CN107384959A - Pd‑1和ctla4双基因缺陷型t淋巴细胞制剂的制备方法 - Google Patents

Pd‑1和ctla4双基因缺陷型t淋巴细胞制剂的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种PD‑1和CTLA4双基因缺陷型T淋巴细胞制剂的制备方法。PD‑1和CTLA4双基因敲除载体的构建，T淋巴细胞分离与激活，电转染T淋巴细胞及T7E1酶切鉴定，流式细胞仪筛选与测序分析。本发明的基因缺陷型免疫细胞制剂的生产，一方面简化了细胞的生产程序，另一方面提升了T淋巴细胞杀灭肿瘤细胞的能力，并能增强长期肿瘤免疫。

Description

PD-1和CTLA4双基因缺陷型T淋巴细胞制剂的制备方法
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种PD-1和CTLA4双基因缺陷型T淋巴细胞制剂的制备方法。
背景技术
T细胞主要识别由细胞表面主要组织相容性复合物(MHC)提呈的抗原肽。大多数情况下，T细胞表面抗原受体(TCR)信号转导可以活化抗原激活的T细胞，然而，仅仅依靠TCR信号转导途径难以触发T细胞免疫应答。因此，T细胞的有效活化和功能介导需要双重信号的协同作用：一是抗原肽-MHC复合物，由T细胞抗原受体(TCR)识别；二是协同刺激信号，由抗原递呈细胞(APC)和T细胞表面的协同刺激分子配体和受体对提供。其中，PD-1/PD-L1是公认的最基本的协同刺激信号，由表达在T细胞上的PD-1和表达在抗原递呈细胞表面的PD-L1和PD-L2相互作用产生。PD-1(programmed death-1)，又称为PDCDl、CD279，是CD28免疫球蛋白超家族中的一员，它是在诱导T细胞杂交瘤发生凋亡时发现并命名的，主要表达在外周循环T细胞、自然杀伤细胞(NKT)，B细胞和单核细胞上。PD-1分子有两个配体PD-L1(又称CD274)和PD-L2(又称CD273)，它们均为B7家族成员。PD-1与其配体PD-L1相结合可对机体免疫系统起负性调节作用。肿瘤免疫应答早期，循环免疫细胞T细胞可以识别、浸润继而清除某些癌细胞，然而，一些癌细胞可以通过某些方式逃过免疫监视和免疫系统介导的细胞死亡。研究表明，共刺激分子PD-1，与其配体PD-L1相互作用可以降低免疫应答的强度和持续时间，这为癌细胞的免疫逃逸提供了有利条件。体外研究表明阻断PD-1/PD-L1途径可以增强T细胞免疫效能，调节机体抗肿瘤免疫应答。目前认为共刺激分子及其调节途径在癌细胞抗肿瘤免疫过程中发挥了极其重要的作用。阻断PD-1/PD-L1通路能有效促进肿瘤特异性CD8+T细胞对肿瘤组织的浸润，分泌大量肿瘤杀伤因子，从而抑制肿瘤的生长。
细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)又称CD125分子，是一种免疫调节分子，是B7分子配体，属于免疫球蛋白超家族的抑制分子，其结合后诱导T细胞参与免疫反应负调节，即诱导T细胞无反应，使T细胞的细胞周期停滞于Gl期等，抑制T淋巴细胞的增殖和功能。研究表明，用抗体阻断CTLA4功能可显著增加T淋巴细胞的激活。抗肿瘤T淋巴细胞在机体对恶性肿瘤的免疫监视中起关键作用。实验显示，给移植了肿瘤的小鼠注射抗CTLA4抗体可抵制多种类型的肿瘤并可长期保持抗肿瘤免疫。临床研究表明阻断CTLA4可使肿瘤缩小。这些资料都表明CTLA4在肿瘤的发生发展中起重要作用。
因此，采用CRISPR/Cas9技术敲除T淋巴细胞中的PD-1基因，从而激活T淋巴细胞对肿瘤细胞攻击的能力，实现肿瘤的免疫治疗，敲除CTLA4更有利于T淋巴细胞的激活，并能使细胞获得长期的抗肿瘤免疫，双缺陷基因的T淋巴细胞更具有杀灭肿瘤细胞的能力。
发明内容
本发明的目的是提供一种PD-1和CTLA4双基因缺陷型T淋巴细胞制剂的制备方法，简化了细胞的生产程序、提升了T淋巴细胞攻击肿瘤细胞的能力，并能增强长期肿瘤免疫。
本发明所述的PD-1和CTLA4双基因缺陷型T淋巴细胞制剂的制备方法，步骤如下：
(1)PD-1和CTLA4双基因敲除载体的构建
根据PD-1和CTLA4全基因序列(外显子区)分别设计gRNA target序列，然后将两个gRNA target序列克隆进表达载体，获得带有两个不同target序列gRNA的敲除载体；
两个gRNA target序列分别为5’-CCGAGCCTACCATATGGTGT-3’和5’-CCGCTGCCAGAGATCCCAAA-3’；
(2)T淋巴细胞分离与激活
T淋巴细胞分离，培养，激活，繁殖，收集；
(3)电转染T淋巴细胞及T7E1酶切鉴定
T淋巴细胞中加入电转液和步骤(1)得到的敲除载体进行电转染，电转染结束后，继续培养，收集细胞提取基因组，采用T7E1酶切鉴定；
(4)流式细胞仪筛选与测序分析
电转染结束后收集的细胞采用流式细胞仪进行分离得到单克隆细胞，单克隆细胞扩大培养，即得PD-1和CTLA4双基因缺陷型T淋巴细胞制剂；扩大培养后的单克隆细胞提取基因组进行测序分析。
步骤(1)中所述的表达载体为pU6gRNA-Cas9-GFP表达载体。
步骤(3)中所述的电转液组成如下，以体积百分比计：
无钙镁PBS 90％
无血清培养基RPMI 1640 10％；
以无钙镁PBS和无血清培养基RPMI 1640的总体积为100％计，EDTA加入量为30g/L，蔗糖加入量为200mmol/L。
电转液的制备方法是将无钙镁PBS与无血清培养基RPMI 1640混合，然后加入EDTA和蔗糖，溶解后再过滤除菌。
步骤(3)中所述的继续培养时间为48h。
步骤(4)中流式细胞仪筛选方法是细胞转染48h后，用PBS清洗细胞两次，经流式细胞仪筛选GFP阳性单克隆T淋巴细胞，而后扩大繁殖培养，提取基因组，进行PCR后连接T载体，转化大肠杆菌感受态进行测序分析，筛选PD-1与CTLA4基因均发生移码突变的T淋巴细胞(由单克隆细胞繁殖而成)，即获得新型免疫细胞制剂。
本发明构建特异的、高效的双基因敲除载体，高效的电转染方法，流式细胞仪筛选单克隆细胞后，筛选双基因缺陷型T淋巴细胞，扩繁获得可用于肿瘤治疗与预防的免疫细胞制剂。两个gRNA均属于独立表达单元，载体还包含Cas9基因和绿色荧光蛋白(GFP)基因。
双基因敲除载体经电转染T淋巴细胞后，利用流式细胞仪筛选GFP阳性单克隆细胞，最终获得双基因缺陷型T淋巴细胞，具备用于肿瘤预防与治疗的免疫细胞条件。
流式细胞仪筛选的PD-1和CTLA4基因缺陷型T淋巴细胞为一免疫细胞制剂，可用于人体回输预防或治疗肿瘤。
本发明利用生物信息学技术获得特异性、高效识别靶位点并有效切断靶位点的gRNA target序列，而后将序列克隆进pU6gRNA-Cas9-GFP表达载体，构建成功可以同时表达两个带有不同target序列gRNA的表达载体。
本发明在构建gRNA与Cas9表达载体的基础上，利用电转染技术将表达载体转入活化的T淋巴细胞，电转染采用优化的电转染缓冲液，转化效率高，细胞死亡率低，更有效获得PD-1和CTLA4双基因缺陷型T淋巴细胞。
本发明的有益效果如下：
本发明首先确定了能够实现高效敲除PD-1和CTLA4基因的两个gRNA target序列，而后优化电转染缓冲液，实现T淋巴细胞的高效电转染和保证电转染后细胞的成活率，最后利用流式细胞仪筛选GFP阳性细胞，分离筛选双基因移码突变的纯合子T淋巴细胞，获得PD-1和CTLA4双基因缺陷细胞。本发明的基因缺陷型免疫细胞制剂的生产，一方面简化了细胞的生产程序，另一方面提升了T淋巴细胞杀灭肿瘤细胞的能力，并能增强长期肿瘤免疫。
附图说明
图1为单PD-1敲除载体示意图。
图2为构建双敲除载体所用的中间载体。
图3为PD-1和CTLA4双基因敲除载体示意图。
图4为激活的T淋巴细胞。
图5为电转染48小时后的T7E1酶切鉴定结果。
图6为PD-1基因测序结果。
图7为CTLA4基因测序结果。
图8为PD-1和CTLA4双基因缺陷细胞株的western blotting图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步描述。
以下实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如《分子克隆实验指南》(第三版，科学出版社，2005)等本领域常用工具书中所述的条件，或按试剂生产厂家所建议的条件进行。
实施例1
(1)PD-1和CTLA4双基因敲除载体的构建
①gRNA target序列的设计
从NCBI获取PD-1全基因序列(EF064716.1)和CTLA4全基因序列(NG_011502.1)，基于CRISPR-DO网站设计gRNA target序列，而后根据设定的参数，选择两个基因合适的target序列(各20bp长度)，然后由上海生工生物工程有限公司合成互补的两段target序列(增加BbsI酶切后的粘性末端)。
如：PD-1 oligo：F 5’-ATAG CCGAGCCTACCATATGGTGT-3’
R 5’-AAAT ACACCATATGGTAGGCTCGG-3’
CTLA4 oligo：F 5’-ATAG CCGCTGCCAGAGATCCCAAA-3’
R 5’-AAAT TTTGGGATCTCTGGCAGCGG-3’
②敲除载体构建
用BbsI酶切pU6gRNA-CMV-Cas9-GFP表达载体，回收后与PD-1oligo序列形成的oligo双链连接，构建含有一个gRNA的PD-1基因敲除载体(图1)。
以pU6gRNA-CMV-Cas9-GFP表达载体为模板，用引物gRNA-R：5’-ACAGAATTCGTCAATAATCAATGTCATTAATTAAGG-3’和pU6gRNA-CMV-Cas9-GFP-F：5’-ACAAAGCTTTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGG-3’将表达载体线性化，断裂点位于gRNA和CMV启动子序列之间，并在两段添加HindIII和EcoRI酶切位点。
然后，以pU6gRNA-CMV-Cas9-GFP表达载体为模板，用引物gRNA-F：5-’ACAAAGCTTAAGGTCGGGCAGGAAGAGGG-3’和gRNA-R：5’-ACAGAATTCGTCAATAATCAATGTCATTAATTAAGG-3’克隆gRNA表达单元，并连入pUC19，然后通过BbsI酶切连入CTLA4oligo序列获得中间载体(图2)。用HindIII和EcoRI双酶切线性化的pU6gRNA-CMV-Cas9-GFP表达载体和中间载体，回收后将二者连接，获得可以表达两个不同target序列gRNA的敲除载体，见图3。
(2)T淋巴细胞分离与激活
①CD3+抗体包被平板
于6孔板中加入2ml/孔的PBS缓冲液，然后加入CD3+抗体至终浓度10μg/ml，置于37℃CO2培养箱孵育2小时，而后吸去PBS，用新鲜的预热PBS清洗平板2次，再用无血清RPMI-1640培养基清洗1次。
②成熟T淋巴细胞分离与培养
1、通过肱动脉抽取健康人新鲜血液1mL，马上加入含有10μL肝素抗凝剂的1.5mL离心管中。为保持淋巴细胞的活性，采血后马上进行分离。
2、加入3mL的PBS或0.9％NaCl稀释血液或血浆。稀释血液可降低红细胞的凝聚，提高淋巴细胞收获量。
3、取4mL淋巴细胞分离液加入离心管管底，并升温到室温。
4、用巴斯德玻璃吸管吸取4ml稀释后的血液样品，沿管壁缓慢铺到淋巴细胞分离液上面，不要打乱液层界面。
5、水平转子离心2000r/min或700×g离心20min，室温20℃。存放2h以上的血液应离心30min。
6、离心后管底是红细胞，中间层是分离液，最上层是血浆。血浆层与分离液之间是一薄层较致密的白膜，含单个核细胞(包括淋巴细胞和单核粒细胞)。用吸管直接插入到单个核细胞层并吸取该层，放入另一试管中。
7、加10ml Hank’s液稀释分离的淋巴细胞，250×g离心10min，弃上清。重复洗涤2次，除去血小板和抗凝物质。最后用PBS稀释10倍计数板计数细胞，台盼蓝染色确定细胞存活率>95％。
③T淋巴细胞激活与繁殖
将RPMI-1640全培养基重悬②中第7步骤中的T淋巴细胞沉淀，转移至(①)CD3+抗体包被的6孔板中，置于CO2培养箱培养24小时，而后加入白介素-2(终浓度1000U/ml)刺激细胞生长，所得结果见图4。
(3)电转染T淋巴细胞及T7E1酶切鉴定
收集T淋巴细胞用PBS清洗一遍，加入优化的电转液400μl(配方：无钙镁PBS 90％，EDTA 30g/L，无血清培养基RPMI 1640 10％，蔗糖200mmol/L)重悬至终浓度5-10×106cell/ml，然后加入(1)中构建的PD-1和CTLA4双基因敲除质粒至终浓度为40μg/ml。0.4cm电击杯，280V电压，电击20ms。电转染结束后加入预热的RPMI-1640全培养基置于二氧化碳培养箱中继续培养，48小时后，收集细胞提取基因组，用鉴定引物PD-1(PD1F：5’-GACTGGGCACAGGAGTGGGAGG-3’；PD1R：5’-GCCTGACTCAGGCCAGGATCC-3’)进行PCR扩增，PCR产物采用T7E1酶切鉴定，结果出现550bp与300bp的DNA片段，说明基因组的PD-1基因发生了突变，见图5。
(4)流式细胞仪筛选与测序分析
电转染T淋巴细胞48小时后，收集细胞用PBS清洗细胞2次，并置于1ml PBS缓冲液中采用流式细胞仪对GFP阳性细胞进行分离，分离单克隆细胞。
分离所得细胞扩大培养，取1-2×106cell提取基因组，利用鉴定引物PD-1(PD1F：5’-GACTGGGCACAGGAGTGGGAGG-3’；PD1R：5’-GCCTGACTCAGGCCAGGATCC-3’)和CTLA4(PD1F’：5’-AGTAGTCGGAGCCGTAAGAA-3’；PD1R’：5’-TGTCCACAAGAGAGCAAACC-3’)进行PCR，PCR产物回收后连接T载体，然后转化大肠杆菌感受态，挑取单克隆菌进行sanger测序分析，结果如图6和图7所示：筛选得到双基因缺陷型T淋巴细胞纯合子，该细胞具有优于PD-1基因缺陷T淋巴细胞纯合子的免疫功效。
(5)western blotting分析
将该测序纯合子细胞扩增繁殖后，收集细胞，提取总蛋白，进行western blotting分析PD-1和CTLA4基因在细胞内的表达情况，以β-actin做内参蛋白，结果如图8所示，该细胞中已经检测不到两种蛋白的表达，说明获得的T淋巴细胞中PD-1和CTLA4基因已经缺失。
本发明中双gRNA敲除双基因方案获得T淋巴细胞的生产时间短，耗资少，且双基因缺陷型纯合子T淋巴细胞能够增强杀死肿瘤细胞的功效，并能增强长期肿瘤免疫，所以本发明所构建的PD-1和CTLA4双基因缺陷型T淋巴细胞群为一新型免疫细胞制剂，可用于肿瘤患者的防治。

Claims (4)

1.一种PD-1和CTLA4双基因缺陷型T淋巴细胞制剂的制备方法，其特征在于步骤如下：
(1)PD-1和CTLA4双基因敲除载体的构建
根据PD-1和CTLA4全基因序列分别设计gRNA target序列，然后将两个gRNA target序列克隆进表达载体，获得带有两个不同target序列gRNA的敲除载体；
两个gRNA target序列分别为5’-CCGAGCCTACCATATGGTGT-3’和5’-CCGCTGCCAGAGATCCCAAA-3’；
(2)T淋巴细胞分离与激活
T淋巴细胞分离，培养，激活，繁殖，收集；
(3)电转染T淋巴细胞及T7E1酶切鉴定
T淋巴细胞中加入电转液和步骤(1)得到的敲除载体进行电转染，电转染结束后，继续培养，收集细胞提取基因组，采用T7E1酶切鉴定；
(4)流式细胞仪筛选与测序分析
电转染结束后收集的细胞采用流式细胞仪进行分离得到单克隆细胞，单克隆细胞扩大培养，即得PD-1和CTLA4双基因缺陷型T淋巴细胞制剂；扩大培养后的单克隆细胞提取基因组进行测序分析。
2.根据权利要求1所述的PD-1和CTLA4双基因缺陷型T淋巴细胞制剂的制备方法，其特征在于步骤(1)中所述的表达载体为pU6gRNA-Cas9-GFP表达载体。
3.根据权利要求1所述的PD-1和CTLA4双基因缺陷型T淋巴细胞制剂的制备方法，其特征在于步骤(3)中所述的电转液组成如下，以体积百分比计：
无钙镁PBS 90％
无血清培养基RPMI 1640 10％；
以无钙镁PBS和无血清培养基RPMI 1640的总体积为100％计，EDTA加入量为30g/L，蔗糖加入量为200mmol/L。
4.根据权利要求1所述的PD-1和CTLA4双基因缺陷型T淋巴细胞制剂的制备方法，其特征在于步骤(3)中所述的继续培养时间为48h。
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108531457A (zh) * 2018-04-10 2018-09-14 杭州荣泽生物科技有限公司 一种Cas9/RNP敲除T细胞PD-1和LAG3基因及制备CAR-T细胞的方法
CN108642071A (zh) * 2017-08-02 2018-10-12 山东百福基因科技有限公司 Pd-1和ctla4双基因缺陷型t淋巴细胞制剂的制备方法
CN109136190A (zh) * 2018-04-11 2019-01-04 北京中诚华科生物科技有限公司 一种抵抗肿瘤免疫抑制环境的btla-/-t淋巴细胞的制备方法与应用
WO2020055962A1 (en) * 2018-09-11 2020-03-19 Board Of Regents, The University Of Texas System A genetic mouse model of autoimmune adverse events and immune checkpoint blockade therapy
CN111440799A (zh) * 2020-04-17 2020-07-24 皖南医学院第一附属医院（皖南医学院弋矶山医院） 一种CRISPR-Cpf1介导实现多个免疫卡控点基因编辑免疫细胞的试剂盒及其应用
CN117169518A (zh) * 2023-11-03 2023-12-05 赛德特(北京)生物工程有限公司 T淋巴细胞制剂中的cd3抗体残留物的检测方法和试剂盒

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20170020922A1 (en) * 2015-07-16 2017-01-26 Batu Biologics Inc. Gene editing for immunological destruction of neoplasia
CN106480097A (zh) * 2016-10-13 2017-03-08 南京凯地生物科技有限公司 利用CRISPR/Cas9技术敲除人PD‑1基因构建可靶向MSLN新型CAR‑T细胞的方法及其应用
CN106480027A (zh) * 2016-09-30 2017-03-08 重庆高圣生物医药有限责任公司 CRISPR/Cas9 靶向敲除人PD‑1基因及其特异性gRNA
US20170152506A1 (en) * 2015-08-28 2017-06-01 Batu Biologics, Inc. Inactivation of lymphocyte immunological checkpoints by gene editing

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018041121A1 (en) * 2016-08-31 2018-03-08 Beijing Biocytogen Co., Ltd Genetically modified non-human animal with human or chimeric ctla-4
CN107384959A (zh) * 2017-08-02 2017-11-24 山东百福基因科技有限公司 Pd‑1和ctla4双基因缺陷型t淋巴细胞制剂的制备方法
CN107475292B (zh) * 2017-08-02 2018-06-15 山东百福基因科技有限公司 Pd-1基因缺陷型t淋巴细胞制剂的制备方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20170020922A1 (en) * 2015-07-16 2017-01-26 Batu Biologics Inc. Gene editing for immunological destruction of neoplasia
US20170152506A1 (en) * 2015-08-28 2017-06-01 Batu Biologics, Inc. Inactivation of lymphocyte immunological checkpoints by gene editing
CN106480027A (zh) * 2016-09-30 2017-03-08 重庆高圣生物医药有限责任公司 CRISPR/Cas9 靶向敲除人PD‑1基因及其特异性gRNA
CN106480097A (zh) * 2016-10-13 2017-03-08 南京凯地生物科技有限公司 利用CRISPR/Cas9技术敲除人PD‑1基因构建可靶向MSLN新型CAR‑T细胞的方法及其应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JIANGTAO REN等: "A versatile system for rapid multiplex genome-edited CAR T cell generation", 《ONCOTARGET》 *

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108642071A (zh) * 2017-08-02 2018-10-12 山东百福基因科技有限公司 Pd-1和ctla4双基因缺陷型t淋巴细胞制剂的制备方法
CN108531457A (zh) * 2018-04-10 2018-09-14 杭州荣泽生物科技有限公司 一种Cas9/RNP敲除T细胞PD-1和LAG3基因及制备CAR-T细胞的方法
CN109136190A (zh) * 2018-04-11 2019-01-04 北京中诚华科生物科技有限公司 一种抵抗肿瘤免疫抑制环境的btla-/-t淋巴细胞的制备方法与应用
WO2020055962A1 (en) * 2018-09-11 2020-03-19 Board Of Regents, The University Of Texas System A genetic mouse model of autoimmune adverse events and immune checkpoint blockade therapy
CN112654245A (zh) * 2018-09-11 2021-04-13 得克萨斯州大学系统董事会 自身免疫不良事件和免疫检查点阻断治疗的遗传小鼠模型
JP2022500026A (ja) * 2018-09-11 2022-01-04 ボード オブ リージェンツ, ザ ユニバーシティ オブ テキサス システムBoard Of Regents, The University Of Texas System 自己免疫有害事象および免疫チェックポイント遮断療法の遺伝的マウスモデル
CN112654245B (zh) * 2018-09-11 2022-05-27 得克萨斯州大学系统董事会 自身免疫不良事件和免疫检查点阻断治疗的遗传小鼠模型
JP7338894B2 (ja) 2018-09-11 2023-09-05 ボード オブ リージェンツ，ザ ユニバーシティ オブ テキサス システム 自己免疫有害事象および免疫チェックポイント遮断療法の遺伝的マウスモデル
CN111440799A (zh) * 2020-04-17 2020-07-24 皖南医学院第一附属医院（皖南医学院弋矶山医院） 一种CRISPR-Cpf1介导实现多个免疫卡控点基因编辑免疫细胞的试剂盒及其应用
CN111440799B (zh) * 2020-04-17 2021-03-02 皖南医学院第一附属医院（皖南医学院弋矶山医院） 一种CRISPR-Cpf1介导实现多个免疫卡控点基因编辑免疫细胞的试剂盒及其应用
CN117169518A (zh) * 2023-11-03 2023-12-05 赛德特(北京)生物工程有限公司 T淋巴细胞制剂中的cd3抗体残留物的检测方法和试剂盒
CN117169518B (zh) * 2023-11-03 2024-01-19 赛德特(北京)生物工程有限公司 T淋巴细胞制剂中的cd3抗体残留物的检测方法和试剂盒

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