CN102850456A - 一种血管内皮生长因子人源化单克隆抗体及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新型抗人血管内皮生长因子(VEGF)的单克隆抗体。该单克隆抗体对VEGF有很高的亲和力，很低的免疫原性，并且其生物活性有显著提高。本发明还包含了所述单克隆抗体在研究及诊断治疗方面的应用。本发明提供的高特异性的人源化VEGF单克隆抗体，所述单抗与阳性药物相比药效更佳且制备工艺简便，成本更低，为癌症以及眼科疾病的防治、早期筛查、诊断工作提供了准确、简便、有效的监测手段，具有广泛的应用范围和社会需求。总之，本发明积极适应了现代生物、预防保健、临床诊断等领域的工作需要和人性化服务的需要，本发明为研究开发该人源化VEGF单克隆抗体，为我国医药市场提供一种性价比更高的治疗药物，因此具有十分广阔的应用前景。

Description

一种血管内皮生长因子人源化单克隆抗体及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于抗体药物开发和生产技术领域,具体地，具体地，本发明涉及一种人血管内皮生长因子(VEGF)单克隆抗体及其制备方法。

背景技术

血管生成系统在许多疾病发展过程发挥着重要作用，如肿瘤、类风湿性关节炎、增生性视网膜病、牛皮癣。多数实体肿瘤生长是血管依赖性的，如果没有丰富血液供应氧气和营养物质，原发肿瘤不会超过2～3mm³。

血管内皮生长因子(VEGF)是血管生成重要调节因子，是一个血管生成的关键调节因子，在胚胎发育及出生后的血管发程中均起着极为重要的调节作用，主要参与新生血管的形成VEGF有至少五种不同大小的剪切形式，包括121、145、165、189和206个氨基酸等，其中VEGF121、VEGFi4s和VEGF165是分泌蛋白。VEGF受体包括VEGFR1、VEGFR2和VEGFR3。VEGF与内皮细胞膜上内皮生长因子受体(VGFR)结合后，使VEGFR二聚体化，受体酪氨酸激酶活性被激活，由受体自身磷酸化后启动下游信号通路如PKC信号通路。VEGF在肿瘤细胞中表达水平显著升高。高表达的VEGF除了能够使血管内皮细胞分化增殖和迁移，促进血管的构建及生长，还能够提高血管的通透性、增加血浆蛋白溶酶激活物(PA)及血浆纤溶酶原激活物抑制剂一l(PAI-1)的表达，促进肿瘤的侵袭、转移。

使用抗体靶向肿瘤特异抗原可以用来治疗肿瘤。鼠移植动物模型鉴定肿瘤抗原分为两种：一种是肿瘤特异移植抗原；一种是肿瘤相关移植抗原。肿瘤特异移植抗原是指肿瘤中突变基因编码的蛋白，经过I型MHC被展示到细脆表面。人基因组单个细胞的恶性转化诱因包括化学诱因、放射性诱因和病毒诱因等。在基因组水平，这体现为病毒癌基因、细胞原癌基因、抑癌基因等癌症相关基因的突变。癌症相关基因功能多与细胞复制调控和细胞死亡调控直接相关。诱导细胞复制的原癌基因有编码生长因子和生长因子受体的，例如SiS编码一种血小板来源生长因子，fms、erbB和neu编码生长因子受体；有编码信号传导通路和转录因子的，例如src编码酪氨酸激酶，ras编码GTP结合蛋白，myc、jun和fos等编码转录因子。抑癌基因能够抑制过度细胞复制，例如Rb基因突变导致retinoblastoma，p53蛋白编码一个核磷酸蛋白。大部分癌症诱导和发展过程是多步骤的。例如人直肠癌发展过程表现出稳定的不同时期特征和依次经历系列的遗传突变。不能有效免疫激活和/或免疫耐受可能是肿瘤晚期无法控制的原因，临床表现为恶性肿瘤形成和原发肿瘤临近淋巴结的肿大。肿瘤相关移植抗原包括肿瘤发展必须蛋白、细胞有丝分裂特异蛋白、肿瘤细胞组织特异性蛋白。

血管内皮生长因子(VEGF)是主要的血管内皮生长因子，是恶性肿瘤组织新血管生成所必须的。原位杂交研究表明，许多肿瘤VEGF是过度表达的，包括：肺癌、乳腺癌、肾癌、和子宫癌等。Genentech公司生产的VEGF人源抗体Bevacizumab(Avastin)对非小细胞肺癌、直肠癌和乳腺癌均有疗效，其药理是体内注射VEGF抗体特异阻断VEGF的促新血管生成功能，从而抑制恶性肿瘤生长速度。

除癌症外，VEGF也是治疗如老年性黄斑变性(AMD)、糖尿病引起的眼底病在内的多种眼科疾病关键。为治疗这类疾病，在Avastin基础上，Genentech又将其全抗体分子结构进行简化，保留能够中和VEGF的抗体片段，同时将给药途径由静脉注射改为玻璃体直接注射，由此推出另一个单抗药物-Lucentis。2006年，Lucenti被美国FDA批准用于治疗老年黄斑变形，很快就成为治疗老年性黄斑病变、糖尿病引起的眼底病的首选药，占领北美市场80%以上的份额。

因此，研发一种具有高特征性的人源化VEGF单克隆抗体成为当下的研究热点，更是为满足我国经济困难地区的生物制品用药、癌症治疗的迫切需求。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是提供一种人源化VEGF单克隆抗体及其制备方法和用途。

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种人源化VEGF单克隆抗体，其中重链可变区VH的高变区具有如下氨基酸序列：CDRH1(SEQ ID NO.l：DYTPTDYQVK)，CDRH2(SEQ ID NO.2：GIDYNFGDTVYNAKFW)，CDRH3(SEQ ID NO.3：WANRTAQW)。

本发明还提供了优选的VEGF抗体轻链可变区，其中高变区具有下列氨基酸序列：CDRLl(SEQ ID NO.4：DSSQALLDNDGQTYVN)，CDRL2(SEQ ID NO.5：LGSYYNS)，CDRL3(SEQ ID NO.6：YQGAHPPQT)。

本发明提供了一种VEGF抗体，其重链可变区具有SEQ ID NO.7所示氨基酸序列和序列表l所示核苷酸序列，轻链可变区具有SEQ ID NO.8所示序列和序列表2所示核苷酸序列，人源化抗体重链可变区具有SEQ ID NO.9所示序列，轻链可变区具有SEQ ID NO.10所示序列。

本发明还提供了抗VEGF单克隆抗体的氨基酸序列及其其可变区链，以及具有这些链的其他蛋白质或融合表达产物，具体地，本发明包括具有含超变区(互补决定区，CDR)的轻链和重链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该超变区与本发明的轻链和重链的超变区相同或至少90%同源性，较佳地至少95%同源性。

抗体的抗原结构特性可由位于重链和轻链可变区的3各特定的区域来描述，成为互补决定区(complementarity determining region,CDR)，将该段间隔成4各框架区域(FR)，4个FR的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构，通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的CDR和相应轻链上的CDR构成了抗体的抗原结合位点。本领域技术人员通过常规方法分析将本发明抗体的重链和轻链序列(SEQID NO:1和SEQ ID NO:2)，可确定其CDR区。本发明还包括这些CDR区完全相同的抗体重链和抗体轻链，以及由所述重链和轻链构成的抗体。

此外，最近还发现由轻链可变区构成的相关结构，与相应的重链可变区相比，其结合的动力学较小，分离的重链可变区域自身具有抗原结合活性。

本发明不仅包括完整的单克隆抗体，还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab或(Fab’)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但保留来自人的抗体部分的抗体，可用于本发明的形成嵌合抗体的技术是本领域公知的，以及抗体与药物、毒素、细胞因子、放射性核素或酶等偶联，组成免疫偶联物。

本发明还提供了编码上述单克隆抗体或其片段的DNA分子。本发明的单抗的核苷酸全长序列或其片段通常可用PRC扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短室。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外，还可将轻链和重链的编码序列融合在一起，形成单链抗体。

获得有关序列后，即可用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

本发明中所述的“核酸分子”指聚核苷酸，例如脱氧核糖核苷酸(DNA)和核糖核苷酸(RNA)，还包括由核苷酸类似物形成的DNA或RNA的等效物、类似物，单链(有义链或反义链)和双链聚核苷酸。该术语还包括同源序列。对本领域技术人员来说，很显然，任意一种上述形式的核酸分子都当然地涵盖了该“核酸分子”的所有上述等效形式。

此外，目前已可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列，然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

上述的宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物稀薄。代表例有：大肠杆菌、链霉菌属、鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞、真菌细胞如酵母、果蝇S2或Sf9的昆虫细胞、CHO、COS7或293细胞的动物细胞等。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主细胞为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收货，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域中公知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可以用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的诉诸细胞，培养中所用的培养基可选用各种常规的培养基。在适合宿主细胞生长的条件下培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转化或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上述方法中的重组多肽可在细胞内、或细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的其他特性通过各种分离方法分离纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其他各种液相层析技术及这些方法的结合。

一种上述单克隆抗体的用途，是作为活性成分用于制备治疗VEGF诱导型血管生成相关疾病的药物，优选为制备治疗VEGF诱导的恶性肿瘤和眼部病变。

作为一种优选方案，所述用途是将上述单克隆抗体作为活性成分用于制备治疗肺癌、乳腺癌、肾癌、子宫癌、老年性黄斑病变和糖尿病引起的眼底病的药物。

本发明还提供了一种治疗非霍奇金淋巴瘤的药物组合物，其含有上述的单克隆抗体或免疫偶联物，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配置于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常为5-8，较佳的pH为6-8，尽管pH值可随被配制物的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：腹膜内、静脉内、或局部给药。

本发明药物组合物的制备方法可以是将现有的市售可得的上述化合物，或从生物中提取的含上述化合物的提取物，按配比，采用本领域的常规方法获得，即得所述的抗VEGF单克隆抗体组合物。本发明中述及的各原料或试剂均市售可得。

在具体使用方面，本发明所述的抗VEGF单克隆抗体组合物能够单独直接使用，还能够与其他许多化学物质一起使用。无论这些化学物质是否具有生物活性或具有治疗疾病的功能，包括辅助功能如协同放大作用、拮抗或缓解抗VEGF单克隆抗体组合物的副作用等，这些化学物质是包括医药学上可接受的载体、天然产物、化学合成药物或人类用药等中的一种或多种；优选包括医药学上可接受的载体等中的一种或多种。

本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明上述的单克隆抗体的药物组合物，以及药学上可接受的载体或赋形剂或稀释剂。这类载体包括，但不限于：任何和所有的生理适用的溶剂、分散介质、胞衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂或吸收延迟剂等中的一种或多种。医药学上可接受载体的例子包括一种或多种的水、盐水、磷酸缓冲盐水、缓冲液、葡萄糖、甘油或乙醇等及其组合物中的一种或多种。例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。

如本文所用，术语“抗VEGF的特异性单克隆抗体”、“抗VEGF单抗”、“VEGF单抗”、“VEGF抗体”等可互换使用，都是指由抗体重链元件的氨基酸序列和抗体轻链元件的氨基酸序列构成的抗体；该术语还包括与GST等形成的融合蛋白，只要在该融合蛋白中抗体部分仍然保留与VEGF的结合活性。

所述“药学上可接受的载体”包括任何和所有的生理适用的溶剂、分散介质、胞衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂或吸收延迟剂等中的一种或多种。药学上可接受载体的例子包括一种或多种的水、盐水、磷酸缓冲盐水、葡萄糖、甘油或乙醇等及其组合物中的一种或多种。在许多情况下，在该组合物中最好包括等渗剂，例如，糖、诸如甘露醇、山梨醇、山梨醇的多元醇或氯化钠等中的一种或多种。药学上可接受载体还可以包含少量的辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲液等中的一种或多种，它们增强了该抗补体或抗氧化组合物的有效期或效力。

从具体的分类上看，所说的药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，包括润滑剂，如滑石粉、聚乙二醇或硬脂酸镁等中的一种或多种；崩解剂，如微晶纤维素、羧甲基纤维素钠或低取代羟丙纤维素等中的一种或多种；填充剂，如淀粉、糊精或乳糖等中的一种或多种；粘合剂，如预胶化淀粉、纤维素衍生物、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基纤维素等中的一种或多种；渗透压调节剂，如氯化钠、葡萄糖、蔗糖、山梨醇或甘露醇等中的一种或多种；pH调节剂，如盐酸、氢氧化钠等酸或碱中的一种或多种；溶剂，如水、缓冲液、乙醇或丙二醇等中的一种或多种等；抗氧剂和络合剂，如亚硫酸钠、EDTA等中的一种或多种；表面活性剂，如季铵化合物、十六烷醇等；吸附载体，如高岭土或皂粘土等中的一种或多种；高分子骨架剂，如环糊精、聚乙二醇、泊洛沙姆等中的一种或多种；稀释剂如淀粉、糖粉、糊精、微晶纤维素、甘露醇、乳糖和大豆油等中的一种或多种；稳定剂如羧甲基纤维素钠或环糊精等中的一种或多种；防腐剂如对羟基苯甲酸乙酯或苯甲酸钠等中的一种或多种。另外，还可以在该药物组合物中加入其他辅助剂，如香味剂和/或甜味剂如蔗糖、果糖和天冬甜素等中的一种或多种。

与现有技术相比，本发明提供了一种高特异性的人源化VEGF单克隆抗体，所述单抗与阳性药物相比药效更佳且制备工艺简便，成本更低，为癌症以及眼科疾病的防治、早期筛查、诊断工作提供了准确、简便、有效的监测手段，具有广泛的应用范围和社会需求。总之，本发明积极适应了现代生物、预防保健、临床诊断等领域的工作需要和人性化服务的需要，本发明为研究开发该人源化VEGF单克隆抗体，为我国医药市场提供一种性价比更高的治疗药物，因此其应用前景十分广阔。

附图说明

图1和2显示了鼠单克隆抗体21-7的重链可变区(SEQ.ID NO.：7)和轻链可变区(SEQ.ID NO.：8)，人源化单克隆抗体Bh21-7的重链可变区(SEQ.ID NO.：9)和轻链可变区(SEQ.IDNO.：10)，人重链亚组I human I(SEQ.ID NO.：11)和轻链K亚组Ⅱ(SEQ.ID NO.：12)的可变区序列。下划线标出了互补决定区(CDR)。

图3体现了人源化抗VEGF的单克隆抗体Bh21-7对裸鼠肿瘤生长的抑制作用；与阴性对照组相比，Bh21-7、阳性对照抗体Bevacizumab均可显著抑制肿瘤的生长(p<0.05)，*表示显著性差别。

具体实施方式

以下结合具体实施例，进一步阐明本发明。应理解，下述实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。比例和百分比基于重量，除非特别说明。

实施例1小鼠单克隆抗体的制备和筛选

(1)抗原的制备人血管内皮生长因子VEGF165(Human Vascular endothelial growth factor，hVEGF165)基因通过PCR从人基因转录组中扩增获得，上游引物为：

5’-CGCGGATCCGCACCCATGGCAGAAGGAGG-3’；下游引物为：

5’-CTCCTCGAGTCACCGCCTCGGCTTGTCACATC-3’。利用BamHI和Xho I双酶切，将基因片段连入原核表达载体pET32a(+)，PCR和双酶切鉴定阳性克隆后测序，序列测定正确后，提取质粒。原核表达载体pET32a-VEGF165转化Rosetta菌株，在l00mlLB培养基中，OD600达到约0.5时，ImM IPTG诱导表达4h，VEGF165蛋白形成包涵体。超声破菌后，用1×SDS上样缓冲液溶解包涵体，测定靶蛋白的表达量。将制备好的VEGF165蛋白进行SDS-PAGE电泳，割胶纯化蛋白。

(2)小鼠的免疫将纯化后的VEGF165蛋白溶解在l×PBS，取适量的蛋白溶液与弗氏完全佐剂(Sigma)混匀乳化，取8周龄的BALB/c雌鼠，皮下多点注射抗原。2周后，取适量的蛋自溶液与弗氏不完全佐剂(Sigma)混匀乳化，在小鼠的皮下，进行第二次免疫。以后每隔3周，进行第三、四次免疫。第四次免疫后3天，取脾脏进行细胞融合。

(3)细胞融合和阳性克隆的筛选

引颈处死小鼠，用70%酒精消毒其体表。无菌条件下取出脾脏，在灭菌不锈钢网中，用注射器向脾脏内注入3ml无血清培养液，反复抽吸数次获得细胞悬液，将细胞悬液注入50ml离心管中，加入20ml无血清培养液，轻轻吹打数次，l000rpm/min离心。用无血清培养液将细胞重悬，与小鼠骨髓瘤细胞SP210以适当比例轻轻混匀，在37℃水浴锅中加入PEG1400，水浴1.5min。加入无血清培养液35ml，离心。沉淀用含有20%FCS的RPMl-1640重悬，每孔200uL均分到96孔细胞培养板，放入37℃5%CO₂培养箱中培养。24h后，加入选择培养液HAT，每3天换一次新鲜培养液。

14天后，取细胞培养上清，ELISA鉴定出阳性克隆。多次进行亚克隆鉴定阳性克隆细胞成系，继续体外培养6个月。选出7株高效表达细胞株，分别命名为21-1、21-2、21-3、21-4、21-5、21-6、21-7。

(4)单克隆抗体的鉴定

血清1：1000-1：50000稀释，l00ngVEGF165蛋白上样，进行Western Blot分析抗体的特异性。将VEGF165基因通过TOPO克隆方法连入表达载体pLent17.3/V5-TOPO，真核表达载体pLent17.3/V5-VEGF165利用Lipofectamine2000(1nvitrogen)介导瞬时转染293T细胞，血清1：100稀释，进行免疫荧光鉴定抗体。测定可知，21-7细胞株的抗体特异性最好，且能识别细胞内源表达的抗原。

(5)单克隆抗体可变区序列的获得

利用Trizol(Invitrogen)法提取杂交瘤细胞株21-7的总RNA，然后用oligo-dT引物和SuperScript Ⅱ Reverse Transcriptase(lnvitrogen)反转录成cDNA。根据小鼠抗体重链和轻链的FR1区氨基酸序列，合成兼并的寡核苷酸引物，用作正同引物。反向引物根据小鼠抗体的恒定区设计，可将全部的可变区扩增得到。PCR反应完成后，分别将抗体重链和轻链的DNA片段连于TA克隆载体，挑取克隆进行测序。

实施例2鼠单克隆抗体的人源化和表达纯化

(1)鼠单克隆抗体的人源化将小鼠的抗体氨基酸序列与人抗体氨基酸序列进行比对，获得最高同源序列的人亚类共有序列的架构，即人轻链V_Lκ亚组Ⅱ(V_LκⅡ)和重链V_H亚组I(VHI)，作为人源化构架。按照kabat等人的定义将L链的CDR1：24-34，CDR2：50-56，CDR3：89-97；H链的CDR1：26-35,CDR2:50-65,CDR3:95-102(sequences of proteins ofimmunological Interest,(5th),Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)。利用计算机构建鼠单克隆抗体VL-VH区的立体图模型(Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：4285-4289(1992)Eigenbrot.J．Mol.Biol.)229：969-995(1993))，确定将哪些鼠抗体构架区残基引入人源化抗体。其中重链除CDRH1，CDRH2，CDRH3外，在H73位点人源化构架改用鼠抗体氨基酸，轻链CDRL1，CDRL2，CDRL3使用鼠抗体氨基酸序列。

(2)人源化抗体IgG的构建和表达纯化人源化抗体重链和轻链可变区核苷酸序列全基因合成后，分别克隆入载体AbVecl-hIgGl，AbVecl-hIgKappa。转化DH5Q，提取阳性克隆质粒。利用转染试剂Lipofectamine2000(Invitrogen)，将构建好的质粒共转染人293A细胞。培养24h后，DMEM培养基被换成基本培养基，并在5天之内每天收获上清。上清合并以后用ProteinA-Sepharose CL-4B(Amersham)纯化抗体，并用SDS-PAGE电泳鉴定。经过亲和层析的鉴定产物再次通过分子筛层析，获得高纯度的单抗，然后利用EZQ ProteinQuantitationKit(Invitrogen)对抗体定量，以进行下一步的实验。

实施例3人源化单克隆抗体的理化性质及生物活性分析

(1)VEGF亲和力分析

Scatchard法测定单克隆抗体21-7，Bh21-7，Bevacizumab的亲和力。表l显示了测定的结果，说明两株单克隆抗体与VEGF有较强的结合亲和力。

(2)体外抑制内皮细胞增殖分析

在内皮细胞基本培养基(EGM-2，Lonza)中，加入2%胎牛血清和生长因子(BulletKit，Lonza)，配制成内皮细胞生长培养基。当人脐静脉内皮细胞(HUVECs)(Lonza，Walkersville，MD)生长到致密单层时，以4×10³细胞/孔的密度接种于96孔板中，此时的分析培养液EGM-2不加入生长因子。阳性耐照抗体为Avastin(Genetech)，人源化VEGF抗体按一定稀释梯度加入，孵育1~2h后，加入人VEGF165使其终浓度为15ng/ml。37℃，5%CO₂，培养箱培养4天后，每孔中加入10uLAlamarBlue(Invitrogen)继续培养24h。在激发波长530nm和发射波长590nm时，利用Wallac Victor V multilabel HTS counter(PerkinElmer)测定细胞的增殖情况。每个处理设3次重复，每个重复测定两次。

结果显示，在VEGF有效浓度下，抗体21-7和Bh21-7对人脐静脉内皮细胞的增殖有较好的抑制作用，阳性对照抗体和抗体的IC50值分别为0.052，0.026。

(3)体内抑制肿瘤生长研究

在含有链霉素、青霉素和10%胎牛血清的高糖DMEM培养基(GIBCO)中，培养人A673成横纹肌细胞瘤细胞。在6-8周龄的雌性BALB/c裸鼠的背部区域皮下，注射l×10⁷个活肿瘤细胞。当肿瘤体积达到约l00mm³(50～200mm³)时，裸鼠被随机分组，每组10只，抗体在腹膜内注入。人源化VEGF抗体和阳性对照抗体Avastin(Genetech的给药剂量是0.5和5mg/kg；无菌生理盐水作为对照。肿瘤细胞接种后l天开始，每周在裸鼠腹膜内施用2次单克隆抗体，每2～3天测定肿瘤大小。肿瘤细胞接种4周后，裸鼠被安乐死亡，然后肿瘤被取出称重。

实验结果说明，在两种剂量(0.5和5mg/kg)，人源化VEGF抗体能显著抑制肿瘤的生长。与对照组相比，人源化VEGF抗体在两种剂量下肿瘤重量分别下降96%和98%，而使用Avastin的对照组动物肿瘤重量各下降89%和91%。

最后有必要在此说明的是：以上实施例只用于对本发明的技术方案作进一步详细地说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。

序列表

<110>上海博沃生物工程有限公司

<120>血管内皮生长因子人源化单克隆抗体

<170>Patentln version3.3

<210>1

<211>336

<212>DNA

<213>Mus musculus

<400>gaggttaagc tggaggagtc tggacctgaa ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata

    60

ccctgcaagg cttctggata cacattcact gactacaacg tggcctgggt gaaacagagc

120

catggaaaga gccttgagtt gattggagat attgatccta acaatggtaa tactatctac

180

aaccagaaat tcaagggcaa ggccacattg actgtagaaa agtcctccag cacagcctac

240

atggagctcc gcagcctgac atctgaggac actgcagtct attactgtgc aagaggtgcc

300

cactggggtc aaggaacctc agtcaccgtc tcctca

336

<210>1

<210>336

<212>DNA

<213>Mus musculus

<400>2

gatattgtga tcacccagtc tccattcact ttgccggtta ccattggaca accagcctcc  60

atctcttgca agtcaagtca gagcctctta gatagtgatg gaaagacata tttgaattgg  120

tcgttacaga ggccaggcca gtctccaaag cgcctaatct atctggtgtc taaattggac  180

tctggacjtcc ctgacagatt cactggcagt ggatcaggga ctgatttcac actgaaaatc  240

agcagagtgg aggctgagga tttgggagtt tattattgct ggcaaggtac acattttccg  300

tggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaa

<210>1

<211>269

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>3

ttgattgtac gggaaaagcc tttttaaaac atcttttacg ttgcttaaac ctacagtttcaaagcattcc gaaggctaaa

gtgagaaata agcccaggct agggagagga gaaacgaagttcacgtccta gtctggcacc gggttggatt

gtcgctggga cggcagtcag gcatttggtgtggtcgccta aggggtgggt ccttcggcgg gagctccggg

aaaccccgtg ggcctgcgcggcgttcttcc ttttcgatcc gccatctgc

Claims (8)

1.一种人源化抗VEGF单克隆抗体，其特征在于：它具有含有如下氨氨基酸序列的三个高变区的重链可变区：CDRH1(SEQ ID NO.l：DYTPTDYQVKGYTFTDYNVA)，CDRH2(SEQ ID NO.2：GIDYNFGDTVYNAKFWDIDPNNGNTIYNQKFK)，CDRH3(SEQ ID NO.3：WANRTAQW YCARGAHW)。

2.根据权利要求1所述的人源化VEGF单克隆抗体，其特征在于：它还包括VEGF抗体轻链可变区，所述轻链可变区具有下列氨基酸序列：CDRLl(SEQ IDNO.4：DSSQALLDNDGQTYVN KSSQSLLDSDGKTYLN)，CDRL2(SEQ ID NO.5：LGSYYNS LVSKLDS)，CDRL3(SEQ ID NO.6：YQGAHPPQT)。

3.根据权利要求1所述的人源化VEGF单克隆抗体，其特征在于：所述人源化VEGF单克隆抗体的重链可变区具有SEQ ID NO.7所示氨基酸序列，轻链可变区具有SEQ ID NO.8所示序列。

4.根据权利要求1所述的人源化VEGF单克隆抗体，其特征在于：人源化抗体重链可变区具有SEQ ID NO.9所示序列，轻链可变区具有SEQ ID NO.10所示序列。

5.一种分离的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子含有SEQ ID NO.11所示的编码所述单克隆抗体可变区的核苷酸序列，以及SEQ ID NO.12所示的编码所述单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列。

6.根据权利要求5所述核酸分子，其特征在于：它编码权利要求1所述的单克隆抗体。

7.一种药物组合物，其特征在于：它以权利要求1～4所述的人源化VEGF单克隆抗体作为主要有效组分和药学上可接受的载体。

8.一种制备权利要求1所述的人源化VEGF单克隆抗体的方法，其特征在于：在宿主细胞中表达权利要求5所述的核酸分子，以及从宿主细胞培养物中分离纯化抗体。

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