CN109444426A

CN109444426A - 消除捕获法IgM抗体检测系统中HAMA干扰的方法

Info

Publication number: CN109444426A
Application number: CN201811516940.0A
Authority: CN
Inventors: 秦志扬; 陶占领; 伊鹏军; 郑亚平
Original assignee: Autobio Diagnostics Co Ltd
Current assignee: Autobio Diagnostics Co Ltd
Priority date: 2018-12-12
Filing date: 2018-12-12
Publication date: 2019-03-08

Abstract

本发明公开了一种消除捕获法IgM抗体检测系统中HAMA干扰的方法，是在所述捕获法IgM抗体检测系统中添加阻断剂，所述阻断剂能与HAMA的Fab区域结合，产生使HAMA不能与标记抗体反应的位阻效应，从而消除干扰。本发明的优点在于在捕获法IgM抗体检测系统中增加一种阻断剂，该阻断剂是一种抗体（可采用嗜异性抗体和HAAA为免疫原产生的混合的鼠McAb），能与HAMA的Fab区域结合，结合后产生的位阻效应能阻止与标记抗体的结合，既不影响真阳性样本的检测结果，同时能很好（或完全）消除干扰。

Description

消除捕获法IgM抗体检测系统中HAMA干扰的方法

技术领域

本发明涉及体外诊断技术，尤其是涉及一种消除捕获法IgM抗体检测系统中HAMA干扰的方法。

背景技术

人血清中的抗体种类包括IgG、IgM、IgA、IgD、IgE，其中IgM抗体约占抗体总量的10%，在病原体感染后IgM抗体出现和消失时间最早，因此常用于疾病的早期诊断，例如甲型肝炎、风疹、肺炎支原体肺炎、弓形虫感染等。捕获法是检测IgM抗体的常用方法，该方法固相载体上包被的是抗人IgM抗体，可结合样本中的IgM抗体，标记物是特异性抗原或者与抗原特异性反应的单克隆抗体。标记特异性抗原的方法要求抗原有较高的纯度，并且含有明确与IgM抗体反应的位点，一般是重组抗原；标记特异性单克隆抗体的方法对抗原的纯度要求不高，一般是粗提的抗原或完整的病毒，包含全部可能的IgM反应位点，不容易漏检，因此应用更加普遍。

嗜异性抗体是人血清或血浆中含有的一种能与其他种属的免疫球蛋白，包括免疫分析试剂中的异源抗体结合的抗体，这些抗体会干扰免疫检验体系，造成与实际分析物浓度无关的虚高检测值，表现为假阳性结果，HAMA（人抗鼠抗体）是嗜异性抗体中对免疫检测干扰最大的一类。诱发人体产生HAMA的原因很多，包括接触老鼠、接受单克隆抗体治疗、自身免疫疾病（包括类风湿）等，调查发现人群中HAMA的阳性率约为10%~40%，其中类风湿人群阳性率最高。

捕获法检测IgM抗体的方法，包被的是鼠抗人IgM抗体，标记抗体也是鼠单克隆抗体，相对于肿瘤标志物等双单抗夹心法，更容易受到HAMA干扰，因为捕获法在第一步反应中会主动结合HAMA，而夹心法则是HAMA选择性的结合包被抗体。类风湿因子是人抗自身抗体的抗体，这种抗体与鼠抗体也会有交叉反应，而且类风湿因子大部分是IgM亚型，这就是类风湿人群容易出现假阳性的原因，实验中发现捕获法IgM检测类风湿因子阳性样本，假阳性率能达到30~40%。

消除HAMA干扰的方法有多种，多用于双抗体夹心法检测。欧专局申请EP0174026A公开了一种方法，是在检测系统中添加鼠抗体或兔抗体；美专局申请US4914040公开了一种方法，是在检测系统中添加纯化的Fab或鼠抗体；这两种方法都能消除部分的假阳性，但有些仍旧无法消除，而且需要添加的鼠抗体量需在100ug/ml以上。其他的方法包括使用抗体的Fab片段代替整分子的抗体，或者使用人源化抗体，这些方法由于都不是针对捕获法检测IgM抗体方法设计的，效果都不尽如人意。

发明内容

本发明的目的在于根据捕获法检测IgM抗体的方法学特点，提供一种消除捕获法IgM抗体检测系统中HAMA干扰的方法，从而能很好的消除干扰。

为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：

本发明所述的消除捕获法IgM抗体检测系统中HAMA干扰的方法，是在所述捕获法IgM抗体检测系统中添加阻断剂，所述阻断剂能与HAMA的Fab区域结合，产生使HAMA不能与标记抗体反应的位阻效应，从而消除干扰。

所述捕获法IgM抗体检测系统中的固相抗体为鼠抗人IgM单克隆抗体或羊抗人IgM多克隆抗体或兔抗人IgM多克隆抗体。

所述捕获法IgM抗体检测系统中的标记抗体为能与病原体抗原特异性反应的单克隆抗体；其标记物可为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、吖啶酯或异鲁米诺等。

所述HAMA为能与标记抗体和固相的抗人IgM抗体与之反应的人IgM型抗体。

所述标记抗体为能与病原体抗原特异性反应的单克隆抗体，所述阻断剂添加在所述标记抗体试剂中。

所述阻断剂为嗜异性抗体和HAAA为免疫原产生的混合的鼠McAb，其使用浓度≥10ug/ml。

本发明的优点在于在捕获法IgM抗体检测系统中增加一种阻断剂，该阻断剂是一种抗体（最好是嗜异性抗体和HAAA为免疫原产生的混合的鼠McAb），能与HAMA的Fab区域结合，结合后产生的位阻效应能阻止与标记抗体的结合，既不影响真阳性样本的检测结果，同时能很好（或完全）消除干扰。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明做更加详细的说明，以利于本领域技术人员的理解。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，做出若干等同替代或明显变型，而且性能或用途相同的方法，都应当视为属于本发明的保护范围。

实施例1 消除HAMA对肠道病毒71型IgM抗体检测试剂的干扰

肠道病毒71型IgM抗体检测试剂用于临床手足口病的辅助诊断，手足口病是学龄儿童春夏之际易发的一种以发热、手、足、口部位疱疹为主要症状的急性传染病。试剂的微孔板包被的是鼠抗人IgM抗体，酶结合物是辣根过氧化物酶标记的鼠抗肠道病毒71型抗体，待测样本稀释后加入到微孔板中与包被抗体反应，然后洗涤微孔板，加入肠道病毒71型抗原和酶结合物，反应结束后洗涤微孔板，然后加入TMB和过氧化氢显色，最后用稀硫酸终止反应，读取OD值，阳性样本的OD值>0.15。

本发明采用嗜异性抗体和HAAA为免疫原产生的混合的鼠McAb作为阻断剂

将本发明阻断剂与罗氏的HAMA消除试剂MAK33（纯化交联的鼠抗体），伊美诺的HAMA消除试剂HBR1#（纯化的鼠单克隆抗体），分别添加到试剂的酶结合物中。添加浓度分别为：本发明阻断剂（20ug/ml，50ug/ml），MAK33（100ug/ml，200ug/ml），HBR1#（100ug/ml，200ug/ml）。

选取5例肠道病毒71型IgM抗体阳性样本（P1-P5）和16例HAMA干扰样本（HM1-HM50）用于验证HAMA干扰消除效果。16例HAMA干扰样本均是类风湿因子阳性，用肠道病毒71型IgM抗体检测试剂检测为阳性，去除抗原后检测仍为阳性且OD值没有显著差异。

在试剂的酶结合物中添加不同的干扰消除试剂，检测结果（OD值）见表1：

从表1数据可以看出，16例HAMA干扰样本在不添加任何干扰消除试剂时全部为假阳性。

添加本发明的阻断剂可以全部消除干扰，添加量至20ug/ml即可以满足要求，且对真实阳性样本结果没有显著影响。

添加罗氏的MAK33和伊美诺的HBR1#均不能完全消除干扰，添加至200ug/ml时仍有7例样本没有消除干扰。

实施例2 消除HAMA对呼吸道合胞病毒IgM抗体检测试剂（磁微粒化学发光法）的干扰呼吸道合胞病毒是引起婴幼儿下呼吸道感染的重要病毒病原，临床症状主要为毛细支气管炎、肺炎、气管支气管炎，小于2岁的先天性心脏病、肺部疾病婴幼儿、免疫力低下的儿童，会导致严重疾病。试剂的磁微粒包被的是鼠抗人IgM抗体，酶结合物是辣根过氧化物酶标记的鼠抗呼吸道合胞病毒抗体F(ab)₂，待测样本稀释后加入到磁微粒中与包被抗体反应，然后洗涤磁微粒，加入呼吸道合胞病毒抗原和酶结合物，反应结束后洗涤磁微粒，然后加入发光底物读取信号值，阳性样本的S/CO值>1.0。

本发明选用嗜异性抗体和HAAA为免疫原产生的混合的鼠McAb作为阻断剂

将本发明阻断剂与罗氏的HAMA消除试剂MAK33（纯化交联的鼠抗体），伊美诺的HAMA消除试剂HBR1#（纯化的鼠单克隆抗体），分别添加到试剂的酶结合物中。添加浓度分别为：本发明阻断剂（20ug/ml，50ug/ml），MAK33（200ug/ml），HBR1#（200ug/ml）。

选取5例呼吸道合胞病毒IgM抗体阳性样本（P1-P5）和13例HAMA干扰样本（HM4-HM16）用于验证HAMA干扰消除效果。13例HAMA干扰样本均是类风湿因子阳性，用呼吸道合胞病毒IgM抗体检测试剂检测为阳性，去除抗原后检测仍为阳性且信号值没有显著差异。

在试剂的酶结合物中添加不同的干扰消除试剂，检测结果（S/CO值）见表2：

本实施例试剂中酶结合物标记的抗体不是完整的抗体分子，而是经酶切抗体Fc片段后纯化的F(ab)2，目的是为了消除HAMA结合抗体的Fc片段导致假阳性，而这种假阳性是HAMA干扰最常见的情况。本实施例中13例HAMA干扰样本在不添加任何干扰消除试剂时全部为假阳性，说明这些干扰样本是针对标记抗体的F(ab)2，添加罗氏的MAK33和伊美诺的HBR1#至200ug/ml均不能消除干扰，而添加本发明的阻断剂至20ug/ml可消除9例，添加至50ug/ml可消除11例，且对真实阳性样本结果没有显著影响。

Claims

1.一种消除捕获法IgM抗体检测系统中HAMA干扰的方法，其特征在于：在所述捕获法IgM抗体检测系统中添加阻断剂，所述阻断剂能与HAMA的Fab区域结合，产生使HAMA不能与标记抗体反应的位阻效应。

2.根据权利要求1所述的消除捕获法IgM抗体检测系统中HAMA干扰的方法，其特征在于：所述捕获法IgM抗体检测系统中的固相抗体为鼠抗人IgM单克隆抗体或羊抗人IgM多克隆抗体或兔抗人IgM多克隆抗体。

3.根据权利要求1所述的消除捕获法IgM抗体检测系统中HAMA干扰的方法，其特征在于：所述捕获法IgM抗体检测系统中的标记抗体为能与病原体抗原特异性反应的单克隆抗体；其标记物为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、吖啶酯、或异鲁米诺。

4.根据权利要求1所述的消除捕获法IgM抗体检测系统中HAMA干扰的方法，其特征在于：所述HAMA为能与标记抗体和固相的抗人IgM抗体与之反应的人IgM型抗体。

5.根据权利要求1所述的消除捕获法IgM抗体检测系统中HAMA干扰的方法，其特征在于：所述标记抗体为能与病原体抗原特异性反应的单克隆抗体，所述阻断剂添加在所述标记抗体试剂中。

6.根据权利要求1所述的消除捕获法IgM抗体检测系统中HAMA干扰的方法，其特征在于：所述阻断剂为嗜异性抗体和HAAA为免疫原产生的混合的鼠McAb，其使用浓度≥10ug/ml。