CN112326973A - 一种用于检测新型冠状病毒抗体的试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及病毒检测技术领域，尤其涉及一种用于检测新型冠状病毒抗体的试剂盒及其应用。所述试剂盒包括抗体检测试纸；抗体检测试纸包括：底板、沿底板长度方向依次设置的样品垫、免疫微球垫、免疫硝酸纤维素膜和吸水纸；免疫微球垫包被有被新型冠状病毒人工抗原所标记的乳胶微球；所述新型冠状病毒人工抗原包括如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。本发明采用乳胶微球作为示踪标记物，利用抗原抗体反应对目标物进行检测，通过对制备工艺中的多项参数进行优化，并采用阻断剂进行处理，后得到的试剂盒可以准确、快捷地对新型冠状病毒进行检测。

Description

一种用于检测新型冠状病毒抗体的试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及病毒检测技术领域，尤其涉及一种用于检测新型冠状病毒抗体的试剂盒及其应用。

背景技术

目前，由新型冠状病毒（SARS-CoV-2）感染引起的新型冠状肺炎（COVID-19）在大范围内广泛传播，对患者的身体健康及各行业经济发展造成严重影响。据目前研究，新型冠状病毒潜伏期一般在1-14天左右，多为3-7天。对于新型冠状病毒的实验室检测可采用病原学检查和血清学检查等方法。由于病原学检查有一定的漏检率，现有技术一般采用血清学检查结合病原学检查的方法进行检测，这可以显著提高新型冠状病毒的检出率，同时血清学检查结果对于医生判断治疗中的病人的病情情况有很大的参考价值。

抗体检测是血清学检测中的重要检测方式之一，抗体检测主要通过特异的抗原重组蛋白与血液样本中潜在的新型冠状病毒抗体进行免疫反应，来实现抗体的检测。一般情况下，抗体需要病毒感染人体后，由抗原决定簇与淋巴细胞接触进而诱导淋巴细胞产生特异性抗体。而不同个体对入侵抗原的免疫应答呈现不同的强度和反应时间，会对抗体检测的灵敏度有较大影响。

新型冠状病毒由棘突蛋白基因、包膜蛋白基因、膜糖蛋白基因和核衣壳蛋白基因组成。选择何种人工合成抗原去特异性的结合感染期的抗体，成为抗体检测试剂表现高灵敏度的重要研究基础，而如何排除血清中诸如血色素、胆固醇以及其他疾病产生的抗体的干扰是保证产品准确性的重要研究内容。

发明内容

为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种用于检测新型冠状病毒抗体的试剂盒及其应用。本发明通过对试剂盒中免疫微球垫、免疫硝酸纤维素膜制备流程中的各项工艺进行了优化，并采用阻断剂进行处理，得到的试剂盒可以准确、快捷地对新型冠状病毒（2019-nCoV）进行检测。

第一方面，本发明提供一种用于检测新型冠状病毒抗体的试剂盒，包括：抗体检测试纸；

所述抗体检测试纸包括：底板、沿底板长度方向依次设置的样品垫、免疫微球垫、免疫硝酸纤维素膜和吸水纸；

所述免疫微球垫包被有被新型冠状病毒人工抗原所标记的乳胶微球；

所述新型冠状病毒人工抗原包括如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，具体由SEQ IDNO.2所示核苷酸序列编码得到。

本发明乳胶颗粒作为标记示踪物，利用抗原抗体反应和侧向层析方法对目标物进行检测分析。乳胶颗粒粒径均匀、颜色鲜艳，表面可以偶联官能团，因此可以采用共价方式进行标记，标记后的抗体结合稳定不易脱落，是一种理想的肉眼可视标记示踪物。

进一步地，所述免疫微球垫的制备方法包括如下步骤：

将乳胶微球经过15~45mg/mL EDC以及5~15mg/mL的NHS活化剂处理后，使用1.5~2mg/mL新型冠状病毒人工抗原标记3～4小时，在标记的同时加入兔IgG，经过离心纯化得到乳胶微球-新型冠状病毒人工抗原复合物；

将所述乳胶微球-新型冠状病毒人工抗原复合物包被至释放垫上即得免疫微球垫。将所述乳胶微球-新型冠状病毒人工抗原复合物包被至释放垫上即得免疫微球垫。

EDC作为一种活化剂，使用浓度过低会导致标记效率降低，产品达不到预期的灵敏度，但是使用浓度过高有可能会导致乳胶标记后出现凝集或者增加非特异性反应，在15~45mg/mL的范围内，可以起到较好的活化效果。

标记抗体量对产品性能同样有一定的影响，浓度过低会导致灵敏度低，浓度过高容易增加非特异性反应，在1.5~2mg/mL的范围内，具有较好的标记效果。

此外，反应时间也对乳胶微球和人工抗原的结合效率有一定影响，3~4个小时为最合适的反应时间。

进一步地，所述包被为采用喷涂的方式，喷涂量为2.5~3μL/cm。

进一步地，所述免疫硝酸纤维素膜上设有质控线和检测线，所述检测线包括新型冠状病毒IgG单克隆抗体检测线和新型冠状病毒IgM单克隆抗体检测线；

并且所述质控线和检测线在包被时，抗体浓度均为2~2.5mg/mL，在此浓度范围内，可以保证免疫反应充分进行的同时节约抗体蛋白的用量。

进一步地，所述质控线为羊抗兔IgG抗体，所述新型冠状病毒IgG单克隆抗体和所述新型冠状病毒IgM单克隆抗体均为鼠抗人抗体。

进一步地，所述免疫微球垫和所述免疫硝酸纤维素膜在制备完成后还包括干燥处理，所述干燥处理为在38-42℃的环境条件中干燥处理4~16h。

干燥时间同样会影响免疫微球垫和免疫硝酸纤维素膜的性能，过低会导致拖带产生，而过高会产生假阴性的检测结果。

进一步地，所述样品垫经过阻断处理，所述阻断处理为：使用5~15HAMA μg/mL阻断剂浸泡处理5~10min。

因产品测试部分健康人样本时出现假阳现象，本发明在处理该不良现象时分析这可能是有部分健康人拥有小鼠抗体具有特异性抗体，因此筛选分析发现HAMA阻断剂可以起到良好的阻断效果，因此本发明针对样品垫进行了阻断处理，显著降低了出现假阳性和假阴性效果的可能。

进一步地，所述试剂盒还包括样本缓冲液。

进一步地，在抗体检测试纸接触待测样本10-20分钟内判读检测结果。

本发明进一步提供所述试剂盒在制备用于检测新型冠状病毒的产品中的应用。

作为优选的实施方式，本发明提供一种用于检测新型冠状病毒抗体的试剂盒的制备方法，包括：

（1）将乳胶微球经过15~45mg/mL EDC活化剂处理后，使用1.5~2mg/mL新型冠状病毒S1蛋白标记3～4小时，在标记的同时加入0.5~1.5mg/mL兔IgG，经过离心纯化得到新型冠状病毒S1蛋白-乳胶微球复合物；

（2）将所述新型冠状病毒S1蛋白-乳胶微球复合物以2.5~3μL/cm的喷量喷涂至释放垫上制备免疫微球垫；

（3）使用2~2.5mg/mL鼠抗人新型冠状病毒 IgG单克隆抗体配置T1检测线溶液、使用2~2.5mg/mL鼠抗人新型冠状病毒IgM单克隆抗体配置T2检测线溶液，使用2~2.5mg/mL羊抗兔IgG抗体配置C质控线溶液；

（4）在硝酸纤维素膜上喷涂步骤（3）中的T1检测线溶液、T2检测线溶液和C质控线溶液制备免疫硝酸纤维素膜；

（5）将所述免疫微球垫和所述免疫硝酸纤维素膜，在38-42℃的环境条件中干燥处理4~16h；

（6）对样品垫使用5~15 μg/mL HAMA阻断剂浸泡处理5min·10min；

所述新型冠状病毒S1蛋白包括如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

进一步地，还包括：将这样品垫、免疫微球垫、免疫硝酸纤维素膜和吸水纸沿长度方向粘贴在塑料衬片上组成新型冠状病毒抗体检测试纸半成品板。

进一步地，将新型冠状病毒抗体检测试纸半成品板分切成试剂条，装进塑料卡卡槽内，组装成卡后，和干燥剂一起装入铝箔袋，密封、包装即得单人份新型冠状病毒抗体检测试纸（卡型）。

进一步地，将若干单人份新型冠状病毒抗体检测试纸和样本缓冲液、说明书包装在一起即为新型冠状病毒抗体检测试剂盒成品。

本发明具备如下有益效果：

本发明采用乳胶微球作为示踪标记物，利用抗原抗体反应对目标物进行检测，通过对制备工艺中的多项参数进行优化，并采用阻断剂进行处理，得到的试剂盒可以准确、快捷地对新型冠状病毒进行检测。

本发明提供的试剂盒在特异性和灵敏度上和现有的临床检测方法近似，即在实际应用时，即使是无专业知识的检测人员，也可以通过本发明提供的试剂盒中试纸快捷、准确地进行新型冠状病毒的检测，可以在基层社区医院及卫生服务中心广泛开展检测。

附图说明

图1为本发明实施例1提供的制备用于检测新冠病毒抗体的试剂盒的流程示意图；

图2为本发明实施例1提供的检测新冠病毒抗体的试剂盒的使用方法示意图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

本实施例提供一种用于检测新冠病毒抗体的试剂盒，制备流程如图1所示，具体包括如下步骤：

（1）用乳胶微球标记新型冠状病毒人工抗原，同时加入兔IgG，制备免疫微球溶液，得到乳胶微球-新型冠状病毒（2019-nCoV）人工抗原复合物。

（2）将免疫微球溶液（乳胶微球-新型冠状病毒人工抗原复合物）适当稀释后分别包被到释放垫上制备免疫微球垫。

（3）用鼠抗人新型冠状病毒IgG单克隆抗体配制检测线（T1线）溶液，用鼠抗人新型冠状病 IgM单克隆抗体配制检测线（T2线）溶液，用羊抗兔IgG配制质控线（C线）溶液。

（4）在硝酸纤维素膜上喷点C、T1、T2线，制得免疫硝酸纤维素膜。

（5）将免疫微球垫和免疫硝酸纤维素膜进行干燥。

（6）采用HAMA阻断剂对样品垫进行处理。

（7）用样品垫、免疫微球垫（包被乳胶微球-新型冠状病毒人工抗原复合物）、免疫硝酸纤维素膜（包被鼠抗人新型冠状病毒 IgG单克隆抗体、鼠抗人新型冠状病毒IgM单克隆抗体、羊抗兔IgG）、吸水纸粘贴在塑料衬片上组成新型冠状病毒抗体检测试纸半成品板。

（8）将新型冠状病毒抗体检测试纸半成品板分切成试剂条，装进塑料卡卡槽内，组装成卡后，和干燥剂一起装入铝箔袋，密封、包装即得单人份新型冠状病毒抗体检测试纸（卡型）。

（9）将若干单人份新型冠状病毒抗体检测试纸和样本缓冲液、说明书包装在一起即为新型冠状病毒抗体检测试剂盒（乳胶法）成品。

本实施例制备得到的试剂盒，其中的检测试纸在实际使用时如图2所示：

图2中的A为新型冠状病毒IgG阳性结果示意图：质控区（C）出现一条红色的线条，同时T1/G区有一条红色的线条，表明样本中存在高于试剂检出限2019-nCoV IgG抗体。

图2中的B为新型冠状病毒IgM阳性结果示意图：质控区（C）出现一条红色的线条，同时T2/M区有一条红色的线条，表明样本中存在高于试剂检出限2019-nCoV IgM抗体。

图2中的C为新型冠状病毒IgM和新型冠状病毒IgG均为阳性的结果示意图：质控区（C）出现一条红色的线条，同时T1/G区有一条红色的线条，T2/M区有一条红色的线条。

图2中的D为阴性检测结果示意图：仅质控区（C）出现一条红色的线条，在测试区（T1/G、T2/M）内无红色条带出现。阴性结果表明：表示样本中不存在2019-nCoV IgM，和/或，IgG抗体或2019-nCoV IgM，和/或，IgG抗体低于试剂检出限。

图2中的E为检测结果无效示意图：质控区（C）未出现红色条带，表明不正确的操作过程或试剂已变质损坏，在任何情况下，应重新测试。

实施例2

本发明采用乳胶颗粒作为标记示踪物，利用抗原抗体反应和侧向层析方法对目标物进行检测分析。乳胶颗粒粒径均匀、颜色鲜艳，表面可以偶联官能团，因此可以采用共价方式进行标记，标记后的抗体结合稳定不易脱落，是一种理想的标记示踪物，而且乳胶颗粒制作工艺成熟，市场上有很多优质的乳胶颗粒供应商，比如赛默飞世尔和默克以及苏州为度等企业。本发明购买优质乳胶颗粒，直接进行生产标记操作。

本发明涉及的新型冠状病毒人工抗原可以选择多种可以和新型冠状病毒相结合的抗原，在本实施例中为新型冠状病毒S1蛋白。

本发明针对实施例1涉及的乳胶微球溶液制备工艺进行了优化，具体如下：

1、免疫微球溶液制备工艺

乳胶标记的步骤按照相关文献和厂家指导进行操作，采用的是EDC活化标记原理，具体步骤如下：

（1）乳胶预处理：量取稀释至1%的乳胶微球用标记缓冲液MES加至批量体积并洗涤，13000rpm离心20分钟，弃上清；沉淀加入MES到批量体积复溶，并超声均匀，13000rpm离心20分钟，弃上清；

（2）EDC活化：沉淀加入一定体积的标记缓冲液MES，与一定体积的15mg/mL的EDC（0.01ml/mL）和10mg/mL的NHS（0.075ml/mL）混合至批量体积，反应1小时。13000rpm离心20分钟，弃上清；沉淀加入MES到一定体积批量体积复溶，并超声均匀；

（3）乳胶标记：量取一定量的新型冠状病毒人工抗原加入其中达到批量体积，同时加入1mg/mL的兔IgG，反应过夜；

（4）封闭：加入1M氨基乙醇（0.03ml/mL），反应30分钟，封闭；

（5）离心纯化：13000rpm离心20分钟，弃上清；将沉淀颗粒用TBS复溶至批量体积。并超声混匀， 旋转器4小时；

（6）再次重复离心操作：13000rpm离心20分钟。弃上清；将沉淀颗粒用TBS复溶到批量体积，超声混匀后备用。至此，完成标记工作，得免疫微球溶液（乳胶微球-新型冠状病毒单克隆抗体复合物）。

2、免疫微球溶液制备工艺优化

本发明针对上述免疫微球溶液制备工艺中EDC量、标记抗体浓度和反应时间进行了优化，以获得最优的灵敏度和特异性。

2.1 EDC量的确定：

EDC作为一种活化剂，使用浓度过低会导致标记效率降低，产品达不到预期的灵敏度；使用浓度过高有可能会导致乳胶标记后出现凝集或者增加非特异性反应。因此本发明对EDC用量进行了优化试验，具体结果如下：

结果如上表所示：在其他条件相同的情况下，随着EDC浓度增加，灵敏度呈上升趋势，但在60mg/mL以上时出现了假阳性反应。而30mg/mL的EDC浓度，表现出良好的灵敏度和特异性，因此确定EDC的最佳浓度为30mg/mL。

2. 2标记抗体量的确定

标记抗体量对产品性能有一定的影响，浓度过低会导致灵敏度低，浓度过高容易增加非特异性反应。因此本发明对标记蛋白量进行了优化试验。

结果如上表所示：EDC量确定为30mg/mL，加入量为0.1ml/mL，在其他条件相同的情况下，随着标记人工合成蛋白1量增加，灵敏度呈上升趋势，在2.5mg/mL时出现了微弱的假阳性反应。标记量为1.5mg/mL和2.0mg/mL时，性能满足要求，但1.5mg/mL时，阳性反应强度稍弱，因此最终确定最佳标记抗体量为2.0mg/mL。

2.3反应时间的确定

反应时间对人工抗原和乳胶的结合效率有影响，时间短标记效率低，时间越长标记越充分，因此本发明对需要的最低反应时间进行了确认。

结果如上表所示：在其他条件固定的情况下，不同反应时间对标记后性能的影响有明显的影响，反应时间在2小时以内，结合效率很低，最低检测限无法检出，阳性中等浓度检测结果也较浅。而3小时是最低需要的反应时间，延长至4小时，性能又有所提升。在4小时之后，再延长时间，对产品也不再造成大的影响。因此确定4小时为反应所需的最佳时间。

实施例3

本发明进一步针对如实施例1所示试剂盒进行了各项制备工艺的优化，具体如下：

1、免疫微球垫制备工艺

将免疫微球溶液（乳胶微球-新型冠状病毒人工抗原复合物）喷点到释放垫上，即可获得免疫微球垫。根据需喷点的释放垫长度来计算并量取纯化免疫乳胶垫，基本尺度为处理2.5μL/cm纯化免疫微球稀释溶液。将量取的纯化免疫微球溶液用pH7.8，0.01M磷酸盐缓冲液（含0.01%BSA）缓冲液10倍稀释。将释放垫放在运行平台上的对应位置，选择喷膜的所需程序并按产品工艺要求设定好参数：每2.5μL免疫乳胶稀释溶液喷点到1cm释放垫上，至所有的释放垫处理完。

1.1 免疫微球稀释溶液最适喷量的确定

释放垫具有很强的蛋白吸附能力和亲水性，将适当浓度免疫微球溶液喷点在垫上并干燥，即可得到固相蛋白。本发明研究发现在免疫层析试验中喷量太高或太低都会影响到产品的敏感性、特异性以及均一性。喷量太高，可能造成一些非特异性的反应，而且造成抗体浪费；喷量过低，则可能降低产品的敏感性；在释放垫的喷涂过程中，如果喷量过高，还容易造成超过释放垫的有效吸附量，从而造成在检测过程产生过深的背景，跑板不清晰，释放不干净等结果难以判断的现象。确定喷量有两个目的：一是保证免疫反应充分进行；二是尽量节约原料，避免非特异性反应和过量浪费。

试验方法：将免疫微球稀释溶液（乳胶微球-新型冠状病毒人工合成抗原复合物）按照1.0μL/cm、2.0μL/cm、2.5μL/cm、3μL/cm、5μL/cm的梯度喷量。使用1μL/cm的参数进行划线，干燥后组装试纸条进行性能检测判断最适喷量。试验结果如下表4所示：

注：“+”表示颜色较弱、“++”表示颜色明显、“+++”表示颜色很深、“—”表示颜色不可见。

试验结果表明：当喷量为1.0μL/cm和2.0μL/cm时，线条颜色比较弱，且不均匀，免疫反应不充分；当喷量为2.5μL/cm和3μL/cm时，颜色易于判断，且条带颜色均匀一致，免疫反应充分。依据不浪费和降低非特异性反应的原则，确定工艺的喷量为2.5μL/cm。

1.2 免疫微球垫最佳干燥条件的确定

本发明试验发现喷点后的干燥条件对免疫微球垫的性能有影响，具体地，喷点后的免疫微球垫在放入38-42℃烘箱中，干燥4小时以上能够达到较优的效果。

试验方法：将喷点完成的免疫微球垫放入38-42℃烘箱的环境中分别干燥2小时、3小时、4小时、8小时、16小时和18小时。干燥完成后组装试纸条进行性状观察和性能检测，性状是否均匀和性能检测是否合格来判断最佳的干燥时间。试验结果如下表5所示：

试验结果表明：当干燥时间小于4小时，免疫微球垫在检测时背景较红，出现假阳性结果；当干燥时间大于16小时，检测结果中有假阴性出现的情况；当干燥时间为4~16小时，免疫微球垫背景干净，性能检测都合格。因此确定免疫微球垫的最佳干燥时间为4~16小时。

2、 免疫硝酸纤维素膜制备工艺

硝酸纤维素膜具有很强的蛋白吸附能力和亲水性，将适当浓度蛋白喷点在膜上并干燥，即可得到固相蛋白。在乳胶微球免疫层析试验中便会在蛋白包被处因抗原（或抗体）被捕获而出现一定的色带。蛋白浓度太高或太低会影响到产品的敏感性、特异性以及膜条背景的清晰程度。检测线溶液浓度太高，可能造成一些非特异性的反应，而且造成抗体浪费；检测线溶液浓度过低，则可能降低产品的敏感性；在膜的包被过程中，如果蛋白质浓度过高，还容易造成超过膜的蛋白有效吸附量，从而造成在检测过程产生背景模糊，跑板不清晰，结果难以判断的现象。

2.1 免疫硝酸纤维素膜抗体蛋白最适包被浓度的确定

免疫硝酸纤维素膜上有两条蛋白包被带，即质控线（C线）和检测线（T线），在C线包被羊抗兔IgG抗体；在T线包被新型冠状病毒单克隆抗体。

确定C/T线包被浓度有两个目的：一是保证免疫反应充分进行；二是尽量节约抗体蛋白，避免非特异性反应和过量浪费。

试验方法：将羊抗兔IgG抗体和新型冠状病毒单克隆抗体分别稀释成1.0mg/mL、1.5mg/mL、2.0mg/mL、2.5mg/mL。使用1µL/cm的参数进行划线，干燥后组装试纸条进行性能检测，观察C/T线颜色深浅，以及均匀度来判断包被的合适浓度。试验结果如下表6所示：

试验结果表明：当包被浓度为1.0mg/mL时，C/T线颜色比较弱，且不均匀，影响结果判读；当包被浓度为1.5mg/mL时，C线颜色明显，但是T线颜色偏弱，免疫反应不充分；当包被浓度为2.0mg/mL和2.5mg/mL时，C线和T线的颜色易于判断，且条带颜色均匀一致，免疫反应充分。依据不浪费和降低非特异性反应的原则，确定划线工艺中C线和T线的蛋白包被浓度为2.0mg/mL。

2.2 免疫硝酸纤维素膜最佳干燥条件的确定

划线后的干燥条件对免疫硝酸纤维素膜的性能有影响。本发明试验发现划线后的免疫硝酸纤维素膜在放入38-42℃烘箱，时间4小时以上的环境中干燥能够达到良好的效果。

试验方法：将划线完成的硝酸纤维素膜放置38-42℃烘箱环境中分别干燥2小时、3小时、4小时、8小时、16小时和18小时。干燥完成后组装试纸条进行性状观察和性能检测，以C/T线是否均匀和性能检测是否合格来判断最佳的干燥时间。试验结果如下表7所示：

试验结果表明，当干燥时间小于4小时，C/T线在检测时有拖带且边缘不太整齐，比较分散；当干燥时间大于16小时，检测结果中有假阴性出现的情况；当干燥时间为4~16小时，C/T线整齐无拖带，性能检测都合格。

因此确定免疫硝酸纤维素膜的最佳干燥时间为4~16小时。

3、样品垫处理方式的确定

因产品测试部分健康人样本时出现假阳现象，本发明在处理该不良现象时分析这可能是有部分健康人拥有小鼠抗体具有特异性抗体，所以尝试在0.2M pH7.0的磷酸盐的样品垫处理中加入10μg/mL的阻断剂，异嗜性抗体阻断剂是一种专门为阻止人抗小鼠抗体（HAMA）、类风湿因子（RF）及其他可能对免疫分析造成假阳性或假阴性结果的异嗜性干扰物质而开发的独特阻断剂。健康人1和健康人2是本发明筛选出来的，会出现假阳性检测结果（未出现新冠症状且核酸检测结果阴性）的样本。

所以选择10μg/mL的HAMA阻断剂加入样品垫处理液中可以得到良好的阻断效果。

4、有效判定时间

对于试剂盒，检测物浓度越高、反应时间越长，显色结果会越明显。抗原抗体的反应需要一定的时间，样本和标记物层析完全也需要一定的时间，因此就需要一个最低的等待时间。同时，过长的时间有可能增加假阳性反应，也可能导致样品返流，发生返流时一般都会出现假阳性的结果，因此，还要设定一个最高的时间点，所以试剂盒一般都会设定在一个时间段能进行判读。

试验方法：各取一份阳性和阴性的参考品，按照说明书检测卡型，记录检测结果和现象。

试验结果：在滴加样本后滴加稀释液5分钟后，免疫反应进行完全，C/T线显色正常、清晰；样本全部层析至吸水端；膜背景全部冲刷干净，无颜色拖尾现象。适当延长反应时间，可以利于背景的消除，使膜显色更清晰，便于结果判定。15分钟内，阳性和阴性样本的多次检测结果中都没有出现非特异性反应的现象，检测结果都正确。

因此，在10-20分钟内判读检测结果，既能够保证检测结果正确，也能够确保膜背景干净、清晰。

实施例4

本发明进一步针对所用新型冠状病毒人工抗原进行了优化，新冠病毒(SARS-CoV-2)有四种主要的结构蛋白：刺突蛋白（Spike protein，S蛋白），核衣壳蛋白（Nucleocapsid，N蛋白），膜蛋白（Membrane protein，M蛋白），包膜蛋白（Envelope protein，E蛋白）。新冠病毒刺突蛋白S蛋白有两个亚基：S1和S2，受体结合位点（RBD）位于S1亚基上。它以三聚体的形式组成病毒粒子外膜表面的刺突，其主要功能是识别宿主细胞表面受体，介导与宿主细胞的融合。本发明设计的蛋白既包含N蛋白同时包括S1的RBD区域，对比了这两者识别新型冠状病毒IgG和IgM抗体的能力；并且与此同时，本发明发现对于S1蛋白的RBD区域的若干区域突变后，其作为标记抗原蛋白时，稳定性得到一定的提高，同时和新冠病毒IgG和IgM的结合能力得到进一步提升，具体如下表所示：

从表中可以看出，N蛋白本身对新冠病毒IgM的识别能力较差，S蛋白Arg319-Tyr689区域对于IgG和IgM具有一定的识别能力，而该区域突变型（氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示）针对新冠病毒IgG和IgM的识别能力均显著提高，这可能是由于其中从带正电荷的精氨酸残基突变为中性且较小的异亮氨酸残基后可以帮助抗原识别，从而进一步提升了S蛋白Arg319-Tyr689区域的抗原识别能力。

为了进一步验证S蛋白Arg319-Tyr689（突变型）和S蛋白Arg319-Tyr689区域的功能变化，本发明进一步经过多种实验验证，发现S蛋白Arg319-Tyr689（突变型）蛋白的稳定性相较于未突变时，稳定性有显著提升，具体如下：

将产品置入45℃烘箱7天的数据，用IgG质控P1(弱阳)/IgM质控P2(弱阳）测试七天，可以发现S蛋白Arg319-Tyr689（突变型）在稳定性上显著提高。

实验例1

本发明针对实施例1的新型冠状病毒抗体检测试剂盒进行了临床对比实验，对试剂盒性能进行了验证。

1、本发明对比了新型冠状病毒感染的肺炎疑似病例的临床血清样本334例（其中确诊病例174例，排除病例160例），这334例样本均经过核酸检测，本发明的新型冠状病毒抗体检测试剂盒对这334例样本的检测结果和华大生物核酸检测试剂结果进行对比得到如表11所示结果：

2、本发明进一步使用新型冠状病毒抗体检测试剂盒针对56例疑似病例中的确诊病例不同病程阶段进行了统计分析华大生物核酸检测试剂的检测结果进行对比，得到如表12所示结果：

综上所述，本发明提供的新型冠状病毒（2019-nCoV）抗体检测试剂盒可以有效地定性检测新型冠状病毒IgG/IgM抗体，辅助诊断新型冠状病毒（2019-nCoV）的感染。

实验例2

本实验例针对实施例1的新型冠状病毒抗体检测试剂盒进行了临床对比实验，实验样本为新型冠状病毒感染的肺炎疑似病例的临床血清样本 197例（其中确诊病例147例，排除病例50例）。

1、本发明以新冠肺炎诊疗方案中推荐方法作为参比方法，对比统计分析检测结果可得如表13所示结果：

2、本发明进一步对比新型冠状病毒抗体检测试剂盒和华大生物核酸检测试剂的检测结果，得到如表14所示结果：

3、本发明采用新型冠状病毒抗体检测试剂盒对147例疑似病例中的确诊病例的检测结果和华大生物核酸检测试剂的检测结果进行对比，得到如表15所示结果：

4、本发明采用新型冠状病毒抗体检测试剂盒对106例疑似病例的全血、血清和血浆同源样本进行了对比试验，得到如表16所示结果：

综上所述，本发明提供的新型冠状病毒（2019-nCoV）抗体检测试剂盒可以有效地定性检测新型冠状病毒IgG/IgM抗体，辅助诊断新型冠状病毒（2019-nCoV）的感染。

实验例3

本实验例进一步将实施例1制得的新型冠状病毒抗体检测试剂盒送中国食品药品检定研究院进行检验，通过了中国食品药品检定研究院制定的新型冠状病毒抗体检测试剂标准物质盘测试并得到了检验合格的报告，检验报告显示：

1、本发明提供的新型冠状病毒抗体检测试剂盒不受到以下物质的干扰：甲型流感病毒IgM阳性血浆、甲、乙型流感病毒IgM阳性血浆、甲型流感病毒IgM阳性血浆、嗜肺军团菌IgM阳性血浆、肺炎衣原体IgM阳性血浆、含类风湿因子血清、肺炎支原体IgM阳性血浆、腺病毒、阳性血浆、呼吸道合胞病毒IgM阳性血浆 、副流感病毒IgM阳性血浆、肺炎衣原体IgG阳性血浆、麻疹病毒IgG阳性血浆、腮腺炎病毒IgG阳性血浆和正常人血浆。

2、本发明提供的新型冠状病毒抗体检测试剂盒：

针对新型冠状病毒IgM抗体，阴性参考品符合率为25/25；阳性参考品符合率为10/10；最低检测限L1、L2均为阳性，L3～L10均为阴性；精密度平行检测10次，结果均为阳性且显色度均一。

针对新型冠状病毒IgG抗体，阴性参考品符合率为25/25；阳性参考品符合率为10/10；最低检测限L1为阳性，L2～L10为阴性；精密度平行检测10次，结果均为阳性且显色度均一。

并得出本产品按产品技术要求检验，结果符合规定的结论。

由此看来，本发明提供的新型冠状病毒抗体检测试剂盒在特异性、灵敏度、准确度和可重复性上均符合检测要求。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 北京金沃夫生物工程科技有限公司

<120> 一种用于检测新型冠状病毒抗体的试剂盒及其应用

<130> KHP201119606.6YS

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 371

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn

1 5 10 15

Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val

20 25 30

Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser

35 40 45

Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val

50 55 60

Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp

65 70 75 80

Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln

85 90 95

Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr

100 105 110

Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly

115 120 125

Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys

130 135 140

Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr

145 150 155 160

Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser

165 170 175

Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val

180 185 190

Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly

195 200 205

Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn

210 215 220

Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys

225 230 235 240

Phe Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp

245 250 255

Ala Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys

260 265 270

Ser Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn

275 280 285

Gln Val Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val

290 295 300

Ala Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr

305 310 315 320

Gly Ser Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu

325 330 335

His Val Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile

340 345 350

Cys Ala Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Ala Ala Ala Ser

355 360 365

Val Ala Ser

370

<210> 2

<211> 1131

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agagtccaac caacagaatc tattgttaga tttcctaata ttacaaactt gtgccctttt 60

ggtgaagttt ttaacgccac cagatttgca tctgtttatg cttggaacag gaagagaatc 120

agcaactgtg ttgctgatta ttctgtccta tataattccg catcattttc cacttttaag 180

tgttatggag tgtctcctac taaattaaat gatctctgct ttactaatgt ctatgcagat 240

tcatttgtaa ttagaggtga tgaagtcatt caaatcgctc cagggcaaac tggaaagatt 300

gctgattata attataaatt accagatgat tttacaggct gcgttatagc ttggaattct 360

aacaatcttg attctaaggt tggtggtaat tataattacc tgtatagatt gtttaggaag 420

tctaatctca aaccttttga gagagatatt tcaactgaaa tctatcaggc cggtagcaca 480

ccttgtaatg gtgttgaagg ttttaattgt tactttcctt tacaatcata tggtttccaa 540

cccactaatg gtgttggtta ccaaccatac agagtagtag tactttcttt tgaacttcta 600

catgcaccag caactgtttg tggacctaaa aagtctacta atttggttaa aaacaaatgt 660

gtcaatttca acttcaatgg tttaacaggc acaggtgttc ttactgagtc taacaaaaag 720

tttctgcctt tccaacaatt tggcagagac attgctgaca ctactgatgc tgtccgtgat 780

ccacagacac ttgagattct tgacattaca ccatgttctt ttggtggtgt cagtgttata 840

acaccaggaa caaatacttc taaccaggtt gctgttcttt atcaggatgt taactgcaca 900

gaagtccctg ttgctattca tgcagatcaa cttactccta cttggcgtgt ttattctaca 960

ggttctaatg tttttcaaac acgtgcaggc tgtttaatag gggctgaaca tgtcaacaac 1020

tcatatgagt gtgacatacc cattggtgca ggtatatgcg ctagttatca gactcagact 1080

aattctcctc gggcggcagc gagtgtagct agtcatcatc accatcacca t 1131

Claims (9)

1.一种用于检测新型冠状病毒抗体的试剂盒，其特征在于，包括：抗体检测试纸；

所述抗体检测试纸包括：底板、沿底板长度方向依次设置的样品垫、免疫微球垫、免疫硝酸纤维素膜和吸水纸；

所述免疫微球垫包被有被新型冠状病毒人工抗原所标记的乳胶微球；

所述新型冠状病毒人工抗原包括如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述免疫微球垫的制备方法包括如下步骤：

将乳胶微球经过15~45mg/mL EDC以及5~15mg/mL的NHS活化剂处理后，使用1.5~2mg/mL新型冠状病毒人工抗原标记3～4小时，在标记的同时加入兔IgG，经过离心纯化得到乳胶微球-新型冠状病毒人工抗原复合物；

将所述乳胶微球-新型冠状病毒人工抗原复合物包被至释放垫上即得免疫微球垫。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述免疫硝酸纤维素膜上设有质控线和检测线，所述检测线包括新型冠状病毒IgG单克隆抗体检测线和新型冠状病毒IgM单克隆抗体检测线；

并且所述质控线和检测线在包被时，抗体浓度均为2~2.5mg/mL。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述质控线为羊抗兔IgG抗体，和/或，所述新型冠状病毒IgG单克隆抗体和所述新型冠状病毒IgM单克隆抗体均为鼠抗人抗体。

5.根据权利要求2-4任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述免疫微球垫和所述免疫硝酸纤维素膜在制备完成后还包括干燥处理，所述干燥处理为在38-42℃的环境条件中干燥处理4~16h。

6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述样品垫经过阻断处理，所述阻断处理为：使用5~15 μg/mLHAMA阻断剂浸泡处理5~10min。

7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括样本缓冲液。

8.权利要求1-7任一项所述试剂盒的制备方法，其特征在于，包括：

（1）将乳胶微球经过15~45mg/mL EDC活化剂处理后，使用1.5~2mg/mL新型冠状病毒S1蛋白标记3～4小时，在标记的同时加入0.5~1.5mg/mL兔IgG，经过离心纯化得到新型冠状病毒S1蛋白-乳胶微球复合物；

（2）将所述新型冠状病毒S1蛋白-乳胶微球复合物以2.5~3μL/cm的喷量喷涂至释放垫上制备免疫微球垫；

（3）使用2~2.5mg/mL鼠抗人新型冠状病毒 IgG单克隆抗体配置T1检测线溶液、使用2~2.5mg/mL鼠抗人新型冠状病毒IgM单克隆抗体配置T2检测线溶液，使用2~2.5mg/mL羊抗兔IgG抗体配置C质控线溶液；

（4）在硝酸纤维素膜上喷涂步骤（3）中的T1检测线溶液、T2检测线溶液和C质控线溶液制备免疫硝酸纤维素膜；

（5）将所述免疫微球垫和所述免疫硝酸纤维素膜，在38-42℃的环境条件中干燥处理4~16h；

（6）对样品垫使用5~15 μg/mL HAMA阻断剂浸泡处理5min·10min；

所述新型冠状病毒S1蛋白包括如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

9.权利要求1-7任一项所述试剂盒在制备用于检测新型冠状病毒的产品中的应用。

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