CN107207580A - 抗‑cldn嵌合抗原受体和使用方法 - Google Patents

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Abstract

本文提供了新颖的抗‑CLDN嵌合抗原受体和使用它们治疗增殖性病症的方法。

Description

抗-CLDN嵌合抗原受体和使用方法
交叉引用的申请
本申请要求2014年11月5日提交的专利合作条约(PCT)申请号PCT/US2014/064165、2015年5月6日提交的美国临时申请号62/157,928和2015年10月27日提交的美国临时申请号62/247,108的权益，它们中的每一篇通过引用整体并入本文。
序列表
本申请含有序列表，其已经通过EFS-Web以ASCII格式递交，并特此通过引用整体并入。所述ASCII拷贝（创建于2015年11月3日）被命名为sc2703pct_S69697_1270WO_SEQL_110315.txt，且具有247,510字节的大小。
技术领域
本发明一般地涉及过继免疫疗法，其包含掺入封闭蛋白（claudin）(CLDN)结合结构域的新嵌合抗原受体的应用。在优选的实施方案中，公开的嵌合抗原受体可用于治疗或预防增殖性病症及其任何复发或转移。
背景技术
干细胞和祖细胞的分化和增殖是正常的持续过程，其一致地起作用以支持器官发生、细胞修复和细胞替代过程中的组织生长。紧密地调节系统以确保基于生物的需要而仅产生适当的信号。细胞增殖和分化通常仅在对于替换受损伤的或正在死亡的细胞而言或对于生长而言必要时发生。但是，这些过程的破坏可以由许多因素触发，所述因素包括各种信号传导化学物质的不足或过多、改变的微环境的存在、基因突变或它们的组合。正常细胞增殖和/或分化的破坏可以导致各种病症，包括增殖性疾病诸如癌症。
用于癌症的常规治疗性治疗包括化学疗法、放射疗法和免疫疗法。这些治疗经常是无效的，且外科手术切除术不可提供可行的临床替代。现有护理标准的限制在患者经历第一线治疗且随后复发的那些情况下尤其明显。在此类情况下，难治性肿瘤频繁出现，其经常为侵袭性的和不可治愈的。对于许多实体瘤而言，总生存率在多年中维持基本上不变，这至少部分地归因于防止复发、肿瘤复发和转移的现有疗法的失败。因此，仍然非常需求开发针对增殖性病症的更靶向和有效的疗法。本发明解决了该需求。
发明概况
在一个宽的方面，本发明提供了包含CLDN结合结构域的新嵌合抗原受体(CAR) (CLDNCAR)，所述CLDN结合结构域特异性地结合CLDN家族的至少一种蛋白。在选择的实施方案中，本发明的CLDN CAR特异性地结合CLDN6或特异性地结合CLDN6和CLDN9。在其它的实施方案中，本发明的抗体以基本上相同的表观结合亲和力结合CLDN6和CLDN9。在其它实施方案中，公开的CAR可以与CLDN4交叉反应。在其它优选的实施方案中，在肿瘤起始细胞上表达CLDN靶蛋白。
通过遗传修饰(例如，转导)，在细胞毒性的淋巴细胞(优选自体的)上表达CLDNCAR以提供CLDN敏感的淋巴细胞，其用于靶向和杀伤CLDN阳性的肿瘤细胞。如在本文中将广泛地讨论的，本发明的CAR通常包含含有CLDN结合结构域的细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，所述细胞内信号传导结构域活化某些淋巴细胞并产生针对CLDN阳性的肿瘤细胞(即，是CLDN6+和/或CLDN9+和/或CLDN4+的那些)的免疫应答。本发明的选择的实施方案包含表达公开的CAR的免疫活性的宿主细胞以及编码本发明的CLDN CAR的各种多核苷酸序列和载体。其它方面包括增强个体中的T淋巴细胞或天然杀伤(NK)细胞活性的方法，以及通过向个体中引入表达CLDN CAR分子的宿主细胞来治疗遭受癌症的个体的方法。这样的方面具体地包括肺癌(例如，小细胞肺癌)、黑素瘤、乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、肾细胞癌、卵巢癌、神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤、白血病和淋巴瘤的治疗。
如在下面更详细地讨论的，本文中使用的术语“抗体”应当认为是指完整抗体(例如，IgG或IgM)以及它们的任何免疫反应片段(例如，Fab片段)或免疫反应构建体或衍生物(例如，scFv)。在某些实施方案中，本发明的CLDN结合结构域(和CLDN CAR)将包含scFv构建体，且在优选的实施方案中，将包含与含有本文中公开的重链和轻链可变区的抗体竞争结合的scFv构建体。在其它优选的实施方案中，本发明的CLDN结合结构域(和CLDN CAR)将包含这样的scFv构建体：其包含本文中公开的重链和轻链可变区或其片段。这样，为了本发明的目的，术语“抗体”应当一般地使用，且将明确地意在包括其免疫反应片段、构建体或衍生物，除非另外根据上下文指出。
在本发明的特定方面，所述CAR结合结构域结合CLDN家族的至少一个成员(例如，CLDN4、CLDN6和/或CLDN9)，且将源自、包含抗体或抗体片段或者与抗体或抗体片段竞争结合，所述抗体或抗体片段包含：SEQ ID NO: 21的轻链可变区(VL)和SEQ ID NO: 23的重链可变区(VH)；或SEQ ID NO: 25的VL和SEQ ID NO: 27的VH；或SEQ ID NO: 29的VL和SEQ IDNO: 31的VH；或SEQ ID NO: 33的VL和SEQ ID NO: 35的VH；或SEQ ID NO: 37的VL和SEQ IDNO: 39的VH；或SEQ ID NO: 41的VL和SEQ ID NO: 43的VH；或SEQ ID NO: 45的VL和SEQ IDNO: 47的VH；或SEQ ID NO: 49的VL和SEQ ID NO: 51的VH；或SEQ ID NO: 53的VL和SEQ IDNO: 55的VH；或SEQ ID NO: 57的VL和SEQ ID NO: 59的VH。在特别优选的实施方案中，所述CLDN结合结构域将包含含有前述VL和VH序列或其片段的scFv构建体。在本发明的某些方面，所述CAR结合结构域包含嵌合的、CDR移植的、人源化的或人的抗体或其免疫反应片段。在本发明的其它方面，包含前述序列的CAR结合结构域是内化抗体。
在其它的实施方案中，所述CAR结合结构域特异性地结合CLND6；或特异性地结合CLDN6和CLDN9，并与抗体竞争结合，所述抗体包含：SEQ ID NO: 21的轻链可变区(VL)和SEQID NO: 23的重链可变区(VH)；或SEQ ID NO: 25的VL和SEQ ID NO: 27的VH；或SEQ ID NO:29的VL和SEQ ID NO: 31的VH；或SEQ ID NO: 33的VL和SEQ ID NO: 35的VH；或SEQ ID NO:37的VL和SEQ ID NO: 39的VH；或SEQ ID NO: 41的VL和SEQ ID NO: 43的VH；或SEQ ID NO:45的VL和SEQ ID NO: 47的VH；或SEQ ID NO: 49的VL和SEQ ID NO: 51的VH；或SEQ ID NO:53的VL和SEQ ID NO: 55的VH；或SEQ ID NO: 57的VL和SEQ ID NO: 59的VH。
本发明的其它优选的CAR将包含CDR移植的或人源化的CAR结合结构域，其包含一个或多个如在图3A或3B中所示的重(CDRH1、CDRH2、CDRH3)或轻(CDRL1、CDRL2、CDRL3)链CDR，其中所述CDR按照Kabat等人衍生出。
在一个特定实施方案中，本发明包含结合结构域，所述结合结构域结合CLDN家族的至少一种蛋白并与抗体竞争结合，所述抗体包含如在SEQ ID NO: 61中所示的三个可变轻链CDR (CDRL)；和如在SEQ ID NO: 63中所示的三个可变重链CDR (CDRH)；或如在SEQ IDNO: 65中所示的三个CDRL和如在SEQ ID NO: 67中所示的三个CDRH；或如在SEQ ID NO: 69中所示的三个CDRL和如在SEQ ID NO: 71中所示的三个CDRH；如在SEQ ID NO: 73中所示的三个CDRL和如在SEQ ID NO: 87中所示的三个CDRH。
在另一个实施方案中，本发明包含人源化的或CDR移植的结合结构域，所述结合结构域结合CLDN家族的至少一种蛋白并与抗体竞争结合，所述抗体包含VH和VL，其中所述VL具有三个CDRL，所述CDRL包含SEQ ID NO: 151的CDRL1、SEQ ID NO: 152的CDRL2和SEQ IDNO: 153的CDRL3；或VL具有三个CDRL，所述CDRL包含SEQ ID NO: 157的CDRL1、SEQ ID NO:158的CDRL2和SEQ ID NO: 159的CDRL3；或VL具有三个CDRL，所述CDRL包含SEQ ID NO: 163的CDRL1、SEQ ID NO: 164的CDRL2和SEQ ID NO: 165的CDRL3；或VL具有三个CDRL，所述CDRL包含SEQ ID NO: 169的CDRL1、SEQ ID NO: 170的CDRL2和SEQ ID NO: 171的CDRL3。
在另一个实施方案中，本发明包含人源化的或CDR移植的结合结构域，所述结合结构域结合CLDN家族的至少一种蛋白并与抗体竞争结合，所述抗体包含VL和VH，其中所述VH具有三个CDR (CDRH)，所述CDRH包含SEQ ID NO: 154的CDRH1、SEQ ID NO: 155的CDRH2和SEQ ID NO: 156的CDRH3；或所述VH具有三个CDRH，所述CDRH包含SEQ ID NO: 160的CDRH1、SEQ ID NO: 161的CDRH2和SEQ ID NO: 162的CDRH3；或所述VH具有三个CDRH，所述CDRH包含SEQ ID NO: 166的CDRH1、SEQ ID NO: 167的CDRH2和SEQ ID NO: 168的CDRH3；或所述VH具有三个CDRH，所述CDRH包含SEQ ID NO: 172的CDRH1、SEQ ID NO: 173的CDRH2和SEQ IDNO: 174的CDRH3；或所述VH具有三个CDRH，所述CDRH包含SEQ ID NO: 172的CDRH1、SEQ IDNO: 176的CDRH2和SEQ ID NO: 174的CDRH3。
在另一个实施方案中，本发明包含人源化的或CDR移植的结合结构域，所述结合结构域结合CLDN家族的至少一种蛋白并与抗体竞争结合，所述抗体包含VL和VH，其中所述VL具有三个CDRL，所述CDRL包含SEQ ID NO: 151的CDRL1、SEQ ID NO: 152的CDRL2和SEQ IDNO: 153的CDRL3，且所述VH具有三个CDRH，所述CDRH包含SEQ ID NO: 154的CDRH1、SEQ IDNO: 155的CDRH2和SEQ ID NO: 156的CDRH3；或包含VL和VH的抗体，其中所述VL具有三个CDRL，所述CDRL包含SEQ ID NO: 157的CDRL1、SEQ ID NO: 158的CDRL2和SEQ ID NO: 159的CDRL3，且所述VH具有三个CDRH，所述CDRH包含SEQ ID NO: 160的CDRH1、SEQ ID NO: 161的CDRH2和SEQ ID NO: 162的CDRH3；或包含VL和VH的抗体，其中所述VL具有三个CDRL，所述CDRL包含SEQ ID NO: 163的CDRL1、SEQ ID NO: 164的CDRL2和SEQ ID NO: 165的CDRL3，且所述VH具有三个CDRH，所述CDRH包含SEQ ID NO: 166的CDRH1、SEQ ID NO: 167的CDRH2和SEQ ID NO: 168的CDRH3；或包含VL和VH的抗体，其中所述VL具有三个CDRL，所述CDRL包含SEQ ID NO: 169的CDRL1、SEQ ID NO: 170的CDRL2和SEQ ID NO: 171的CDRL3，且所述VH具有三个CDRH，所述CDRH包含SEQ ID NO: 172的CDRH1、SEQ ID NO: 173的CDRH2和SEQ IDNO: 174的CDRH3；或包含VL和VH的抗体，其中所述VL具有三个CDRL，所述CDRL包含SEQ IDNO: 169的CDRL1、SEQ ID NO: 170的CDRL2和SEQ ID NO: 171的CDRL3，且所述VH具有三个CDRH，所述CDRH包含SEQ ID NO: 172的CDRH1、SEQ ID NO: 176的CDRH2和SEQ ID NO: 174的CDRH3。
在特别优选的实施方案中，所述CAR结合结构域将与包含SEQ ID NO: 69的VL和SEQ ID NO: 71的VH的抗体竞争。在其它实施方案中，所述CAR构建体将包含含有SEQ IDNO: 69的VL和SEQ ID NO: 71的VH的结合结构域。优选地所述结合结构域将包含scFv。
在其它特别优选的实施方案中，所述CAR结合结构域将与包含SEQ ID NO: 73的VL和SEQ ID NO: 87的VH的抗体竞争。在其它实施方案中，所述CAR构建体将包含含有SEQ IDNO: 73的VL和SEQ ID NO: 87的VH的结合结构域。优选地所述结合结构域将包含scFv。在某些优选的实施方案中，前述嵌合抗原受体中的每一种包含人源化的或CDR移植的结合结构域。
当在公开的结合结构域的上下文中使用时，术语“竞争”或“竞争抗体”是指抗体之间的结合竞争，如通过测定所确定的，在所述测定中，参比抗体或免疫学功能片段基本上(例如，大于30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%或90%)阻止或抑制测试抗体与共同抗原的特异性结合。用于确定这样的竞争的适合方法包括本领域已知的技术，例如，生物层干扰量度法、表面等离子体共振、流式细胞计量术、竞争性ELISA等。
在某些实施方案中，本发明涉及一种编码CAR的核酸，所述CAR包含本文中公开的任一种抗-CLDN结合结构域的重链或轻链氨基酸序列。在这点上，编码这样的示例性的人源化的或CDR移植的重链和轻链可变区的核酸序列阐述在附带的图3C和序列表中。在优选的实施方案中，将所述编码结合结构域或CAR的核酸掺入在质粒或载体中。在其它的实施方案中，所述载体将包含病毒载体。
在其它实施方案中，本发明提供了治疗癌症诸如胰腺癌、卵巢癌、结直肠癌、小细胞肺癌和非小细胞肺癌和胃癌的方法，所述方法包括施用药物组合物，所述药物组合物包含表达本文中公开的抗-CLDN CAR的宿主细胞。
在某些实施方案中，本发明提供了治疗癌症的方法，所述方法包括施用药物组合物，所述药物组合物包含表达本文中公开的抗-CLDN CAR的宿主细胞且还包括给所述受试者施用至少一种另外的治疗部分。在优选的实施方案中，所述宿主细胞将包含敏化的淋巴细胞。
本发明也提供了一种减少肿瘤细胞群体中的肿瘤起始细胞的方法，其中所述方法包括，使包含肿瘤起始细胞和除了肿瘤起始细胞以外的肿瘤细胞的肿瘤细胞群体与表达抗-CLDN CAR的宿主细胞接触，由此降低肿瘤起始细胞的频率。
在其它优选的实施方案中，本发明也提供了可用于治疗CLDN相关病症诸如癌症的试剂盒或装置和有关的方法。为此目的，本发明优选地提供了一种制成品，其可用于产生用于治疗CLDN相关病症的CLDN敏化的淋巴细胞，所述制成品包括例如，含有编码公开的CAR的载体(例如，病毒载体)的容器，和关于产生CLDN敏化的淋巴细胞的指导材料。在选择的实施方案中，所述试剂盒将包含另外的试剂和容器以有效地转导所述淋巴细胞。在某些选择的实施方案中，所述试剂盒将用于转导得自要治疗的患者的自体淋巴细胞。在其它选择的实施方案中，这样的试剂盒包含同种异体的CLDN敏化的淋巴细胞，其可以直接施用给所述患者以产生期望的免疫应答。
前述是概述，且因而必然地含有细节的简化、泛化和省略；因此，本领域技术人员会明白，所述概述仅仅是示例性的，且无意以任何方式限制。将从本文阐述的教导中明白本文描述的方法、组合物和/或装置和/或其它主题的其它方面、特征和优点。提供所述概述来以简化形式介导概念的选择，所述概念在下面在详细描述中进一步描述。该概述无意鉴别要求保护的主题的关键特征或基本特征，也无意用作确定要求保护的主题的范围的辅助。
附图简述
图1显示了通过选择的患者衍生的异种移植物(PDX)肿瘤中的全转录组(SOLiD)测序确定的CDLN4、CLDN6和CLDN9的相对mRNA表达水平，其中根据在下面表3中列出的缩写表示肿瘤类型；
图2A - 2C显示了CLDN家族成员之间的关联，其中图2A是显示由23种人CLDN基因编码的30种CLDN蛋白之间的相似性的相对程度的树形图；图2B是CLDN4、CLDN6和CLDN9中的细胞外结构域(ECD) 1或ECD2的氨基酸残基的同一性百分比的表格表示；且图2C是包含CLDN4、CLDN6和CLDN9的人、大鼠、小鼠和食蟹猴直系同源物的集合的16种蛋白之间的ECD1环和ECD2环中的氨基酸残基的同一性百分比的表格表示；
图3A - 3C以表格形式提供了示例性的小鼠和人源化抗-CLDN抗体(SEQ ID NO: 21-75，奇数)和hSC27.22、hSC27.108和hSC27.204的变体的轻链(图3A)和重链(图3B)连续可变区氨基酸序列，而图3C显示了这样的示例性的小鼠和人源化的抗-CLDN抗体(SEQ ID NO:20-74，偶数)以及抗体hSC27.22、hSC27.108和hSC27.204的变体的相同轻链和重链可变区的核酸序列；
图4A-4C证实了本发明的某些结合结构域的交叉反应性，其中图4A显示了抗-CLDN结合结构域SC27.1和SC27.22的结合过表达人CLDN4、CLDN6和CLDN9的HEK-293T细胞的能力，图4B显示了抗-CLDN抗体的结合过表达CLDN4、CLDN6和CLDN9的HEK-293T细胞的能力，且图4C用图解释了一种示例性的抗-CLDN抗体对CLDN6和CLDN9的表观结合亲和力，如通过相对于固定数目的表达目标抗原的细胞滴定抗体的量所确定的；
图5提供了与本文中的教导一致的示例性CLDN CAR构建体的示意图；
图6A - 6D描绘了本发明的两种新嵌合抗原受体SCT1-SC27.108和SCT1-SC27.204v2的核酸(图6A和6C)和氨基酸(图6B和6D)序列；
图7提供的示意图解释了用于生产CLDN敏化的淋巴细胞的方法和它们随后用于制备针对CLDN阳性肿瘤细胞的免疫应答的用途；
图8A和8B证实了示例性CLDN CAR在转导的Jurkat细胞上的表达(图8A)和hCLDN在经工程改造的HEK-293T对照细胞上的表达(图8B)，各自使用流式细胞计量术来测量；
图9A和9B描绘了CLDN CAR Jurkat细胞与表达CLDN的对照细胞的比率，其用于计量示例性的CLDN CAR细胞的活性(图9A)以及通过IL-2产生来测量的SCT1-h27.108或SCT1-h27.204v2转导的Jurkat细胞中的免疫应答的诱导(图9B)；
图10证实，可以将来自两个个体的人淋巴细胞工程改造以有效地表达根据本文中的教导的抗-CLDN CAR (SCT1-h27.108或SCT1-h27.204v2)；
图11A和11B提供了经工程改造成表达CLDN6的293T细胞系(图11A)和卵巢癌患者衍生出的异种移植物(“PDX”)细胞系(图11B)的CLDN表面表达概况，如通过流式细胞计量术所证实的；
图12A和12B证实了当暴露于经工程改造的293T细胞(图12A)或PDX肿瘤细胞(图12B)时，包含来自两个个体的宿主细胞的CLDN敏化的淋巴细胞的引起免疫应答(如通过INFγ的诱导所测量的)的能力；
图13A和13B证实了当暴露于经工程改造的293T细胞(图13A)或PDX肿瘤细胞(图13B)时，包含来自两个个体的宿主细胞的CLDN敏化的淋巴细胞的引起免疫应答(如通过TNFα的诱导所测量的)的能力；和
图14A和14B显示了包含来自两个个体的宿主细胞的CLDN敏化的淋巴细胞消除暴露后的经工程改造的293T细胞(图14A)或PDX肿瘤细胞(图14B)的能力。
发明详述
本发明可以以许多不同的形式具体化。本文中公开了本发明的非限制性的示例性实施方案，它们例证了本发明的原理。本文中使用的任何段落标题仅仅用于组织目的，不应解释为限制描述的主题。为了本发明的目的，所有标识序列登录号都可以在NCBI参照序列(RefSeq)数据库和/或NCBI GenBank®档案序列数据库中找到，除非另外指出。
在过继转移免疫疗法中的新近进展已经提供了用于治疗多种瘤形成的有前途的方案和改善患者体验的机会，特别是就实体瘤而言。在这点上，本发明涉及包含细胞外结合或靶向结构域的新嵌合抗原受体(“CAR”)的用途，所述结构域与至少一个封闭蛋白家族成员(“CLDN”)结合或反应。优选地，所述CAR将与CLDN6、CLDN4和/或CLDN9中的至少一种免疫特异性地结合。如在本文中将广泛地讨论的，CLDN (例如，CLDN6)是在许多不同癌症上表达的特别有效的肿瘤标志物，且显著地已经发现与癌症干细胞有关。因而，当将本发明的抗-CLDN结合结构域掺入在淋巴细胞上表达的嵌合抗原受体中时，得到的“CLDN敏化的淋巴细胞”(例如，免疫特异性地识别CLDN的天然杀伤细胞或T细胞)能够有效地引起针对异常CLDN阳性细胞（包括癌症干细胞）的免疫应答。这种有效地消除致瘤“种子”细胞的能力经常在减小肿瘤复发或转移的可能性中是关键性的。为此目的，应当理解，本发明的抗-CLDN CAR T细胞可以与其它治疗剂(包括抗-CLDN抗体药物缀合物)联合使用，或用作护理治疗标准以后的维持方案的组成部分。
更具体地，嵌合抗原受体是人工构建的杂合蛋白或多肽，其含有或包含与信号传导结构域(例如，T-细胞信号传导或T-细胞活化结构域)连接的抗体的抗原结合结构域。利用单克隆抗体的抗原结合性质，CAR具有将这样的敏化的淋巴细胞(例如，T-细胞)特异性和反应性以非-MHC限制的方式重新导向CLDN阳性的靶细胞的能力。非-MHC限制的抗原识别会给表达CAR的T-细胞提供独立于抗原加工而识别CLDN的能力，因而绕过肿瘤逃逸的主要机制。此外，当在T-细胞中表达时，CAR有利地不会与内源性T细胞受体(TCR)α和β链二聚化，所述二聚化可能在应用TCR工程改造技术时发生。
因此，本发明一般地涉及包含CLDN结合结构域的嵌合抗原受体，所述CLDN结合结构域与靶细胞上的CLDN免疫特异性地结合并刺激免疫应答。在优选的实施方案中，所述CAR的CLDN结合结构域可以包含从本文中公开的重链和轻链抗体可变区衍生出的scFv。更具体地，本发明的“抗-CLDN CAR”或简称“CLDN CAR”应当包含掺入细胞外CLDN结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域的嵌合蛋白(参见图5)。通常，将合成或工程改造编码期望的CLDN CAR的核苷酸序列并插入表达载体或系统(例如慢病毒表达载体或系统、逆转录病毒表达载体或系统等)中。在优选的实施方案中，然后将得自患者或供体的淋巴细胞（包括T-淋巴细胞和天然杀伤细胞(“NK细胞”)）暴露于(例如，转导)选择的CLDN CAR载体以提供经工程改造的、表达具有细胞外CLDN结合结构域的CAR蛋白的淋巴细胞(即，“CLDN敏化的淋巴细胞”)。在其它实施方案中，可以将同种异体细胞工程改造成表达公开的CAR以提供CLDN敏化的淋巴细胞。在任选的繁殖以后，可以将这些CLDN敏化的淋巴细胞输入患者中以引起对CLDN阳性的肿瘤细胞的免疫特异性应答(通常参见图7)。在这点上，CLDN敏化的淋巴细胞在与表达CLDN决定簇的靶细胞接触后将被活化。活化敏化的淋巴细胞(例如，T细胞和NK细胞)是指诱导它们的生物学状态的变化，由此使所述细胞表达活化标志物、生产细胞因子、增殖和/或变得对靶细胞具有细胞毒性。所有这些变化可以由主要刺激信号产生，优选地与扩大主要信号的量级的共刺激性信号一起，并在初步刺激以后抑制细胞死亡，从而导致更持久的活化状态并因而导致更高的细胞毒性能力。
进一步理解，除了CLDN结合结构域以外，本发明的CAR将包含细胞内的或细胞质的结构域，其起始主要细胞质信号传导序列(例如，用于通过T-细胞受体复合物起始抗原依赖性的主要活化的序列)。适合的细胞内结构域可以例如源自CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d。在其它优选的实施方案中，本发明的CAR将包含细胞内结构域，其起始次要或共刺激信号。适合的共刺激性结构域可以包含，例如，从CD2、CD4、CD5、CD8α、CD8β、CD28、CD134、CD137、ICOS、CD154、4-1BB和糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体衍生出的细胞内结构域(参见U.S.P.N. US/2014/0242701)。另外，在优选的实施方案中，公开的CAR将包含插入在所述细胞外CLDN结合结构域和所述细胞内信号传导结构域之间的跨膜(和任选地间隔物)结构域。如在下面更详细地讨论的，所述跨膜结构域可以包含，例如，抗体恒定(Fc)区的组成部分、人CD8a或本领域已知的人工生产的间隔物。基本上，将CAR锚定在细胞膜中并允许CLDN结合结构域的有效结合和从细胞内结构域传播适当信号传导的任何氨基酸序列适合本发明。
关于本发明的新颖的CLDN CAR，应当理解，CLDN作为肿瘤靶标的选择在产生有效的免疫应答中是组成性的。更具体地已经发现，CLDN表型决定簇在临床上与多种增殖性病症（包括几类癌症）有关，并且CLDN蛋白及其变体或同种型会提供可以用于治疗相关疾病的有用肿瘤标志物。在这点上，本发明提供了多种嵌合抗原受体，其除了包含任何信号传导组分以外还包含抗-CLDN结合结构域。如在下面更详细地讨论的，公开的CLDN CAR会特别有效地消除致瘤性细胞，且因此可用于治疗和预防某些增殖性病症或其进展或复发。
此外，如在本申请中所述，已经发现，CLDN标志物或决定簇诸如细胞表面CLDN蛋白在治疗上与癌症干细胞(也被称作肿瘤永存细胞)有关，且可以有效地影响以消除或沉默它们。通过使用如本文中公开的CLDN CAR来选择性地减少或消除癌症干细胞的能力是惊人的，因为已知这样的细胞通常耐受许多常规治疗。也就是说，传统的、以及更近的靶向治疗方法的有效性经常受限于抗性癌症干细胞的存在和/或出现，所述抗性癌症干细胞能够甚至在面临不同治疗方法的情况下保全肿瘤生长。此外，由于低或不一致的表达、不能保持与致瘤性细胞有关或不能存在于细胞表面上，与癌症干细胞相关的决定簇经常造成差治疗靶标。与现有技术的教导形成尖锐对比的是，本发明公开的CLDN CAR和相关的方法会有效地克服该固有抗性，以特异性地消除、耗尽、沉默或促进这样的癌症干细胞的分化，由此消除它们的持续或显著地重新诱导潜在肿瘤生长的能力。
因而，特别惊人的是，CLDN CAR诸如本文中公开的那些可以有利地用于治疗和/或预防选择的增殖性(例如，肿瘤)病症或其进展或复发。应当理解，尽管将在下面广泛地讨论本发明的优选实施方案，特别是以示例性信号传导或共刺激性结构域或区域的方式或在包含选定特征的癌症干细胞或肿瘤和它们与公开的CLDN CAR的相互作用的上下文中，本领域技术人员会明白，本发明的范围不受限于这样的示例性实施方案。相反，本发明的最可扩大的实施方案和所附权利要求广泛地和明确地指向包含免疫特异性地缔合或结合至少一种封闭蛋白家族成员的结合结构域的任何嵌合抗原受体和它们在多种CLDN相关的或介导的病症（包括肿瘤或细胞增殖性病症）的治疗和/或预防中的用途，不论任何特定作用机理、CAR构建体或特异性地靶向的肿瘤、细胞的或分子组分。在特别优选的实施方案中，本发明的CAR将免疫特异性地结合或缔合CLDN6。
为此目的，和如在本申请中证实的，已经意外地发现，公开的CLDN CAR可以有效地用于靶向和消除或以其它方式废除增殖性或致瘤性细胞并治疗CLDN相关病症(例如，瘤形成)。本文中使用的“CLDN相关病症”应当认为是指在疾病或病症的进程或病原学中通过CLDN遗传组分或表达(“CLDN决定簇”)的表型畸变标记、诊断、检测或鉴别的任何病症或疾病(包括增殖性病症)。在这点上，CLDN表型畸变或决定簇可以例如包含升高的或降低的CLDN蛋白表达水平(例如，CLDN6)、在某些可定义的细胞群体上异常的CLDN蛋白表达、或在细胞生命周期的不适当时期或阶段的异常的CLDN蛋白表达。当然，应当理解，CLDN的基因型决定簇(例如，mRNA转录水平)的类似表达概况也可以用于分类、检测或治疗CLDN病症。
I. 封闭蛋白(CLDN)生理学
已经发现，CLDN表型决定簇在临床上与多种增殖性病症（包括瘤形成）有关，并且CLDN家族蛋白(包括CLDN6)及其变体或同种型会提供可用于治疗相关疾病的有用肿瘤标志物。在这点上，本发明提供了多种包含经工程改造的抗-CLDN结合或靶向试剂的CLDN CAR构建体，所述抗-CLDN结合或靶向试剂可操作地与一个或多个能够在淋巴细胞中诱导免疫应答的信号传导结构域结合。如在下面更详细地讨论的和在附加的实施例中所述的，公开的抗-CLDN CAR会特别有效地消除致瘤性细胞且因此可用于治疗和预防某些增殖性病症或其进展或复发。
此外，已经发现，CLDN标志物或决定簇诸如细胞表面CLDN蛋白(例如，CLDN6)在治疗上与癌症干细胞(也被称作肿瘤永存细胞)有关，且可以有效地用于消除或沉默它们。通过使用本文中公开的CLDN CAR选择性地减少或消除癌症干细胞的能力是惊人的，因为已知这样的细胞通常耐受许多常规治疗。也就是说，传统的、以及更近的靶向治疗方法的有效性经常受限于抗性癌症干细胞的存在和/或出现，所述抗性癌症干细胞能够甚至在面临这些不同治疗方法的情况下保全肿瘤生长。此外，由于低或不一致的表达、不能保持与致瘤性细胞有关或不能存在于细胞表面上，与癌症干细胞有关的决定簇经常造成差治疗靶标。与现有技术的教导形成尖锐对比的是，本发明公开的CAR和方法会有效地克服该固有抗性，并特异性地消除、排除、沉默或促进这样的癌症干细胞的分化，由此消除它们的持续或重新诱导潜在肿瘤生长的能力。
封闭蛋白是包含紧密连接部(极化细胞类型中的最顶端细胞-细胞粘附连接部，诸如在上皮或内皮细胞片层中发现的那些)的主要结构蛋白的膜内在蛋白。紧密连接部由成网络的蛋白链组成，所述成网络的蛋白链形成在细胞周围的连续密封，以给细胞旁空间中的溶质和水的运输提供物理的、但是可调节的屏障。人类中的蛋白的封闭蛋白家族由大小范围为22-34 kDa的至少23个成员构成。所有封闭蛋白都具有跨膜四蛋白拓扑学，其中两个蛋白末端位于膜的细胞内表面上，从而导致两个细胞外(EC)环EC1和EC2的形成。EC环介导头对头同嗜性的相互作用和对于封闭蛋白的某些组合而言的异嗜性相互作用，其导致紧密连接部的形成。具体的封闭蛋白-封闭蛋白相互作用和封闭蛋白EC序列是离子选择性和紧密连接部强度的一个关键决定因素(例如，参见Nakano等人, 2009, PMID: 19696885)。通常，EC1是约50-60个氨基酸的大小，含有在较大W-X(17-22)-W-X(2)-C-X(8-10)-C基序内的保守二硫键和参与离子通道形成的许多带电荷残基(Turksen和Troy, 2004, PMID:15159449)。EC2小于EC1，为约25个氨基酸。由于它的螺旋-转角-螺旋构象，已经提出，EC2有助于在相对细胞膜上形成封闭蛋白的二聚体或多聚体，尽管在两个环中的突变可能扰乱复合物形成。体外封闭蛋白-封闭蛋白复合物可以在二聚体至六聚体的大小范围内，取决于所涉及的具体封闭蛋白(Krause等人, 2008, PMID: 18036336)。个别封闭蛋白显示一定范围的组织特异性的表达模式，以及在发育上受调节的表达，如通过PCR分析所确定的(Krause等人, 2008, PMID:18036336; Turksen, 2011, PMID:21526417)。
序列分析可以用于构建封闭蛋白家族成员的系统树，从而指示蛋白序列的关系和相关性的程度(图2A)。例如，可以看出，CLDN6和CLDN9蛋白密切相关，鉴于它们的基因在染色体位置16p3.3处的相邻头对头位置，这提示祖先基因复制。这些相似性可以转化为这些家族成员异型地相互作用的能力。类似地，CLDN3和CLDN4蛋白通过序列分析密切相关，并且它们的基因可以在染色体位置7r11.23处串联地发现。某些家族成员之间的EC1或EC2环的高同源性(例如图2B)为开发与各种封闭蛋白家族成员多反应的抗体提供机会，而不同物种的ECD环1和ECD环2之间的实质同源性(图2C)允许开发结合选择的直系同源物的交叉反应性抗体。
CLDN6，也被称作skullin，是一种在发育上受调节的封闭蛋白。代表性的CLDN6蛋白直系同源物包括、但不限于人(NP_067018)、黑猩猩(XP_523276)、恒河猴(NP_001180762)、小鼠(NP_061247)和大鼠(NP_001095834)。在人类中，CLDN6基因由在染色体位置16p13.3处跨越约3.5kBp的2个外显子组成。CLDN6基因座的转录产生成熟的1.4 kB mRNA转录物(NM_021195)，其编码219氨基酸蛋白(NP_061247)。CLDN6在献身于上皮命运的ES细胞衍生物中(Turksen和Troy, 2001, PMID: 11668606)、在周皮中(Morita等人, 2002,PMID: 12060405)和在表皮的上基部水平中(Turkson和Troy, 2002, PMID: 11923212)表达。它也在正在发育的小鼠肾脏中表达(Abuazza等人, 2006, PMID: 16774906)，尽管在成体肾脏中未检测到表达(Reyes等人, 2002, PMID: 12110008)。CLDN6也与CLDN1和CLDN9一起是丙型肝炎病毒的共受体(Zheng等人, 2007, PMID: 17804490)。
CLDN9是与CLDN6最密切相关的家族成员。代表性的CLDN9蛋白直系同源物包括、但不限于人(NP_066192)、黑猩猩(XP_003314989)、恒河猴(NP_001180758)、小鼠(NP_064689)和大鼠(NP_001011889)。在人类中，CLDN9基因由在染色体基因座16p13.3处跨越约2.1kBp的单一外显子组成。无内含子的CLDN9基因座的转录产生2.1 kB mRNA转录物(NM_020982)，其编码217氨基酸蛋白(NP_0066192)。CLDN9在内耳(Kitarjiri等人, 2004, PMID:14698084; Nankano等人, 2009, PMID: 19696885)、角膜(Ban等人, 2003, PMID:12742348)、肝脏(Zheng等人, 2007, PMID:17804490)和正在发育的肾脏(Abuazza等人, 2006, PMID:16774906)的不同结构中表达。与其在耳蜗中的表达一致，表达具有错义突变的CLDN9蛋白的动物表现出听觉缺陷，可能是由于改变的细胞旁K+渗透性，随之扰动对于参与声音检测的毛细胞的去极化而言关键的离子电流。CLDN9在内耳的细胞中的表达特别定位于由其它封闭蛋白形成的更顶端紧密连接束下方的子结构域，从而指示并非正常组织中的所有封闭蛋白都存在于最顶端和可接近的紧密连接部中(Nankano等人, 2009, PMID:19696885)。与耳蜗中的结果相比，表达错义CLDN9的小鼠没有表现出肝或肾缺陷的体征(Nankano等人, 2009, PMID: 19696885)。
CLDN4也被称作产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）肠毒素受体，这是由于它与该毒素的高亲和力结合，所述毒素引起食物中毒和其它胃肠疾病。代表性的CLDN4蛋白直系同源物包括、但不限于人(NP_001296)、黑猩猩(XP_519142)、恒河猴(NP_001181493)、小鼠(NP_034033)和大鼠(NP_001012022)。在人类中，无内含子的CLDN4基因在染色体位置17q11.23处跨越约1.82kBp。CLDN4基因座的转录产生1.82 kB mRNA转录物(NM_001305)，其编码209氨基酸蛋白(NP_001296)。与CLDN4的结合由胃肠病原体产生的毒素的能力一致，可以在整个胃肠道中以及在前列腺、膀胱、乳房和肺中检测到CDLN4表达(Rahner等人, 2001,PMID:11159882; Tamagawa等人, 2003, PMID:12861044; Wang等人, 2003, PMID:12600828; Nichols等人, 2004, PMID:14983936)。
尽管封闭蛋白在正常组织的功能和体内稳态中是重要的，肿瘤细胞频繁表现出异常的紧密连接功能。这可能与封闭蛋白的失调表达和/或定位相关，所述封闭蛋白的失调表达和/或定位是肿瘤细胞的去分化或要求迅速生长的癌组织在具有异常血管形成的肿瘤块内有效地吸收营养物的结果(Morin, 2005, PMID: 16266975)。各个封闭蛋白家族成员可以在某些癌症类型中上调，但是在其它癌症类型中下调。例如，CLDN3和CLDN4表达在某些胰腺癌、乳腺癌和卵巢癌中升高，但是可以在其它乳腺(例如，“封闭蛋白-低”)癌中更低。封闭蛋白可以是CAR的特别好的靶标，因为已知封闭蛋白经历胞吞作用，一些封闭蛋白的周转时间相对于其它膜蛋白是短的(Van Itallie等人, 2004, PMID: 15366421)，封闭蛋白表达在癌细胞中失调，且肿瘤细胞之间的紧密连接结构在癌细胞中被破坏。这些特性可以为活化的淋巴细胞结合肿瘤组织中（但是不在正常组织中）的封闭蛋白提供更多机会。尽管对各种封闭蛋白特异性的结合结构域可以是有用的，但是也可能多反应性的封闭蛋白CAR将更可能促进净荷向更广患者群体的递送。具体地，多反应性的封闭蛋白CAR可以允许由于较高聚集抗原密度而更有效地靶向表达多种封闭蛋白的细胞，降低具有低水平的任何单一封闭蛋白的抗原表达的肿瘤细胞的逃逸的可能性，并且如下面表达实施例中所见，扩展单一CLDN CAR的治疗适应症的数目。
II. 癌症干细胞
如上面提及的，已经令人惊讶地发现，异常的CLDN表达(遗传型和/或表型)与多种致瘤性细胞亚群有关。在这方面，本发明提供了CLDN CAR介导的治疗方案，其对于靶向这类细胞(例如，癌症干细胞)而言可能是特别有用的，由此促进肿瘤病症的治疗、控制或预防。因而，在优选的实施方案中，公开的CLDN CAR可以有利地用于根据本教导降低肿瘤起始细胞频率并由此促进增殖性病症的治疗或控制。
根据当前模型，肿瘤包含非致瘤性细胞和致瘤性细胞。非致瘤性细胞不具有自我更新的能力，并且不能可再现地形成肿瘤（即使当以过量细胞数目移植进免疫受损的小鼠中时）。占肿瘤的细胞群体的0.1-40％(更通常0.1-10%)的致瘤性细胞，在本文中也被称作”肿瘤起始细胞”(TIC)，具有形成肿瘤的能力。致瘤性细胞包括肿瘤永存细胞(TPC)（可互换地称为癌症干细胞(CSC)）和肿瘤祖细胞(Tprog)。
CSC，如支持在正常组织中的细胞层次的正常干细胞一样，能够无限地自我复制，同时维持多谱系分化的能力。CSC能够生成致瘤性后代和非致瘤性后代，并且能够完全重演亲本肿瘤的异质细胞组成（如通过将少量分离的CSC连续分离和移植入免疫受损的小鼠中所证实的）。
Tprog，如CSC一样，具有刺激原代移植物中的肿瘤生长的能力。但是，不同于CSC，它们不能重演亲代肿瘤的细胞异质性，并且在随后的移植物中重新起始肿瘤发生的效率较低，因为Tprog通常仅能够有限数目的细胞分裂（如通过将少量高度纯化的Tprog连续移植进免疫受损的小鼠中所证实的）。Tprog可以进一步被分为早期Tprog和晚期Tprog，其可以通过表型(例如，细胞表面标志物)和它们的重演肿瘤细胞体系结构的不同能力来区分。尽管都不能重演肿瘤至与CSC相同的程度，早期Tprog具有比晚期Tprog更大的重演亲代肿瘤的特征的能力。尽管存在上述区别，已经证实，一些Tprog群体，在稀有情况下，可以获得通常归因于CSC的自我更新能力，并且可以自身变为CSC。
CSC表现出比以下更高的致肿瘤性且相对更静止：(i)Tprog(早期和晚期Tprog)；和(ii)非致瘤性细胞，诸如肿瘤浸润细胞，例如，成纤维细胞/间质、内皮细胞和造血细胞，它们可以衍生自CSC且通常构成肿瘤块。鉴于常规疗法和方案在很大程度上已经被设计成减小肿瘤且攻击快速增殖的细胞，CSC比更快速增殖的Tprog和其它大量肿瘤细胞群体诸如非致瘤性细胞更耐受常规疗法和方案。可以使得CSC相对更化学耐受常规疗法的其它特征是增加的多药抗性转运蛋白的表达、增强的DNA修复机制和抗细胞凋亡的基因表达。CSC中的这些特性构成确保具有晚期瘤形成的大部分患者的长期利益的标准肿瘤学治疗方案的失败的关键原因，因为标准化学疗法不靶向实际刺激继续肿瘤生长和复发的CSC。
已经令人惊讶地发现，CLDN表达(包括CLDN6表达)与多种致瘤性细胞群体相关。本发明提供了CLDN CAR，其可以特别用于靶向致瘤性细胞，并且可以用于沉默、敏化、中和、降低其频率、阻断、废除、干扰、降低、阻碍、制止、控制、排除、减轻、介导、减少、重编、消除或以其它方式抑制(统称为“抑制”)致瘤性细胞，由此促进增殖性病症(例如癌症)的治疗、控制和/或预防。有利地，可以选择本发明的新颖的CLDN CAR，使得它们优选地在施用给受试者后降低致瘤性细胞的频率或致肿瘤性，无论CLDN决定簇的形式(例如，同种型a或b)。致瘤性细胞频率的降低可以作为以下的结果而发生：(i)致瘤性细胞的抑制或消除；(ii)控制致瘤性细胞的生长、扩增或复发；(iii)中断致瘤性细胞的起始、繁殖、维持或增殖；或(iv)通过以其它方式阻碍致瘤性细胞的存活、再生和/或转移。在某些实施方案中，致瘤性细胞的抑制可以作为一种或多种生理学途径的变化的结果而发生。无论是通过抑制致瘤性细胞、改变它们的潜能(例如，通过诱导的分化或小生境破坏)还是以其它方式干扰致瘤性细胞的影响肿瘤环境或其它细胞的能力，途径中的变化允许通过抑制肿瘤发生、肿瘤维持和/或转移和复发而更有效地治疗CLDN相关病症。
可用于评估致瘤性细胞的频率的降低的方法包括、但不限于细胞计数或免疫组织化学分析，优选地通过体外或体内有限稀释分析(Dylla等人. 2008, PMID: PMC2413402和Hoey等人. 2009, PMID: 19664991)。
流式细胞计量术和免疫组织化学也可以用于确定致瘤性细胞频率。两种技术均采用一种或多种抗体或试剂，它们结合本领域公认的已知致瘤性细胞富集的细胞表面蛋白或标志物(参见WO 2012/031280)。如本领域已知的，流式细胞计量术(例如，荧光激活的细胞分选(FACS))也可以用于表征、分离、纯化、富集或分选多种细胞群体，包括致瘤性细胞。流式细胞计量术通过使在其中悬浮了混合细胞群体的流体流传递穿过电子检测设备来测量致瘤性细胞水平，所述电子检测设备能够测量高达每秒数千个颗粒的物理和/或化学特征。免疫组织化学会提供额外信息，因为它能够通过用结合致瘤性细胞标志物的经标记的抗体或试剂将组织样品染色而在原位(例如，在组织切片中)显现致瘤性细胞。
下面列出了已经与CSC群体相关、并在某些情况下已经用于分离或表征CSC的标志物：ABCA1、ABCA3、ABCG2、ADCY9、ADORA2A、AFP、AXIN1、B7H3、BCL9、Bmi-1、BMP-4、C20orf52、C4.4A、羧肽酶M、CAV1、CAV2、CD105、CD133、CD14、CD16、CD166、CD16a、CD16b、CD2、CD20、CD24、CD29、CD3、CD31、CD324、CD325、CD34、CD38、CD44、CD45、CD46、CD49b、CD49f、CD56、CD64、CD74、CD9、CD90、CEACAM6、CELSR1、CPD、CRIM1、CX3CL1、CXCR4、DAF、饰胶蛋白聚糖、easyh1、easyh2、EDG3、eed、EGFR、ENPP1、EPCAM、EPHA1、EPHA2、FLJ10052、FLVCR、FZD1、FZD10、FZD2、FZD3、FZD4、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、GD2、GJA1、GLI1、GLI2、GPNMB、GPR54、GPRC5B、IL1R1、IL1RAP、JAM3、Lgr5、Lgr6、LRP3、LY6E、MCP、mf2、mllt3、MPZL1、MUC1、MUC16、MYC、N33、Nanog、NB84、巢蛋白、NID2、NMA、NPC1、制癌蛋白M、OCT4、OPN3、PCDH7、PCDHA10、PCDHB2、PPAP2C、PTPN3、PTS、RARRES1、SEMA4B、SLC19A2、SLC1A1、SLC39A1、SLC4A11、SLC6A14、SLC7A8、smarcA3、smarcD3、smarcE1、smarcA5、Sox1、STAT3、STEAP、TCF4、TEM8、TGFBR3、TMEPAI、TMPRSS4、转铁蛋白受体、TrkA、WNT10B、WNT16、WNT2、WNT2B、WNT3、WNT5A、YY1和β-联蛋白。参见，例如，Schulenburg等人, 2010, PMID: 20185329、U.S.P.N. 7,632,678和U.S.P.N. 2007/0292414、2008/0175870、2010/0275280、2010/0162416和2011/0020221。
类似地，与某些肿瘤类型的CSC相关的细胞表面表型的非限制性例子包括CD44高CD24低、ALDH+、CD133+、CD123+、CD34+CD38−、CD44+CD24−、CD46高CD324+CD66c−、CD46高CD324+CD66c+、CD133+CD34+CD10−CD19−、CD138−CD34−CD19+、CD133+RC2+、CD44+α2β1 高CD133+、CD44+CD24+ESA+、CD271+、ABCB5+以及本领域中已知的其它CSC表面表型。参见，例如，Schulenburg等人, 2010, 出处同上，Visvader等人, 2008, PMID: 18784658和U.S.P.N. 2008/0138313。就本发明而言特别重要的是包含CD46高CD324+表型的CSC制备物。
“阳性”、“低”和“阴性”表达水平当它们适用于标志物或标志物表型时如下定义。具有阴性表达(即“-”)的细胞在本文中定义为这样的细胞:其表达小于或等于在荧光发射的额外通道中在针对其它目标蛋白标记的完全抗体染色混合液存在下在荧光通道中用同种型对照抗体观察到的表达的95%。本领域技术人员会明白，用于定义阴性事件的该程序被称为“荧光减一”或“FMO”染色。具有大于使用上述FMO染色程序用同种型对照抗体观察到的表达的95%的表达的细胞在本文中被定义为“阳性”(即”+”)。如本文所定义，存在被广泛定义为“阳性”的多种细胞群体。如果抗原的平均观察表达高于使用如上所述用同种型对照抗体的FMO染色确定的95%，则细胞被定义为阳性的。如果平均观察表达高于通过FMO染色确定的95%并且是在95%的一个标准差内，则阳性细胞可以被称为具有低表达(即“低”)的细胞。可选地，如果平均观察表达高于通过FMO染色确定的95%并且大于95%以上的一个标准差，则阳性细胞可以被称为具有高表达(即“高”)的细胞。在其它实施方案中，99%可以优选地用作阴性和阳性FMO染色之间的分界点，并且在特别优选的实施方案中，所述百分位数可以大于99％。
CD46高CD324+标志物表型和上面刚刚例举的那些可以与标准流式细胞计数分析和细胞分选技术结合使用，以表征、分离、纯化或富集TIC和/或TPC细胞或细胞群体用于进一步分析。
因此使用上述的技术和标志物可以确定本发明的抗体降低致瘤性细胞的频率的能力。在某些情况下，CLDN CAR可以使致瘤性细胞的频率降低10%、15%、20%、25%、30%或甚至35%。在其它实施方案中，致瘤性细胞的频率的降低可以是40%、45%、50%、55%、60%或65%的等级。在某些实施方案中，公开的过继免疫疗法可以使致瘤性细胞的频率降低70%、75%、80%、85%、90%或甚至95%。应当理解，致瘤性细胞的频率的任何降低可能导致瘤形成的致肿瘤性、持续性、复发和侵袭性的相应降低。
III. 嵌合抗原受体疗法
癌症免疫疗法目标在于利用人免疫系统通过细胞毒性的淋巴细胞(包含T-淋巴细胞和NK细胞)的活性根除肿瘤的能力。从研究推断出细胞毒性的淋巴细胞介导的免疫应答可以导致残余肿瘤细胞的根除，所述研究对比了已经经历不同类型移植的白血病患者中的复发率：相对于接受同系移植物的那些患者，对于接受除去非-T-细胞的骨髓（在来自HLA相同同胞的同种异体移植物中）的患者观察到复发率的显著下降，并且该效应可以归因于除了移植物抗宿主病应答以外的其它T-细胞介导的作用。但是，抗肿瘤T-细胞的临床上有效的过继转移已经受到以下事实阻碍：大多数肿瘤抗原是自体抗原，且因此是差免疫原性的。带有识别自体抗原的高亲和力T-细胞受体(TCR)的T-细胞的负选择在发育过程中发生在胸腺中，从而导致具有肿瘤/自体抗原的低亲合力识别的T-细胞的中心耐受性和选择。这些较低亲合力T-细胞然后具有抗肿瘤T-细胞功能的随后弱活化和有限持久性。遗传工程改造的细胞毒性的淋巴细胞正在被用在两个主要方案中以防止通向强抗肿瘤T-细胞活化的该耐受性/低亲合力阻断。在第一个方案中，使用分子基因工程技术将亲和力增强的识别肿瘤抗原的TCR人工引入T-细胞中。该方案受限于几个因素，包括在接近野生型TCR表达的水平表达亲和力增强的TCR中的困难，当将TCR基因的另外集合引入天然T-细胞中时产生TCR链错配的潜力，和肿瘤细胞通过下调MHC分子避免MHC限制的TCR识别的能力。
通向细胞毒性的淋巴细胞的基因工程的第二个方案是，将人工的非-MHC限制的嵌合抗原受体(CAR)引入各种淋巴细胞群体中。这最典型地如下实现：收获大量淋巴细胞群体，其在用编码CAR分子的逆转录病毒或慢病毒载体转导之前离体培养、刺激和扩增。象天然TCR一样，CAR必须具有特异性地和选择性地识别靶抗原的能力，然后在结合该抗原后，将适当信号转导至淋巴细胞以刺激持久的抗肿瘤免疫学应答所需的效应子功能和/或细胞因子产生。CAR修饰的T-细胞的概念源自这样的研究，其中观察到，当独立于TCR:CD3蛋白复合物表达时，特别当CD3ζITAM结构域与异源细胞外结构域和跨膜结构域融合时，CD3ζ链的细胞质ITAM结构域可以活化T-细胞。将第一代CD4-CD3ζCAR转导进T-细胞中并在HIV患者中测试。随访研究表明这些经工程改造的CAR-T细胞在输注以后持续多达十年，从而指示经工程改造的细胞的某种增殖和持久性。随后，通过在单个重组分子中将scFv结构域和跨膜结构域与CD3ζ链的细胞质结构域组合来构建抗肿瘤CAR，并且可以证实这些经工程改造的CAR-T细胞的抗原识别被重新导向以反映scFv的特异性(U.S.P.N. 7,446,179)。这些第一代scFv-指导的CAR-T细胞能够充当非-MHC限制的细胞毒性的淋巴细胞，从而识别天然肿瘤抗原而不是经过加工的肽，并促进表达天然抗原的肿瘤细胞的裂解。
尽管许多第一代scFv-指导的CAR-T细胞表现出预期的体外效应，在癌症患者中的体内研究由于它们缺乏抗肿瘤作用和缺乏CAR-T持久性是令人失望的。随着T-细胞生物学已经变得更好理解，已经变清楚的是，T-细胞群体包含存活短的效应细胞、存活较长的中心和周围记忆T-细胞、以及与其它T-细胞亚群相互作用的调节性T-细胞(Treg)。这些群体的功能的中心是，共刺激信号在通过细胞因子产生而诱导静止原初或记忆T-细胞的持久活化中的作用，以及共刺激在阻止无反应性（一种T-细胞无应答性的状态，其可能潜在地源自在没有共刺激性信号存在下的排它TCR:CD3ζ信号传导）中提供的作用。具体地，来自蛋白的各种共刺激性信号诸如CD28、OX40、CD27、CD137/4-1BB、CD2、CD3、CD11a/CD18、CD54和CD58可能对于细胞因子产生、增殖和克隆繁殖的最佳水平以及细胞裂解活性的诱导而言是有益的。在这些中，CD28可能是最佳地理解的共刺激性信号，且CD28共刺激已经被证实会增加抗原活化的CAR-T细胞的细胞因子释放。类似地，通过CD137/4-1BB进行的共刺激性信号传导已经被证实会增强天然T-细胞增殖，且可以促进CAR-T体内更长持久性。因此，已经设计了所谓的第二代CAR构建体，其中已经将来自这些分子的各种另外信号传导结构域串联地添加至CD3ζ结构域(U.S.P.N. 5,686,281和8,399,645)。据报道还正在开发所谓的第三代CAR分子，其包括三个或更多个信号传导结构域(例如，CD3ζ和两个共刺激性信号传导结构域)。
已经证实几种针对CD19抗原的第二代CAR-T细胞在具有血液恶性肿瘤的患者中具有强烈的抗肿瘤作用以及实质的持久性。CAR-T疗法的一个重要边界是在实体瘤治疗中的应用。就本发明而言，已经令人惊讶地发现，抗-CLDN结合结构域可以有利地与前述嵌合抗原受体和过继免疫疗法中的每一种结合以提供克服一些前述限制的有效抗肿瘤治疗。
IV. 嵌合抗原受体
如上面提及的，本发明的CAR通常包含含有CLDN结合结构域的细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，所述细胞内信号传导结构域活化某些淋巴细胞并产生针对CLDN阳性的肿瘤细胞的免疫应答。更一般而言，公开的嵌合抗原受体包含各自如宿主细胞壁所定义的外结构域和内结构域，。在这点上，术语“外结构域”或“细胞外结构域”将表示CAR多肽在细胞外部或膜脂质双层外面的部分，其可以包含抗原识别(例如，CLDN)结合结构域、任选的铰链区和在物理上跨膜的氨基酸残基之外的任意间隔结构域。相反，术语“内结构域”或“细胞内结构域”将表示CAR多肽在细胞内部或膜脂质双层里面的部分，其可以包含在物理上跨膜的氨基酸残基之内的任意间隔结构域以及细胞内信号传导结构域。
A. CLDN结合结构域
1. 结合结构域结构
如在本发明中广泛地讨论的，包含抗-CLDN结合结构域的嵌合抗原受体可以有利地用于提供多种增殖性病症的靶向疗法。应当理解，适合的抗-CLDN结合结构域可以包含抗-CLDN抗体或其免疫反应片段。在某些实施方案中，完整抗体或包含fc或恒定结构域的至少一些部分的抗体包含CLDN结合结构域(参见，例如，U.S.P.N. 2015/0139943)。在特别优选的实施方案中，和如在随其附带的实施例中证实的，抗-CLDN结合结构域可以包含从结合CLDN的单克隆抗体(包括人源化的或CDR移植的单克隆抗体)衍生出的scFv。在下面立即更详细地讨论可以用于提供符合本发明的CLDN结合结构域的适合抗体。为了本申请的目的，术语“结合结构域”和“抗体”或“抗体片段”可以互换使用，除非另外根据上下文指出。
抗体及其变体和衍生物(包括公认的命名法和编号系统)已经广泛地描述在例如Abbas等人(2010), Cellular and Molecular Immunology (第6版), W.B. SaundersCompany；或Murphey等人(2011), Janeway’s Immunobiology (第8版), Garland Science中。
“完整抗体”通常包含Y-形四聚体蛋白，其包含通过共价二硫键和非共价相互作用保持在一起的两个重(H)和两个轻(L)多肽链。每个轻链由一个可变结构域(VL)和一个恒定结构域(CL)组成。每个重链包含一个可变结构域(VH)和一个恒定区，其在IgG、IgA和IgD抗体的情况下，包含三个被称作CH1、CH2和CH3的结构域(IgM和IgE具有第四个结构域，CH4)。在IgG、IgA和IgD类别中，CH1和CH2结构域被柔性铰链区隔开，所述柔性铰链区是可变长度(在不同的IgG亚类中，约10个至约60个氨基酸)的富含脯氨酸和半胱氨酸的区段。在轻链和重链中的可变结构域通过约12个或更多个氨基酸的“J”区域连接至恒定结构域，且重链也具有约10个另外氨基酸的“D”区域。每类抗体还包含由成对的半胱氨酸残基形成的链间和链内二硫键。
如上面提及的，术语“抗体”应当一般地解释，且包括多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体和灵长类源化抗体、CDR移植抗体、人抗体、重组地生产的抗体、细胞内抗体、多特异性抗体、双特异性抗体、单价抗体、多价抗体、抗-独特型抗体、合成抗体(包括其突变蛋白和变体)、免疫特异性抗体片段(诸如Fd、Fab、F(ab')2、F(ab')片段)、单链片段(例如scFv和ScFvFc)；及其衍生物，包括Fc融合体和其它修饰，和任何其它免疫反应性的免疫球蛋白分子，只要它表现出与CLDN决定簇的优先缔合或结合。此外，除非由上下文约束另外指出，否则该术语还包含所有抗体类别(即IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)和所有亚类(即，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)及其所有免疫反应片段。对应于不同抗体类别的重链恒定结构域通常分别由相应小写希腊字母α、δ、ε、γ和表示。来自任何脊椎动物物种的抗体的轻链可以基于其恒定结构域的氨基酸序列而指定为两种明显不同的类型(称为κ和λ)之一。简言之，任何这样的结合或缔合人CLDN的抗体适合本文中的教导，且可以用作公开的嵌合抗原受体的结合结构域组分。
抗体的可变结构域显示一种抗体与另一种抗体的氨基酸组成的显著变化，且主要负责抗原识别和结合。每个轻链/重链对的可变区形成抗体结合位点，使得完整IgG抗体具有两个结合位点(即其为二价的)。VH和VL结构域包含三个具有极端变异性的区域，它们被称为高变区，或更通常被称为互补性决定区(CDR)，其由四个较低可变性的区域(被称为框架区(FR))构架和分离。VH和VL区域之间的非共价缔合形成Fv片段(对于“可变片段”)，其含有抗体的两个抗原结合位点之一。特别重要的是，scFv构建体(对于单链可变片段)，其可以通过下面更广泛地讨论的基因工程得到，通过肽接头连接VH和VL区域(优选地来自相同抗体)。取决于期望的构象，应当理解，所述肽接头可以具有不同长度。
如本文中使用的，除非另外指出，否则氨基酸向每个结构域、框架区和CDR的分配可以根据以下文献提供的编号方案之一来进行：Kabat等人(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest (第5版), US Dept. of Health and HumanServices, PHS, NIH, NIH公开号91-3242;Chothia等人, 1987, PMID: 3681981;Chothia等人, 1989, PMID: 2687698; MacCallum等人, 1996, PMID: 8876650；或Dubel,编(2007) Handbook of Therapeutic Antibodies, 第3版, Wily-VCH Verlag GmbH andCo or AbM (Oxford Molecular/MSI Pharmacopia)。在下面阐述了包含由Kabat、Chothia、MacCallum (也被称作Contact)和AbM方案定义的CDR的氨基酸残基(如得自Abysis网站数据库(参见下文))。
表1
Kabat Chothia MacCallum AbM
VH CDR1 31-35 26-32 30-35 26-35
VH CDR2 50-65 52-56 47-58 50-58
VH CDR3 95-102 95-102 93-101 95-102
VL CDR1 24-34 24-34 30-36 24-34
VL CDR2 50-56 50-56 46-55 50-56
VL CDR3 89-97 89-97 89-96 89-97
根据在本领域中已开发的一般规则(如上所述，例如，Kabat编号系统)，或通过将序列与已知可变区的数据库比对，可以鉴别抗体序列中的可变区和CDR。用于鉴别这些区域的方法描述于Kontermann和Dubel, 编, Antibody Engineering, Springer, New York,NY, 2001和Dinarello等人, Current Protocols in Immunology, John Wiley and SonsInc., Hoboken, NJ, 2000。抗体序列的示例性数据库描述于“Abysis”网站www.bioinf.org.uk/abs (由A.C. Martin in the Department of Biochemistry &Molecular Biology University College London, London, England维护)和VBASE2网站www.vbase2.org (如描述于Retter等人, Nucl. Acids Res., 33 (数据库发行): D671 -D674 (2005))中，且可通过前述网站获得。优选地，使用Abysis数据库分析抗体序列，所述Abysis数据库将来自Kabat、IMGT和Protein Data Bank (PDB)的序列数据与来自PDB的结构数据整合。参见Dr. Andrew C. R. Martin的书章节Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody可变Domains. 见: Antibody Engineering Lab Manual (编著:Duebel, S. 和Kontermann, R., Springer-Verlag, Heidelberg, ISBN-13: 978-3540413547，也可在网站bioinforg.uk/abs上得到)。Abysis数据库网站还包括已开发用于鉴别可根据本文中的教导使用的CDR的一般规则。除非另有说明，否则本文中阐述的所有CDR都根据Abysis数据库网站按照Kabat等人衍生出。
对于在本发明中讨论的重链恒定区氨基酸位置，编号是根据在Edelman等人,1969, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63(1): 78-85中首次描述的Eu索引，其描述据报道为第一个测序的人IgG1的骨髓瘤蛋白Eu的氨基酸序列。Edelman的EU索引也描述于Kabat等 人, 1991 (出处同上)中。因此，术语“如Kabat中所述的EU索引”或“Kabat的EU索引”或“EU索引”在重链的上下文中表示基于如Kabat等人, 1991 (出处同上)中描述的Edelman等人的人IgG1 Eu抗体的残基编号系统。用于轻链恒定区氨基酸序列的编号系统类似地描述于Kabat等人, (出处同上)中。在下面立即描述适合本发明的一个示例性的κ轻链恒定区氨基酸序列：
。
类似地，在下面立即描述的是适合本发明的一个示例性的IgG1重链恒定区氨基酸序列：
。
使用标准分子生物学技术，可以将公开的恒定区序列或其变型或衍生物与公开的重链和轻链可变区可操作地结合以提供抗体(全长抗体或包含部分fc区域的免疫反应片段)，其可以原样使用或并入本发明的CLDN CAR中(优选地作为跨膜结构域的部分)。
更一般而言，可以从特异性地识别或结合至少一个CLDN决定簇(例如，CLDN4、CLDN6、CLDN9)或它们的某种组合的任何抗体制备适合CAR的抗-CLDN结合结构域组分。本文中使用的“决定簇”或“靶标”意指任何可检测的特性、性质、标志物或因子，其可与特定细胞、细胞群体或组织可鉴别地关联或特异性地见于特定细胞、细胞群体或组织内部或表面。决定簇或靶标在性质上可以是形态的、功能的或生物化学的，且优选为表型的。在某些优选实施方案中，决定簇是由特定细胞类型或在某些条件下(例如在特定生境中在细胞周期或细胞的特定点中)由细胞差异地表达(过表达或低表达)的蛋白。为了本发明的目的，决定簇优选地在异常癌细胞上差异地表达，且可以包含CLDN家族成员蛋白，或它的剪接变体、同种型、同系物或家族成员，或其特定结构域、区域或表位中的任一种。“抗原”、“免疫原性决定簇”、“抗原决定簇”或“免疫原”意指当引入免疫活性动物中时可以刺激免疫应答且被从所述免疫应答产生的抗体识别的任何蛋白或其任何片段、区域或结构域。本文中预见到的CLDN决定簇的存在或不存在可以用于鉴别细胞、细胞亚群或组织(例如，肿瘤、致瘤性细胞或CSC)。
2. 抗体制备和生产
使用本领域已知的多种方法可以生产适合本发明的抗体，并且可以进一步修饰任何这样的抗体以提供本发明的抗-CLDN嵌合抗原受体的结合结构域。
a. 在宿主动物中制备多克隆抗体
在各种宿主动物中生产多克隆抗体是本领域众所周知的(参见例如，Harlow和Lane(编) (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press；和Harlow等人(1989)Antibodies, NY, Cold Spring Harbor Press)。为了制备多克隆抗体，用抗原性蛋白或包含抗原性蛋白的细胞或制备物免疫免疫活性的动物(例如，小鼠、大鼠、兔、山羊、非人灵长类动物等)。在一段时间之后，通过使动物出血或处死动物而获得含有多克隆抗体的血清。血清可以以得自动物的形式使用，或者可以部分地或完全地纯化所述抗体以提供免疫球蛋白级分或分离的抗体制备物。
任何形式的抗原或含有抗原的细胞或制备物可以用于制备对决定簇特异性的抗体。术语“抗原”在广义上使用，并且可以包含所选靶标的任何免疫原性片段或决定簇，包括单个表位、多个表位、单个或多个结构域或整个细胞外结构域(ECD)。所述抗原可以是分离的全长蛋白、细胞表面蛋白(例如，用在其表面上表达所述抗原的至少一部分的细胞免疫)或可溶性蛋白(例如，用仅具有所述蛋白的ECD部分免疫)。所述抗原可以在遗传修饰的细胞中产生。任何上述抗原可以单独使用，或与本领域已知的一种或多种免疫原性增强佐剂组合使用。编码抗原的DNA可以是基因组的或非基因组的(例如，cDNA)，并且可以编码足以引发免疫原性应答的ECD的至少一部分。任何载体都可以用于转化在其中表达所述抗原的细胞，包括、但不限于腺病毒载体、慢病毒载体、质粒和非病毒载体，诸如阳离子脂质。
b. 单克隆抗体
在选择的实施方案中，本发明涵盖单克隆抗体的用途。术语“单克隆抗体”或“mAb”表示得自基本上均质抗体的群体的抗体，即构成该群体的各个抗体除了可少量存在的可能突变(例如，天然存在的突变)以外是相同的。
使用多种技术，包括杂交瘤技术、重组技术、噬菌体展示技术、转基因动物(例如，XenoMouse®)或它们的某种组合，可以制备单克隆抗体。例如，在优选的实施方案中，使用杂交瘤技术和生化技术和基因工程技术，诸如在以下文献中更详细地描述的那些，可以生产单克隆抗体：An, Zhigiang (编) Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic, John Wiley and Sons, 2009年第1版; Shire等人(编) Current Trends in Monoclonal Antibody Development and Manufacturing, Springer Science +Business Media LLC, 2010年第1版; Harlow等人,Antibodies: A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988年第2版; Hammerling, 等人,见：Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)。在制备许多特异性地结合决定簇的单克隆抗体以后，通过多种筛选方法可以选择特别合适的抗体，所述筛选方法基于例如对决定簇的亲和力或内化速度。在特别优选的实施方案中，如本文中所述生产的单克隆抗体可以用作“源”抗体，并进一步修饰以提供可以与公开的CAR结合的有效CLDN结合结构域。例如可以操作所述源抗体以提供scFv或其它片段，改善对靶标的亲和力，改善它在细胞培养物中的生产，降低体内免疫原性，制备多特异性的构建体等。在下面和在附加的实施例中阐述了单克隆抗体生产和筛选的更详细描述。
c. 人抗体
适合本发明的抗体可以包含全人抗体。术语“人抗体”表示这样的抗体(优选单克隆抗体)：其氨基酸序列对应于由人产生的和/或已经使用下述用于制备人抗体的技术中的任一种制备的抗体的氨基酸序列。
在一个实施方案中，通过筛选使用噬菌体展示制备的重组组合抗体文库，可以分离重组人抗体。在一个实施方案中，所述文库是scFv噬菌体或酵母展示文库，其使用使用人VL和VH cDNA产生，所述使用人VL和VH cDNA从分离自B细胞的mRNA制备。
通过将人免疫球蛋白基因座引入转基因动物（例如，小鼠，其中内源性免疫球蛋白基因已经被部分地或完全地灭活和人免疫球蛋白基因已经被引入）中，也可以制备人抗体。攻击后，观察到抗体产生，其在所有方面紧密地类似于在人类中看到的抗体产生，所述方面包括基因重排、组装和全人抗体组成成分。该方案描述在，例如，U.S.P.N. 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016,和U.S.P.N. 6,075,181和6,150,584（关于XenoMouse®技术）；和Lonberg和Huszar, 1995, PMID: 7494109)。可选地，通过使生产针对靶抗原的抗体的人B淋巴细胞(这样的B淋巴细胞可以从遭受肿瘤病症的个体回收，或可以已经在体外免疫)永生化，可以制备人抗体。参见，例如，Cole等人,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, 第77页(1985); Boerner等人, 1991,PMID: 2051030；和U.S.P.N. 5,750,373。与其它单克隆抗体一样，这样的人抗体可以用作源抗体。
d. 抗体生产和工程改造
使用得自生产抗体的细胞的遗传物质和重组技术，可以生产或修饰抗体及其片段(参见，例如，Berger和Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology第152卷Academic Press, Inc., San Diego, CA; Sambrook和Russell (编)(2000) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第3版), NY, Cold Spring HarborLaboratory Press; Ausubel等人(2002) Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley,John & Sons, Inc.；和U.S.P.N. 7,709,611)。
如将在下面更详细地讨论的，本发明的另一个方面涉及编码本发明的CLDN结合结构域和CAR的核酸分子。核酸可以存在于全细胞中、细胞裂解物中或以部分地纯化的或基本上纯的形式存在。当通过标准技术(包括碱性/SDS处理、CsCl分带(banding)、柱色谱法、琼脂糖凝胶电泳和本领域众所周知的其它技术)从其它细胞组分或其它污染物(例如，其它细胞核酸或蛋白)分离时，核酸是“分离的”或变成基本上纯的。本发明的核酸可以是例如DNA(例如基因组DNA、cDNA)、RNA及其人工变体(例如，肽核酸)(无论单链或双链或RNA)，RNA，且可以含有或不含内含子。在一个优选实施方案中，所述核酸为cDNA分子。
使用标准分子生物学技术可以得到和操作本发明的核酸。对于由杂交瘤(例如，如下面实施例中所述制备的杂交瘤)表达的抗体，通过标准PCR扩增或cDNA克隆技术可以得到编码抗体的轻链和重链的cDNA。对于得自免疫球蛋白基因文库的抗体(例如，使用噬菌体展示技术)，可以从所述文库回收编码所述抗体的核酸。
通过标准重组DNA技术可以进一步操作编码VH和VL区段的DNA片段，例如以将所述可变区基因转化为全长抗体链基因，转化为Fab片段基因，或优选地转化为编码CLDN特异性的scFv的核苷酸序列。在这些操作中，将编码VL或VH的DNA片段可操作地连接至编码另一种蛋白(诸如抗体恒定区或柔性接头)的另一种DNA片段。在该上下文中使用的术语“可操作地连接”意指，连接两个DNA片段，使得由所述两个DNA片段编码的氨基酸序列保留于框架内。
通过将编码VH的DNA可操作地连接至另一种编码重链恒定区(CH1、CH2和CH3)的DNA分子，可以将分离的编码VH区域的DNA转化为全长重链基因。人重链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如，Kabat, 等人(1991) (出处同上))，且通过标准PCR扩增可以获得包括这些区域的DNA片段。重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，但是最优选地是IgG1或IgG4恒定区。一种示例性的IgG1恒定区描述于SEQ ID NO:2中。对于Fab片段重链基因，可以将编码VH的DNA可操作地连接至另一种仅编码重链CH1恒定区的DNA分子。
通过将编码VL的DNA可操作地连接至另一种编码轻链恒定区(CL)的DNA分子，可以将分离的编码VL区域的DNA转化为全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如，Kabat, 等人(1991) (出处同上))，且通过标准PCR扩增可以获得包括这些区域的DNA片段。轻链恒定区可以是κ或λ恒定区，但是最优选地是κ恒定区。在这方面，一种示例性的适当κ轻链恒定区描述于SEQ ID NO: 1中。
本文预见到表现出与本发明的多肽的“序列同一性”、序列相似性”或“序列同源性”的某些多肽(例如抗体可变区)。“同源的”多肽可以表现出65%、70%、75%、80%、85%或90%序列同一性。在其它实施方案中，“同源的”多肽可以表现出93%、95%或98%序列同一性。如本文中使用的，两个氨基酸序列之间的同源性百分比等同于两个序列之间的同一性百分比。两个序列之间的同一性百分比是由所述序列共享的相同位置的数目的函数，考虑缺口的数目和每个缺口的长度，所述缺口为了两个序列的最佳比对而需要引入。使用如以下非限制性实施例中所述的数学算法，可以实现两个序列之间的序列对比和同一性百分比测定。
使用已并入ALIGN程序(2.0版本)中的E. Meyers和W. Miller (Comput. Appl. Biosci.,4:11-17 (1988))的算法，使用PAM120权重残基表、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分，可以确定两个氨基酸序列之间的同一性百分比。此外，使用已并入GCG软件包(可得自www.gcg.com)内的GAP程序中的Needleman和Wunsch (J. Mol. Biol. 48:444-453(1970))算法，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵和16、14、12、10、8、6或4的缺口权重以及1、2、3、4、5或6的长度权重，可以确定两个氨基酸序列之间的同一性百分比。
额外地或可选地，本发明的蛋白序列可以进一步用作“查询序列”以执行针对公共数据库的搜索，以例如鉴别相关序列。可以使用Altschul, 等人(1990) J. Mol. Biol. 215:403-10的XBLAST程序(2.0版本)执行这样的搜索。可以用XBLAST程序、得分＝50、字长＝3执行BLAST蛋白搜索以获得与本发明的抗体分子同源的氨基酸序列。为了获得缺口比对以用于对比目的，可以如Altschul等人, (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402中所述利用Gapped BLAST。当利用BLAST和Gapped BLAST程序时，可使用各个程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数。
不同的残基位置可以差别在于保守氨基酸置换或非保守氨基酸置换。“保守氨基酸置换”是这样的置换：其中一个氨基酸残基被置换为另一个含有具有类似化学性质(例如，电荷或疏水性)的侧链的氨基酸残基。一般而言，保守氨基酸置换不会实质上改变蛋白的功能性质。在两个或更多个氨基酸序列彼此差别在于保守置换的情况下，可以向上调节序列同一性百分比或相似性程度以校正置换的保守性质。在存在非保守氨基酸置换的情况下，在优选的实施方案中，表现出序列同一性的多肽将保留本发明的多肽(例如，抗体)的期望功能或活性。
本文还预见到表现出与本发明的核酸的“序列同一性”、序列相似性”或“序列同源性”的核酸。“同源序列”意指表现出至少约65%、70%、75%、80%、85%或90%序列同一性的核酸分子的序列。在其它实施方案中，核酸的“同源序列”可以表现出与参照核酸细胞或CSC的93%、95%或98%序列同一性。
3. 衍生出的作为CLDN结合结构域的抗体
已经如上所述制备、选择和分离源抗体以后，可以进一步改变它们以提供适合本文中的教导的抗-CLDN CAR结合结构域组分。优选地，使用已知的分子工程技术修饰或改变源抗体以提供衍生出的具有期望的治疗性能的结合结构域组分。
a. 嵌合的和人源化的抗体
如上面讨论的，本发明的选择的实施方案包含鼠单克隆抗体，其免疫特异性地结合CLDN，且为了本发明的目的，可以视作CLDN结合结构域的“源”抗体。在选择的实施方案中，通过任选地修饰源抗体的恒定区和/或结合抗原的氨基酸序列，可以从这样的源抗体衍生出适合本发明的CLDN结合结构域。在某些实施方案中，如果通过缺失、突变、置换、整合或组合改变源抗体中的选定氨基酸，则从源抗体衍生出抗体。在另一个实施方案中，“衍生出的”抗体是这样的抗体：其中将源抗体的片段(例如，一个或多个CDR或整个重链和轻链可变区)与受体结合结构域构建体组合或者掺入受体结合结构域构建体中，以提供衍生物CLDN结合结构域(例如嵌合的或人源化的结合结构域)。使用如下所述的标准分子生物学技术可以制备这些衍生出的结合结构域，例如，以提供scFv；以改善对决定簇的亲和力；以改善抗体稳定性；以改善表达；以降低体内免疫原性；以减小毒性或以促进信号的传播。通过用化学方式或翻译后修饰来修饰成熟的分子(例如，糖基化模式或聚乙二醇化)，也可以从源抗体衍生出这样的抗体。
在一个实施方案中，从已经共价地连接的来自至少两个不同物种或抗体类别的蛋白区段衍生出本发明的嵌合的结合区域。术语“嵌合的”抗体涉及构建体，其中重链和/或轻链的一部分与来自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而所述链的剩余部分与来自另一个物种或属于另一个抗体类别或亚类的抗体中的相应序列以及这样的抗体的片段相同或同源(U.S.P.N. 4,816,567; Morrison等人, 1984,PMID: 6436822)。在某些优选的实施方案中，本发明的嵌合抗体可以包含与人轻链和重链恒定区的全部或部分可操作地连接的所选鼠重链和轻链可变区的全部或大部分。在其它特别优选的实施方案中，可以从本文中公开的小鼠抗体“衍生出”CLDN结合结构域。
在其它实施方案中，本发明的嵌合的结合结构域是“CDR移植的”结合结构域，其中所述CDR(如使用Kabat、Chothia、McCallum等定义)衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类，而所述结合区域的剩余部分衍生自来自另一个物种或属于另一个抗体类别或亚类的抗体。对于在人类中使用，可以将一种或多种选择的啮齿动物CDR(例如小鼠CDR)移植进人受体结合结构域(即，具有人框架区)中，从而替换人抗体的一个或多个天然存在的CDR。这些构建体通常具有以下优点：提供有效结合，同时降低受试者对结合结构域的不希望的免疫应答。在特别优选的实施方案中，所述CDR移植的结合结构域将包含并入人框架序列中的得自小鼠的一个或多个CDR。
与CDR移植的结合结构域类似的是“人源化的”结合结构域。本文中使用的“人源化的”结合结构域是包含从一种或多种非人抗体(供体或源抗体)衍生出的一个或多个氨基酸序列(例如CDR序列)的人结合结构域(通常包含人框架区的受体结构域)。在某些实施方案中，可以将“回复突变”引入人源化的结合结构域中，其中在受体人结合结构域的可变区的一个或多个FR中的残基被来自非人物种供体抗体的对应残基替换。这样的回复突变可以帮助维持移植的CDR的适当三维构型并由此改善亲和力和结合结构域稳定性。可以使用来自不同供体物种的抗体，所述供体物种包括、但不限于小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物。此外，人源化抗体或片段可以包含未在受体抗体或供体抗体中发现的新残基，以例如进一步改进抗体表现。因此，使用本文所述的现有技术，无需过多实验，可以容易地提供CDR移植的和人源化的抗体(和有关的CLDN结合结构域)，其适合本发明且包含如下实施例所述的源鼠抗体。
各种本领域公认的技术可以进一步用于确定哪些人序列用作受体抗体以提供根据本发明的人源化构建体。适合的人种系序列和确定它们作为受体序列的适合性的方法的汇编公开于例如Tomlinson, I. A. 等人(1992) J. Mol. Biol. 227:776-798; Cook, G.P. 等人(1995) Immunol. Today 16: 237-242; Chothia, D. 等人(1992) J. Mol. Biol. 227:799-817；和Tomlinson等人(1995) EMBO J 14:4628-4638中，它们中的每一篇整体并入本文。V-BASE目录(VBASE2 - Retter等人, Nucleic Acid Res. 33; 671-674,2005)提供了人免疫球蛋白可变区序列的综合性目录(由Tomlinson, I. A. 等人编译，MRCCentre for Protein Engineering, Cambridge, UK)，也可以用于鉴别适合的受体序列。另外，描述在例如U.S.P.N. 6,300,064中的共有人框架序列也可以证明是可以根据本发明教导使用的适合受体序列。一般而言，基于与鼠源框架序列的同源性以及源抗体和受体抗体的CDR规范结构的分析来选择人框架受体序列。然后可以使用本领域公认的技术合成衍生抗体(或结合结构域)的重链和轻链可变区的衍生序列。
作为示例，CDR移植的和人源化的抗体和相关方法描述于U.S.P.N. 6,180,370和5,693,762中。关于其它细节，参见，例如，Jones等人, 1986, PMID: 3713831)；和U.S.P.N.6,982,321和7,087,409。
CDR移植的或人源化的抗体可变区与人受体可变区的序列同一性或同源性可以如本文所讨论来确定，且当这样测量时，将优选地共享至少60%或65%序列同一性，更优选至少70%、75%、80%、85%或90%序列同一性，甚至更优选至少93%、95%、98%或99%序列同一性。优选地，不同一的残基位置因保守氨基酸置换而不同。“保守氨基酸置换”是这样的置换：其中一个氨基酸残基被置换为另一个含有具有类似化学性质(例如，电荷或疏水性)的侧链(R基团)的氨基酸残基。一般而言，保守氨基酸置换不会实质上改变蛋白的功能性质。在两个或更多个氨基酸序列彼此差别在于保守置换的情况下，可以向上调节序列同一性百分比或相似性程度以校正置换的保守性质。
应当理解，使用专有的Abysis数据库按照Kabat等人来定义如在附带的图3A和3B中提供的注解的CDR和框架序列。但是，如本文中讨论的，本领域技术人员可以容易地鉴别根据Chothia等人、ABM或MacCallum等人以及Kabat等人提供的定义的CDR。这样，包含根据前述系统中的任一个衍生出的一个或多个CDR的抗-CLDN人源化抗体被明确地保留在本发明的范围内。
b. 抗体片段、衍生物或构建体
在特别优选的实施方案中，所述CLDN结合结构域将包含抗体片段、衍生物或构建体。更具体地，不论选择何种形式的抗体(例如嵌合抗体、人源化抗体等)来实践本发明，应当理解，根据本文中的教导，可以使用它们的免疫反应片段作为CLDN CAR的部分。在广义上，“抗体片段”至少包含完整抗体的免疫反应部分。也就是说，本文中使用的术语“抗体片段”至少包括完整抗体的抗原结合片段或部分，且术语“抗原结合片段”表示免疫球蛋白或抗体的多肽片段，所述多肽片段与CLDN的免疫原性决定簇免疫特异性地结合或反应，或者与所述片段的来源完整抗体竞争特异性的抗原结合。此外，为了本发明的目的，“抗体构建体”或“抗体衍生物”应当认为是指包含抗体片段的任何分子结构。优选地，这样的衍生物或构建体应当是非天然的，且将被制造以赋予有益的分子性能，同时维持抗体的免疫反应性的(或免疫特异性的)性质。
示例性的适合的抗体片段、构建体或衍生物包括：可变轻链片段(VL)、可变重链片段(VH)、scFv、F(ab')2片段、Fab片段、Fd片段、Fv片段、单结构域抗体片段、双体、直链抗体、单链抗体分子和从抗体片段形成或衍生出的多特异性抗体。在其它实施方案中，本发明的CLDN结合结构域可以包含完整抗体、scFv-Fc构建体、微抗体（minibody）、双体、scFv构建体、Fab-scFv2构建体、Fab-scFv构建体或肽体（peptibody）。在某些方面，将CLDN结合结构域共价地连接(例如，通过使用本领域公知的基因工程技术)至CAR的跨膜结构域和细胞内结构域。在其它实施方案中，可以将CLDN结合结构域非共价地连接(例如，经由在U.S.P.N.2015/0139943中所述的结合结构域的Fc部分)至CAR的跨膜结构域和细胞内结构域。只要敏化的淋巴细胞能够诱导期望的免疫应答，结合结构域连接的每种形式适合本发明。
在特别优选的实施方案中，和如在附加的实施例中所示，所述CLDN结合结构域将包含scFv构建体。本文中使用的“单链可变片段(scFv)”是指从抗体衍生出的保留结合抗原的能力的单链多肽。scFv的一个例子包括通过重组DNA技术形成的抗体多肽，且其中免疫球蛋白重链和轻链片段的Fv区域经由间隔序列连接。多种用于制备scFv的方法是已知的，且包括在U.S.P.N. 4,694,778中描述的方法。在随本文附带的实施例中更详细地描述了适合本发明的抗-CLDN scFv构建体。
在其它实施方案中，所述CLDN结合结构域是这样的结构域：其包含Fc区且其保留至少一种通常与存在于完整抗体中的Fc区有关的生物学功能，诸如FcRn结合、抗体半衰期调节、ADCC功能和补体结合。在一个实施方案中，抗体片段是具有与完整抗体基本上类似的体内半衰期的单价抗体。例如，这样的结合结构域可以包含与Fc序列连接的免疫反应区域，所述Fc序列包含至少一个能够给所述片段赋予体内稳定性的游离半胱氨酸。在其它实施方案中，使用本领域公知的技术可以修饰Fc区以改变公开的CAR和敏化的淋巴细胞的药代动力学或药效动力学。
在CLDN结合结构域包含Fc部分的情况下，它可以经由与跨膜结构域和细胞内结构域可操作地结合的细胞外Fc受体或结合分子(“Fc结合剂”)与CAR的剩余部分非共价地连接或结合。本文中使用的术语“Fc结合剂”被理解为是指与抗体的Fc部分(例如，Fc受体)结合或缔合的任何分子或其部分。可以使用标准的分子生物学技术制造这样的构建体(即，包含Fc结合剂、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域的“原-CAR”)并与如本文中所述的选择的淋巴细胞(自体或同种异体淋巴细胞)结合(例如，经由转导)以产生“致敏的淋巴细胞”。在引入患者中之前的某个时点，然后可以在允许CLDN结合结构域与原-CAR结合的条件下将致敏的淋巴细胞暴露于选择的至少包含Fc部分的CLDN结合结构域。所述结合结构域与原-CAR的非共价结合会提供本发明的CLDN敏化的淋巴细胞且可以用于抑制如本文中所述的致瘤性细胞增殖(通常参见U.S.P.N. 2015/0139943，其整体并入本文中)。
在包含原-CAR的那些实施方案中，所述Fc结合剂可以包含Fc受体诸如Fc-γ受体、Fc-α受体或Fc-ε受体。在某些选择的实施方案中，所述Fc受体可以包含CD16 (例如，CD16A或CD16B)、CD32 (例如，CD32A或CD32B)或CD64 (例如，CD64A、CD64B或CD64C)的配体结合结构域。在某些其它实施方案中，所述Fc结合剂不是Fc受体。例如，所述Fc结合剂可以包含蛋白A或蛋白G的全部或部分，只要所述原-CAR具有与CLDN结合结构域结合的能力。在其它实施方案中，所述Fc结合剂可以包含结合免疫球蛋白的Fc部分的免疫反应性抗体或其片段或构建体或衍生物。关于这样的实施方案，所述Fc结合剂可以例如包含scFv、纳米体（nanobody）或微抗体（minibody）。类似地，适合这样的实施方案的CLDN结合结构域包括能够被Fc结合剂结合且与CLDN免疫特异性地反应的任意分子。在某些实施方案中，所述CLDN结合结构域将包含完整CLDN单克隆抗体或完整CLDN单克隆抗体的混合物。在其它实施方案中，所述CLDN结合结构域可以包含完整多克隆CLDN抗体(优选全人)。在其它的实施方案中，所述CLDN结合结构域可以包含scFv-Fc构建体。更一般而言，本领域技术人员基于本发明的教导的公开内容将能够容易地鉴别适合原-CAR的CLDN结合区域。
此外，如本领域技术人员容易认识到的，通过分子工程或通过完整或完全抗体或抗体链的化学或酶处理(诸如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶)或通过重组方式，可以得到公开的片段、构建体或衍生物。关于抗体片段的更详细描述，参见，例如，Fundamental Immunology,W. E. Paul, 编, Raven Press, N.Y. (1999)。
c. 生产后选择
无论如何获得，可以选择、克隆抗体生产细胞(例如，杂交瘤、酵母集落等)，并针对期望特征(包括，例如，对CLDN的高亲和力)进一步筛选。可以在细胞培养物中在体外扩增杂交瘤，或可以在同基因的免疫受损的动物中在体内扩增杂交瘤。选择、克隆和扩增杂交瘤和/或集落的方法是本领域普通技术人员众所周知的。一旦鉴别出期望的抗体，就可以使用常用的本领域公知的分子生物学和生化技术分离、操作和表达相关的遗传物质。
由原初文库产生的抗体(天然的或合成的)可以具有中等亲和力(约106至107 M-1的Ka)。为了增强亲和力，通过构建抗体文库(例如，通过使用易出错的聚合酶在体外引入随机突变)和从那些二级文库再选择对抗原具有高亲和力的抗体(例如通过使用噬菌体或酵母展示)，可以在体外模仿亲和力成熟。WO 9607754描述了用于诱导免疫球蛋白轻链的CDR中的诱变以产生轻链基因的文库的方法。
可以使用多种技术来选择抗体，包括、但不限于噬菌体或酵母展示，其中在噬菌体或酵母上合成人组合抗体或scFv片段的文库，用目标抗原或其抗体结合部分筛选所述文库，并分离结合所述抗原的噬菌体或酵母，由此可以获得抗体或免疫反应片段(Vaughan等 人, 1996, PMID: 9630891; Sheets等人, 1998, PMID: 9600934; Boder等人, 1997,PMID: 9181578；Pepper等人, 2008, PMID: 18336206)。用于生成噬菌体或酵母展示文库的试剂盒是商购可得的。还存在可用于生成和筛选抗体展示文库的其它方法和试剂(参见U.S.P.N. 5,223,409; WO 92/18619, WO 91/17271, WO 92/20791, WO 92/15679, WO93/01288, WO 92/01047, WO 92/09690；和Barbas等人, 1991, PMID: 1896445)。这样的技术有利地允许筛选大量候选抗体并提供相对容易的序列操作(例如，通过重组改组)。
4. CLDN结合结构域的特征
在选择的实施方案中，可以选择、克隆抗体生产细胞(例如杂交瘤、酵母集落)，并针对有利性能(包括例如稳健生长、高抗体产量，和如在下面更详细地讨论的，期望的结合结构域特征)进一步筛选。在其它情况下，通过针对动物的接种选择特定抗原(例如，特异性的CLDN结构域)或靶抗原的免疫反应片段，可以赋予抗体的特征。在其它实施方案中，可以如上所述工程改造选择的抗体以增强或改进免疫化学特征，诸如亲和力或药代动力学片段。
a. 结合结构域亲和力
本文中公开了对特定决定簇（例如CLDN6）具有高结合亲和力的抗体。术语“KD”表示特定抗体-抗原相互作用的解离常数或表观亲和力。当解离常数KD (koff/kon)≤10-7 M时，本发明的抗体可以免疫特异性地结合它的靶抗原。当KD≤5x10-9 M时，抗体以高亲和力特异性地结合抗原，且当KD≤5x10-10 M时，抗体以非常高的亲和力特异性地结合抗原。在本发明的一个实施方案中，所述抗体具有≤10-9 M的KD和约1x10-4/秒的解离速率。在本发明的一个实施方案中，所述解离速率< 1x10-5/秒。在本发明的其它实施方案中，所述抗体将以约10-7 M至10-10 M之间的KD结合决定簇，并且在另一个实施方案中，它将以≤2x10-10 M的KD结合。本发明的其它选择的实施方案包含具有小于10-6 M、小于5x10-6 M、小于10-7 M、小于5x10-7 M、小于10-8 M、小于5x10-8 M、小于10-9 M、小于5x10-9 M、小于10-10 M、小于5x10-10 M、小于10-11 M、小于5x10-11 M、小于10-12 M、小于5x10-12 M、小于10-13 M、小于5x10-13 M、小于10-14 M、小于5x10-14 M、小于10-15 M或小于5x10-15 M的KD (koff/kon)的抗体。
在某些实施方案中，本发明的免疫特异性地结合决定簇(例如CLDN)的抗体可以具有至少105 M-ls-l、至少2x105 M-ls-l、至少5x105 M-ls-l、至少106 M-ls-l、至少5x106 M-ls-l、至少107 M-ls-l、至少5x107 M-ls-l或至少108 M-ls-l的结合速率常数或k on (或k a )速率(抗体+ 抗原(Ag)k on←抗体-Ag)。
在另一个实施方案中，本发明的免疫特异性地结合决定簇(例如CLDN)的抗体可以具有小于l0-l s- l、小于5xl0-l s- l、小于l0-2 s- l、小于5xl0-2 s- l、小于l0-3 s- l、小于5xl0-3 s- l、小于l0-4 s- l、小于5xl04 s- l、小于l0-5 s- l、小于5xl0-5 s- l、小于l0-6 s- l、小于5xl0-6 s- l小于l0-7 s- l、小于5xl0-7 s- l、小于l0-8 s- l、小于5xl0-8 s- l、小于l0-9 s- l、小于5xl0-9 s- l或小于l0-10 s- l的解离速率常数或k off (或k d )速率(抗体+ 抗原(Ag)k off←抗体-Ag)。
使用本领域已知的多种技术，例如，表面等离子体共振、生物层干扰量度法、双极化干扰量度法、静态光散射、动态光散射、等温滴定量热法、ELISA、分析超速离心和流式细胞计量术，可以确定结合亲和力。
b. 分仓和表位作图
本文中使用的术语“分仓(binning)”表示用于基于它们的抗原结合特征和它们是否彼此竞争而将抗体(或结合结构域)分组至“仓室（bin）”中的方法。仓室的初始确定可以通过如本文所述的表位作图和其它技术进一步改进和证实。但是，应当理解，抗体向各个仓室的经验分配会提供可以指示公开的抗体的治疗潜力的信息。
更具体地，通过使用本领域中已知的和本文实施例中描述的方法，可以确定所选参比抗体(或其片段)是否与第二测试抗体竞争结合(即处于相同仓室中)。在一个实施方案中，参比抗体与CLDN抗原在饱和条件下结合，且然后使用标准的免疫化学技术确定第二或测试抗体的结合CLDN的能力。如果测试抗体能够与参考抗-CLDN抗体同时实质上结合CLDN，那么与第一或参比抗体相比，第二或测试抗体结合不同的表位。但是，如果测试抗体不能同时实质上结合CLDN，那么测试抗体结合相同表位、重叠表位或与由第一抗体结合的表位紧密邻近(至少在空间上)的表位。也就是说，测试抗体竞争抗原结合且与参比抗体处于相同仓室中。
当在公开的抗体的上下文中使用时，术语“竞争”或“竞争抗体”意指抗体之间的竞争，如通过其中所测试的测试抗体或免疫学功能片段抑制参比抗体与共同抗原的特异性结合的测定法所确定的。通常，此类测定法涉及使用结合至固体表面或细胞的经纯化的抗原(例如，CLDN或其结构域或片段)、未标记的测试抗体和标记的参比抗体。通过在有测试抗体存在下确定结合至固体表面或细胞的标记的量，测量竞争性抑制。通常，测试抗体以过量存在和/或被允许首先结合。关于确定竞争性结合的方法的额外细节提供在本文实施例中。通常，当竞争抗体以过量存在时，它使参比抗体与共同抗原的特异性结合抑制至少30%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%或75%。在一些情况下，使结合抑制至少80%、85%、90%、95%或97%或更多。
相反，当结合参比抗体时，它优选地使随后添加的测试抗体(即，CLDN抗体)的结合抑制至少30%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%或75%。在一些情况下，使测试抗体的结合抑制至少80%、85%、90%、95%或97%或更多。
通常，使用多种本领域公知的技术，例如，免疫测定诸如蛋白质印迹、放射免疫测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)、“夹心”免疫测定、免疫沉淀测定、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散测定、凝集测定、补体结合测定、免疫放射测定、荧光免疫测定和蛋白A免疫测定，可以确定分仓或竞争性结合。这样的免疫测定是常规的和本领域众所周知的(参见，Ausubel等人, 编, (1994) Current Protocols in Molecular Biology, 第1卷,John Wiley & Sons, Inc., New York)。另外，可以使用交叉阻断测定(参见，例如，WO2003/48731；和Harlow等人(1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold SpringHarbor Laboratory, Harlow和David Lane编著)。
用于确定竞争性抑制(和因此确定“仓室”)的其它技术包括：表面等离子体共振，其使用例如BIAcore™2000系统(GE Healthcare)；生物层干扰量度法，其使用例如ForteBio®Octet RED (ForteBio)；或流式细胞计量术珠子阵列，其使用例如FACSCanto II(BD Biosciences)或多路LUMINEX™检测测定(Luminex)。
Luminex是一种能够实现大规模多路抗体配对的基于珠子的免疫测定平台。所述测定对比抗体对与靶抗原的同时结合模式。所述对中的一种抗体(捕获mAb)结合Luminex珠子，其中每个捕获mAb结合不同颜色的珠子。另一种抗体(检测mAb)结合荧光信号(例如藻红蛋白(PE))。所述测定分析抗体与抗原的同时结合(配对)，并将具有类似配对特性的抗体分组在一起。检测mAb和捕获mAb的类似概况指示，两种抗体结合相同的或密切相关的表位。在一个实施方案中，可以使用Pearson相关系数确定配对概况以鉴别与测试的抗体的集合上的任何特定抗体最密切相关的抗体。在优选的实施方案中，如果抗体对的Pearson相关系数为至少0.9，则将确定测试/检测mAb与参考/捕获mAb在相同的仓室中。在其它实施方案中，Pearson相关系数为至少0.8、0.85、0.87或0.89。在其它实施方案中，Pearson相关系数为至少0.91、0.92、0.93、0.94、0.95、0.96、0.97、0.98、0.99或1。分析得自Luminex测定的数据的其它方法描述于U.S.P.N. 8,568,992。Luminex的同时分析100种不同类型的珠子(或更多)的能力会提供几乎无限的抗原和/或抗体表面，从而导致在生物传感器测定中的抗体表位绘图中的通量和分辨率改善(Miller, 等人, 2011, PMID: 21223970)。
“表面等离子体共振”表示允许通过检测生物传感器基质内的蛋白浓度的改变来分析实时特异性相互作用的光学现象。
在其它实施方案中，可以用于确定测试抗体是否与参比抗体“竞争”结合的技术是“生物层干扰量度法”，即一种分析从以下两个表面反射的白光的干涉图样的光学分析技术：在生物传感器尖部上的固定化蛋白层，和内部参比层。与生物传感器尖部结合的分子的数目的任何变化会造成可以实时测量的干涉图样迁移。这样的生物层干扰量度法测定可以如下使用ForteBio®Octet RED机器进行。将参比抗体(Ab1)捕获在抗-小鼠捕获芯片上，然后使用高浓度的非结合抗体封闭芯片并收集基线。然后用特异性抗体(Ab1)捕获单体重组靶蛋白，并将尖部浸入含有相同抗体(Ab1)作为对照的孔中或浸入含有不同测试抗体(Ab2)的孔中。如果没有发生进一步结合（如通过将结合水平与对照Ab1进行对比所确定的），那么确定Ab1和Ab2是“竞争”抗体。如果用Ab2观察到另外的结合，那么确定Ab1和Ab2不会彼此竞争。在代表独特仓室的96-孔板中使用整行抗体可以扩大该过程以筛选独特抗体的大文库。在优选的实施方案中，如果参比抗体使测试抗体与共同抗原的特异性结合抑制至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%或75%，测试抗体将与参比抗体竞争。在其它实施方案中，使结合抑制至少80%、85%、90%、95%或97%或更多。
一旦已经定义包括一组竞争抗体的仓室，则可以实施进一步表征以确定仓室中的抗体所结合的抗原上的具体结构域或表位。可以使用由Cochran等人, 2004, PMID:15099763描述的方案的改良方案进行结构域-水平表位作图。精细表位作图是确定抗原上构成抗体所结合的决定簇的表位的具体氨基酸的方法。术语“表位”以它的普通生物化学意义使用，并且表示靶抗原的能够被特定抗体识别且特异性地结合的部分。在某些实施方案中，表位或免疫原性决定簇包括分子的化学活性表面分组，诸如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，且在某些实施方案中，可以具有特定三维结构特征和/或比电荷特征。在某些实施方案中，当抗体在蛋白和/或大分子的复杂混合物中优选识别其靶抗原时，将该抗体称为与抗原特异性结合。
当抗原是多肽(诸如CLDN)时，表位通常可以由连续氨基酸和通过蛋白的三级折叠而靠近的非连续氨基酸(“构象表位”)形成。在这样的构象表位中，存在跨越蛋白上的彼此线性分离的氨基酸残基的相互作用点。由连续氨基酸形成的表位(有时被称作“线性”或“连续”表位)通常在蛋白变性后保留，而由三级折叠形成的表位通常在蛋白变性后消失。抗体表位通常包括独特空间构象中的至少3个、且更通常至少5个或8-10个氨基酸。表位确定或“表位作图”的方法是本领域众所周知的，并且可以与本发明结合使用以鉴别CLDN上被公开的抗体结合的表位。
适合的表位作图技术包括丙氨酸扫描突变体、肽印迹法(Reineke (2004)Methods Mol Biol 248:443-63)或肽切割分析。此外，可以使用诸如表位切除、表位提取和抗原的化学修饰的方法(Tomer (2000) Protein Science 9: 487-496)。其它适合的方法包括酵母展示方法。在其它实施方案中，修饰辅助绘图(Modification-AssistedProfiling；MAP)，也被称作基于抗原结构的抗体绘图(Antigen Structure-basedAntibody Profiling；ASAP)，会提供根据每种抗体与化学地或酶促地修饰的抗原表面的结合概况的相似性来将大量针对相同抗原的单克隆抗体归类的方法(U.S.P.N. 2004/0101920)。该技术允许快速过滤遗传上相同的抗体，使得表征可以集中于遗传上不同的抗体。应当理解，可以使用MAP将本发明的CLDN抗体分选至结合不同表位的抗体组中。
一旦确定抗原上的期望的表位，就可能生成针对该表位的抗体，例如通过使用本发明中描述的技术用包含所述表位的肽进行免疫。可选地，在发现过程期间，抗体的生成和表征可以阐明关于位于特定结构域或基序中的期望表位的信息。从该信息，则可能针对与相同表位的结合来竞争性地筛选抗体。一个实现该目的的方案是进行竞争研究以发现竞争对抗原的结合的抗体。用于基于抗体的交叉竞争而对抗体进行分仓的高通量方法描述于WO03/48731中。分仓或结构域水平或表位作图的其它方法(包含抗体竞争或酵母上的抗原片段表达)是本领域众所周知的。
B. 任选的铰链区
本文中使用的术语“铰链区”表示柔性多肽连接区(在本文中也被称作“铰链”)，其可以被包括在CAR外结构域内从而给侧接多肽区域提供结构柔性。铰链区可以由天然的或合成的多肽组成。本领域技术人员将理解，铰链区可以通过促进抗原识别结构域相对于被所述抗原识别结构域识别的抗原部分的最佳定位来改善CAR的功能。应当理解，在某些实施方案中，铰链区可以不是最佳CAR活性所需的。在其它实施方案中，包含短氨基酸序列的有益铰链区会通过促进抗原结合结构域或抗体的柔性来促进CAR活性。编码铰链区的序列可以位于抗原识别部分(例如，抗-CLDN scFv)和跨膜结构域之间。铰链序列可以是从任意合适的分子衍生出或得到的任意部分或序列。在一个实施方案中，例如，从人CD8α分子或CD28分子衍生出铰链序列。从免疫球蛋白(例如，IgGl)衍生出的“铰链区”通常被定义为人IgG1的Glu216至Pro230的段。可以如下将其它IgG同种型的铰链区与IgG1序列比对：将形成重链间二硫(S-S)键的第一个和最后一个半胱氨酸残基放在相同位置。在其它实施方案中，所述铰链区可以是天然存在的或非天然存在的，包括、但不限于如在U.S.P.N. 5,677,425中所述的改变的铰链区。当然，当在CAR中使用某些结合结构域诸如(Fab’)2或完整抗体时，天然地随后包括对应铰链区。
在其它选择的实施方案中，铰链区可以包括从抗体衍生出的完整铰链区，所述抗体来自与CH1结构域的抗体不同的类别或亚类。术语“铰链区”也可以包括从人CD8α分子或CD28分子和在给侧接区域提供柔性中起类似功能的任意其它受体衍生出的区域。铰链区可以具有约4个氨基酸至约50个氨基酸的长度，例如，约4个氨基酸至约10个氨基酸、约10个氨基酸至约15个氨基酸、约15个氨基酸至约20个氨基酸、约20个氨基酸至约25个氨基酸、约25个氨基酸至约30个氨基酸、约30个氨基酸至约40个氨基酸、或约40个氨基酸至约50个氨基酸。可以容易地选择合适的铰链区，且可以具有许多合适长度中的任一种，诸如1个氨基酸(例如，Gly)至20个氨基酸、2个氨基酸至15个氨基酸、3个氨基酸至12个氨基酸，包括4个氨基酸至10个氨基酸、5个氨基酸至9个氨基酸、6个氨基酸至8个氨基酸或7个氨基酸至8个氨基酸，且可以是1、2、3、4、5、6或7个氨基酸。
本领域技术人员会明白，适合的铰链区是众所周知的，且因此，可以容易地选择可行的实施方案并掺入本发明的CLDN CAR中。
C. 跨膜/间隔结构域
如上面所提及的，本发明的CLDN CAR优选地包含插入在细胞外CLDN结合结构域和/或铰链区之间的跨膜结构域、和细胞内的或细胞质的信号传导结构域。为了本发明的讨论的目的，术语“跨膜结构域”将与以下理解一起使用：尽管它总是包括在物理上埋在细胞膜的脂质双层中的氨基酸残基，它可以包括可延伸超出细胞膜的任一侧的支持或“间隔结构域”。本领域技术人员可以容易地区分CAR组分的功能方面，且考虑到本发明容易地确定什么构成适合的跨膜结构域。
应当理解，可以从天然多肽衍生出跨膜结构域，或可以人工地设计跨膜结构域。可以从任何膜结合蛋白或跨膜蛋白（其在必要时可以经过修饰或截短）衍生出适合的跨膜结构域。例如，从T细胞受体α或β链、IgG (诸如IgG4)的Fc区、CD3ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、ICOS、CD154或GITR衍生出的跨膜结构域都适合公开的CLDN CAR构建体的不同实施方案。在某些实施方案中，优选的是采用CD8ζ、FcRη、FcεR1-γ和-β、MB1 (Igα)、B29或CD3-γ、ζ或ε的跨膜结构域，以便保留与受体复合物的其它成员的物理结合。适合的人工跨膜结构域可以包含掺入高水平的疏水残基（诸如亮氨酸和缬氨酸）的各种多肽序列。在其它优选的实施方案中，所述跨膜结构域可以包含位于合成的跨膜结构域的每个末端处的苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。
本发明的某些实施方案将包含具有间隔物的跨膜结构域。在本发明的CLDN CAR中，“间隔结构域”或“间隔区域”是可以安排在细胞外功能结构域(例如，抗原结合结构域或铰链区，如果包括的话)和跨膜结构域之间、或细胞内信号传导结构域和跨膜结构域之间的氨基酸序列。间隔结构域是指用于连接跨膜结构域和细胞外结构域和/或连接跨膜结构域和细胞内结构域的任意寡肽或多肽，其目的是为了有效的CAR功能使这些元件在CAR多肽内最佳地定位。间隔结构域包含至多300个氨基酸，优选10-100个氨基酸，和最优选25-50个氨基酸。间隔结构域优选地具有促进CLDN CAR与CLDN的结合并增强向细胞中的跨膜信号传导的序列。预期会促进结合的氨基酸的例子包括在潜在糖基化位点中的半胱氨酸、带电荷的氨基酸和丝氨酸和苏氨酸，并且这些氨基酸可以用作构成间隔结构域的氨基酸。在优选的实施方案中，所述间隔物可以包含抗体恒定区的全部或部分(例如，IgG1 CH或CL)，它们可以任选地二聚化。
其它适合的间隔物包括本领域已知的甘氨酸聚合物(G)n、甘氨酸-丝氨酸聚合物、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物和其它柔性的间隔物。可以使用甘氨酸和甘氨酸-丝氨酸聚合物；Gly和Ser都是相对无组织的，且因此可以充当组分之间的中性系链（tether）。可以使用甘氨酸聚合物；甘氨酸占用比甚至丙氨酸显著更多的phi-psi空间，且与具有较长侧链的残基相比受到少得多的限制。
本领域技术人员会明白，适合的跨膜结构域是本领域众所周知的，且因此，可以容易地选择可行的实施方案并掺入本发明的CLDN CAR中。
D. 细胞内信号传导结构域
除了细胞外CLDN结合结构域和跨膜结构域以外，本发明的CLDN CAR将包含细胞内的或细胞质的结构域，其含有至少一个信号传导和/或T细胞活化部分。在本发明中使用的细胞内信号传导结构域是这样的分子：当在相同分子内存在(或非共价地结合)的细胞外结构域与CLDN结合(相互作用)时，所述分子可以将一个或多个信号传导进细胞中。CLDN的结合会触发沿着CAR传输并向细胞内传递以活化敏化的淋巴细胞的信号。该淋巴细胞活化会触发期望的免疫应答，其导致靶细胞的消除。
T-淋巴细胞活化的双信号理论提出，需要两个信号才能有效地活化T-细胞：首先，在MHC分子的背景下呈递的抗原肽会与TCR的α:β链异源二聚体相互作用，从而引起构象变化，所述构象变化导致来自在TCR复合物的蛋白组分中存在的细胞质结构域的信号的活化；和其次，随着它们与在细胞上呈递肽:MHC复合物的它们的相应配体相互作用，单个或几个共刺激分子从细胞质结构域传递信号。更具体地，已知的是，仅经由TCR复合物产生的信号可能不足以活化T细胞，并且还需要次要或共刺激信号以避免被称作无反应性的T-细胞无活性状态。天然的T细胞-活化通过两个不同种类的细胞质信号传导序列来传递，也就是说，一个经由TCR复合物起始抗原依赖性的主要活化的序列(主要细胞质信号传导序列)，和一个独立于抗原起作用以提供次要或共刺激信号的序列(次要细胞质信号传导序列)。在一个优选的方面，本发明的CLDN CAR包含主要细胞质信号传导序列和/或次要细胞质信号传导序列作为CAR内结构域。
一般而言，在免疫系统受体的细胞质结构域中存在的信号传导基序可以是活化性的或抑制性的。刺激活化的主要细胞质信号传导序列可以包含被称作基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)的信号转导基序[Nature, 第338卷, 第383-384页(1989)]。另一方面，以抑制方式起作用的主要细胞质信号传导序列包含被称作基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)的信号转导基序。在本发明中，可以使用具有ITAM或ITIM的细胞内结构域。
从天然TCR复合物传递用于T-细胞活化的第一刺激信号的主要细胞质信号传导序列是在CD3ζ链中出现的ITAM，但是已知的是，还可以采用其它ITAM来传递明确的主要活化信号。可以在本发明中使用的具有ITAM的细胞内结构域的例子包括具有从CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d衍生出的ITAM的细胞内结构域。具体地，ITAM的例子包括具有以下序列的肽：CD3ζ(NCBI RefSeq: NP—932170.1)的氨基酸编号51-164、FcεRIγ(NCBI RefSeq: NP—004097.1)的氨基酸编号45-86、FcεRIβ(NCBI RefSeq:NP—000130.1)的氨基酸编号201-244、CD3γ(NCBI RefSeq: NP—000064.1)的氨基酸编号139-182、CD3δ(NCBI RefSeq: NP—000723.1)的氨基酸编号128-171、CD3ε(NCBI RefSeq:NP—000724.1)的氨基酸编号153-207、CD5 (NCBI RefSeq: NP—055022.2)的氨基酸编号402-495、0022 (NCBI RefSeq: NP—001762.2)的氨基酸编号707-847、CD79a (NCBIRefSeq: NP—001774.1)的氨基酸编号166-226、CD79b (NCBI RefSeq: NP—000617.1)的氨基酸编号182-229和CD66d (NCBI RefSeq: NP—001806.2)氨基酸编号177-252，以及它们的具有这些肽所具有的相同功能的变体。基于每种蛋白的前体(包含信号肽序列等)的全长，进行基于本文描述的NCBI RefSeq ID或GenBank的氨基酸序列信息的氨基酸编号。
次要共刺激信号可以来自多种共刺激分子的细胞质结构域，其中最佳地表征的是CD28。CD28在T-细胞上表达，且是CD80 (B7.1)和CD86 (B7.2)的受体。但是，其它共刺激分子包括、但不限于CD27分子、CD137/4-1BB分子、CD134/OX40分子和本领域已知的其它细胞内信号传导分子。已知CD134/OX40会增强T-细胞克隆繁殖（可能通过抑制细胞凋亡），且可能在记忆细胞的建立中起作用。4-1BB（也被称作CD137）将有效的共刺激信号传导给T-细胞，从而促进分化和增强T淋巴细胞的长期存活。由于这些共刺激分子中的每一种活化不同的细胞内信号传导途径且可能在不同的T-淋巴细胞群体中具有不同的作用，可以在CAR的内结构域中包括来自一种、几种或每一种的结构域，以便使T-细胞活化和CAR的其它期望性能最大化。在一个优选的实施方案中，CD28、CD27、4-1BB和OX40分子是人的。可以在本发明中使用的包含次要细胞质信号传导序列的细胞内结构域的例子包括从CD2、CD4、CD5、CD8α、CD8β、CD28、CD134、CD137、ICOS和CD154衍生出的序列。其具体例子包括具有以下序列的肽：CD2 (NCBI RefSeq: NP-001758.2)的氨基酸编号236-351、CD4 (NCBI RefSeq: NP-000607.1)的氨基酸编号421-458、CD5 (NCBI RefSeq: NP-055022.2)的氨基酸编号402-495、CD8α(NCBI RefSeq: NP-001759.3)的氨基酸编号207-235、CD83 (GenBank:AAA35664.1)的氨基酸编号196-210、CD28 (NCBI RefSeq: NP—006130.1)的氨基酸编号181-220 (SEQ ID No.: 25)、CD137 (4-1BB, NCBI RefSeq: NP-001552.2)的氨基酸编号214-255、CD134 (OX40, NCBI RefSeq: NP-003318.1)的氨基酸编号241-277和ICOS (NCBIRefSeq: NP-036224.1)氨基酸编号166-199，以及它们的具有这些肽所具有的相同功能的变体。
由公开的核酸序列编码的CLDN CAR的信号传导/活化结构域可以包含前述信号传导结构域中的任一种和前述细胞间T-细胞活化结构域中的任意一种或多种的任意组合。例如，本发明的核酸序列可以编码包含CD28信号传导结构域以及CD28和CD3ζ的细胞内T-细胞活化结构域的CAR。可选地，例如，本发明的核酸序列可以编码包含CD8α信号传导结构域以及CD28、CD3ζ、Fc受体γ(FcRγ)链和/或4-1BB的T细胞信号传导结构域的CAR。
本领域技术人员会明白，前述信号传导/刺激结构域中的每一种适合本发明，且可以与公开的CLDN CAR一起(单独地或优选地组合地)有效地使用。因此，前述部分中的每一种（以任意组合或构型）作为细胞内/细胞质结构域的组分被明确地预见到在本发明的范围内。
V. CAR核酸和载体
本发明提供了一种经分离的或经纯化的核酸序列，其编码抗-CLDN嵌合抗原受体，其中所述CAR优选地包含细胞外结合结构域(例如，scFv)、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域(例如，T-细胞活化部分)。本文中使用的“核酸序列”意图包括DNA或RNA的聚合物（即，多核苷酸），其可以是单链的或双链的，且其可以含有非天然的或改变的核苷酸。本文中使用的术语“核酸”和“多核苷酸”表示任意长度的核苷酸的聚合形式，无论是核糖核苷酸(RNA)还是脱氧核糖核苷酸(DNA)。这些术语表示分子的一级结构，且因而包括双链和单链DNA、以及双链和单链RNA。该术语包括作为等同物的、从核苷酸类似物和经修饰的多核苷酸（例如、但不限于甲基化的和/或加帽的多核苷酸）制成的RNA或DNA的类似物。
“分离的”是指从它的天然环境取出核酸。“纯化的”是指，给定的核酸的纯度已经增加，其中“纯度”是相对术语，而不是“绝对纯度”，所述给定的核酸是已经从自然界中取出的核酸(包括基因组DNA和mRNA)或在实验室条件下合成的(包括cDNA)和/或扩增的核酸。但是，应当理解，核酸和蛋白可以用稀释剂或佐剂配制，且仍然为了实用目的而分离。例如，当用于引入细胞中时，通常将核酸与可接受的载体或稀释剂混合。
如本文中所述的和在附加的实施例中证实的，使用本领域已知的方法可以制备适合本发明的核酸序列。例如，使用标准重组DNA方法，可以重组生产核酸序列、多肽和蛋白(参见，例如，Sambrook等人, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第3版, ColdSpring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 2001)。此外，可以从来源（诸如CHO细胞、植物、细菌、昆虫或哺乳动物，例如，大鼠、人等）分离和/或纯化合成制备的编码CLDNCAR的核酸序列。分离和纯化的方法是本领域众所周知的。可选地，可以商业地合成本文描述的核酸序列。在这方面，本发明核酸序列可以是合成的、重组的、分离的和/或纯化的。
本发明的核酸序列可以编码任意长度的CLDN CAR，即，所述CAR可以包含任意数目的氨基酸，前提条件是，所述CAR保留它的生物学活性，例如，特异性地结合抗原和治疗或预防哺乳动物中的疾病等的能力。例如，所述CAR可以包含50个或更多个、60个或更多个、100个或更多个、250个或更多个或500个或更多个氨基酸。优选地，所述CAR是约50至约700个氨基酸(例如，约70个、约80个、约90个、约150个、约200个、约300个、约400个、约550个或约650个氨基酸)、约100个至约500个氨基酸(例如，约125个、约175个、约225个、约250个、约275个、约325个、约350个、约375个、约425个、约450个或约475个氨基酸)、或由前述值中的任意2个限定的范围。
在本发明的范围内包括编码本文中描述的CLDN CAR的功能部分的核酸序列。当关于CAR使用时，术语“功能部分”表示本发明的CAR的任何部分或片段，所述部分或片段保留其来源CAR(亲本CAR)的生物学活性。功能部分包括，例如，这样的CAR部分：其保留识别靶细胞、或者提供免疫调节性信号、或者治疗疾病的能力，其达到与亲本CAR相似的程度、相同的程度或更高的程度。关于编码亲本CLDN CAR的核酸序列，编码CAR的功能部分的核酸序列可以编码这样的蛋白：其包含亲本CAR的例如约10%、25%、30%、50%、68%、80%、90%、95%或更多。在这点上，适合的核酸序列可以编码这样的CAR功能部分：其含有位于所述部分的氨基或羧基端或者两端的额外氨基酸，所述额外氨基酸不存在于亲本CAR的氨基酸序列中。理想地，所述额外氨基酸不干扰所述功能部分的生物学功能，例如，识别靶细胞、检测癌症、治疗或预防癌症等。更理想的是，与亲本CAR的生物学活性相比，所述额外氨基酸增强所述CAR的生物学活性。
本发明还提供了编码CLDN CAR的功能变体的核酸序列。本文中使用的术语“功能变体”表示与由公开的核酸序列编码的CAR具有基本或显著序列同一性或相似性的CAR、多肽或蛋白，所述功能变体保留所述功能变体作为其变体的CAR的CLDN结合能力。功能变体包括，例如，这样的本文所述的CAR(亲本CAR)的变体：所述变体保留识别CLDN阳性的靶细胞的能力，达到与亲本CAR相似的程度、相同的程度或更高的程度。关于编码亲本CAR的核酸序列，编码所述CAR的功能变体的核酸序列可以与编码亲本CAR的核酸序列具有例如约10%同一性、约25%同一性、约30%同一性、约50%同一性、约65%同一性、约80%同一性、约90%同一性、约95%同一性、或约99%同一性。
不论CLDN CAR的精确形式，应当理解，本发明的核酸可以用于所选宿主细胞(例如，淋巴细胞)的离体转化或直接引入受试者中用于体内基因治疗。在每种情况下，除了本文中公开的其它赋形剂以外，公开的核酸还可以与促进核酸向细胞中的转移的物质（例如，用于引入核酸的试剂诸如脂质体或阳离子脂质）组合。在某些优选的实施方案中，本发明的核酸将与载体组合或者掺入载体中，所述载体适合用于体内基因治疗。
因此，与前述内容结合，本发明提供了包含CLDN CAR核酸的组合物，所述CLDN CAR核酸与药学上可接受的载体一起可以用作活性成分或制备敏化的淋巴细胞。合适的药学上可接受的添加剂是本领域技术人员众所周知的。药学上可接受的添加剂或赋形剂的例子包括磷酸盐缓冲盐水(例如0.01 M磷酸盐, 0.138 M NaCl, 0.0027 M KCl, pH 7.4)，含有无机酸盐诸如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐或硫酸盐的水溶液，盐水，乙二醇或乙醇的溶液，和有机酸盐诸如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐或苯甲酸盐。还可以使用佐剂（诸如润湿剂或乳化剂）和pH缓冲剂。可以将本发明的组合物配制成适合于胃肠外施用（例如，注射或输注）的已知形式。此外，这样的组合物可以包含配制添加剂诸如助悬剂、防腐剂、稳定剂和/或分散剂，和用于在贮存期间延长有效期的保存剂。此外，所述组合物可以呈在使用前用适当的无菌液体重构的干燥形式。
除了编码CLDN CAR的核酸序列以外，适合的载体优选地包含表达控制序列，诸如启动子、增强子、多腺苷酸化信号、转录终止子、内核糖体进入位点(IRES)等，其提供所述核酸序列在宿主细胞中的表达。在这点上，来自多种不同来源的大量启动子（包括组成型、诱导型和阻抑型启动子）是本领域众所周知的。启动子的代表性来源包括，例如病毒、哺乳动物、昆虫、植物、酵母和细菌，并且来自这些来源的合适启动子是容易得到的，或者可以基于公众可得到的序列（例如从保藏机构诸如ATCC以及其它商业或个体来源）合成地制备。启动子可以是单向的（即，在一个方向起始转录）或双向的（即，在3’或5’方向起始转录）。启动子的非限制性例子包括例如T7细菌表达系统、pBAD (araA)细菌表达系统、巨细胞病毒(CMV)启动子、SV40启动子和RSV启动子。诱导型启动子包括例如Tet系统、蜕皮激素可诱导的系统、T-REX™系统(Invitrogen, Carlsbad, Calif.)、LACSWITCH™系统(Stratagene, SanDiego, Calif.)和Cre-ERT他莫昔芬可诱导的重组酶系统。另外，所述CLDN CAR可以与基因结合，所述基因可以是用于证实核酸的表达的标志物(例如药物抗性基因、编码报告酶的基因或编码荧光蛋白的基因)。
在某些实施方案中，可以优选地将编码CLDN CAR的核酸与任何控制元件一起插入载体中，然后可以将所述载体引入选择的细胞中以提供公开的CLDN敏化的淋巴细胞。在优选的实施方案中，所述载体可以是，例如，质粒、转座子、粘粒或病毒载体(例如，噬菌体、逆转录病毒、慢病毒或腺病毒)。例如，可以使用病毒载体诸如逆转录病毒载体(包括肿瘤逆转录病毒载体、慢病毒载体和假型载体)、腺病毒载体、腺伴随病毒(AAV)载体、猿猴病毒载体、痘苗病毒载体或仙台病毒载体、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)载体和HSV载体。
更一般地，术语“载体”、“克隆载体”和“表达载体”是指媒介物，其可以用于将DNA或RNA序列(例如，编码CLDN CAR的外源基因)引入宿主细胞中，从而转化宿主和促进引入的序列的表达(例如转录和翻译)。应当理解，引入的基因或序列可以包括调节或控制序列，诸如由细胞的遗传机制使用的起始序列、停止序列、启动子序列、信号序列、分泌序列或其它序列。如本文中所述的，适合的载体是本领域众所周知的，且包括质粒、转座子、噬菌体、病毒等。然后可以使用载体转化选择的淋巴细胞(自体的或同种异体的)以提供公开的敏化的淋巴细胞。为了本发明的目的，术语“转化”将以它的最一般含义使用，且应当认为是指将异源基因、DNA或RNA序列引入宿主细胞(原核细胞或真核细胞)中，使得所述宿主细胞将表达引入的基因或序列以产生期望的物质，通常是由引入的基因或序列编码的蛋白或酶。适合本发明的示例性细胞转化方法包括转染和转导。本文中使用的术语“转染”是指使用物理或化学方式将外来核酸或基因引入细胞(原核细胞或真核细胞)中，而术语“转导”是指通过使用病毒载体将外来核酸或基因引入细胞(原核细胞或真核细胞)中。
就转导而言，可以将噬菌体或病毒载体引入宿主细胞中，优选地在合适的包装细胞（其中许多是商购可得的）中培养感染性颗粒以后。适合的转导方法和包装细胞如在下面实施例中所述，且考虑到本发明将是技术人员可容易地辨别的。
作为例子，当要使用逆转录病毒载体时，可以如下制备适合本文中的教导的组合物：基于载体具有的LTR序列和包装信号序列而选择合适的包装细胞，和使用所述包装细胞制备逆转录病毒颗粒。包装细胞的例子包括PG13 (ATCC CRL-10686)、PA317 (ATCC CRL-9078)、GP+E-86和GP+envAm-12和Psi-Crip。还可以使用具有高转染效率的293细胞或293T细胞制备逆转录病毒颗粒。基于逆转录病毒和可以用于包装逆转录病毒载体的包装细胞而生产的许多种类的逆转录病毒载体可广泛地商购得自许多公司。也可商购得到用于根据本文中的教导制造适合慢病毒载体的类似系统。这样的载体可以用于转导选择的淋巴细胞群体以提供期望的CLDN敏化的淋巴细胞。
另外，非病毒包装载体系统也可以与脂质体和缩合剂（诸如在WO 96/10038、WO97/18185、WO 97/25329、WO 97/30170和WO 97/31934 (它们通过引用并入本文)中描述的阳离子脂质）联合用在本发明中。
类似地，许多转染方法适合本发明且可以与本文中的教导结合使用以提供期望的组合物。如讨论的，转染通常表示使用物理或化学方法将一种或多种外源多核苷酸引入宿主细胞中。许多转染技术是本领域已知的，且包括，例如，磷酸钙DNA共沉淀；DEAE-葡聚糖；电穿孔；阳离子脂质体介导的转染；钨颗粒促进的微粒轰击；和磷酸锶DNA共沉淀。另外，电穿孔、声致穿孔、穿刺转染（impalefection）、光学转染和流体力学递送构成一些适合本发明的基于非化学的基因转染方法。
不论选择的用于实现转化的方法，应当理解，可以使用CLDN CAR核酸构建体和载体来制备公开的敏化的淋巴细胞。
VI. 宿主细胞
可以将包含编码CLDN CAR的核酸的载体引入能够携带和/或表达CAR蛋白的任何宿主细胞中，所述宿主细胞包括任意合适的原核或真核细胞。适合的转化方法包括使用慢病毒和逆转录病毒系统以及转座子和裸RNA。优选的宿主细胞是这样的宿主细胞：其可以容易地且稳定地生长，具有相当快速的生长速率，具有良好表征的表达系统，并且可以被容易地和有效地转化或转染。
本文中使用的术语“宿主细胞”表示可以含有表达载体的任何类型的细胞。所述宿主细胞可以是真核细胞(例如，植物、动物、真菌或藻类)、原核细胞(例如，细菌或原生动物)或病毒或逆转录病毒载体。所述宿主细胞可以是培养的或“成品(off-the-shelf)”细胞或原代细胞(即，直接分离自受试者)。所述宿主细胞可以是贴壁细胞或悬浮细胞，即，在混悬液中生长的细胞。合适的宿主细胞是本领域已知的，并且包括，例如，DH5α大肠杆菌细胞、中国仓鼠卵巢细胞、猴VERO细胞、COS细胞、HEK293细胞等。为了扩增或复制重组表达载体的目的，所述宿主细胞可以是原核细胞，例如，DH5α细胞。为了制备重组CAR的目的，所述宿主细胞可以是哺乳动物细胞。所述宿主细胞优选地是人细胞。所述宿主细胞可以是任何细胞类型，可以源自任何类型的组织，并且可以处于任何发育阶段。例如，可以使用从体液、组织或器官诸如血液(外周血、脐带血等)或骨髓收集、分离、纯化或诱导的细胞。可以使用外周血单核细胞(PBMC)、免疫细胞[树突细胞、B细胞、造血干细胞、巨噬细胞、单核细胞、NK细胞或造血细胞(嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞)]、脐带血单核细胞、成纤维细胞、前体脂肪细胞、肝细胞、皮肤角质形成细胞、间质干细胞、脂肪干细胞、各种癌细胞品系或神经干细胞。在特别优选的实施方案中，所述宿主细胞可以是外周血淋巴细胞(PBL)、外周血单核细胞(PBMC)或天然杀伤(NK)细胞。优选地，所述宿主细胞包含天然杀伤(NK)细胞。在其它优选的实施方案中，所述宿主细胞将是T-细胞，且在选择的实施方案中，是细胞毒性的T-细胞。用于选择合适的哺乳动物宿主细胞的方法和用于转化、培养、繁殖、筛选和纯化细胞的方法是本领域已知的。
本发明提供了一种分离的宿主细胞或其组合物，所述宿主细胞表达编码本文描述的CLDN CAR的核酸序列。在特别优选的实施方案中，所述宿主细胞包含淋巴细胞，其在公开的CAR表达后被转化成CLDN敏化的淋巴细胞。在一个实施方案中，所述宿主细胞是T-细胞。本发明的T-细胞可以是任意T-细胞，诸如培养的T-细胞(例如，原代T-细胞，或者得自培养的T-细胞系的T-细胞，或得自哺乳动物的T-细胞)。如果得自哺乳动物，T-细胞可以得自众多来源，包括、但不限于血液、骨髓、淋巴结、胸腺或其它组织或流体。T-细胞也可以被富集或纯化。T-细胞优选地是人T-细胞(例如，分离自人)。T-细胞可以处于任何发育阶段，包括、但不限于，CD4+/CD8+ 双阳性的T-细胞、CD4+ 辅助性T-细胞，例如，Th1和Th2细胞、CD8+ T-细胞(例如，细胞毒性的T-细胞)、肿瘤浸润细胞、记忆T-细胞、原初T-细胞等。在一个实施方案中，T-细胞是CD8+ T-细胞或CD4+ T-细胞。T-细胞系可得自商业来源(例如，美国典型培养物保藏中心和德国微生物和细胞培养物保藏中心)，且包括，例如，Jurkat细胞(ATCC TIB-152)、Sup-T1细胞(ATCC CRL-1942)、RPMI 8402细胞(DSMZ ACC-290)、Karpas 45细胞(DSMZACC-545)、及其衍生物。
在另一个实施方案中，所述宿主细胞是天然杀伤(NK)细胞。NK细胞是在先天性免疫系统中起作用的一类细胞毒性的淋巴细胞。NK细胞被定义为大颗粒淋巴细胞，且构成从共同淋巴祖细胞（其也产生B和T淋巴细胞）分化成的第三类细胞(参见，例如，Immunobiology, 第5版, Janeway等人, 编, Garland Publishing, New York, N.Y.(2001))。NK细胞在骨髓、淋巴结、脾、扁桃体和胸腺中分化并成熟。成熟以后，NK细胞作为具有特征性的细胞毒性颗粒的大淋巴细胞进入循环中。NK细胞能够识别和杀伤一些异常细胞，例如，一些肿瘤细胞和病毒感染的细胞，并且被认为在对抗细胞内病原体的先天性免疫防御中是重要的。如上面关于T-细胞所述，NK细胞可以是任意NK细胞，诸如培养的NK细胞，例如，原代NK细胞，或得自培养的NK细胞系的NK细胞，或得自哺乳动物的NK细胞。如果得自哺乳动物，NK细胞可以得自众多来源，包括、但不限于血液、骨髓、淋巴结、胸腺或其它组织或流体。NK细胞也可以被富集或纯化。NK细胞优选地是人NK细胞(例如，分离自人)。NK细胞系可得自商业来源(例如，美国典型培养物保藏中心)，且包括、例如，NK-92细胞(ATCC CRL-2407)、NK92MI细胞(ATCC CRL-2408)、及其衍生物。
在自体过继免疫疗法中，将患者的循环淋巴细胞或肿瘤浸润的淋巴细胞在体外分离(例如，通过血液成分部分清除)，优选地用淋巴因子（诸如IL-2）活化或刺激，并然后用编码CLDN CAR构建体的核酸转导。转导后，优选地将自体敏化的淋巴细胞用本领域已知的细胞因子支持物扩增并重新施用给患者。为了实现该目的，给动物或人患者施用免疫学上有效量的活化的淋巴细胞，其被遗传修饰成表达如本文中所述的CLDN CAR基因。在这样的自体程序中，活化的淋巴细胞(即，CLDN敏化的淋巴细胞)是患者自身的细胞，其最优选地在以前分离自血液或肿瘤样品并在体外活化和扩增。在本发明的某些方面，将来自癌症患者的T淋巴细胞或NK细胞分离并用SCT1-h27.xx多核苷酸(下面实施例9)转导，使得CLDN CAR在T细胞或NK细胞的细胞表面上表达。然后将经修饰的细胞重新施用进患者中以靶向和杀伤肿瘤细胞(通常参见图7)。
本发明的其它优选方面包含CLDN敏化的淋巴细胞的同种异体移植物。在这样的实施方案中，可以将公开的CLDN CAR引入(例如，通过转导)得自除了要治疗的受试者以外的来源的淋巴细胞中。本发明的一些方面包括使用得自供体的同种异体的淋巴细胞，所述供体已经在免疫学上与接受者匹配以减少排斥的机会。在其它方面，将公开的CAR引入“成品”同种异体淋巴细胞(参见PMID: 26183927其通过引用并入本文)中，其已经经过修饰以促进移植和在与靶细胞接触后产生适当的免疫应答。应当理解，这样的预先制造的同种异体淋巴细胞制品的应用可能在制备药学上有活性的敏化的淋巴细胞和减少患者排斥机会的方面提供几个优点。
还应当理解，可以在用CLDN CAR转化之前或之后在体外扩增CLDN敏化的淋巴细胞。扩增选择的细胞群体的方法是本领域众所周知的，且几种适合本发明的商业试剂盒是可得到的。在这点上，可以在体外扩增T细胞和/或NK细胞以提供更稳健剂量选择。例如，根据本发明，可以通过暴露于特定细胞来优先扩增NK细胞，所述特定细胞缺乏或较差地表达主要组织相容性复合物I和/或II分子且其已经被遗传修饰成表达膜结合的IL-15和4-1BB配体(CDI37L)。这样的细胞系包括，但是不一定限于，K562 (ATCC, CCL 243)和肾母细胞瘤细胞系HFWT、子宫内膜肿瘤细胞系HHUA、黑素瘤细胞系HMV-II、肝胚细胞瘤细胞系HuH-6、肺小细胞癌细胞系Lu-130和Lu-134-A、神经母细胞瘤细胞系NB 19和N1369、来自睾丸NEC 14的胚胎性癌细胞系、子宫颈癌细胞系TCO-2和骨髓转移的（metastated）神经母细胞瘤细胞系TNB 1。优选地，使用的细胞系缺乏或较差地表达MHC I和II分子，诸如K562和HFWT细胞系。类似的技术允许扩增选择的T细胞群体。在这点上，一些方法采用抗-CD3+ 自体或同种异体饲养细胞和高剂量的IL-2。其它方法使用IL-7、Il-15、IL-21或它们的组合来扩增和刺激T细胞。应当理解，前述方法中的每一种，与提供期望数目的CLDN敏化的淋巴细胞的任意方法一起，适合本发明。
VII. CLDN敏化的淋巴细胞的制剂和施用
如本文所述，可以在体外扩增CLDN敏化的淋巴细胞用于用在包含自体或同种异体淋巴细胞的过继细胞免疫疗法中。在这点上，可以使用本发明的组合物和方法来产生一群优选递送主要信号和共刺激信号的敏化的淋巴细胞用于治疗癌症，和作为例子，治疗肺癌（包括小细胞肺癌）、黑素瘤、乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、肾细胞癌、卵巢癌、神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤、白血病和淋巴瘤。在本发明中描述的组合物和方法可以与其它类型的癌症疗法（诸如化学疗法、外科手术、辐射、基因治疗、诸如此类）联合使用。
优选地以包含一种或多种药学上可接受的载体的药物组合物的形式将CLDN敏化的淋巴细胞或宿主细胞施用给受试者。在特别优选的实施方案中，公开的药物组合物将包含一群表达CLDN CAR的T细胞或NK细胞(自体细胞或同种异体细胞)。除了这样的宿主细胞以外，本发明的药物组合物可以包含其它药学活性剂或药物，诸如化学治疗剂(例如，天门冬酰胺酶、白消安、卡铂、顺铂、柔红霉素、多柔比星、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、甲氨蝶呤、紫杉醇、利妥昔单抗、长春碱、长春新碱等)或进一步促进免疫应答的佐剂疗法。在一个优选的实施方案中，所述药物组合物包含分离的表达公开的CLDN CAR的T细胞或NK细胞，和更优选地包含一群表达公开的CLDN CAR的敏化的T细胞或NK细胞。另外，如本领域众所周知的，这样的组合物可以包含药学上可接受的缓冲剂、防腐剂、赋形剂等。
可选地，可以将编码CLDN CAR的核酸序列或包含编码CLDN CAR的核酸序列的载体配制在药物组合物中并用于转导离体淋巴细胞或直接施用给患者。在这样的实施方案中，包含病毒载体宿主细胞(例如，慢病毒系统或逆转录病毒系统)或指导的人工病毒包膜的载体系统是优选的。这样的载体允许在体内产生CLDN敏化的淋巴细胞，其然后可以诱导期望的抗肿瘤免疫应答。
在任何事件中，本发明的CLDN CAR宿主细胞和任何辅助试剂可以使用本领域公认的技术以多种方式配制。在某些实施方案中，本发明的治疗性组合物可以单独施用或与最少额外组分一起施用，而其它组合物可以任选地配制成含有合适的药学上可接受的载体。本文中使用的“药学上可接受的载体”包含本领域众所周知的赋形剂、媒介物、佐剂和稀释剂，并且可得自用于在药物制剂中使用的商业来源(参见，例如，Gennaro (2003)Remington: The Science and Practice of Pharmacy with Facts and Comparisons: Drugfacts Plus, 第20版, Mack Publishing; Ansel等人(2004) Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 第7版, Lippencott Williams和Wilkins;Kibbe等人(2000) Handbook of Pharmaceutical Excipients, 第3版, PharmaceuticalPress)。
合适的药学上可接受的载体通常包含这样的物质：其是相对惰性的且可以促进敏化的淋巴细胞或宿主细胞的施用，或可以辅助它们加工成对于向作用部位递送而言经过药学上优化的制品。这样药学上可接受的载体包括可以改变制剂的形式、稠度、粘度、pH、张度、稳定性、摩尔渗透压浓度、药代动力学、蛋白聚集或溶解度的试剂，且包括缓冲剂、润湿剂、乳化剂、稀释剂、包囊剂和皮肤穿透促进剂。载体的某些非限制性例子包括盐水、缓冲盐水、右旋糖、精氨酸、蔗糖、水、甘油、乙醇、山梨醇、葡聚糖、羧甲基纤维素钠和它们的组合。用于全身施用的敏化的淋巴细胞可配制成用于肠内、胃肠外或局部施用。实际上，所有三类制剂可以同时使用以实现活性成分的全身施用。用于胃肠外和非胃肠外药物递送的赋形剂以及制剂是本领域众所周知的。
适合用于CLDN敏化的淋巴细胞的胃肠外施用(例如通过注射)的制剂包括水性的或非水性的、等渗的、无热原的、无菌的液体(例如溶液、悬浮液)，其中溶解、悬浮或以其它方式提供活性成分(例如，在脂质体或其它微粒中)。此类液体可以额外含有其它药学上可接受的载体，诸如抗氧化剂、缓冲剂、防腐剂、稳定剂、抑菌剂、助悬剂、增稠剂和使制剂与目标接受者的血液(或其它相关体液)等渗的溶质。赋形剂的例子包括例如水、醇类、多元醇类、甘油、植物油等。用于此类制剂中的合适的等渗的药学上可接受的载体的例子包括氯化钠注射液、林格氏溶液或含乳酸盐的林格氏注射液。
引入细胞组分的方法也是本领域已知的，且包括诸如在U.S.P.N. 4,844,893和4,690,915中举例说明的那些程序。使用的CLDN敏化的淋巴细胞(例如，T细胞或NK细胞)的量可以在体外和体内应用之间变化，以及随着靶细胞的量和类型变化。施用的量还将随患者的状况而变化，并且应当由从业人员在考虑所有适当的因素以后确定。
CLDN敏化的淋巴细胞的特定剂量方案(即剂量、时机和重复)将取决于特定个体以及经验考虑诸如药代动力学(例如，半衰期、清除率等)。例如，可以给个体施用增加剂量的如本文中所述生产的敏化的淋巴细胞。在选择的实施方案中，可以分别基于凭经验确定或观察的副作用或毒性而逐渐增加或降低或减少剂量。本领域技术人员诸如主治医师基于状况的考虑和正在治疗的状况的严重程度、正在治疗的受试者的年龄和总体健康状况等，可以做出施用频率的确定。可以在疗程中基于所选组合物的效力和定量施用方案的评估来调整施用频率。此类评估可以基于特定疾病、病症或状况的标志物而做出。在其中个体具有癌症的实施方案中，这些包括经由触诊或目视观察对肿瘤大小的直接测量；通过x-射线或其它成像技术对肿瘤大小的间接测量；如通过直接肿瘤活组织检查和肿瘤样品的显微镜检查所评估的改善；在本文中鉴别的间接肿瘤标志物(例如，PSMA)或CLDN抗原的测量；增殖性或致瘤性细胞的数目的减少，此类赘生性细胞的减少的维持；赘生性细胞的增殖的减少；或转移的发展的延迟。
考虑到本发明，可以按特定计划表施用CLDN CAR。通常，将有效剂量的敏化的淋巴细胞给受试者施用一次或多次。更具体地，每个月1次、超过每个月1次或小于每个月1次给受试者施用有效剂量的CLDN CAR。在某些实施方案中，可以施用有效剂量的CLDN敏化的淋巴细胞多次，包括持续至少一个月、至少六个月、至少一年、至少两年或几年的时段。在其它实施方案中，CLDN敏化的淋巴细胞的施用之间可以经过几天(2、3、4、5、6或7)、几周(1、2、3、4、5、6、7或8)或几个月(1、2、3、4、5、6、7或8))或甚至一年或几年。
在某些优选的实施方案中，涉及CLDN CAR的疗程将包含选择的敏化的淋巴细胞在数周或数月时段内的多次剂量。更具体地，可以每天一次、每两天一次、每四天次、每周一次、每十天一次、每两周一次、每三周一次、每个月一次、每六周一次、每两个月一次、每十周一次或每三个月一次施用本发明的CLDN敏化的淋巴细胞。在这点上，应当理解，可以基于患者应答和临床实践改变剂量或调节间隔。
施用给哺乳动物(例如，人)的宿主细胞的典型量可以是，例如，在100万至1000亿个细胞的范围内；但是，低于或高于该示例性范围的量是在本发明范围内。例如，本发明的宿主细胞的每日剂量可以是约100万至约500亿个细胞(例如，约500万个细胞、约2500万个细胞、约5亿个细胞、约10亿个细胞、约50亿个细胞、约200亿个细胞、约300亿个细胞、约400亿个细胞、或由前述值中的任意2个限定的范围)，优选约1000万至约1000亿个细胞(例如，约2000万个细胞、约3000万个细胞、约4000万个细胞、约6000万个细胞、约7000万个细胞、约8000万个细胞、约9000万个细胞、约100亿个细胞、约250亿个细胞、约500亿个细胞、约750亿个细胞、约900亿个细胞、或由前述值中的任意2个限定的范围)，更优选约1亿个细胞至约500亿个细胞(例如，约1.2亿个细胞、约2.5亿个细胞、约3.5亿个细胞、约4.5亿个细胞、约6.5亿个细胞、约8亿个细胞、约9亿个细胞、约30亿个细胞、约300亿个细胞、约450亿个细胞、或由前述值中的任意2个限定的范围)。在优选的实施方案中，将约5亿、10亿、15亿、20亿、25亿、30亿、35亿、40亿、45亿、50亿、55亿、60亿、65亿、70亿、75亿、80亿、85亿、90亿、95亿或100亿个细胞在一个或多个剂量中施用给患者。
通过定期评估接受治疗的患者，可以监测治疗或预防效力。对于持续若干天或更久的重复给药而言，根据情况，重复所述治疗直至疾病征状得到期望的抑制。但是，其它剂量方案可能是有用的，且在本发明的范围内。通过所述组合物的单次推注施用，通过所述组合物的多次推注施用，或通过所述组合物的连续输注施用，可以递送期望的剂量。
如上面讨论的，使用标准的施用技术，包括静脉内、腹膜内、皮下、肺、透皮、肌肉内或鼻内，可以给哺乳动物施用组合物，其包含表达CLDN CAR的敏化的宿主细胞。所述组合物优选地适合于胃肠外施用。本文中使用的术语“胃肠外”包括静脉内、肌肉内、皮下、直肠、阴道和腹膜内施用。更优选地，通过静脉内、腹膜内或皮下注射，利用外周全身递送将所述组合物施用给哺乳动物。
此外，可以将表达CLDN CAR核酸序列的宿主细胞、或包含编码CAR的核酸序列的载体与一种或多种其它治疗剂一起施用，它们可以共同施用给哺乳动物。“共同施用”是指，在时间上足够接近地施用一种或多种其它治疗剂以及包含本发明的宿主细胞或本发明的载体的组合物，使得CLDN CAR可以增强一种或多种其它治疗剂的作用，或反之亦然。在这点上，可以首先施用包含敏化的淋巴细胞的组合物，然后可以施用一种或多种其它治疗剂，或反之亦然。可选地，可以同时施用包含CLDN敏化的淋巴细胞的组合物以及一种或多种其它治疗剂。
在选择的优选的实施方案中，将CLDN敏化的淋巴细胞与淋巴毒性的疗法结合施用以增加体内平衡细胞因子(例如，IL-7、IL-15等)的可用性从而支持T细胞繁殖。在这样的方案中，优选地在施用敏化的淋巴细胞之前进行淋巴毒性的疗法。更具体地，据信，耗竭淋巴细胞的准备方案可能如下增强过继细胞疗法的效力：减少内源性淋巴细胞，由此导致支持施用的敏化的淋巴细胞的繁殖和持久性的体内平衡细胞因子的积累。此外，这样的准备处理可以导致Treg的数目和频率的短暂减少，由此减少淋巴细胞抑制和肠损伤的诱导（这可能导致活化先天性免疫系统的细菌副产物(例如，脂多糖)的全身性释放）。这样的机制一起可以实质上增强免疫环境对移植的CLDN敏化的淋巴细胞的接纳，由此促进它们的繁殖和持久性。
VIII. 适应症
本发明提供了本发明的CLDN敏化的淋巴细胞用于治疗、维持和/或预防多种病症（包括肿瘤的、炎症性的、血管生成性的和免疫学的CLDN相关病症）的用途。优选的治疗靶标是肿瘤状况，包括实体瘤和血液恶性肿瘤。在某些实施方案中，本发明的CLDN CAR治疗将用于抑制、减少或消除表达CLDN的肿瘤或致瘤性细胞。优选地，要治疗的“受试者”或“患者”将是人，尽管本文中使用的该术语明确地意在包括任何哺乳动物物种。
经受根据本发明的治疗的肿瘤状况可以是良性的或恶性的；实体瘤或其它血液肿瘤；并且可以选自包括、但不限于以下状况的组：肾上腺肿瘤、AIDS相关的癌症、软组织腺泡状肉瘤、星形细胞肿瘤、自主神经节肿瘤、膀胱癌(鳞状细胞癌和移行细胞癌)、囊胚腔病症、骨癌(成釉细胞瘤、动脉瘤性骨囊肿、骨软骨瘤、骨肉瘤)、脑和脊髓癌、转移性脑肿瘤、乳腺癌（包括三重阴性的乳腺癌）、颈动脉体肿瘤、子宫颈癌、软骨肉瘤、脊索瘤、嫌色性肾细胞癌、透明细胞癌、结肠癌、结肠直肠癌、皮肤良性纤维组织细胞瘤、结缔组织增生性小圆细胞肿瘤、室管膜瘤、上皮病症、尤因瘤、骨外粘液样软骨肉瘤、骨纤维发育不全、骨纤维性结构不良、胆囊和胆管癌、胃癌、胃肠道疾病、妊娠滋养细胞疾病、生殖细胞肿瘤、腺体病症、头颈癌、下丘脑癌、肠癌、胰岛细胞肿瘤、卡波西氏肉瘤、肾癌(肾母细胞瘤、乳头状肾细胞癌)、白血病、脂肪瘤/良性脂肪瘤、脂肪肉瘤/恶性脂肪瘤、肝癌(肝胚细胞瘤、肝细胞癌)、淋巴瘤、肺癌(小细胞癌、腺癌、鳞状细胞癌、大细胞癌等)、巨噬细胞病症、髓母细胞瘤、黑素瘤、脑膜瘤、多发性内分泌肿瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、神经母细胞瘤、神经内分泌瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳头状甲状腺癌、甲状旁腺肿瘤、儿科癌症、周边神经鞘肿瘤、嗜铬细胞瘤、垂体瘤、前列腺癌、后代眼色素层黑色素瘤(posterious unveal melanoma)、罕见性血液学病症、肾转移性癌症、杆状瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤、皮肤癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、胃癌、间质病症、滑膜肉瘤、睾丸癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲状腺转移性癌和子宫癌(子宫颈癌、子宫内膜癌和平滑肌瘤)。
在特别优选的实施方案中，所述受试者将遭受卵巢癌、胰腺癌、结直肠癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌和胃癌。在优选的实施方案中，所述受试者将是就卵巢癌、胰腺癌、结直肠癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌和胃癌而言难治的。
在其它优选的实施方案中，公开的CLDN CAR治疗在治疗肺癌中是特别有效的，所述肺癌包括下述亚型：小细胞肺癌和非小细胞肺癌(例如鳞状细胞非小细胞肺癌或鳞状细胞小细胞肺癌)。在选择的实施方案中，可以将CLDN敏感的淋巴细胞施用给表现出有限阶段疾病或广泛阶段疾病的患者。在其它优选的实施方案中，将公开的细胞组合物施用给难治性患者(即，其疾病在完成初始疗法的进程期间或之后不久复发的那些)；敏感的患者(即，其复发在初始治疗之后长于2-3个月的那些)；或表现出对基于铂的药剂(例如卡铂、顺铂、奥沙利铂)和/或紫杉烷(例如多西他赛、紫杉醇、拉罗他赛或卡巴他赛)的抗性的患者。
在另一个特别优选的实施方案中，公开的CLDN CAR治疗可有效地治疗卵巢癌，包括卵巢-浆液癌和卵巢-乳头状浆液癌。
在另一个优选的实施方案中，本发明的CLDN CAR治疗可以用在维持疗法中以减少或消除在疾病的初次呈现以后的肿瘤复发机会。优选地，所述病症将会得到治疗且最初的肿瘤块被消除、减小或以其它方式改善，使得所述患者无症状或缓解。在此时，可以给受试者施用药学有效量的公开的CLDN CAR治疗一次或多次，即使使用标准的诊断程序几乎不存在或根本不存在疾病的指征。在某些实施方案中，在一段时间内按规则计划表施用所述调节剂，诸如每周、每两周、每月、每六周、每两个月、每三个月、每六个月或每年。鉴于本文中的教导，本领域技术人员可以容易地确定有利的剂量和定量施用方案以减少疾病复发的潜力。此外，这样的治疗可以持续数周、数月、数年的时段或甚至无限，取决于患者应答和临床参数和诊断参数。
在另一个优选的实施方案中，本发明的CLDN CAR治疗可以用于预防性地或作为辅助疗法来阻止或减少减瘤（debulking）程序以后肿瘤转移的可能性。如在本发明中使用的，“减瘤程序”被广泛地定义，且应当是指消除、减少、治疗或改善肿瘤或肿瘤增殖的任何手术、技术或方法。示例性的减瘤程序包括、但不限于外科手术、辐射处理(即，光束辐射)、化学疗法、免疫疗法或切除。在本领域技术人员考虑到本发明容易地确定的适当时间，可以将公开的CLDN CAR治疗按照临床、诊断或治疗诊断程序提示施用以减少肿瘤转移。可以在使用标准技术确定的药学上有效的剂量施用CLDN敏化的淋巴细胞一次或多次。优选地，所述定量施用方案将伴有允许对它进行修改的适当诊断或监测技术。
本发明的其它实施方案包括给无症状的、但是处于发生增殖性病症的风险中的受试者施用本发明的CLDN CAR治疗。也就是说，本发明的CLDN CAR治疗可以以真实的防止性含义使用，并施用给已经经过检查或测试且具有一种或多种记录的风险因素(例如，基因组指征、家族史、体内或体外测试结果等)、但是尚未发生瘤形成的患者。在这样的情况下，本领域技术人员能够通过经验观察或通过公认的临床实践确定有效的定量施用方案。
IX. 联合治疗
如以前讨论的，应当理解，本文描述的CLDN CAR治疗可以与其它临床肿瘤学治疗联合使用。一般而言，本发明的治疗可以与治疗部分或药物诸如抗癌剂（包括、但不限于，细胞毒性剂、细胞抑制剂、抗血管生成剂、减瘤剂、化学治疗剂、放疗剂、靶向的抗癌剂、生物应答调节剂、癌症疫苗、细胞因子、激素疗法、抗转移剂和免疫治疗剂）一起使用。
联合治疗可用于预防或治疗癌症和预防癌症的转移或复发。本文中使用的“联合治疗”意指包含至少一种CLDN CAR治疗和至少一种治疗部分(例如，抗癌剂)的组合的施用，其中所述组合优选地具有治疗协同作用或者与以下治疗相比改善在癌症的治疗中的可测量的治疗效果：(i)单独使用的CLDN CAR治疗，或(ii)单独使用的治疗部分，或(iii)所述治疗部分与另一个治疗部分的联合使用，没有添加CLDN CAR治疗。本文中使用的术语“治疗协同作用”意指CLDN CAR治疗和一种或多种治疗部分的组合，所述组合具有比CLDN CAR治疗和所述一种或多种治疗部分的组合的累加效应更大的治疗效果。
通过与对照或基线测量对比来定量公开的组合的期望结果。本文中使用的相对术语诸如“改善”、“增加”或“减少”指示相对于对照的值，所述对照是诸如在起始本文所述的治疗之前在相同个体中的测量结果，或在没有本文描述的CLDN CAR治疗存在下、但是在有其它治疗部分（诸如护理标准治疗）存在下在一个对照个体(或多个对照个体)中的测量结果。一种代表性的对照个体是患有与正在治疗的个体相同形式的癌症的个体，其与正在治疗的个体的年龄约相同(以确保治疗的个体和对照个体中的疾病的阶段是可比较的)。
响应于疗法的变化或改善通常是统计上显著的。本文中使用的术语“显著性”或“显著的”涉及在两个或更多个实体之间存在非随机关联的概率的统计分析。为了确定关联是否为“显著的”或具有“显著性”，可以计算“p值”。低于用户定义的截止点的p值被认为是显著的。小于或等于0.1、小于0.05、小于0.01、小于0.005或小于0.001的p值可以被认为是显著的。
协同治疗效果可以是由单一治疗部分或CLDN CAR治疗引起的治疗效果或由给定组合的CLDN CAR治疗或单一治疗部分引起的治疗效果的总和的至少约两倍、或至少约五倍、或至少约十倍、或至少约二十倍、或至少约五十倍、或至少约一百倍的效果。协同治疗效果也可观察为，与由单一治疗部分或CLDN CAR治疗引起的治疗效果或由给定组合的CLDNCAR治疗或单一治疗部分引起的治疗效果的总和相比，治疗效果增加至少10％或至少20%、或至少30%、或至少40%、或至少50%、或至少60%、或至少70%、或至少80%、或至少90%、或至少100%或更多。协同效果还是允许在联合使用治疗剂时减少所述治疗剂的定量施用的效果。
在实施联合治疗中，可以使用相同的或不同的施用途径在单一组合物中或作为两种或更多种不同组合物将CLDN CAR治疗和治疗部分同时施用给受试者。可选地，使用CLDNCAR治疗的治疗可以在治疗部分治疗之前或之后，例如，间隔为数分钟至数周。在一个实施方案中，在彼此的约5分钟至约两周内施用治疗部分和CAR。在其它实施方案中，在CAR和治疗部分的施用之间可以经过几天(2、3、4、5、6或7)、几周(1、2、3、4、5、6、7或8)或几个月(1、2、3、4、5、6、7或8)。
可以以各种计划表(诸如每天一次、两次或三次，每两天一次，每三天一次，每周一次，每两周一次，每个月一次，每两个月一次，每三个月一次，每六个月一次)施用所述联合治疗，直至所述状况得到治疗、减轻或治愈，或者可以连续地施用。所述CAR和治疗部分可以隔日或隔周施用；或者可以施用CLDN CAR治疗的顺序，随后为一次或多次用额外治疗部分的治疗。在一个实施方案中，将CLDN CAR与一种或多种治疗部分联合施用，持续短治疗周期。在其它实施方案中，施用所述联合治疗，持续长治疗周期。可以经由任何途径施用所述联合治疗。
在某些实施方案中，所述CLDN CAR治疗(即CLDN敏化的淋巴细胞的施用)可以与多种第一线癌症治疗联合使用。在一个实施方案中，所述联合治疗包括使用CLDN CAR治疗和细胞毒性剂诸如异环磷酰胺、丝裂霉素C、长春地辛、长春碱、依托泊苷、ironitecan、吉西他滨、紫杉烷类、长春瑞滨、甲氨蝶呤和培美曲塞)和任选的一种或多种其它治疗部分。
PD-1，与它的配体PD-L1一起，是抗肿瘤T淋巴细胞应答的另一种负调节剂。在一个实施方案中，所述联合治疗可以包含CLDN CAR治疗以及抗-PD-L1抗体(例如lambrolizumab、nivolumab)和任选的一种或多种其它治疗部分。在另一个实施方案中，所述联合治疗可以包含CLDN CAR治疗以及抗-PD-L1抗体(例如MPDL3280A、MEDI4736)和任选的一种或多种其它治疗部分。在另一个实施方案中，所述联合治疗可以包含施用给患者的CLDN CAR治疗以及抗PD-1抗体(例如，pembrolizumab)，所述患者继续接受使用其它抗-PD-1和/或靶向BRAF联合治疗(例如，伊匹木单抗和威罗菲尼或dabrafinib)的治疗。
在另一个实施方案中，所述联合治疗包括使用CLDN CAR治疗和基于铂的药物(例如卡铂或顺铂)和任选的一种或多种其它治疗部分(例如长春瑞滨；吉西他滨；紫杉烷例如，多西他赛或紫杉醇；irinotican；或培美曲塞)。
在一个实施方案中，例如，在BR-ERPR、BR-ER或BR-PR癌症的治疗中，所述联合治疗包括使用CLDN CAR治疗和一种或多种被描述为“激素疗法”的治疗部分。本文中使用的“激素疗法”表示，例如，他莫昔芬；促性腺素或黄体生成素释放激素(GnRH或LHRH)；依维莫司和依西美坦；托瑞米芬；或芳香酶抑制剂(例如阿那曲唑、来曲唑、依西美坦或氟维司群)。
在另一个实施方案中，例如，在BR-HER2的治疗中，所述联合治疗包括使用CLDNCAR治疗和曲妥珠单抗或ado-trastuzumab emtansine和任选的一种或多种其它治疗部分(例如培妥珠单抗和/或多西他赛)。
在某些实施方案中，例如，在转移性乳腺癌的治疗中，所述联合治疗包括使用CLDNCAR治疗和紫杉烷(例如多西他赛或紫杉醇)和任选的额外治疗部分，例如，蒽环霉素(例如多柔比星或表柔比星)和/或艾立布林。
在另一个实施方案中，例如，在转移性或复发性乳腺癌或BRCA-突变体乳腺癌的治疗中，所述联合治疗包括使用CLDN CAR治疗和甲地孕酮和任选的额外治疗部分。
在其它实施方案中，例如，在BR-TNBC的治疗中，所述联合治疗包括使用CLDN CAR治疗和聚ADP核糖聚合酶(PARP)抑制剂(例如BMN-673、奥拉帕利、rucaparib和veliparib)和任选的额外治疗部分。
在另一个实施方案中，例如，在乳腺癌的治疗中，所述联合治疗包括使用CLDN CAR治疗和环磷酰胺和任选的额外治疗部分(例如多柔比星、紫杉烷、表柔比星、5-FU和/或甲氨蝶呤)。
在另一个实施方案中，用于治疗EGFR-阳性的NSCLC的联合治疗包括使用CLDN CAR治疗和阿法替尼和任选的一种或多种其它治疗部分(例如厄洛替尼和/或贝伐珠单抗)。
在另一个实施方案中，用于治疗EGFR-阳性的NSCLC的联合治疗包括使用CLDN CAR治疗和厄洛替尼和任选的一种或多种其它治疗部分(例如贝伐珠单抗)。
在另一个实施方案中，用于治疗ALK-阳性的NSCLC的联合治疗包括使用CLDN CAR治疗和色瑞替尼和任选的一种或多种其它治疗部分。
在另一个实施方案中，用于治疗ALK-阳性的NSCLC的联合治疗包括使用CLDN CAR治疗和克唑替尼和任选的一种或多种其它治疗部分。
在另一个实施方案中，所述联合治疗包括使用CLDN CAR治疗和贝伐珠单抗和任选的一种或多种其它治疗部分(例如紫杉烷例如，多西他赛或紫杉醇；和/或铂类似物)。
在另一个实施方案中，所述联合治疗包括使用CLDN CAR治疗和贝伐珠单抗和任选的一种或多种其它治疗部分(例如吉西他滨和/或铂类似物)。
在一个实施方案中，所述联合治疗包括使用CLDN CAR治疗和基于铂的药物(例如卡铂或顺铂)类似物和任选的一种或多种其它治疗部分(例如紫杉烷例如，多西他赛和紫杉醇)。
在一个实施方案中，所述联合治疗包括使用CLDN CAR治疗和基于铂的药物(例如卡铂或顺铂)类似物和任选的一种或多种其它治疗部分(例如紫杉烷，例如，多西他赛和紫杉醇和/或吉西他滨和/或多柔比星)。
在一个特定实施方案中，用于治疗铂抗性肿瘤的联合治疗包括使用CLDN CAR治疗和多柔比星和/或依托泊苷和/或吉西他滨和/或长春瑞滨和/或异环磷酰胺和/或亚叶酸-调节的5-氟尿嘧啶和/或贝伐珠单抗和/或他莫昔芬；和任选的一种或多种其它治疗部分。
在另一个实施方案中，所述联合治疗包括使用CLDN CAR治疗和PARP抑制剂和任选的一种或多种其它治疗部分。
在另一个实施方案中，所述联合治疗包括使用CLDN CAR治疗和贝伐珠单抗和任选的环磷酰胺。
所述联合治疗可以包含CLDN CAR治疗和对肿瘤有效的化疗部分，所述肿瘤包含突变的或异常地表达的基因或蛋白(例如BRCA1)。
更一般地，本发明的CLDN CAR治疗可以与许多抗癌剂联合使用。本文中使用的术语“抗癌剂”或“化学治疗剂”是“治疗部分”的一个子集，所述治疗部分又是被描述为“药学上有活性的部分”的药剂的子集。更具体地，“抗癌剂”意指可用于治疗细胞增殖性病症诸如癌症的任何药剂，包括、但不限于细胞毒性剂、细胞抑制剂、抗血管生成剂、减瘤剂、化学治疗剂、放射疗法和放疗剂、靶向的抗癌剂、生物反应调节剂、治疗性抗体、癌症疫苗、细胞因子、激素疗法、抗转移剂和免疫治疗剂。应当理解，在如上面所讨论的所选实施方案中，此类抗癌剂可以包含抗体药物缀合物，并且可以在施用前与抗体结合。
也可以是抗癌剂的术语“细胞毒性剂”意指对细胞有毒性且降低或抑制细胞的功能和/或造成细胞的破坏的物质。通常，所述物质是源自活生物体的天然存在的分子(或合成地制备的天然产物)。细胞毒性剂的例子包括、但不限于小分子毒素或细菌的酶活性毒素(例如，白喉毒素、假单胞菌内毒素和外毒素、葡萄球菌肠毒素A)、真菌的酶活性毒素(例如，α-帚曲毒蛋白、局限曲菌素)、植物的酶活性毒素(例如，相思豆毒蛋白、蓖麻蛋白、蒴莲根毒蛋白、viscumin、美洲商陆抗病毒蛋白、皂草素、白树毒素、momoridin、天花粉蛋白、大麦毒素、油桐蛋白、石竹素蛋白、美洲商陆蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草抑制剂、丝林霉素(mitegellin)、局限曲菌素、酚霉素、新霉素和单端孢菌毒素)或动物的酶活性毒素(例如，细胞毒性的RNA酶，诸如细胞外胰腺RNA酶；DNA酶I，包括其片段和/或变体)。
抗癌剂可以包括抑制、或被设计为抑制癌细胞或可能变为癌性或生成致瘤性后代的细胞(例如，致瘤性细胞)的任何化学剂。此类化学试剂经常针对对于细胞生长或分裂而言必需的细胞内过程，并且因此对通常迅速生长和分裂的癌细胞是特别有效的。例如，长春新碱使微管解聚，并且因此抑制细胞进入有丝分裂。此类试剂经常施用，并且经常在组合中（例如，在制剂CHOP中）是最有效的。
可以与本发明的CLDN CAR治疗联合使用的抗癌剂的例子包括、但不限于：烷化剂类、烷基磺酸酯类、阿那曲唑、鹅膏亭类、氮丙啶类、乙烯亚胺类和甲基蜜胺类、番荔枝内酯类、喜树碱、BEZ-235、硼替佐米、苔藓抑素、callystatin、CC-1065、色瑞替尼、克唑替尼、念珠藻环肽类、多拉司他汀、多卡米星、软珊瑚醇、厄洛替尼、水鬼蕉碱、sarcodictyin、海绵抑素、氮芥类、抗生素类、烯二炔达内霉素、双磷酸盐类、埃斯波霉素、色蛋白烯二炔抗生素生色团、阿克拉霉素类、放线菌素、氨茴霉素(authramycin)、偶氮丝氨酸、博来霉素类、放线菌素C、坎磷酰胺、carabicin、洋红霉素、嗜癌霉素、色霉素类、环磷酰胺、更生霉素、柔红霉素、地托比星、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星、表柔比星、依索比星、依西美坦、氟尿嘧啶、氟维司群、吉非替尼、伊达比星、拉帕替尼、来曲唑、氯那法尼、麻西罗霉素、乙酸甲地孕酮、丝裂霉素类、麦考酚酸、诺拉霉素、橄榄霉素类、帕唑帕尼、培洛霉素、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素、雷帕霉素、罗多比星、索拉非尼、链黑霉素、链佐星、他莫昔芬、柠檬酸他莫昔芬、替莫唑胺、tepodina、替匹法尼、杀结核菌素、乌苯美司、凡他尼布、伏氯唑、XL-147、净司他丁、佐柔比星；抗代谢药、叶酸类似物、嘌呤类似物、雄激素类、抗-肾上腺类、叶酸补充剂诸如亚叶酸(frolinic acid)、醋葡醛内酯、醛磷酰胺糖苷、氨基酮戊酸、恩尿嘧啶、安吖啶、bestrabucil、比生群、依达曲沙(edatraxate)、地磷酰胺(defofamine)、秋水仙胺、地吖醌、elfornithine、依利醋铵、埃博霉素、依托格鲁、硝酸镓、羟基脲、香菇多糖、lonidainine、美坦辛类、米托胍腙、米托蒽醌、mopidanmol、nitraerine、喷司他丁、蛋氨氮芥、吡柔比星、洛索蒽醌、鬼臼酸、2- 乙基酰肼、丙卡巴肼、多糖复合物、雷佐生；根霉素；SF-1126、西佐喃；锗螺胺；替奴佐酸；三亚胺醌；2,2',2”-三氯三乙胺；单端孢霉烯类(T-2毒素、疣孢菌素(verracurin) A、杆孢菌素A和蛇行菌素)；urethan；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷; gacytosine；阿糖胞苷；环磷酰胺；塞替派；紫杉烷类, chloranbucil；吉西他滨; 6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物，长春碱；铂；依托泊苷；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺肖林；替尼泊苷；依达曲沙；道诺霉素；氨基蝶呤；希罗达；伊班膦酸盐；伊立替康，拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸；维A酸类；卡培他滨；考布他汀；亚叶酸；奥沙利铂; XL518，减少细胞增殖的PKC-α、Raf、H-Ras、EGFR和VEGF-A的抑制剂，和以上任一种的药学上可接受的盐或溶剂合物、酸或衍生物。在该定义中还包括抗激素剂（其起作用以调节或抑制激素对肿瘤的作用）诸如抗雌激素剂和选择性的雌激素受体抗体，抑制酶芳香酶（其调节肾上腺中的雌激素产生）的芳香酶抑制剂，和抗雄激素类；以及曲沙他滨(一种1,3- 二氧杂环戊烷核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，核酶诸如VEGF表达抑制剂和HER2表达抑制剂；疫苗，PROLEUKIN®rIL-2；LURTOTECAN®拓扑异构酶1抑制剂；ABARELIX®rmRH；长春瑞滨和埃斯波霉素和以上任一种的药学上可接受的盐或溶剂合物、酸或衍生物。
特别优选的抗癌剂包括商业上或临床上可得到的化合物诸如厄洛替尼(特罗凯®, Genentech/OSI Pharm.), 多西他赛(泰索帝®, Sanofi-Aventis), 5-FU (氟尿嘧啶, 5-氟尿嘧啶, CAS No. 51-21-8), 吉西他滨(健择®, Lilly), PD-0325901 (CASNo. 391210-10-9, Pfizer), 顺铂(顺式-二胺, 二氯铂(II), CAS No. 15663-27-1), 卡铂(CAS No. 41575-94-4), 紫杉醇(泰素®, Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton, N.J.), 曲妥珠单抗(赫赛汀®, Genentech), 替莫唑胺(4-甲基-5-氧代- 2,3,4,6,8-五氮杂双环[4.3.0]壬-2,7,9-三烯-9-甲酰胺, CAS No. 85622-93-1, TEMODAR®, TEMODAL®, Schering Plough), 他莫昔芬((Z)-2-[4-(1,2-二苯基丁-1-烯基)苯氧基]-N,N-二甲基乙胺, 诺瓦得士®, ISTUBAL®, VALODEX®),和多柔比星(阿霉素®)。另外的商业上或临床上可得到的抗癌剂包括奥沙利铂(ELOXATIN®, Sanofi), 硼替佐米(万珂®, Millennium Pharm.), 索坦(舒尼替尼®, SU11248, Pfizer), 来曲唑(弗隆®,Novartis), 甲磺酸伊马替尼(格列卫®, Novartis), XL-518 (Mek抑制剂, Exelixis,WO 2007/044515), ARRY-886 (Mek抑制剂, AZD6244, Array BioPharma, AstraZeneca), SF-1126 (PI3K抑制剂, Semafore Pharmaceuticals), BEZ-235 (PI3K抑制剂,Novartis), XL-147 (PI3K抑制剂, Exelixis), PTK787/ZK 222584 (Novartis), 氟维司群(FASLODEX®, AstraZeneca), 甲酰四氢叶酸(亚叶酸), 雷帕霉素(西罗莫司, 雷帕鸣®, Wyeth), 拉帕替尼(TYKERB®, GSK572016, Glaxo Smith Kline), 氯那法尼(SARASAR™, SCH 66336, Schering Plough), 索拉非尼(多吉美®, BAY43-9006, BayerLabs), 吉非替尼(易瑞沙®, AstraZeneca), 伊立替康(CAMPTOSAR®, CPT-11,Pfizer), 替匹法尼(ZARNESTRA™, Johnson & Johnson), ABRAXANE™(不含克列莫佛),紫杉醇的白蛋白工程改造的纳米颗粒制剂(American Pharmaceutical Partners,Schaumberg, Il), 凡他尼布(rINN, ZD6474, ZACTIMA®, AstraZeneca),chloranmbucil, AG1478, AG1571 (SU 5271; Sugen), 坦罗莫司(TORISEL®, Wyeth),帕唑帕尼(GlaxoSmithKline), 坎磷酰胺(TELCYTA®, Telik), 塞替派和环磷酰胺(CYTOXAN®, NEOSAR®)；长春瑞滨(诺维本®)；卡培他滨(希罗达®, Roche), 他莫昔芬(包括诺瓦得士®；柠檬酸他莫昔芬, 法乐通®(枸橼酸托瑞米芬)，MEGASE®(乙酸甲地孕酮), 阿诺新®(依西美坦; Pfizer), 福美坦（formestanie）, 法倔唑, RIVISOR®(伏氯唑), 弗隆®(来曲唑; Novartis),和瑞宁得®(阿那曲唑; AstraZeneca)。
术语“药学上可接受的盐”或“盐”意指分子或大分子的有机或无机盐。酸加成盐可以用氨基形成。示例性的盐包括，但不限于，硫酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、草酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸式磷酸盐、异烟酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、酸式柠檬酸盐、酒石酸盐、油酸盐、鞣酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、龙胆酸盐（gentisinate）、富马酸盐、葡萄糖酸盐、葡糖醛酸盐、蔗糖酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐和扑酸盐(即，1,1′亚甲基二-(2-羟基3-萘甲酸盐))。药学上可接受的盐可以涉及包括另一种分子诸如乙酸根离子、琥珀酸根离子或其它平衡离子。所述平衡离子可以是稳定母体化合物上的电荷的任何有机或无机部分。此外，药学上可接受的盐可以在其结构中具有超过一个带电荷的原子。当多个带电荷的原子是药学上可接受的盐的组成部分时，所述盐可以具有多个平衡离子。因此，药学上可接受的盐可以具有一个或多个带电荷的原子和/或一个或多个平衡离子。
“药学上可接受的溶剂合物”或“溶剂合物”表示一个或多个溶剂分子与分子或大分子的结合。形成药学上可接受的溶剂合物的溶剂的例子包括，但不限于，水、异丙醇、乙醇、甲醇、DMSO、乙酸乙酯、乙酸和乙醇胺。
在其它实施方案中，本发明的CLDN CAR治疗可以与当前处于临床试验或商购可得的多种抗体(或免疫治疗剂)中的任一种联合使用。为此目的，公开的CLDN敏化的淋巴细胞可以与选自以下的抗体联合使用：阿巴伏单抗、阿德木单抗、阿托珠单抗、阿仑珠单抗、阿妥莫单抗、amatuximab、anatumomab、阿西莫单抗、巴维昔单抗、贝妥莫单抗、贝伐珠单抗、比伐珠单抗、兰妥莫单抗、brentuximab、美坎珠单抗、卡妥索单抗、西妥昔单抗、citatuzumab、西妥木单抗、clivatuzumab、可那木单抗、达雷木单抗、drozitumab、duligotumab、dusigitumab、地莫单抗、达西珠单抗、dalotuzumab、依美昔单抗、依洛珠单抗、ensituximab、厄马索单抗、埃达珠单抗、法利珠单抗、ficlatuzumab、芬妥木单抗、flanvotumab、futuximab、ganitumab、吉妥珠单抗、吉瑞昔单抗、glembatumumab、替伊莫单抗、伊戈伏单抗、imgatuzumab、indatuximab、伊珠单抗、英妥木单抗、伊匹木单抗、伊妥木单抗、拉贝珠单抗、lambrolizumab、来沙木单抗、林妥珠单抗、lorvotuzumab、鲁卡木单抗、马帕木单抗、马妥珠单抗、米拉珠单抗、明瑞莫单抗、米妥莫单抗、moxetumomab、narnatumab、naptumomab、奈昔木单抗、尼妥珠单抗、nivolumab、若莫单抗、阿托珠单抗、ocaratuzumab、奥法木单抗、olaratumab、奥拉帕利、onartuzumab、oportuzumab、奥戈伏单抗、帕木单抗、parsatuzumab、patritumab、pemtumomab、培妥珠单抗、pidilizumab、平妥单抗、普立木单抗、雷妥莫单抗、radretumab、雷莫芦单抗、利妥木单抗、利妥昔单抗、罗妥木单抗、沙妥莫单抗、司美替尼、西罗珠单抗、司妥昔单抗、simtuzumab、solitomab、他珠单抗、taplitumomab、替妥莫单抗、替妥木单抗、替加珠单抗、托西莫单抗、曲妥珠单抗、tucotuzumab、ublituximab、维妥珠单抗、vorsetuzumab、伏妥莫单抗、扎芦木单抗、CC49、3F8、MDX-1105和MEDI4736和它们的组合。
其它特别优选的实施方案包括使用被批准用于癌症治疗的抗体，包括，但不限于，利妥昔单抗、吉妥珠单抗奥唑米星、阿仑珠单抗、替伊莫单抗、托西莫单抗、贝伐珠单抗、西妥昔单抗、patitumumab、奥法木单抗、伊匹木单抗和brentuximab vedotin。本领域技术人员将能够容易地鉴别适合本文中的教导的额外抗癌剂。
本发明还提供了CLDN CAR治疗与放射疗法(即，用于在肿瘤细胞内局部地诱导DNA损伤的任何机制，诸如γ-辐照、X-射线、紫外光照射、微波、电子发射等)的组合。还预见到使用放射性同位素向肿瘤细胞的定向递送的联合治疗，并且公开的CLDN CAR治疗可以与靶向的抗癌剂或其它靶向方式结合使用。通常，在约1至约2周的时间段中以脉冲形式施用辐射疗法。可以将辐射疗法施用给患有头颈癌的受试者持续约6至7周。任选地，可以施用辐射疗法作为单次剂量或作为多个连续剂量。
X. 诊断
本发明提供了用于检测、诊断或监测任何淋巴细胞转导的效率或任何CLDN敏化的淋巴细胞对肿瘤细胞（包括致瘤性细胞）的影响的体外和体内方法。这样的方法包括鉴别用于治疗的具有癌症(例如，CLDN阳性的肿瘤)的个体或监测癌症的进展，包括在用CLDN敏化的淋巴细胞治疗之前、过程中或之后用如本文中所述的抗体测试患者或得自患者的样品(体内或体外)，并检测样品中所述抗体或游离靶分子的存在或不存在、或所述抗体的结合水平。在某些实施方案中，所述CLDN抗体将包含如本文中所述的可检测标记或报告分子。在其它的实施方案(例如，原位杂交或ISH)中，与基因组CLDN决定簇反应的核酸探针将用在增殖性病症的检测、诊断或监测中。
更一般地，使用蛋白或核酸分析领域的普通技术人员可得到的许多技术中的任一种，例如，直接物理测量(例如，质谱法)、结合测定(例如，免疫测定、凝集测定和免疫色谱测定)、聚合酶链式反应(PCR、RT-PCR; RT-qPCR)技术、支链寡核苷酸技术、RNA印迹技术、寡核苷酸杂交技术和原位杂交技术，可以测量CLDN决定簇的存在和/或水平。所述方法还可以包括测量从化学反应产生的信号，例如，光学吸光度的变化，荧光的变化，化学发光或电化学发光的产生，反射率、折射率或光散射的变化，来自表面的可检测标记的积累或释放，氧化或还原或氧化还原物质，电流或电势，磁场的变化等。合适的检测技术可以如下检测结合事件：通过经由标记的光致发光(例如，经由测量荧光、时间分辨荧光、隐失波荧光、上转换磷光体、多光子荧光等)、化学发光、电化学发光、光散射、光学吸光度、放射性、磁场、酶活性(例如，通过测量酶活性，这通过造成光学吸光度或荧光的变化或造成化学发光的发射的酶反应实现)测量所述标记，从而测量标记结合试剂的参与。可选地，可以使用不需要使用标记的检测技术，例如，基于测量质量(例如，表面声波测量)、折射率(例如，表面等离子体共振测量)或分析物的固有发光的技术。
在某些实施方案中，检测剂与样品中的特定细胞或细胞组分的结合指示，所述样品可能含有致瘤性细胞，由此指示可以用如本文中所述的组合物有效地治疗所述具有癌症的个体。
在某些优选的实施方案中，所述测定可以包含免疫组织化学(IHC)测定或其变体(例如，荧光、产色、标准ABC、标准LSAB等)、免疫细胞化学或其变体(例如，直接、间接、荧光、产色等)或原位杂交(ISH)或其变体(例如，产色原位杂交(CISH)或荧光原位杂交(DNA-FISH或RNA-FISH))。
在这点上，本发明的某些方面包括经标记的CLDN用于免疫组织化学(IHC)的用途。更具体地，CLDN IHC可以用作诊断工具来辅助诊断多种增殖性病症和监测对治疗（包括CLDN抗体疗法）的潜在应答。如本文中讨论的和在下面实施例中证实的，可以在已经化学固定(包括、但不限于: 甲醛、戊二醛、四氧化锇、重铬酸钾、乙酸、醇、锌盐、氯化汞、四氧化铬和苦味酸)和包埋(包括、但不限于: 甲基丙烯酸乙二醇酯、石蜡和树脂)或通过冷冻保存的组织上执行适合的诊断测定。这样的测定可以用于指导治疗决定和确定定量施用方案和时机。
本发明的其它特别适合的方面包括使用原位杂交来检测或监测CLDN决定簇。原位杂交技术或ISH是本领域技术人员众所周知的。简而言之，将细胞固定，并将含有特定核苷酸序列的可检测探针加给固定的细胞。如果所述细胞含有互补的核苷酸序列，则所述探针（其可以被检测到）将与它们杂交。使用本文所述的序列信息，可以设计探针以鉴别表达基因型CLDN决定簇的细胞。探针优选地与对应于这样的决定簇的核苷酸序列杂交。常规地可以优化杂交条件以使非完全互补的杂交产生的背景信号最小化，尽管优选地所述探针优选地与选择的CLDN决定簇完全互补。在选择的实施方案中，用附着于探针的荧光染料来标记探针，所述荧光染料可容易地通过标准荧光方法学检测到。
适合的体内治疗诊断或诊断测定可以包含本领域公知的成像或监测技术诸如磁共振成像、计算机化断层摄影(例如CAT扫描)、正电子断层摄影术(例如，PET扫描)放射摄影术、超声等，如本领域技术人员已知的。
在一个特别优选的实施方案中，本文公开的抗体可以用于检测和定量患者样品(例如，血浆或血液)中的特定决定簇(例如，CLDN)的水平，所述水平又可以用于在用CLDN敏化的淋巴细胞治疗之前和之后检测、诊断或监测增殖性病症。在有关的实施方案中，本文公开的抗体可以用于与公开的CLDN敏化的淋巴细胞治疗组合地检测、监测和/或定量体内或体外循环肿瘤细胞(WO 2012/0128801)。在其它的实施方案中，所述循环肿瘤细胞可以包括致瘤性细胞。
在本发明的某些实施方案中，可以在CLDN CAR疗法或方案之前使用公开的抗体评估或表征受试者或来自受试者的样品中的致瘤性细胞，以建立基线。在其它实施例中，可以从衍生自所治疗的受试者的样品评估致瘤性细胞。
XI. 制成品
本发明还包括药物包和包含一个或多个容器的试剂盒，其中容器可以包含一个或多个转化剂量的本发明的CLDN CAR质粒或载体。在某些实施方案中，所述包或试剂盒含有载体制品(例如，慢病毒或逆转录病毒)，所述载体制品包含编码CLDN CAR的核酸，含有或没有一种或多种另外的试剂和任选的实现转导的工具。优选地，所述试剂盒还将包括在施用前监测和表征CLDN敏感的淋巴细胞的制备的工具。
在选择的实施方案中，适合本发明的试剂盒将允许用户生产CLDN敏感的淋巴细胞、监测转导速率和表征得到的CLDN敏感的淋巴细胞群体以确保施用之前的质量。因此，本发明的试剂盒通常含有CAR核酸(或载体)的药学上可接受的制剂，和任选的在相同或不同容器中的一种或多种试剂。在优选的实施方案中，所述CLDN CAR载体将包含病毒载体(例如，慢病毒或逆转录病毒)，其允许转导选择的宿主细胞以提供公开的敏化的淋巴细胞。在某些实施方案中，所述选择的宿主细胞将是自体的(即源自要治疗的患者)，而在其它实施方案中，所述选择的宿主细胞将是同种异体的。本发明的某些方面涉及试剂盒，其包括同种异体细胞以及CLDN CAR载体。其它实施方案包含含有药物组合物的试剂盒或容器，所述药物组合物包含同种异体的CLDN敏化的淋巴细胞。在这样的试剂盒中，所述容器可以包含输注袋，其允许将CLDN敏化的淋巴细胞直接施用给患者。
所述试剂盒也可以含有用于诊断或联合治疗的其它药学上可接受的制剂或装置。诊断装置或器械的例子包括可以用于检测、监测、定量或描绘与CLDN敏感的淋巴细胞、转化效率或要治疗的增殖性病症相关的细胞或标志物的那些。在特别优选的实施方案中，所述装置可以用于体内或体外检测、监测和/或定量循环肿瘤细胞。在其它优选的实施方案中，循环肿瘤细胞可以包含致瘤性细胞。
当在一种或多种液体溶液中提供试剂盒的选定组分时，所述液体溶液可以是非水性的，但是，水溶液是优选的，其中无菌水溶液是特别优选的。试剂盒的制剂(例如，病毒载体)还可以作为干燥粉末或以低压冻干形式（其可以在添加适当液体后重构）提供。用于重构的液体可以被包含在单独的容器中。这样的液体可以包含无菌的药学上可接受的缓冲液或其它稀释剂，诸如抑制细菌注射用水、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液或右旋糖溶液。在试剂盒包含与另外试剂组合的本发明的CAR质粒或载体的情况下，可以将溶液预混合（在摩尔当量组合中，或一种组分相对于其它组分过量）。可选地，可以在转化淋巴细胞之前将本发明的质粒和任何任选的辅助试剂分别维持在不同容器内。在其它优选的实施方案中，试剂盒的容器可以包含同种异体的CLDN敏化的淋巴细胞的液体制剂。
所述试剂盒可以包含一个或多个容器和在容器内、表面上或与容器伴随的标签或包装说明书，其指示包封的组合物用于准备细胞用于治疗选择的疾病状况。合适的容器包括，例如，瓶子、小瓶、注射器等。所述容器可以由多种材料诸如玻璃或塑料形成。所述容器可以包含无菌接近口，例如，所述容器可以是静脉内溶液袋或具有可以被皮下注射针穿透的塞子的小瓶。
在某些实施方案中，所述试剂盒可以含有用于将敏化的淋巴细胞和任何任选的组分施用给患者的装置，例如，一个或多个针头或注射器(预填充的或空的)，滴眼管、移液器、或其它这样的类似设备，从所述装置可以将制剂注射或引入受试者中或应用于身体的患病区域。本发明的试剂盒还将通常包括用于容纳小瓶的装置，或这样的类似物，和用于商业销售的在密闭空间中的其它组分，例如，吹塑成型的塑料容器，其中放置并保留期望的小瓶和其它设备。
XIII. 其它内容
除非在本文中另外定义，与本发明结合使用的科学和技术术语应当具有本领域普通技术人员通常理解的含义。而且，除非上下文有其它规定，单数形式的术语应当包括复数，而复数形式的术语应当包括单数。另外，在说明书和所附权利要求中提供的范围包括两个端点和在所述端点之间的所有点。因此，2.0-3.0的范围包括2.0、3.0、和在2.0与3.0之间的所有点。
通常，本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学和化学的技术是本领域众所周知和常用的那些。本文所使用的命名法以及此类技术也是本领域中常用的。通常根据本领域众所周知的常规方法，并且如贯穿本说明书引用的各种参考文献中所述，执行本发明的方法和技术，除非另外指出。
XIV. 参考文献
无论关于特定参考文献是否使用短语“通过引用并入”，在本文中引用的所有专利、专利申请和出版物的整个公开内容以及电子地可得到的材料(包括，例如，核苷酸序列提交(在例如GenBank和RefSeq中)和氨基酸序列提交(在例如SwissProt、PIR、PRF、PDB中)，以及来自GenBank和RefSeq内的标注编码区的翻译)都通过引用并入。仅为了理解清楚的目的，已经给出前述详细描述和随后的实施例。从其中不应理解不必要的限制。本发明不限于所示和所述的精确细节。在由权利要求定义的本发明中将包括本领域技术人员显而易见的变型。本文使用的任何段落标题仅仅用于组织目的，不应解释为限制主题描述的方法。
XV. 序列
本申请附有附图和包含许多核酸和氨基酸序列的序列表。以下表2提供了包括的序列的概述。
表2
SEQ ID NO 描述
1 κ轻链(LC)恒定区蛋白
2 IgGI重链(HC)恒定区蛋白
3 scFv接头蛋白
4 SC27.108 scFv核酸
5 SC27.108 scFv氨基酸
6 SC27.204v2 scFv核酸
7 SC27.204v2 scFv氨基酸
8 SCT1-h27.108核酸
9 SCT1-h27.108氨基酸
10 SCT1-h27.204v2核酸
11 SCT1-h27.204v2氨基酸
12-19 保留
20 SC27.1 VL DNA
21 SC27.1 VL蛋白
22 SC27.1 VH DNA
23 SC27.1 VH蛋白
24-59 如在SEQ ID NO: 20-23中的额外小鼠克隆
60 hSC27.1 VL DNA
61 hSC27.1 VL蛋白
62 hSC27.1 VH DNA
63 hSC27.1 VH蛋白
64-75 如在SEQ ID NO: 60-63中的额外人源化克隆
76-77 hSC27.108v1 VL DNA和蛋白
78-79 hSC27.22-VH1-8 VH DNA和蛋白
80-81 hSC27.22-VH1-46 VH DNA和蛋白
82-83 hSC27.22-VH1-69 VH DNA和蛋白
84-85 hSC27.204v1 DNA和蛋白
86-87 hSC27.204v2 DNA和蛋白
88-89 hSC27.204v3 DNA和蛋白
90-91 hSC27.204v4 DNA和蛋白
92-93 hSC27.204v5 DNA和蛋白
94-95 hSC27.204v6 DNA和蛋白
96-97 hSC27.204v7 DNA和蛋白
98-99 hSC27.204v8 DNA和蛋白
100-101 hSC27.204v9 DNA和蛋白
102-103 hSC27.204v10 DNA和蛋白
104-105 hSC27.204v11 DNA和蛋白
106-107 hSC27.204v12 DNA和蛋白
108-109 hSC27.204v13 DNA和蛋白
110-111 hSC27.204v14 DNA和蛋白
112-113 hSC27.204v15 DNA和蛋白
114-115 hSC27.1全长LC和HC蛋白
116-117 hSC27.22全长LC和HC蛋白
118-119 hSC27.108全长LC和HC蛋白
120-121 hSC27.204全长LC和HC蛋白
122 hSC27.22ss1全长HC蛋白
123 hSC27.22-VH1-8全长HC蛋白
124 hSC27.22-VH1-46全长HC蛋白
125 hSC27.22-VH1-69全长HC蛋白
126 hSC27.22 IgG2全长HC蛋白
127 hSC27.22 IgG4 R409K全长HC蛋白
128 hSC27.22 IgG4 S228P全长HC蛋白
129 hSC27.22 IgG4 S228P K370E R409K全长HC蛋白
130 hSC27.22 IgG4 K370E全长HC蛋白
131 hSC27.22 IgG4 S228P K370E全长HC蛋白
132 hSC27.22 IgG4 C127S S228P全长HC蛋白
133 hSC27.22 IgG4 C127S K370E全长HC蛋白
134 hSC27.22 IgG4 C127S S228P K370E全长HC蛋白
135 hSC27.108v1全长LC蛋白
136 hSC27.204v1全长HC蛋白
137 hSC27.204v2全长HC蛋白
138 hSC27.204v3全长HC蛋白
139 hSC27.204v4全长HC蛋白
140 hSC27.204v5全长HC蛋白
141 hSC27.204v6全长HC蛋白
142 hSC27.204v7全长HC蛋白
143 hSC27.204v8全长HC蛋白
144 hSC27.204v9全长HC蛋白
145 hSC27.204v10全长HC蛋白
146 hSC27.204v11全长HC蛋白
147 hSC27.204v12全长HC蛋白
148 hSC27.204v13全长HC蛋白
149 hSC27.204v14全长HC蛋白
150 hSC27.204v15全长HC蛋白
151-156 hSC27.1 CDRL1; CDRL2; CDRL3, CDRH1; CDRH2; CDRH3
157-162 hSC27.22 CDRL1; CDRL2; CDRL3, CDRH1; CDRH2; CDRH3
163-168 hSC27.108 CDRL1; CDRL2; CDRL3, CDRH1; CDRH2; CDRH3
169-174 hSC27.204 CDRL1; CDRL2; CDRL3, CDRH1; CDRH2; CDRH3
175 hSC27.204v1、hSC27.204v5和hSC27.405v13的CDRH2
176 hSC27.204v2、hSC27.204v6和hSC27.405v14的CDRH2
177 hSC27.204v3、hSC27.204v7和hSC27.405v15的CDRH2
178 密码子优化的hSC27.22ss1全长HC DNA
如在下面实施例4中讨论的，上面表2还可以用于指示在图3A和3B中描绘的示例性Kabat CDR的SEQ ID NO。更具体地，图3A和3B表示每个重(CDRH)和轻(CDRL)链可变区序列的三个Kabat CDR，且上面表2提供了SEQ ID命名的指定，其可以应用于轻链的每个CDRL1、CDRL2和CDRL3以及重链的每个CDRH1、CDRH2和CDRH3。使用该方法，可以给图3A和3B所示的每个独特CDR指定连续的SEQ ID NO且可以用于提供本发明的衍生抗体。
XVI. 肿瘤列表
PDX肿瘤细胞类型通过缩写和随后的数字表示，其指示特定肿瘤细胞系。测试的样品的传代数由随附样品名称的p0-p#指示，其中p0指示直接得自患者肿瘤的未传代的样品，且p#指示在测试之前肿瘤已经通过小鼠传代的次数。如本文中使用的，肿瘤类型和亚型的缩写显示在如下表3中：
表3
肿瘤类型 缩写 肿瘤亚型 缩写
乳房 BR
雌激素受体阳性的和/或黄体酮受体阳性的 BR-ERPR
ERBB2/Neu阳性的 BR- ERBB2/Neu
HER2阳性的 BR-HER2
三重阴性的 TNBC
三重阴性的封闭蛋白亚型 TNBC-CLDN
结肠直肠 CR
子宫内膜 EN
胃 GA
弥散性腺癌 GA-Ad-Dif/Muc
肠腺癌 GA-Ad-Int
间质瘤 GA-GIST
胶质母细胞瘤 GB
头和颈 HN
肾 KDY
清晰的肾细胞癌 KDY-CC
乳头状肾细胞癌 KDY-PAP
移行细胞或泌尿道上皮癌 KDY-URO
未知 KDY-UNK
肝 LIV
肝细胞癌 LIV-HCC
胆管癌 LIV-CHOL
淋巴瘤 LN
肺 LU
腺癌 LU-Ad
类癌 LU-CAR
大细胞神经内分泌的 LU-LCC
非小细胞 NSCLC
鳞状细胞 LU-SCC
小细胞 SCLC
梭形细胞 LU-SPC
黑素瘤 MEL
卵巢 OV
透明细胞 OV-CC
子宫内膜样的 OV-END
混合亚型 OV-MIX
恶性的混合中胚层 OV-MMMT
粘液的 OV-MUC
神经内分泌的 OV-NET
乳头状浆液的 OV-PS
浆液的 OV-S
小细胞 OV-SC
移行细胞癌 OV-TCC
胰腺 PA
腺泡细胞癌 PA-ACC
十二指肠癌 PA-DC
粘液腺癌 PA-MAD
神经内分泌的 PA-NET
腺癌 PA-PAC
腺癌外分泌型 PA-PACe
导管腺癌 PA-PDAC
壶腹腺癌 PA-AAC
前列腺 PR
皮肤 SK
黑素瘤 MEL
鳞状细胞癌 SK-SCC
实施例
通过参考以下实施例将更容易理解至此在上面一般地描述的发明，所述实施例通过举例的方式提供，且无意限制本发明。所述实施例无意表示以下实验是进行的所有或唯一实验。除非另外指出，份是重量份，分子量是重量平均分子量，温度是以摄氏度为单位，且压力是处于或接近大气压。
实施例1
肿瘤上的CLDN4、CLDN6和CLDN9表达的鉴别
为了表征实体瘤当存在于癌症患者中时的细胞异质性、辅助使用特定表型标志物鉴别CSC和鉴别临床上有关的治疗靶标，使用本领域公认的技术开发和维持大PDX肿瘤库。通过最初得自罹患多种实体瘤恶性肿瘤的众多癌症患者的异质肿瘤细胞的多次传代，在免疫受损的小鼠中繁殖PDX肿瘤库，其包含大数目的离散肿瘤细胞系。大量具有明确定义的谱系的离散早代PDX肿瘤细胞系的持续可用性极大地促进所述鉴别，且CSC作为PDX肿瘤的分离允许可再现地和重复地表征CSC。最少传代的PDX肿瘤细胞系的应用会简化体内实验并提供容易证实的结果。此外，早代PDX肿瘤会对治疗剂诸如伊立替康(即Camptosar®)做出应答，这会提供临床上有关的洞察力来理解驱动肿瘤生长、对现有疗法的抗性和肿瘤复发的相关机制。
为了从PDX肿瘤细胞系生成RNA，在肿瘤达到800 - 2,000 mm3之后从小鼠切除肿瘤，并使用本领域公知的酶消化技术(参见，例如，U.S.P.N. 2007/0292414)将肿瘤解离成单细胞悬浮液。将选择的解离的PDX肿瘤细胞制备物除尽小鼠细胞，并基于其CD46高和/或CD324 (CSC亚群的标志物)的表达进行分选(关于CD46高的定义，参见U.S.P.N2013/0260385)。将表达人EpCAM、CD46高和/或CD324 (即CSC)或EpCAM、但不表达CD46高和/或CD324(即NTG细胞)的细胞通过使用BD FACSAria细胞分选仪的FACS分离，并根据生产商的说明书在RLTplus RNA裂解缓冲液(Qiagen)中裂解。然后将裂解物在-80℃储存，并解冻用于RNA提取。解冻后，按照供应商的说明书使用RNeasy分离试剂盒(Qiagen, GmbH)提取总RNA，并然后再次使用生产商的方案和推荐的仪器设置使用NanoDrop分光光度计(ThermoScientific)和/或Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies)进行定量。通过基因测序和基因表达分析来评估得到的总RNA制备物。
使用Applied Biosystems (ABI) Sequencing by Oligo Ligation/Detection(SOLiD) 4.5或SOLiD 5500xl下一代测序系统(Life Technologies)进行定量的高质量RNA的全转录组测序。使用来自ABI的被设计用于低输入总RNA的改进全转录组方案或OvationRNA-Seq系统V2™(NuGEN Technologies)，从1 ng总RNA样品生成cDNA。将得到的cDNA文库片段化，并添加条形码适配子以允许在测序运行过程中合并来自不同样品的片段文库。将由SOLiD平台生成的数据映射至使用公布的人基因组的NCBI版本hg19.2由RefSeq版本47注释的34,609个基因，并且提供在大多数样品中的RNA水平的可验证测量。使用映射至基因的外显子区域的度量RPM (每百万的读数)和RPKM(每百万每千碱基的读数)，将来自SOLiD平台的测序数据名义上表示为转录物表达值，从而使基础基因表达分析能够被归一化和列举为RPM_Transcript或RPKM_Transcript。
使用SOLiD的全转录组测序的结果显示与以下PDX细胞系中的NTG相比在分选的CSC中的CLDN4 mRNA的表达升高：BR13、BR22、OV100、PA20和PA3，以及在额外的CSC群体(包括BR36、OV106MET、OV72MET和OV91MET)中的高表达(图1)。CLDN6 mRNA在分选的CSC群体(包括BR36、OV106MET、OV72MET和OV91MET)中升高(图1)。不同于对于CLDN4或CLDN6的情况，观察到相关的家族成员CLDN9在所有分选的肿瘤群体中具有低表达。与肿瘤样品相反，正常卵巢和胰腺组织显示所有三种家族成员CLDN4、CLDN6和CLDN9没有表达或非常低的mRNA表达。
不同类型的人肿瘤中的升高的CLDN4和CLDN6 mRNA表达的鉴别指示这些抗原值得作为潜在的诊断和/或免疫治疗靶标进一步评价。
实施例2
重组CLDN蛋白的克隆和表达
为了推导封闭蛋白蛋白序列之间的关系，使用Vector NTI软件包的AlignX程序比对来自23种人CLDN基因的30种封闭蛋白蛋白序列。该比对的结果被描绘为图2A中的树形图。该图的概览显示，CLDN6和CLDN9在序列上非常密切地相关，从而在树形图的相同分支上彼此相邻出现。图2A还显示，CLDN4是CLDN6的下一个最密切相关的家族成员。数据的更详细的概览显示，人CLDN6蛋白在细胞外结构域(ECD)中与人CLDN9蛋白序列非常密切相关，其中在ECD1中具有>98％同一性且在ECD2中具有>91％同一性(图2B)。还发现人CLDN4在ECD序列中与人CLDN6密切相关，其中在ECD1中具有>84％同一性且在ECD2中具有>78％同一性(图2B)。基于这些蛋白序列关系，假定用人CLDN6抗原免疫接种可以产生识别人CLDN6的抗体，其也将与人CLDN9交叉反应，且可能还与人CLDN4交叉反应。
为了确定筛选这些多反应性的封闭蛋白抗体将需要CLDN6、CLDN9和CLDN4的何种物种直系同源物，分析来自以下物种各自的CLDN4、CLDN6和CLDN9的ECD序列：人、食蟹猴、小鼠和大鼠。当可用时，使用AlignX和NCBI数据库蛋白序列进行分析(人、小鼠和大鼠蛋白的NP登录号显示于图2C中)。可选地，从通过人CLDN可读框序列相对于食蟹猴全基因组鸟枪法测序重叠群的BLAST组装的食蟹猴CLDN基因的翻译推导蛋白序列。这些比对的检查揭示：(1) CLDN4、CLDN6和CLDN9蛋白的推导的食蟹猴蛋白ECD序列与各自人ECD序列具有100%同一性；(2)小鼠和大鼠CLDN9 ECD序列与人直系同源物序列具有100%同一性；且(3)小鼠和大鼠CLDN4和CLDN6 ECD序列彼此不同且不同于各自的人直系同源物。因此，包含人CLDN4、人CLDN6、人CLDN9、小鼠CLDN4、小鼠CLDN6、大鼠CLDN4和大鼠CLDN6的七种构建体的集合的生成应当能够确定任何结合结构域与所有可能的12种直系同源物的交叉反应性。
编码人CLDN6、CLDN4和CLDN9蛋白的DNA片段
为了生成在本发明中有用的与人CLDN6 (hCLDN6)蛋白有关的分子和细胞材料，合成了密码子优化的DNA片段，其编码与NCBI蛋白登录NP_067018相同的蛋白(IDT)。将该DNA克隆用于表达成熟hCLDN6蛋白或其片段的构建体的所有后续工程改造。类似地，购买密码子优化的编码与NCBI蛋白登录NP_001296（对于人CLDN4 (hCLDN4)）或NCBI蛋白登录NP_066192（对于人CLDN9 (hCLDN9)）相同的蛋白的DNA片段，并用于表达hCLDN4或hCLDN9蛋白或其片段的构建体的所有后续工程改造。
编码小鼠CLDN6和CLDN4蛋白的DNA片段
为了生成在本发明中有用的与小鼠CLDN6 (mCLDN6)蛋白有关的分子和细胞材料，合成密码子优化的编码与NCBI蛋白登录NP_061247相同的蛋白的DNA片段(IDT)。将该DNA克隆用于表达成熟mCLDN6蛋白或其片段的构建体的所有后续工程改造。类似地，购买密码子优化的编码与NCBI蛋白登录NP_034033（对于小鼠CLDN4 (mCLDN4)）相同的蛋白的DNA片段，且用于表达成熟mCLDN4蛋白或其片段的构建体的所有后续工程改造。
编码大鼠CLDN6和CLDN4蛋白的DNA片段
为了生成在本发明中有用的与大鼠CLDN6 (rCLDN6)蛋白有关的分子和细胞材料，合成密码子优化的编码与NCBI蛋白登录NP_001095834相同的蛋白的DNA片段(IDT)。将该DNA克隆用于表达成熟rCLDN6蛋白或其片段的构建体的所有后续工程改造。类似地，购买密码子优化的编码与NCBI蛋白登录NP_001012022（对于大鼠CLDN4 (rCLDN4)）相同的蛋白的DNA片段，且用于表达成熟rCLDN4蛋白或其片段的构建体的所有后续工程改造。
细胞系工程改造
使用本领域公认的技术使用慢病毒载体转导HEK-293T或3T3细胞系，构建过表达上面列出的各种CLDN蛋白的经工程改造的细胞系。首先，使用上述商业合成的DNA片段作为模板，使用PCR扩增编码目标蛋白(例如，hCLDN6、mCLDN6、rCLDN6、hCLDN9、hCLDN4、mCLDN4或rCLDN4)的DNA片段。然后，将各种PCR产物亚克隆进慢病毒表达载体pCDH-EF1-MCS-T2A-GFP(System Biosciences)的多克隆位点(MCS)中，以生成一系列慢病毒载体。所得到的pCDH-EF1-CLDN-T2A-GFP载体中的T2A序列会促进肽键缩合的核糖体跳跃，从而导致两种独立蛋白的表达：在T2A肽的上游编码的特定CLDN蛋白的高水平表达，在T2A肽的下游编码的GFP标记蛋白的共表达。使用本领域技术人员众所周知的标准慢病毒转导技术，使用该组慢病毒载体建立过表达各种CLDN蛋白的单独的稳定的HEK-293T或3T3细胞系。使用也是GFP强阳性的高表达HEK-293T亚克隆，用FACS选择CLDN阳性的细胞。
实施例3
抗-CLDN抗体的制备
因为CLDN6是与CLDN4和CLDN9最同源的(参见图2A和上面在实施例2中所述的分析)，所以将CLDN6用作用于制备多反应性的抗-CLDN抗体的免疫原。给小鼠接种过表达hCLDN6的HEK-293T细胞或3T3细胞(如在实施例2中所述制备)，以便生成产生抗体的杂交瘤。给6只小鼠(以下品系各2只：Balb/c、CD-1、FVB)接种100万个用等体积的TiterMax®佐剂乳化的hCLDN6-HEK-293T细胞。使用过表达CLDN6的3T3细胞，执行6只小鼠(以下品系各2只：Balb/c、CD-1、FVB)的第二次单独接种。在初次接种以后，每周2次给小鼠注射过表达CLDN6的细胞（用等体积的明矾佐剂乳化）持续4周。
将小鼠处死并对引流淋巴结(腘、腹股沟和内侧髂)进行解剖并将其用作抗体生产细胞的来源。使用模型BTX Hybrimmune系统(BTX Harvard Apparatus)通过电细胞融合将B细胞的单细胞悬浮液(305x106个细胞)与非分泌性的P3x63Ag8.653骨髓瘤细胞(ATCC #CRL-1580)以1:1的比例融合。将细胞再悬浮于杂交瘤选择培养基：补充有偶氮丝氨酸(Sigma)、15％胎牛克隆I血清(Hyclone)、10％BM condimed (Roche Applied Sciences)、1mM丙酮酸钠、4 mM L-谷氨酰胺、100 IU青霉素-链霉素、50 μM 2-巯基乙醇和100 μM次黄嘌呤的DMEM培养基(Cellgro)，并在三个T225烧瓶中在每个烧瓶的90 mL选择培养基中培养。将烧瓶置于含有5％CO2和95％空气的增湿37℃培养箱中6天。将该文库以约15x106个活细胞/瓶冷冻于6个小瓶的CryoStor CS10缓冲液(BioLife Solutions)中，且在液氮中储存。
将来自文库的一个小瓶在37℃解冻，并将冷冻的杂交瘤细胞加入90 mL上述的杂交瘤选择培养基，并置于T150烧瓶中。将细胞在具有5％CO2和95％空气的增湿37℃培养箱中培养过夜。次日，从烧瓶收集杂交瘤细胞，并以1个细胞/孔(使用FACSAria I细胞分选仪)在200 μL补充的杂交瘤选择培养基中铺板到48块Falcon 96-孔U-底平板中。将杂交瘤培养10天，并使用流式细胞计量术针对对hCLDN6, hCLDN4或hCLDN9蛋白特异性的抗体筛选上清液。如下进行流式细胞计量术：将1x105/孔的HEK-293T细胞（用编码hCLDN6、hCLDN4或hCLDN9的慢病毒载体稳定地转导）与100 μL杂交瘤上清液一起温育30分钟。将细胞用PBS/2%FCS洗涤，然后与每个样品50 μL DyeLight 649标记的山羊-抗-小鼠IgG、Fc片段特异性的第二抗体(在PBS/2%FCS中1:200稀释)一起温育。15分钟温育之后，将细胞用PBS/2%FCS洗涤两次，并且再悬浮于含有DAPI(以检测死细胞)的PBS/2%FCS中，并通过流式细胞计量术针对超过用同种型对照抗体染色的细胞的荧光的荧光进行分析。在旁边设置针对一种或多种CLDN抗原的抗体测试阳性的所选杂交瘤，用于进一步表征。将剩余的未使用的杂交瘤文库细胞在液氮中冷冻用于将来文库测试和筛选。
实施例4
抗-CLDN抗体的测序
如上所述生成抗-CLDN抗体，然后如下测序。使用RNeasy Miniprep Kit (Qiagen)根据生产商的说明书从所选杂交瘤细胞纯化总RNA。每个样品使用104至105个细胞。将分离的RNA样品在-80℃储存直至使用。使用与对所有小鼠Ig同种型特异性的3' 小鼠Cγ引物组合的两种5'引物混合物，扩增每种杂交瘤的Ig重链的可变区，所述5'引物混合物包含86种小鼠特异性的前导序列引物，所述引物被设计成靶向完整小鼠VH所有组成成分。类似地，将两种引物混合物（其含有64种被设计成扩增每个VK小鼠家族的5' VK前导序列）与对小鼠κ恒定区特异性的单一反向引物联合使用，以便对κ轻链扩增和测序。如下使用Qiagen一步(OneStep) RT-PCR试剂盒，从100 ng总RNA扩增VH和VL转录物。针对每种杂交瘤运行总共四个RT-PCR反应，两个针对VK轻链和两个针对VH重链。PCR反应混合物包括1.5 μL RNA、0.4µL100 μM重链或κ轻链引物(由IDT定制合成)，5 μL 5x RT-PCR缓冲液、1 μL dNTP、和0.6 μL含有逆转录酶和DNA聚合酶的酶混合物。热循环仪程序包括以下步骤：RT步骤50℃持续60分钟，95℃持续15分钟，随后是35个循环(94.5℃持续30秒，57℃持续30秒，72℃持续1分钟)，和在72℃持续10分钟的最终温育。使用与上文所述相同的特异性可变区引物，对提取的PCR产物进行测序。将PCR产物送至外部测序供应商(MCLAB)用于PCR纯化和测序服务。
图3A描绘了来自抗-CLDN抗体的几种新颖小鼠轻链可变区的连续氨基酸序列(SEQID NO: 21-57, 奇数)。图3B描绘了来自相同抗-CLDN抗体的新颖小鼠重链可变区的连续氨基酸序列(SEQ ID NO: 23-59, 奇数)。小鼠轻链和重链可变区核酸序列提供于图3C中(SEQID NO: 20-58, 偶数)。综上，图3A和3B提供了10种小鼠抗-CLDN抗体(称为SC27.1、SC27.22、SC27.103、SC27.104、SC27.105、SC27.106、SC27.108 (等同于SC27.109)、SC27.201、SC27.203和SC27.204)的注解序列。注解氨基酸序列以鉴别根据Kabat定义的框架区(即FR1 - FR4)和互补性决定区(即图3A中的CDRL1 - CDRL3或图3B中的CDRH1 -CDRH3)。使用Abysis数据库的专有版本分析可变区序列以提供CDR和FR名称。尽管根据Kabat将CDR编号，本领域技术人员会明白，也可以根据Chothia、McCallum或任何其它接受的命名系统来定义CDR和FR名称。
每种特定抗体的SEQ ID NO是连续的奇数。因此，单克隆抗-CLDN抗体SC27.1包含氨基酸SEQ ID NO: 21和23（分别对于VL和VH）；且SC27.22包含SEQ ID NO: 25和27等。每种抗体氨基酸序列的对应核酸序列被包括在图3C中，且具有在相应氨基酸SEQ ID NO前面紧邻的SEQ ID NO。因此，例如，SC27.1抗体的VL和VH的核酸序列的SEQ ID NO分别是SEQ IDNO:20和22。
实施例5
嵌合的和人源化的抗-CLDN抗体的制备
如下使用本领域公知的技术制备嵌合的抗-CLDN抗体。使用标准的生化技术从产生抗-CLDN抗体的杂交瘤提取总RNA，并PCR扩增所述RNA。关于小鼠抗体的VH和VL链的V、D和J基因区段的数据得自本发明的抗-CLDN抗体的核酸序列(关于核酸序列，参见图3C)。使用以下限制位点，设计对抗体的VH和VL链的框架序列特异性的引物集合：对于VH片段为AgeI和XhoI，和对于VL片段为XmaI和DraIII。用Qiaquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化PCR产物，然后用限制性酶AgeI和XhoI（对于VH片段）和XmaI和DraIII（对于VL片段）消化。将VH和VL消化的PCR产物分别纯化并连接进IgH或IgK表达载体中。在10 μL的总体积中进行连接反应，所述总体积含有200 U T4-DNA连接酶(New England Biolabs)、7.5 μL消化和纯化的基因特异性的PCR产物和25 ng线性化的载体DNA。将感受态大肠杆菌DH10B细菌(LifeTechnologies)在42℃经由热激用3 μL连接产物转化，并以100 μg/mL的浓度铺板于氨苄西林平板上。在扩增的连接产物的纯化和消化之后，将VH片段克隆进包含HuIgG1的pEE6.4表达载体(Lonza) (pEE6.4HuIgG1)的AgeI-XhoI限制位点，并将VL片段克隆进包含人κ轻链恒定区的pEE12.4表达载体(Lonza) (pEE12.4Hu-κ)的XmaI-DraIII限制位点。
通过用pEE6.4HuIgG1和pEE12.4Hu-κ表达载体共转染HEK-293T或CHO-S细胞，表达嵌合抗体。转染前，在标准条件下在150 mm平板中在Dulbecco氏改良的伊格尔培养基(DMEM) (其补充有10%热灭活的FCS、100 μg/mL链霉素和100 U/mL青霉素G)中培养HEK-293T细胞。对于瞬时转染，使细胞生长至80％汇合。将2.5 μg每种pEE6.4HuIgG1和pEE12.4Hu-κ载体DNA加给在1.5 mL Opti-MEM内的10 μL HEK-293T转染试剂。将该混合物在室温温育30分钟，并添加给细胞。在转染后3-6天，收获上清液。对于CHO-S细胞，将2.5 μg每种pEE6.4HuIgG1和pEE12.4Hu-κ载体DNA加给在400µL Opti-MEM中的15 μg PEI转染试剂。将混合物在室温温育10分钟，并添加给细胞。在转染后3-6天，收获上清液。通过在800×g离心10分钟，从细胞碎片澄清含有重组嵌合抗体的培养物上清液，并在4℃储存。用蛋白A珠子纯化重组嵌合抗体。
如下使用专有的计算机辅助的CDR移植方法(Abysis Database, UCL Business)和标准分子工程改造技术，将小鼠抗-CLDN抗体人源化。基于人种系抗体序列的框架序列和CDR规范结构以及相关小鼠抗体的框架序列和CDR之间的最高同源性，设计可变区的人框架区。为了分析的目的，根据Kabat编号将氨基酸分配至每个CDR结构域。一旦选择出可变区，从合成基因区段生成它们(Integrated DNA Technologies)。使用上面关于嵌合抗体所述的分子方法克隆和表达人源化抗体。
人源化抗体的VL和VH氨基酸序列衍生自相应小鼠抗体的VL和VH序列(例如，hSC27.1衍生自小鼠SC27.1)。在生成的四种人源化抗体(hSC27.1、hSC27.22、hSC17.108和hSC27.204)的轻链或重链可变区中没有产生框架改变或回复突变。
为了解决稳定性担忧，使用相同VH1家族中的不同VH框架产生hSC27.22的三种变体。所述变体被称为hSC27.22-VH1-8; hSC27.22-VH1-46; hSC27.22-VH1-69。此外，构建hSC27.108的一种变体，被称为hSC27.108v1，其与hSC27.108共享相同的重链(SEQ ID NO:119)，但是与hSC27.108相比在轻链上不同。此外，生成hSC27.204的几种变体，被称为hSC27.204v1至hSC27.204v15，它们都共享相同的轻链(SEQ ID NO: 120)，但是在重链上不同。hSC27.204和hSC27.204v4的重链相差单个框架区突变T28D。hSC27.204v1至hSC27.204v3和hSC27.204v5至hSC27.204v7在CDR中掺入保守突变以解决稳定性担忧。具体地，hSC27.204v1、hSC27.204v2和hSC27.204v3在hSC27.204重链背景上分别含有修饰N58K、N58Q和T60N。类似地，hSC27.204v5、hSC27.204v6和hSC27.204v7在hSC27.204v4背景上分别含有修饰N58K、N58Q和T60N。最后，变体hSC27.204v8和hSC27.204v9在重链的位置93处不包括回复突变，以使免疫原性最小化。具体地，除了变体8-15缺乏A93T回复突变以外，变体hSC27.204v8、hSC27.204v9、hSC27.204v10、hSC27.204v11、hSC27.204v12、hSC27.204v13、hSC27.204v14和hSC27.204v15分别对应于变体hSC27.204、hSC27.204v1、hSC27.204v2、hSC27.204v3、hSC27.204v4、hSC27.204v5、hSC27.204 6和hSC27.204v7。
另外，构建hSC27.22人源化抗体恒定区的9种变体。第一变体hSC27.22ss1是位点特异性的变体，并在下面实施例8中更详细地描述。通过用IgG2 (被称为“hSC27.22 IgG2”)或IgG4的突变形式(被称为“hSC27.22 IgG4 R409K”；“hSC27.22 IgG4 S228P”；“hSC27.22IgG4 S228P K370E R409K”；“hSC27.22 IgG4 K370E”；“hSC27.22 IgG4 S228P K370E”；“hSC27.22 IgG4 C127S S228P”；“hSC27.22 IgG4 C127S K370E”；和“hSC27.22 IgG4C127S S228P K370E”)置换IgG同种型，构建其它变体。下表4显示了根据Kabat等人编号的人源化抗CLDN抗体及其变体和残基变化的概述。
在每种情况下，检查人源化抗体的结合亲和力，以确保其基本上等同于相应的小鼠抗体。图3A描绘了示例性人源化抗体及其变体的VL的连续氨基酸序列。图3B描绘了示例性人源化抗体及其变体的VH的连续氨基酸序列。抗-CLDN人源化抗体的轻链和重链可变区的核酸序列提供在图3C中。
表4
应当理解，每种前述抗体或其免疫反应片段可以用于提供根据本发明的CLDN CAR结合结构域。
实施例6
抗-CLDN抗体的特异性
表征如实施例3中所述生成的小鼠抗体，以确定它们是否与CLDN家族成员和CLDN家族成员的直系同源物交叉反应。
如下进行流式细胞计量术分析：用如上述实施例4中所述制备的编码(i) hCLDN6、mCLDN6和rCLDN6；(ii) hCLDN9；或(iii) hCLDN4、mCLDN4和rCLDN4的慢病毒载体稳定地转导HEK-293T细胞。将用上述表达构建体稳定地转导的1x105个HEK-293T细胞与hSC27.1或hSC27.22抗体（在50µl终体积的PBS/2%FCS中稀释至10 μg/ml）一起在4℃温育30分钟。温育后，将细胞用200 μL PBS/2%FCS洗涤，通过离心进行沉淀，弃去上清液，并将细胞沉淀物再悬浮于50 μL/样品的在PBS/2%FCS中1:200稀释的DyeLight 649标记的山羊-抗-小鼠IgG、Fc片段特异性的第二抗体中。在4℃温育15分钟之后，将细胞如先前所述用PBS/2%FCS洗涤和沉淀两次，并再悬浮于100 μL含有2 μg/mL 4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐(DAPI)的PBS/2%FCS中。通过流式细胞计量术分析样品，并针对超过用同种型对照抗体染色的细胞的荧光的荧光用DyeLight 649评估活细胞。
上述流式细胞计量术测定导致众多抗-CLDN抗体的鉴别。基于所述抗体与特异性地过表达指示的CLDN家族成员的细胞系的结合相对于使用荧光减去一种(FMO)同种型对照(灰色-实心)确定的信号的几何平均荧光强度的变化(ΔMFI)，确定交叉反应性(图4A)。因而，两种hCLDN6结合抗体SC27.1和SC27.22可以描述为封闭蛋白多反应性的抗体，因为它们在该测定中与人CLDN家族的三个成员(hCLDN6、hCLDN4和hCLDN9)交叉反应。SC27.1和SC27.22抗体也结合CLDN4和CLDN9的小鼠和大鼠直系同源物(数据未显示)。
为了测试各种额外小鼠抗体的结合CLDN家族成员的能力，使用过表达人CLDN4、CLDN6或CLND9的细胞系进行流式细胞计量术，所述细胞系已经与10 μg/mL的纯化的第一抗-CLDN抗体或小鼠IgG2b对照抗体一起温育，随后与Alexa 647抗-小鼠第二抗体一起温育。如在图4B中所示，所有抗体都结合CLDN6，但是一些是CLDN6特异性的(例如SC27.102、SC27.105和SC27.108)，且其它是多反应性的且结合CLDN6和CLDN9 (例如，SC27.103和SC27.204)或结合CLDN6和CLDN4 (例如，SC27.104)。因此，对于本发明的抗体，获得广范围的多反应性结合概况。
为了对比多反应性的抗-CLDN抗体对CLDN6和CLDN9的表观结合亲和力，用人源化的抗-CLDN抗体hSC27.22的系列稀释物进行流式细胞计量术。将抗体连续稀释至在50 pg/ml至100 μg/ml范围内的浓度，并添加至含有过表达CLDN6或CLDN9的HEK-293T细胞的96孔板，并在冰上保持1小时。添加第二抗-人抗体(Jackson ImmunoResearch目录号109-605-098)，并在暗处温育1小时。将细胞在PBS中洗涤两次，此后添加Fixable Viability染料(eBioscience目录号65-0863-14)保持10分钟。用PBS额外洗涤后，将细胞用多聚甲醛(PFA)固定，并根据生产商的说明书在BD FACS Canto II流式细胞计上读出。使用荧光微球(Bangs Laboratories)根据生产商的说明书将MFI值归一化。使用以下方程式，使用关于抗体与CLDN6或CLDN9表达细胞的结合观察到的归一化的最大MFI值，将数据转换为每种过表达细胞的分数最大结合：分数最大结合＝(观察到的归一化的MFI/最大归一化的MFI)。然后使用log (抑制剂)相对于GraphPad Prism软件包(La Jolla, CA)中提供的应答模型的四参数可变斜率曲线拟合，计算hSC27.22对每种细胞系的结合的表观EC50值。图4C表明，人源化的多反应性的抗-CLDN6抗体hSC27.22具有的对CLDN6的表观EC50与对CLDN9的表观EC50基本上相同(表观EC50 CLDN6 - 3.45 μg/mL (拟合优度的r2= 0.9987，99%置信界限：2.51- 4.75 μg/mL)；表观EC50 CLDN9 - 4.66 μg/mL (拟合优度的r2 = 0.9998，99%置信界限：4.09 - 5.31 μg/mL))。
因此，可以定制公开的CAR的结合结构域以与选择的CLDN蛋白(例如，CLDN6)或与CLDN蛋白的组合(例如，CLDN6和CLDN9)结合（取决于期望的治疗指数）。
实施例7
抗-CLDN嵌合抗原受体的制备
抗-CD19 CAR的制造
为了制备阳性对照CAR构建体，合成了编码针对人CD19的第二代CAR的合成可读框(参见US2014/0271635) (Life Technologies)，并将其亚克隆进慢病毒表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-T2A-Puro (System Biosciences, Mountain View CA)的多克隆位点(MCS)中。然后由CMV启动子驱动CD19 CAR构建体的表达，而双顺反子GFP-T2A-Puro可读框允许通过分析GFP表达(例如，显微术或FACS)和使用抗生素嘌呤霉素选择细胞来检测转导的细胞。抗-CD19 CAR可读框包含这样的核苷酸，其从5’至3’编码来自人CD8α链的信号前导序列(氨基酸1 - 21, UniProt accession P01732-1)、从识别人CD19的小鼠单克隆抗体衍生出的scFv (Nicholson等人, 1997; PMID 9566763)、人CD8α铰链、跨膜结构域和近侧区域(氨基酸138 - 206, UniProt accession P01732-1)、来自人4-1BB蛋白的细胞内共刺激性信号传导区域(氨基酸214-255, UniProt accession Q07011-1)和人CD3ζ链细胞内信号传导区域(氨基酸52 - 164, UniProt accession P20963-1)。除了提供阳性对照以外，以这样的方式用限制位点设计抗-CD19 CAR/慢病毒表达载体：抗-CD19 scFv组分可以被容易地除去并用针对任何选定决定簇的替代结合区域组分置换。如下所述，使用在图5中所示的该盒系统(SCT1-XX，其中XX指示特定CLDN结合结构域组分)来验证本发明的不同实施方案。应当指出，取决于上下文，SCT命名可以表示表达的抗-CLDN CAR蛋白、表达CAR蛋白的细胞毒性的淋巴细胞、抗-CLDN CAR ORF或包含相同ORF的表达载体(例如，慢病毒、逆转录病毒、质粒等)（取决于上下文）。
SCT1-h27.108的制造
为了制备新颖的抗-CLDN CAR构建体(SCT1-h27.108)，首先如下合成编码scFv片段的核苷酸序列：经由五聚体多聚体GlyGlyGlyGlySer (G4S)3 (ggggsggggsggggs; SEQ ID NO.3)接头将抗-hSCh27.108 VL (SEQ ID NO. 68)和VH (SEQ ID NO. 70)核苷酸序列可操作地连接在一起以提供hSC27.108-scFv多核苷酸序列：
其编码下面马上阐述的氨基酸序列：
其中scFv包含在SEQ ID NO. 69中所示的VL氨基酸序列和在SEQ ID NO. 71中所示的VH氨基酸序列。
随后使用标准的分子工程改造技术将hSC27.108-scFv核苷酸序列克隆进SCT1盒中以提供包含抗-CLDN CAR的SCT1-h27.108慢病毒表达载体。在这点上，SCT1-27.108 CAR包含从5’至3’编码以下元件的可读框：CD8α链前导序列区域(氨基酸1-21, UniProtP01732-1)、h27.108 VL结构域(按照实施例5)、(G4S)3合成接头序列(氨基酸1-15, Huston等人, 1988)、h27.108 VH结构域(按照实施例5)、人CD8α铰链和跨膜结构域(氨基酸138 -206, UniProt accession P01732-1)、来自人4-1BB蛋白的细胞内共刺激性信号传导区域(氨基酸214-255, UniProt accession Q07011-1)和人CD3ζ链细胞内信号传导区域(氨基酸52 - 164, UniProt accession P20963-1)。对CAR可读框进行序列确认。SCT1-h27.108CAR可读框的示意图显示在图5中，对应的核酸序列显示在图6A (SEQ ID NO. 8)中，且得到的氨基酸序列显示在图6B (SEQ ID NO. 9)中。
SCT1-h27.204 v2的制造
为了制备新颖的抗-CLDN CAR构建体(SCT1-h27.204v2)，首先如下合成编码scFv片段的核苷酸序列：经由五聚体多聚体GlyGlyGlyGlySer (G4S)3 (ggggsggggsggggs; SEQ IDNO. 3)接头将抗-hSCh27.204 VL (SEQ ID NO. 72)和VH (SEQ ID NO. 86)核苷酸序列可操作地连接在一起以提供hSC27.204v2-scFv多核苷酸序列：
其编码下面马上阐述的氨基酸序列：
其中scFv包含在SEQ ID NO. 73中所示的VL氨基酸序列和在SEQ ID NO. 87中所示的VH氨基酸序列。
随后使用标准的分子工程改造技术将hSC27.204v2-scFv核苷酸序列克隆进SCT1盒中以提供包含抗-CLDN CAR的SCT1-h27.204v2慢病毒表达载体。在这点上，SCT1-27.204v2 CAR包含从5’至3’编码以下元件的可读框：CD8α链前导序列区域(氨基酸1-21,UniProt P01732-1)、h27.204 VL结构域(按照实施例5)、(G4S)3合成接头序列(氨基酸1-15,Huston等人, 1988)、h27. 204v2 VH结构域(按照实施例5)、人CD8α铰链和跨膜结构域(氨基酸138 - 206, UniProt accession P01732-1)、来自人4-1BB蛋白的细胞内共刺激性信号传导区域(氨基酸214-255, UniProt accession Q07011-1)和人CD3ζ链细胞内信号传导区域(氨基酸52 - 164, UniProt accession P20963-1)。对CAR可读框进行序列确认。SCT1-h27.204v2 CAR可读框的示意图显示在图5中，对应的核酸序列显示在图6C (SEQ IDNO. 10)中，且得到的氨基酸序列显示在图6D (SEQ ID NO. 11)中。
实施例8
慢病毒载体颗粒的制备和表征
如下进行SCT1-h27.108和SCT1-h27.204v2的慢病毒载体包装：在有聚乙烯亚胺(Polysciences)存在下，以1:4的DNA:PEI比率将10ug SCT1-h27.108或SCT1-h27.204v2质粒、7ug pΔR8.74和4ug pMD2.G共转染进1000万个HEK-293T细胞(ATCC)中。将共转染的细胞在37℃(5%CO2)温育过夜，随后在次日更换培养基。转染后48小时，将含有慢病毒颗粒的培养基收获并通过在4℃在1200rpm离心5min进行澄清以除去细胞碎片。为了沉淀慢病毒载体颗粒，将澄清的培养基在4℃在19500rpm超速离心2小时。超速离心以后，抛弃上清液，将病毒沉淀物再悬浮于无菌PBS中，并在-80℃储存。通过p24 ELISA (Cell Biolabs)评估回收的慢病毒载体储备物的定量，并通过标准慢病毒载体滴定方法评估基因转移效率(功能滴度)。慢病毒载体储备物的通常收率是在7-15 ug/ml p24抗原范围内，且功能滴度是在1-3 x 10e8 TU/ml范围内。将SCT1-h27.108和SCT1-27.204v2慢病毒载体储备物冷冻和储存直到使用。
如在以后的实施例中所述，可以使用载体储备物来制备敏化的淋巴细胞和诱导期望的免疫应答，如贯穿本申请详细讨论的和在随文附带的图7中示意地显示的。
实施例9
表达SCT1-H27.108和SCT1-H27.204V2 CAR构建体的T淋巴细胞的制备
通过在有10ug/ml聚凝胺(EMD Millipore)存在下以约4的感染复数(MOI)用来自以前实施例的SCT1-h27.108或SCT1-h27.204v2慢病毒载体转导100万个Jurkat E6-1 (ATCC) T淋巴细胞以确保有效的病毒转导，制备表达SCT1-h27.108或SCT1-h27.204v2的CLDN靶标特异性的Jurkat淋巴细胞。将所述细胞在有慢病毒颗粒存在下在37℃(5%CO2)温育72小时。然后，将用过的培养基用含有2ug/ml嘌呤霉素(Life Technologies)的新鲜培养基替换以阳性地选择表达SCT1-h27.108或SCT1-h27.204v2的细胞。将细胞在有嘌呤霉素存在下温育另外5天，然后通过流式细胞计量术推断抗-CLDN scFv在细胞表面上的存在(图8A)。更具体地，然后将表达SCT1-h27.108或SCT1-h27.204v2的经转导的Jurkat细胞和未转导的对照细胞如本文中所述沉淀、洗涤并再悬浮于缓冲液中。然后在BD FACS Canto II流式细胞计上按照生产商的说明书分析制品以检测GFP的存在，并因此推断SCT1-h27.108或SCT1-h27.204的表达，如在图8A中所示。
还使用流式细胞计量术检测hCLDN6蛋白在过表达hCLDN6的经工程改造的HEK-293T细胞系的表面上的存在(图8B)，所述hCLDN6用于表征本发明的CAR构建体。在这点上，将HEK-293T母代细胞或过表达hCLDN6的HEK-293T细胞收获并用维尔烯（Versene）(LifeTechnologies)分离成单细胞悬浮液。将分离的细胞如上所述洗涤，并在4℃在暗处与1微克抗-CLDN6抗体一起温育30分钟，然后在PBS/2%FCS中洗涤3次。然后将细胞与50 μL/样品的AlexaFluor-647标记的山羊-抗-小鼠IgG、Fc片段特异性的第二抗体(Life Technologies)（在PBS/2%FCS中1:200稀释）一起温育30分钟，用PBS/2%FCS洗涤3次，并再悬浮于含有DAPI(以检测死细胞)的PBS/2%FCS中。然后在BD FACS Canto II流式细胞计上按照生产商的说明书分析细胞，以提供图8B所示的数据集。
图8A和8B分别证实，SCT1-h27.108和SCT1-h27.204v2在转导的Jurkat T淋巴细胞上表达，但是不在未转导的Jurkat细胞上表达，并且人CLDN6蛋白在经工程改造的HEK-293T细胞上表达，但是不在HEK-293T-原初细胞上表达。
实施例10
Jurkat- SCT1-h27.108或SCT1-h27.204v2 T淋巴细胞在接触表达hCLDN的细胞后诱导IL-2产生
通过测量IL-2诱导（其指示CAR介导的T-细胞活化），针对靶标特异性的活性评估转导的Jurkat-SCT1-h27.108或SCT1-h27.204v2淋巴细胞。更具体地，使用来自以前实施例的转导的Jurkat淋巴细胞和经工程改造的表达hCLDN6的293T细胞，监测IL-2水平以证实，表达CAR的淋巴细胞被活化并且在与表达hCLDN6的细胞接触后引起免疫应答。
在这点上，将实施例9的Jurkat-SCT1-h27.108或SCT1-h27.204v2淋巴细胞与HEK-293T细胞共培养，所述HEK-293T细胞被工程改造成在细胞表面上过表达hCLDN6抗原（如通过流式细胞计量术所证实的）。在图9A所示的描述的淋巴细胞与靶细胞(L:T)比率执行淋巴细胞与靶标HEK-293T-hCLDN细胞一起的共培养以评估剂量应答和确定最大IL-2产量条件。将共培养物在37℃(5%CO2)温育48小时，在此时将培养基收获并通过在1200 rpm离心5分钟来澄清细胞碎片。然后针对IL-2产量通过ELISA (Thermo Scientific)按照生产商的说明书评估澄清的上清液。为了评估背景IL-2产量，将未转导的Jurkat细胞(Jurkat-原初)与HEK-293T-hCLDN细胞一起共培养。
如图9B所示的数据集证实的，在暴露于表达hCLDN6的细胞后促使Jurkat- SCT1-h27.108或SCT1-h27.204v2淋巴细胞以浓度依赖性的方式生产IL-2。这样的IL-2产生指示SCT1 CAR在识别表达hCLDN6的细胞(包括表达hCLDN的致瘤性细胞)上的CLDN抗原后实现的T-细胞活化。可观察的IL-2产生在含有HEK-293T-CLDN和未转导的Jurkat细胞的共培养物中的缺乏，进一步阐明了特异性的CAR介导的Jurkat细胞活化(图9B)。
如以前提及的，用于产生这种期望免疫应答的方法（如贯穿本申请详细讨论的）示意地显示在随文附带的图7中。
实施例11
表达SCT1-h27.108或SCT1-h27.204v2 CAR构建体的T淋巴细胞的制备
为了证实公开的CAR可以用于提供敏化的淋巴细胞，使用人CD3阳性选择试剂盒(Stemcell Technologies)从商购可得的外周血单核细胞制品(PBMC：所有细胞)分离原代人CD3+ T淋巴细胞。PBMC得自两种不同的供体(供体1和供体2)。
分离后，在含有10%热灭活的胎牛血清(Hyclone)、1%青霉素/链霉素(Corning)、1%l-谷氨酰胺(Corning)和10mM HEPES (Corning)的RPMI培养基中培养CD3+ T细胞。将T淋巴细胞在有CD3/CD28活化珠子(Dynabeads)存在下以1:5比率在37℃(5%CO2)温育进行活化。隔日加入IL-2 (Peprotech)至50 IU/ml的终浓度。初次活化以后24小时，通过在有10ug/ml聚凝胺(EMD Millipore)存在下用SCT1-h27.108或SCT1-h27.204v2慢病毒载体(基本上如实施例8所述制备)以约5的感染复数(MOI)转导100万个T细胞以确保有效的病毒转导，制备CLDN靶标特异性的表达SCT1-h27.108或SCT1-h27.204v2的T淋巴细胞。将细胞在有慢病毒颗粒存在下在37℃(5%CO2)温育72小时，然后通过流式细胞计量术评估抗-CLDN CAR表面表达(图10)。
如下执行表达SCT1-h27.108或SCT1-h27.204v2的转导的T淋巴细胞以及不携带CAR的T淋巴细胞对照细胞的流式细胞计量术分析：将每种样品的106个细胞收获并通过在1200 rpm在4℃离心5分钟进行沉淀；除去上清液并将沉淀物在冷PBS/2%FCS中洗涤2次。除去来自最后一次洗涤的上清液以后，为了直接检测CAR在细胞表面处的存在，将细胞沉淀物再悬浮于含有1微克Alexa Fluor®647-缀合的Affinipure山羊抗-人IgG, F(ab’)抗体(Jackson ImmunoResearch)的100微升PBS/2%FCS中。将细胞在暗处在4℃温育30分钟。温育以后，将细胞在PBS/2%FCS中洗涤3次，然后再悬浮于含有DAPI (以检测活细胞)的PBS/2%FCS中。然后在BD FACS Canto II流式细胞计上按照生产商的说明书分析细胞以提供图10所示的数据集。
图10清楚地表明，SCT1-h27.108或SCT1-h27.204v2都在转导的原代T淋巴细胞(即，敏化的淋巴细胞)上表达，但是不在未转导的淋巴细胞上表达。
实施例12
表达CLDN靶抗原的细胞的制备和表征
如在实施例9中所述，使用流式细胞计量术来检测CLDN蛋白在经工程改造的过表达人CLDN6的HEK-293T细胞系的表面上的存在。类似地，使用流式细胞计量术来证实人CLDN在患者衍生的xenograph (PDX)肿瘤细胞系(OV78)上的表达。人工工程改造的293T细胞系和衍生的卵巢癌细胞系可以用于表征本发明的敏化的淋巴细胞。
更具体地，将过表达人CLDN6的HEK-293T细胞(293T-CLDN)收获并用维尔烯(LifeTechnologies)分离成单细胞悬浮液。类似地，使用肿瘤解离试剂盒(Mylteni Biotec)将新鲜收获的OV78 PDX肿瘤处理成单细胞悬浮液。将分离的细胞如本文中所述进行洗涤，并与1微克抗-CLDN抗体(SC27.22)或同种型对照一起在4℃在暗处温育30分钟，然后在PBS/2%FCS中洗涤3次。然后将细胞与50微升/样品的AlexaFluor-647标记的山羊-抗-小鼠IgG、Fc片段特异性的第二抗体(Life Technologies)（在PBS/2%FCS中1:200稀释）一起温育30分钟，用PBS/2%FCS洗涤3次，并再悬浮于含有DAPI (以检测活细胞)的PBS/2%FCS中。然后在BD FACSCanto II流式细胞计上按照生产商的说明书分析细胞以提供在图11A和11B中所示的数据集。
得到的数据表明，人CLDN蛋白在经工程改造的HEK-293T细胞(图11A)和OV78 PDX肿瘤细胞(图11B)上表达。
实施例13
T淋巴细胞-SCT1-h27.108或SCT1-h27.204v2在接触表达CLDN的细胞后诱导细胞因子产生
通过测量与表达CLDN的靶细胞接触后的IFNγ和TNFα诱导，针对靶标特异性的活化评估包含SCT1-h27.108或SCT1-h27.204v2的敏化的淋巴细胞。应当理解，细胞因子产生(例如，TNFα和IFNγ诱导)指示能够诱导抗肿瘤免疫应答的活性嵌合抗原受体。
为了评估靶标特异性的(即CLDN)活化，将敏化的淋巴细胞（包含来自两种不同供体的宿主细胞）暴露于CLDN+ 293T细胞和表达CLDN的卵巢癌细胞(二者来自实施例11)。更具体地，基本上如上所述使用来自两种不同供体(供体1和供体2)的PMBC制品提供CD3+ T淋巴细胞制品。然后基本上如实施例11所述将各种淋巴细胞制品用SCT1-h27.108或SCT1-h27.204v2转导以提供供体1和供体2 CLDN敏化的淋巴细胞制品(与作为对照的未转导的淋巴细胞一起)。然后将每种敏化的淋巴细胞制品(与对照一起)与293T-CLDN或OV78 PDX靶细胞一起以3:1的效应物与靶标(E:T)比率共培养。将共培养物在37℃(5%CO2)温育48小时，在此时将培养基收获并通过在1200 rpm离心5分钟来澄清细胞碎片。然后针对TNFα产量通过ELISA (Thermo Fisher)和针对IFNγ通过ELISA (Invitrogen)按照生产商的说明书评估澄清的上清液。将得到的IFNγ和TNFα的水平的测量结果分别显示在图12A和12B (IFNγ))和图13A和13B (TNFα)中。在两种情况下，较高的细胞因子产量指示更稳健的CAR+群体活化。
如图12A (293细胞)和12B (肿瘤细胞)以及图13A (293细胞)和13B (肿瘤细胞)所示的数据集证实的，在暴露于经工程改造的和肿瘤衍生的表达人CLDN的细胞后，促进携带SCT1-h27.108或SCT1-h27.204v2的T淋巴细胞生产TNFα和IFNγ，而不携带CAR的T淋巴细胞在与相同靶细胞共培养时表现出微小的TNFα和IFNγ诱导。这证实了本发明的CLDN敏化的淋巴细胞是有活性的，且能够在暴露于CLDN+ 肿瘤细胞后产生免疫刺激性信号。
实施例14
SCT1-h27.108或SCT1-h27.204v2-T淋巴细胞对表达CLDN的体外细胞的靶向杀伤
为了证实CLDN敏化的淋巴细胞以靶标特异性的方式杀伤细胞的能力，将本发明的CAR转导的细胞暴露于经工程改造的293细胞和表达CLDN的肿瘤细胞(各自来自实施例12)。暴露后，计算剩余的活靶细胞的数目，结果显示在图14A (293细胞)和14B (肿瘤细胞)中。
更具体地，将SCT1-h27.108或SCT1-h27.204v2敏化的淋巴细胞(按照实施例11用来自两种供体的宿主细胞制备)与293T-CLDN或OV78 PDX细胞一起以3:1的效应物与靶标(E:T)比率共培养(应当指出，由于测定条件，暴露于OV78细胞的供体1淋巴细胞的活性的测量结果是不确定的)。将共培养物在37℃(5%CO2)温育48小时，然后确定剩余的存活的携带CLDN的细胞。
如下计算活细胞的百分比：将共培养物如本文中所述收获和洗涤，然后与1微克抗-CLDN抗体或同种型对照一起在4℃在暗处温育30分钟，随后在PBS/2%FCS中洗涤3次。然后将细胞与50微升/样品的AlexaFluor-647标记的山羊-抗-小鼠IgG Fc片段-特异性的第二抗体(Life Technologies)（在PBS/2%FCS中1:200稀释）一起温育30分钟。将细胞用PBS/2%FCS洗涤3次，随后重新悬浮在200微升含有DAPI (Life Technologies)（用于细胞生存力鉴别）和10000个绝对计数珠子(Life Technologies)（用于归一化细胞计数）的PBS/2%FCS中。通过定量每7500个收集的绝对计数珠子的存活的携带CLDN的细胞的各自数目，在BDFACS Canto II流式细胞计上执行剩余的存活的携带CLDN的靶细胞的分析和计数。在有不携带CAR的T淋巴细胞存在下剩余的存活的靶细胞的数目用作基准来对比SCT1-h27.108或SCT1-h27.204v2敏化的淋巴细胞对携带CLDN的细胞的靶标特异性杀伤。
如在图14A (293细胞)和14B (肿瘤细胞)中所示，293T-CLDN6细胞表现出对SCT1-h27.108-T淋巴细胞或SCT1-h27.204-T淋巴细胞实现的细胞裂解的显著易感性，大于70%的靶细胞被消除。重要的是，当在有OV78 PDX肿瘤细胞存在下培养携带抗-CLDN6 CAR的T淋巴细胞时，证实了类似的结果，其中大约50%的OV78细胞被消除。总之，这些数据证实了通过SCT1-h27.108和SCT-h27.204 CAR的CLDN6特异性识别对表达CLDN6的细胞的活化和杀伤。
本领域技术人员进一步明白，本发明可以以其它具体形式体现，而不背离其精神或中心属性。因为本发明的前述描述仅仅公开了其示例性实施方案，应当理解，预见到其它变体是在本发明范围内。因此，本发明不限于已经在本文中详细描述的特定实施方案。相反，应当提及所附权利要求作为本发明的范围和内容的指示。

Claims (28)

1.一种嵌合抗原受体，其包含抗-CLDN结合结构域。
2.根据权利要求1的嵌合抗原受体，其中所述抗-CLDN结合结构域包含scFv抗-CLDN结合结构域。
3.根据权利要求2的嵌合抗原受体，其中所述scFv抗-CLDN结合结构域包含以下区域或与包含以下区域的抗体竞争结合：SEQ ID NO: 21的轻链可变区(VL)和SEQ ID NO: 23的重链可变区(VH)；或SEQ ID NO: 25的VL和SEQ ID NO: 27的VH；或SEQ ID NO: 29的VL和SEQID NO: 31的VH；或SEQ ID NO: 33的VL和SEQ ID NO: 35的VH；或SEQ ID NO: 37的VL和SEQID NO: 39的VH；或SEQ ID NO: 41的VL和SEQ ID NO: 43的VH；或SEQ ID NO: 45的VL和SEQID NO: 47的VH；或SEQ ID NO: 49的VL和SEQ ID NO: 51的VH；或SEQ ID NO: 53的VL和SEQID NO: 55的VH；或SEQ ID NO: 57的VL和SEQ ID NO: 59的VH。
4.根据权利要求3的嵌合抗原受体，其中所述scFv抗-CLDN结合结构域包含
(a) SEQ ID NO: 69的轻链可变区(VL)的三个互补性决定区和SEQ ID NO: 71的重链可变区(VH)的三个互补性决定区；或
(b) SEQ ID NO: 73的VL的三个互补性决定区和SEQ ID NO: 87的VH的三个互补性决定区。
5.根据权利要求1的嵌合抗原受体，其中所述结合结构域免疫特异性地结合CLDN6。
6.根据权利要求5的嵌合抗原受体，其中所述结合结构域不与CLDN4或CLDN9交叉反应。
7.根据权利要求5的嵌合抗原受体，其中所述结合结构域与CLDN4或CLDN9交叉反应。
8.根据权利要求1-7中的任一项的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包含含有4-1BB信号传导结构域和CD3ζ信号传导结构域的细胞内结构域。
9.根据权利要求8的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体还包含含有人CD8α铰链的跨膜结构域。
10.一种多核苷酸，其编码根据权利要求1-9中的任一项的嵌合抗原受体。
11.一种载体，其包含根据权利要求10的多核苷酸。
12.根据权利要求11的载体，其中所述载体包含病毒载体。
13.根据权利要求12的载体，其中所述病毒载体包含慢病毒载体或逆转录病毒载体。
14.一种药物组合物，其包含根据权利要求10所述的多核苷酸或根据权利要求11-13中的任一项所述的载体。
15.一种试剂盒，其用于制备CLDN敏化的淋巴细胞的，其包含根据权利要求14所述的药物组合物。
16.一种分离的宿主细胞，其包含根据权利要求1-9中的任一项所述的嵌合抗原受体。
17.根据权利要求16的分离的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含CLDN敏化的淋巴细胞。
18.根据权利要求17的分离的宿主细胞，其中所述CLDN敏化的淋巴细胞得自患者。
19.根据权利要求17或18的分离的宿主细胞，其中所述CLDN敏化的淋巴细胞是T细胞或NK细胞。
20.根据权利要求19的分离的宿主细胞，其中所述T细胞是CD8+ T细胞。
21.根据权利要求19的分离的宿主细胞，其中所述CLDN敏化的淋巴细胞是NK细胞。
22.一种药物组合物，其包含根据权利要求16-21中的任一项所述的宿主细胞。
23.一种治疗遭受癌症的患者的方法，所述方法包括给所述患者施用根据权利要求22所述的药物组合物的步骤。
24.根据权利要求23的方法，其中所述患者遭受选自肺癌、黑素瘤、乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、肾细胞癌、卵巢癌、神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤、白血病和淋巴瘤的癌症。
25.根据权利要求24的方法，其中所述癌症是肺癌，且所述肺癌是小细胞肺癌。
26.根据权利要求24的方法，其中所述癌症是卵巢癌。
27.一种降低肿瘤细胞群体中的癌症干细胞频率的方法，其中所述方法包括使所述肿瘤细胞群体与根据权利要求22所述的药物组合物接触。
28.一种生产CLDN-敏化的淋巴细胞的方法，所述方法包括用根据权利要求10所述的多核苷酸转化宿主细胞的步骤。
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