CN109517798A

CN109517798A - 一种嵌合cea抗原受体的nk细胞及其制备方法与应用

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Publication number: CN109517798A
Application number: CN201811433148.9A
Authority: CN
Inventors: 卢戌; 刘静维; 王跃; 刘雪松; 李君阳
Original assignee: Great Biotech Inc Of Beijing Kang Airui
Current assignee: Great Biotech Inc Of Beijing Kang Airui
Priority date: 2018-11-28
Filing date: 2018-11-28
Publication date: 2019-03-26
Anticipated expiration: 2038-11-28
Also published as: CN109517798B

Abstract

本发明公开了一种嵌合CEA抗原受体的NK细胞及其制备方法与应用。本发明的嵌合CEA抗原受体的NK细胞是在NK细胞中表达嵌合CEA抗原受体得到的。所述嵌合CEA抗原受体的NK细胞具有以下几种特性：1、能高效且特异地杀伤肿瘤细胞。2、在表达CEA‑CAR的同时其自身调控机制不受影响，即抑制其对同源正常细胞发生作用的能力不受影响。3、淋巴细胞体外扩增后NK细胞在收获的总细胞中占比＞90％，所述CEA‑CAR‑NK在收获的总细胞中占比＞34％。本发明的嵌合CEA抗原受体的NK细胞作为生物制剂将在临床上治疗各种实体肿瘤中发挥重要作用。

Description

一种嵌合CEA抗原受体的NK细胞及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种嵌合CEA抗原受体的NK细胞及其制备方法与应用。

背景技术

嵌合抗原受体(Chimeric angtigen receptor，CAR)是一类能在细胞膜上表达，且能与细胞外专一信号分子结合进而激活细胞内一系列生物化学反应，使细胞能特异地识别外界刺激并产生相应效应的特殊蛋白质。CAR主要由胞膜外抗原结合区、铰链区、胞内信号传导区三部分构成。CAR的胞外区是一段单链可变区结构域(single chain Fv domain，scFv)，具有特异性识别并结合抗原的功能。其构成是将单克隆抗体的重链可变区(thevariable region of heavy chain，VH)和轻链可变区(the variable region of lightchain，VL)用一可弯曲的多肽接头(Linker)将VH和VL连接起来，构成VH-Linker-VL或VL-Linker-VH。CAR的铰链区通常是由免疫球蛋白超家族组成，如CD8，CD28以及IgG。CAR的胞内信号传导区主要是由TCR-CD3复合体中的ζ链组成。

目前CAR-T细胞治疗中产生的副作用主要包括以下四个方面。①插入突变：CAR技术将外源性基因序列整合到T细胞内，理论上正常T细胞可能发生基因突变继发肿瘤。虽然目前临床前及临床研究未有相关报道，但相关忧虑不无道理，所以某些研究中心已采用mRNA直接转导T细胞的办法以避免该风险。②脱靶效应：若CAR所针对的抗原不仅表达于肿瘤细胞，而在正常组织中亦有表达，则CAR-T细胞将同时攻击正常组织，造成组织脏器损伤、自身免疫性疾病或免疫缺陷。因此，在采用该手段治疗时，必须个体化地权衡利弊。同时应尽量研发和采用特异性强的抗体。③炎症反应：CAR-T细胞输注后在体内肿瘤抗原的刺激下活化，分泌大量IFN-γ和TNF-α等炎症因子，形成细胞因子风暴，致使脏器损伤。此外，肿瘤细胞大量破坏后也可能出现肿瘤溶解综合征及肾功能损害等表现。虽然临床试验中大部分患者能耐受输注，但亦有个别病例在短期内出现多脏器功能衰竭而死亡。④CAR-T细胞的归宿：肿瘤缓解期的患者在接受CAR-T细胞治疗后，若无有效的肿瘤抗原刺激，CAR-T细胞在体内能否增殖及长期存活还不清楚，但输注供者来源的CAR-T细胞可能引起移植物抗宿主疾病(GVHD)。

癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)是存在于细胞表面的富含多糖的蛋白复合物，多见于大肠癌、胰腺癌、胃癌、肺癌、肝癌、胆管癌、乳腺癌、卵巢、甲状腺髓样癌和泌尿系统的肿瘤中，其体外检测可用于肿瘤发生发展的诊断和评估，同时也可将其作为上述癌症生物治疗的靶点，目前已经开发了许多以CEA为靶点的分子药物，如CEA抗体、CEA疫苗已经应用于临床并且显示了良好疗效，在以CEA为靶点进行的CAR-T细胞免疫治疗实体肿瘤的过程中，虽然出现了良好的疾病缓解率，但是由于CEA在正常消化管组织中的表达，脱靶效应的发生概率也大大增加，因此，在以CEA为靶点的CAR细胞治疗过程中，选择一种能根据靶细胞的不同调控自身杀伤反应的效应细胞显得尤为重要。

自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)是机体重要的免疫细胞，不仅与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节有关，而且在某些情况下参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生。NK细胞杀伤靶细胞主要通过ADCC作用、穿孔素溶解肿瘤细胞、NK细胞毒因子溶解肿瘤细胞以及释放TNF导致靶细胞程序性死亡等方式来进行，除ADCC作用外，这些杀伤途径与细胞毒性T细胞(cytotoxic T cell，CTL)杀伤肿瘤细胞的途径相似，并且体外实验证明NK与CTL细胞的杀伤活性并无显著差别。但是NK细胞的杀伤靶细胞的激活及调控途径与CTL细胞有很大区别，NK细胞的杀伤活性无MHC限制，具有独特的细胞识别及活化模式，这种模式使其既能发挥免疫杀伤作用，又能避免杀伤自体正常组织细胞。NK细胞的识别需通过抑制性受体与活化性受体与靶细胞上配体的相互作用，继而整合这些受体传导的不同受体信号，抑制信号与活化信号之间的平衡决定了NK细胞是否对靶细胞进行杀伤。一般地，被病毒感染的细胞或肿瘤细胞的MHCI类分子表达下调或异常，抑制性受体不能结合这些细胞表面表达的I类分子无法转导负性调节信号，NK细胞遂接受活化信号而被激活，继而对靶细胞行使杀伤效应。当与正常细胞作用时，NK细胞表面抑制性受体与同一个体正常细胞表达的MHC I类分子结合后传导抑制性信号，从而抑制NK细胞功能，避免了NK细胞对正常细胞的攻击。

有大量的临床试验使用NK细胞作为一种生物制剂，同时联合化疗或放疗来治疗癌症，并且已经取得了一些成果，但其在单独治疗或在治疗晚期肿瘤的过程中的疗效并不理想，主要原因是NK细胞虽然能够不受MHC限制地去杀伤肿瘤细胞，但其靶向性和特异性较弱，过继给患者的细胞不能集中地杀伤肿瘤细胞。

NK细胞的治疗效果主要受NK细胞体外扩增情况的影响，T淋巴细胞中有50％-80％的表达量，相比之下NK细胞在体内只占总淋巴细胞的5％-10％，其体外扩大培养也相对较难，这也是之前大部CAR的研究者选择将其表达于T细胞的原因之一。目前NK体外扩增技术主要是通过在体外培养体系中加入IL-2、IL-12、IL-15和IFN-γ等细胞因子来实现的，但是细胞扩增效果差，纯度低，对细胞因子的需求量大，培养效果不稳定。因此，现有技术有待于改进和发展。

发明内容

鉴于上述现有技术的不足，本发明提供了一种嵌合CEA抗原受体的NK细胞，这种NK细胞具有以下几种特性：①所述NK细胞能高效且特异地杀伤肿瘤细胞。②所述NK细胞在表达CEA-CAR的同时其自身调控机制不受影响，即抑制其对同源正常细胞发生作用的能力不受影响。③淋巴细胞体外扩增后NK细胞在收获的总细胞中占比＞90％，所述CEA-CAR-NK在收获的总细胞中占比＞34％。

本发明一方面保护一种带有嵌合抗原受体的NK细胞(CAR-NK细胞)。

本发明保护的CAR-NK细胞中，所述嵌合抗原受体中的抗原受体是针对CEA的抗原受体。

上述CAR-NK细胞中，所述嵌合抗原受体包括信号识别结构域和信号传导结构域；

所述信号识别结构域为抗CEA的单链抗体(CEAscFv)；

所述信号传导结构域依次由CD8α铰链区、CD137跨膜区和胞内区以及CD3ζ胞内区串联而成。

进一步的，所述信号识别结构域为如下a1)或a2)：

a1)由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

a2)由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有相同功能的由a1)衍生的蛋白质；

所述信号传导结构域为如下b1)或b2)：

b1)由SEQ ID No.4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

b2)由SEQ ID No.4所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有相同功能的由b1)衍生的蛋白质。

更进一步的，所述信号识别结构域的编码基因序列为如下A1)或A2)或A3)：

A1)SEQ ID No.1所示的cDNA分子或基因组DNA分子；

A2)在严格条件下与A1)限定的DNA分子杂交且编码所述嵌合CEA抗原受体的信号识别结构域的cDNA分子或基因组DNA分子；

A3)与A1)或A2)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码所述嵌合CEA抗原受体的信号识别结构域的cDNA分子或基因组DNA分子；

所述信号传导结构域的编码基因序列为如下B1)或B2)或B3)：

B1)SEQ ID No.3所示的cDNA分子或基因组DNA分子；

B2)在严格条件下与B1)限定的DNA分子杂交且编码所述嵌合CEA抗原受体的信号传导结构域的cDNA分子或基因组DNA分子；

B3)与B1)或B2)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码所述嵌合CEA抗原受体的信号传导结构域的cDNA分子或基因组DNA分子。

在本发明的一个实施例中，所述嵌合抗原受体的结构如下：CEAscFv-CD8α-CD137-CD3ζ。所述嵌合抗原受体具体为如下c1)或c2)：

c1)由SEQ ID No.6所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

c2)由SEQ ID No.6所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有相同功能的由c1)衍生的蛋白质。

所述嵌合抗原受体的编码基因序列具体为如下C1)或C2)或C3)：

C1)SEQ ID No.5所示的cDNA分子或基因组DNA分子；

C2)在严格条件下与C1)限定的DNA分子杂交且编码所述嵌合抗原受体的cDNA分子或基因组DNA分子；

C3)与C1)或C2)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码所述嵌合抗原受体的cDNA分子或基因组DNA分子。

本发明另一方面保护上述CAR-NK细胞的制备方法。

本发明保护的CAR-NK细胞的制备方法包括如下步骤：在NK细胞中表达嵌合CEA抗原受体，得到嵌合CEA抗原受体的NK细胞。

上述CAR-NK细胞的制备方法中，所述嵌合CEA抗原受体的结构如下：CEAscFv-CD8α-CD137-CD3ζ；

所述嵌合CEA抗原受体的信号识别结构域为抗CEA的单链抗体(CEAscFv)；

所述嵌合CEA抗原受体的信号传导结构域依次由CD8α铰链区、CD137跨膜区和胞内区以及CD3ζ胞内区串联而成。

进一步的，所述嵌合CEA抗原受体的信号识别结构域为上述a1)或a2)；

所述嵌合CEA抗原受体的信号传导结构域为上述b1)或b2)；

更进一步的，所述嵌合CEA抗原受体的信号识别结构域的编码基因序列为上述A1)或A2)或A3)；

所述嵌合CEA抗原受体的信号传导结构域的编码基因序列为上述B1)或B2)或B3)。

在本发明的一个实施例中，所述嵌合CEA抗原受体具体为上述c1)或c2)；

所述嵌合CEA抗原受体的编码基因序列具体为上述C1)或C2)或C3)。

上述CAR-NK细胞的制备方法中，所述表达的方法为将所述嵌合CEA抗原受体的编码基因导入NK细胞中。

进一步的，所述嵌合CEA抗原受体的编码基因通过重组慢病毒载体导入NK细胞中。

更进一步的，所述重组慢病毒载体为将SEQ ID NO.5所示的DNA分子替换pLVX-IRES载体中HindⅢ、BglⅡ酶切位点间的小片段后得到的载体。

在本发明的一个实施例中，所述表达的方法包括如下步骤：

1)利用所述重组慢病毒载体和慢病毒包装质粒转染慢病毒包装细胞，进行培养，获得重组慢病毒；

2)将所述重组慢病毒感染NK细胞，从而获得所述嵌合CEA抗原受体的NK细胞。

所述1)中，所述慢病毒包装质粒由gag质粒、Rev质粒和VSV-G质粒组成；

所述慢病毒包装细胞可为293T细胞。

所述包装的方法具体可按照如下步骤进行：将293T细胞使用含10％胎牛血清的DMEM培养基进行培养，当293T细胞汇合度达到80％时于培养上清中加入慢病毒包装质粒及重组慢病毒载体。所述慢病毒包装质粒及重组慢病毒载体在培养体系中的浓度分别可为：VSV-G 1.5ug/mL、gag 2ug/mL、Rev 3ug/mL、pLVX-CAR 3.5ug/mL。

所述2)中，所述NK细胞的获得方法如下：抽取人外周血，使用密度梯度离心的分离方法分离PBMC；诱导培养所述PBMC，获得NK细胞。所述NK细胞主要通过诱导扩增淋巴细胞系中原有NK细胞、体外诱导单核细胞转化为NK细胞、以及诱导T细胞转化为有NK细胞特性的NKT细胞来实现。

所述诱导的方法具体可按照如下步骤进行：将PBMC接种于添加了5％灭活自体血清、500IU/mL IL2、1％非必须氨基酸、1％谷氨酰胺的1640培养基中，培养一天后转入提前使用含0.3-0.6g/mL的CD3、CD56、CD14三种抗体的包被液包被的培养瓶中进行培养；在培养过程中的第三天补加MICA蛋白和MICB蛋白，两种蛋白在培养体系中的终浓度均为0.5-2mg/mL；在培养过程中的第七天时补加MICA蛋白和MICB蛋白，两种蛋白在培养体系中的终浓度均为0.5-2mg/mL，培养至第十四天时收获细胞产品。

所述感染的方法具体可按照如下步骤进行：在诱导培养第五天，向培养体系中加入50ug/mL的鱼精蛋白，置于室温30min后，滴加1)中所述的重组慢病毒，使所述重组慢病毒在培养体系中的滴度为(0.5-2.0)×10⁷TU/mL。

本发明还保护如下任一所示生物材料：

(X1)按照上述方法制备得到的所述嵌合CEA抗原受体的NK细胞；

(X2)上述嵌合CEA抗原受体的编码基因序列；

(X3)含有所述编码基因序列的表达盒、重组载体、重组菌或重组细胞。

上述生物材料在制备治疗肿瘤的产品中的应用也属于本发明的保护范围。

上述生物材料在制备用于杀伤肿瘤细胞的产品中的应用也属于本发明的保护范围。

上述嵌合CEA抗原受体的编码基因序列或含有所述编码基因序列的表达盒、重组载体、重组菌或重组细胞在制备嵌合CEA抗原受体的NK细胞中的应用也属于本发明的保护范围。

上述应用中，所述肿瘤可为常见的肿瘤，如大肠癌、胰腺癌、胃癌、肺癌、肝癌、胆管癌、乳腺癌、卵巢、甲状腺髓样癌和泌尿系统的肿瘤等。在本发明的一个实施例中，所述肿瘤具体为乳腺癌。

所述肿瘤细胞可为常见的肿瘤细胞，如大肠癌细胞、胰腺癌细胞、胃癌细胞、肺癌细胞、肝癌细胞、胆管癌细胞和乳腺癌细胞等。在本发明的一个实施例中，所述乳腺癌细胞具体可为MCF7细胞。

本发明的有益效果如下：

1、CEA是常见于大肠癌、胰腺癌、胃癌、肺癌、肝癌、胆管癌、乳腺癌、卵巢、甲状腺髓样癌和泌尿系统的肿瘤中的肿瘤特异性抗原。本发明针对CEA抗原的结构构建了能表达其抗原受体的质粒，并通过慢病毒感染的方法使其表达于NK细胞，制备出嵌合CEA抗原受体的NK细胞即CEA-CAR-NK细胞，这种生物制剂将在临床治疗上述各种实体肿瘤中发挥作用。

2、相比于NK细胞，本发明所得的CAR-NK细胞能够更高效地杀伤肿瘤细胞。NK细胞虽然能够不受MHC限制地去杀伤肿瘤细胞，但其靶向性和特异性较弱，过继给患者的细胞不能集中地杀伤肿瘤细胞，本发明针对不同肿瘤的特异性抗原体外构建CAR的质粒，并使其表达于NK细胞，使NK细胞获得了特异性识别肿瘤细胞的能力，解决了上述问题。

3、相比于CAR-T细胞，本发明所得的CAR-NK细胞在达到与CAR-T细胞相同的治疗效果的基础上，其在治疗实体瘤的过程中能减少脱靶效应的发生。NK细胞具有独特的细胞识别及活化模式，这种模式使其既能发挥免疫杀伤作用，又能避免杀伤自体正常组织细胞。

4、本发明使用的NK细胞培养方法使得本发明获得高纯度的NK细胞(NK细胞占培养体系中所有细胞的比例＞90％)；本发明使用的慢病毒包装方法使得本发明获得高浓度的慢病毒(慢病毒滴度＞3×10⁸TU/mL)、本发明使用的慢病毒感染方法使得本发明获得高纯度的CAR-NK细胞(CAR-NK细胞占培养体系中所有细胞的比例＞34％)。

5、本发明所得的CAR-NK细胞能进行异体使用而不产生移植物抗宿主反应。大量的临床试验证实了使用异体NK细胞治疗的安全性，一些晚期的癌症患者，其体内免疫系统处于紊乱状态，NK细胞的体外培养往往不能达到预期的效果，对于这些患者来说，使用异体的CAR-NK细胞治疗将成为一种有效的方法，而异体CAR-T细胞的输注可能会导致致死性的移植物抗宿主反应。

附图说明

图1是本发明所述嵌合抗原受体NK细胞的结构示意图。

图2是本发明构建含CEA-CAR-pLVX质粒的流程图。

图3是CEA-CAR-pLVX质粒、CEA-CAR-pUC57质粒及使用HindⅢ、BglⅡ双酶切上述质粒后的电泳图。电泳结果显示酶切后CEA-CAR-pLVX质粒、CEA-CAR-pUC57质粒的小片段长度相等，表明CEA-CAR-pLVX质粒构建成功。

图4是含GFP-PLVX质粒的慢病毒感染后293T中GFP表达量检测。

图5是细胞收获时流式检测NK细胞(CD3-CD56+)的占比。结果显示其占总细胞数的95.5％。

图6是细胞收获时流式检测CEA-CAR-NK细胞的占比。结果显示其占总细胞数的34.5％。

图7是杀伤实验结果分析图。图中7AAD+Annexin V+细胞群为凋亡的靶细胞群。

图8是以MCF7为靶细胞NK细胞和CEA-CAR-NK细胞分别为效应细胞，以不同的效靶比作用时靶细胞凋亡率的曲线。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1：CEA-CAR-pLVX质粒的构建及扩增

一、CEA-CAR-pLVX质粒的构建

按照图2所示的流程构建CEA-CAR-pLVX质粒，具体构建方法如下：

1、委托金斯瑞生物科技有限公司依据本研究单位提供的基因序列SEQ ID NO.1合成含酶切位点HindⅢ(-AAGCTT-)、BglⅡ(-AGATCT-)的基因序列片段，并将其克隆到pUC57质粒(金斯瑞生物科技有限公司，货号：SD1176)中，得到的重组质粒即为CEA-CAR-pUC57质粒。

CEA-CAR-pUC57质粒为将SEQ ID NO.5所示的DNA分子插入pUC57质粒的HindⅢ、BglⅡ酶切位点间后得到的质粒。

2、将pLVX-IRES质粒(Taksra公司，货号：631238)与CEA-CAR-pUC57质粒同时用HindⅢ(Taksra公司，货号：1060A)和BglⅡ(Taksra公司，货号：1021A)进行双酶切，产物进行凝胶电泳并回收pLVX-IRES酶切后的大片段和CEA-CAR-pUC57酶切后的小片段。

3、回收产物用T4DNA连接酶(Takara公司，货号：2011A)连接即获得CEA-CAR-pLVX质粒。

CEA-CAR-pLVX质粒为将SEQ ID NO.5所示的DNA分子替换pLVX-IRES质粒中HindⅢ、BglⅡ酶切位点间的小片段后得到的质粒。

按照上述方法，将SEQ ID NO.7所示的DNA分子替换pLVX-IRES质粒中HindⅢ、BglⅡ酶切位点间的小片段后得到GFP-pLVX质粒。

二、CEA-CAR-pLVX质粒的扩增

1、用CaCl₂处理DH5a菌株，使其处于感受态，并将其与CEA-CAR-pLVX质粒37℃共保温16-24h，挑取单独菌落进行扩大培养。

2、使用质粒大提试剂盒(Sigma公司，PLX50-1KT)，按推荐的实验流程提取质粒，提取的产物用HindⅢ和BglⅡ进行双酶切，得到的小片段与用HindⅢ和BglⅡ双酶切CEA-CAR-pUC57质粒时得到的小片段长度相同，证明CEA-CAR-pLVX质粒构建成功(图3)。

3、使用NanoUV-3000超微量紫外分光光度计测其浓度，结果表明：CEA-CAR-pLVX质粒浓度为0.8-1.2ug/ul。

实施例2：慢病毒载体的包装及慢病毒滴度的检测

一、慢病毒载体的包装

1、复苏293T细胞并进行培养，培养基为含10％胎牛血清(Gibico公司，货号：10099141)的DMEM培养基(Gibico公司，货号：11995065)。调整细胞浓度，使得细胞在10cm培养皿中的培养体积为10mL、汇合度为80％。

2、按照实施例1中的方法对慢病毒包装所需质粒gag(优宝生物，货号:VT1548)、Rev(优宝生物，货号:VT1445)、VSV-G(优宝生物，货号:VT1491)进行扩增及浓度检测。结果表明：上述质粒浓度均为0.8-1.2ug/ul。

3、于1mL DMEM培养基中加入上述gag质粒20ug、Rev质粒30ug、VSV-G质粒15ug和实施例1制备的CEA-CAR-pLVX质粒35ug，混匀后室温孵育15min，之后，将混合质粒体系加入293T细胞的培养上清中，混匀后继续培养。

4、添加质粒后，293T细胞培养24h时收集病毒上清，并补加培养基10mL，48h时再次收集病毒上清。

5、收集后的病毒上清使用0.45um滤器进行过滤，向病毒上清中加入1/4体积的无菌PEG8000(北京凯瑞基生物科技有限公司，货号：25322-68-3)，置于摇床上4℃过夜，12000r/mim离心30min，弃去上清，用1mL DMEM培养基重悬底部沉淀即得到浓缩的含有CEA-CAR-pLVX质粒的慢病毒载体，保存于-80℃备用。

按照上述方法将GFP-pLVX质粒进行包装，得到含有GFP-pLVX质粒的慢病毒载体。

二、慢病毒滴度的检测

1、使用0.25％胰酶消化293T细胞，用含10％FBS的DMEM培养基重悬混匀后计数。取1×10⁶个细胞接入6孔板，接入3个复孔，并用含10％FBS的DMEM培养基调整培养体系至2mL，置于37℃、5％CO₂培养箱内培养。

2、待细胞贴壁后向培养体系中加入含GFP-pLVX质粒的慢病毒载体1uL，混匀后置于37℃、5％CO₂培养箱内培养。

3、加入慢病毒后第三天，使用0.25％胰酶消化细胞并计数，使用流式细胞术检测GFP表达量；并根据以下公式计算含有GFP-pLVX质粒的慢病毒载体滴度：慢病毒滴度(TU/mL)＝293T细胞数×三个复孔的平均GFP表达量×10³，本实施例的几个复孔的检测结果显示加入慢病毒后293T细胞GFP表达量为25％(图4)，293T细胞数约1.5×10⁶个，因此慢病毒滴度＝1.5×10⁶×25％×10³＝3.75×10⁸TU/mL。作为平行实验，该病毒滴度也为含有CEA-CAR-pLVX质粒的慢病毒载体的病毒滴度。

实施例3：CEA-CAR-NK细胞的制备

一、NK细胞的培养及CEA-CAR-NK细胞的制备

1、使用肝素抗凝采血管静脉采集50-80mL外周血，1500r/mim离心5min，用移液器吸取上层血清备用，细胞沉淀用等量PBS重悬，缓慢加入至等体积的Ficoll(葡聚糖－泛影葡胺)分离液(购于通用电气医疗集团，货号：17-5442-02/03)中，设置离心机自然升降速度，2000r/min离心20min，离心后吸取中间白膜层细胞为外周血单个核细胞。

2、使用添加了5％灭活自体血清(灭活自体血清的制备方法：将血清置于56℃水浴箱水浴半小时)、500IU/mL IL-2(Invitrogen公司，货号：PA5-46923)、1％非必需氨基酸(购买自solarbio，货号：N1250)、1％谷氨酰胺的1640培养基对步骤1获得的外周血单个核细胞进行培养，培养一天后转入提前使用含0.3-0.6g/mL的CD3(亚诺法生技公司，货号：MAB4959)、CD56(亚诺法生技公司，货号：MAB3511)、CD14(亚诺法生技公司，货号：PAB4880)三种抗体的包被液包被的培养瓶中进行培养。

3、在培养过程中的第三天补加MICA(Reliatech公司，货号：101-M569)和MICB(Reliatech公司，货号：101-M570)蛋白，两种蛋白在培养体系中的终浓度均为0.5-2mg/mL。

4、在细胞培养第五天，往CEA-CAR-NK细胞培养体系中加入鱼精蛋白(上海生工生物，货号：A600787-0001)，其在培养体系中浓度为50ug/mL，置于室温30min后，滴加实施例2中获得的慢病毒(浓缩的含有CEA-CAR-pLVX质粒的慢病毒载体)，使慢病毒在培养体系中的滴度为(0.5-2.0)×10⁷TU/mL。之后，将细胞置于32℃、5％CO₂孵箱内培养，24h后换液并将细胞置于37℃、5％CO₂孵箱内进行后续培养。

5、在培养过程中的第七天时补加MICA和MICB蛋白，两种蛋白在培养体系中的终浓度均为0.5-2mg/mL。

6、培养至第十四天时收获CEA-CAR-NK细胞产品。

本发明制备的嵌合CEA抗原受体的NK细胞(CEA-CAR-NK细胞)的结构示意图如图1所示。

二、NK细胞及CEA-CAR-NK细胞的检测

培养结束后，使用实施例2所述的流式细胞术检测培养体系中NK细胞的表达量及CEA-CAR-NK细胞的表达量。具体步骤如下：

1、NK细胞的检测

取培养结束的CEA-CAR-NK细胞，使用Percp-CyTM5.5Mouse Anti-Human CD3(BD公司，货号：560835)、PE Mouse Anti-Human CD56(美国BD公司，货号：555516)单克隆抗体染色，FSC-SSC圈门分析CD3-CD56+细胞群的表达量即为NK细胞的表达量，本实施例实验结果显示以本发明方法培养获得的NK细胞可达95.5％(图5)。

2、CEA-CAR-NK细胞的检测

用PBS调整蛋白L(北京天恩泽生物技术有限公司，货号：131082-1)浓度为100ug/mL，取1×10⁶个待检细胞于5mL流式管中，用4℃的缓冲洗液(含4％牛血清白蛋白的PBS)3mL清洗三次以除去培养基中的免疫球蛋白，清洗完成后，用200uL缓冲洗液重悬细胞，并加入1ug蛋白L，4℃孵育45min，用4℃的缓冲洗液3mL清洗三次，加入10uL PE-conjugatedstreptavidin(美国BD公司，货号：554061)，4℃避光孵育25min，用4℃的缓冲洗液3mL清洗1次，用300uL洗液重悬上机检测。SC-SSC圈门分析，PE通道阳性细胞群的表达量即为CEA-CAR-NK细胞表达量，本实施例实验结果显示以本发明方法培养获得的CEA-CAR-NK细胞可达34.5％(图6)。

实施例4：CEA-CAR-NK细胞杀伤活性检测

检测CAR-NK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性。具体步骤如下：

1、使用0.25％的胰酶将处在对数生长期的乳腺癌细胞系MCF7细胞从培养瓶中消化并转入50mL离心管中，800转离心3min，弃上清。用含10％胎牛血清的DMEM培养基重悬细胞并计数，调整靶细胞浓度为1×10⁵个/mL，接入24孔板，每孔500uL，接好细胞的培养板置于二氧化碳培养箱37℃、5％CO₂孵育24小时。

2、效应细胞(培养至十四天的CEA-CAR-NK和对照组NK细胞)1500转离心5min，弃上清，使用CellTracker^TMFluorescent Probes(life公司货号:C34565)工作液重悬细胞，室温孵育20min。离心并弃掉CellTracker^TMFluorescent Probes工作液，用PBS洗细胞3次，加入效应细胞培养所需的培养基重悬计数，按相应的效靶比(0:1、1:1、5:1、10:1、20:1)调整细胞浓度，接入含靶细胞的24孔板，每孔500uL。接好细胞的培养板置于37℃，5％CO₂孵箱24小时。

3、重悬培养板中的细胞至离心管，并用4℃PBS洗两次，用1×Binding Buffer(美国BD公司，货号：556454)重悬细胞。取100uL细胞至5mL圆底管，加入5uL PE Annexin V(美国BD公司，货号：556422)和5uL 7-AAD(美国BD公司，货号：559925)避光染色20min后，用PBS洗去多余染色剂，用400uL 1×Binding Buffer重悬细胞，进行流式细胞术分析，分析时使用CellTracker^TMDeep Red dye来圈门，分析门内7AAD+Annexin V+细胞群即为凋亡细胞(图7)，并根据检测结果做凋亡曲线，本实施例实验结果显示以CEA-CAR-NK细胞对乳腺癌细胞系MCF7细胞的杀伤效果要明显优于对照组NK细胞(图8)。

序列表

<110> 北京康爱瑞浩生物科技股份有限公司

<120> 一种嵌合CEA抗原受体的NK细胞及其制备方法与应用

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 732

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gacattcaga tgacccagag cccaagcagc cttagcgcca gcgtgggtga cagactgaca 60

atctgctgta gtaccagctc gggtgtaagt tacatgcact ggtaccagca gaagcccggt 120

aaggctccaa ggctatagat ctacagcaca tccaatctgg cttctggtgt gccaagcaat 180

ttctccggta gcggtagcgg taccgacttc accttcacca tcagcagcct ccagccacaa 240

gacatcgcct gctactactg ccatgaatgg agtagttatc ccacgttcgg ccaggggacc 300

aaggtggaac taaaaggatc cacttccggt tcaggaaagc ccgggagtgg tgaaggtagc 360

actgaaggcc aggtcgaact ggaacaaagc ggcccaggtc ttgtgagacc tagccagacc 420

ctgagcctga cctgcaccaa ttctctcttc accatcagca gtccttgaag ctggcactgg 480

gtgcgtcagc cacctggacg aggtcttgag aggattggat acatacagta cagtggtatc 540

actcgttaca acccctctct caaaagtaga gtgacaatgc tggtagacac cagcaagaac 600

cagttcagcc tgcgcctcag cagcgtgaca gccgccgaca ccgcagtcta ttattgtgca 660

agacaagact atgattacca ctggtacttc gatgtctggg gtcaaggcag cacggtctgc 720

gtctcctcag gt 732

<210> 2

<211> 244

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Asp Ile Gln Met Thr Glu Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Leu Thr Ile Cys Cys Ser Thr Ser Ser Gly Val Ser Tyr Met

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Arg Ile Leu Ile Tyr

35 40 45

Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Asn Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Pro Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Gln

65 70 75 80

Asp Ile Ala Cys Tyr Tyr Cys His Glu Trp Ser Ser Tyr Pro Thr Phe

85 90 95

Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Leu Lys Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly

100 105 110

Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Glu Gly Gln Val Glu Leu Glu

115 120 125

Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr

130 135 140

Cys Thr Val Ser Gly Phe Thr Ile Ser Ser Gly Cys Ser Trp His Trp

145 150 155 160

Val Arg Gln Pro Pro Gly Asn Gly Leu Glu Arg Ile Gly Tyr Ile Glu

165 170 175

Tyr Ser Gly Leu Thr Arg Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr

180 185 190

Met Leu Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Ile Arg Leu Ser Ser

195 200 205

Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Asp Tyr

210 215 220

Asp Tyr His Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Ser Thr Val Cys

225 230 235 240

Val Ser Ser Gly

<210> 3

<211> 663

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60

tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120

gacttcgcct gtgatatcta catctgggcg cccctggccg ggacttgtgg ggtccttctc 180

ctgtcactgg ttatcaccaa acggggcaga aagaaactcc tgtatatatt caaacaacca 240

tttatgagac gagtacaaac tactcaagag gaagatggct gtagctgccg atttccagaa 300

gaagaagaag gaggatgtga actgagagtg aagttcagca ggagcgcaga cgcccccgcg 360

taccagcagg gccagaacca gctctataac gagctcaatc taggacgaag agaggagtac 420

gatgttttgg acaagagacg tggccgggac cctgagatgg ggggaaagcc gcagagaagg 480

aagaaccctc aggaaggcct gtacaatgaa ctgcagaaag ataagatggc ggaggcctac 540

agtgagattg ggatgaaagg cgagcgccgg aggggcaagg ggcacgatgg cctttaccag 600

ggtctcagta cagccaccaa ggacacctac gacgcccttc acatgcaggc cctgccccct 660

cgc 663

<210> 4

<211> 221

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

1 5 10 15

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

20 25 30

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile

35 40 45

Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val

50 55 60

Ile Thr Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro

65 70 75 80

Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys

85 90 95

Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe

100 105 110

Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu

115 120 125

Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp

130 135 140

Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg

145 150 155 160

Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met

165 170 175

Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly

180 185 190

Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp

195 200 205

Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

210 215 220

<210> 5

<211> 1464

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cccaagcttg gggacattca gatgacccag agcccaagca gccttagcgc cagcgtgggt 60

gacagactga caatctgctg tagtaccagc tcgggtgtaa gttacatgca ctggtaccag 120

cagaagcccg gtaaggctcc aaggctatag atctacagca catccaatct ggcttctggt 180

gtgccaagca atttctccgg tagcggtagc ggtaccgact tcaccttcac catcagcagc 240

ctccagccac aagacatcgc ctgctactac tgccatgaat ggagtagtta tcccacgttc 300

ggccagggga ccaaggtgga actaaaagga tccacttccg gttcaggaaa gcccgggagt 360

ggtgaaggta gcactgaagg ccaggtcgaa ctggaacaaa gcggcccagg tcttgtgaga 420

cctagccaga ccctgagcct gacctgcacc aattctctct tcaccatcag cagtccttga 480

agctggcact gggtgcgtca gccacctgga cgaggtcttg agaggattgg atacatacag 540

tacagtggta tcactcgtta caacccctct ctcaaaagta gagtgacaat gctggtagac 600

accagcaaga accagttcag cctgcgcctc agcagcgtga cagccgccga caccgcagtc 660

tattattgtg caagacaaga ctatgattac cactggtact tcgatgtctg gggtcaaggc 720

agcacggtct gcgtctcctc aggtggcggt ggaggcggtg gaggaggcgg ttctggcggt 780

ggaggctctg gaagatcttc caccacgacg ccagcgccgc gaccaccaac accggcgccc 840

accatcgcgt cgcagcccct gtccctgcgc ccagaggcgt gccggccagc ggcggggggc 900

gcagtgcaca cgagggggct ggacttcgcc tgtgatatct acatctgggc gcccctggcc 960

gggacttgtg gggtccttct cctgtcactg gttatcacca aacggggcag aaagaaactc 1020

ctgtatatat tcaaacaacc atttatgaga cgagtacaaa ctactcaaga ggaagatggc 1080

tgtagctgcc gatttccaga agaagaagaa ggaggatgtg aactgagagt gaagttcagc 1140

aggagcgcag acgcccccgc gtaccagcag ggccagaacc agctctataa cgagctcaat 1200

ctaggacgaa gagaggagta cgatgttttg gacaagagac gtggccggga ccctgagatg 1260

gggggaaagc cgcagagaag gaagaaccct caggaaggcc tgtacaatga actgcagaaa 1320

gataagatgg cggaggccta cagtgagatt gggatgaaag gcgagcgccg gaggggcaag 1380

gggcacgatg gcctttacca gggtctcagt acagccacca aggacaccta cgacgccctt 1440

cacatgcagg ccctgccccc tcgc 1464

<210> 6

<211> 488

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Pro Lys Leu Gly Asp Ile Gln Met Thr Glu Ser Pro Ser Ser Leu Ser

1 5 10 15

Ala Ser Val Gly Asp Arg Leu Thr Ile Cys Cys Ser Thr Ser Ser Gly

20 25 30

Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Arg

35 40 45

Ile Leu Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Asn

50 55 60

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Pro Thr Phe Thr Ile Ser Ser

65 70 75 80

Leu Gln Pro Gln Asp Ile Ala Cys Tyr Tyr Cys His Glu Trp Ser Ser

85 90 95

Tyr Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Leu Lys Gly Ser Thr

100 105 110

Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Glu Gly Gln

115 120 125

Val Glu Leu Glu Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln Thr

130 135 140

Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Thr Ile Ser Ser Gly Cys

145 150 155 160

Ser Trp His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Asn Gly Leu Glu Arg Ile

165 170 175

Gly Tyr Ile Glu Tyr Ser Gly Leu Thr Arg Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

180 185 190

Ser Arg Val Thr Met Leu Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Ile

195 200 205

Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

210 215 220

Arg Gln Asp Tyr Asp Tyr His Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly

225 230 235 240

Ser Thr Val Cys Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly

245 250 255

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Thr Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala

260 265 270

Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser

275 280 285

Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr

290 295 300

Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala

305 310 315 320

Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Lys Arg Gly

325 330 335

Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val

340 345 350

Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu

355 360 365

Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp

370 375 380

Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn

385 390 395 400

Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg

405 410 415

Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu

420 425 430

Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser

435 440 445

Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly

450 455 460

Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu

465 470 475 480

His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

485

<210> 7

<211> 812

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cccaagcttg ggacggtggg aggtctatat aagcagagct ggtttagtga accgtcagat 60

ccgctagcgc taccggtcgc caccatggtg agcaagggcg aggagctgtt caccggggtg 120

gtgcccatcc tggtcgagct ggacggcgac gtaaacggcc acaagttcag cgtgtccggc 180

gagggcgagg gcgatgccac ctacggcaag ctgaccctga agttcatctg caccaccggc 240

aagctgcccg tgccctggcc caccctcgtg accaccctga cctacggcgt gcagtgcttc 300

agccgctacc ccgaccacat gaagcagcac gacttcttca agtccgccat gcccgaaggc 360

tacgtccagg agcgcaccat cttcttcaag gacgacggca actacaagac ccgcgccgag 420

gtgaagttcg agggcgacac cctggtgaac cgcatcgagc tgaagggcat cgacttcaag 480

gaggacggca acatcctggg gcacaagctg gagtacaact acaacagcca caacgtctat 540

atcatggccg acaagcagaa gaacggcatc aaggtgaact tcaagatccg ccacaacatc 600

gaggacggca gcgtgcagct cgccgaccac taccagcaga acacccccat cggcgacggc 660

cccgtgctgc tgcccgacaa ccactacctg agcacccagt ccgccctgag caaagacccc 720

aacgagaagc gcgatcacat ggtcctgctg gagttcgtga ccgccgccgg gatcactctc 780

ggcatggacg agctgtacaa ggaagatctt cc 812

Claims

1.一种带有嵌合抗原受体的NK细胞，其特征在于：所述嵌合抗原受体中的抗原受体是针对CEA的抗原受体。

2.根据权利要求1所述的NK细胞，其特征在于：所述嵌合抗原受体包括信号识别结构域和信号传导结构域；

所述信号识别结构域为抗CEA的单链抗体；

3.根据权利要求1或2所述的NK细胞，其特征在于：所述信号识别结构域为如下a1)或a2)：

a1)由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

或，所述信号传导结构域为如下b1)或b2)：

b1)由SEQ ID No.4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

4.根据权利要求3所述的NK细胞，其特征在于：所述信号识别结构域的编码基因序列为如下A1)或A2)或A3)：

A1)SEQ ID No.1所示的cDNA分子或基因组DNA分子；

或，所述信号传导结构域的编码基因序列为如下B1)或B2)或B3)：

B1)SEQ ID No.3所示的cDNA分子或基因组DNA分子；

5.根据权利要求1-4所述的NK细胞，其特征在于：所述嵌合抗原受体为如下c1)或c2)：

c1)由SEQ ID No.6所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

6.根据权利要求5所述的NK细胞，其特征在于：所述嵌合抗原受体的编码基因序列为如下C1)或C2)或C3)：

C1)SEQ ID No.5所示的cDNA分子或基因组DNA分子；

7.权利要求1-6任一所述的NK细胞的制备方法，包括如下步骤：在NK细胞中表达嵌合CEA抗原受体，得到嵌合CEA抗原受体的NK细胞。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述表达的方法为将所述嵌合CEA抗原受体的编码基因导入NK细胞中；

或，所述嵌合CEA抗原受体的编码基因通过重组慢病毒载体导入NK细胞中；

或，所述重组慢病毒载体为将SEQ ID NO.5所示的DNA分子替换pLVX-IRES载体中HindⅢ、BglⅡ酶切位点间的小片段后得到的载体。

9.如下任一所示生物材料：

(X1)按照权利要求7或8所述方法制备得到的所述嵌合CEA抗原受体的NK细胞；

(X2)权利要求6中所述的嵌合抗原受体的编码基因序列；

(X3)含有(X2)所述的编码基因序列的表达盒、重组载体、重组菌或重组细胞。

10.权利要求1-6任一所述的NK细胞或权利要求9所述的生物材料在制备治疗肿瘤的产品中的应用；

或，权利要求1-6任一所述的NK细胞或权利要求9所述的生物材料在制备用于杀伤肿瘤细胞的产品中的应用；

或，权利要求9中所述的编码基因序列、表达盒、重组载体、重组菌或重组细胞在制备嵌合CEA抗原受体的NK细胞中的应用。