CN117169518B - T淋巴细胞制剂中的cd3抗体残留物的检测方法和试剂盒 - Google Patents
T淋巴细胞制剂中的cd3抗体残留物的检测方法和试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，特别涉及T淋巴细胞制剂中的CD3抗体残留物的检测方法和试剂盒。本发明提供了T淋巴细胞制剂中的CD3抗体残留物的检测方法和用于T淋巴细胞制剂中的CD3抗体残留物检测的试剂盒。本发明通过实验发现本发明测出的CD3抗体残留准确度高，能够准确反应测定样品CD3抗体的微量残余。本发明检测范围可达到12.5~800 pg/mL，相对回收率（RE%）在80%~120%之间，为客观评价T淋巴细胞制剂的质量提供更准确的数据参考。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及T淋巴细胞制剂中的CD3抗体残留物的检测方法和试剂盒。
背景技术
T细胞免疫疗法是目前临床试验上最受关注和发展最快的肿瘤治疗方法之一。其基本操作是将患者自身的或经基因修饰的肿瘤特异性T细胞在体外纯化、激活、扩增培养制备成T淋巴细胞制剂，再回输到患者体内，利用T淋巴细胞的特异性杀伤作用实现靶向清除肿瘤细胞的目的。
CD3抗体是T细胞体外活化最常用的抗体。研究表明，TCR/CD3与抗原提呈细胞（APCs）表面特异的MHCⅡ抗原肽复合物结合产生的特异性抗原刺激信号是体内诱导T细胞的活化最重要的信号之一；在体外联合使用CD3抗体刺激T细胞，模拟T细胞活化的信号作用，是进行T细胞激活与扩增应用最广泛的方法。T淋巴细胞制剂中CD3抗体残留物的含量是T细胞制剂质量评价的重要参数之一，对细胞制剂产品的安全性和质量可控性水平都非常重要。目前现有的方法在CD3抗体残留物较少的情况下很难被检测到，特别是在ng/mL级别上的CD3抗体残留物检测准确度较低。因此建立一种高效，操作简便且准确度高的T淋巴细胞制剂中的CD3抗体残留物检测方法非常重要。
发明内容
有鉴于此，本发明目的在于建立一种高效，操作简便且准确度高的T淋巴细胞制剂中的CD3抗体残留物检测方法。本发明提供了T淋巴细胞制剂中的CD3抗体残留物的检测方法和试剂盒。本发明通过实验发现本发明测出的CD3抗体残留准确度高，能够准确反应测定样品CD3抗体的微量残余。本发明检测范围可达到12.5~800 pg/mL，相对回收率（RE%）在80%~120%之间，为客观评价T淋巴细胞制剂的质量提供更准确的数据参考。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了T淋巴细胞制剂中的CD3抗体残留物的检测方法，其包括如下步骤：
步骤1、取抗原包被于载体，清洗，封闭；
步骤2、清洗；
标准品组加入标准品溶液；
试验组加入供试品溶液；
孵育，清洗；
步骤3、空白对照组、所述标准品组和所述试验组分别加入标记抗体，孵育，清洗，显色，终止，于450 nm波长下分别获得所述空白对照组、所述标准品组和所述试验组的吸光度数据；
步骤4、以所述标准品组的吸光度数据减去所述空白对照组吸光度数据为纵坐标，以所述标准品溶液的浓度为横坐标，采用Logistic曲线拟合获得标准曲线，根据所述试验组的吸光度数据，通过所述标准曲线获得所述CD3抗体残留物的检测结果；
所述抗原为CD3E&CD3D异二聚体蛋白；
所述标准品为Anti-Human CD3 mAB；
所述供试品为含CD3抗体为原料的T淋巴细胞制剂。
在本发明的一些具体实施方案中，所述T淋巴细胞制剂包括中央记忆型T淋巴细胞制剂。
在本发明的一些具体实施方案中，所述CD3E&CD3D异二聚体蛋白的包被量为0.1 μg/单位载体；
所述抗原包被的条件为2~8℃下包被过夜；
所述清洗的洗液为磷酸钠盐；
所述清洗的次数为3次。
在本发明的一些具体实施方案中，所述载体为酶标板；
在本发明的一些具体实施方案中，所述CD3E&CD3D异二聚体蛋白的包被量为0.1 μg/孔。
在本发明的一些具体实施方案中，所述磷酸钠盐为1×PBST。
在本发明的一些具体实施方案中，所述1×PBST的制备方法包括：取PBS粉末1袋，加2 L灭菌注射用水，充分溶解；再加入1 mL Tween20，充分混匀，获得所述1×PBST。
在本发明的一些具体实施方案中，所述清洗的条件为3次，每次用量为300 μL/单位载体。
在本发明的一些具体实施方案中，所述封闭的时间为1小时；
所述封闭所采用的封闭液为含质量体积比为2%BSA的PBST溶液或含质量体积比为5%脱脂奶粉的PBST溶液。
在本发明的一些具体实施方案中，所述封闭液的用量为300 μL/单位载体。
在本发明的一些具体实施方案中，所述封闭所采用的封闭液为含质量体积比为2%BSA的PBST溶液。
在本发明的一些具体实施方案中，步骤2所述孵育为25℃±5℃孵育2小时。
在本发明的一些具体实施方案中，步骤3所述孵育为25℃±5℃避光孵育1小时。
在本发明的一些具体实施方案中，所述标记抗体溶液的浓度为0.05μg/单位载体。
在本发明的一些具体实施方案中，所述标记抗体的标记物为辣根过氧化物酶（HRP）、生物素（Biotin）、异硫氰酸荧光素（FITC）或碱性磷酸酶（AP）。
在本发明的一些具体实施方案中，所述标记抗体的来源为兔抗、鼠抗、羊抗或重组的IgG抗体。
在本发明的一些具体实施方案中，所述标记抗体为HRP标记的山羊抗小鼠IgG2a。
在本发明的一些具体实施方案中，所述显色的时间为10~15分钟；
所述显色所采用的显色液为显色液TMB。
在本发明的一些具体实施方案中，所述封闭液的用量为100μL/单位载体。
在本发明的一些具体实施方案中，所述终止所采用的终止液的用量为50μL/单位载体。
在本发明的一些具体实施方案中，所述检测方法具体包括如下步骤：
步骤1、取CD3E&CD3D异二聚体蛋白蛋白，灭菌注射用水调整其浓度为600 μg/mL，1×包被液进行600倍稀释制成终浓度为1 μg/mL包被蛋白溶液；将1 μg/mL的包被蛋白溶液加入至空酶标板中，每孔100 μL，置于2℃~8℃条件下过夜包被，获得包被酶标板；取出包被酶标板恢复至25℃±5℃，洗液清洗3次，300 μL/孔，最后1次弃液后如果孔内有残留液体，在吸水纸上拍干；每孔加入300 μL封闭液，25℃±5℃封闭1小时；
步骤2、洗液清洗3次，300 μL/孔，最后1次弃液后如果孔内有残留液体，在吸水纸上拍干；标准品组加入标准品溶液、试验组加入供试品溶液，100µL/孔，每组设置2个复孔，封板膜封板，25℃±5℃孵育2小时；
步骤3、洗液清洗3次，300 μL/孔，最后1次弃液后如果孔内有残留液体，在吸水纸上拍干；空白对照组、所述标准品组和所述试验组每孔分别加入标记抗体溶液，100 µL/孔，封板膜封板，25℃±5℃避光孵育1小时；洗液清洗3次，300 μL/孔，最后1次弃液后如果孔内有残留液体，在吸水纸上拍干；每孔加入显色液TMB，100 µL/孔，封板膜封板，25℃±5℃避光孵育10~15分钟；每孔加入终止液，50 µL/孔，混匀后使用酶标仪测量450 nm波长处的吸光度值；
步骤4、以标准品组的吸光度值均值减去空白对照组均值为纵坐标Y，以标准品理论浓度为横坐标X，采用Logistic曲线（四参数）拟合作图，得到标准曲线回归方程及相关系数R2；从标准曲线上由Y计算X，得出供试品的实测浓度值；如果供试品经过了预先稀释，根据标准曲线所得出的供试品浓度要再乘以其稀释倍数；
所述标准品为Anti-Human CD3 mAB；
所述供试品为以CD3为原料的T淋巴细胞制剂。
在本发明的一些具体实施方案中，所述检测方法的检测范围为12.5~800 pg/mL。
本发明还提供了用于T淋巴细胞制剂中的CD3抗体残留物检测的试剂盒，包括CD3E&CD3D异二聚体蛋白，封闭液和标记抗体；
所述CD3E&CD3D异二聚体蛋白和所述标记抗体的质量比为2：1；
所述封闭液为含质量体积比为2%BSA的PBST溶液或含质量体积比为5%脱脂奶粉的PBST溶液。
在本发明的一些具体实施方案中，还包括显色液TMB。
本发明包括但不限于取得了如下有益效果：
本发明检测范围可达到12.5~800 pg/mL，相对回收率（RE%）在80%~120%之间，为客观评价T淋巴细胞制剂的质量提供更准确的数据参考。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示实施例的标准曲线；
图2示对比例1拟合曲线；
图3示对比例2拟合曲线；
图4示对比例3拟合曲线。
具体实施方式
本发明公开了T淋巴细胞制剂中的CD3抗体残留物的检测方法和试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
相关术语解释：
Elisa：即酶联免疫吸附试验，指将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体特异性结合进行免疫反应的定性和定量检测方法，操作步骤复杂，影响反应因素较多，特别是固相载体的包被难达到各个体之间的一致，因此在定量测定中，每批测试均须用一系列不同浓度的参考标准品在相同的条件下制作标准曲线。
相对回收率（RE%）：相对回收率主要考察准确度。准确度系指用该方法测定的结果与真实值或认可的参考值之间接近的程度。有时也称真实度。 一定的准确度为定量测定的必要条件，因此涉及到定量测定的检测项目均需要验证准确度，如含量测定、杂质定量试验等。
相对回收率RE（%）=（测定浓度/真实浓度）×100%
四参数拟合：是指用含有四个参数的方程表示因变量（y）随自变量（x）变化的规律。
四参数模式为Y=(a-d)/[1+(x/c)b]+d
a:曲线上渐近线估值
d:曲线下渐近线估值
b:曲线的斜率
c:最大结合一半时对应的剂量
相关系数R是用以反映变量之间相关关系密切程度的统计指标。
相关系数R（coefficient of correlation）的平方即为决定系数，它与相关系数的区别在于除掉|R|=0和1情况。
相关系数是用来描述两个变量之间的线性关系的，但决定系数的适用范围更广，可以用于描述非线性或者有两个及两个以上自变量的相关关系。
结果输出要求求出a，b，c，d四个参数使这几组解为最优，使R2≥0.95，并且在最大点和最小点之间的曲线为单调曲线。
本发明的目的是提供一种T淋巴细胞制剂中，特别是中央记忆型T淋巴细胞微量CD3抗体残留物的检测方法。
T淋巴细胞制剂生产工艺过程中通常会添加人CD3单克隆抗体，用于细胞前期的活化、增殖。经过细胞活化增殖、目的细胞收集、清洗等工艺操作，大部分CD3单克隆抗体会被去除，仅有微量残留。T淋巴细胞制剂中CD3抗体残留物的含量是T细胞制剂质量评价的重要参数之一，对细胞制剂产品的安全性和质量可控性水平都非常重要。目前现有的方法在CD3抗体残留物较少的情况下很难被检测到，特别是在ng/mL级别上的CD3抗体残留物检测准确度较低。因此建立一种高效，操作简便且准确度高的T淋巴细胞制剂中的CD3抗体残留物检测方法非常重要。
CD3残留检测常采用间接ELISA法。将CD3E&CD3D异二聚体蛋白包被酶标板，供试品和标准品中的CD3抗体可与蛋白结合形成抗原-抗体复合物，去除游离的成分；加入辣根过氧化酶（HRP）标记的山羊抗小鼠IgG2a检测抗体（二抗），该抗体与复合物中的抗体结合，形成抗原-抗体-抗抗体复合物，去除游离成分，加入显色底物（TMB），结合在复合物上的辣根过氧化物酶会使无色的显色剂变蓝，颜色与CD3抗体浓度呈正比，加终止液后变黄，该溶液在450 nm处有吸收峰，通过检测其在450 nm OD值，绘制标准曲线计算供试品中CD3抗体浓度。
ELISA试验涉及到多个环节。发明人针对CD3抗体微量残留的检测优化了该试验的多个环节，发明人不断对ELISA反应体系和参数进行优化，在大量的试验基础上总结得出了本发明的检测方法。本发明检测范围可达到12.5~800 pg/mL，相对回收率（RE%）在87%~103%之间，为客观评价T淋巴细胞制剂的质量提供更准确的数据参考。
本发明采用ELISA法，将已知浓度的CD3抗体标准品按照800 pg/mL、400 pg/mL、200 pg/mL、100 pg/mL、50 pg/mL、25 pg/mL、12.5 pg/mL进行梯度稀释，对包被蛋白质浓度、封闭时间、洗板次数、孵育时间、二抗浓度和反应时间、显色时间等环节进行了优化，根据OD450读数通过逻辑拟合获得标准曲线，本发明的检测范围可达到12.5~800 pg/mL，相对回收率（RE%）可达87%~103%。
本发明中与已知浓度标准品的对比为与已知浓度标准品曲线进行对比，优选通过使用抗CD3抗体标准品与待测生物样本进行平行试验，获得已知浓度标准品曲线。具体地，通过使用含PBST的空白对照样品梯度稀释CD3抗体标准品，并加样，加样后的酶标板按照上述同样步骤进行反应操作，并OD450读数，根据所有读数通过逻辑拟合获得标准曲线。该标准曲线要求R2>0.95。其中，CD3抗体标准品的稀释，通常按如下梯度：800 pg/mL、400 pg/mL、200 pg/mL、100 pg/mL、50 pg/mL、25 pg/mL、12.5 pg/mL。
所述生物样品为：以CD3抗体为原料的T淋巴细胞制剂。
待测样品缓冲液为常用缓冲液，如磷酸盐缓冲液等。
优选地，所述缓冲液中可添加0.1% BSA。
优选地，所述缓冲液中可添加Tween20。
所述包被于酶标上的包板条件，为使用1 μg/mL的CD3蛋白溶液，并于4℃冰箱放置过夜。
所述包被蛋白浓度为0.1 μg/孔，封闭浓度为300 μL/孔，封闭时间为1小时；
所述洗板的洗涤液，为磷酸钠盐，浓度为300 μL/孔，洗板次数为3次。
所述的封闭液为：2% BSA-PBST或5%脱脂奶粉或BSA或其他常用封闭液。
所述标记抗体为发光物质标记的人IgG抗体，其标记物包括但不限于辣根过氧化物酶（HRP）、生物素（Biotin）、异硫氰酸荧光素（FITC）、碱性磷酸酶（AP）等，其检测形式可以是化学发光、荧光、常规可见光等。抗人IgG抗体可以常用的哺乳动物制备抗体，如兔抗、鼠抗、羊抗等，也可以是重组的IgG抗体。一个非限制性例子例如：所述标记抗体为酶联抗体，具体例如但不限于为酶联标记的兔抗人IgG。此外，所述酶联抗体也可用其他标记的多种抗人IgG。
所述加完样的酶标板的静置反应为2小时。
所述的显色液为TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯胺），显色反应的浓度和时间分别为100 μL/孔，10~15分钟，反应温度为25℃±5℃；所述终止液为常规终止液。
以下的实施例用于为本领域中的普通技术人员提供有关如何实施和使用本发明的完整披露和描述，并且这些例子并非意在对发明人所认为的发明范围进行限制，亦非意指下文的实验是被实施的全部实验而且是仅可实施的实验。实施例中未注明具体条件的试剂和设备，通常为本技术领域常规市购的试剂、设备；实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件。
具体地，关于下面实施例中涉及的原料生产厂家如下表（表1）：
表1 原料表
如无特殊说明，本发明提供的T淋巴细胞制剂中的CD3抗体残留物的检测方法和试剂盒中所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例 反应体系和方法
1.1 包被板准备
配制1×包被液：取包被液（10×），用灭菌注射用水稀释为1×包被液，充分混匀，备用；
配制包被蛋白：取Human CD3E&CD3D Heterdimei Protein蛋白一支，加入灭菌注射用水使其浓度为600 μg/mL，充分混匀，可分装贮存在-70±10℃备用；取该浓度蛋白用1×包被液进行600倍稀释制成终浓度为1 μg/mL包被蛋白溶液；
包被酶标板：将1 μg/mL的包被蛋白加入至空酶标板中，每孔100 μL，置于2℃~8℃条件下过夜包被。
1.2 试剂准备
1.2.1 洗液（1×PBST）：取PBS粉末1袋，加2 L灭菌注射用水，充分溶解；再加入1mL Tween20，充分混匀；
1.2.2 封闭液（2% BSA-PBST）：按照0.6 g BSA粉末，加30 mL 1×PBST的比例配制，充分溶解；
1.2.3 样本稀释液（0.1% BSA-PBST）：取2% BSA-PBST加1×PBST进行20倍稀释，充分溶解；
1.2.4 二抗溶液：取山羊抗小鼠IgG2a(HRP)，用样品稀释液（0.1% BSA-PBST）稀释至终浓度为0.5 μg/mL的二抗溶液。
1.3 操作流程
1.3.1 洗板：取出包被酶标板恢复至25℃±5℃，用洗液洗板3次，300 μL/孔，最后1次弃液后如果孔内有残留液体，在吸水纸上拍干；
1.3.2 封闭：每孔加入300 μL封闭液，25℃±5℃封闭1小时；
1.3.3 洗板：同1.3.1；
1.3.4 加样：按照板子排布将标准品、供试品、质控品（其中，空白对照（Blank）不添加任何试剂）、等加入相应孔中，100 μL/孔，每组设置2个复孔，封板膜封板，25℃±5℃孵育2小时；
1.3.5 洗板：同1.3.1.；
1.3.6 加二抗（标记抗体）溶液：每孔加入二抗溶液，100 μL/孔，封板膜封板，25℃±5℃避光孵育1小时；
1.3.7 洗板：同1.3.1.；
1.3.8 显色：每孔加入TMB显色液，100 μL/孔，封板膜封板，25℃±5℃避光孵育10~15分钟，具体孵育时间根据实际显色结果确定；
1.3.9 终止：每孔加入终止液，50 μL/孔，混匀后使用酶标仪测量450 nm波长处的OD值，将OD值以Excel形式导出，作为初始数据进行分析。
1.4 数据处理：
1.4.1 计算各样本复孔的平均吸光度值，减去Blank复孔的平均吸光度值，计算复孔CV值。
复孔CV（%）=复孔SD/复孔Mean
1.4.2 标准曲线拟合：以标准品的吸光度值均值减去Blank均值为纵坐标，以标准品理论浓度为横坐标，采用Logistic曲线（四参数）拟合作图，得到标准曲线回归方程及相关系数R2。
从标准曲线上由Y计算X，得出标准品、质控、供试品等的实测浓度值；如果供试品经过了预先稀释，根据标准曲线所得出的供试品浓度要再乘以其稀释倍数。
1.4.3 计算标准曲线、质控、加标供试品的回收率RE（%）。
回收率RE（%）=（测定浓度/理论浓度）×100%
表2 本发明实施例数据
其中：
S1-S7为标准品，浓度分别为800 pg/mL、400 pg/mL、200 pg/mL、100 pg/mL、50pg/mL、25 pg/mL、12.5 pg/mL；
BL为空白对照；
HQC、MQC、LQC为高中低三个不同浓度的质控品，浓度分别为600 pg/mL、250 pg/mL、37.5 pg/mL；
A1、A2为待测样本（供试品）。
根据R2的计算公式，通过参数逻辑拟合得到标准曲线如图1，为CD3抗体标准曲线，标准曲线回归方程为：Y=【5.84187-（-0.00349）】/【1+（x/3350.61790）^（-0.91572）】+（-0.00349），其中R2为0.999，检测限度为12.5 pg/mL~800 pg/mL。
X轴为CD3抗体浓度值（pg/mL）,Y轴为OD450值。
根据该标准曲线，测得的质控品浓度的相对回收率为95.57~103.46%，与质控品的实际浓度差别非常小，表明该方法测得的数据能够反映质控品的真实浓度。
对比例 反应体系和方法
本对比例的基本方法和流程按照实施例进行，相关差别见下表：
表3 本发明实施例与对比例参数对比表
根据四参数拟合方法，得到对比例1、对比例2、对比例3的标准曲线，相关数据和标准曲线如表4~6和图2~4所示：
表4 对比例1试验数据
标准曲线回收率指标准曲线的各点回归标准曲线后拟合的浓度与标准点浓度的比例，体现为各标准点与标准曲线的贴合程度，可作为判定标准曲线是否合格的依据。对比例1相对于实施例，调整了样品孵育时间，拟合的标准曲线回归方程为：Y=【1.08096-0.00217】/【1+（x/258.37857）^（-0.97269）】+0.00217，其中，R2为0.992，拟合曲线多点不符合回收标准，标准曲线不合格，质控点相对回收率（RE%）结果HQC过低，整体板孔吸光度较低，实验不成立。
表5 对比例2试验数据
对比例2相对于实施例在包被蛋白质浓度、封闭时间、洗板次数、孵育时间、二抗浓度和反应时间、显色时间等环节进行了调整，对比例2拟合的标准曲线回归方程为：Y=【0.44768-（-0.01174）】/【1+（x/147.14028）^（-1.12889）】+（-0.01174），其中，R2为0.993，多点不符合回收标准，标准曲线不合格，质控点相对回收率（RE%）低，实验不成立。
表6 对比例3试验数据
对比例3相对于实施例在包被蛋白质浓度、封闭时间、洗板次数、孵育时间、二抗浓度和反应时间、显色时间等环节进行了调整，拟合标准曲线回归方程为：Y=【1.64760-（-0.00324）】/【1+（x/188.43738）^（-1.09000）】+0.0324，其中，R2为0.991，多点不符合回收标准，标准曲线不合格，质控点相对回收率（RE%）结果不稳定，整体板孔吸光度过高，实验不成立。
从以上对比结果可以看出，本发明的实施例能够形成准确度较高的标准曲线，准确度高的标准曲线能够确保测试样品测出的值真实可靠。从相对回收率（RE%）的情况看，本发明的质控品相对回收率（RE%）为95.57-103.46%，明显高于对比例1~3，对比例的相对回收率分别为71.08~104.74%，19.43~30.39%，22.66~117.21%，对比例质控品的RE%明显偏离，说明本发明有突出的试验效果。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.T淋巴细胞制剂中的CD3抗体残留物的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1、取抗原包被于载体，清洗，封闭；
步骤2、清洗；
标准品组加入标准品溶液；
试验组加入供试品溶液；
孵育，清洗；
步骤3、空白对照组、所述标准品组和所述试验组分别加入标记抗体，孵育，清洗，显色，终止，于450 nm波长下分别获得所述空白对照组、所述标准品组和所述试验组的吸光度数据；
步骤4、以所述标准品组的吸光度数据减去所述空白对照组吸光度数据为纵坐标，以所述标准品溶液的浓度为横坐标，采用Logistic曲线拟合获得标准曲线，根据所述试验组的吸光度数据，通过所述标准曲线获得所述CD3抗体残留物的检测结果；
所述抗原为CD3E&CD3D异二聚体蛋白；
所述标准品为Anti-Human CD3 mAB；
所述供试品为含CD3抗体为原料的T淋巴细胞制剂。
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述T淋巴细胞制剂包括中央记忆型T淋巴细胞制剂。
3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述CD3E&CD3D异二聚体蛋白的包被量为0.1 μg/单位载体；
所述抗原包被的条件为2~8℃下包被过夜；
所述清洗的洗液为磷酸钠盐；
所述清洗的次数为3次。
4.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述封闭的时间为1小时；
所述封闭所采用的封闭液为含质量体积比为2%BSA的PBST溶液或含质量体积比为5%脱脂奶粉的PBST溶液。
5.如权利要求4所述的检测方法，其特征在于，步骤2所述孵育为25℃±5℃孵育2小时。
6.如权利要求5所述的检测方法，其特征在于，步骤3所述孵育为25℃±5℃避光孵育1小时。
7.如权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述标记抗体溶液的浓度为0.05μg/单位载体。
8.如权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述显色的时间为10~15分钟；
所述显色所采用的显色液为显色液TMB。
9.用于T淋巴细胞制剂中的CD3抗体残留物检测的试剂盒，其特征在于，包括CD3E&CD3D异二聚体蛋白，封闭液和标记抗体；
所述CD3E&CD3D异二聚体蛋白和所述标记抗体的质量比为2：1；
所述封闭液为含质量体积比为2%BSA的PBST溶液或含质量体积比为5%脱脂奶粉的PBST溶液。
10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，还包括显色液TMB。
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| GR01 | Patent grant | ||
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