CN114957483A - 一种靶向cd155的car结构设计及其应用 - Google Patents

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Abstract

本申请属于肿瘤免疫治疗技术领域，具体涉及一种靶向CD155的CAR结构设计及其应用专利申请事宜。该CAR序列包括依次连接的人源TIGIT胞外区序列、CD8信号传导片段、以及CD28或41BB刺激信号分子，结构式分别命名为：CD155‑28z‑CAR或者CD155‑BBz‑CAR。本申请中，发明人以CD155作为目标靶点，设计了新的CAR结构。基于此CAR结构设计，发明人进一步制备了靶向CD155的重组慢病毒表达质粒，进一步地T细胞转染和相关初步实验结果表明，相关CAR结构设计能有效刺激肿瘤细胞产生大量效应因子IL‑2和IFN‑γ，表明该CAR结构对相关肿瘤尤其是实体瘤的防治具有较好应用前景。

Description

一种靶向CD155的CAR结构设计及其应用
技术领域
本申请属于肿瘤免疫治疗技术领域，具体涉及一种靶向CD155的CAR（ChimericAntigen Receptor，嵌合抗原受体）结构设计及其应用专利申请事宜。
背景技术
肿瘤防治中，基于免疫系统的CAR-T（Chimeric Antigen Receptor T-Cell，嵌合抗原受体T细胞）治疗方式，因其副作用小、适应症广泛等技术优势，近年来得到了较多研究和发展。
现有技术中，以CD19为靶点，利用CAR-T细胞来定向清除CD19+肿瘤细胞已在非实体瘤的急性淋巴细胞白血病(ALL)的治疗中表现出较好防治效果。但是CAR-T技术在实体瘤中的应用目前尚不尽人意，还有许多问题需要解决，其中一个重要技术问题就是寻找在实体肿瘤中特异表达的靶点抗原。
针对细胞表面表达分子相关研究表明，CD155作为一种免疫球蛋白样粘附分子，属于Nectin样分子家族中的第五个成员，其参与了细胞运动、自然杀伤和T细胞以及NK细胞介导的免疫过程。作为共刺激受体CD226和天然杀伤细胞和T细胞上的共抑制受体TIGIT和CD96的配体，CD155通过与包括TIGIT、CD226和CD96在内的多种配体相互作用在免疫中发挥双重作用。
已有研究表明，CD155在人的各种正常组织中很少或弱表达，但在多种人类恶性肿瘤中存在过度表达现象，对肿瘤的增殖转移有明显的促进作用，并与患者不良预后相关。基于这一特点，将CD155作为目标靶点，进而开发一种CAR-T细胞治疗方法，则有望拓展CAR-T技术在实体瘤治疗中的应用范围以及进一步改善肿瘤的治疗效果是具有十分重要的技术意义的。
发明内容
针对CD155靶点，本申请目的在于提供一种新的CAR结构设计，从而为相关实体瘤的防治奠定一定技术基础。
本申请所采取的技术方案详述如下。
一种靶向CD155的CAR结构设计，该CAR序列包括依次连接的人源TIGIT胞外区序列、CD8信号传导片段、以及CD28或41BB刺激信号分子，具体结构式分别命名为：CD155-28z-CAR或者CD155-BBz-CAR；具体说明如下。
（1）CD155-28z-CAR结构：
包括依次连接的：人CD8a分子信号肽(Leading signal，CD8a)、人源TIGIT胞外区（人源CD155胞外区）、人CD8a分子柔性片段(CD8Hinge)、人CD28分子跨膜区与胞内区(CD28)，人CD3z分子胞内区(CD3z)；其蛋白总长为388个氨基酸，具体氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示，具体如下：
MALPVTALLLPLALLLHAARPMMTGTIETTGNISAEKGGSIILQCHLSSTTAQVTQVNWEQQDQLLAICNADLGWHISPSFKDRVAPGPGLGLTLQSLTVNDTGEYFCIYHTYPDGTYTGRIFLEVLESSVAEHGARFQIPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR。
其中，其中， 所述人CD8a分子信号肽（CD8a），包括21个氨基酸，具体为：MALPVTALLLPLALLLHAARP；
所述TIGIT胞外区（人源CD155胞外区），包括120个氨基酸，具体为：MMTGTIETTGNISAEKGGSIILQCHLSSTTAQVTQVNWEQQDQLLAICNADLGWHISPSFKDRVAPGPGLGLTLQSLTVNDTGEYFCIYHTYPDGTYTGRIFLEVLESSVAEHGARFQIP；
所述人CD8a分子柔性片段(CD8Hinge)，包括66个氨基酸，具体为：TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT；
所述人CD28分子跨膜区与胞内区(CD28)，包括68个氨基酸，具体为：
FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS；
人CD3z分子胞内区(CD3z)，包括113个氨基酸，具体为：RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR。
（2）CD155-BBz-CAR结构：
包括依次连接的：人CD8a分子信号肽(Leading signal)、人源TIGIT胞外区、人CD8a分子柔性片段(CD8Hinge)、人41BB分子跨膜区与胞内区(41BB)，人CD3z分子胞内区(CD3z)。
CD155-BBz-CAR编码蛋白序列，包括362个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，具体为：
MALPVTALLLPLALLLHAARPMMTGTIETTGNISAEKGGSIILQCHLSSTTAQVTQVNWEQQDQLLAICNADLGWHISPSFKDRVAPGPGLGLTLQSLTVNDTGEYFCIYHTYPDGTYTGRIFLEVLESSVAEHGARFQIPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR；
其中， 所述人41BB分子跨膜区与胞内区(41BB)，包括42个氨基酸，具体为：
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL。
所述靶向CD155的CAR结构在制备肿瘤相关药剂中的应用，所述肿瘤具体例如为胃癌相关肿瘤。
利用所述靶向CD155的CAR结构设计所构建的慢病毒表达载体，通过如下步骤构建获得：
（一）CAR结构制备
按照SEQ ID No.1所示CD155-28z-CAR结构序列、以及按照SEQ ID No.2所示CD155-BBz-CAR结构序列，制备获得对应的DNA编码序列；其中SEQ ID No.1对应的DNA序列（1164bp）为：
atgcgctggtgtctcctcctgatctgggcccaggggctgaggcaggctcccctcgcctcaggaatgatgacaggcacaatagaaacaacggggaacatttctgcagagaaaggtggctctatcatcttacaatgtcacctctcctccaccacggcacaagtgacccaggtcaactgggagcagcaggaccagcttctggccatttgtaatgctgacttggggtggcacatctccccatccttcaaggatcgagtggccccaggtcccggcctgggcctcaccctccagtcgctgaccgtgaacgatacaggggagtacttctgcatctatcacacctaccctgatgggacgtacactgggagaatcttcctggaggtcctagaaagctcagtggctgagcacggtgccaggttccagattccaaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccttttgggtgctggtggtggttggtggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctccagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgcagagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc
其中SEQ ID No.2对应的DNA序列（995bp）为：
Atgcgctggtgtctcctcctgatctgggcccaggggctgaggcaggctcccctcgcctcaggaatgatgacaggcacaatagaaacaacggggaacatttctgcagagaaaggtggctctatcatcttacaatgtcacctctcctccaccacggcacaagtgacccaggtcaactgggagcagcaggaccagcttctggccatttgtaatgctgacttggggtggcacatctccccatccttcaaggatcgagtggccccaggtcccggcctgggcctcaccctccagtcgctgaccgtgaacgatacaggggagtacttctgcatctatcacacctaccctgatgggacgtacactgggagaatcttcctggaggtcctagaaagctcagtggctgagcacggtgccaggttccagattccaaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgcagagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc。
（二）构建获得重组慢病毒表达质粒
以pCDH-EF1-MSC-T2A-GFP质粒为载体，通过酶切、连接方式，将步骤（一）中的编码序列插入到pCDH-EF1-MSC-T2A-GFP质粒中，以构建获得重组后慢病毒表达质粒pCDH-EF1-CAR-CD155-28z或pCDH-EF1-CAR-CD155-BBz。该过程的具体操作委托上海生工公司完成。
基于所述靶向CD155的CAR结构设计所构建的慢病毒表达载体在制备抗肿瘤相关药剂中的应用，所述肿瘤具体例如为胃癌相关肿瘤。
所述靶向CD155的CAR结构设计所构建的慢病毒表达载体在制备CAR-T细胞中应用，具体应用方法包括如下步骤：
（一）慢病毒包装
以293T细胞为包装细胞，将pCDH-EF1-CAR-CD155-28z或pCDH-EF1-CAR-CD155-BBz表达质粒与包装质粒（pSPAX2与pMD2.G）混合，对293T细胞进行转染（例如采用磷酸钙转染试剂或者其他类型转染剂）、培养；培养一定时间后，收集上清，用于后续T细胞感染。
具体包装操作可参考如下：
以293T细胞为包装细胞，将293T细胞铺板24小时后（细胞融合率达到约80%），准备2个1.5mL的 EP管，并分别加入0.5mL 的Opti-MEM培养基；
在其中一管中将pCDH-EF1-CAR-CD155-28z（或pCDH-EF1-CAR-CD155-BBz表达质粒）与包装质粒（pSPAX2与pMD2.G）混合（三种质粒的摩尔比为1:1:1，总质量为4ug）；混匀后，室温（22-25℃）静置孵育5min；
另一管加入Lipofectamine 3000；
之后将两管混合（即，将包装后质粒与Lipo培养基混合），室温静置孵育20min；
随后，将质粒-Lipo混合物小心加入293T细胞中，转染16-18h后，小心移去上清，然后缓慢加入3mL含10%血清的DMEM，静置培养；
继续培养48小时后，收集上清，用于后续T细胞感染。
（二）T细胞纯化与感染；
采集健康人外周血，经密度梯度离心后，分离外周血单个核细胞；
利用T细胞分离试剂盒获得纯化的CD3+T细胞，再按照2个细胞加入1个磁珠的比例，加入适量CD3/CD28磁珠活化2天；
2天后，加入病毒上清与polybrene孵育过夜；
次日，离心清洗T细胞3次后，加入含1000U IL-2与5%胎牛血清的RPMI1640培养基扩增T细胞。
具体操作可参考如下：
采集健康人外周血，经密度梯度离心后，弃上清， 加入预冷 1×Buffer 调整细胞密度至 1×108/mL；
将 2 mL 上述细胞悬液转至无菌流式管，加入 200 µL的Human CD3+ T CellBiotinylated Antibody Cocktail，轻轻混匀后，4℃孵育15 min；
加入250 µL的Streptavidin Ferrofluid（链霉亲和素铁磁）， 小心混匀， 4℃孵育15 min；
加入 0.55 mL 预冷 （1×）Buffer 至 3 mL，轻轻混匀后将含有细胞悬液的流式管放置到磁分选架上，室温静止6 min，小心将悬液转到新的无菌管中，这部分细胞就是CD3+细胞；
将分选得到的CD3+细胞在含有IL2的完全RPMI1640培养基中进行培养，再按照2个细胞加入1个磁珠的比例，加入适量CD3/CD28磁珠活化2天；
2天后，加入病毒上清（6孔板中每孔加2 ml）与polybrene（6孔板中每孔加10 µL）孵育过夜；
次日，离心清洗T细胞3次后，加入含1000U IL-2与5%胎牛血清的RPMI1640培养基培养T细胞。
（三）检测和扩增
对步骤（二）中T细胞感染7天后，利用流式细胞术对T细胞表面CAR的表达情况进行检测，其中荧光蛋白GFP的表达代表CAR的表达情况，检测合格后（一般要求为，GFP阳性率≥50%），进一步对转染后对CAR-T细胞在含1000U IL-2与5%胎牛血清的RPMI1640培养基中进行体外扩增。
本申请中，发明人以CD155作为目标靶点，基于现有人源TIGIT胞外域、CD8信号传导片段等组合设计了新的CAR结构，该结构设计中，其以人源TIGIT胞外域作为CAR-T细胞识别区，用于避免免疫排斥发生，有助于治疗效果改善；而胞内刺激信号CD28或41BB的加入，则在于改善T细胞功能。基于此CAR结构设计，发明人进一步制备了靶向CD155的重组慢病毒表达质粒，进一步地T细胞转染和相关初步实验结果表明，相关CAR结构设计能有效刺激肿瘤细胞产生大量效应因子IL-2和IFN-γ，表明该CAR结构对相关肿瘤尤其是实体瘤的防治具有较好的应用前景。
附图说明
图1为所设计CAR结构：CD155-28z-CAR和CD155-BBz-CAR的示意图；
图2为流式细胞术检测T细胞表达CAR表达；
图3为CAR-T细胞增殖情况；
图4说明CAR-T细胞能够特异杀伤CD155阳性细胞；
图5说明以CD155为靶点的CAR-T细胞与靶细胞共孵育后能有效分泌效应因子；
图6说明CAR-T细胞能够控制肿瘤生长。
具体实施方式
下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明。
实施例1
考虑肿瘤细胞与正常细胞表达分子差异，基于前期工作积累，本申请中，发明人旋转CD155作为目标靶点，同时基于发明人以往CAR结构设计工作经验，发明人设计了新的CAR结构。具体介绍如下。
靶向CD155的CAR结构，包括依次连接的人源TIGIT胞外区序列、CD8信号传导片段、以及CD28或41BB刺激信号分子，具体结构式分别命名为：CD155-28z-CAR或者CD155-BBz-CAR；示意图参见图1。具体说明如下。
（1）CD155-28z-CAR结构：
包括依次连接的：人CD8a分子信号肽(Leading signal，CD8a)、人源TIGIT胞外区（人源CD155胞外区）、人CD8a分子柔性片段(CD8Hinge)、人CD28分子跨膜区与胞内区(CD28)，人CD3z分子胞内区(CD3z)；其蛋白总长为388个氨基酸，具体氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示，具体如下：
MALPVTALLLPLALLLHAARPMMTGTIETTGNISAEKGGSIILQCHLSSTTAQVTQVNWEQQDQLLAICNADLGWHISPSFKDRVAPGPGLGLTLQSLTVNDTGEYFCIYHTYPDGTYTGRIFLEVLESSVAEHGARFQIPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR。
其中，其中， 所述人CD8a分子信号肽（CD8a），包括21个氨基酸，具体为：MALPVTALLLPLALLLHAARP；
所述TIGIT胞外区（人源CD155胞外区），包括120个氨基酸，具体为：MMTGTIETTGNISAEKGGSIILQCHLSSTTAQVTQVNWEQQDQLLAICNADLGWHISPSFKDRVAPGPGLGLTLQSLTVNDTGEYFCIYHTYPDGTYTGRIFLEVLESSVAEHGARFQIP；
所述人CD8a分子柔性片段(CD8Hinge)，包括66个氨基酸，具体为：TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT；
所述人CD28分子跨膜区与胞内区(CD28)，包括68个氨基酸，具体为：
FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS；
人CD3z分子胞内区(CD3z)，包括113个氨基酸，具体为：RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR。
（二）CD155-BBz-CAR结构：
包括依次连接的：人CD8a分子信号肽(Leading signal)、人源TIGIT胞外区、人CD8a分子柔性片段(CD8Hinge)、人41BB分子跨膜区与胞内区(41BB)，人CD3z分子胞内区(CD3z)。
CD155-BBz-CAR编码蛋白序列，包括362个氨基酸(SEQ ID No:2所示)，具体为：
MALPVTALLLPLALLLHAARPMMTGTIETTGNISAEKGGSIILQCHLSSTTAQVTQVNWEQQDQLLAICNADLGWHISPSFKDRVAPGPGLGLTLQSLTVNDTGEYFCIYHTYPDGTYTGRIFLEVLESSVAEHGARFQIPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR；
其中， 所述人41BB分子跨膜区与胞内区(41BB)，包括42个氨基酸，具体为：
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL。
需要解释的是，CAR结构设计中，人源TIGIT胞外域作为CAR-T细胞识别区的选择，可以有效避免免疫排斥发生，从而有助于治疗效果改善。而胞内刺激信号(CD28或41BB)的添加，则期望能够改善T细胞功能。
实施例2
在实施例1所设计CAR结构基础上，发明人进一步构建了重组的慢病毒表达质粒，并进一步转染T细胞，以对所设计的CAR结构功能效果进行了初步验证，具体实验过程简介如下。
（一）CAR结构制备
按照SEQ ID No.1所示CD155-28z-CAR结构序列、以及按照SEQ ID No.2所示CD155-BBz-CAR结构序列，委托上海生工公司合成制备获得了对应的DNA编码序列；其中SEQID No.1对应的DNA序列为：
Atgcgctggtgtctcctcctgatctgggcccaggggctgaggcaggctcccctcgcctcaggaatgatgacaggcacaatagaaacaacggggaacatttctgcagagaaaggtggctctatcatcttacaatgtcacctctcctccaccacggcacaagtgacccaggtcaactgggagcagcaggaccagcttctggccatttgtaatgctgacttggggtggcacatctccccatccttcaaggatcgagtggccccaggtcccggcctgggcctcaccctccagtcgctgaccgtgaacgatacaggggagtacttctgcatctatcacacctaccctgatgggacgtacactgggagaatcttcctggaggtcctagaaagctcagtggctgagcacggtgccaggttccagattccaaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccttttgggtgctggtggtggttggtggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctccagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgcagagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc；
其中SEQ ID No.2对应的DNA序列为：
Atgcgctggtgtctcctcctgatctgggcccaggggctgaggcaggctcccctcgcctcaggaatgatgacaggcacaatagaaacaacggggaacatttctgcagagaaaggtggctctatcatcttacaatgtcacctctcctccaccacggcacaagtgacccaggtcaactgggagcagcaggaccagcttctggccatttgtaatgctgacttggggtggcacatctccccatccttcaaggatcgagtggccccaggtcccggcctgggcctcaccctccagtcgctgaccgtgaacgatacaggggagtacttctgcatctatcacacctaccctgatgggacgtacactgggagaatcttcctggaggtcctagaaagctcagtggctgagcacggtgccaggttccagattccaaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgcagagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc。
（二）构建获得重组慢病毒表达质粒
以pCDH-EF1-MSC-T2A-GFP质粒为载体，通过酶切、连接方式，将步骤（一）中的编码序列插入到pCDH-EF1-MSC质粒中，以构建获得重组后慢病毒表达质粒pCDH-EF1-CAR-CD155-28z或pCDH-EF1-CAR-CD155-BBz。该过程的具体操作委托上海生工公司完成。
（三）慢病毒包装
具体包装操作参考如下：
以293T细胞为包装细胞，将293T细胞铺板24小时后（细胞融合率达到约80%），准备2个1.5mL的 EP管，并分别加入0.5mL 的Opti-MEM培养基；
在其中一管中将pCDH-EF1-CAR-CD155-28z（或pCDH-EF1-CAR-CD155-BBz表达质粒）与包装质粒（pSPAX2与pMD2.G）混合（三种质粒的摩尔比为1:1:1，总质量为4ug）；混匀后，室温（25℃左右）静置孵育5min；
另一管加入Lipofectamine 3000；
之后将两管混合（即，将包装后质粒与Lipo培养基混合），室温静置孵育20min；
随后，将质粒-Lipo混合物小心加入293T细胞中，转染16h后，小心移去上清，然后缓慢加入3mL含10%血清的DMEM，静置培养；
继续培养48小时后，收集上清，用于后续T细胞感染。
（四）T细胞纯化与感染；
采集健康人外周血，经密度梯度离心后，弃上清， 加入预冷 1×Buffer 调整细胞密度至 1×108/mL；
将 2 mL 上述细胞悬液转至无菌流式管，加入 200 µL的Human CD3+ T CellBiotinylated Antibody Cocktail，轻轻混匀后，4℃孵育15 min；
加入250 µL的Streptavidin Ferrofluid（链霉亲和素铁磁）， 小心混匀， 4℃孵育15 min；
加入 0.55 mL 预冷 （1×）Buffer 至 3 mL，轻轻混匀后将含有细胞悬液的流式管放置到磁分选架上，室温静止6 min，小心将悬液转到新的无菌管中，这部分细胞就是CD3+细胞；
将分选得到的CD3+细胞在含有IL2的完全RPMI1640培养基中进行培养，再按照2个细胞加入1个磁珠的比例，加入适量CD3/CD28磁珠活化2天；
2天后，加入病毒上清（6孔板中每孔加2 ml）与polybrene（6孔板中每孔加10 µL）孵育过夜；
次日，离心清洗T细胞3次后，加入含1000U IL-2与5%胎牛血清的RPMI1640培养基培养T细胞。
（五）检测和扩增
对步骤（二）中T细胞感染7天后，利用流式细胞术对T细胞表面CAR的表达情况进行检测，其中荧光蛋白GFP的表达代表CAR的表达情况，检测合格后（一般要求为，GFP阳性率≥50%），进一步对转染后对CAR-T细胞在含1000U IL-2与5%胎牛血清的RPMI1640培养基中进行体外扩增。
流式细胞术检测结果表明（图2所示），CAR表达阳性率可达60~70%，这一结果说明CAR表达质粒构建及病毒包装成功，可为后续应用奠定基础。
进一步CAR-T细胞增殖情况如图3所示（以1× 106个转染后T细胞为基础，分别于扩增的7、10和14天时进行计数），可以看出，转染后CAR-T细胞均能够高效增殖，表明相关CAR结构设计对于T细胞活力没有明显影响。
（六）CAR-T细胞体外杀伤效果
选择转染14天后T细胞，计数T细胞与靶细胞，并利用细胞染料(eFluor670)对靶细胞进行标记；然后按照效靶比(效应细胞:靶细胞，E:T)1:1、5:1、20:1的比例，将转染后T细胞(效应细胞)分别与CD155高表达靶细胞(胃癌细胞系AGS，购买于生科院细胞库)、CD155阴性对照细胞(正常胃永生化细胞系GES-1，购买于生科院细胞库)共孵育8小时。同时设置对照组（对照组回输Mock-T细胞）。
共孵育结束后，离心收集细胞，利用凋亡染色试剂盒标记细胞，然后流式细胞术分析靶细胞凋亡情况。
实验结果如图4所示。分析可以看出：CAR-T细胞对表达CD155的肿瘤细胞具有很强的杀伤能力，而对CD155阴性细胞的影响很小，说明该CAR-T细胞具有很强的特异性杀伤能力。
进一步，收集共孵育8小时后的培养上清，检测培养上清效应因子的分泌情况。ELISA实验结果显示（以效靶比为20:1为例），CAR-T细胞与表达CD155的肿瘤细胞共孵育后产生大量效应因子IL-2（A）和IFN-γ（B），而与CD155阴性的细胞共孵育则没有该效果；对照T细胞与肿瘤细胞共孵育则不能产生大量效应因子(结果如图5所示)。该结果进一步说明CAR-T细胞具有很强的特异性杀伤能力。
（七）动物实验
在上述细胞实验基础上，发明人进一步进行了动物实验，具体试验情况简介如下。
选择NOD-SCID免疫缺陷小鼠（购自维通利华公司），皮下接种5× 106个AGS细胞，7天后，经尾静脉分别注射5× 106个前述所制备CAR-T细胞或对照T细胞（Mock-T）进行治疗。
然后分别于注射后的第0、7、14、21天时，利用小动物活体成像设备，观察肿瘤大小。
结果如图6所示。可以看出：在CAR-T细胞注射后7天(A)，肿瘤体积明显缩小，而且随着治疗时间的延长，CAR-T细胞治疗组的肿瘤体积越来越小(B)，提示CAR-T细胞具有良好的肿瘤杀伤能力。
SEQUENCE LISTING
<110> 郑州大学第三附属医院（河南省妇幼保健院）
<120> 一种靶向CD155的CAR结构设计及其应用
<130> none
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 388
<212> PRT
<213> 人工设计
<400> 1
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn
20 25 30
Ile Ser Ala Glu Lys Gly Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser
35 40 45
Ser Thr Thr Ala Gln Val Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln
50 55 60
Leu Leu Ala Ile Cys Asn Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser
65 70 75 80
Phe Lys Asp Arg Val Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln
85 90 95
Ser Leu Thr Val Asn Asp Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr
100 105 110
Tyr Pro Asp Gly Thr Tyr Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu
115 120 125
Ser Ser Val Ala Glu His Gly Ala Arg Phe Gln Ile Pro Thr Thr Thr
130 135 140
Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro
145 150 155 160
Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val
165 170 175
His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro
180 185 190
Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Phe
195 200 205
Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu
210 215 220
Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg
225 230 235 240
Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro
245 250 255
Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala
260 265 270
Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr
275 280 285
Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg
290 295 300
Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met
305 310 315 320
Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn
325 330 335
Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met
340 345 350
Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly
355 360 365
Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala
370 375 380
Leu Pro Pro Arg
385
<210> 2
<211> 362
<212> PRT
<213> 人工设计
<400> 2
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn
20 25 30
Ile Ser Ala Glu Lys Gly Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser
35 40 45
Ser Thr Thr Ala Gln Val Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln
50 55 60
Leu Leu Ala Ile Cys Asn Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser
65 70 75 80
Phe Lys Asp Arg Val Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln
85 90 95
Ser Leu Thr Val Asn Asp Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr
100 105 110
Tyr Pro Asp Gly Thr Tyr Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu
115 120 125
Ser Ser Val Ala Glu His Gly Ala Arg Phe Gln Ile Pro Thr Thr Thr
130 135 140
Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro
145 150 155 160
Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val
165 170 175
His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro
180 185 190
Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Lys
195 200 205
Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg
210 215 220
Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro
225 230 235 240
Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser
245 250 255
Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu
260 265 270
Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg
275 280 285
Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro
290 295 300
Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala
305 310 315 320
Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His
325 330 335
Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp
340 345 350
Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
355 360

Claims (5)

1.一种靶向CD155的CAR结构设计，其特征在于，该CAR序列包括依次连接的人源TIGIT胞外区序列、CD8信号传导片段、以及CD28或41BB刺激信号分子，具体结构式分别命名为：CD155-28z-CAR或者CD155-BBz-CAR；具体如下：
（1）CD155-28z-CAR结构：
包括依次连接的：人CD8a分子信号肽CD8a、人源TIGIT胞外区、人CD8a分子柔性片段CD8Hinge、人CD28分子跨膜区与胞内区CD28、人CD3z分子胞内区CD3z；其蛋白总长为367个氨基酸，具体氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；
（2）CD155-BBz-CAR结构：
包括依次连接的：人CD8a分子信号肽CD8a、人源TIGIT胞外区、人CD8a分子柔性片段CD8Hinge、人41BB分子跨膜区与胞内区41BB、人CD3z分子胞内区CD3z；
CD155-BBz-CAR蛋白序列，包括341个氨基酸，具体氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
2.权利要求1所述靶向CD155的CAR结构在制备抗肿瘤相关药剂中的应用。
3.利用权利要求1所述靶向CD155的CAR结构所构建的慢病毒表达载体，其特征在于，通过如下步骤构建获得：
（一）CAR结构制备
按照SEQ ID No.1所示CD155-28z-CAR结构序列、或者按照SEQ ID No.2所示CD155-BBz-CAR结构序列，制备获得对应的DNA编码序列；
（二）构建获得重组慢病毒表达质粒
以pCDH-EF1-MSC-T2A-GFP质粒为载体，通过酶切、连接方式，将步骤（一）中的编码序列插入到pCDH-EF1-MSC质粒中，以构建获得重组后慢病毒表达质粒pCDH-EF1-CAR-CD155-28z或pCDH-EF1-CAR-CD155-BBz。
4.权利要求3所述慢病毒表达载体在在制备抗肿瘤相关药剂中的应用。
5.权利要求3所述利用靶向CD155的CAR结构所构建的慢病毒表达载体在制备CAR-T细胞中应用，其特征在于，具体应用方法包括如下步骤：
（一）慢病毒包装
具体包装操作如下：
以293T细胞为包装细胞，将pCDH-EF1-CAR-CD155-28z或pCDH-EF1-CAR-CD155-BBz表达质粒与包装质粒pSPAX2与pMD2.G混合，对293T细胞进行转染、培养后，收集上清，用于后续T细胞感染；
（二）T细胞纯化与感染；
采集健康人外周血，经密度梯度离心后，分离外周血单个核细胞；
利用T细胞分离试剂盒获得纯化的CD3+T细胞，并加入CD3/CD28磁珠活化；
活化后，加入步骤（一）所制备病毒上清与polybrene进行孵育以感染T细胞；
孵育结束后，清洗T细胞，并加入培养基扩增T细胞；
（三）检测和扩增
对步骤（二）中感染后T细胞进行扩增培养后，利用流式细胞术对T细胞表面CAR的表达情况进行检测，检测合格后，进一步对转染后对CAR-T细胞进行体外扩增增殖。
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