에의 MAB1의 결합
Figure pct00005
[표 5] 샌드위치 ELISA에 의한 인간 PCSK9에의 MAB1의 결합
Figure pct00006
EC50을 이후 흡광도 값의 정량적 분석을 사용하여 커브 시뮬레이션 (표 6)을 통해 얻었다.
[표 6] 샌드위치 ELISA에 의해 측정되는 PCSK9에 대한 MAB1의 EC50
Figure pct00007
분명하게는, MAB1은 인간, 마우스, 및 원숭이 PCSK9에 대해 효과적으로 결합할 수 있다.
2. 경쟁적 ELISA에 의한 LDLR에 대한 인간 PCSK9과의 MAB1의 결합 활성 측정
LDLR-His (실시예 2에서 제조함)를 4℃에서 밤새 미세적정기 플레이트에 결합시켰다. 플레이트를 2시간 동안 37℃에서 1% BSA로 차단한 이후, 인간 PCSK9 및 MAB1의 혼합물 (표 7에 나타난 바와 같은 농도)을 첨가하였고, 30분 동안 37℃에서 배양하였고, 이후 퍼록시다아제-콘주게이션된 2차 염소 항-인간 IgG를 37℃에서 첨가하였고, 60분 동안 배양시켰다. 플레이트를 PBS로 3회 세적하였고, 퍼옥시다아제 기재를 첨가하였다. 반응을 종결하고, 흡광도를 마이크로플레이트 리더를 사용하여 450 nM에서 결정하였다 (표 7).
LDLR (실시예 2에서 제조함)에 대한 PCSK9에 대한 MAB1의 결합 활성은 도 4에 나타나 있고, 이는 MAB1가 용량 의존적으로 효과적으로 LDLR과의 PCSK9의 연합을 차단할 수 있는 것으로 나타내었다.
상이한 용량의 흡광도 값은 표 7에 나타나 있고, 이는 MAB1이 PCSK9에의 결합을 통한 세포막 상에서의 LDLR의 감소를 억제할 수 있고 (즉, MAB1은 LDLR에 대한 PCSK9의 결합 및 LDLR의 내재화(internalization) 및 열화(degradation)를 차단할 수 있음); 이러한 억제는 용량 의존적임을 나타내었다.
[표 7] LDLR에 대한 PCSK9와의 MAB1의 경쟁적 결합
Figure pct00008
EC50은 흡광도 값의 정량적 분석을 사용하는 커브 시뮬레이션을 통해 2.339 nM인 것으로 계산되었다. 분명하게는, MAB1은 LDLR에 대해 PCSK9에 경쟁적으로 결합되고, 세포 표면 상에서의 LDLR의 PCSK9-유도된 감소를 억제하고 (하기 실시예 6에서의 설명), 생체내 LDL 콜레스테롤의 대사작용을 조절할 수 있다 (즉, 하기 실시예 7에 나타난 바와 같이, MAB1은 혈청에서의 LDL 콜레스테롤의 수준을 하향조절한다).
실시예 6. MAB1의 세포 활성
유세포 분석 및 웨스턴 블롯을 사용하여 인간 간 세포주 HepG2 표면 상에서의 LDLR의 수준에 대해 MAB1의 효과를 측정하였다.
1. MAB1에 의해 조절된 HepG2 표면 상에서의 LDLR 수준의 FACS 측정
세포 배양 배지를 제거한 이후, 건강한 HepG2 세포를 24시간 및 48시간 동안 각각 표 8에 기재된 농도에서 PCSK9 및 항체로 배양하였다.
24시간 및 48시간 동안 배양한 이후, 세포를 각 튜브에서의 2×105 세포로 종래의 효소 절단에 의해 수집하였다. PE 표지된 토끼 항-hLDLR (1% PBSA로 200배 희석시킴)을 각각의 튜브에 첨가하였고, 1시간 동안 얼음 중에서 배양시켰다. 세포를 PBS로 2회 세척하였고, 300 ㎕의 PBS 중에 재현탁시켰다. PE 형광 신호를 유세포 분석으로 측정하였다.
24시간 및 48시간 이후의 결과를 도 5 및 도 6에 각각 나타내었다. 분명하게는, MAB1를 용량 의존적 방식으로 세포 표면 상에서 LDLR의 PCSK9-유도된 감소를 블로킹하였고, PCSK9에 의해 효과적으로 LDLR의 음성 조절을 방지하였다.
[표 8] 항체 및 PCSK9 항원의 농도
Figure pct00009
2. MAB1에 의해 조절된 HepG2 표면 상에서의 LDLR 수준의 WB 측정
세포 배양 배지를 제거한 이후, HepG2 세포를 24시간 동안 표 8에 기재된 농도에서 PCSK9 및 항체와 함께 배양하였다. 세로를 수집하고, 용해시키고, 상청액을 SDS-PAGE으로 조사하였다. 도 7에 나타난 바와 같이, 표적 단백질이 약 140 kD에서 나타낼 것이다. 데이터는 MAB1은 용량 의존적 방식으로 LDLR의 수준을 상향조절할 수 있고, PCSK9에 의해 LDLR의 음성 조절을 효과적으로 방지할 수 있음을 나타내었다.
실시예 7. 생체내 저밀도 지질단백질 콜레스테롤 (LDL-C)에 대한 MAB1의 효과
1. 마우스에서의 혈청 LDL-C에 대한 MAB1의 효과
혈청 LDL-C에 대한 MAB1의 효과를 조사하기 위해, 마우스를 피하 주사를 위해 4개의 군으로 무작위적으로 할당하였다:
Figure pct00010
대조군 그룹 (염수, 10 mL/kg, n=8)
Figure pct00011
MAB1 60 mg/kg 그룹 (MAB1 60 mg/kg, 10 mg/kg로서 투여됨, n=6)
Figure pct00012
MAB1 90 mg/kg 그룹 (MAB1 90 mg/kg, 20 mg/kg로서 투여됨, n=6)
Figure pct00013
에볼로쿠맙 60 mg/kg 그룹 (에볼로쿠맙 60 mg/kg, 10 mg/kg로서 투여됨, n=4).
각각의 마우스의 혈액 샘플 (150㎕)을 투여전, 투여 이후 3일차, 7일차, 10일차, 18일차, 24일차, 및 32일차에 내부 안각의 정맥으로부터 수집하였고, 이는 수집 이후 10분 동안 4500 rpm으로 원심분리하여 혈청을 단리시켰다. 혈청에서의 HDL-C 수준을 이후 Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd로부터 구입한 HDL-C 분석 키트가 구비된 Mindray BS-180 자동화 생화학 분석기로 측정하였다.
도 8에 나타난 바와 같이, MAB1은 BALB/c 마우스에서 3일차에 혈청 LDL-C 수준을 감소시키고, 에볼로쿠맙과 동등한 효능을 나타내기 시작하였고, MAB1은 에볼로쿠맙 (18일차)보다 더 장기의 효능 기간 (32일차)을 나타내었다.
2. 원숭이에서의 혈청 LDL-C에 대한 MAB1의 효과
혈청 LDL-C에 대한 MAB1의 효과를 조사하기 위해, 4마리의 수컷 시노몰구스 원숭이를 피하 주사를 위한 2개의 군으로 무작위적으로 할당하였다:
Figure pct00014
MAB1 3 mg/kg 그룹 (MAB1 3 mg/kg, n=2)
Figure pct00015
MAB1 18 mg/kg 그룹 (MAB1 18 mg/kg, n=2).
투여전 혈청 LDL-C 수준을 대조군으로서 사용하였다. 각 원숭이의 혈액 샘플을 투여전, 투여후 30분, 5시간, 1일차, 5일차, 7일차, 9일차, 11일차, 13일차, 15일차, 17일차, 19일차, 및 21일차에서 수집하였고, 이를 수집 전에 10분 동안 3000 rpm으로 원심분리시켜 혈청을 단리시켰다. 혈청에서의 LDL-C 수준을 이후 Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd로부터 구입한 LDL-C 분석 키트가 구비된 Mindray BS-180 자동화 생화학 분석기로 측정하였다.
도 9에 나타난 바와 같이, 3 mg/kg 및 18 mg/kg 복용량으로의 MAB1은 원숭이에서 혈청 LDL-C 수준을 감소시켰고, 18 mg/kg의 복용량으로의 MAB1은 시노몰구스 원숭이에서 장기의 효능 기간 (17일차)을 나타내었다.
실시예 8: 생체내 고밀도 지질단백질 콜레스테롤 (HDL-C)에 대한 MAB1의 효과
1. 마우스에서의 혈청 HDL-C에 대한 MAB1의 효과
혈청 HDL-C에 대한 MAB1의 효과를 조사하기 위해, 마우스를 피하 주사를 위해 4개의 군으로 무작위적으로 할당하였다:
Figure pct00016
대조군 그룹 (염수, 10 mL/kg, n=8)
Figure pct00017
MAB1 60 mg/kg 그룹 (MAB1 60 mg/kg, 10 mg/kg로서 투여됨, n=6)
Figure pct00018
MAB1 90 mg/kg 그룹 (MAB1 90 mg/kg, 20 mg/kg로서 투여됨, n=6)
Figure pct00019
MAB1 120 mg/kg 그룹 (MAB1 120 mg/kg, 20 mg/kg로서 투여됨, n=3)
Figure pct00020
에볼로쿠맙 60 mg/kg 그룹 (에볼로쿠맙 60 mg/kg, 10 mg/kg로서 투여됨, n=4).
각각의 마우스의 혈액 샘플 (150㎕)을 투여전, 투여 이후 3일차, 7일차, 10일차, 18일차, 24일차, 및 32일차에 내부 안각의 정맥으로부터 수집하였고, 이는 수집 이후 10분 동안 4500 rpm으로 원심분리하여 혈청을 단리시켰다. 혈청에서의 LDL-C 수준을 이후 Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd로부터 구입한 LDL-C 분석 키트가 구비된 Mindray BS-180 자동화 생화학 분석기로 측정하였다.
도 10에 나타난 바와 같이, MAB1은 에볼로쿠맙과 동일하게 BALB/c 마우스에서 3일차에 혈청 HDL-C 수준을 감소시켰다. 10일 후, 혈청 HDL-C 수준을 대조군 그룹의 것과 동일하게 회수하였다.
2. 원숭이에서의 혈청 HDL-C에 대한 MAB1의 효과
혈청 HDL-C에 대한 MAB1의 효과를 조사하기 위해, 4마리의 수컷 시노몰구스 원숭이를 피하 주사를 위한 2개의 군으로 무작위적으로 할당하였다:
Figure pct00021
MAB1 3 mg/kg 그룹 (MAB1 3 mg/kg, n=2)
Figure pct00022
MAB1 18 mg/kg 그룹 (MAB1 18 mg/kg, n=2).
투여전 혈청 HDL-C 수준을 대조군으로서 사용하였다. 각 원숭이의 혈액 샘플을 투여전, 투여후 30분, 5시간, 1일차, 5일차, 7일차, 9일차, 11일차, 13일차, 15일차, 17일차, 19일차, 및 21일차에서 수집하였고, 이를 수집 전에 10분 동안 3000 rpm으로 원심분리시켜 혈청을 단리시켰다. 혈청에서의 HDL-C 수준을 이후 Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd로부터 구입한 HDL-C 분석 키트가 구비된 Mindray BS-180 자동화 생화학 분석기로 측정하였다.
도 11에 나타난 바와 같이, 3 mg/kg 및 18 mg/kg의 복용량에서의 MAB1은 시노몰구스 원숭이에서 혈청 HDL-C에 대한 영향을 나타내지 않았다.
실시예 9. 생체내 트리글리세라이드 (TG)에 대한 MAB1의 효과
1. 마우스에서의 혈청 트리글리세라이드 (TG)에 대한 MAB1의 효과
혈청 트리글리세라이드에 대한 MAB1의 효과를 조사하기 위해, 마우스를 피하 주사를 위해 5개의 군으로 무작위적으로 할당하였다:
Figure pct00023
대조군 그룹 (염수, 10 mL/kg, n=8)
Figure pct00024
MAB1 60 mg/kg 그룹 (MAB1 60 mg/kg, 10 mg/kg로서 투여됨, n=6)
Figure pct00025
MAB1 90 mg/kg 그룹 (MAB1 90 mg/kg, 20 mg/kg로서 투여됨, n=6)
Figure pct00026
에볼로쿠맙 60 mg/kg 그룹 (에볼로쿠맙 60 mg/kg, 10 mg/kg로서 투여됨, n=4).
각각의 마우스의 혈액 샘플 (150㎕)을 투여전, 투여 이후 3일차, 7일차, 10일차, 18일차, 24일차, 및 32일차에 내부 안각의 정맥으로부터 수집하였고, 이는 수집 이후 10분 동안 4500 rpm으로 원심분리하여 혈청을 단리시켰다. 혈청에서의 트리글리세라이드 수준을 이후 Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd로부터 구입한 HDL-C 분석 키트가 구비된 Mindray BS-180 자동화 생화학 분석기로 측정하였다.
도 12에 나타난 바와 같이, MAB1은 높은 복용량 (90 mg/kg)에서 BALB/c 마우스에서 3일차 이후, 낮은 복용량 (60 mg/kg)에서 32일차 이후 혈청 트리글리세라이드 수준을 증가시켰고, 다른 시점에서 대조군 그룹과 차이가 없었다.
2. 원숭이에서의 혈청 트리글리세라이드 (TG)에 대한 MAB1의 효과
혈청 트리글리세라이드에 대한 MAB1의 효과를 조사하기 위해, 4마리의 수컷 시노몰구스 원숭이를 피하 주사를 위한 2개의 군으로 무작위적으로 할당하였다:
Figure pct00027
MAB1 3 mg/kg 그룹 (MAB1 3 mg/kg, n=2)
Figure pct00028
MAB1 18 mg/kg 그룹 (MAB1 18 mg/kg, n=2).
투여전 혈청 트리글리세라이드 수준을 대조군으로서 사용하였다. 각 원숭이의 혈액 샘플을 투여전, 투여후 30분, 5시간, 1일차, 5일차, 7일차, 9일차, 11일차, 13일차, 15일차, 17일차, 19일차, 및 21일차에서 수집하였고, 이를 수집 전에 10분 동안 3000 rpm으로 원심분리시켜 혈청을 단리시켰다. 혈청에서의 트리글리세라이드 수준을 이후 Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd로부터 구입한 LDL-C 분석 키트가 구비된 Mindray BS-180 자동화 생화학 분석기로 측정하였다.
도 13에 나타난 바와 같이, 18 mg/kg의 복용량에서 MAB1은 투여후 13일차정도의 기간 동안 시노몰구스 원숭이에서 혈청 트리글리세라이드를 감소시켰다.
본 발명의 특정 구현예가 상세하게 기재되어 있지만, 본 기술분야의 당업자에게 이해될 수 있는 바와 같이, 이러한 설명은 본 발명자가 개시한 모든 교시에 따라 다양한 변형 및 치환이 일어날 수 있다. 이러한 변화 모두는 본 발명의 범위를 포함한다. 본 발명의 전체 범위는 첨부된 청구범위 및 이의 동등물로 한정된다.
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Claims (20)

  1. 하기의 것으로부터의 CDR을 함유하는 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
    a. 아미노산 서열 서열번호: 5 내지 7로부터의 HCDR, 및/또는
    b. 아미노산 서열 서열번호: 8 내지 10으로부터의 LCDR.
  2. 청구항 1에 있어서,
    a. 아미노산 서열 서열번호: 2로부터의 중쇄 가변 영역 (VH), 및/또는
    b. 아미노산 서열 서열번호: 4로부터의 경쇄 가변 영역 (VL)
    을 함유하는, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    상기 서열 또는 상기 서열의 일부가 Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, dAb, CDR 단편, 단일 쇄 항체 (예를 들면, scFv), 인간화 항체, 키메라 항체, 또는 이중특이성 항체에 함유되어 있는 것인, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  4. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    PCSK9에 대한 이의 결합 친화도 (KD)가 10-5 M 미만, 예를 들면, 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M, 또는 10-10 M 이하인 것인, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  5. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    마우스 이외의 종, 예컨대 인간으로부터의 비-CDR 영역을 함유하는, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  6. 아미노산 서열 서열번호: 5 내지 7로부터의 CDR을 갖는 중쇄 가변 단편; 바람직하게는, 아미노산 서열 서열번호: 2; 더 바람직하게는, 뉴클레오티드 서열 서열번호: 1로부터의 중쇄 가변 단편에 대해 암호화된 서열을 함유하는, 단리된 뉴클레오티드.
  7. 아미노산 서열 서열번호: 8 내지 10으로부터의 CDR을 갖는 경쇄 가변 단편; 아미노산 서열 서열번호: 4; 더 바람직하게는 뉴클레오티드 서열 서열번호: 3으로부터의 경쇄 가변 단편에 대해 암호화된 서열을 함유하는, 단리된 뉴클레오티드.
  8. 청구항 6 및/또는 청구항 7 중 어느 한 항의 단리된 뉴클레오티드를 함유하는, 발현 작제물.
  9. 청구항 6 및/또는 청구항 7 중 어느 한 항의 단리된 뉴클레오티드, 또는 청구항 8의 발현 작제물을 함유하는, 발현 세포주.
  10. 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항의 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조 방법으로서, 적절한 조건 하에서 청구항 9로부터의 세포주를 성장시키는 단계, 및 세포 배양물으로부터 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 회수하는 단계를 포함하는, 제조 방법.
  11. 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항의 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 검출가능한 마커로서의 콘주게이션 파트너; 바람직하게는 방사성 동위원소, 플루오레신, 발광성 물질, 채색 물질, 또는 효소와 같은 콘주게이션 파트너를 함유하는, 콘주게이트.
  12. 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항의 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 청구항 11의 콘주게이트를 포함하는 시약 키트로서, 바람직하게는, 상기 키트는 상기 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 특이적으로 인식하는 2차 항체를 함유할 수 있고; 임의로, 상기 2차 항체는 검출가능한 마커, 예컨대 방사성 동위원소, 플루오레신, 발광성 물질, 채색 물질, 또는 효소를 함유할 수 있는, 시약 키트.
  13. 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항의 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 청구항 11의 콘주게이트를 사용하여 샘플에서 PCSK9의 존재 또는 수준을 검출하기 위한 시약 키트의 제조 방법.
  14. 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항의 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 청구항 11의 콘주게이트를 함유하고; 임의로 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 함유하는, 약물의 조합.
  15. 고혈압, 고콜레스테롤혈증, 및 이러한 병태에 의해 야기되는 심혈관 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 제제에 사용되는, 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항의 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 청구항 11의 콘주게이트.
  16. 하기 목적을 위한 제제에 사용되는, 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항의 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 청구항 11의 콘주게이트:
    a. PCSK9와 특이적으로 결합하거나,
    b. PCSK9의 LDLR과의 연합을 차단하거나,
    c 세포 표면 상의 LDLR의 양 또는 혈장에서의 LDLR의 수준을 상향조절하거나,
    d. 혈장에서의 LDL 또는 LDL-C의 수준을 저하시키거나,
    e. 혈장에서의 LDL의 축적을 제한하거나,
    f. 상기 LDLR의 PCSK9-매개 저하를 억제하거나, 또는
    g. LDL 콜레스테롤 및/또는 트리글리세라이드의 대사작용을 증가시킴.
  17. 하기 목적을 위해 유효 용량의 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항의 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 청구항 11의 콘주게이트를 이용하는 생체내 또는 시험관내 방법:
    a. PCSK9와 특이적으로 결합하거나,
    b. PCSK9의 LDLR과의 연합을 차단하거나,
    c 세포 표면 상의 LDLR의 양 또는 혈장에서의 LDLR의 수준을 상향조절하거나,
    d. 혈장에서의 LDL 또는 LDL-C의 수준을 저하시키거나,
    e. 혈장에서의 LDL의 축적을 제한하거나,
    f. 상기 LDLR의 PCSK9-매개 저하를 억제하거나, 또는
    g. LDL 콜레스테롤 및/또는 트리글리세라이드의 대사작용을 증가시킴.
  18. 유효 용량의 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항의 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 청구항 11의 콘주게이트를 이용하는, 고혈압, 고콜레스테롤혈증, 및 이러한 병태에 의해 야기되는 심혈관 질환의 예방 방법 및/또는 치료 방법.
  19. 고혈압, 고콜레스테롤혈증, 및 이러한 병태에 의해 야기되는 심혈관 질환의 예방 및/또는 치료를 위해 사용되는, 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항의 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 청구항 11의 콘주게이트.
  20. 하기 목적을 위해 사용되는, 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항의 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 청구항 11의 콘주게이트:
    a. PCSK9와 특이적으로 결합하거나,
    b. PCSK9의 LDLR과의 연합을 차단하거나,
    c 세포 표면 상의 LDLR의 양 또는 혈장에서의 LDLR의 수준을 상향조절하거나,
    d. 혈장에서의 LDL 또는 LDL-C의 수준을 저하시키거나,
    e. 혈장에서의 LDL의 축적을 제한하거나,
    f. 상기 LDLR의 PCSK9-매개 저하를 억제하거나, 또는
    g. LDL 콜레스테롤 및/또는 트리글리세라이드의 대사작용을 증가시킴.
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