CN111423517A

CN111423517A - 一种肿瘤细胞干性限制型car及其应用

Info

Publication number: CN111423517A
Application number: CN202010295115.3A
Authority: CN
Inventors: 张毅; 张凯; 温纯利
Original assignee: First Affiliated Hospital of Zhengzhou University
Current assignee: Saidete Biopharmaceutical Co ltd
Priority date: 2020-04-15
Filing date: 2020-04-15
Publication date: 2020-07-17
Anticipated expiration: 2040-04-15
Also published as: CN111423517B

Abstract

本申请属于肿瘤细胞免疫治疗技术领域，具体涉及一种能抑制肿瘤细胞干性的限制型CAR及其应用专利申请事宜。该嵌合抗原受体为一若干蛋白片段连接的氨基酸序列，为依次连接的：人CD8a分子信号肽CD8a、人源NKG2D胞外区、人CD8分子跨膜区与41BB分子胞内区41BB、人CD3z分子胞内区CD3Zeta，优选设计中，进一步通过连接序列与IL24 CDS区序列IL24进行连接。本申请通过对于CAR的进一步结构优化，同时结合SFN应用，对于有效杀伤肿瘤细胞及肿瘤干细胞、减少疾病复发的发生，以及提高CAR‑T细胞的应用效果都表现出良好的技术效果，因此具有较好的实用价值和推广应用意义。

Description

一种肿瘤细胞干性限制型CAR及其应用

技术领域

本申请属于肿瘤细胞免疫治疗技术领域，具体涉及一种能抑制肿瘤细胞干性的限制型CAR（Chimeric Antigen Receptor，嵌合抗原受体）及其应用专利申请事宜。

背景技术

CAR-T（Chimeric Antigen Receptor T-Cell，嵌合抗原受体T细胞）作为肿瘤免疫治疗的一种有效治疗方式，近年来得到了较多研究和重视。临床上，以CD19为靶点，利用CAR-T清除CD19⁺肿瘤细胞已在急性淋巴细胞白血病(ALL)的治疗中表现出较好效果。但是该技术在实体瘤中的应用目前尚不尽人意，还有许多问题需要解决，在临床中的使用还有诸多限制，其中一个重要问题就是治疗后残留肿瘤干细胞所引起的复发问题。

MDA-7/IL-24(melanoma differentiation-associated 7)属于IL-10超家族一员，主要由活化的单核细胞、巨噬细胞和辅助T2(Th2)细胞释放并作用于非造血组织。它在促炎症反应、组织重塑、伤口愈合和抗菌反应中发挥一定免疫调节作用，同时也有研究为IL-24可以通过不同方式诱导肿瘤细胞及肿瘤干细胞凋亡。也因此，如能将CAR-T技术与IL-24进行结合，对于CAR-T技术在实体瘤中应用以及进一步改善肿瘤的治疗效果具有十分重要的技术意义。

发明内容

基于CAR-T技术与IL-24联合应用的设计需要，本申请目的在于提供一种能限制肿瘤细胞干性的限制型CAR，从而为CAR-T技术在实体瘤中应用及改善实体瘤的治疗效果奠定一定技术基础。

本申请所采取的技术方案详述如下。

一种肿瘤细胞干性限制型CAR，该嵌合抗原受体为一若干蛋白片段连接的氨基酸序列，命名为NKG2D-41BB-CD3z，具体为依次连接的：人CD8a分子信号肽（CD8a）、人源NKG2D胞外区、人CD8分子跨膜区与41BB分子胞内区（41BB）、人CD3z分子胞内区（CD3Zeta），即：CD8a—NKG2D—41BB—CD3Zeta（CD3ζ）；

优选设计中，人CD3z分子胞内区（CD3Zeta）进一步通过连接序列（具体例如采用PA2连接序列（P2A））与IL24 CDS区序列（IL24）进行连接，以进一步通过IL-24这一细胞因子来限制肿瘤细胞干性表达，即总体结构为：CD8a—NKG2D—41BB—CD3Zeta（CD3ζ）—P2A—IL24，该优选设计以NKG2D -41BB-CD3z-IL24命名；

所述人CD8a分子信号肽（CD8a），包括21个氨基酸，序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：

MALPVTALLLPLALLLHAARP；

所述人源NKG2D胞外区，包括144个氨基酸，序列如SEQ ID NO.2所示，具体为：

IWSAVFLNSLFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTV；

所述人CD8分子跨膜区与41BB分子胞内区（41BB），包括人CD8分子跨膜区与41BB分子胞内区两个部分，其中：

人CD8分子跨膜区，包括69个氨基酸，序列如SEQ ID NO.3所示，具体为：

TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC；

41BB分子胞内区，包括42个氨基酸，序列如SEQ ID NO.4所示，具体为：

KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL；

所述人CD3z分子胞内区（CD3Zeta），包括112个氨基酸，序列如SEQ ID NO.5所示，具体为：

RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR；

所述PA2连接序列（P2A），包括22个氨基酸，序列如SEQ ID NO.6所示，具体为：

GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP；

所述IL24 CDS区序列IL24，包括207个氨基酸，序列如SEQ ID NO.7所示，具体为：

MNFQQRLQSLWTLASRPFCPPLLATASQMQMVVLPCLGFTLLLWSQVSGAQGQEFHFGPCQVKGVVPQKLWEAFWAVKDTMQAQDNITSARLLQQEVLQNVSDAESCYLVHTLLEFYLKTVFKNYHNRTVEVRTLKSFSTLANNFVLIVSQLQPSQENEMFSIRDSAHRRFLLFRRAFKQLDVEAALTKALGEVDILLTWMQKFYKL；

因此，优选的NKG2D-41BB-CD3z-IL24氨基酸序列，包括617个氨基酸，序列如SEQ IDNO.8所示，具体为：

MALPVTALLLPLALLLHAARPIWSAVFLNSLFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTVTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMNFQQRLQSLWTLASRPFCPPLLATASQMQMVVLPCLGFTLLLWSQVSGAQGQEFHFGPCQVKGVVPQKLWEAFWAVKDTMQAQDNITSARLLQQEVLQNVSDAESCYLVHTLLEFYLKTVFKNYHNRTVEVRTLKSFSTLANNFVLIVSQLQPSQENEMFSIRDSAHRRFLLFRRAFKQLDVEAALTKALGEVDILLTWMQKFYKL。

所述肿瘤细胞干性限制型CAR编码DNA序列，也即，NKG2D-41BB-CD3z-IL24的编码DNA序列为：

ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGATATGGAGTGCTGTATTCCTAAACTCATTATTCAACCAAGAAGTTCAAATTCCCTTGACCGAAAGTTACTGTGGCCCATGTCCTAAAAACTGGATATGTTACAAAAATAACTGCTACCAATTTTTTGATGAGAGTAAAAACTGGTATGAGAGCCAGGCTTCTTGTATGTCTCAAAATGCCAGCCTTCTGAAAGTATACAGCAAAGAGGACCAGGATTTACTTAAACTGGTGAAGTCATATCATTGGATGGGACTAGTACACATTCCAACAAATGGATCTTGGCAGTGGGAAGATGGCTCCATTCTCTCACCCAACCTACTAACAATAATTGAAATGCAGAAGGGAGACTGTGCACTCTATGCCTCGAGCTTTAAAGGCTATATAGAAAACTGTTCAACTCCAAATACGTACATCTGCATGCAAAGGACTGTGACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCGGCAGCGGGGCCACCAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCCGGCGACGTGGAGGAGAACCCAGGGCCCATGAACTTCCAGCAGCGGCTGCAGTCCCTGTGGACACTGGCCTCCCGGCCATTCTGCCCCCCCCTGCTGGCCACAGCCAGCCAGATGCAGATGGTGGTGCTGCCCTGCCTGGGCTTCACCCTGCTGCTGTGGAGCCAGGTGAGCGGGGCCCAGGGCCAGGAGTTCCACTTTGGCCCCTGCCAGGTGAAGGGGGTGGTGCCCCAGAAGCTGTGGGAGGCCTTCTGGGCCGTGAAGGACACCATGCAGGCCCAGGACAACATCACCAGCGCCAGGCTGCTGCAGCAGGAGGTGCTGCAGAACGTGAGCGATGCCGAGAGCTGCTACCTGGTGCACACCCTGCTGGAGTTCTACCTGAAGACAGTGTTCAAGAACTACCACAACAGGACAGTGGAGGTGAGGACACTGAAGAGCTTCTCCACCCTCGCCAACAACTTCGTGCTGATTGTGAGCCAGCTGCAGCCCAGCCAGGAGAACGAGATGTTCAGCATCAGGGATTCCGCCCACCGGCGGTTCCTGCTGTTCAGGAGGGCCTTCAAGCAGCTGGATGTGGAGGCCGCCCTGACAAAGGCCCTGGGCGAGGTGGATATCCTGCTGACATGGATGCAGAAGTTCTACAAGCTG。

利用所述肿瘤细胞干性限制型CAR所构建的慢病毒表达质粒，具体通过如下步骤制备获得：

（1）按照中心法则，采用现有技术获得所述CAR的编码序列DNA；

（2）以pCDH-EF1-conGFP质粒为表达载体，对其进行EcoR I酶切，然后利用In-FusionHD Cloning Kits将步骤（1）中的编码序列DNA整合重组进入pCDH-EF1-conGFP质粒中；

（3）将步骤（2）中的连接产物转化STABL3感受态细胞，筛选、扩大培养后进一步提取质粒，即可获得可表达NKG2D-41BB-CD3z或NKG2D-41BB-CD3z-IL24的重组慢病毒表达质粒（分别命名为：pCDH-EF1-NKG2D-41BB-CD3z、pCDH-EF1-NKG2D-41BB-CD3z-IL24）。

所述慢病毒表达质粒在制备抗肿瘤药剂中的应用，所述肿瘤具体例如为NSCLC癌（非小细胞肺癌，包括鳞状细胞癌、腺癌、大细胞癌）相关肿瘤，进一步例如为人非小细胞肺癌H460、Calu-3及H322相对应癌症；应用时，通过转染制备成CAR-T细胞进行应用，用于肿瘤细胞或肿瘤干细胞；

具体应用步骤包括如下步骤：

（1）慢病毒包装；具体可参考如下操作：

以293T细胞作为待转染目的细胞，首先进行铺板孵育24h；

然后将所构建获得的慢病毒表达质粒与包装质粒混合，利用脂质体转染试剂对待转染的目的细胞293T细胞进行转染48h；

转染结束后，收集上清（上清液即为包装后慢病毒颗粒），备用，以准备用于T细胞的感染；

（2）制备纯化的T细胞

首先，从人外周血分离获得单个核细胞（具体例如采用密度梯度离心方法）；

然后，分离获得纯化的CD³⁺T细胞（具体例如采用T细胞分离磁珠进行分离纯化），

最后，加入适量CD3/CD28磁珠活化2天备用；

（3）T细胞感染

在步骤（2）中活化2天后的细胞中，加入步骤（1）中所收集的病毒上清与polybrene（聚凝胺，又名为溴化己二甲铵），孵育过夜以进行感染；

（4）扩增T细胞

为便于应用，对步骤（3）中孵育感染后T细胞，离心清洗（一般不少于3次）后，加入含1000U IL-2与含5%胎牛血清的RPMI1640培养基，以进一步扩增T细胞；

对扩增后T细胞可利用流式细胞技术以对T细胞表面CAR的表达情况、或者细胞增殖进行检测判定，根据检测结果进一步回输后即可用于杀伤肿瘤细胞。

所述慢病毒表达质粒在制备抗肿瘤药剂中的应用，优选情况下，与萝卜硫素(Sulforaphane，SFN)共同应用。

现有技术中，慢病毒作为逆转录病毒科中的一种RNA病毒，可将所携带的基因整合到细胞基因组中，并且长时间持续稳定表达，同时能够随细胞分裂稳定遗传下去，因此以慢病毒为基础改造的慢病毒载体成为导入外源基因的有效工具，并得了广泛研究和应用。基于此，本申请借助于慢病毒特性可将所构建的CAR转染T细胞来发挥抗肿瘤作用。

而另一方面，萝卜硫素(Sulforaphane，SFN)作为一种来源于十字花科的异硫氰酸酯类化合物，在抗肿瘤方面表现出一定应用效果。为此，本申请将SFN与CAR-T同时针对肿瘤细胞进行应用，表现出了较好的协同抗肿瘤作用。

总体上，鉴于现有CAR-T细胞在实体瘤治疗应用中存在的复发问题，本申请通过对于CAR的进一步结构优化，同时结合SFN应用，对于有效杀伤肿瘤细胞及肿瘤干细胞、减少疾病复发的发生，以及提高CAR-T细胞的应用效果都表现出良好的技术效果，因此具有较好的实用价值和推广应用意义。

附图说明

图1为所设计的两种不同的CAR分子NKG2D-41BB-CD3z （上图）、NKG2D -41BB-CD3z-IL24（下图）结构示意图；其中LTR为骨架质粒长末端重复序列，EF1为骨架质粒启动子序列，GFP为骨架质粒荧光标签序列；

图2为重组的质粒pCDH-EF1-NKG2D-41BB-CD3z-P2A-IL24结构示意图；

图3为pCDH-EF1-NKG2D -41BB-CD3z-IL24构建电泳鉴定结果；

图4为流式细胞术检测CAR-T转染效率图；

图5为CAR-T细胞对不同肿瘤细胞（H460、Calu-3、H322）的杀伤效率结果图；

图6为不同T细胞处理组中肿瘤细胞CD133表达情况；其中左图为荧光拍照图片，右图为统计图；

图7与肿瘤细胞（H460、Calu-3、H322）共孵育后，不同T细胞处理组中IL 24分泌情况；

图8小鼠肺转移模型检测不同T细胞处理的杀伤效果；上图为荧光照片，下图为荧光统计图；

图9为NKG2D.CAR.IL24-T细胞联合萝卜硫素杀伤肿瘤细胞效果统计。

具体实施方式

下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明。在介绍具体实施例前，就下述实施例中部分实验材料等实验背景情况简要介绍说明如下。

实验材料：

非肥胖型糖尿病/重度联合免疫缺陷（nod/scid）小鼠，6-8周的雌性小鼠，购自北京维通利华有限公司（中国北京），无菌环境饲养；

人非小细胞肺癌相关细胞系：H460、Calu-3、H322（NKG2DL阴性），购自ATCC；相关细胞系在Dulbecco's Modified Eagle培养基(DMEM)中培养，该培养基中含有10%胎牛血清（FBS，HyClone，Chicago, IL, USA）和100 U/ml青霉素、100μg/ml链霉素（Invitrogen,Carlsbad, CA, USA）；（荧光细胞株获得：实验开始前，用含荧光素酶-GFP的病毒上清液转染肿瘤细胞，用FACS AriaTM细胞分选仪(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)对GFP通道进行分选，最终获得稳定表达荧光素酶-绿色荧光蛋白(GFP)的细胞株）。

实施例1

基于现有CAR技术研究，为进一步改善CAR-T在实体瘤治疗中应用效果，发明人设计了新的CAR结构，具体结构示意图如图1所示。

具体而言：

NKG2D-41BB-CD3z为：依次连接的人CD8a分子信号肽（CD8a）、人源NKG2D胞外区、人CD8分子跨膜区与41BB分子胞内区（41BB）、人CD3z分子胞内区（CD3Zeta），即：CD8a—NKG2D—41BB—CD3Zeta（CD3ζ）；

NKG2D -41BB-CD3z-IL24为：依次连接的人CD8a分子信号肽（CD8a）、人源NKG2D胞外区、人CD8分子跨膜区与41BB分子胞内区（41BB）、人CD3z分子胞内区（CD3Zeta）、PA2连接序列（P2A）、IL22 CDS区序列（IL22）；即：CD8a—NKG2D—41BB—CD3Zeta（CD3ζ）—P2A—IL24。

MALPVTALLLPLALLLHAARP；

所述人CD8分子跨膜区与41BB分子胞内区（41BB），包括人CD8分子跨膜区与41BB分子胞内区两个部分，其中

TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC；

KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL；

所述PA2连接序列（P2A），包括18个氨基酸，序列如SEQ ID No.6所示，具体为：

GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP；

MNFQQRLQSLWTLASRPFCPPLLATASQMQMVVLPCLGFTLLLWSQVSGAQGQEFHFGPCQVKGVVPQKLWEAFWAVKDTMQAQDNITSARLLQQEVLQNVSDAESCYLVHTLLEFYLKTVFKNYHNRTVEVRTLKSFSTLANNFVLIVSQLQPSQENEMFSIRDSAHRRFLLFRRAFKQLDVEAALTKALGEVDILLTWMQKFYKL。

氨基酸序列，包括388个氨基酸，具体序列为：

MALPVTALLLPLALLLHAARPIWSAVFLNSLFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTVTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR。

氨基酸序列，包括617个氨基酸，序列如SEQ ID NO.8所示，具体为：

实施例2

在实施例1基础上，发明人进一步构建了慢病毒表达载体，从而便于后续进一步用于感染T细胞及制备CAR-T，具体慢病毒表达载体构建过程介绍如下。

（2）以pCDH-EF1-conGFP质粒为表达载体，使用限制性内切酶EcoR I(NEB)在37℃对其进行酶切，然后利用In-Fusion HD Cloning Kits(宝生物)将步骤（1）中的编码序列DNA整合重组进入pCDH-EF1-conGFP质粒中；

（3）将步骤（2）中的连接产物转化STABL3感受态细胞，筛选、扩大培养后进一步提取质粒，即可获得可表达NKG2D-41BB-CD3z或NKG2D-41BB-CD3z-IL24的重组慢病毒表达质粒（分别命名为：pCDH-EF1-NKG2D-41BB-CD3z、pCDH-EF1-NKG2D -41BB-CD3z-IL24）。

所构建的pCDH-EF1-NKG2D -41BB-CD3z-IL24质粒结构示意图如图2所示。最终所成功构建质粒电泳鉴定结果如图3所示。

实施例3

在实施例2基础上，发明人进一步将所构建的慢病毒表达质粒通过转染制备成CAR-T细胞，并进一步进行了初步的细胞实验。具体实验过程简要介绍如下。

（一）慢病毒包装

以293T细胞作为初步待转染目的细胞，具体而言：

首先，六孔板铺板并孵育24h以培养293T细胞(37℃、DMEM完全培养基)；

随后，将培养基更换为OPTI-MEM培养基，再将实施例2所构建的慢病毒表达质粒1.5g、1.5g包装质粒psPAX2、和Pmd2.G 1g，以及脂质体转染试剂8 µl进行混合，以对目的细胞293T进行转染；

转染12小时后更换为正常的DMEM培养基；

最后，继续培养48小时后收取病毒上清（即为包装完成的病毒样颗粒），1500rpm离心10分钟，取上清-80℃保存备用，以用于感染T细胞。

（二）制备纯化的CD³⁺T细胞

首先，从人外周血分离获得单个核细胞（具体采用密度梯度离心方法）；

然后，分离获得纯化的CD3⁺T细胞（具体采用T细胞分离磁珠进行分离纯化）；

再后，将纯化得到的T细胞在24孔细胞培养板中用含有IL-2(100 IU/ml，PeproTech,Suzhou, Jiangsu, China)和L-谷氨酰胺(2 mM ,Gibco/Life Technologies/ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA)的RPMI-1640进行培养；

最后，使用前，将T细胞用CD3/CD28活化抗体(1µl/10⁷ cells)进行刺激活化2天。

具体操作方式参考现有技术即可，不再赘述。

（三）T细胞感染

利用24孔细胞培养板，每孔加入步骤（2）中活化2天后的T细胞（10⁶/孔），同时每孔加入步骤（1）中所收集的病毒上清1ml与polybrene（8μg/mL），孵育过夜以进行感染；

24小时后，更换为正常的含有IL-2(100 IU/ml，PeproTech, Suzhou, Jiangsu,China)和L-谷氨酰胺(2 mM ,Gibco/Life Technologies/Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA)的RPMI-1640进行培养。

（四）T细胞扩增

为便于后续实验应用，进一步地，对步骤（三）孵育感染后T细胞，离心清洗（3次）后，加入含1000U IL-2与5%胎牛血清的RPMI1640培养基（每2-3天更换一次培养基），以进一步扩增T细胞，所制备的细胞分别记为：NKG2D -T（含有慢病毒载体质粒NKG2D-41BB-CD3z）、NKG2D-IL24-T（含有慢病毒载体质粒NKG2D -41BB-CD3z-IL24）。

需要说明的是，作为对照，参考上述操作，发明人将含有GFP的pCDH-EF1质粒包装成慢病毒后直接感染T细胞，将所制备细胞记为：GFP-T（相当于仅表达GFP的空白对照T细胞组）。

（五）具体实验检测

（1）病毒包装情况检测及对T细胞增殖情况评价

对上述步骤（四）中感染5天后T细胞，利用流式细胞术对T细胞表面CAR的表达情况进行检测。结果如图4所示，可以看出：CAR表达阳性率达到30%~60%，这一结果表明所构建的CAR表达质粒被包装成慢病毒颗粒后成功感染了T细胞，并得到了较好表达，可以用于后续实验。

（2）对不同肿瘤细胞凋亡情况检测

以不同NKG2DL表达情况的肿瘤细胞作为实验对象，以CAR-T细胞作为实验“药剂”，通过肿瘤细胞凋亡来检测和评价所构建的CAR的技术效果。具体实验过程简介如下。

分别用高表达NKG2DL的人非小细胞肺癌细胞系H460、Calu-3和NKG2DL阴性的人非小细胞肺癌细胞系H322作为靶细胞，以不同处理的T细胞作为效应细胞(GFP-T、NKG2D-T、NKG2D-IL24-T)，按照不同的效靶比(1：1、5：1、15：1)将T细胞与靶细胞于96孔板中共孵育6小时，每组设置三个复孔。

孵育结束后，收集共孵育后细胞上清液，将细胞沉淀物用Annexin V- bindingbuffer (BioLegend, San Diego, CA, USA)重悬，随后加入1µl CD326 antibody和1µlAnnexin V antibody (BioLegend)，4℃的避光环境中孵育15分钟；上机前再加入Propidium(碘化丙碇，Sigma)。采用C6流式细胞仪(Becton Dickinson)上机检测分析，数据使用FlowJo软件(FlowJo, LLC, Ashland, Covington, KY, USA)分析。

结果如图5所示，可以看出：即使针对不同的肿瘤细胞，相比于GFP-T细胞，NKG2D-T细胞均可以有效的特异性杀伤NKG2DL阳性的肿瘤细胞，而在相同比例下NKG2D-IL24-T细胞的杀伤效果比NKG2D-T细胞更好，这一结果说明：在IL24存在情况下，NKG2D-IL24-T细胞对于肿瘤细胞的清除效果更好。具体例如：在效靶比为15：1情况下，其差异效果更为明显，NKG2D-T细胞对NKG2DL阳性的肿瘤细胞的清除效果在30-50%，而NKG2D-IL24-T细胞对NKG2DL阳性的肿瘤细胞的清除效果可达到60%以上。

（3）IL24分泌及CD133表达情况

在上述“（2）不同肿瘤细胞凋亡情况检测”评价过程中，发明人进一步对IL24分泌及肿瘤细胞干性基因CD133表达情况进行了检测分析。

需要说明的是，CD133表达检测方法（具体操作细节参考现有技术即可）具体参考如下：

首先，收集不同组别的T细胞与肿瘤细胞共孵育后存活的肿瘤细胞；

然后，使用RD公司的免疫荧光抗体对CD133及细胞核(DAPI)进行标记；

最后，使用荧光显微镜进行拍照分析。

具体结果如图6所示。可以看出，肿瘤细胞表面CD133表达明显下调，这一结果说明，IL24可以有效抑制肿瘤细胞CD133表达。

进一步地，对不同效靶比情况下、不同效应T细胞组对肿瘤细胞处理后的IL24分泌情况进行检测，结果如图7所示。

结果统计及分析可以看出：E/T比值越小，T细胞的细胞毒性功能越弱，分泌功能性细胞因子的能力越弱，而分泌IL24的CAR-T细胞相较其他细胞具有较强的细胞毒性作用，因此，通过增强IL24的分泌表达量来提高T细胞毒性是一种较为可行的途径。与此结果相对应的，肿瘤细胞的CD133表达由原来的60%下调至25%左右，也进一步表明，通过偶联IL-24基因，提高IL-24表达量来抑制肿瘤细胞干性是可行的。

（4）小鼠肿瘤生长情况检测

在上述实验基础上，发明人进一步进行了小鼠动物实验，具体过程简要介绍如下。

利用NOD/SCID免疫缺陷小鼠，尾静脉接种PBS重悬的10⁶ H460-fluc 细胞(100ul)，构建小鼠肺转移荷瘤模型，10天后，经尾静脉分别注射1×10⁶个不同组别的T细胞(PBS、GFP-T、NKG2D-T、NKG2D-IL24-T)进行治疗（每组4只）。

实验过程中利用小动物活体成像设备检测肿瘤表达的荧光变化（每7天拍摄一次生物发光照片）。

利用小动物活体成像设备检测肿瘤表达的荧光变化时，首先用3%异氟醚(RWD生命科学，深圳，中国)在诱导室内麻醉小鼠；然后每只小鼠用注射器腹腔注射100ul 的d -荧光素溶液(0.15mg/ml, Yeasen Biotech Co.，Ltd.，Shanghai, China)，10分钟后利用动物活体成像设备IVIS Lumina, Series Ⅲ spectrometer (Caliper Life Science) 检测荧光，最后利用live image 4.3.1 software (PerkinElmer, Waltham, MA, USA)进行分析。

实验结果如图8所示。结果统计及分析可以看出：

在PBS和GFP-T治疗组中，两者没有差异，而经过NKG2D-T细胞治疗的小鼠肿瘤荧光降到10⁷级别，经过NKG2D-IL24-T细胞治疗的小鼠肿瘤荧光降到10⁶级别，各组之间进行对比，前两组之前没有差异，后两组与前两组有明显差异，荧光明显降低，而NKG2D-IL24-T细胞治疗组相对于NKG2D-T细胞治疗组荧光进一步下降一个数量级，差异明显。

（5）T细胞联合SFN杀伤肿瘤细胞

在上述实验基础上，发明人进一步进行了T细胞联合SFN杀伤肿瘤细胞实验，具体过程简要介绍如下。

用高表达NKG2DL的人非小细胞肺癌细胞系Calu-3作为靶细胞，以NKG2D-IL24-T(E:T=15:1)细胞以及SFN(15µM/L)作为处理条件，按照不同的处理方式(NKG2D.CAR.IL24-T，SFN，NKG2D.CAR.IL24-T +SFN)与靶细胞按照于96孔板中共孵育6小时，每组设置三个复孔。

收集共孵育后细胞上清液，上机检测（具体操作参考前述）。结果如图9所示。

结果统计及分析可以看出：NKG2D.CAR.IL24-T和SFN都可以有效杀伤肿瘤细胞，而当两者联合时，对肿瘤细胞的杀伤能力更强，肿瘤细胞凋亡率达到60-70%，说明联合NKG2D.CAR.IL24-T和SFN杀伤肿瘤细胞是一种比较可行的方法。

综上实验结果可以看出，本发明通过对现有靶向NKG2D的CAR结构进行优化，优化后的NKG2D.CAR.IL24结构经过慢病毒包装及T细胞感染构建的NKG2D.CAR.IL24-T细胞能有有效的杀伤肿瘤细胞并抑制肿瘤干细胞活性，同时本发明提出的联合NKG2D.CAR.IL24-T和SFN杀伤肿瘤细胞展现出更好的治疗效果，可以作为肿瘤治疗的一种有效方法。

SEQUENCE LISTING

<110> 郑州大学第一附属医院

<120> 一种肿瘤细胞干性限制型CAR及其应用

<130> none

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro

20

<210> 2

<211> 144

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Ile Trp Ser Ala Val Phe Leu Asn Ser Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln

1 5 10 15

Ile Pro Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile

20 25 30

Cys Tyr Lys Asn Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp

35 40 45

Tyr Glu Ser Gln Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys

50 55 60

Val Tyr Ser Lys Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr

65 70 75 80

His Trp Met Gly Leu Val His Ile Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp

85 90 95

Glu Asp Gly Ser Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met

100 105 110

Gln Lys Gly Asp Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile

115 120 125

Glu Asn Cys Ser Thr Pro Asn Thr Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val

130 135 140

<210> 3

<211> 69

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

1 5 10 15

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

20 25 30

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile

35 40 45

Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val

50 55 60

Ile Thr Leu Tyr Cys

65

<210> 4

<211> 42

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40

<210> 5

<211> 112

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 5

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 6

<211> 22

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 6

Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val

1 5 10 15

Glu Glu Asn Pro Gly Pro

20

<210> 7

<211> 207

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 7

Met Asn Phe Gln Gln Arg Leu Gln Ser Leu Trp Thr Leu Ala Ser Arg

1 5 10 15

Pro Phe Cys Pro Pro Leu Leu Ala Thr Ala Ser Gln Met Gln Met Val

20 25 30

Val Leu Pro Cys Leu Gly Phe Thr Leu Leu Leu Trp Ser Gln Val Ser

35 40 45

Gly Ala Gln Gly Gln Glu Phe His Phe Gly Pro Cys Gln Val Lys Gly

50 55 60

Val Val Pro Gln Lys Leu Trp Glu Ala Phe Trp Ala Val Lys Asp Thr

65 70 75 80

Met Gln Ala Gln Asp Asn Ile Thr Ser Ala Arg Leu Leu Gln Gln Glu

85 90 95

Val Leu Gln Asn Val Ser Asp Ala Glu Ser Cys Tyr Leu Val His Thr

100 105 110

Leu Leu Glu Phe Tyr Leu Lys Thr Val Phe Lys Asn Tyr His Asn Arg

115 120 125

Thr Val Glu Val Arg Thr Leu Lys Ser Phe Ser Thr Leu Ala Asn Asn

130 135 140

Phe Val Leu Ile Val Ser Gln Leu Gln Pro Ser Gln Glu Asn Glu Met

145 150 155 160

Phe Ser Ile Arg Asp Ser Ala His Arg Arg Phe Leu Leu Phe Arg Arg

165 170 175

Ala Phe Lys Gln Leu Asp Val Glu Ala Ala Leu Thr Lys Ala Leu Gly

180 185 190

Glu Val Asp Ile Leu Leu Thr Trp Met Gln Lys Phe Tyr Lys Leu

195 200 205

<210> 8

<211> 617

<212> PRT

<213> 人工设计

<400> 8

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Ile Trp Ser Ala Val Phe Leu Asn Ser Leu Phe

20 25 30

Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys

35 40 45

Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp

50 55 60

Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn

65 70 75 80

Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys

85 90 95

Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly Leu Val His Ile Pro Thr Asn

100 105 110

Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu

115 120 125

Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser

130 135 140

Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser Thr Pro Asn Thr Tyr Ile Cys

145 150 155 160

Met Gln Arg Thr Val Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro

165 170 175

Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys

180 185 190

Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala

195 200 205

Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu

210 215 220

Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys

225 230 235 240

Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr

245 250 255

Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly

260 265 270

Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala

275 280 285

Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg

290 295 300

Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu

305 310 315 320

Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn

325 330 335

Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met

340 345 350

Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly

355 360 365

Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala

370 375 380

Leu Pro Pro Arg Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln

385 390 395 400

Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Asn Phe Gln Gln Arg

405 410 415

Leu Gln Ser Leu Trp Thr Leu Ala Ser Arg Pro Phe Cys Pro Pro Leu

420 425 430

Leu Ala Thr Ala Ser Gln Met Gln Met Val Val Leu Pro Cys Leu Gly

435 440 445

Phe Thr Leu Leu Leu Trp Ser Gln Val Ser Gly Ala Gln Gly Gln Glu

450 455 460

Phe His Phe Gly Pro Cys Gln Val Lys Gly Val Val Pro Gln Lys Leu

465 470 475 480

Trp Glu Ala Phe Trp Ala Val Lys Asp Thr Met Gln Ala Gln Asp Asn

485 490 495

Ile Thr Ser Ala Arg Leu Leu Gln Gln Glu Val Leu Gln Asn Val Ser

500 505 510

Asp Ala Glu Ser Cys Tyr Leu Val His Thr Leu Leu Glu Phe Tyr Leu

515 520 525

Lys Thr Val Phe Lys Asn Tyr His Asn Arg Thr Val Glu Val Arg Thr

530 535 540

Leu Lys Ser Phe Ser Thr Leu Ala Asn Asn Phe Val Leu Ile Val Ser

545 550 555 560

Gln Leu Gln Pro Ser Gln Glu Asn Glu Met Phe Ser Ile Arg Asp Ser

565 570 575

Ala His Arg Arg Phe Leu Leu Phe Arg Arg Ala Phe Lys Gln Leu Asp

580 585 590

Val Glu Ala Ala Leu Thr Lys Ala Leu Gly Glu Val Asp Ile Leu Leu

595 600 605

Thr Trp Met Gln Lys Phe Tyr Lys Leu

610 615

Claims

1.一种肿瘤细胞干性限制型CAR，其特征在于，该嵌合抗原受体为一若干蛋白片段连接的氨基酸序列，命名为NKG2D-41BB-CD3z，具体为依次连接的：人CD8a分子信号肽CD8a、人源NKG2D胞外区、人CD8分子跨膜区与41BB分子胞内区41BB、人CD3z分子胞内区CD3Zeta，即：CD8a—NKG2D—41BB—CD3Zeta；

所述人CD8a分子信号肽CD8a，包括21个氨基酸，序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：

MALPVTALLLPLALLLHAARP；

所述人CD8分子跨膜区与41BB分子胞内区41BB，包括人CD8分子跨膜区与41BB分子胞内区两个部分，其中：

TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC；

KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL；

所述人CD3z分子胞内区CD3Zeta，包括112个氨基酸，序列如SEQ ID NO.5所示，具体为：

RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR。

2.如权利要求1所述肿瘤细胞干性限制型CAR，其特征在于，人CD3z分子胞内区（CD3Zeta）进一步通过连接序列与IL24 CDS区序列IL24进行连接；

3.如权利要求1所述肿瘤细胞干性限制型CAR，其特征在于，所述连接序列采用PA2连接序列P2A，该序列包括22个氨基酸，序列如SEQ ID NO.6所示，具体为：

GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP；

由此，将所构建的CAR命名为NKG2D-41BB-CD3z-IL24，其包括617个氨基酸，序列如SEQID NO.8所示，具体为：

4.利用权利要求1~3任一所述肿瘤细胞干性限制型CAR所构建的慢病毒表达质粒，其特征在于，通过如下步骤制备获得：

（3）将步骤（2）中的连接产物转化STABL3感受态细胞，筛选、扩大培养后进一步提取质粒，即可获得可表达NKG2D-41BB-CD3z或NKG2D-41BB-CD3z-IL24的重组慢病毒表达质粒。

5.权利要求1~3任一所述肿瘤细胞干性限制型CAR在制备抗肿瘤药剂中的应用，其特征在于，通过包装成病毒颗粒并感染T细胞后发挥抗肿瘤作用。

6.如权利要求5所述肿瘤细胞干性限制型CAR在制备抗肿瘤药剂中的应用，其特征在于，所述肿瘤为人非小细胞肺癌相关肿瘤。

7.如权利要求5所述肿瘤细胞干性限制型CAR在制备抗肿瘤药剂中的应用，其特征在于，应用时，联合萝卜硫素SFN共同应用。

8.权利要求4所述利用肿瘤细胞干性限制型CAR所构建的慢病毒表达质粒在制备抗肿瘤药剂中的应用，其特征在于，通过包装成慢病毒颗粒后，进一步感染T细胞后进行应用。

9.如权利要求8所述慢病毒表达质粒在制备抗肿瘤药剂中的应用，其特征在于，应用时，联合萝卜硫素SFN共同应用。