CN102936288A - 促红细胞生成素模拟肽融合蛋白及突变体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及人红细胞缺乏症如贫血等疾病的治疗药物。具体的,本发明提供一种用于治疗人各种类型贫血的融合蛋白及其制备方法和应用。所述融合蛋白含有促红细胞生成素模拟肽(EMP-1)和人IgG2-Fc(铰链区-CH2-CH3)或IgG2-Fc突变体(T250Q/M428L;T307Q/N434A;N434S),能有效改善贫血患者的生存状况,同时增加EMP-1体内的半衰期,尤其是EMP-1与IgG-Fc(T250Q/M428L;T307Q/N434A;N434S)突变体融合蛋白,增强与FcRn亲和力,进一步增加EMP-1的体内半衰期。通过体内和体外的活性试验证实本发明的融合蛋白及突变体具有较好的生物活性。
Description
技术领域
本发明涉及人红细胞缺乏症如贫血等疾病的治疗药物。具体的,本发明提供一种用于治疗人各种类型贫血的融合蛋白及其制备方法和应用。所述融合蛋白含有促红细胞生成素模拟肽(EMP-1)和人IgG2-Fc(铰链区-CH2-CH3)或IgG2-Fc突变体(T250Q/M428L;T307Q/N434A;N434S),能有效改善贫血患者的生存状况,同时增加EMP-1体内的半衰期,尤其是EMP-1与IgG-Fc(T250Q/M428L;T307Q/N434A;N434S)突变体融合蛋白,增强与FcRn亲和力,进一步增加EMP-1的体内半衰期。
背景技术
促红细胞生成素(EPO)是由165个氨基酸和4个糖链组成的糖蛋白激素,通过特异结合红血球前体细胞表面上的特异性的受体,发挥红细胞生成的主要调节剂作用。此过程能够发出它们增殖和向成熟的红细胞分化的信号。促红细胞生成素受体是对促红细胞生成素具有高亲和力的484-氨基酸糖蛋白(Anna-Leena Sirén等,Acta Neuropathologica,1996(101),271-276)。对于促红细胞生成素受体来说,配体诱发的同二聚体化作用是控制活化的关键因素。
健康的哺乳动物体内血浆中EPO的浓度非常低,正常情况下现有循环数目的红细胞足以满足组织对养料的需求。EPO的存在会刺激新的红细胞的生成,以替代在老化过程中损失的那些红细胞(Iain C Macdouga1l等人,Kidney Internationa1,1996(50),1694-1699)。但是,某些疾病状态经常出现异常的红细胞生成。在许多国家,使用重组人EPO(rHuEPO)治疗红细胞减少的各类贫血性疾病。美国食品和药品管理局(U.S.Food and Drug Administration;FDA)已经批准了重组人EPO在治疗末期肾病有关的贫血中的用途。接受血液透析来治疗肾病相关贫血患者一般患有严重的贫血,后者作为透析治疗的结果,由红细胞的破裂和过早死亡造成。EPO也用于治疗其它类型的贫血。例如,可以用EPO治疗化疗诱发的贫血、与脊髓发育不良有关的贫血、与各种先天性障碍有关的贫血、AIDS-有关的贫血和早熟-有关的贫血。另外,EPO可以在其它的领域起作用,例如在骨髓移植患者、准备自体输血的患者和患有铁过载障碍的患者中帮助更迅速地恢复正常的血细胞比容。
促红细胞生成素具有相对较短的半衰期。在患有慢性肾功能衰竭(CRF)的患者中,体内半衰期大约为3~4小时。在治疗剂量范围内,可检测水平的血浆促红细胞生成素能维持至少24小时。皮下施用促红细胞生成素后,在5~24小时内达到峰值血清水平,此后缓慢下降。因此,需要提供改善的和/或修饰形式的EPO治疗蛋白,其能克服这些问题和本领域已知的其它问题。
促红细胞生成素(EPO)是调控红细胞生长的红细胞特异生长因子,EPO受体(EPOR)属于造血生长因子受体超家族成员,这一家族缺乏胞内激酶活性。寻找EPO受体肽配体的研究最初与IL-1R相同,将可溶性受体蛋白固定于抗体基质上,通过筛选随机的噬菌体展示肽文库对促红细胞生成素受体的亲和力,几个研究组鉴别出了促红细胞生成素的小肽模仿物(Peptidomimetics)。得到单一的环八肽序列RIGPITWC,可竞争EPO与EPO受体的结合,IC50为10μmol/L。以此作为前导肽构建限制性文库,筛选得到与ERO受体特异结合的肽配体,这些肽含有高度保守的核心序列GPLTW和成对的半胱氨酸;另外,在二硫桥外还发现有一高度保守的Y残基,此Y残基在短肽活化受体时有很重要的作用。化学合成一组与核心序列最为匹配的肽,它们能够与EPO竞争结合EPO受体,其IC50为0.2~1μmol/L,活性提高了10~50倍。这些序列与促红细胞生成素没有同源性。在功能测定中,这些肽中的几种表现出了活性,但仅是重组促红细胞生成素的活性的1/100,000。尽管已经通过制备肽模仿物的共价二聚体或多聚体,进行了提高这些肽的效力的几种尝试,但在摩尔基础上,这些化合物仍然是促红细胞生成素的活性的1/10,000~1/1,000,且具有非常短的半衰期,这使得它们不适用作治疗剂(US patent7393662完全引述作为参考)。
FDGR-1是IL-3依赖的鼠髓源单核细胞系,有完整的造血生长因子信号传导通路,用转染人全长EPO受体的FDGR-1细胞(YDGR-1hEPOR)评价对结合肽的生物学活性。单独用肽刺激FDGR-1hEPOR显示有与EPO同样的增殖效应;蛋白酪氨酸磷酸化和细胞周期动力学检测发现此类肽与EPO的效应相同。结果表明,用噬菌体肽库筛选得到了具有EPO激动剂效应的肽配体GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG,被命名为“EPO模拟肽(EMP1)”具有较高的EPO受体激动活性(US19960641071完全引述作为参考)。
通过EMP1人们得到了高质量的EPO受体的晶体结构,为EPO和EPO受体的结构与功能关系提供了重要信息,X射线衍射分析表明,EMP1可以二聚化,并导致EPO受体二聚化。通过Lys-β-Ala二肽桥可以形成EMP1的对称二聚体,在探讨肽二聚体的生物学活性时,发现正确形成二硫键的EMP1二聚体有更为明显的细胞增殖效应,其EC50值为2nmol/L,比单分子(EC50值为200nmol/L)提高了100倍;体内实验也说明二聚体分子的活性有所增强。鼠缺氧红细胞增多生物检测实验表明,双体比单体的活性高出100倍;采用聚乙二醇(PEG)进行EMP1的N端二聚化则可使其作为激动剂的体内外活性提高10~1000倍(Kathryn W.Woodburn等人,Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology.104,155~163)。
人EMP1具有短的体内半衰期。在小鼠中,人EMP1的半衰期为1~2小时。在开发红细胞缺乏类疾病如贫血等的治疗药物中,用作治疗的EMP-1多肽,可能需要延长在体内的半衰期。具有延长半衰期的EMP-1多肽可允许较低频率给予患者药物注射。因此,如何在不影响EMP-1生物活性的同时增加在体内的半衰期,是众多科学家研究的焦点。如US patent2004/028976或US patent2007/0275871中描述的EMP-1融合IgG-Fc,能明显的增强其在体内的半衰期。半衰期延长是由于Fc与FcRn的结合,使IgG获得了保护,同时增加在体内的循环时间,已经在美国进入I期临床研究(P.J.Bugelski等人,Journal of Biotechnology.2008(134)171-180)。此外,Affymax和百时美施贵宝公司联合开发的聚乙二醇化的EMP1(商品名Hematide)已经顺利进入美国的III期临床研究(Kathryn W.Woodburn等人,Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology.104,155-163)。这使得人们进行更多努力以研究基于EMP1肽在体内功效稳定且长效药物。
IgG-Fc是被广泛使用的延长肽类、细胞因子和可溶性受体类药物体内半衰期的融合蛋白,例如Enbrel和Aflibercept。在IgG中,位于Fc上CH2和CH3域之间的位点介导与新生受体FcRn的相互作用,其中结合可以让来自内体的内吞抗体再循环到血流中(Raghavan et al.,1996,Annu Rev Cell Dev Biol.12:181-220;Ghetie et al,2000,Annu Rev Immunol.18:739-766)。上述过程结合大分子减少肾脏滤过作用,产生1~3周的体内血清半衰期。Fc与FcRn的结合在抗体转运中也起关键作用。Fc上结合FcRn的位点也是细菌蛋白A和G结合的位点。与这些蛋白的紧密结合通常可以用作蛋白纯化,使用蛋白A或蛋白G亲和色谱法纯化抗体Fc的方式。因此,FcRn受体也负责将与其结合的Fc融合蛋白转移到新生儿的肠道和成年人的肠上皮腔中(Ghetie andWard,Annu.Rev.Immunol.,2000,18:739-766;Yoshida et al.,Immunity,2004,20(6):769-783)。
人Fcγ的突变研究过程中,已经对结合FcRn重要的一些残基进行了研究,结果表明他们能明显的增加血清半衰期。Hinton等在人Fcγ1中逐一地将三个残基突变成了另外19种常见的氨基酸。他们发现一些双重点突变体增加了FcRn结合亲和力,其中T250Q/M428L位点的双突变能显著提高Fc与FcRn的亲和力效果,进而明显提高在体内的半衰期。另外,HenryB.Lowman等通过突变IgG-Fc的T307Q/N434A以及N434S位点,同样能明显的增强体内血清半衰期。这些实验都通过猴的体内药物代谢实验得到了证实。另外,还可以增加融合蛋白或抗体的跨细胞作用(Transcytosis)和组织的通透性,增加体内组织系统对药物的暴露,最大程度的发挥药效(Hinton et al.,2004,J.Biol.Chem.279(8):6213-6216;Henry B.Lowman et al.,Cancer Research.70(8):3269-3277)。
发明内容
本发明涉及预防和治疗红细胞缺乏类疾病如贫血的融合蛋白以及生产方法和应用。本发明的组合物包含新的EMP1融合蛋白及其突变体。该融合蛋白含有与IgG重链恒定(Fc)区融合的EMP1分子或者其类似物或片段。该IgG为人源的,可以选自IgG1、IgG2或IgG4。本发明的融合蛋白在本发明中被称为EMP1/IgG-Fc或EMP1/IgG-Fc(T250Q/M428L;QL)或EMP1/IgG-Fc(T307Q/N434A;QA)突变体。
在本发明的其他方面,该融合蛋白的突变体为EMP1/IgG-Fc(QL)或EMP1/IgG-Fc(QA)等,含有IgG-Fc的T250Q,M428L,T307Q或N434A突变位点中的任意一个或者多个突变组合以及EMP1的突变体。
本发明的融合蛋白及其突变体在受试者中对各类红细胞缺乏类疾病如贫血的治疗有效。同样地,本发明提供了用于治疗受试者红细胞缺乏类疾病如贫血的方法,其中如果需要给受试者使用所述的融合蛋白及其突变体。
本发明还提供了使用哺乳动物表达和细菌培养系统,制备本发明的EMP1/IgG-Fc及突变体融合蛋白的新方法。在这两种系统中,培养细胞克隆以制备包括EMP1/IgG-Fc及突变体融合蛋白以及有效延长体内半衰期的突变体型,例如但不限于EMP1/IgG-Fc(QL),EMP1/IgG-Fc(N434S)和EMP1/IgG-Fc(QA)。增强FcRn受体的结合,延长体内血清滞留时间。
本发明的二价EMP1/IgG-Fc及其突变体融合蛋白具有独特的特点:
1.增加了EMP1的体内循环半衰期t1/2,尤其是EMP1/IgG-Fc(QL),EMP1/IgG-Fc(N434S)或EMP1/IgG-Fc(QA)能明显的进一步增加了EMP1在体内的半衰期;
2.增强EMP1的体内和体外的活性及稳定性;
3.提高与FcRn的亲和力,增强EMP1体内组织系统的穿透性和跨细胞作用,提高药物的效果,减少药物的注射频次,减轻患者的疼痛和降低治疗成本;
4.通过生物工程方法生产,有利于获得生物活性更高的蛋白。用于大规模制备的简便的一步ProteinA提纯。可以将本发明的融合蛋白按需要以多种形式提供给受试者。
本发明的一方面提供了一种用于受试者提高红细胞数量的EMP1融合蛋白。
本发明的一方面提供了一种用于控制受试者贫血的EMP1融合蛋白。
本发明的一方面提供了一种异源性融合蛋白,该融合蛋白含有与IgG多肽融合的EMP1多肽或其变异体,其中所述的IgG为人IgG2。
根据本发明的一方面,所述IgG-Fc是人IgG1、IgG2或IgG4,及上述的突变体。
根据本发明的一方面,所述IgG-Fc是人源IgG1-Fc、IgG2-Fc或IgG4-Fc的杂合体。
根据本发明的一方面,所述EMP1多肽选自由EMP1(SEQ ID No.1)及其片段和突变体组成的组。
根据本发明的一方面,所述EMP1为SEQ ID No.1。
根据本发明的一方面,所述药用组合物用于受治疗者的红细胞缺乏疾病的治疗,所述组合物含有包含与IgG多肽融合的EMP1多肽或者其衍生物或活性片段的异源性融合蛋白。
本发明一方面提供了所述异源性融合蛋白用于治疗或预防红细胞缺乏类疾病如贫血等的治疗用途。
根据本发明的一方面,所述IgG选自由人IgG1、IgG2和IgG4组成的组。
本发明的其他特点和优越性可通过以下详细的描述体现。但是,应该理解的是,仅以示例的方式给出详细描述和具体实施例以表明本发明的实施方案,这是因为对于本领域熟练技术人员从所述的详细描述中在本发明的实质和范围内多种改变和改良是显而易见的。
附图说明
图1:构建编码EMP1/IgG-Fc及其突变体的表达质粒。图1A显示运用PCR技术,分别将EMP1和IgG-Fc的序列从各自的模板中扩增,接下来以上述的PCR产物为模板,用引物1和4扩增出EMP1/IgG-Fc序列。然后,将编码EMP1/IgG-Fc融合蛋白的cDNA连接到表达载体pcDNA3.1的BmHI和EcoRV位点之间。利用核苷酸位点定向突变方法,产生编码EMP1/IgG-Fc融合蛋白的cDNA,使用与上述相同的方法将EMP1/IgG-Fc,EMP1/IgG-Fc(QL)或EMP1/IgG-Fc(QA)克隆入pcDNA3.1表达载体。1B中显示由活性EMP1分子和包含人IgG2重链恒定区(铰链、CH2和CH3部分)的IgG-Fc组成的EMP1/IgG-Fc融合蛋白的图示。这些蛋白质表达时均以同型二聚体的形式分泌,形成如图所示的空间结构。
图2:EMP1/IgG-Fc融合蛋白及其突变体在CHO-S细胞中的表达和检测。用编码IgG-Fc、EMP1/IgG-Fc、EMP1/IgG-Fc(N434S)、EMP1/IgG-Fc(QL)或EMP1/IgG-Fc(QA)等蛋白的质粒载体融合转染CHO-S细胞,转染48h后吸取上清液,用A蛋白琼脂糖凝股纯化融合蛋白。分别进行还原(reduced)和非还原(Non-reduced)的SDS-PAGE分析,用考马斯亮蓝(Comasie Blue)染色。然后,将SDS-PAGE胶转移到醋酸纤维素膜上,进行Western blot分析。上述膜用抗小鼠抗体(1∶5000)探测,并用ECL显影。结果显示EMP1/IgG-Fc及其突变体约为64KDa的同源二聚体,与理论分子量一致。其中,泳道1、2、3、4分别是EMP1/IgG-Fc、EMP1/IgG-Fc(QL)、EMP1/IgG-Fc(N434S)或EMP1/IgG-Fc(QA)非还原状态的SDS-PAGE。泳道5、6、7、8为EMP1/IgG-Fc、EMP1/IgG-Fc(QL)、EMP1/IgG-Fc(N434S)或EMP1/IgG-Fc(QA)融合蛋白的非还原状态SDS-PAGE分析。
图3:融合蛋白Western blot检测结果。取小规模提取的溶于SDS上样缓冲液的融合蛋白30μ1经10%SDS-PAGE凝胶电泳分离后转移至醋酸纤维素膜,并用抗鼠抗体(1∶5000,Amersham-Pharmacia)探测,用ECL显影。泳道1~5依次为EMP1/IgG-Fc、EMP1/IgG-Fc(QL)、EMP1/IgG-Fc(QA)、EMP1/IgG-Fc(N434S)蛋白的分子量约为64kDa。
图4:A表明Aranesp(darbepoetin-α)和EMP1-Fc及其突变体融合蛋白处理UT-7EPO细胞后的生物活性。Aranesp显示出明显低于EMP1-Fc融合蛋白突变体的生物活性。B表明注射EMP1-Fc融合蛋白及其突变体后体内的血清浓度与时间的曲线。这些数据用来估计表1中的药代动力学参数。
图5:显示Aranesp和EMP1-Fc及其突变体融合蛋白对于RTC,RBC和Hgb影响的剂量效应曲线,每组的样本量为n=6。
具体实施方式
在一个实施方案中,本发明的组合物和方法延长了EMP1/IgG-Fc的循环半衰期,增强了其功效。这是通过IgG-Fc突变体增强与FcRn的亲和力进一步增加体内半衰期。本发明的IgG是人源的,可以选自IgG1、IgG2和IgG4。EMP1多肽可以是本身序列或衍生物的片段。EMP1多肽可以是SEQ ID No.1的氨基酸序列。
在另一个实施方案中,本发明的融合蛋白含有EMP1多肽、EMP1片段或和IgG-Fc,IgG-Fc(T250Q/M428L)和/或IgG-Fc(T307Q/N434A)和/或IgG-Fc(N434S)突变体片段。
本发明还提供了编码本发明的可分泌的融合蛋白的载体,所述融合蛋白包括但不局限于:活性EMP1和人IgG1/IgG2/IgG4-Fc氨基酸序列,用于哺乳动物表达二价的EMP1多肽;以及活性的EMP1/IgG-Fc(QL),EMP1/IgG-Fc(N434S)和EMP1/IgG-Fc(QA)氨基酸序列。本领域技术人员可以在如同在本文实施例中描述的载体中或是以相同的方法容易地制备任何所需的EMP1序列。体外细胞系研究结合昆明小鼠体内肌肉注射融合蛋白,研究网织红细胞、红细胞和血红蛋白的变化情况,证明重组的人类EMP1融合蛋白EMP1/IgG-Fc,EMP1/IgG-Fc(N434S),EMP1/IgG-Fc(QL)和EMP1/IgG-Fc(QA)的生物学特性以及有效性。这种治疗方法在严重的红细胞缺乏症如贫血等疾病模型中证明有效。总之,本发明为用蛋白质预防和治疗红细胞缺乏症如贫血提供了一种新的方法。
融合蛋白的构建是融合EMP1和IgG-Fc突变体组成一种新的分子,该分子能促进EMP1的功效并结合有IgG-Fc的优点,即增加EMP1的体内生物活性,并且增加在体内的半衰期。同样,EMP1及其突变体与IgG-Fc(T250Q/M428L)或IgG-Fc(T307Q/N434A)形成的新分子,其具有所述的促进EMP1功效和IgG-Fc(T250Q/M428L;T307Q/N434A)分子的优点,增强Fc与FcRn的亲和力,进一步增加体内的半衰期。
本发明的融合蛋白作为药物应用于人类或动物可以通过多种途径,并不局限于局部施用,如口服、喷雾、气管内灌输、腹膜内注射、静脉注射、肌肉注射和基因疗法。施用剂量取决于患者需要,期望取得的效果和施用途径。例如人类的施用量可以为2nmol/kg体重或是0.02~100nmol/kg体重。
本发明适用于任何需要此类治疗的个体。这些个体有可能发展成各类贫血、或新近诊断为贫血的患者或是已经诊断为贫血的患者。本发明的适应症主要包括但不限于如下种类疾病:1.肾性贫血,2.爱滋病患者贫血,3.癌症相关贫血。本发明所涉及融合蛋白也可用于预防癌症化疗,尤其是顺铂类抗肿瘤药物所致贫血。
除上述适应症外,本发明所涉及的融合蛋白还可用于如下类疾病的治疗:1.自体供血,可加快术前血液收集、储存更多的输血单位,从而提高患者自身的供血能力并减少血容量的降低。2.术后贫血,3.骨髓移植。此外,本发明所涉及的融合蛋白也可以用于再生障碍性贫血、类风湿关节炎患者贫血、骨髓增生异常综合征患者贫血和镰状红胞性贫血或β-地中海型贫血的治疗。
本发明提供了一种基于EMP1突变体与IgG-Fc突变体的优化组合的融合蛋白,通过这种优化的突变组合获得明显提高蛋白的体内和体外的活性,显著提高体内的半衰期的融合蛋白,这些融合蛋白能够增强药物的体内组织和细胞穿透能力,增强药效。
本发明还提供了新的编码融合蛋白的质粒,该融合蛋白编码含有通过应用重叠PCR(聚合酶链反应)得到的人EMP1和人IgG-Fc(图1)。图例显示IgG-Fc区域含有IgG2恒定重链(包括铰链、CH2和CH3)。
本发明还提供了可产生先导序列并导入载体使融合蛋白可以表达后分泌到细胞外培养液环境中去的方法。如图显示,一段人IgG2重链信号肽序列与EMP1序列融合引导合成的多肽分泌到培养液中。在本发明的实施例中,一段人IgG2重链信号肽序列(MEFGLSWLFLVAILKGVQC)与EMP1及IgG-Fc序列融合引导合成的多肽分泌到培养液中。每一个实施例中,这一战略保证了在分泌过程中在切除分泌先导肽之后将使产生的EMP1与IgG-Fc融合蛋白N端的活性组氨酸残基融合。有代表性的EMP1/IgG-Fc见图2。这种方法能达到:
1.由于Fc融合蛋白以均一的二聚体的形式分泌,EMP1-Fc融合蛋白体内半衰期长,且结构稳定,其较高的FcRn配体亲和性从而使融合蛋白具有更高的效价。
2.由于大量的胰岛素受体在细胞表面以二聚体的前体形式存在,因而增强了多肽的药效。
3.简化了纯化过程。利用ProteinA凝胶可以一步完成提纯,利于融合蛋白的分离纯化。
用Western免疫印迹法和抗鼠抗体还分析了转染的中国仓鼠卵巢细胞CHO-S细胞裂解物和细胞培养液以确定融合蛋白在翻译水平上的表达。如图3中所示,在培养液和细胞裂解物检测Fc融合蛋白。可以通过Western免疫印迹法来检测融合蛋白。在条件培养液和细胞裂解物中同时检测融合蛋白表明融合蛋白已经在哺乳动物细胞中合成并分泌。CHO-S细胞系分别瞬时转染了递增量的EMP1/IgG-Fc质粒和EMP1-Fc-only质粒,转染后48h收集细胞培养液。从50m1培养液(接种浓度约1.25×105个细胞/ml,静止培养2天)利用Protein A凝胶一步纯化融合蛋白(Jungbauer等人,J Chromatogr.1989;46:257-268)得到约300μg融合蛋白。样品再分别经还原和非还原的2种凝胶电泳分离并经考马斯亮兰染色分别检测到了一个约32KDa或约64KDa的条带(图2),表明二聚体EMP1/IgG-Fc融合蛋白以天然状态存在。
在一个实施方案中,显示的是EMP1/IgG-Fc,EMP1/IgG-Fc(N434S),EMP1/IgG-Fc(QL)和EMP1/IgG-Fc(QA)在预防和治疗红细胞减少疾病如贫血中有效,用于实施例中,UT-7EPO细胞作为融合蛋白体外活性检测的细胞系。本发明对人的EMP1/IgG-Fc进行改造,与IgG2-Fc通过一段柔性短肽连接,构建融合蛋白EMP1/IgG-Fc及其突变体,使其具有EMP1的疗效又有Fc的特性,获得一种具有稳定、持续促进红细胞分裂作用的新型蛋白药物。更重要的是增强了与FcRn的亲和力,进一步提高了其在体内的半衰期。在UT-7EPO细胞模型中,对经纯化后的重组蛋白进行了生物活性鉴定;并在昆明鼠模型中对融合蛋白进行了药效分析。
通过体外注射治疗途径施用EMP1/IgG-Fc及其突变体的在预防和治疗红细胞缺乏类疾病如贫血中有效。编码本发明的任意融合蛋白例如EMP1/IgG-Fc,EMP1/IgG-Fc(N434S),EMP1/IgG-Fc(QL)和EMP1/IgG-Fc(QA)分子用于治疗是有效的。通过对昆明小鼠注射施用上述的融合蛋白。所有的受试鼠中,在第一次注射融合蛋白后,分别监控受试鼠网织红细胞、红细胞和血红蛋白的进展情况。如上所示,同时通过融合蛋白治疗途径用EMP1/IgG-Fc突变体处理的年龄匹配的昆明鼠在10天显示出网织红细胞数量达到最高峰,同时红细胞和血红蛋白的数量随后都有明显增加,而对照组小鼠的网织红细胞、红细胞和血红蛋白水平则处于较低水平(图4)。这些结果表明用EMP1/IgG-Fc的治疗可以有效增加网织红细胞、红细胞和血红蛋白的数量,并有效缓解贫血症状。
基于IgG-Fc的药物有许多优点。因为融合蛋白能够形成64KDa的二聚体的形式,并不会被肾脏在短时间内清除,因此具有实质上更长的半衰期(Larrick and Fry,Hum AntibodiesHybridomas.1991;2(4):172-189;Weir等人,Biochem Soc Trans.2002;30(4):512-516)。因此,大的EMP1/IgG-Fc同型二聚体融合蛋白较天然EMP1半衰期增长。由于一些酶更容易降解较小的多肽(Hupe-Sodmann等人,Regul Pept.1995;58(3).149-156),而分子量较大的EMP1/IgG-Fc不容易被降解。而且EMP1/IgG-Fc二聚体可以增加配体的亲和性,通过预先形成的胰岛素受体二聚体及多聚体(George等人,Nat Rev Drug Discov.2002;(10):808-820;Dupuis等人,BrainRes Mol Brain Res.1999;67(1):107-123)增强细胞内信号传导,因此以同型二聚体形式存在的EMP1-融合蛋白有更多潜力,结合更多的EMP1受体。
总之,本发明是EMP1与IgG-Fc及其突变体(QA/QL)融合形成EMP1/IgG-Fc突变体以增加半衰期、增强在体内活性并减少免疫原性EMP1/IgG-Fc融合蛋白以天然二价的形式存在。在本发明的一个实施方案中,EMP1/IgG-Fc融合蛋白可以直接通过注射施用。用鼠模型体内试验表明,可以通过融合蛋白的注射施用,这种方法可以有效增加体内的网织红细胞、红细胞和血红蛋白的数量,并能较长时间的维持红细胞数量的正常水平;在UT-7EPO细胞系模型证明融合蛋白具有非常高的激活EPO受体的活性。同时,通过鼠的药物代谢实验进一步证实EMP1/IgG-Fc(QL),EMP1/IgG-Fc(N434S)和EMP1/IgG-Fc(QA)比EMP1/IgG-Fc具有更长的体内半衰期。
上述公开的内容对本发明进行了大体的描述。通过参考下列具体实施例对本发明做更全面的理解。这些实施例仅仅是为了进一步的说明,而不是为了限定本发明的范围。换言之,一些形式上的变异或替换是用作达意的考量。因此,在下文例引用的一些特殊的术语旨在达意,而非限制其意的目的。
实施例
实施例1:载体的构建
使用重叠PCR(overlap PCR)构建了含有EMP1和IgG2-Fc及突变体的编码融合蛋白的载体。IgG2-Fc区含有IgG2恒定重链(铰链-CH2-CH3部分)。将人IgG2重链信号肽序列与EMP1-Fc序列融合以便引导合成的融合蛋白分泌到培养液中。编码EMP1/hIgG-Fc融合蛋白的cDNA是化学合成的,并将其连接到编码人IgG2-Fc(铰链、CH2和CH3)的PCR扩增的产物上,然后插入pcDNA3.1(Invitrogen)载体的EcoRV和BamHI位点间构建EMP1/hIgG-Fc-pcDNA3.1载体。可分泌的EMP1/hIgG-Fc及其突变体融合蛋白含有IgG2恒定重链(铰链-CH2-CH3)。人IgG2重链信号肽与EMP1序列融合引导合成的蛋白分泌到细胞培养液中。图2显示分泌的EMP1/IgG-Fc融合蛋白的图示。其特点是:
1.解决了EMP1半衰期短的问题,因为融合蛋白是以同型二聚体的形式分泌的,在体内具有长的半衰期并由于配体的高度亲和性而达到了高效价(Ozmen等人,J Immunol.1993,150(7):2698-2705;Kurschner等人,J Immunol.1992;149(12):4096-4100;Kurschner等,J Biol Chem.1992;267(13):9354-9360)。
2.基于FcRn亲和力的突变改造,能够进一步的增加EMP1在体内的半衰期,同时增强药物在体内组织和细胞的穿透能力,增强药物的效果;
3.由于大多数EMP1受体是在细胞表面预先形成二聚体(Oded Livnah等人,Science,1996(273)464-471)因而多肽与其受体的结合将更为有效;
4.提高EMP1蛋白的体内活性;
使用基因特异性引物和重叠PCR从EMP1(化学合成,Shenggong company,Shanghai)cDNA和IgG质粒扩增全长EMP1和IgG-Fc cDNA。对于第一轮重叠PCR,使用5'-GGATCCATGGAGTTCGGCCTGAGCTGGCTGTTCCT-3’和5'-ATTTGCGCTCGGATCCGCCGCCGCCGGATCCGCCGCCGCCGGATCCGCCGCCGCCGCCGCCCTGG-3’;5'-CCAGGGCGGCGGCGGCGGCGGATCCGGCGGCGGCGGATCCGGCGGCGGCGGATCCGAGCGCAAAT-3’和5'-GATATCTTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTCTTCT-3’。在第二轮重叠PCR中使用PCR及产物制备备用EMP1/IgG2-Fc cDNA。将扩增的产物亚克隆到载体Bam HI和Eco RV位点,使用5’-GGATCCATGGAGTTCGGCCTGAGCTGGCTGTTCCT-3’和5'-GATATCTTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTCTTCT-3’引物。
为构建编码EMP1-IgG-Fc的对照载体,使用5'-GGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAG-3’和5'-TGATGTGGGTCTTCTCGGACTCGGACTCGGACCC GTTC-3’,通过PCR单独扩增IgG cDNA并克隆到载体Bam HI和Eco RV位点。用于编码人IgG2-Fc(铰链-CH2-CH3)的cDNA片段的PCR扩增的引物为:5'-GGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAG-3’和5'-TGATGTGGGTCTTCTCGGACTCGGACTCGGACCCGTTCCCTAAG-3’。载体含有CMV直接-早期(immediate-early)增强子和启动子、单一真核生物转录单元。嘌呤尾和转录终止序列。为使EMP1序列分泌,通过PCR于其5’端引入鼠IgK-链信号肽序列。为在细菌中表达EMP1/IgG-Fc融合蛋白,融合cDNA序列通过PCR扩增并亚克隆至pET32a载体(Novagen,EMDBioscience,San Diego,CA)。IgG-Fc(QL)和EMP1/IgG-Fc(QA)表达质粒的构建方法同上,T250Q/M428L和T307Q/N434A突变位点另外设计两对PCR引物,进行重叠PCR反应,最后获得EMP1/IgG-Fc(QL)、EMP1/IgG-Fc(N434S)和EMP1/IgG-Fc(QA)表达质粒(图1)。上述融合蛋白所使用的连接肽均为SEQ ID No.5。
实施例2:EMP1/IgG-Fc及其突变体融合蛋白的CHO表达
将EMP1/IgG-Fc或IgG-Fc的cDNA通过脂质体(Lipofectamine)2000(Invitrogen,Carlsbad,CA)转染到CHO-S细胞中。其过程是先将密度为每孔2.5×105个的CHO-S细胞生长在6孔细胞培养板。添加含有4μg EMP1/IgG-Fc cDNA和10μl转染脂质体的无血清无抗菌素的DMEM(Invitrogen)进行培养。转染6h后,转换为全培养液。转染后48h分别收集培养液和细胞。为了大规模地表达EMP1/IgG-Fc融合蛋白,将生长在150mm培养皿内的CHO-S细胞用阳离子转染试剂、聚乙酰亚胺(Poly-ethyleneimine;PEI,25kDa)和80μg相关cDNA转染。用150mM Nacl分别稀释DNA和PEI,混合后培养20min。然后将DNA/PEI复合物加到细胞中,并在无血清无抗菌素的培养液中培养6h。以加有10%FBS和P/S的DMEM替换培养液。
为建立稳定表达EMP1/IgG-Fc的CHO-S细胞,将在6孔细胞培养板(2.5×105个细胞/孔)上生长的细胞用4μg线性化的EMP1/IgG-Fc或IgG-Fc转染。转染24h后,细胞在含有G418(500μg/ml)的DMEM培养液分裂和培养,以筛选那些已经将重组质粒稳定整合到其基因组内的细胞。培养过程中,每3天换培养液一次直至细胞克隆形成。分离单克隆细胞并扩展成稳定的细胞系并将这些细胞系在24孔板上生长的组织培养的上清液用人EMP1试剂盒检测融合蛋白,选择能分泌融合蛋白的细胞用作以后的特性分析。
实施例3:从哺乳动物细胞培养液中纯化融合蛋白
应用A蛋白葡聚糖凝胶柱可以进行中规模的蛋白纯化。50ml的柱体积可以纯化15cm培养皿中生长的转染EMP1/1gG-Fc及其突变体融合载体的CHO-S细胞的条件培养液。收集细胞转染后48h的50ml DMEM培养液,或是收集稳定表达融合蛋白的细胞,将其加入A蛋白葡聚糖凝胶1mL满体积(Amersham-Pharmacia)。加入1%Triton X-100在4℃下培养过夜。然后用含1%TritonX-100的PBS缓冲液洗涤,然后用150mM Nacl洗涤,最后用1mM Nacl氨基乙酸(pH2.7)将蛋白从树脂上洗脱。洗脱液立即用Tris缓冲液(pH9.0)中和并且纯化的蛋白用PD-10凝胶柱除盐(Amersham-Pharmacia)并用PBS洗脱。如图中所见(图2),两步洗脱方法可以将大部分融合蛋白由葡聚糖凝胶柱上洗脱下来。样品的组分经SDS-PAGE溶解并经考马斯亮兰染色显影以评估产率和纯化率,结果显示每ml培养液接种1.25×105细胞培养2d后,融合蛋白得率约为10μg/ml。
实施例4:融合蛋白的细菌表达
在大肠杆菌细胞中表达EMP1/IgG-Fc及其突变体融合蛋白。为了补偿大肠杆菌BL21细胞的密码子偏倚(Codon bias),使用了可以促进二硫键形成并可额外搭载质粒以表达7个罕见的tRNAs的Rosetta gami2细胞(Merck,Germany)用EMP1/IgG-Fc/pET32a,EMP1/IgG-Fc(N434S),EMP1/IgG-Fc(QL)pET32a,EMP1/IgG-Fc(QA)pET32a或IgG-Fc/pET32a载体(Novagen)转化细菌后,选择并筛选出其中几个克隆以最佳表达融合蛋白。蛋白质的表达是将单一克隆培养在有卡那霉素的50ml的2×YT培养液中于37℃过夜培养。而后将培养液稀释成(1:50)新培养液,直至细胞密度达到OD600读数值0.6后,再在培养液中添加1mM的IPTG(EMD)3h以诱导表达。收集细菌并将菌球(Pallet)保存以进行其他步骤。
蛋白质的提取是将离心后的细菌重新悬浮在冰浴的含有蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Sigma,St.Louis,MO)的PBS缓冲液后用超声波裂解细胞。添加1%TritonX-100以溶解蛋白,30min后离心(12000g,10min)收集含有融合蛋白的上清液。表达的融合蛋白通过A蛋白葡聚糖凝胶纯化并通过SDS-PAGE和考马斯亮兰染色分析验证。从4L的细菌培养液中可以提纯约120μg的EMP1/IgG-Fc和Fc-only融合蛋白。
实施例5:SDS-PAGE和/或免疫印迹法检测融合蛋白
对表达的融合蛋白进行翻译水平上的检测。用Western免疫印记法和抗鼠抗体检测了转染的CHO-S细胞裂解物和细胞培养液以确定融合蛋白在翻译水平上的表达。如图3中所示,同时在培养液和细胞裂解物中检测到Fc融合蛋白。融合蛋白的电泳迁移位置大约在32kDa,是在还原的SDS-PAGE条件下融合蛋白单体的分子量。取小规模提取的溶于SDS上样缓冲液的融合蛋白30μl经10%SDS-PAGE凝胶电泳分离后转移至醋酸纤维素膜,并用抗鼠抗体(1:5000,Amersham-Pharmacia)探测,用ECL显影(Amersham-Pharmacia)(见图3)。中等规模提取的融合蛋白则经10%SDS-PAGE凝胶电泳分离后用考马斯亮兰染色检测。
实施例6:UT-7EPO细胞活性检测
使用UT-7EPO细胞的分裂分析来检测融合蛋白的生物活性。UT-7EPO细胞是UT-7细胞的EPO独立的亚细胞系,是一种人巨核母细胞白血病细胞。细胞PBS溶液洗涤3次,然后悬浮在含有2mM L-谷氨酰胺和5%胎牛血清的培养基(由Iscove’s改造的Dulbecco’s培养基),培养过程不加入epoetin-α,形成EPO饥饿。EPO饥饿24小时后,细胞使用PBS洗涤一次并计数,最后重悬在新鲜的I5Q培养基。细胞被分到96孔板内,每孔30,000个细胞并设平行孔。融合蛋白被加到96孔板内,在培养箱内5%CO2,37℃培养。48小时后,每孔加入100μL包含20μL MTS试剂(Cell Titer 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay,Promega)的反应液。每隔1小时进行读数,在融合蛋白加入后的1小时开始读数。96孔板在490nm波长读数,并参照650nm波长的吸收峰。使用GraphPad PRISM分析3个小时的数据。上述数据所述的浓度为引起50%最大反应浓度(EC50)。
实施例7 药代动力学研究
在第0天,称量所有受试鼠的体重,并作相应的记录。随后静脉注射1mg/kg(4mL/kg)的EMP1/IgG-Fc、EMP1/IgG-Fc(QA)、EMP1/IgG-Fc(QL)或EMP1/IgG-Fc(N434S)。在注射后的20min,60min,6hr,24hr,48hr,3day,6,10,14,21和28天采集血样。为了获得血样,先将鼠用CO2进行麻醉,用细玻璃在眼眶取血300uL。血液通过离心机离心,分离血清。将分离后的血清储存在-80℃冰箱内。血清中的EMP1/IgG-Fc融合蛋白及其突变体使用Elisa双(抗体夹心法进行检测。上述检测过程按照已有的方法操作(Bugelski PJ等2008,J Biotechnol134:171-180),在鼠的血浆中使用羊抗人Fc捕获/羊抗人Fc检测和使用抗EMP-1Fab捕获/羊抗人Fc检测融合蛋白的含量。使用非房室发通过血清浓度数据来估计融合蛋白的标准要代动力学参数。上述过程参照(Bugelski PJ等2008,J Biotechnol.134:171-180)方法进行。实验过程严格遵守实验动物伦理道德规范的要求进行操作。
表1 融合蛋白体外活性及药代动力学特点
实施例9:融合蛋白体内活性检测
在体内活性研究的第4,8,15,23,30和37天,使用毛细玻璃管从鼠的眼角膜取血液样品样本。通过ADVIA120血液分析仪(Siemens Medical Solutions Diagnostics,Tarrytown,NY)按照原来的方法(Kliwinski C等,Open Hematology Journal.2011,4:17-20.)测试鼠的血液参数。网织红细胞(Retic)百分率(%)=多个视野内Retic总数/多个视野内RBC总数×100%。为了验证不同EPO受体激活剂对于网织红细胞的成熟有不同的影响效果的假说,本发明应用来自于控制组鼠的数据构建模型,并应用于治疗组。
RBC(tN)=((RBC(tN-1)+RTC(tN))·SF)其中
RBC(tN)=第N天的红细胞总数
RTC(tN)=第N天的网织红细胞总数
SF=PBS处理后鼠的存活数量
其中,RBC(t0)表示用PBS处理的鼠,在第四天红细胞的平均数量。为了验证关于网织红细胞转变为红细胞的不同影响有着重要的意义的假说,我们估计了曲线下面积的血红蛋白(Hgb)与时间曲线(HgbAUC)的改变。本发明主要估计了实验第1~37天的血红蛋白曲线下面积(当epoetin-α处理的组的血红蛋白值恢复到基线水平时),估计方法为在每个时间点,用处理组的血红蛋白值减去控制组的血红蛋白质所获得的数值,加上样本间和结果总数的值。HgbAUC(1~37)的数据通过如下的方程式进行计算。给药过程中使用的单位为mg/kg。
Hgb AUC(1~37)=a·log(dose)+b
本发明使用SigmaStatv2.03(SPSS,Inc.San Rafael,CA)进行统计学分析。Hgb AUC(1~37)之间的相互坡度曲线和EPO受体激动剂的清除率呈斯皮尔曼等级相关。当P<0.05认为有统计学意义。实验过程严格遵守实验动物伦理道德要求。
Claims (10)
1.一种融合蛋白,由促红细胞生成素模拟肽(erythropoietin mimetic peptides,EMP)通过连接肽(Linker)与IgG-Fc或IgG-Fc突变体形成,其通式为EMP-Linker-IgG-Fc或者IgG-Fc-Linker-EMP。
2.权利要求1所述EMP选自促红细胞生成素模拟肽及其突变体(SEQ ID NO:1)。
3.权利要求1所述Linker选自序列SEQ ID NO:2;SEQ ID NO:3;SEQ ID NO:4;SEQ ID NO:5;SEQ ID NO:6;SEQ ID NO:7或(GGGGS)n,其中n为1,2,3,4,5或6。
4.权利要求1所述Linker可以选自SEQ ID NO:8,其中n为0,1,2,3,4,5或6,或者为其它甘氨酸富集的连接肽。
5.权利要求1所述IgG Fc(铰链区-CH2-CH3)序列为人IgG1、IgG2或IgG4的Fc及其突变或缺失体,上述序列选自SEQ ID NO:9;SEQ ID NO:10;SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12,或者选自上述IgG-Fc序列的杂合体,其中IgG-Fc序列参照EU(Kabat)指数进行编号,重要的是上述IgG-Fc突变体选自序列SEQ ID NO:13;SEQ ID NO:14;SEQ ID NO:15;SEQ ID NO:16,上述突变位点可以是单位点突变或多位点突变组合,这些位点可选自如下:
Xaa1=Gln或Thr
Xaa2=Gln或Thr
Xaa3=Leu,Met或His
Xaa4=Ala,Ser或Asn。
6.根据权利要求1所述,更进一步,与促红细胞生成素模拟肽(EMP)相连的融合蛋白可以选自人血白蛋白或转铁蛋白,也可以选自人血白蛋白或转铁蛋白部分片段、突变体和缺失体。
7.权利要求1~5所述融合蛋白应用于人红细胞减少类疾病如贫血的预防与治疗,或者其DNA序列应用于基因治疗。
8.权利要求5所述融合蛋白突变体,是基于增加与FcRn的亲和力来进一步增加EMP在体内的半衰期。
9.权利要求1~5所述融合蛋白使用真核细胞进行表达,蛋白纯化过程中使用A或G蛋白葡聚糖凝胶层析柱。
10.权利要求1~5所述融合蛋白使用原核细胞进行表达。
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