PCSK9抗体、其药物组合物及其用途
技术领域
本发明属于免疫学和分子生物学领域,涉及一种PCSK9抗体、其药物组合物及其用途。具体地,本发明涉及PCSK9的单克隆抗体。
背景技术
前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶Kexin-9型(Proproteinconvertasesubtilisin/kexintype9,PCSK9)是一种具有前蛋白转化酶活性的枯草溶菌素蛋白酶。PCSK9在肝脏、小肠和肾脏中表达量较多,在皮肤、神经系统中有少量表达。肝脏中的PCSK9可以分泌到血循环中,并通过结合与内吞作用降低细胞表面低密度脂蛋白受体(LDLreceptor,LDLR)的数目。因为LDLR可以从血浆中高效消除LDL,LDLR受体数量减少可促使LDL积聚,所以PCSK9所介导的LDLR降解,可以提高血浆低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的水平。PCSK9参与富含甘油三脂的载脂蛋白B的脂代谢,PCSK9的分泌能提高肠道甘油三脂(TG)的水平,从而参与诱发高胆固醇血症(RashidS.,etal.,Proproteinconvertasesubtilisinkexintype9promotesintestinaloverproductionoftriglyceride-richapolipoproteinBlipoproteinsthroughbothlow-densitylipoproteinreceptor-dependentand-independentmechanisms.Circulation.2014Jul29;130(5):431-41.)。
高胆固醇血症病人中有29%的病人在使用他汀类药物。不能耐受他汀类药物和他汀类药物不能达到所需血脂胆固醇水平的患者占高胆固醇血症病人的8.2%。全球七大药物市场(不包括中国)共有高胆固醇血症病人3亿9千万。2004年10月12日,卫生部公布的《中国居民营养与健康状况调查》报告显示,我国成人高血压患病率为18.8%,估计全国患病总数为1.6亿人,比1991年增加了7000多万人。全国血脂异常患者也已达到1.6亿人。
目前,尚需要开发新的能够特异作用于人类PCSK9的免疫治疗抗体,其可结合至PCSK9并阻断PCSK9与LDLR的结合。阻断PCSK9与LDLR的结合可以提高细胞表面LDLR的数量,提高LDL和所携带胆固醇的代谢,防治和减少高胆固醇血症所引起的心血管疾病。尤其需要开发高效能的PCSK9抗体,其还能够同时提高甘油三脂(TG)代谢或降低TG水平,甚至能够在较长的时间内维持功效。
发明内容
本发明人经过深入的研究和创造性的劳动,得到了一种PCSK9单克隆抗体。本发明人惊奇地发现,本发明的单克隆抗体能够很好地特异性与PCSK9结合,并且能够十分有效地阻断PCSK9与LDLR的结合,提高细胞表面LDLR的数量,提高LDL和所携带胆固醇的代谢,提高甘油三脂(TG)代谢,具有用于制备防治高胆固醇血症所引起的心血管疾病的药物的潜力。由此提供了下述发明:
本发明的一个方面涉及一种单克隆抗体,其包括:
重链可变区,其包含氨基酸序列为(或者包含)SEQIDNO:17-19的CDR;和/或
轻链可变区,其包含氨基酸序列为(或者包含)SEQIDNO:20-22的CDR。
抗体治疗药物,特别是单克隆抗体(MAB)已在多种疾病的治疗中取得了良好的疗效。获取这些治疗性抗体的传统实验方法是采用抗原免疫动物,在免疫动物体内获取靶向抗原的抗体,或通过亲和力成熟的方法来改进那些与抗原的亲和力较低的抗体。然而,这些方法需要大量时间和精力,大多数时候也并不能针对抗原上的特定表位。
轻链和重链的可变区决定抗原的结合;每条链的可变区均含有三个高变区,称互补决定区(CDR)(重链(H)的CDR包含HCDR1、HCDR2、HCDR3,轻链(L)的CDR包含LCDR1、LCDR2、LCDR3;其由Kabat等人命名,见SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,FifthEdition(1991),第1-3卷,NIHPublication91-3242,BethesdaMd)。
本发明人创造性地构建了6个CDR区的氨基酸序列,并做特定修改以提高抗体可变区对抗原的结合活性。为配合在CDR区的改动,框架区也同时被修改,但是需要确保这些框架区的修改仍与人源的种系序列相兼容。框架的修改也将同时进行分析,以确保这些改变对CDR区与抗原的结合没有影响。
本发明重链可变区的3个CDR如下:
HCDR1:GFTFSSYS(SEQIDNO:17)
HCDR2:ISSSSSYI(SEQIDNO:18)
HCDR3:EYDFWSAYYDAFDV(SEQIDNO:19)
轻链可变区的3个CDR如下:
LCDR1:SRNIGGGND(SEQIDNO:20)
LCDR2:GVI(SEQIDNO:21)
LCDR3:QSFDGSLSGSV(SEQIDNO:22)。
在本发明的一个实施方案中,涉及一种单克隆抗体,其包括:
重链可变区,其氨基酸序列为(或者包含)SEQIDNO:14;和/或
轻链可变区,其氨基酸序列为(或者包含)SEQIDNO:16。通过本领域技术人员所熟知的技术手段,例如通过美国国立生物技术信息中心网站(NCBI),分析该单克隆抗体重链可变区和轻链可变区的互补决定区(CDR),其亦分别如上面的SEQIDNO:17-19和SEQIDNO:20-22所示。在本发明中,将该单克隆抗体命名为MAB1。
根据本发明任一项所述的单克隆抗体,其中,其重链恒定区为小鼠抗体的重链恒定区或人抗体的重链恒定区,其轻链恒定区为小鼠抗体的轻链恒定区或人抗体的轻链恒定区。
本发明的另一方面涉及一种分离的核酸序列,具体地,所述核酸序列为SEQIDNO:13和SEQIDNO:15所示的核苷酸序列;其编码SEQIDNO:14和SEQIDNO:20所示的氨基酸序列。
本发明的再一方面涉及一种核酸构建体,其含有本发明任一项所述的核苷酸序列;具体地,所述核酸构建体为重组表达载体;更具体地,为重组原核表达载体或重组真核表达载体。
本发明的再一方面涉及一种重组宿主细胞,其含有本发明任一项所述的核酸构建体;具体地,所述重组宿主细胞为重组原核细胞或者重组真核细胞。
本发明的再一方面涉及一种单克隆抗体偶联物,包括单克隆抗体和偶联部分,其中,所述单克隆抗体为本发明中任一项所述的单克隆抗体,所述偶联部分为选自放射性核素、药物、毒素、细胞因子、酶、荧光素、和生物素中的一种或多种;具体地,所述偶联部分为蓖麻毒素;更具体地,所述偶联部分为蓖麻毒素A链。
本发明的再一方面涉及本发明中任一项所述的单克隆抗体或者本发明任一项所述的单克隆抗体偶联物在制备预防和/或治疗和/或辅助治疗高血压、高胆固醇、高胆固醇血症及其所引起的心血管疾病的药物中的用途。
本发明的再一方面涉及本发明中任一项所述的单克隆抗体或者本发明任一项所述的单克隆抗体偶联物在制备如下的药物或者试剂中的用途:
特异性与PCSK9结合的药物或者试剂,
阻断PCSK9与LDLR结合的药物或者试剂,
提高细胞表面LDLR数量或者血浆中LDLR水平的药物或试剂,
降低血浆中LDL或LDL-C水平的药物或试剂,
降低血浆中TG水平的药物或试剂,
抑制血浆中LDL积聚的药物或试剂,
抑制PCSK9所介导的LDLR降解的药物或试剂,或者
提高LDL所携带胆固醇的代谢水平和/或提高TG代谢水平的药物或者试剂。
本发明人还通过实验(体内实验)发现,本发明的PCSK9抗体能够有效地降低血浆中LDL和/或LDL-C水平,并且能在更长时间(可达17天)降低血浆中LDL和/或LDL-C水平。特别是出乎意料地发现,本发明的PCSK9抗体还能降低体内血清的TG水平,并且效果能够维持长达13天。目前现有技术中,尚未有任何PCSK9抗体能够实现这一技术效果。
本发明的再一方面涉及一种在体内或体外的方法,包括使用有效量的本发明中任一项所述的单克隆抗体或者本发明任一项所述的单克隆抗体偶联物的步骤,所述方法选自如下:
治疗和/或预防和/或辅助治疗高血压、高胆固醇、高胆固醇血症及其所引起的心血管疾病的方法,
特异性与PCSK9结合的方法,
阻断PCSK9与LDLR结合方法,
提高细胞表面LDLR数量或者血浆中LDLR水平的方法,
降低血浆中LDL或LDL-C水平的方法,
降低血浆中TG水平的方法,
抑制血浆中LDL积聚的方法,
抑制PCSK9所介导的LDLR降解的方法,或者
提高LDL所携带胆固醇的代谢水平和/或提高TG的代谢水平的方法。
本发明中部分术语的解释:
多核苷酸
本发明还涉及含有编码本发明所述单抗的重链可变区和/或轻链可变区的核酸序列的分离多核苷酸。在一个优选实施方案中,该核酸序列包含编码SEQIDNO:18或20所示的氨基酸序列。在另一个优选实施方案中,该多核苷酸包含SEQIDNO:17或19的核苷酸序列。本发明的核酸序列包括基因组序列,以及相应的cDNA和RNA序列。此处所用术语“核酸序列”应理解为包括合成DNA在内的所有这类变种。
核酸构建体
本发明还涉及包含本发明所述核酸序列及与之可操作连接的一个或多个调控序列的核酸构建体,所述调控序列在其相容条件下能指导编码序列在合适的宿主细胞中进行表达。表达应理解为包括多肽(单抗)生产中所涉及的任何步骤,包括,但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
“核酸构建体”在文中定义为单链或双链核酸分子,它们分离自天然基因,或者经修饰而含有以非天然方式组合和并列的核酸片段。当核酸构建体包含表达本发明所述编码序列必需的所有调控序列时,术语核酸构建体与表达盒同义。术语“编码序列”在文中定义为核酸序列中直接确定其蛋白产物的氨基酸序列的部分。编码序列的边界通常是由紧邻mRNA5’端开放读码框上游的核糖体结合位点(对于原核细胞)和紧邻mRNA3’端开放读码框下游的转录终止序列确定。编码序列可以包括,但不限于DNA、cDNA和重组核酸序列。
可以以多种方式操作编码本发明所述单抗的分离的核酸序列,使其表达所述单抗。可能期望或必须在插入载体之前对核酸序列进行加工,这取决于表达载体。应用重组DNA方法修饰核酸序列的技术为本领域所熟知。
本文中术语“控制序列”定义为包括表达本发明单抗所必需或有利的所有组分。每个调控序列对于编码单抗的核酸序列可以是天然含有的或外来的。这些调控序列包括,但不限于,前导序列、多聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号序列和转录终止子。最低限度,调控序列要包括启动子以及转录和翻译的终止信号。为了导入特定的限制位点以便将调控序列与编码单抗的核酸序列的编码区进行连接,可以提供带接头的调控序列。术语“可操作连接”在文中定义为这样一种构象,其中调控序列位于相对DNA序列之编码序列的适当位置,以使调控序列指导单抗的表达。
调控序列可以是合适的启动子序列,即可被表达核酸序列的宿主细胞识别的核酸序列。启动子序列含有介导单抗表达的转录调控序列。启动子可以是在所选宿主细胞中有转录活性的任何核酸序列,包括突变的、截短的和杂合的启动子,可以得自编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内单抗的基因。
调控序列还可以是合适的转录终止序列,即能被宿主细胞识别从而终止转录的一段序列。终止序列可操作连接在编码单抗的核酸序列的3’末端。在所选宿主细胞中可发挥功能的任何终止子都可以用于本发明。
调控序列还可以是合适的前导序列,即对宿主细胞的翻译十分重要的mRNA非翻译区。前导序列可操作连接于编码单抗的核酸序列的5’末端。在所选宿主细胞中可发挥功能的任何前导序列均可用于本发明。
调控序列还可以是信号肽编码区,该区编码一段连在单抗氨基端的氨基酸序列,能引导编码单抗进入细胞分泌途径。核酸序列编码区的5’端可能天然含有翻译读框一致地与分泌单抗的编码区片段自然连接的信号肽编码区。或者,编码区的5’端可含有对编码序列是外来的信号肽编码区。当编码序列在正常情况下不含有信号肽编码区时,可能需要添加外来信号肽编码区。或者,可以用外来的信号肽编码区简单地替换天然的信号肽编码区以增强单抗分泌。但是,任何能引导表达后的单抗进入所用宿主细胞的分泌途径的信号肽编码区都可以用于本发明。
添加能根据宿主细胞的生长情况来调节单抗表达的调控序列可能也是需要的。调控系统的例子是那些能对化学或物理刺激物(包括在有调控化合物的情况下)作出反应,从而开放或关闭基因表达的系统。调控序列的其他例子是那些能使基因扩增的调控序列。在这些例子中,应将编码单抗的核酸序列与调控序列可操作连接在一起。
表达载体
本发明还涉及包含本发明核酸序列、启动子和转录及翻译终止信号的重组表达载体。可以将上述各种核酸和调控序列连接在一起来制备重组表达载体,该载体可以包括一个或多个方便的限制位点,以便在这些位点插入或取代编码单抗的核酸序列。或者,可以通过将核酸序列或包含该序列的核酸构建体插入适当表达载体而表达本发明所述核酸序列。制备表达载体时,可使编码序列位于载体中以便与适当的表达调控序列可操作连接。
重组表达载体可以是任何便于进行重组DNA操作并表达核酸序列的载体(例如质粒或病毒)。载体的选择通常取决于载体与它将要导入的宿主细胞的相容性。载体可以是线性或闭环质粒。
载体可以是自主复制型载体(即存在于染色体外的完整结构,可独立于染色体进行复制),例如质粒、染色体外元件、微小染色体或人工染色体。载体可包含保证自我复制的任何机制。或者,载体是一个当导入宿主细胞时,将整合到基因组中并与所整合到的染色体一起复制的载体。此外,可应用单个载体或质粒,或总体包含将导入宿主细胞基因组的全部DNA的两个或多个载体或质粒,或转座子。
优选本发明所述载体含有一个或多个便于选择转化细胞的选择标记。选择标记是这样一个基因,其产物赋予对杀生物剂或病毒的抗性、对重金属的抗性,或赋予营养缺陷体原养型等。细菌选择标记的例子如枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因,或者抗生素如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素的抗性标记。
优选本发明所述载体包含能使载体稳定整合到宿主细胞基因组中,或保证载体在细胞中独立于细胞基因组而进行自主复制的元件。
就进行自主复制的情况而言,载体还可以包含复制起点,使载体能在目标宿主细胞中自主地复制。复制起点可以带有使其在宿主细胞中成为温度敏感型的突变(参见例如,Ehrlich,1978,美国国家科学院学报75:1433)。
可以向宿主细胞插入1个以上拷贝的本发明核酸序列以提高该基因产物的产量。该核酸序列的拷贝数增加可以通过将该序列的至少1个附加拷贝插入宿主细胞基因组中,或者与该核酸序列一起插入一个可扩增的选择标记,通过在有合适选择试剂存在下培养细胞,挑选出含有扩增拷贝的选择性标记基因、从而含有附加拷贝核酸序列的细胞。
用于连接上述各元件来构建本发明所述重组表达载体的操作是本领域技术人员所熟知的(参见例如Sambrook等,分子克隆实验室手册,第二版,冷泉港实验室出版社,冷泉港,纽约,1989)。
宿主细胞
本发明还涉及包含可用来重组生产单抗的本发明所述核酸序列的重组宿主细胞。可将包含本发明之核酸序列的载体导入宿主细胞,从而使该载体以上述染色体整合体或自我复制的染色体外载体形式得以维持。术语“宿主细胞”涵盖任何由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的后代。宿主细胞的选择很大程度上取决于单抗编码基因及其来源。
宿主细胞可以是原核细胞或者真核细胞,例如细菌或酵母细胞。可以通过本领域技术人员熟知的技术将载体导入宿主细胞。
制备方法
本发明还涉及重组制备本发明单抗的方法,该方法包括:(a)在适于产生所述单抗的条件下,培养含有核酸构建体的宿主细胞,该核酸构建体包含编码所述单抗的核酸序列;和(b)回收该单抗。
在本发明所述制备方法中,用本领域已知方法在合适单抗产生的营养培养基中培养细胞。例如,可以在合适的培养基中,在允许单抗表达和/或分离的条件下,通过摇瓶培养、实验室或工业发酵罐中小规模或大规模发酵(包括连续、分批、分批加料或固态发酵)来培养细胞。在包含碳和氮源以及无机盐的合适的培养基中,采用本领域已知的步骤进行培养。合适的培养基可由供应商提供或者可以参照公开的组成(例如,美国典型培养物保藏中心的目录中所述)来制备。如果单抗被分泌到培养基中,则可以直接从培养基中回收单抗。如果单抗不分泌,可以从细胞裂解物中回收。
可以用本领域已知方法回收所产生的单抗。例如,可以通过常规操作(包括,但不限于离心、过滤、抽提、喷雾干燥、蒸发或沉淀)从培养基中回收单抗(多肽)。
可以通过各种本领域已知的操作来纯化本发明所述单抗,这些操作包括,但不限于层析(例如,离子交换层析、亲和层析、疏水作用层析、层析聚焦、和大小排阻层析)、电泳(例如,制备性等电点聚焦)、差示溶解度(例如硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或抽提(参见例如,蛋白质纯化,J.C.Janson和LarsRyden编,VCHPublishers,NewYork,1989)。
药物组合物
本发明还涉及含有本发明单抗和药学可接受载体和/或赋形剂的药物组合物。所述药物组合物可用于诊断、缓解或治疗与旋毛虫感染有关的疾病或病症。在一个实施方案中,含有治疗有效量的本发明单抗的药物组合物以利于药用的方式配制和给药,并需考虑到个体病人的临床状况、运送位点、给药方法、给药日程安排和医生已知的其它因素。因此用于本文目的的“有效量”由这些方面的考虑决定。
含治疗有效量的本发明单抗的药物组合物可口服、非肠道给药、脑池内给药、鞘内给药等。“药学可接受辅料”指无毒的固体、半固体或液体填充物、稀释液、胶囊材料或任何类型的配方辅助物。本文所用术语“非肠道的”表示的给药方式包括静脉内、肌肉内、腹膜内、胸骨内、皮下、鞘内和关节内注射和输注。本发明单抗还可通过缓释系统恰当地给药。
在本发明中,术语EC50是指半最大效应浓度(concentrationfor50%ofmaximaleffect),是指能引起50%最大效应的浓度。
发明的有益效果
本发明的单克隆抗体(MAB1)能够很好地特异性与PCSK9结合,并且能够十分有效地阻断PCSK9与LDLR的结合,提高细胞表面LDLR的数量,提高LDL和所携带胆固醇的代谢,降低TG水平,防治和减少高胆固醇血症所引起的心血管疾病。
附图说明
图1:hLDLR-His片段的SDS-PAGE检测结果。从左至右的2个泳道的样品依次为:1.双酶切后hLDLR-His;M.1KBDNAMarker片段条带。
图2:菌落PCR鉴定pMC1-PCSK9-hLDLR-His重组子。从左至右的泳道样品依次为:1-5:克隆子pMC1-PCSK9-hLDLR-His;M:1kbpDNAMarker片段条带。
图3:PCSK9抗体MAB1的SDS-PAGE检测结果。从左至右的泳道样品及其上样量依次为:BSA,1μg;Marker,10μl;Reduced:还原型蛋白电泳上样缓冲液样品,1μg;Non-reduced:非还原型蛋白电泳上样缓冲液样品,1μg。
图4:MAB1的动力学特征参数检测结果图。
图5:ELISA方法检测MAB1分别与人、鼠、猴PCSK9抗体结合的曲线图。
图6:采用竞争ELISA方法检测MAB1抗体及人源PCSK9抗原与LDLR的竞争结合。
图7:流式细胞术检测MAB1孵育人肝HepG2细胞24h后细胞表面LDLR的表达水平。
图8:流式细胞术检测MAB1孵育人肝HepG2细胞48h后细胞表面LDLR的表达水平。
图9:SDS-PAGE检测MAB1孵育人肝HepG2细胞24h后细胞表面LDLR的表达水平。
图10:PCSK9抗体MAB1对小鼠体内血清LDL-C浓度的影响。
图11:PCSK9抗体MAB1对猴体内血清LDL-C浓度的影响。
图12:PCSK9抗体MAB1对猴体内血清TG浓度的影响。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解,下面的实施例仅用于说明本发明,而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者,按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著,黄培堂等译的《分子克隆实验指南》,第三版,科学出版社)或按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,为可以通过市场购买获得的常规产品。
在本发明的下述实施例中,使用的BALB/C小鼠购自广东省医学实验动物中心。
制备例1:人源、鼠源和猴源的PCSK9-TEV-his6融合蛋白的设计
和制备
1.基因PCSK9-TEV-his6的合成
分别对人源(NCBIReferenceSequence:NP_777596.21)、鼠源(NCBIReferenceSequence:NP_705793.1)和猴源(NCBIReferenceSequence:NP_001106130.1)PCSK9氨基酸序列与TEV-his6进行融合设计。分别将获得的融合蛋白所对应的序列(SEQIDNO:1)、(SEQIDNO:3)和(SEQIDNO:5)进行人工优化,并委托金斯瑞公司合成优化后的相对应的融合蛋白基因PCSK9-TEV-his6(SEQIDNO:2)、(SEQIDNO:4)和(SEQIDNO:6)。
675aa
QEDEDGDYEELVLALRSEEDGLAEAPEHGTTATFHRCAKDPWRLPGTYVVVLKEETHLSQSERTARRLQAQAARRGYLTKILHVFHGLLPGFLVKMSGDLLELALKLPHVDYIEEDSSVFAQSIPWNLERITPPRYRADEYQPPDGGSLVEVYLLDTSIQSDHREIEGRVMVTDFENVPEEDGTRFHRQASKCDSHGTHLAGVVSGRDAGVAKGASMRSLRVLNCQGKGTVSGTLIGLEFIRKSQLVQPVGPLVVLLPLAGGYSRVLNAACQRLARAGVVLVTAAGNFRDDACLYSPASAPEVITVGATNAQDQPVTLGTLGTNFGRCVDLFAPGEDIIGASSDCSTCFVSQSGTSQAAAHVAGIAAMMLSAEPELTLAELRQRLIHFSAKDVINEAWFPEDQRVLTPNLVAALPPSTHGAGWQLFCRTVWSAHSGPTRMATAVARCAPDEELLSCSSFSRSGKRRGERMEAQGGKLVCRAHNAFGGEGVYAIARCCLLPQANCSVHTAPPAEASMGTRVHCHQQGHVLTGCSSHWEVEDLGTHKPPVLRPRGQPNQCVGHREASIHASCCHAPGLECKVKEHGIPAPQEQVTVACEEGWTLTGCSALPGTSHVLGAYAVDNTCVVRSRDVSTTGSTSEGAVTAVAICCRSRHLAQASQELQENLYFQGHHHHHH(SEQIDNO:1)
2033bp
GCTTCAATGCAGGAGGACGAAGACGGGGATTACGAGGAACTGGTGCTGGCACTGCGAAGCGAGGAAGATGGACTGGCTGAGGCACCAGAACACGGAACCACAGCTACTTTCCATCGATGCGCAAAGGACCCATGGCGACTGCCAGGAACCTACGTCGTCGTGCTGAAAGAGGAAACTCACCTGAGTCAGTCAGAGAGAACCGCACGGAGACTGCAGGCACAGGCAGCTAGGCGAGGATATCTGACCAAAATCCTGCACGTCTTCCATGGACTGCTGCCTGGCTTTCTGGTGAAGATGTCCGGGGATCTGCTGGAGCTGGCTCTGAAACTGCCCCACGTGGACTACATTGAGGAAGATAGCTCCGTGTTTGCCCAGTCTATCCCTTGGAACCTGGAGAGGATTACACCCCCTAGATACAGGGCCGACGAATATCAGCCACCAGATGGAGGGAGCCTGGTCGAGGTGTATCTGCTGGACACTTCCATCCAGTCTGATCACAGGGAGATTGAAGGCCGCGTCATGGTGACTGATTTCGAGAACGTGCCAGAGGAAGACGGAACCAGATTTCATAGGCAGGCTTCAAAGTGCGATAGCCACGGCACCCATCTGGCAGGGGTCGTGTCTGGAAGAGACGCAGGCGTGGCCAAGGGGGCTAGTATGCGCTCACTGCGAGTCCTGAATTGTCAGGGAAAAGGCACCGTGAGTGGAACACTGATCGGCCTGGAGTTCATTCGAAAGAGCCAGCTGGTCCAGCCAGTGGGACCTCTGGTCGTGCTGCTGCCACTGGCAGGAGGATACAGCAGAGTGCTGAACGCAGCATGCCAGCGACTGGCAAGAGCTGGAGTCGTGCTGGTGACAGCTGCAGGCAATTTTCGGGACGATGCCTGTCTGTATAGCCCTGCATCCGCCCCAGAAGTCATCACTGTGGGGGCAACCAACGCACAGGACCAGCCAGTGACCCTGGGAACACTGGGGACTAATTTCGGAAGATGCGTGGACCTGTTTGCCCCCGGCGAGGATATCATTGGGGCTTCTAGTGACTGCTCAACATGTTTCGTCAGCCAGTCCGGAACTAGCCAGGCCGCTGCACACGTGGCAGGAATTGCAGCTATGATGCTGAGCGCCGAGCCTGAACTGACCCTGGCTGAGCTGCGCCAGCGACTGATCCATTTCTCCGCAAAAGATGTGATTAACGAGGCCTGGTTTCCAGAAGACCAGAGGGTCCTGACACCCAATCTGGTGGCAGCACTGCCTCCAAGCACTCACGGAGCTGGATGGCAGCTGTTTTGTCGCACCGTGTGGTCTGCCCATAGTGGCCCTACAAGAATGGCTACTGCAGTGGCCAGGTGCGCCCCAGATGAGGAACTGCTGTCCTGTAGCAGCTTCTCTCGCAGTGGGAAGCGACGGGGAGAGCGAATGGAAGCCCAGGGGGGAAAACTGGTGTGCAGGGCTCACAACGCATTTGGCGGGGAAGGCGTGTATGCTATCGCACGCTGCTGTCTGCTGCCCCAGGCTAATTGTTCCGTGCATACCGCACCCCCTGCCGAGGCTTCTATGGGAACAAGGGTCCACTGCCATCAGCAGGGACACGTGCTGACCGGCTGTTCCTCTCATTGGGAGGTCGAAGACCTGGGAACACACAAGCCACCAGTGCTGCGGCCCAGAGGACAGCCTAATCAGTGCGTGGGACATCGCGAAGCCTCCATCCACGCTTCTTGCTGTCATGCCCCTGGGCTGGAGTGTAAGGTGAAAGAACACGGCATCCCCGCACCACAGGAGCAGGTCACCGTGGCCTGCGAGGAAGGGTGGACACTGACTGGATGTAGCGCCCTGCCAGGAACATCCCACGTCCTGGGCGCATACGCCGTGGATAACACTTGCGTCGTGAGGAGTCGCGACGTGTCAACTACCGGCTCAACCAGCGAGGGAGCAGTCACAGCTGTGGCAATCTGCTGTCGATCTCGGCACCTGGCCCAGGCTAGTCAGGAGCTGCAGGAAAATCTGTATTTCCAGGGCCACCATCACCATCACCA(SEQIDNO:2)
673aa
QDEDGDYEELMLALPSQEDGLADEAAHVATATFRRCSKEAWRLPGTYIVVLMEETQRLQIEQTAHRLQTRAARRGYVIKVLHIFYDLFPGFLVKMSSDLLGLALKLPHVEYIEEDSFVFAQSIPWNLERIIPAWHQTEEDRSPDGSSQVEVYLLDTSIQGAHREIEGRVTITDFNSVPEEDGTRFHRQASKCDSHGTHLAGVVSGRDAGVAKGTSLHSLRVLNCQGKGTVSGTLIGLEFIRKSQLIQPSGPLVVLLPLAGGYSRILNAACRHLARTGVVLVAAAGNFRDDACLYSPASAPEVITVGATNAQDQPVTLGTLGTNFGRCVDLFAPGKDIIGASSDCSTCFMSQSGTSQAAAHVAGIVARMLSREPTLTLAELRQRLIHFSTKDVINMAWFPEDQQVLTPNLVATLPPSTHETGGQLLCRTVWSAHSGPTRTATATARCAPEEELLSCSSFSRSGRRRGDWIEAIGGQQVCKALNAFGGEGVYAVARCCLVPRANCSIHNTPAARAGLETHVHCHQKDHVLTGCSFHWEVEDLSVRRQPALRSRRQPGQCVGHQAASVYASCCHAPGLECKIKEHGISGPSEQVTVACEAGWTLTGCNVLPGASLTLGAYSVDNLCVARVHDTARADRTSGEATVAAAICCRSRPSAKASWVQENLYFQGHHHHHH(SEQIDNO:3)
2019bp
CAGGATGAAGATGGGGATTACGAGGAACTGATGCTGGCTCTGCCTTCCCAGGAAGACGGACTGGCAGATGAGGCCGCTCACGTGGCTACCGCAACATTCCGGAGATGCTCTAAAGAAGCCTGGCGCCTGCCAGGGACTTATATCGTGGTCCTGATGGAGGAAACCCAGCGGCTGCAGATTGAGCAGACTGCACACCGACTGCAGACCCGAGCAGCAAGGCGAGGCTACGTGATCAAGGTCCTGCATATCTTCTACGATCTGTTCCCCGGCTTTCTGGTGAAGATGAGCTCCGACCTGCTGGGGCTGGCCCTGAAACTGCCTCACGTGGAATACATCGAGGAAGATTCCTTCGTCTTTGCTCAGTCTATTCCCTGGAACCTGGAGCGCATCATTCCTGCATGGCATCAGACAGAGGAAGACCGGTCTCCCGATGGCTCTAGTCAGGTGGAGGTCTATCTGCTGGACACTAGTATCCAGGGAGCACACCGAGAAATCGAGGGAAGAGTGACTATTACCGATTTCAACTCCGTCCCTGAGGAAGACGGAACCCGGTTTCATAGACAGGCCTCTAAGTGCGATAGTCATGGCACACACCTGGCTGGAGTGGTCAGTGGCAGAGACGCCGGGGTGGCTAAGGGAACATCTCTGCACAGTCTGAGGGTGCTGAATTGTCAGGGAAAAGGAACCGTGAGCGGCACCCTGATCGGACTGGAGTTCATTAGAAAGAGTCAGCTGATCCAGCCATCAGGACCACTGGTGGTCCTGCTGCCTCTGGCAGGAGGATACAGCAGGATTCTGAACGCTGCATGCAGACATCTGGCTAGGACCGGAGTGGTCCTGGTGGCAGCTGCAGGCAATTTTCGCGACGATGCCTGTCTGTATTCACCTGCCAGCGCCCCAGAAGTGATCACAGTCGGAGCAACTAACGCACAGGACCAGCCAGTGACCCTGGGGACACTGGGAACTAATTTCGGCAGGTGCGTGGACCTGTTTGCACCCGGCAAAGATATCATTGGGGCCTCAAGCGACTGCAGCACCTGTTTCATGAGTCAGTCAGGGACATCCCAGGCCGCTGCACACGTGGCAGGAATTGTCGCCCGCATGCTGTCACGAGAACCCACACTGACTCTGGCCGAGCTGAGACAGAGGCTGATCCATTTCAGCACAAAGGATGTGATTAACATGGCCTGGTTTCCAGAAGACCAGCAGGTGCTGACACCCAATCTGGTCGCTACTCTGCCCCCTTCCACCCACGAGACAGGAGGACAGCTGCTGTGCCGAACCGTGTGGTCCGCCCATTCTGGACCAACCCGAACAGCAACTGCCACCGCTAGGTGCGCTCCCGAGGAAGAGCTGCTGAGCTGTTCCTCTTTCAGCCGGTCCGGACGACGGAGAGGCGATTGGATCGAAGCCATTGGGGGACAGCAGGTGTGCAAAGCTCTGAATGCATTTGGCGGAGAGGGCGTGTACGCAGTCGCAAGGTGCTGTCTGGTGCCACGCGCAAACTGTTCCATCCACAATACACCTGCCGCTAGAGCCGGCCTGGAGACTCACGTGCATTGCCACCAGAAGGATCATGTCCTGACCGGGTGTTCTTTTCACTGGGAAGTGGAGGACCTGAGTGTCAGGCGCCAGCCTGCCCTGAGGTCACGACGGCAGCCAGGACAGTGCGTGGGACATCAGGCAGCCTCAGTCTACGCTAGCTGCTGTCACGCACCTGGCCTGGAGTGTAAGATCAAAGAGCATGGCATTAGTGGGCCATCAGAACAGGTGACCGTCGCCTGCGAGGCTGGATGGACACTGACTGGCTGTAACGTGCTGCCAGGAGCAAGCCTGACTCTGGGAGCTTATTCCGTGGACAATCTGTGCGTGGCCAGAGTCCACGACACCGCTAGGGCAGATCGCACCAGCGGAGAGGCAACAGTGGCTGCAGCCATCTGCTGTCGCAGCCGACCCTCCGCTAAGGCATCTTGGGTCCAGGAGAATCTGTATTTCCAGGGGCATCATCATCATCACCAT(SEQIDNO:4)
675aa
QEDEDGDYEELVLALRSEEDGLADAPEHGATATFHRCAKDPWRLPGTYVVVLKEETHRSQSERTARRLQAQAARRGYLTKILHVFHHLLPGFLVKMSGDLLELALKLPHVDYIEEDSSVFAQSIPWNLERITPARYRADEYQPPKGGSLVEVYLLDTSIQSDHREIEGRVMVTDFESVPEEDGTRFHRQASKCDSHGTHLAGVVSGRDAGVAKGAGLRSLRVLNCQGKGTVSGTLIGLEFIRKSQLVQPVGPLVVLLPLAGGYSRVFNAACQRLARAGVVLVTAAGNFRDDACLYSPASAPEVITVGATNAQDQPVTLGTLGTNFGRCVDLFAPGEDIIGASSDCSTCFVSRSGTSQAAAHVAGIAAMMLSAEPELTLAELRQRLIHFSAKDVINEAWFPEDQRVLTPNLVAALPPSTHRAGWQLFCRTVWSAHSGPTRMATAVARCAQDEELLSCSSFSRSGKRRGERIEAQGGKRVCRAHNAFGGEGVYAIARCCLLPQVNCSVHTAPPAGASMGTRVHCHQQGHVLTGCSSHWEVEDLGTHKPPVLRPRGQPNQCVGHREASIHASCCHAPGLECKVKEHGIPAPQEQVIVACEDGWTLTGCSPLPGTSHVLGAYAVDNTCVVRSRDVSTTGSTSKEAVAAVAICCRSRHLVQASQELQENLYFQGHHHHHH(SEQIDNO:5)
2025bp
CAGGAAGACGAAGACGGCGATTACGAGGAACTGGTGCTGGCCCTGAGGAGCGAGGAAGACGGACTGGCCGATGCTCCTGAACACGGCGCAACTGCCACCTTCCATCGATGCGCAAAGGACCCATGGCGACTGCCAGGGACTTACGTCGTCGTGCTGAAAGAGGAAACCCACCGAAGTCAGTCAGAGCGGACAGCTCGGAGACTGCAGGCACAGGCAGCTAGGCGAGGCTATCTGACAAAAATCCTGCATGTCTTCCACCATCTGCTGCCCGGGTTTCTGGTGAAGATGTCCGGAGATCTGCTGGAGCTGGCTCTGAAACTGCCTCACGTCGACTACATTGAGGAAGATAGCTCCGTGTTTGCCCAGAGCATCCCATGGAACCTGGAGAGGATTACCCCCGCCAGATACAGGGCTGACGAATATCAGCCCCCTAAAGGCGGGTCCCTGGTCGAGGTGTATCTGCTGGACACATCCATCCAGTCTGATCACAGAGAGATTGAAGGCAGGGTCATGGTGACCGATTTCGAATCTGTGCCTGAGGAAGACGGGACAAGATTTCATAGGCAGGCTTCTAAGTGCGATAGTCACGGAACCCATCTGGCAGGAGTCGTGTCCGGACGAGACGCAGGGGTGGCAAAGGGAGCTGGACTGCGCTCTCTGCGAGTCCTGAATTGTCAGGGGAAAGGAACCGTGTCAGGAACACTGATCGGCCTGGAGTTCATTCGAAAGAGCCAGCTGGTCCAGCCAGTGGGACCTCTGGTCGTGCTGCTGCCACTGGCAGGAGGATACAGCAGAGTGTTCAACGCAGCATGCCAGCGGCTGGCTAGAGCAGGAGTCGTGCTGGTGACAGCTGCAGGAAATTTTCGGGACGATGCCTGTCTGTATAGTCCTGCCTCAGCTCCAGAAGTCATCACTGTGGGAGCAACCAACGCCCAGGATCAGCCAGTGACCCTGGGCACACTGGGGACTAATTTCGGCCGGTGCGTGGACCTGTTTGCACCAGGAGAGGATATCATTGGCGCTTCTAGTGACTGCAGCACTTGTTTCGTCAGCAGATCCGGAACCTCCCAGGCAGCTGCACATGTGGCAGGAATTGCAGCTATGATGCTGAGTGCAGAGCCTGAACTGACCCTGGCAGAGCTGCGACAGCGACTGATCCACTTCAGCGCCAAGGATGTGATTAACGAGGCATGGTTTCCTGAAGACCAGAGAGTCCTGACTCCAAATCTGGTGGCAGCCCTGCCACCATCTACCCACCGAGCTGGATGGCAGCTGTTTTGTAGAACAGTGTGGAGCGCCCATTCCGGGCCAACAAGGATGGCAACTGCAGTGGCTCGATGCGCACAGGACGAGGAACTGCTGAGCTGTTCAAGCTTCTCTAGGAGTGGGAAGCGACGAGGAGAGCGAATCGAAGCACAGGGGGGAAAAAGGGTGTGCCGCGCTCACAACGCATTTGGCGGGGAGGGCGTGTACGCAATTGCCAGGTGCTGTCTGCTGCCCCAGGTCAATTGTTCTGTGCATACAGCCCCTCCAGCTGGCGCAAGTATGGGGACTCGCGTCCACTGCCATCAGCAGGGGCACGTGCTGACAGGATGTTCCTCTCATTGGGAGGTCGAAGATCTGGGCACTCACAAACCACCTGTGCTGCGACCAAGAGGACAGCCTAACCAGTGCGTGGGGCATCGGGAGGCATCAATCCACGCAAGCTGCTGTCATGCACCAGGACTGGAGTGTAAGGTGAAAGAACACGGGATCCCAGCACCCCAGGAGCAGGTCATTGTGGCCTGCGAAGACGGCTGGACACTGACTGGGTGTAGTCCTCTGCCAGGAACTTCACACGTCCTGGGCGCCTATGCTGTGGATAATACCTGCGTCGTGAGGTCCCGCGACGTGTCTACCACAGGCTCAACCAGCAAGGAGGCCGTCGCTGCAGTGGCTATCTGCTGTCGAAGCCGGCACCTGGTGCAGGCAAGCCAGGAACTGCAGGAGAATCTGTATTTTCAGGGACATCACCACCACCACCAT(SEQIDNO:6)
2.pUC57simple-PCSK9-TEV-his6质粒的获得
由金斯瑞公司将合成的PCSK9-TEV-his6融合基因(SEQIDNO:2)克隆到pUC57simple(金斯瑞公司提供)载体中,获得pUC57simple-PCSK9-TEV-his6质粒。
pcDNA3-PCSK9-TEV-his6重组质粒的构建:将质粒pUC57simple-PCSK9-TEV-his6进行酶切后(XbaI和BamHI),电泳回收得到的融合基因片段PCSK9-TEV-his并与pcDNA3.1载体进行连接反应重组构建获得pcDNA3.1-PCSK9-TEV-his6(pcDNA3.1表达载体购自Invitrogen公司;DH5a感受态购自TIANGEN公司),并筛选得到阳性的pcDNA3.1-PCSK9-TEV-his6克隆菌落,按照常规方法扩增大肠杆菌然后采用试剂盒提取得到pcDNA3.1-PCSK9-TEV-his6重组质粒。(操作步骤参照试剂盒说明书)。
3.融合蛋白PCSK9-TEV-his6的表达、纯化及抗原PCSK9的获得
将上面构建的人源、鼠源和猴源的重组质粒pcDNA3.1-PCSK9-TEV-his6分别转染293F细胞7天后,将培养液进行高速离心、微孔滤膜抽真空过滤,根据厂家提供的操作方法采用HisTrap柱(蛋白纯化液相色谱系统/AKTAPurifier10,GE)进行纯化,分别得到纯化的人源、鼠源和猴源PCSK9-TEV-his6融合蛋白。将得到的纯化的融合蛋白用TEV蛋白酶进行酶切,并过Ni-NTA亲和层析柱纯化获得PCSK9抗原。
制备例2:LDLR蛋白的表达和纯化
1.利用分子克隆技术构建hLDLR-His质粒
以购买的LDLRhumancDNA(购自Origene公司)为模板,分别使用引物对LDLR_F_XbaI和LD_788HIS_R(表1)进行PCR扩增并用普通DNA产物纯化试剂盒纯化回收hLDLR-His片段。
表1:引物序列
2.使用限制性内切酶XbaI、HindIII酶切得到的hLDLR-His片段,并凝胶回收目的片段(图1)。
3.将回收后的目的片段hLDLR-His与XbaI&HindIII-HF酶切,通过T4连接酶连接,并将全部连接产物转化DH5a化学感受态细胞,涂布带有Amp的Agar平板。挑选5个分离良好的单菌落,使用pTT5-F,pTT5-R引物(表1)做菌落PCR鉴定(图2)。
4.挑选PCR鉴定结果为阳性的克隆子(图2,1和2号),接种到LB培养基培养,并取菌液送广州英俊公司测序验证,测序结果比对显示,阳性重组子插入序列完全正确。
LDLR-his蛋白序列如下(796aa):
MGPWGWKLRWTVALLLAAAGTAVGDRCERNEFQCQDGKCISYKWVCDGSAECQDGSDESQETCLSVTCKSGDFSCGGRVNRCIPQFWRCDGQVDCDNGSDEQGCPPKTCSQDEFRCHDGKCISRQFVCDSDRDCLDGSDEASCPVLTCGPASFQCNSSTCIPQLWACDNDPDCEDGSDEWPQRCRGLYVFQGDSSPCSAFEFHCLSGECIHSSWRCDGGPDCKDKSDEENCAVATCRPDEFQCSDGNCIHGSRQCDREYDCKDMSDEVGCVNVTLCEGPNKFKCHSGECITLDKVCNMARDCRDWSDEPIKECGTNECLDNNGGCSHVCNDLKIGYECLCPDGFQLVAQRRCEDIDECQDPDTCSQLCVNLEGGYKCQCEEGFQLDPHTKACKAVGSIAYLFFTNRHEVRKMTLDRSEYTSLIPNLRNVVALDTEVASNRIYWSDLSQRMICSTQLDRAHGVSSYDTVISRDIQAPDGLAVDWIHSNIYWTDSVLGTVSVADTKGVKRKTLFRENGSKPRAIVVDPVHGFMYWTDWGTPAKIKKGGLNGVDIYSLVTENIQWPNGITLDLLSGRLYWVDSKLHSISSIDVNGGNRKTILEDEKRLAHPFSLAVFEDKVFWTDIINEAIFSANRLTGSDVNLLAENLLSPEDMVLFHNLTQPRGVNWCERTTLSNGGCQYLCLPAPQINPHSPKFTCACPDGMLLARDMRSCLTEAEAAVATQETSTVRLKVSSTAVRTQHTTTRPVPDTSRLPGATPGLTTVEIVTMSHQALGDVAGRGNEKKPSSVRHHHHHH**(SEQIDNO:11)
LDLR-his蛋白对应的DNA序列(2388bp):
ATGGGGCCCTGGGGCTGGAAATTGCGCTGGACCGTCGCCTTGCTCCTCGCCGCGGCGGGGACTGCAGTGGGCGACAGATGCGAAAGAAACGAGTTCCAGTGCCAAGACGGGAAATGCATCTCCTACAAGTGGGTCTGCGATGGCAGCGCTGAGTGCCAGGATGGCTCTGATGAGTCCCAGGAGACGTGCTTGTCTGTCACCTGCAAATCCGGGGACTTCAGCTGTGGGGGCCGTGTCAACCGCTGCATTCCTCAGTTCTGGAGGTGCGATGGCCAAGTGGACTGCGACAACGGCTCAGACGAGCAAGGCTGTCCCCCCAAGACGTGCTCCCAGGACGAGTTTCGCTGCCACGATGGGAAGTGCATCTCTCGGCAGTTCGTCTGTGACTCAGACCGGGACTGCTTGGACGGCTCAGACGAGGCCTCCTGCCCGGTGCTCACCTGTGGTCCCGCCAGCTTCCAGTGCAACAGCTCCACCTGCATCCCCCAGCTGTGGGCCTGCGACAACGACCCCGACTGCGAAGATGGCTCGGATGAGTGGCCGCAGCGCTGTAGGGGTCTTTACGTGTTCCAAGGGGACAGTAGCCCCTGCTCGGCCTTCGAGTTCCACTGCCTAAGTGGCGAGTGCATCCACTCCAGCTGGCGCTGTGATGGTGGCCCCGACTGCAAGGACAAATCTGACGAGGAAAACTGCGCTGTGGCCACCTGTCGCCCTGACGAATTCCAGTGCTCTGATGGAAACTGCATCCATGGCAGCCGGCAGTGTGACCGGGAATATGACTGCAAGGACATGAGCGATGAAGTTGGCTGCGTTAATGTGACACTCTGCGAGGGACCCAACAAGTTCAAGTGTCACAGCGGCGAATGCATCACCCTGGACAAAGTCTGCAACATGGCTAGAGACTGCCGGGACTGGTCAGATGAACCCATCAAAGAGTGCGGGACCAACGAATGCTTGGACAACAACGGCGGCTGTTCCCACGTCTGCAATGACCTTAAGATCGGCTACGAGTGCCTGTGCCCCGACGGCTTCCAGCTGGTGGCCCAGCGAAGATGCGAAGATATCGATGAGTGTCAGGATCCCGACACCTGCAGCCAGCTCTGCGTGAACCTGGAGGGTGGCTACAAGTGCCAGTGTGAGGAAGGCTTCCAGCTGGACCCCCACACGAAGGCCTGCAAGGCTGTGGGCTCCATCGCCTACCTCTTCTTCACCAACCGGCACGAGGTCAGGAAGATGACGCTGGACCGGAGCGAGTACACCAGCCTCATCCCCAACCTGAGGAACGTGGTCGCTCTGGACACGGAGGTGGCCAGCAATAGAATCTACTGGTCTGACCTGTCCCAGAGAATGATCTGCAGCACCCAGCTTGACAGAGCCCACGGCGTCTCTTCCTATGACACCGTCATCAGCAGAGACATCCAGGCCCCCGACGGGCTGGCTGTGGACTGGATCCACAGCAACATCTACTGGACCGACTCTGTCCTGGGCACTGTCTCTGTTGCGGATACCAAGGGCGTGAAGAGGAAAACGTTATTCAGGGAGAACGGCTCCAAGCCAAGGGCCATCGTGGTGGATCCTGTTCATGGCTTCATGTACTGGACTGACTGGGGAACTCCCGCCAAGATCAAGAAAGGGGGCCTGAATGGTGTGGACATCTACTCGCTGGTGACTGAAAACATTCAGTGGCCCAATGGCATCACCCTAGATCTCCTCAGTGGCCGCCTCTACTGGGTTGACTCCAAACTTCACTCCATCTCAAGCATCGATGTCAACGGGGGCAACCGGAAGACCATCTTGGAGGATGAAAAGAGGCTGGCCCACCCCTTCTCCTTGGCCGTCTTTGAGGACAAAGTATTTTGGACAGATATCATCAACGAAGCCATTTTCAGTGCCAACCGCCTCACAGGTTCCGATGTCAACTTGTTGGCTGAAAACCTACTGTCCCCAGAGGATATGGTTCTCTTCCACAACCTCACCCAGCCAAGAGGAGTGAACTGGTGTGAGAGGACCACCCTGAGCAATGGCGGCTGCCAGTATCTGTGCCTCCCTGCCCCGCAGATCAACCCCCACTCGCCCAAGTTTACCTGCGCCTGCCCGGACGGCATGCTGCTGGCCAGGGACATGAGGAGCTGCCTCACAGAGGCTGAGGCTGCAGTGGCCACCCAGGAGACATCCACCGTCAGGCTAAAGGTCAGCTCCACAGCCGTAAGGACACAGCACACAACCACCCGACCTGTTCCCGACACCTCCCGGCTGCCTGGGGCCACCCCTGGGCTCACCACGGTGGAGATAGTGACAATGTCTCACCAAGCTCTGGGCGACGTTGCTGGCAGAGGAAATGAGAAGAAGCCCAGTAGCGTGAGGCACCACCATCATCACCACTAATAG(SEQIDNO:12)
5.LDLR蛋白的表达和纯化
按照lipofectamin转染试剂盒(购自Invitrogen公司)方法将重组质粒LDLR-his转染293F细胞(购自Invitrogen公司)7天后,将培养液通过高速离心、上清浓缩并换液至BindingBufferA后上样至HisTrap柱,用ElutionBufferA线性洗脱蛋白,初纯样品用HiTrapDesalting柱换液至BindingBufferB并上样至HiTrapQ柱,用ElutionBufferB线性洗脱蛋白、回收目标样品并换液至PBS。取纯化后样品加入还原型蛋白电泳上样缓冲液,进行SDS-PAGE电泳检测。
实施例1:MAB1重链和轻链序列的设计,表达和纯化
1.抗体的设计
为制备单克隆抗体MAB1,本发明人根据已有的PCSK9蛋白序列(SEQIDNO:1)及其蛋白三维晶体结构等,创造性地人工设计了一系列的抗体序列。通过大量的筛选和检测,最终得到了一种与PCSK9特异性结合的MAB1。该单克隆抗体重链和轻链可变区的氨基酸序列及其编码序列如下面的SEQIDNO:13-16。
设计的MAB1重链VH的DNA序列如下(369bp):
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGAGGAGGCCTGGTGCAGCCCGGAAGATCTCTGAGACTGAGTTGCGCCGCTTCAGGATTCACCTTTAGCTCCTACAGCATGAACTGGGTGCGGCAGGCTCCTGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCCGGAATCTCTAGTTCAAGCTCCTACATTAGCTATGCAGACTCCGTCCAGGGAAGGTTCACCATCTCTCGCGATAACGGCAAGAACAGCCTGTATCTGCAGATGAACAGCCTGCGAGCAGAGGACACAGCCCTGTACTTCTGTGCCAGAGAATATGACTTCTGGTCCGCCTATTACGACGCCTTCGATGTCTGGGGACAGGGGACTATGGTCACTGTCTCAAGC(SEQIDNO:13)
其编码的VH蛋白序列如下(123aa):
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSGISSSSSYISYADSVQGRFTISRDNGKNSLYLQMNSLRAEDTALYFCAREYDFWSAYYDAFDVWGQGTMVTVSS(SEQIDNO:14)
MAB1轻链VL的DNA序列如下(651bp):
CAGAGCGAACTGACTCAGCCAAGAAGCGTCAGTGGATCACCTGGCCAGAGCGTGACAATCTCCTGCACCGGCACAAGCAGGAACATTGGCGGGGGAAATGACGTCCACTGGTACCAGCAGCATCCAGGGAAGGCCCCCAAACTGCTGATCTCCGGAGTGATTGAGCGGAGCTCCGGCGTCCCCGATAGATTCAGCGGGTCCAAGTCTGGAAACACAGCTTCTCTGACTATCAGTGGCCTGCAGGCAGAGGACGAAGCCGATTACTATTGCCAGTCTTTCGACGGCAGTCTGTCAGGGAGCGTGTTTGGCACTGGGACCGATGTGACCGTCCTGGGACAGCCTAAGGCAGCTCCATCTGTGACACTGTTCCCCCCTTCTAGTGAGGAACTGCAGGCTAACAAGGCAACTCTGGTGTGTCTGATTAGCGACTTTTACCCAGGAGCTGTGACCGTCGCATGGAAGGCTGATTCAAGCCCCGTGAAAGCAGGAGTCGAGACCACAACTCCTAGTAAGCAGTCAAACAACAAGTACGCAGCCTCCTCTTATCTGAGCCTGACCCCCGAACAGTGGAAATCCCACCGGTCCTATTCTTGCCAGGTGACCCACGAAGGCTCTACCGTCGAGAAAACAGTCGCTCCTACCGAATGCTCC(SEQIDNO:15)
其编码的VL蛋白序列如下(217aa):
QSELTQPRSVSGSPGQSVTISCTGTSRNIGGGNDVHWYQQHPGKAPKLLISGVIERSSGVPDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCQSFDGSLSGSVFGTGTDVTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS(SEQIDNO:16)
2.抗体的表达和纯化
将MAB1的重链cDNA序列(其中的可变区编码序列如SEQIDNO:17所示)和轻链的cDNA序列(其中的可变区编码序列如SEQIDNO:19所示)分别克隆到pUC57simple(金斯瑞公司提供)载体中,分别获得pUC57simple-MAB1H和pUC57simple-MAB1L质粒。
分别将质粒pUC57simple-MAB1H和pUC57simple-MAB1L进行酶切(HindIII&EcoRI),电泳回收得到的重链轻链分别亚克隆到pcDNA3.1载体中,提取重组质粒共转染293F细胞。细胞培养7天后,将培养液通过高速离心、上清浓缩后上样至HiTrapMabSelectSuRe柱,用ElutionBuffer一步洗脱蛋白并回收目标样品并换液至PBS。
将纯化后的样品分别加入还原型蛋白电泳上样缓冲液和非还原型蛋白电泳上样缓冲液,煮沸后进行SDS-PAGE电泳检测。MAB1的电泳图如图3所示,还原型蛋白样品目标蛋白在45kD和30KD处,非还原型蛋白样品(单个抗体)目标蛋白在150kD处。
本实施例制得的MAB1用于下面的实施例2-6。
实施例2:MAB1与抗原PCSK9-his的动力学参数测定
使用Fortebio分子相互作用仪测定MAB1与人源抗原PCSK9-his的动力学参数。
MAB1(实施例1制得)采用氨基偶联的方式固定于AR2G传感器表面,经乙醇胺封闭,于PBST中平衡后,与抗原PCSK9-his(制备例1制备)结合,抗原用PBST两倍稀释,浓度为411、205.5、102.8、51.4、25.7、12.8、0nM,于PBST中解离。
MAB1的动力学参数见表2,检测结果如图4所示。
表2:MAB1的动力学参数
KD为亲和力常数;kon为抗原抗体结合速率;kdis为抗原抗体解离速率;KD=kdis/kon。
结果表明,抗体MAB1与抗原有较好的亲和力。
实施例3:MAB1与抗原PCSK9的结合活性分析
1.采用ELISA夹心法分别测定单克隆抗体与鼠源、猴源和人源抗原PCSK9(制备例1制备)的结合活性。
将包被鼠抗his单克隆抗体(金斯瑞生物,A00186)的酶标板用BSA封闭2h,分别加入鼠源、猴源和人源抗原PCSK9预保温30min,加入MAB1进行孵育30min,加入HRP标记羊抗人IgG二抗(Jackson,109-035-088),用TMB(Neogen,308177)进行显色反应5min,并在酶标仪中检测450nm波长吸光度。
检测结果如图5所示。
由图5可见,MAB1能有效地结合PCSK9蛋白,并且其结合效率呈剂量依赖关系。
MAB1抗体不同稀释浓度梯度结合鼠源、猴源和人源抗原PCSK9的吸光强度见表3-表5。
表3:MAB1与鼠源PCSK9的结合(ELISA夹心法)
表4:MAB1与猴源PCSK9的结合(ELISA夹心法)
表5:MAB1与人源PCSK9的结合(ELISA夹心法)
通过对结合的MAB1抗体进行吸光强度定量分析,曲线模拟得到结合效率EC50(表6)。
表6:ELISA夹心法分析MAB1与抗原PCSK9的结合效率EC50
结果表明,MAB1能有效地结合人、鼠和猴PCSK9。
2.采用竞争ELISA方法测定MAB1及PCSK9抗原(人源)与LDLR的竞争结合。
用LDLR-his(制备例2制得)包被酶标板4℃过夜,1%BSA封闭2h后加入人源PCSK9和MAB1抗原抗体混合液(稀释浓度见表7),37℃孵育30min后加入酶标二抗孵育1h,37℃孵育30min。在酶标仪上检测450nm的吸光值(见表7)。
检测MAB1与LDLR(制备例2制备)竞争结合的结果如图6所示。
由图6可见,MAB1有效地阻断抗原PSCK9与LDLR的结合,并且其结合效率呈剂量依赖关系。
各剂量的吸光强度见表7。结果表明,抗体MAB1能有效地结合PCSK9蛋白并抑制PCSK9诱导的细胞表面LDLR下降(即MAB1可以有效阻断PCSK9与LDLR的结合及后者的内吞噬现象),并且这种抑制作用与抗体剂量呈正相关性(即剂量依赖关系)。
表7:MAB1抗体与PSCK9抗原竞争LDLR结合
通过吸光强度曲线模拟分析得到MAB1的结合效率EC50为0.591nM。结果很明显地表明,MAB1在极低的浓度下就能有效地与PCSK9抗原竞争结合LDLR,从而抑制PCSK9所诱导的细胞表面LDLR下降(见实施例4),继而达到低密度胆固醇体内代谢的调节作用(即MAB1降低血清中低密度胆固醇的水平)(见实施例5)。
实施例4:MAB1的细胞生物学活性分析
为检测MAB1对人肝细胞株HepG2细胞中低密度胆固醇受体(LDLR)水平的调节作用,采用流式方法和蛋白免疫印迹方法检测MAB1对HepG2细胞表面LDLR水平的调节作用。
1.流式细胞法检测MAB1对HepG2细胞LDLR水平的调节作用
取生长良好的HepG2细胞样本,移去旧培养液,按如下设计加抗原抗体分别孵育24h和48h。
表8:MAB1及抗原PCSK9处理样本剂量表
抗原抗体分别孵育24,48小时后,采用常规胰酶消化方法获取HepG2细胞并使每个收集管细胞数为2×105,用PBS(含1%BSA)配制PE标记的兔抗人LDLR(1:200)的抗体稀释液,冰上避光孵育1小时后,用PBS洗涤细胞2次后加入300μlPBS,在流式细胞仪上用PE通道检测荧光信号。
抗原抗体孵育24h检测结果如图7所示。孵育48h检测结果如图8所示。
由图7、图8可见,MAB1呈剂量依赖性阻断PCSK9引发的细胞表面LDLR表达的降低,能有效地拮抗抗原PCSK9对LDLR的负性调节作用。
2.蛋白免疫印迹法检测MAB1对人干细胞株HepG2细胞表面LDLR水平的调节作用
取生长良好的HepG2细胞样本,移去旧培养基,按表8设计加抗体药物孵育24h。药物处理后,收集并裂解细胞,对收集的裂解上清进行SDS-PAGE电泳检测,如图9所示,目标蛋白在~140kD处。检测结果显示:MAB1有效地增加了LDLR的表达水平,并呈现剂量依赖的关系;并且有效地拮抗抗原PCSK9-His对LDLR的负性调节作用。
实施例5:MAB1对体内低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)浓度的影响
1.MAB1对小鼠血清LDL-C浓度的影响
为检测MAB1对小鼠血清LDL-C浓度的影响,取实验小鼠分为3组:生理盐水组(n=8),MAB1静脉注射组(MAB1iv组,n=6),MAB1皮下注射组(MAB1sc组,n=3)。静脉注射给药,给药剂量为10mg/kg。皮下注射给药,给药剂量为20mg/kg。分别在药前、给药3d、6d、9d、12d、18d后眼眶采血150μl,4500rpm离心10min分离血清,分别在给药3d、6d、9d、12d、18d测定血清中低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)含量。测定所用设备为迈瑞BS-180全自动生化分析仪,LDL-C测定试剂盒均自深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司。
结果显示,抗PCSK9抗体MAB1皮下注射给药3天后能够明显降低BALB/c小鼠血清LDL-C的含量,静脉注射和皮下注射6和9天后能够明显降低BALB/c小鼠血清LDL-C的含量(图10)。
2.MAB1对猴血清LDL-C浓度的影响
为检测MAB1对猴血清LDL-C浓度的影响,将4只雄性健康食蟹猴分为2组:MAB13mg/kg组(n=2)和MAB118mg/kg组(n=2),皮下注射给药,以药前血脂水平为正常对照。分别在药前、给药30min、5h、1d、5d、7d、9d、11d、13d、15d、17d、19d、21d采血,3000rpm离心10min分离血清,测定血清中LDL-C含量。测定所用设备为迈瑞BS-180全自动生化分析仪,LDL-C测定试剂盒均购自深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司。
结果显示,抗PCSK9抗体MAB1的剂量分别为3mg/kg和18mg/kg均能够明显降低食蟹猴血清LDL-C的含量,18mg/kg给药剂量的药效维持时间更长,达17天(图11)。
实施例6:MAB1对体内甘油三酯(TG)浓度的影响
检测MAB1对猴血清TG浓度的影响。
将4只雄性健康食蟹猴分为2组:MAB13mg/kg组(n=2)和MAB118mg/kg组,皮下注射给药,以药前血脂水平为正常对照。分别在药前、给药30min、5h、1d、5d、7d、9d、11d、13d、15d、17d、19d、21d采血,3000rpm离心10min分离血清,测定血清中TG含量。测定所用设备为迈瑞BS-180全自动生化分析仪,TG测定试剂盒均购自深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司。
结果显示,抗PCSK9抗体MAB1的剂量为18mg/kg时能够明显降低食蟹猴血清TG的含量,药效维持时间可达13天(图12)。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述,本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导,可以对那些细节进行各种修改和替换,这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。