ES2895901T3 - Células T transducidas con CXCR6 para terapia tumoral dirigida - Google Patents
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Abstract
Un vector de expresión para su uso en el tratamiento de una enfermedad caracterizada por la sobreexpresión de CXCL16, en el que dicho vector es capaz de transducir células T y comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en: (a) una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, y (b) una secuencia de ácido nucleico que es al menos el 84 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 1 y que se caracteriza por tener una actividad de receptor de quimiocinas 6 (CXCR6).
Description
DESCRIPCIÓN
Células T transducidas con CXCR6 para terapia tumoral dirigida
Se dan a conocer (una) célula(s) T transducida(s) con CXCR6 tales como (una) célula(s) T CD8+, (una) célula(s) T CD4+, (una) célula(s) T CD3+, (una) célula(s) T y8 o (una) célula(s) T citolítica(s) natural(es) (NK) para terapia tumoral dirigida, secuencias de ácido nucleico, vectores capaces de transducir tales (una) célula(s) T, (una) célula(s) T transducida(s) que porta(n) tales secuencias de ácido nucleico o vectores, y métodos y kits que comprenden tales secuencias de ácido nucleico o vectores. También se proporciona el uso de dicha(s) célula(s) T transducida(s) en un método para el tratamiento de enfermedades caracterizadas por sobreexpresión de CXCL16, así como una composición farmacéutica/medicamento que comprende (una) célula(s) T transducida(s) que expresan el CXCR6 para su uso en métodos de tratamiento de enfermedades caracterizadas por sobreexpresión de CXCL16.
La terapia adoptiva con células T (ACT) es un enfoque de tratamiento potente que usa células T específicas de cáncer (Rosenberg y Restifo, Science 348(6230) (2015), 62-68). La ACT puede usar células específicas de tumor que se producen de manera natural o células T que se vuelven específicas mediante ingeniería genética usando receptores de antígenos quiméricos o de células T (Rosenberg y Restifo, Science 348(6230) (2015), 62-68). El documento WO-A1 2015/028444 que se encuentra en el campo de la terapia adoptiva con células T (ACT) describe células T transducidas que expresan un receptor de antígeno quimérico (CAR) anti-CD30 para su uso en el tratamiento de cáncer positivo para CD30. Además, el documento US-A1 2014/271635 da a conocer células T recombinantes que expresan un receptor de antígeno quimérico específico para CD19 para su uso en el tratamiento de enfermedades asociadas con la expresión de CD19. La ACT puede tratar con éxito e inducir remisión en pacientes que padecen incluso enfermedades avanzadas o, de lo contrario, refractarias al tratamiento tales como leucemia linfática aguda, linfoma no Hodgkin o melanoma (Dudley et al., J Clin Oncol 26(32) (2008), 5233-5239; Grupp et al., N Engl J Med 368 (16) (2013), 1509-1518; Kochenderfer et al., J Clin Oncol. (2015) 33(6):540-9. doi: 10.1200/JCO.2014.56.2025. Epub 25 de agosto de 2014). Sin embargo, los beneficios a largo plazo se limitan a un pequeño subconjunto de pacientes, mientras que la mayoría recaerá y sucumbirá a su enfermedad refractaria.
El acceso de las células T a las células tumorales o el tejido se ha considerado esencial para el éxito de la ACT. Por lo tanto, deben desarrollarse e implementarse estrategias que permitan la entrada de las células T (Gattinoni et al., Nat Rev Immunol 6(5) (2006), 383-393). El método más eficaz actualmente para lograr una infiltración mejorada de células T es la irradiación corporal total, que permeabiliza el tejido tumoral, remodela la vasculatura y agota las células supresoras (Dudley et al., J Clin Oncol 23(10) (2005), 2346-2357). Si bien esta estrategia ha demostrado eficacia en ensayos clínicos, su naturaleza inespecífica induce efectos secundarios graves, limitando su aplicabilidad y exigiendo estrategias más específicas (Dudley et al., J Clin Oncol 23(10) (2005), 2346-2357).
La entrada y el tráfico de células T en los tejidos es un proceso estrechamente regulado donde las integrinas y las quimiocinas desempeñan un papel central (Franciszkiewicz et al., Cancer Res 72(24) (2012), 6325-6332; Kalos y June, Immunity 39(1) (2013), 49-60). Se secretan quimiocinas por células residentes y forman gradientes, que atraen células que portan su receptor correspondiente, regulando la entrada celular (Franciszkiewicz et al., Cancer Res 72(24) (2012), 6325-6332). Los tumores usan este principio para atraer poblaciones celulares inmunosupresoras mientras excluyen subconjuntos proinflamatorios (Curiel et al., Nat Med 10(9) (2004), 942-949). Wennerberg et al., Cancer Immunol Immunother 64 (2015), 225-235, ubicado en el campo de la terapia adoptiva con células T (ACT), dan a conocer que la expansión ex vivo de células citolíticas naturales (NK) da como resultado una expresión aumentada del receptor CXCR3. Además, se describe en Wennerberg et al. que estas células NK expandidas mostraron una capacidad de migración mejorada hacia tumores sólidos que secretan CXCL10. Sin embargo, las células NK como se describen en Wennerberg et al. no se modificaron por ingeniería genética para expresar el receptor de quimiocinas CXCR3. La introducción de receptores de quimiocinas (que se seleccionan como diana por quimiocinas expresadas dentro del tejido tumoral) en células T se ha usado para redirigir células T específicas de antígeno y para mejorar su migración al tejido tumoral. CCR2, CCR4 y CXCR2 se han sometido a prueba en modelos preclínicos. Conducen a una eficacia terapéutica mejorada de ACT, pero generalmente no pueden rechazar los tumores, lo que indica una infiltración y funcionalidad insuficientes de las células T en el sitio del tumor (Di Stasi et al., Blood 113(25) (2009), 6392-6402; Peng et al., Clin Cancer Res 16(22) (2010), 5458-5468; Asai et al., PLoS One 8(2) (2013), e56820). Además, Sapoznik et al., Cancer Immunol Immunother 61 (2012), 1833-1847 dan a conocer que las células de linfocitos infiltrantes de tumor (TIL) modificadas por ingeniería genética para expresar CXCR1 mostraron una migración mejorada hacia células de melanoma que secretan la quimiocina CXCL8. Además, se describió la transfección de células Baf-3 de la línea de células B murinas con un constructo de vector que albergaba el CXCR6 de ratón (Matsumura et al., J. Immunol. 181 (2013), 3099-3107). Sin embargo, el único propósito del procedimiento experimental descrito en la publicación de Matsumura et al. fue demostrar que CXCL16 secretada por células tumorales de ratón tratadas previamente con radiación era funcional, es decir, que tales células tumorales de ratón podrían inducir la migración de células positivas para CXCR6. Por lo tanto, se realizó la transfección de las células Baf-3 de la línea de células B murinas con un constructo de vector que albergaba el CXCR6 de ratón para generar una línea celular funcional para los efectos de CXCL16 y no al contrario para el impacto de CXCR6. Como se mencionó anteriormente, la línea celular transfectada descrita en la publicación de Matsumura et al. es una línea de células B murinas, es decir, un linaje totalmente independiente de la funcionalidad y el desarrollo de células T. Por lo tanto, la eficacia terapéutica demostrada en el presente documento de las células T transducidas con CXCR6 no puede extrapolarse de la línea de células B murinas
descrita en la publicación de Matsumura et al. Además, Xiao et al., Oncotarget, 6(16) (2015), 14165-14178 dan a conocer la construcción de un vector que expresa el CXCR6 humano de longitud completa para la transducción de células mamarias humanas. Además, Deng et al., Nature 388 (1997), 296-300 dan a conocer vectores que albergan la secuencia de CXCR6 humana depositada con el número de registro AF007545. Sin embargo, los vectores como se describen en Xiao et al. y Deng et al. ni se han caracterizado estructural y completamente ni se han depositado.
En consecuencia, es necesario mejorar la terapia tumoral dirigida, particularmente, la terapia adoptiva con células T para satisfacer las necesidades de los pacientes con cáncer. Por lo tanto, todavía existe la necesidad de proporcionar medios mejorados que tengan el potencial de mejorar la seguridad y la eficacia de la ACT y superar las desventajas anteriores.
La presente invención aborda esta necesidad proporcionando las realizaciones como se definen en las reivindicaciones.
En particular, la invención se refiere a un vector de expresión para su uso en el tratamiento de una enfermedad caracterizada por la sobreexpresión de CXCL16, en el que el vector es capaz de transducir células T y comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en (a) una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1; y (b) una secuencia de ácido nucleico que es al menos el 84 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 1 y que se caracteriza por tener una actividad de receptor de quimiocinas 6 (CXCR6).
La invención también se refiere a una célula T que expresa un receptor de quimiocinas 6 (CXCR6), célula T que se transduce con un vector de expresión que codifica el CXCR6, en el que el vector comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en (a) una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1; y (b) una secuencia de ácido nucleico que es al menos el 84 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 1 y que se caracteriza por tener una actividad de receptor de quimiocinas 6 (CXCR6).
La invención se refiere además a un método in vitro para la producción de una célula T transducida que expresa un receptor de quimiocinas 6 (CXCR6) que comprende las siguientes etapas:
(a) transducir una célula T con un vector de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en:
(i) una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, y
(ii) una secuencia de ácido nucleico que es al menos el 84 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 1 y que se caracteriza por tener una actividad de receptor de quimiocinas 6 (CXCR6);
(b) cultivar la célula T transducida en condiciones que permitan la expresión del receptor de quimiocinas 6 (CXCR6) en o sobre dicha célula T; y
(c) recuperar la célula T transducida del cultivo.
Se proporciona un vector capaz de transducir (una) célula(s) T, preferiblemente (una) célula(s) T CD8+, (una) célula(s) T CD4+, (una) célula(s) T CD3+, (una) célula(s) T yS o (una) célula(s) T citolítica(s) natural(es) (NK), lo más preferiblemente (una) célula(s) T CD8+, comprendiendo/que comprenden un ácido nucleico que codifica un receptor de quimiocinas 6 (CXCR6) o un fragmento del mismo, que se caracteriza por tener actividad de receptor de quimiocinas 6 (CXCR6).
CXCR6 es el receptor para CXCL16, que se secreta por células mieloides, pero también por células malignas tales como células de cáncer pancreático (Gaida et al., Clin Exp Immunol 154(2) (2008), 216-223; van der Voort et al., J Leukoc Biol 87(6) (2010), 1029-1039). La expresión de CXCR6 está restringida a ciertos subconjuntos de células T CD4+, células T citolíticas naturales (NK) y células mieloides, pero está ausente de células T CD8+ citotóxicas (Matloubian et al, Nat Immunol 1(4) (2000), 298-304; van der Voort et al, J Leukoc Biol 87(6) (2010), 1029-1039). El ligando de CXCR6 existe en dos formas: CXL16 unida a la membrana y una forma soluble secretada de CXCL16. Esto explica la doble función de CXCR6. CXCR6 media en la migración hacia CXCL16 soluble y media en la adhesión a través de la forma unida a la membrana (Matloubian et al., Nat Immunol 1(4) (2000), 298-304; Gough et al., J Immunol 172(6) (2004), 3678-3685). Estas propiedades hacen que CXCR6 sea único entre los receptores de quimiocinas. En el contexto de la presente invención, sorprendente e inesperadamente se ha encontrado que CXCR6 puede transducirse en células T CD8+ y, de ese modo, media en su migración hacia células tumorales. Además, los datos proporcionados en el presente documento demuestran que células T transducidas con CXCR6, preferiblemente células T CD8+, células T CD4+, células T CD3+, células T yS o células T citolíticas naturales (NK), lo más preferiblemente células T CD8+, tienen la ventaja adicional de que se adhieren a las células tumorales diana de una manera independiente de antígeno y, por lo tanto, soportan el reconocimiento de células tumorales en el sitio del tumor. En consecuencia, la presente divulgación se refiere a la transducción de (una) célula(s) T, preferiblemente (una) célula(s) T CD8+, (una) célula(s) T CD4+, (una) célula(s) T CD3+, (una) célula(s) T yS o (una) célula(s) T citolítica(s) natural(es) (NK), lo más preferiblemente (una) célula(s) T CD8+, con CXCR6, mediando de ese modo en su migración
hacia (una) célula(s) tumoral(es) que secreta(n) CXCL16. Como se muestra en los ejemplos adjuntos, el tratamiento de (una) tumor(es) con (una) célula(s) T transducida(s) que expresa(n) un receptor de quimiocinas 6 (CXCR6) reduce significativamente el tamaño del tumor en comparación con los experimentos de control (véase la figura 17). En consecuencia, se encontró sorprendentemente que puede(n) usarse célula(s) T transducida(s) que expresa(n) un receptor de quimiocinas 6 (CXCR6) para el tratamiento de enfermedades caracterizadas por sobreexpresión de CXCL16 tal como cáncer pancreático.
Por lo tanto, la transducción de (una) célula(s) T, preferiblemente (una) célula(s) T CD8+, (una) célula(s) T CD4+, (una) célula(s) T CD3+, (una) célula(s) T y8 o (una) célula(s) T citolítica(s) natural(es) (NK), lo más preferiblemente (una) célula(s) T CD8+, con CXCR6 dará como resultado ventajosamente una terapia adoptiva mejorada con células T. En consecuencia, se proporciona un vector capaz de transducir (una) célula(s) T, preferiblemente (una) célula(s) T CD8+, (una) célula(s) T CD4+, (una) célula(s) T CD3+, (una) célula(s) T y8 o (una) célula(s) T citolítica(s) natural(es) (NK), lo más preferiblemente (una) célula(s) T CD8+, comprendiendo/que comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica CXCR6 o un fragmento del mismo, que se caracteriza por tener actividad de CXCR6.
El vector puede comprender una secuencia de ácido nucleico, que codifica un fragmento/parte polipeptídica del receptor de quimiocinas 6 (CXCR6) de longitud completa. Por lo tanto, el receptor de quimiocinas 6 (CXCR6), que está comprendido en el vector proporcionado en el presente documento, es un fragmento/parte polipeptídica del CXCR6 de longitud completa. La secuencia de ácido nucleico que codifica el receptor de quimiocinas de longitud completa 6 (CXCR6) se muestra en el presente documento como SEQ ID NO: 1 (humano) y 3 (murino/ratón). Las secuencias de aminoácidos de CXCR6 de longitud completa murino/ratón y humano se muestran en el presente documento como SEQ ID NO: 4 (murino/ratón) y 2 (humano), respectivamente (el número de entrada de Uni Prot del CXCR6 de longitud completa humano es 000574 (número de registro con el número de versión de entrada 139 y versión 1 de la secuencia. El número de entrada de Uni Prot del CXCR6 de longitud completa de ratón es Q9EQ16 (número de registro con el número de versión de entrada 111 y versión 1 de la secuencia)).
La secuencia de ácido nucleico codifica “un receptor de quimiocinas 6 (CXCR6)”. El término “receptor de quimiocinas 6 (CXCR6)” y su significado científico relacionado con la estructura y la función se conocen bien en la técnica y se usan en consecuencia en el presente documento (Shimaoka et al., J Leukoc Biol. 75(2) (2004), 267-274; Alkhatib G. et al., Nature 388(6639) (1997), 238; Paust et al., Nat Immunol. 11(12) (2010), 1127-1135). La función del receptor de quimiocinas 6 (CXCR6) dentro del vector tal como se da a conocer en el presente documento es actuar como atractor y conector entre una célula, preferiblemente una célula T tal como una célula T CD8+, una célula T CD4+, una célula T CD3+, una célula T y8 o una célula T citolítica natural (NK), lo más preferiblemente una célula T CD8+, que va a transducirse por una secuencia de ácido nucleico que expresa dicho receptor de quimiocinas 6 (CXCR6) y una célula diana que (sobre)expresa el ligando de quimiocinas (motivo C-X-C) 16 (CXCL16). Las secuencias de ácido nucleico de la CXCL16 de longitud completa se muestran en el presente documento como SEQ ID NO: 5 (humano) y 7 (murino/ratón). Las secuencias de aminoácidos de CXCL16 murino/ratón y humano de longitud completa se muestran en el presente documento como SEQ ID NO: 8 (murino/ratón) y 6 (humano), respectivamente (el número de entrada de Uni Prot de la CXCL16 de longitud completa humana es Q9H2A7 (número de registro con el número de versión de entrada 129 y versión 4 de la secuencia). El número de entrada de Uni Prot de la CXCL16 de longitud completa de ratón es Q8BSU2 (número de registro con el número de versión de entrada 103 y versión 2 de la secuencia)). Por lo tanto, la(s) célula(s) T transducida(s) que expresa(n) un receptor de quimiocinas 6 (CXCR6) codificado por una secuencia de ácido nucleico descrita en el presente documento es/son capaz/capaces de migrar hacia y unirse a (una) célula(s) diana que (sobre)expresa(n) CXCL16 tal(es) como, por ejemplo, células progenitoras de enfermedad, líneas celulares primarias, células epiteliales, células neuronales, células de linaje linfoide, células madre o células tumorales.
El término “migrar” como se usa en el presente documento, se refiere a la capacidad de las células T (transducidas), que se caracterizan por (sobre)expresar el CXCR6 hacia células (transducidas) que (sobre)expresan CXCL16 tales como, por ejemplo, células progenitoras de enfermedad, líneas celulares primarias, células epiteliales, células neuronales, células de linaje linfoide, células madre o tumorales. La capacidad de migración de las células diana puede medirse mediante citometría de flujo, ELISA, microscopía o cualquier otro dispositivo o sistema adecuado (Justus et al., J. Vis. Exp. (88) (2014), e51046, doi:10.3791/51046). En resumen, tales ensayos de migración celular funcionan de la siguiente manera: se marcan células T transducidas (por ejemplo, células T CD8+) con un colorante fluorescente adecuado y se siembran en medio libre de suero en el pocillo superior de un inserto Transwell en una placa de 96 pocillos. Se añade CXCL16 recombinante a la cámara inferior. Se permite la migración de las células a 37°C. Después de eso, se cuantifican las células que alcanzan el pocillo inferior. En la bibliografía se conocen ampliamente métodos para medir la migración (Valster A. et al., Methods 37(2) (2005), 208-215) e incluyen ensayos Transwell, microscopía confocal y citometría de flujo para análisis in vitro, mientras que se usan citometría de flujo, obtención de imágenes de bioluminiscencia e inmunohistoquímica para el análisis in vivo (véase también la sección de ejemplo 2.5, a continuación, para más detalles).
El término “unión”, como se usa en el presente documento, se refiere a la capacidad del receptor de quimiocinas 6 (CXCR6) para asociarse con la célula diana, que se caracteriza por (sobre)expresar CXCL16, por ejemplo, a través de interacciones covalentes o no covalentes. Una interacción “covalente” es una forma de enlace químico que se caracteriza por compartir pares de electrones entre átomos, o entre átomos y otros enlaces covalentes. El enlace covalente incluye muchos tipos de interacción bien conocidos en la técnica, tales como, por ejemplo, enlace a, enlace
%, enlace de metal a no metal, interacciones agósticas y enlaces de tres centros y dos electrones. Un enlace “no covalente” es un enlace químico que no implica compartir pares de electrones. Los enlaces no covalentes son críticos para mantener la estructura tridimensional de moléculas grandes, tales como proteínas y ácidos nucleicos, y están implicados en muchos procesos biológicos en los que se unen moléculas específica pero transitoriamente entre sí. Existen varios tipos de enlaces no covalentes, tales como enlaces de hidrógeno, interacciones iónicas, interacciones de Van-der-Waals, enlaces carga-carga, carga-dipolo, dipolo-dipolo y enlaces hidrofóbicos. Las interacciones no covalentes a menudo implican varios tipos diferentes de enlaces no covalentes que funcionan conjuntamente, por ejemplo, para mantener un ligando en posición en un sitio de unión diana en la membrana celular. Puede producirse una interacción con un grupo tal como una carga o un dipolo, que puede estar presente muchas veces en la superficie de la membrana celular. Preferiblemente, la interacción (es decir, la unión) se produce en un sitio definido (implica un constituyente/epítopo de membrana celular específico) de la membrana celular, y avanza con la formación de al menos una interacción, preferiblemente la formación de una red de varias interacciones específicas. Incluso más preferiblemente, la unión es específica para la célula diana, es decir, la unión se produce en la membrana celular de la célula diana pero no, o no significativamente, en la membrana celular de una célula no diana.
Como se da a conocer en el presente documento, el vector capaz de transducir células comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1 (humano) y 3 (murino/ratón) o una secuencia de ácido nucleico que es al menos el 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 1 (humano) o 3 (murino/ratón) y que se caracteriza por tener una actividad de receptor de quimiocinas 6 (CXCR6). En consecuencia, también se abarcan por la presente divulgación moléculas de ácido nucleico, secuencias de ácido nucleico o segmentos de secuencia que tienen al menos el 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con la molécula de ácido nucleico/secuencia de ácido nucleico representada en la SEQ ID NO: 1 (humano) o 3 (murino/ratón). Tales moléculas variantes pueden ser formas de corte y empalme o moléculas homólogas de otras especificaciones. Se apreciará que estas secuencias variantes de molécula de ácido nucleico/ácido nucleico, no obstante, tienen que codificar una secuencia de aminoácidos que tiene la función indicada, es decir, la secuencia codificada por una variante de la SEQ ID NO: 1 (humano) o 3 (murino/ratón) tiene que caracterizarse por tener una actividad de receptor de quimiocinas 6 (CXCR6) como se define a continuación en el presente documento.
Por consiguiente, la secuencia de ácido nucleico puede ser SEQ ID NO: 1 (humano) y 3 (murino/ratón) o una secuencia de ácido nucleico, que es al menos el 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 1 (humano) o 3 (murino/ratón). Si el vector proporcionado en el presente documento es capaz de transducir (una) célula(s) T, preferiblemente (una) célula(s) T CD8+, (una) célula(s) T CD4+, (una) célula(s) T CD3+, (una) célula(s) T y8 o (una) célula(s) T citolítica(s) natural(es) (NK), lo más preferiblemente (una) célula(s) T CD8+, comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1 (humano) y 3 (murino/ratón) o una secuencia de ácido nucleico que es al menos el 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 1 (humano) o 3 (murino/ratón), entonces dicha secuencia de ácido nucleico se caracteriza por tener una actividad de receptor de quimiocinas 6 (CXCR6). La actividad del receptor de quimiocinas 6 (CXCR6) se define por la capacidad de migrar hacia un gradiente de CXCL16 orquestado por células productoras de CXCL16 in vitro e in vivo y que permite la acumulación de células T positivas para CXCR6 en el sitio diana, es decir, sitio del tumor y/o por la capacidad de mediar en la adhesión directamente por unión a CXCL16 o indirectamente a través de la activación de integrinas a células tumorales productoras de CXCL16, aumentando de ese modo el reconocimiento de células tumorales. En la bibliografía se conocen ampliamente métodos para medir la migración (Valster A. et al., Methods 37(2) (2005), 208-215) e incluyen ensayos Transwell, microscopía confocal y citometría de flujo para análisis in vitro, mientras que se usan citometría de flujo, obtención de imágenes de bioluminiscencia e inmunohistoquímica para el análisis in vivo.
Como se usa en el presente documento, el término “al menos % idéntico a” en relación con secuencias de ácido nucleico/moléculas de ácido nucleico describe el número de coincidencias (“aciertos”) de ácidos nucleicos idénticos de dos o más secuencias de ácido nucleico alineadas en comparación con el número de residuos de ácido nucleico que constituyen la longitud global de las secuencias de aminoácidos (o el global en comparación con parte de las mismas). En otros términos, usando una alineación, para dos o más secuencias o subsecuencias, puede determinarse el porcentaje de residuos de ácido nucleico que son iguales (por ejemplo, al menos el 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad), cuando las (sub)secuencias se comparan y alinean para lograr una correspondencia máxima a lo largo de una ventana de comparación, o a lo largo de una región designada como se mide usando un algoritmo de comparación de secuencias como se conoce en la técnica, o cuando se alinean manualmente e inspeccionan visualmente. Los ácidos nucleicos preferidos son aquellos en los que la identidad descrita existe a lo largo de una región que tiene de al menos 100 a 150 nucleótidos de longitud, más preferiblemente, a lo largo de una región que tiene de al menos 200 a 400 nucleótidos de longitud. Los ácidos nucleicos más preferidos son aquellos que tienen la identidad de secuencia descrita a lo largo de toda la longitud de la secuencia de ácido nucleico mostrada en SEQ ID NO: 1 (humano) o 3 (murino/ratón).
Se conoce bien en la técnica cómo determinar el porcentaje de identidad de secuencia entre secuencias usando, por ejemplo, algoritmos tales como los basados en el programa informático CLUSTALW (Thompson Nucl. Acids Res. 2 (1994), 4673-4680) o FASTA (Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci., 1988, 85; 2444). Aunque el algoritmo FASTA
normalmente no considera deleciones o adiciones internas no coincidentes en las secuencias, es decir, huecos, en su cálculo, esto puede corregirse manualmente para evitar una sobreestimación del % de identidad de secuencia. CLUSTALW, sin embargo, tiene en cuenta los huecos de secuencia en sus cálculos de identidad. También están disponibles para los expertos en esta técnica los algoritmos BLAST y BLAST 2.0 (Altschul, Nucl. Acids Res., 25 (1977), 3389). El programa BLASTN para secuencias de ácido nucleico usa por defecto una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) de 10, M=5, N=4, y una comparación de ambas cadenas. Para secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP usa por defecto una longitud de palabra (W) de 3, y una expectativa (E) de 10. La matriz de puntuación BLOSUM62 (Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci., 89 (1989), 10915) usa alineaciones (B) de 50, expectativa (E) de 10, M=5, N=4, y una comparación de ambas cadenas. Todos esos programas pueden usarse para los fines de la presente divulgación. Sin embargo, se usa preferiblemente el programa BLAST. En consecuencia, todas las moléculas de ácido nucleico que tienen la función prescrita y que tienen además una identidad de secuencia de al menos el 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % como se determina con cualquiera de los programas mencionados anteriormente o programas adicionales disponibles para el experto y preferiblemente con el programa BLAST se encuentran dentro del alcance de la divulgación.
Las secuencias de ácido nucleico, que también se denominan en el presente documento polinucleótidos o moléculas de ácido nucleico, incluyen ADN, tal como ADNc o ADN genómico, y ARN. Se entiende que el término “ARN”, como se usa en el presente documento, comprende todas las formas de a Rn , incluidos ARNm, ARNt y ARNr, pero también ARN genómico, tal como en el caso de ARN de virus de ARN. Preferiblemente, las realizaciones que mencionan “ARN” se refieren a ARNm. Se incluyen además moléculas que imitan el ácido nucleico conocidas en la técnica, tales como derivados sintéticos o semisintéticos de ADN o ARN y polímeros mixtos, tanto cadenas sentido como antisentido. Pueden contener bases de nucleótidos adicionales no naturales o derivatizadas, como apreciarán fácilmente los expertos en la técnica. Tales moléculas que imitan el ácido nucleico o derivados de ácido nucleico incluyen ácido nucleico peptídico (PNA), ácido fosforotioatonucleico, ácido fosforamidatonucleico, ácido 2'-O-metoxietilribonucleico, ácido morfolinonucleico, ácido hexitolnucleico (HNA) y ácido nucleico bloqueado (LNA), un derivado de ARN en el que el anillo de ribosa está limitado por una unión de metileno entre el oxígeno 2' y el carbono 4' (véase, por ejemplo, Braasch y Corey, Chemistry & Biology 8 (2001), 1-7). El PNA es un mimético de ADN sintético con una estructura principal de amida en lugar de la estructura principal de azúcar-fosfato de ADN o ARN, como se describe por Nielsen et al., Science 254 (1991):1497; y Egholm et al., Nature 365(1993), 666.
Las moléculas de ácido nucleico/secuencias de ácido nucleico pueden ser de origen natural, así como sintético o semisintético. Por lo tanto, las moléculas de ácido nucleico pueden, por ejemplo, ser moléculas de ácido nucleico que se han sintetizado según protocolos convencionales de química orgánica. El experto en la técnica está familiarizado con la preparación y el uso de tales moléculas de ácido nucleico (véase, por ejemplo, Sambrook y Russel “Molecular Cloning, A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (2001)).
El término que comprende, como se usa en el presente documento, indica que pueden incluirse secuencias, componentes y/o etapas adicionales del método además de las secuencias, componentes y/o etapas específicamente mencionadas del método. Sin embargo, este término también abarca que la materia reivindicada consiste en exactamente las secuencias, componentes y/o etapas mencionadas del método.
En aquellas realizaciones donde la molécula de ácido nucleico comprende (en lugar de consiste en) la secuencia mencionada, se extienden nucleótidos adicionales sobre la secuencia específica o bien en el extremo 5' o el extremo 3', o bien ambos. Esos nucleótidos adicionales pueden ser de naturaleza heteróloga u homóloga. En el caso de secuencias homólogas, estas secuencias pueden comprender hasta 1500 nucleótidos en el extremo 5' y/o 3', tal como por ejemplo hasta 1000 nucleótidos, tal como hasta 900 nucleótidos, más preferiblemente hasta 800 nucleótidos, tal como hasta 700 nucleótidos, tal como por ejemplo hasta 600 nucleótidos, tal como hasta 500 nucleótidos, incluso más preferiblemente hasta 400 nucleótidos, tal como hasta 300 nucleótidos, tal como por ejemplo hasta 200 nucleótidos, tal como hasta 100 nucleótidos, más preferiblemente hasta 50 nucleótidos, tal como hasta 40 nucleótidos, tal como por ejemplo hasta 30 nucleótidos, tal como hasta 20 nucleótidos, más preferiblemente hasta 10 nucleótidos y lo más preferiblemente hasta 5 nucleótidos en el extremo 5' y/o 3'. El término “hasta [...] nucleótidos”, como se usa en el presente documento, se refiere a un número de nucleótidos que incluye cualquier número entero por debajo e incluye el número específicamente mencionado. Por ejemplo, el término “hasta 5 nucleótidos” se refiere a cualquiera de 1, 2, 3, 4 y 5 nucleótidos. Además, en el caso de secuencias homólogas, esas realizaciones no incluyen genomas completos o cromosomas completos.
Las secuencias heterólogas adicionales pueden, por ejemplo, incluir promotores heterólogos, que están operativamente unidos a las secuencias codificantes como se da a conocer en el presente documento, así como secuencias de ácido nucleico reguladoras adicionales bien conocidas en la técnica y descritas con más detalle a continuación en el presente documento. Por lo tanto, las secuencias de ácido nucleico pueden estar bajo el control de secuencias reguladoras. En consecuencia, el vector como se da a conocer en el presente documento comprende además una secuencia reguladora, que está operativamente unida a las secuencias de ácido nucleico descritas en el presente documento. Por ejemplo, pueden emplearse promotores, potenciadores de transcripción y/o secuencias, que permiten la expresión inducida del CXCR6 descrito en el presente documento. Las moléculas de ácido nucleico se expresan bajo el control de un promotor constitutivo o inducible. Promotores adecuados son por ejemplo el promotor de CMV (Qin et al., PLoS One 5(5) (2010), e10611), el promotor UBC (Qin et al., PLoS One 5(5) (2010), e10611), PGK
(Qin et al., PLoS One 5(5) (2010), e10611), el promotor EF1A (Qin et al., PLoS One 5(5) (2010), e10611), el promotor CAGG (Qin et al., PLoS One 5(5) (2010), e10611), el promotor SV40 (Qin et al., PLoS One 5(5) (2010), e10611), el promotor COPIA (Qin et al., PLoS One 5(5) (2010), e10611), el promotor ACT5C (Qin et al., PLoS One 5(5) (2010), e10611), el promotor TRE (Qin et al., PLoS One. 5(5) (2010), e10611), el promotor Oct3/4 (Chang et al., Molecular Therapy 9 (2004), S367-S367 (doi: 10.1016/j.ymthe.2004.06.904)) o el promotor Nanog (Wu et al., Cell Res. 15(5) (2005), 317-24).
El término “secuencia reguladora” se refiere a secuencias de ADN, que son necesarias para efectuar la expresión de secuencias codificantes a las que están ligadas. La naturaleza de tales secuencias de control difiere dependiendo del organismo huésped. En procariotas, las secuencias de control generalmente incluyen (un) promotor(es), (un) sitio(s) de unión al ribosoma y (un) terminador(es). En eucariotas, generalmente las secuencias de control incluyen (un) promotor(es), (un) terminador(es) y, en algunos casos, (un) potenciador(es), (un) transactivador(es) o (un) factor(es) de transcripción. El término “secuencia de control” pretende incluir, como mínimo, todos los componentes cuya presencia es necesaria para la expresión, y también puede incluir componentes ventajosos adicionales.
Además, se prevé para fines adicionales que las moléculas de ácido nucleico puedan contener, por ejemplo, enlaces tioéster y/o análogos de nucleótidos. Dichas modificaciones pueden ser útiles para la estabilización de la molécula de ácido nucleico frente a endo y/o exonucleasas en la célula T transducida. Dichas moléculas de ácido nucleico pueden transcribirse mediante un vector apropiado que contiene un gen quimérico, que permite la transcripción de dicha molécula de ácido nucleico en la célula T transducida. A este respecto, también debe entenderse que tal polinucleótido puede usarse para enfoques de “direccionamiento génico” o “terapia génica”. En otra realización, dichas secuencias de ácido nucleico están marcadas. Los métodos para la detección de ácidos nucleicos se conocen bien en la técnica, por ejemplo, transferencia de tipo Southern y Northern, PCR o extensión de cebador. Esta realización puede ser útil para métodos de cribado para verificar la introducción exitosa de las secuencias de ácido nucleico descritas anteriormente durante los enfoques de terapia génica. Dicha(s) secuencia(s) de ácido nucleico puede(n) ser una secuencia de ácido nucleico quimérico producida de forma recombinante que comprende cualquiera de las secuencias de ácido nucleico mencionadas anteriormente, ya sea sola o en combinación. La molécula de ácido nucleico es parte de un vector de la presente divulgación.
Por lo tanto, la presente divulgación también se refiere a (un) vector(es) que comprende(n) la molécula de ácido nucleico descrita en el presente documento. El término “vector” se refiere a una molécula de ácido nucleico circular o lineal, que puede replicarse de manera autónoma en una célula huésped (es decir, en una célula T transducida) en la que se ha introducido. El “vector”, como se usa en el presente documento, se refiere particularmente a un plásmido, un cósmido, un virus, un bacteriófago y otros vectores comúnmente usados en ingeniería genética. El vector dado a conocer en el presente documento es adecuado para la transformación de (una) célula(s) T, preferiblemente de (una) célula(s) T CD8+, (una) célula(s) T CD4+, (una) célula(s) T CD3+, (una) célula(s) T y8 o (una) célula(s) T citolíticas(s) natural(es) (NK), lo más preferiblemente (una) célula(s) T CD8+. En consecuencia, el vector de la invención es un vector de expresión. En la bibliografía se han descrito ampliamente vectores de expresión. En particular, el vector proporcionado en el presente documento comprende preferiblemente un polinucleótido recombinante (es decir, una secuencia de ácido nucleico que codifica el receptor de quimiocinas 6 (CXCR6) o un fragmento del mismo, que se caracteriza por tener una actividad de CXCR6 como se describe en el presente documento), así como (una) secuencia(s) de control de expresión unida(s) operativamente a la secuencia de nucleótidos que va a expresarse. El vector como se proporciona en el presente documento comprende preferiblemente además (un) promotor(es). El vector descrito en el presente documento también puede comprender un gen marcador de selección y un origen de replicación que garantiza la replicación en el huésped (es decir, la célula T transducida). Además, el vector proporcionado en el presente documento también puede comprender una señal de terminación para la transcripción. Entre el promotor y la señal de terminación hay preferiblemente al menos un sitio de restricción o un poliligador, que permite la inserción de una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico que codifica el CXCR6 descrito en el presente documento) que se desea expresar. El experto conoce cómo puede ponerse en práctica tal inserción. En la técnica se conocen ejemplos de vectores adecuados para comprender una molécula de ácido nucleico para formar el vector como se da a conocer en el presente documento. Por ejemplo, vectores adecuados incluyen cósmidos, plásmidos (por ejemplo, desnudos o contenidos en liposomas) y virus (por ejemplo, lentivirus, retrovirus, adenovirus y virus adenoasociados) que incorporan la molécula de ácido nucleico de la divulgación (es decir, la secuencia de ácido nucleico que codifica el receptor de quimiocinas 6 (CXCR6) o un fragmento del mismo, que se caracteriza por tener una actividad de CXCR6 como se describe en el presente documento). Preferiblemente, el vector de la presente divulgación es un vector viral. Más preferiblemente, el vector es un vector lentiviral, e incluso más preferiblemente, el vector es un vector retroviral (por ejemplo, el vector pMP71). En consecuencia, el vector es un vector lentiviral o un vector retroviral. El vector permite la expresión constitutiva o condicional de la secuencia de ácido nucleico de la presente divulgación que codifica el receptor de quimiocinas 6 (CXCR6). En este contexto, en la técnica se conocen vectores retovirales adecuados para la expresión del CXCR6 tales como SAMEN CMV/SRa (Clay et al., J. Immunol. 163 (1999), 507-513), LZRS-id3-IHRES (Heemskerk et al., J. Exp. Med. 186 (1997), 1597-1602), FeLV (Neil et al., Nature 308 (1984), 814-820), SAX (Kantoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986), 6563-6567), pDOL (Desiderio, J. Exp. Med. 167 (1988), 372-388), N2 (Kasid et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990), 473-477), LNL6 (Tiberghien et al., Blood 84 (1994), 1333-1341), pZipNEO (Chen et al., J. Immunol. 153 (1994), 3630-3638), LASN (Mullen et al., Hum. Gene Ther. 7 (1996), 1123-1129), pG1XsNa (Taylor et al., J. Exp. Med. 184 (1996), 2031 2036), LCNX (Sun et al., Hum. Gene Ther. 8 (1997), 1041-1048), SFG (Gallardo et al., Blood 90 (1997), LXSN (Sun
et al., Hum. Gene Ther. 8 (1997), 1041-1048), SFG (Gallardo et al., Blood 90 (1997), 952-957), HMB-Hb-Hu (Vieillard et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (1997), 11595-11600), pMV7 (Cochlovius et al., Cancer Immunol. Immunother. 46 (1998) , 61-66), pSTITCH (Weitjens et al., Gene Ther 5 (1998), 1195-1203), pLZR (Yang et al., Hum. Gene Ther. 10 (1999) , 123-132), pBAG (Wu et al., Hum. Gene Ther. 10 (1999), 977-982), rKat.43.267bn (Gilham et al., J. Immunother.
25 (2002), 139-151), pLGSN (Engels et al., Hum. Gene Ther. 14 (2003), 1155-1168), pMP71 (Engels et al., Hum. Gene Ther. 14 (2003), 1155-1168), pGCSAM (Morgan et al., J. Immunol. 171 (2003), 3287-3295), pMSGV (Zhao et al., J. Immunol. 174 (2005), 4415-4423) o pMX (de Witte et al., J. Immunol. 181 (2008), 5128-5136). Además, vectores lentivirales adecuados para la expresión del receptor de quimiocinas 6 (CXCR6) como se codifica por la secuencia de ácido nucleico como se da a conocer en el presente documento son, por ejemplo, el vector lentiviral PL-SIN (Hotta et al., Nat Methods. 6(5) (2009), 370-376), p156RRL-sinPPT-CMV-GFPPRE/MeI (Campeau et al., PLoS One 4(8) (2009), e6529), pCMVR8.74 (n.° de catálogo de Addgene 22036), FUGW (Lois et al., Science 295(5556) (2002), 868 872, pLVX-EF1 (n.° de catálogo de Addgene 64368), pLVE (Brunger et al., Proc Natl Acad Sci U S A 111(9) (2014), E798-806), pCDH1-MCS1-EF1 (Hu et al., Mol Cancer Res. 7(11) (2009), 1756-1770), pSLIK (Wang et al., Nat Cell Biol. 16(4) (2014), 345-356), pLJM1 (Solomon et al., Nat Genet. 45(12) (2013), 1428-30), pLX302 (Kang et al., Sci Signal. 6(287) (2013), rs13), pHR-IG (Xie et al., J Cereb Blood Flow Metab. 33(12) (2013), 1875-85), pRRLSIN (n.° de catálogo de Addgene 62053), pLS (Miyoshi et al., J Virol. 72(10) (1998), 8150-8157), pLL3.7 (Lazebnik et al., J Biol Chem. 283(7) (2008), 11078-82), FRIG (Raissi et al., Mol Cell Neurosci. 57 (2013), 23-32), pWPT (Ritz-Laser et al., Diabetologia. 46(6) (2003), 810-821), pBOB (Marr et al., J Mol Neurosci. 22(1-2) (2004), 5-11) o pLEX (n.° de catálogo de Addgene 27976).
La divulgación también se refiere a (una) célula(s) T transducida(s), preferiblemente (una) célula(s) T CD8+, (una) célula(s) T CD4+, (una) célula(s) T CD3+, (una) célula(s) T yS o (una) célula(s) T citolíticas(s) natural(es) (NK), lo más preferiblemente (una) célula(s) T CD8+, que expresan un receptor de quimiocinas 6 (CXCR6) codificado por una secuencia de ácido nucleico como se da a conocer en el presente documento. En consecuencia, la divulgación se refiere a (una) célula(s) T, preferiblemente (una) célula(s) T CD8+, (una) célula(s) T CD4+, (una) célula(s) T CD3+, (una) célula(s) T yS o (una) célula(s) T citolítica(s) natural(es) (NK), lo más preferiblemente (una) célula(s) T CD8+, transducidas con un vector que expresa un receptor de quimiocinas (CXCR6) codificado por una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en (a) una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1 (humano) o 3 (murino/ratón); y (b) una secuencia de ácido nucleico que es al menos el 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 1 (humano) o 3 (murino/ratón) y que se caracteriza por tener una actividad del receptor de quimiocinas 6 (CXCR6). En consecuencia, la(s) célula(s) T transducida(s) puede(n) comprender una secuencia de ácido nucleico que codifica el receptor de quimiocinas 6 (CXCR6) o un vector de la presente invención. Por lo tanto, la célula T transducida se refiere a una célula T transducida, preferiblemente una célula T CD8+, célula T CD4+, una célula T CD3+, una célula T yS o una célula T citolítica natural (NK), lo más preferiblemente una célula T CD8+, que expresa un receptor de quimiocinas 6 (CXCR6) codificado por una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en: (a) una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1 (humano) o 3 (murino/ratón); y (b) una secuencia de ácido nucleico que es al menos el 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 1 (humano) o 3 (murino/ratón) y que se caracteriza por tener una actividad de receptor de quimiocinas 6 (CXCR6).
Como se usa en el presente documento, la expresión “célula T transducida” se refiere a una célula T modificada genéticamente (es decir, una célula T en la que se ha introducido deliberadamente una molécula de ácido nucleico). La célula T transducida proporcionada en el presente documento puede comprender el vector de la presente divulgación. Como se usa en el presente documento, el término “célula T transducida” se refiere a (una) célula(s) T, preferiblemente (una) célula(s) T CD8+, (una) célula(s) T CD4+, (una) célula(s) T CD3+, (una) célula(s) T yS o (una) célula(s) T citolítica(s) natural(es) (NK), lo más preferiblemente (una) célula(s) T CD8+, que se caracteriza(n) por no expresar un receptor de quimiocinas 6 (CXCR6) codificado por una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en (a) una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1 (humano) o 3 (murino/ratón); y (b) una secuencia de ácido nucleico, que es al menos el 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 1 (humano) o 3 (murino/ratón) y que se caracteriza por tener una actividad de receptor de quimiocinas 6 (CXCR6). Preferiblemente, la célula T transducida proporcionada en el presente documento comprende la secuencia de ácido nucleico de la presente divulgación que codifica el receptor de quimiocinas 6 (CXCR6) y/o el vector de la presente divulgación. La célula T transducida puede ser una célula T, que expresa transitoria o establemente el ADN extraño (es decir, la molécula de ácido nucleico, que se ha introducido en la célula T). En particular, la secuencia de ácido nucleico que codifica el receptor de quimiocinas 6 (CXCR6) puede integrarse de manera estable en el genoma de la célula T usando una transducción retroviral o lentiviral. Mediante el uso de transfección de ARNm, la molécula de ácido nucleico que codifica el CXCR6 descrito en el presente documento puede expresarse de forma transitoria. Preferiblemente, la célula T transducida proporcionada en el presente documento se ha modificado genéticamente mediante la introducción de una molécula de ácido nucleico en la célula T a través de un vector viral (por ejemplo, un vector retroviral o un vector lentiviral). La expresión puede ser constitutiva o constitucional, dependiendo del sistema usado. El receptor de quimiocinas 6 (CXCR6) es un receptor que atraviesa siete veces la membrana, de ese modo solo una parte del receptor es accesible desde el espacio intracelular. Una vez transducido en células T, la expresión de CXCR6 en la superficie de la célula T transducida puede detectarse mediante citometría de flujo o microscopía, usando anticuerpos anti-CXCR6. En la bibliografía se describen ampliamente anticuerpos para la detección de CXCR6 y están disponibles comercialmente. A modo de ejemplo, están
disponibles anticuerpos anti-CXCR6 de R&D Systems, Inc., MN, EE.UU. con el número de catálogo “MAB699”. Puede encontrarse una lista completa de todos los anticuerpos anti-CXCR6 disponibles comercialmente en la página web de Biocompare (véase http://www.biocompare.com/pfu/110447/soids/321781/Antibodies/CXCR6).
Las células T son células del sistema inmunitario adaptativo que reconocen su diana de una manera específica de antígeno. Estas células se caracterizan por la expresión de superficie de CD3 y un receptor de células T (TCR), que reconoce un antígeno afín en el contexto de complejos mayores de histocompatibilidad (MHC). Las células T pueden subdividirse adicionalmente en células T CD4+ o CD8+. Las células T CD4+ reconocen un antígeno a través de su TCR en el contexto de moléculas de MHC de clase II que se expresan predominantemente por células presentadoras de antígeno. Las células T CD8+ reconocen su antígeno en el contexto de moléculas de MHC de clase I que están presentes en la mayoría de las células del cuerpo humano. Mientras que la función principal de las células T CD4+ es proporcionar “ayuda”, es decir, factores coestimuladores para otras células específicas de antígeno tales como células T CD8+, las CD8+ son directamente citotóxicas para la célula diana después del acoplamiento de TCR.
Los expertos en la técnica conocen bien métodos para detectar células T CD4+ y CD8+ e incluyen citometría de flujo, microscopía, inmunohistoquímica, RT-PCR o inmunotransferencia de tipo Western (Kobold, J Natl Cancer Inst (2015), 107; Kobold, J Natl Cancer Inst 107 (2015), 364).
La(s) célula(s) T transducida(s) de la presente invención puede(n) ser, por ejemplo, (una) célula T CD8+, (una) célula(s) T CD4+, (una) célula(s) T yS o (una) célula(s) T citolítica(s) natural(es) (NK). Preferiblemente, la célula T transducida es (son) (una) célula(s) T CD8+ transducida(s), (una) célula(s) T CD4+ transducida(s), (una) célula(s) T yS o (una) célula(s) T citolítica(s) natural(es) (NK), más preferiblemente, la(s) célula(s) T transducida(s) es (son) (una) célula(s) T CD8+ transducida(s) o (una) célula(s) T CD4+ transducida(s), lo más preferiblemente, la célula T transducida es (son) (una) célula(s) T CD8+. En consecuencia, la célula T transducida es (son) lo más preferiblemente (una) célula(s) T CD8+. Además, también se prefiere que la(s) célula(s) T transducida(s) sea(n) (una) célula(s) T autóloga(s).
La célula T transducida es (son) preferiblemente (una) célula(s) T CD8+ autóloga(s) transducida(s), (una) célula(s) T CD4+ autóloga(s) transducida(s), (una) célula(s) T yS autóloga(s) transducida(s) o (una) célula(s) T citolítica(s) natural(es) (NK) autóloga(s) transducida(s). Además del uso de (una) célula(s) T autóloga(s) aislada(s) del sujeto, la presente divulgación también comprende el uso de (una) célula(s) T alogénica(s). En consecuencia, la célula T transducida también puede ser una célula T alogénica, tal como una célula T CD8+ alogénica transducida. El uso de células T alogénicas se basa en el hecho de que estas células pueden reconocer un epítopo de antígeno específico presentado por células presentadoras de antígeno (APC) exógenas, siempre que la APC exprese la molécula de MHC, clase I o clase II, a la que la población de células que responden específicamente, es decir, la población de células T, está restringida, junto con el epítopo de antígeno reconocido por las células T. Una “célula T alogénica” es una célula T, de las cuales el donante es de la misma especie que el receptor, pero genéticamente no idéntico al receptor. Por lo tanto, el término alogénico se refiere a células procedentes de un individuo/sujeto donante no relacionado, que tiene un antígeno leucocitario humano (HLA) compatible con el individuo/sujeto, que se tratará mediante, por ejemplo, la célula T transducida que expresa CXCR6 descrita en el presente documento. Una “célula T autóloga” se refiere a (una) célula(s) T que se aísla(n)/obtiene(n) como se describe anteriormente en el presente documento del sujeto que va a tratarse con la célula T transducida descrita en el presente documento. En consecuencia, (una) “célula(s) T autóloga(s)” es (son) (una) célula(s) T, en la que donante y receptor es el mismo individuo.
Como se describió anteriormente, la(s) célula(s) T transducida(s) de la presente divulgación se transduce(n) con una secuencia de ácido nucleico que expresa el receptor de quimiocinas 6 proporcionado en el presente documento (CXCR6). En el caso de (una) célula(s) que porta(n) especificidad antitumoral natural tal como células de linfocitos infiltrantes de tumor (TIL, Dudley et al., J Clin Oncol. 31(17) (2013), 2152-2159 (doi: 10.1200/JCO.2012.46.6441)) o (una) célula(s) específica(s) de antígeno clasificada(s) de la sangre periférica de pacientes por su especificidad tumoral por citometría de flujo (Hunsucker et al., Cancer Immunol Res. 3(3) (2015), 228-235 (doi: 10.1158/2326-6066.CIR-14-0001)), la(s) célula(s) descrita(s) en el presente documento solo se transduciría(n) con el receptor quimérico 6 (CXCR6) de la presente divulgación. Sin embargo, la(s) célula(s) T transducida(s) como se da a conocer en el presente documento puede(n) cotransducirse con moléculas de ácido nucleico adicionales, por ejemplo con una secuencia de ácido nucleico que codifica un receptor de células T o un receptor de antígeno quimérico.
Como se usa en el presente documento, el término “receptor de células T” se conoce comúnmente en la técnica. En particular, en el presente documento, el término “receptor de células T” se refiere a cualquier receptor de células T, siempre que se cumplan los siguientes tres criterios: (i) especificidad tumoral, (ii) reconocimiento de (la mayoría de) células tumorales, lo que significa que un antígeno o diana debe expresarse en (la mayoría de) células tumorales y (iii) que el TCR coincida con el tipo de HLA del sujeto que va a tratarse. En este contexto, se conocen en la técnica receptores de células T adecuados, que cumplen los tres criterios mencionados anteriormente, tales como receptores que reconocen WT1 (antígeno 1 específico de tumor Wilms; para información/informaciones de secuencia véase, por ejemplo, Sugiyama, Japanese Journal of Clinical Oncology 40 (2010), 377-87), MAGE (para la secuencia véanse, por ejemplo, los documentos WO-A1 2007/032255 y PCT/US2011/57272), SSX (solicitud provisional estadounidense n.° 61/388.983), NY-ESO-1 (para información/informaciones de secuencia véase, por ejemplo, el documento PCT/GB2005/001924) y/o HER2neu (para información/informaciones de secuencia véase el documento WO-A1
2011/0280894).
El término “receptor de antígeno quimérico” o “receptor quimérico” se conoce en la técnica y se refiere a un receptor constituido por una parte extracelular de un dominio de anticuerpo de cadena sencilla fusionado por una secuencia espadadora a los dominios de señal de CD3z y CD28. De nuevo, este receptor de antígeno quimérico debe proporcionar especificación tumoral y permitir el reconocimiento de la mayoría de las células tumorales. Los receptores quiméricos adecuados incluyen: anti-EGFRv3-CAR (para la secuencia véase el documento WO-A1 2012/138475), anti-CD22-CAR (véase el documento WO-A1 2013/059593), anti-BCMA-CAR (véase el documento WO-A1 2013/154760), anti-CD19-CAR (véanse los documentos WO-A1 2012/079000 o US-A1 2014/0271635), anti-CD123-CAR (véase el documento US-A1 2014/0271582), anti-CD30-CAR (véase el documento WO-A1 2015/028444) o antimesotelina-CAR (véase el documento WO-A1 2013/142034).
La presente invención también se refiere a un método para la producción de (una) célula(s) T transducida(s) que expresa(n) un receptor de quimiocinas 6 (CXCR6), que comprende las etapas de transducir (una) célula(s) T, preferiblemente (una) célula(s) T CD8+, (una) célula(s) T CD4+, (una) célula(s) T yS o (una) célula(s) T citolítica(s) natural(es) (NK), lo más preferiblemente (una) célula(s) T CD8+, con un vector de expresión de la presente invención, cultivar la(s) célula(s) T transducida(s) en condiciones que permitan la expresión de CXCR6 en o sobre dicha(s) célula(s) T transducida(s) y recuperar dicha(s) célula(s) T transducida(s).
La(s) célula(s) T transducida(s) de la presente divulgación se produce(n) preferiblemente mediante/puede(n) obtenerse mediante el siguiente procedimiento: (una) célula(s) T, preferiblemente (una) célula(s) T CD8+, (una) célula(s) T CD4+, (una) célula(s) T yS o (una) célula(s) T citolítica(s) natural(es) (NK), lo más preferiblemente (una) célula(s) T CD8+ se aísla(n)/obtiene(n) de un sujeto, preferiblemente un paciente humano. Los métodos para aislar/obtener (una) célula(s) T, preferiblemente (una) célula(s) T CD8+, (una) célula(s) T CD4+, (una) célula(s) T yS o (una) célula(s) T citolítica(s) natural(es) (NK), lo más preferiblemente (una) célula(s) T CD8+ de (un) paciente(s) o de (un) donante(s) se conocen bien en la técnica y en el contexto de la presente divulgación la(s) célula(s) T, preferiblemente células(s) T CD8+, célula(s) T CD4+, célula(s) T yS o célula(s) T citolítica(s) natural(es) (NK), lo más preferiblemente, célula(s) T CD8+ de (un) sujeto(s)/paciente(s) o de (un) donante(s) puede(n) aislarse mediante extracción de sangre o extracción de médula ósea. Después de aislar/obtener (una) célula(s) T como una muestra del/de los sujeto(s)/paciente(s) o donante(s), la(s) célula(s) T se separa(n) de los otros componentes de la muestra. Se conocen varios métodos para separar célula(s) T de la muestra e incluyen, sin ser limitantes, por ejemplo leucaféresis para obtener (una) célula(s) T de la muestra de sangre periférica de un paciente o de un donante, aislar/obtener células T usando un aparato FACSort, recogiendo célula(s) T viva(s) o muerta(s) de muestras de biopsia recientes que albergan (una) célula(s) T viva(s) a mano o usando un micromanipulador (véanse, por ejemplo, Dudley, Immunother. 26 (2003), 332-342; Robbins, Clin. Oncol. 29 (2011), 917-924 o Leisegang, J. Mol. Med. 86 (2008), 573 58). En el presente documento, el término “biopsia de paciente reciente” se refiere a tejido, preferiblemente tejido tumoral, retirado de un sujeto mediante cirugía o cualquier otro medio conocido, así como (una) línea(s) celular(es) tumoral(es) o (una) célula(s) (aislada(s)) de un tejido tumoral/célula tumoral. La(s) célula(s) T aislada(s)/obtenida(s), preferiblemente célula(s) T CD8+, célula(s) T CD4+, célula(s) T yS o célula(s) T citolítica(s) natural(es) (NK), lo más preferiblemente célula(s) T CD8+, se cultiva(n) y expande(n) posteriormente, por ejemplo, mediante el uso de un anticuerpo anti-CD3, mediante el uso de anticuerpos monoclonales anti-CD3 y anti-CD28 y/o mediante el uso de un anticuerpo anti-CD3, un anticuerpo anti-CD28 y en presencia de citocinas, por ejemplo interleucina-2 (IL-2) y/o interleucina-15 (IL-15) (véanse, por ejemplo, Dudley, Immunother. 26 (2003), 332-342 o Dudley, Clin. Oncol. 26 (2008), 5233-5239).
En una etapa posterior, la(s) célula(s) T se modifica(n)/transduce(n) artificialmente/genéticamente mediante métodos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Lemoine, J Gene Med 6 (2004), 374-386). En la técnica se conocen métodos para transducir (una) célula(s), particularmente (una) célula(s) T, e incluyen, sin limitarse, en un caso en el que se transduce ácido nucleico o un ácido nucleico recombinante, por ejemplo, un método de electroporación, método de fosfato de calcio, método de lípidos catiónicos o método de liposomas. El ácido nucleico que va a transducirse puede transducirse de manera convencional y altamente eficientemente usando un reactivo de transfección disponible comercialmente, por ejemplo, Lipofectamine (fabricado por Invitrogen, n.° de catálogo 11668027). En un caso donde se usa un vector, el vector puede transducirse de la misma manera que el ácido nucleico mencionado anteriormente siempre que el vector sea un vector plasmídico (es decir, un vector que no es un vector viral). Métodos para transducir (una) célula(s) T incluye(n) transducción de células T retroviral o lentiviral, así como transfección de ARNm. “Transfección de ARNm” se refiere a un método bien conocido por los expertos en la técnica para expresar transitoriamente una proteína de interés, como en el presente caso el CXCR6, en (una) célula(s) T que va(n) a transducirse. En resumen (una(s) célula(s) T puede(n) someterse a electroporación con el ARNm que codifica para el CXCR6 descrito en el presente documento usando un sistema de electroporación (tal como por ejemplo Gene Pulser, Bio-Rad) y posteriormente cultivarse mediante un protocolo de cultivo celular (por ejemplo, célula T) convencional como se describió anteriormente (véase Zhao et al., Mol Ther. 13(1) (2006), 151-159). Preferiblemente, la(s) célula(s) T transducida(s) es(son) (una) célula(s) T CD8+, (una) célula(s) T CD4+, (una) célula(s) T yS o (una) célula(s) T citolítica(s) natural(es) (NK), o lo más preferiblemente (una) células(s) T CD8+, y se genera(n) por transducción lentiviral o, lo más preferiblemente, transducción retroviral de células T.
En este contexto, en la técnica se conocen vectores retrovirales adecuados para transducir (una) célula(s) T tales como SAMEN CMV/SRa (Clay et al., J. Immunol. 163 (1999), 507-513), LZRS-id3-IHRES (Heemskerk et al., J. Exp. Med. 186 (1997), 1597-1602), FeLV (Neil et al., Nature 308 (1984), 814-820), SAX (Kantoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986), 6563-6567), pDOL (Desiderio, J. Exp. Med. 167 (1988), 372-388), N2 (Kasid et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990), 473-477), LNL6 (Tiberghien et al., Blood 84 (1994), 1333-1341), pZipNEO (Chen et al., J. Immunol. 153 (1994), 3630-3638), LASN (Mullen et al., Hum. Gene Ther. 7 (1996), 1123-1129), pG1XsNa (Taylor et al., J. Exp. Med. 184 (1996), 2031-2036), LCNX (Sun et al., Hum. Gene Ther. 8 (1997), 1041-1048), SFG (Gallardo et al., Blood 90 (1997), LXSN (Sun et al., Hum. Gene Ther. 8 (1997), 1041-1048), SFG (Gallardo et al., Blood 90 (1997), 952-957), HMB-Hb-Hu (Vieillard et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (1997), 11595-11600), pMV7 (Cochlovius et al., Cancer Immunol. Immunother. 46 (1998), 61-66), pSTITCH (Weitjens et al., Gene Ther 5 (1998), 1195-1203), pLZR (Yang et al., Hum. Gene Ther. 10 (1999), 123-132), pBAG (Wu et al., Hum. Gene Ther. 10 (1999), 977-982), rKat.43.267bn (Gilham et al., J. Immunother. 25 (2002), 139-151), pLGSN (Engels et al., Hum. Gene Ther. 14 (2003), 1155-1168), pMP71 (Engels et al., Hum. Gene Ther. 14 (2003), 1155-1168), pGCSAM (Morgan et al., J. Immunol. 171 (2003), 3287-3295), pMSGV (Zhao et al., J. Immunol. 174 (2005), 4415-4423) o pMX (de Witte et al., J. Immunol. 181 (2008), 5128-5136). Vectores lentivirales adecuados para transducir células T son, por ejemplo, vector lentiviral PL-SIN (Hotta et al., Nat Methods. 6(5) (2009), 370-376), p156RRL-sinPPT-CMV-GFP-PRE/Mel (Campeau et al., PLoS One 4(8) (2009), e6529), pCMVR8.74 (n.° de catálogo de Addgene 22036), FUGW (Lois et al., Science 295(5556) (2002), 868-872, pLVX-EF1 (n.° de catálogo de Addgene 64368), pLVE (Brunger et al., Proc Natl Acad Sci U S A 111(9) (2014), E798-806), pCDH1-MCS1-EF1 (Hu et al., Mol Cancer Res. 7(11) (2009), 1756-1770), pSLIK (Wang et al., Nat Cell Biol. 16(4) (2014), 345-356), pLJM1 (Solomon et al., Nat Genet. 45(12) (2013), 1428-30), pLX302 (Kang et al., Sci Signal. 6(287) (2013), rs13), pHR-IG (Xie et al., J Cereb Blood Flow Metab. 33(12) (2013), 1875-85), pRRLSIN (n.° de catálogo de Addgene 62053), pLS (Miyoshi et al., J Virol. 72(10) (1998), 8150-8157), pLL3.7 (Lazebnik et al., J Biol Chem. 283(7) (2008), 11078-82), FRIG (Raissi et al., Mol Cell Neurosci. 57 (2013), 23-32), pWPT (Ritz-Laser et al., Diabetologia. 46(6) (2003), 810-821), pBOB (Marr et al., J Mol Neurosci. 22(1-2) (2004), 5 11) o pLEX (n.° de catálogo de Addgene 27976).
La(s) célula(s) T transducida(s) de la presente divulgación se cultiva(n) preferiblemente en condiciones controladas, fuera de su entorno natural. En particular, el término “cultivo” significa que las células (por ejemplo la(s) célula(s) T transducida(s) como se da a conocer en el presente documento), que se derivan de eucariotas multicelulares, preferiblemente de un paciente humano, se cultivan in vitro. El cultivo de células es una técnica de laboratorio para mantener las células vivas, que están separadas de su fuente de tejido original. En el presente documento, la(s) célula(s) T transducida(s) se cultiva(n) en condiciones que permiten la expresión del CXCR6 descrito en el presente documento en o sobre dicha(s) célula(s) T transducida(s). Las condiciones que permiten la expresión o un transgén (es decir, del CXCR6 descrito en el presente documento) se conocen comúnmente en la técnica e incluyen, por ejemplo, anticuerpos agonistas anti-CD3 y anti-CD28 y la adición de citocinas tales como interleucina 2 (IL-2), interleucina 7 (IL-7), interleucina 12 (IL-12) y/o interleucina 15 (IL-15). Después de la expresión del CXCR6 descrito en el presente documento en la(s) célula(s) T transducida(s) cultivada(s), la(s) célula(s) T transducida(s) se recupera(n) (es decir, se reextrae(n)) del cultivo (es decir, del medio de cultivo).
La invención también abarca (una) célula(s) T transducida(s) que expresa(n) un receptor de quimiocinas 6 (CXCR6) como se codifica por un vector de expresión de la invención producido por/que puede obtenerse por el método de la presente invención.
Además, se proporciona una composición farmacéutica/medicamento que comprende (una) célula(s) T transducida(s) que expresa(n) un receptor de quimiocinas 6 (CXCR6) codificado por una secuencia de ácido nucleico de la presente divulgación o una célula T transducida como se obtiene por/producida por el método dado a conocer anteriormente. Dicha composición es una composición farmacéutica que comprende además, opcionalmente, formulaciones adecuadas de portador, estabilizadores y/o excipientes.
Como se usa en el presente documento, el término “medicamento” se usa indistintamente con el término “composición farmacéutica” y se refiere a una composición para su administración a un paciente, preferiblemente un paciente humano. En consecuencia, se proporciona (una) célula(s) T transducida(s), preferiblemente (una) célula(s) T CD8+, (una) célula(s) T CD4+, (una) célula(s) T yS o (una) célula(s) T citolítica(s) natural(es) (NK), lo más preferiblemente (una) célula(s) T CD8+, que expresan un receptor de quimiocinas 6 (CXCR6) codificado por una molécula de ácido nucleico de la divulgación, o producido/que puede obtenerse por el método de la presente divulgación para su uso como medicamento. El medicamento/composición farmacéutica va a administrarse a un paciente del que se aisló/aislaron/obtuvo/obtuvieron célula(s) T transducida(s). El paciente se refiere a un paciente humano. Además, en el contexto de la presente divulgación, ese paciente padece una enfermedad caracterizada por la sobreexpresión de CXCL16. En la técnica se conocen enfermedades que se caracterizan por la sobreexpresión de CXCL16 e incluyen, por ejemplo, cáncer colorrectal (Wagsater et al., Int J Mol Med. 14(1) (2004), 65-69), cáncer cerebral (Ludwig et al., J Neurochem. 93(5) (2005), 1293-1303), cáncer de ovario (Son et al., Cancer Biol Ther. 6(8) (2007), 1302-1312), cáncer de próstata (Lu et al., Mol Cancer Res. 6(4) (2008), 546-554), cáncer pancreático (Wente et al., Int J Oncol. 33(2) (2008), 297-308), cáncer de mama (Matsumura et al., J Immunol. 181(5) (2008), 3099-3107), cáncer renal (Gutwein et al., Eur J Cancer. 45(3) (2009), 478-89), carcinoma nasofaríngeo (Parsonage et al., Am J Pathol. 180(3) (2012), 1215-22), carcinoma hepatocelular (Gao et al., Cancer Res. 72(14) (2012), 3546-3556), cáncer gástrico (Xing et al., Hum Pathol. 43(12) (2012), 2299-2307), cáncer de cuello uterino (Huang et al., Chin J Cancer. 32(5) (2013), 289-296),
cáncer de vejiga (Lee et al., Oncol Lett. 5(1) (2013), 229-235), linfoma (Liu et al., Oncol Rep. 30(2) (2013), 783-792), sarcoma (Na et al., Hum Pathol. 45(4) (2014), 753-760) o cáncer de pulmón (Hu et al., PLoS One. 9(6) (2014), e990562014). En consecuencia, la enfermedad caracterizada por la sobreexpresión de CXCL16 se refiere a una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en cáncer colorrectal, cáncer cerebral, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer pancreático, cáncer de mama, cáncer renal, carcinoma nasofaríngeo, carcinoma hepatocelular, cáncer gástrico, cáncer de cuello uterino, cáncer de vejiga, linfoma, sarcoma y cáncer de pulmón.
La composición farmacéutica que comprende (una) célula(s) T transducida(s) de la presente divulgación o (una) célula(s) T transducida(s) producida(s)/obtenible(s) por el método de la presente divulgación va a administrarse en combinación con protocolos de tratamiento intermedios. Ejemplos de tales protocolos de tratamiento intermedios incluyen, pero no se limitan a, administración de analgésicos, administración de agentes quimioterápicos, manejo quirúrgico de la enfermedad o un síntoma de la misma. Por consiguiente, los regímenes de tratamiento como se dan a conocer en el presente documento abarcan la administración de la(s) célula(s) T transducida(s) que expresa(n) un CXCR6 como se describe en el presente documento junto con ninguno, uno o más de un protocolo de tratamiento adecuado para el tratamiento o la prevención de una enfermedad, o un síntoma de la misma, como se describe en el presente documento o como se conoce en la técnica.
En consecuencia, las célula(s) T transducida(s) que expresan el receptor de quimiocinas 6 (CXCR6) codificado por una secuencia de ácido nucleico de la presente divulgación pueden usarse para el tratamiento de una enfermedad proliferativa, preferiblemente cáncer. Más preferiblemente, la(s) célula(s) T transducida(s) proporcionada(s) en el presente documento que expresa(n) el receptor de quimiocinas 6 (CXCR6) como se describe en el presente documento se usa(n) para el tratamiento de una enfermedad (preferiblemente un cáncer), que se caracteriza por la sobreexpresión de CXCL16. Los tipos de cáncer que se tratan preferiblemente con la célula T transducida proporcionada en el presente documento que expresa el receptor de quimiocinas 6 (CXCR6) se describieron anteriormente en el presente documento. Por lo tanto, la(s) célula(s) T transducida(s) que expresa(n) un receptor de quimiocinas 6 (CXCR6) codificado por una secuencia de ácido nucleico descrita en el presente documento puede(n) usarse en un método de tratamiento de cualquier enfermedad en la que las células tumorales sobreexpresan CXCL16. El método de tratamiento implica preferiblemente la recogida de células mediante un método descrito anteriormente como aislamiento/recogida de las células mediante extracción de sangre o extracción de médula ósea. Posteriormente, la(s) célula(s) aislada(s) se modifica(n) viralmente o mediante electroporación de ARNm con el receptor de fusión (y opcionalmente se cotransduce(n) con moléculas de ácido nucleico adicionales, por ejemplo con una secuencia de ácido nucleico que codifica (un) receptor(es) de células T o (un) receptor(es) quimérico(s)). Después de la expansión celular, como se explicó anteriormente, la(s) célula(s) T transducida(s), preferiblemente célula(s) T CD8+, célula(s) T CD4+, célula(s) T y8 o célula(s) T citolítica(s) natural(es) (NK), lo más preferiblemente célula(s) T CD8+, se transfiere(n) por vía intravenosa de nuevo al paciente. Además, se proporciona un método para el tratamiento de enfermedades que comprende las etapas de aislar (una) célula(s) T, preferiblemente (una) célula(s) T CD8+, (una) célula(s) T CD4+, (una) células T y8 o (una) células T citolíticas naturales (NK), lo más preferiblemente (una) célula(s) T CD8+, de un sujeto, transducir dicha(s) célula(s) T aislada(s) con un ácido nucleico que codifica el receptor de quimiocinas 6 (CXCR6) como se describió anteriormente en el presente documento, cotransducir dicha(s) célula(s) T aislada(s) con moléculas de ácido nucleico adicionales, por ejemplo con una secuencia de ácido nucleico que codifica (un) receptor de células T o (un) receptor(es) quimérico(s) como se describió anteriormente, expandir la(s) célula(s) T transducida(s) y administrar la(s) célula(s) T transducida(s) de nuevo a dicho sujeto. Este método de tratamiento descrito en el presente documento puede repetirse por ejemplo una o dos veces por semana.
También se proporciona un método para el tratamiento de una enfermedad caracterizada por la sobreexpresión de CXCL16 en un sujeto que comprende las etapas de
(a) aislar (una) célula(s) T, preferiblemente (una) célula(s) T CD8+, (una) célula(s) T CD4+, (una) célula(s) T y8 o (una) célula(s) T citolítica(s) natural(es) (NK), lo más preferiblemente (una) célula(s) T CD8+, de un sujeto;
(b) transducir dicha(s) (una) célula(s) T aislada(s), por ejemplo, (una) célula(s) T CD8+, con un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en:
(i) una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1 o 3, y
(ii) una secuencia de ácido nucleico que es al menos el 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 1 o 3 y que se caracteriza por tener una actividad de receptor de quimiocinas 6 (CXCR6); y
(c) administrar dicha(s) célula(s) T transducida(s), por ejemplo célula(s) T CD8+, a dicho sujeto.
Dicha(s) célula(s) T transducida(s), por ejemplo, célula(s) T CD8+, se administra(n) a dicho sujeto mediante infusión intravenosa.
Además, se proporciona un método para el tratamiento de una enfermedad caracterizada por la sobreexpresión de CXCL16 que comprende las etapas de
(a) aislar (una) célula(s) T, preferiblemente (una) célula(s) T CD8+, (una) célula(s) T CD4+, (una) célula(s) T y8 o (una) célula(s) T citolítica(s) natural(es) (NK), lo más preferiblemente (una) célula(s) T CD8+, de un sujeto;
(b) transducir dicha(s) célula(s) T aislada(s), por ejemplo, (una) célula(s) T CD8+, con un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en:
(i) una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1 o 3, y
(ii) una secuencia de ácido nucleico que es al menos el 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 1 o 3 y que se caracteriza por tener una actividad de receptor de quimiocinas 6 (CXCR6); y
(c) cotransducir dicha(s) célula(s) T aislada(s), por ejemplo, (una) célula(s) T CD8+, con (un) receptor(es) de células T;
(d) expandir la(s) célula(s) T, por ejemplo, (una) célula(s) T CD8+, mediante, por ejemplo, anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28; y
(e) administrar la(s) célula(s) T transducida(s), por ejemplo célula(s) T CD8+, a dicho sujeto.
Los términos “tratamiento”, “tratar” y similares se usan en el presente documento para significar generalmente obtener un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado. El efecto puede ser profiláctico en cuanto a prevenir completa o parcialmente una enfermedad o síntoma de la misma y/o puede ser terapéutico en cuanto a curar parcial o completamente una enfermedad y/o efecto adverso atribuido a la enfermedad. El término “tratamiento” como se usa en el presente documento cubre cualquier tratamiento de una enfermedad en un sujeto e incluye: (a) prevenir y/o mejorar la aparición de una enfermedad proliferativa (preferentemente cáncer) en un sujeto que puede estar predispuesto a la enfermedad; (b) inhibir la enfermedad, es decir, detener su desarrollo, como la inhibición de la progresión del cáncer; o (c) aliviar la enfermedad, es decir, provocar la regresión de la enfermedad, como la represión del cáncer. Preferiblemente, el término “tratamiento” como se usa en el presente documento se refiere a la intervención médica de un trastorno ya manifiesto, como el tratamiento de un cáncer diagnosticado.
El “sujeto” (o “paciente”) puede ser un vertebrado e incluye tanto seres humanos como otros animales, particularmente mamíferos, y otros organismos. Por lo tanto, los métodos proporcionados en el presente documento son aplicables tanto a terapia humana como a aplicaciones veterinarias. En consecuencia, dicho sujeto puede ser un animal tal como un ratón, rata, hámster, conejo, cobayas, hurón, gato, perro, pollo, ovejas, especies bovinas, caballo, camello o primate. Preferiblemente, el sujeto es un mamífero. Lo más preferiblemente, el sujeto es un ser humano.
Como se describió anteriormente, la presente divulgación se refiere a una “composición farmacéutica” que comprende la célula T transducida proporcionada en el presente documento que expresa el receptor de quimiocinas 6 (CXCR6) descrito en el presente documento (codificado por la molécula de ácido nucleico de la presente divulgación). Dicha composición farmacéutica puede comprender además un portador, excipiente y/o diluyente farmacéuticamente aceptable. Ejemplos de portadores farmacéuticos adecuados se conocen bien en la técnica e incluyen soluciones salinas tamponadas con fosfato, agua, emulsiones, tales como emulsiones de aceite/agua, diversos tipos de agentes humectantes, disoluciones estériles, etc. El portador puede ser una disolución que es isotónica con la sangre del receptor. Pueden formularse composiciones que comprenden tales portadores mediante métodos convencionales bien conocidos. El régimen de dosificación lo determinará el médico encargado y factores clínicos. Como es bien sabido en las técnicas médicas, las dosificaciones para cualquier paciente dependen de muchos factores, incluyendo el tamaño del paciente, el área de superficie corporal, la edad, el compuesto particular que va a administrarse, el sexo, el momento y la vía de administración, la salud general, y otros fármacos que se administran simultáneamente. Por ejemplo, la composición farmacéutica puede administrarse al sujeto en una dosis de 104 a 1010 células T/kg de peso corporal, preferiblemente de 105 a 106 células T/kg de peso corporal. La composición farmacéutica puede administrarse de tal manera que se realice un aumento a escala de las células T que van a administrarse comenzando con una dosis objeto de aproximadamente 105 a 106 células T/kg de peso corporal y luego aumentando hasta la dosis de 1010 células T/kg de peso corporal. La composición farmacéutica puede administrarse por vía intravenosa (es decir, por infusión intravenosa) pero también por vía intraperitoneal, intrapleural, intratecal, subcutánea o intranodal. Los portadores intravenosos incluyen reabastecedores de fluidos y nutrientes, reabastecedores de electrolitos (tales como los basados en dextrosa de Ringer), y conservantes similares y otros aditivos también pueden estar presentes en la composición farmacéutica, tales como, por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, gases inertes y similares.
La composición farmacéutica puede usarse en terapia conjunta junto con, por ejemplo, moléculas capaces de proporcionar una señal de activación para células efectoras inmunitarias, para proliferación celular o para estimulación celular. Dicha molécula puede ser, por ejemplo, una señal de activación primaria adicional para células T (por ejemplo una molécula coestimuladora adicional: moléculas de la familia de B7, Ox40L, 4.1 BBL, CD40L, anti-CTLA-4, anti-PD-1), o una citocina adicional interleucina (por ejemplo, IL-2).
Los componentes de la composición farmacéutica que van a usarse para la administración terapéutica son preferiblemente estériles. La esterilidad puede lograrse fácilmente mediante, por ejemplo, filtración a través de membranas de filtración estériles (por ejemplo, membranas de 0,2 micrómetros). La composición farmacéutica puede prepararse poniendo en contacto los componentes de la composición farmacéutica de manera uniforme con portadores líquidos. Después de su producción, la composición farmacéutica puede colocarse en un recipiente que tiene un puerto de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa o vial de disolución intravenosa que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica.
También se proporciona un método para el tratamiento de enfermedades que se caracterizan por sobreexpresar CXCL16 tal como, por ejemplo, cáncer colorrectal, cáncer cerebral, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer pancreático, cáncer de mama, cáncer renal, carcinoma nasofaríngeo, carcinoma hepatocelular, cáncer gástrico, cáncer de cuello uterino, cáncer de vejiga, linfoma, sarcoma o cáncer de pulmón que comprende la administración de una célula T transducida como se describe en el presente documento a un sujeto. En el contexto de la presente divulgación, dicho sujeto es un ser humano (como se explicó anteriormente). También se proporciona un método para el tratamiento de una enfermedad que comprende las etapas de aislar (una) célula(s) T, preferiblemente (una) célula(s) T CD8+, (una) célula(s) T CD4+, (una) célula(s) T yS o (una) célula(s) T citolítica(s) natural(es) (NK), lo más preferiblemente (una) célula(s) T CD8+, de un sujeto, transducir dicha(s) células(s) T aislada(s) con un ácido nucleico que codifica el receptor de quimiocinas 6 (CXCR6) como se describió anteriormente en el presente documento o con un vector que comprende un ácido nucleico que codifica el CXCR6 como se describió anteriormente en el presente documento, y administrar las células T transducidas a dicho sujeto. Dichas células T transducidas se administran a dicho sujeto por infusión intravenosa. Además, se proporciona un método para el tratamiento de enfermedades que comprende las etapas de aislar células T, preferiblemente células T CD8+, células T CD4+, células T yS o células T citolíticas naturales (NK), lo más preferiblemente células T CD8+, de un sujeto, transducir dichas células T aisladas con un ácido nucleico que codifica el receptor de quimiocinas 6 (CXCR6) como se describió anteriormente en el presente documento, cotransducir dicha(s) célula(s) T aislada(s) con moléculas de ácido nucleico adicionales, por ejemplo con una secuencia de ácido nucleico que codifica (un) receptor(es) de células T o (un) receptor(es) quimérico(s) como se describió anteriormente, expandir las células transducidas y administrar las células transducidas de nuevo a dicho sujeto.
La etapa de expansión mencionada anteriormente de la(s) célula(s) T transducida(s) puede realizarse en presencia de citocinas (estimulantes) tales como interleucina-2 (IL-2) y/o interleucina-15 (IL-15). La etapa de expansión también puede realizarse en presencia de interleucina-12 (IL-12), interleucina-7 (IL-7) y/o interleucina-21 (IL-21). Según la presente invención, la etapa de expansión de la(s) célula(s) T transducida(s) también puede realizarse en presencia de anticuerpos anti-CD3 y/o anti-CD28.
Como se describe en el presente documento, se proporciona un kit que comprende la molécula de ácido nucleico de la divulgación, el vector de la divulgación y/o la(s) célula(s) T transducida(s) de la divulgación. En el contexto de la presente divulgación, se proporciona un kit para incorporar una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en (a) una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, y (b) una secuencia de ácido nucleico, que es al menos el 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 1 y que se caracteriza por tener una actividad de receptor de quimiocinas 6 (CXCR6) en una célula T CD8+ que comprende un vector de la presente divulgación. Por lo tanto, los métodos de tratamiento proporcionados en el presente documento pueden realizarse usando este kit. Ventajosamente, el kit comprende además opcionalmente (un) tampón/tampones de reacción, disoluciones de almacenamiento (es decir, conservantes), soluciones de lavado y/o reactivos o materiales restantes requeridos para la realización de los ensayos descritos en el presente documento. Además, partes del kit pueden envasarse individualmente en viales o frascos o en combinación en recipientes o unidades de múltiples recipientes. Además, el kit puede contener instrucciones de uso. La fabricación del kit sigue preferentemente procedimientos convencionales, que conoce el experto en la técnica. Como se mencionó anteriormente, el kit proporcionado en el presente documento es útil para tratar a un sujeto, preferiblemente un paciente humano, que tiene una enfermedad que se caracteriza por la sobreexpresión de CXCL16 tal como, por ejemplo, cáncer colorrectal, cáncer cerebral, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer pancreático, cáncer de mama, cáncer renal, carcinoma nasofaríngeo, carcinoma hepatocelular, cáncer gástrico, cáncer de cuello uterino, cáncer de vejiga, linfoma, sarcoma o cáncer de pulmón.
Las figuras muestran
Figura 1: Inducción de CXCL16 por células de cáncer pancreático Panc02-OVA y T110299 tras estimulación con IFN-y o TNF-a
Se sembraron células tumorales (es decir, líneas celulares de cáncer pancreático Panc02-OVA y T110299) (0,01 x 106/pocillo) en una placa de 96 pocillos (fondo plano) y se estimularon con IFN-y recombinante (20 ng/ml) o TNF-a (20 ng/ml) (Peprotech, Hamburgo). Los sobrenadantes se recogieron después de 48 horas. La secreción de CXCL16 se midió con un kit de ELISA de CXCL16 (R&D Systems, Inc., MN, EE. u U.). Como se muestra en la figura, las líneas celulares de cáncer pancreático Panc02-OVA y T110299 liberan CXCL16 en presencia y ausencia de IFN-y y TNF-a
in vitro.
Figura 2: Inducción de CXCL16 a partir de células de cáncer pancreático Panc02-OVA y T110299 tras cocultivo con células T específicas de antígeno
Las líneas celulares de cáncer pancreático Panc02-OVA y T110299 (0,03 x 106/pocillo) se cocultivaron (0,3 x 106/pocillo) con células T (razones de 1:1 - 10:1) en placas de 96 pocillos (fondo plano). Los sobrenadantes se recogieron después de 48 horas. La secreción de CXCL16 se midió con un kit de ELISA de CXCL16 (R&D Systems, Inc., MN, EE. UU.). Como se muestra en la figura 2, el reconocimiento de antígenos en el contexto de MHC por células T específicas de antígeno (células T OT-1, específicas de OVA) en la superficie de las células de cáncer pancreático Panc02-OVA y T110299 induce la liberación de CXCL16 de las células de cáncer pancreático.
Figura 3: Expresión de CXCL16 en ratones que portan tumores Panc02-OVA y T110299
Se analizó la expresión de CXCL16 en ratones que portan tumores a lo largo del tiempo en diferentes órganos. A ratones hembra C57BL/6J (4 por grupo) (Janvier, Francia (número de cat. 2014-07-DE-RM-20)) se les inyectó por vía subcutánea células tumorales Panc02-OVA (Jacobs et al. Int J Cancer 128 (2011), 128) o T110299 (Düwell et al., Cell Death Differ 21(12) (2014), 1825-1837) a una concentración de 2 x 106 células por ratón. Los órganos y tumores se analizaron después de una, dos o tres semanas de inducción y se congelaron en nitrógeno líquido. Después de la determinación del contenido de proteína por el método de Bradford (Bio Rad, Múnich), se midió la expresión de CXCL16 con un kit de ELISA de CXCL16 (R&D Systems, Inc., MN, EE. UU.). Se encontró que el sitio del tumor era el sitio con la mayor expresión de CXCL16 tanto en tumores Panc02-OVA como T110299.
Figura 4: Migración de células T transducidas con CXCR6 hacia un gradiente de CXCL16 recombinante
Se compararon células T CD8+ transducidas con CXCR6 (SEQ ID NO: 3 (ADNc); 4 (proteína)) y células T CD8+ transducidas con GFP por su capacidad para migrar hacia un gradiente de CXCL16. Se usó medio de migración (BSA al 0,5 % en medio RPM i) con o sin CXCL16 recombinante (SEQ ID NO: 9; diluciones en serie desde 50 ng/ml hasta 3,125 ng/ml) (Peprotech, Hamburgo) en la cámara inferior y células T en la cámara superior (1 x 106 células/pocillo) de una placa de 96 pocillos Transwell. Después de 3 horas, las células T migradas se resuspendieron con perlas de recuento (Life Techonologies, Carlsbad, CA, EE. UU.) para la cuantificación. La capacidad migratoria se analizó como número de células y expresión de GFP por citometría de flujo (BD FACS Canto II). Como se muestra en la figura 4, las células T transducidas con CXCR6 (SEQ ID NO: 3 (ADNc); 4 (proteína)) migran específica y dependientemente de la dosis hacia CXCL16, lo que no se observa en células T que solo se transdujeron con GFP (SEQ ID NO: 11 (ácido nucleico); 12 (proteína)). La figura 4B muestra que la migración es específica ya que el enriquecimiento de GFP solo se observa en las células T transducidas con CXCR6. Los valores de p se representan en la figura, ** indica p < 0,01 y *** p < 0,001.
Figura 5: Migración de células T transducidas con CXCR6 y GFP hacia el sobrenadante de células de cáncer pancreático
Se sembraron células tumorales (es decir, células T110299) se sembraron en una placa de 6 pocillos (1 x 106 células/pocillo) y se estimularon con IFN-y y TNF-a recombinantes (20 ng/ml) (Peprotech, Hamburgo). Después de 48 horas, los sobrenadantes se incubaron 30 min con o sin anticuerpo neutralizante anti-CXCL16 (2 |ig/ml) (R&D Systems, Inc., MN, EE. UU., policlonal). Se sembraron células T CD8+ transducidas con CXCR6 (s Eq ID No : 3 (ADNc); 4 (proteína)) y células T CD8+ que solo se transdujeron con GFP (SEQ ID NO: 11 (ácido nucleico); 12 (proteína)) a 1 x 106 células/pocillo. Después de 3 horas, las células T migradas se resuspendieron con perlas de recuento (Life Techonologies, Carlsbad, Ca , EE. UU.) para la cuantificación. La migración se cuantificó como número de células y expresión de GFP por citometría de flujo. Como se muestra en la figura 5A, las células T transducidas con CXCR6 (s Eq ID NO: 3 (ADNc); 4 (proteína) migran específicamente hacia sobrenadantes de células T110299, lo que no se observa con células T transducidas con GFP (SEQ ID NO: 11 (ácido nucleico/ADNc); 12 (proteína)). La figura 5B muestra que la migración es específica ya que el enriquecimiento de GFP solo se observa en células T transducidas con CXCR6. Los valores de p se representan en la figura, ** indica p < 0,01 y *** p < 0,001.
Figura 6: Activación de células T transducidas con CXCR6 en comparación con transducidas con GFP en cocultivo con células tumorales T110299 o Panc02-OVA
Las líneas celulares de cáncer pancreático Panc02-OVA y T110299 (1 x 104/pocillo) se cocultivaron con células T (razones de 1:1 a 1:10) en placas de 96 pocillos (fondo plano). Los sobrenadantes se recogieron después de 3, 8, 12, 24, 30 y 36 horas de cocultivo. El nivel de activación se midió como secreción de IFN-y por ELISA (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, EE. UU.). Como se muestra en las figuras 6A y 6B, las células T transducidas con CXCR6 (SEQ ID NO: 3 (ADNc); 4 (proteína) muestran un reconocimiento mejorado de T110299 y Panc02-OVA en comparación con células T transducidas con GFP (SEQ ID NO: 11 (ácido nucleico/ADNc); 12 (proteína)). Los valores de p se representan en las figuras 6A y 6B, * indica p < 0,05, ** p < 0,01; *** p < 0,001.
Figura 7: Lisis de células tumorales Panc02-OVA por células OT-1-T transducidas con CXCR6 frente a GFP
La línea celular de cáncer pancreático Panc02-OVA (3 x 105 células/pocillo) se cocultivó con células T CD8+ transducidas con CXCR6 (Se Q ID NO: 3 (ADNc); 4 (proteína)) en placas de 96 pocillos (fondo plano). Los sobrenadantes se recogieron después de 5 horas de cocultivo. La citotoxicidad se midió como liberación de LDH (Promega Corporation, Madison, WI, EE. UU.; véase la figura 7A), y el nivel de activación como secreción de IFN-y por ELISA (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, EE. UU.; véase la figura 7B). Como se muestra en la figura, las células T transducidas con CXCR6 (SEQ ID NO: 3 (ADNc); 4 (proteína)) tienen una capacidad de lisis mejorada y dependiente de la dosis de células T de las células tumorales Panc02-OVA en comparación con las células T OT-1 que solo se transdujeron con GFP (SEQ ID NO: 11 (ácido nucleico/ADNc); 12 (proteína)). El valor de p se representa en la figura, ** indica p < 0,01.
Figura 8: Migración de células T OT-1 transducidas con CXCR6 hacia células Panc02-OVA-CXCL16 y posterior lisis de estas células tumorales en comparación con células T OT-1 transducidas con GFP
La línea celular de cáncer pancreático Panc02-OVA se transdujo con CXCL16 (SEQ ID NO: 7 (ADNc) y 8 (proteína); el número de entrada Uniprot de CXCL16 murino/ratón es Q8BSU2 (número de registro con el número de versión de entrada 102 y versión 2 de la secuencia)). Se recubrió una placa de 96 pocillos Transwell con polilisina (100 |ig/ml/pocillo) (Sigma Aldrich, Steinheim). Se sembraron células tumorales (1 x 105/pocillo) en la cámara inferior y se incubaron durante 12 horas. Se administraron células T (8 x 105 células/pocillo) en la cámara superior. Después de 2 horas, se detuvo la migración retirando la cámara superior. Después de 2 horas adicionales, se detuvo la destrucción de las células tumorales midiendo la secreción de LDH e IFN-y por ELISA. Para la cuantificación de la migración, las células T se tiñeron con un anticuerpo anti-CD8 marcado con APC (Biolegend, San Diego, CA, EE. UU., clon 53-6.7) y se resuspendieron con perlas de recuento (Life Techonologies, Carlsbad, CA, EE. UU.). La migración se analizó como número de células y expresión de GFP por citometría de flujo. Como se muestra en la figura 8A, las células T OT-1 transducidas con CXCR6 migran específicamente hacia células tumorales productoras de CXCL16. La figura 8B demuestra que la migración hacia las células tumorales de CXCL16 es específica. Posteriormente, las células T migradas lisaron estas células tumorales (como se muestra en la figura 8C). La lisis tumoral se correlacionó con la activación de las células T medida por la liberación de IFNy (véase la figura 8D). La migración, destrucción y activación es superior a la actividad de células T transducidas con GFP. Los valores de p se representan en la figura, * indica p < 0,05, ** p < 0,01; *** p < 0,001 y ns no significativo.
Figura 9: Tratamiento de tumores Panc02-OVA establecidos en ratones con células T OT-1 transducidas con GFP o CXCR6
A ratones hembra C57BL/6J (5 por grupo) (Janvier, Frankreich, número de cat. 2014-07-DE-RM-20) se les inyectaron células tumorales Panc02-OVA (2 x 106/ratones) por vía subcutánea. Después de 7 días, las células T se transfirieron adoptivamente a través de la vena de la cola (10 x 106 células por ratón). La eficacia terapéutica se midió como crecimiento tumoral cada dos días. Como se muestra en la figura, el tratamiento de tumores Panc02-OVA establecidos con células T OT-1 transducidas con CXCR6 conduce a una actividad antitumoral superior en comparación con las células T OT-1 transducidas con GFP.
Figura 10: Producción de CXCL16 por células dendríticas derivadas de BM
Se aisló médula ósea de un ratón C57BL/6J (Janvier, Francia, número de cat. 2014-07-DE-RM-20) Se cultivaron células de médula ósea con GM-CSF recombinante (20 ng/ml) (Peprotech, Hamburgo) durante siete días. Se sembraron células dendríticas derivadas de médula ósea (BM-DC, 104 por pocillo) en una placa de 96 pocillos (fondo plano) y se estimularon con proteínas recombinantes (20 ng/ml) (TNF-a, IFN-y o IL-4, Peprotech, Hamburgo; o R848 Enzo Life Science, Lorrach). Los sobrenadantes se recogieron después de 48 horas. La secreción de CXCL16 se midió mediante ELISA (R&D Systems, Inc., MN, EE. UU., policlonal). Como se muestra en la figura, las células dendríticas derivadas de médula ósea producen cantidades sustanciales de CXCL16, que pueden mejorarse aún más por diferentes estímulos.
Figura 11: Agrupamiento de células T transducidas con CXCR6 y pMX a células dendríticas
Se tiñeron células T con dos colorantes ligadores de células PKH diferentes (Sigma Aldrich, Steinheim). Se verificó la eficiencia de tinción con citometría de flujo. Se diluyeron células T positivas para CXCR6 (3 x 104 células por pocillo) en una razón 1:1 con células T transducidas con control. Los números de células T se equilibraron mediante resuspensión de muestras diluidas 1:1 de células T con perlas de recuento (Life Techonologies, Carlsbad, CA, EE. UU.) y cuantificación de células viables teñidas mediante citometría de flujo. Se estimularon BM-DC con el péptido OVA257-264 (SEQ ID NO: 10; 1 |ig/ml) (Invivogen, San Diego, CA, EE. UU.) y CpG (3 |ig/ml) (Coley Pharmaceutical Group, Düsseldorf) en placas de 96 pocillos (3 x 103 por pocillo) y se cocultivaron con células T a una razón 1:10 durante 3 horas parcialmente en presencia o ausencia de anticuerpo anti-ICAM1a (0,5 mg/ml) (BioXCell, NH, EE. UU., clon YNI.7.4) o anticuerpo neutralizante anti-CXCL16 (10 |ig/ml) (R&D Systems, Inc., MN, EE. UU., policlonal) durante 3 horas. Las células se transfirieron suavemente a una placa con fondo de vidrio y se usaron para microscopía confocal. Los grupos se analizaron para determinar la proporción de células T positivas para CXCR6GFP con respecto
a células T transducidas con control. Como se muestra en las figuras 11A y 11B, las células T transducidas con CXCR6 (SEQ ID NO: 3 (ADNc); 4 (proteínas)) muestran una capacidad de agolpamiento mejorada para células dendríticas en comparación con células T transducidas con pMX. El vector pMX es un vector retroviral vacío, que no contiene ningún inserto. Este vector puede encontrarse en la página web de Addgene (véase https://www.addgene.org/vectordatabase/3674/). Las células T transducidas con pMX se han publicado en Kitamura (2003) Tokyo Exp Hematol.
31(11): 1007-14. La capacidad de agolpamiento mejorada es dependiente de CXCL16 pero no de ICAM-1. Los valores de p se representan en la figura, * indica p < 0,05, ** p < 0,01; *** p < 0,001 y ns no significativo.
Figura 12: Activación de células T OT-1 transducidas con CXCR6 y GFP en presencia de células dendríticas
Se realizó el cocultivo de células BM-DC (5 x 103 por pocillo) con células T transducidas con CXCR6GFP o con células T transducidas con GFP (razones de 1:1 a 1:10) en placas de 96 pocillos (fondo plano) en presencia de péptido OVA257-264 (1 |ig/ml) (Invivogen, San Diego, CA, EE. UU.). Los sobrenadantes se recogieron después de 2, 4 y 6 horas. La secreción de IFN-y se midió mediante ELISA (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, EE. UU.). Como se muestra en la figura, las células T transducidas con CXCR6 (SEQ ID NO: 3 (ADNc); 4 (proteínas)) muestran una capacidad de activación mejorada por células dendríticas en comparación con células T transducidas con GFP (SEQ ID NO: 11 (ADNc); 12 (proteína)).
Figura 13: Expresión de CXCR6 en ratones portadores de tumor Panc02-OVA
Se analizó la expresión de CXCR6 en ratones portadores de tumores en diferentes órganos, es decir, bazo, ganglio linfático contralateral al tumor (LNk), tumor, riñón, ganglio linfático ipsilateral al tumor (LNi) y pulmón y sangre con respecto a células de sangre periférica. A ratones hembra C57BL/6J (3 por grupo) (Janvier, Francia (número de cat.
2014-07-DE-RM-20)) se les inyectó por vía subcutánea células tumorales Panc02-OVA (Jacobs et al. Int J Cancer 128 (2011) a una concentración de 2 x 106 por ratón. Se aislaron órganos y tumores y se procesaron el día 20 de inducción. Los órganos de bazo, ganglio linfático contralateral al tumor (LNk), tumor, riñón, ganglio linfático ipsilateral al tumor (LNi) y pulmón sometidos a prueba se refieren a suspensiones de células individuales obtenidas de ratones C57BL/6J de tipo silvestre del órgano o sangre correspondiente con respecto a células de sangre periférica de los ratones C57BL/6J. Para el análisis de citometría de flujo, las células se tiñeron con los siguientes anticuerpos: (1.) Panel linfoide: anti-CD3e de ratón conjugado con FITC (clon 17A2, BioLegend, San Diego, CA, EE. UU.), anti-CD4 de ratón conjugado con PE (clon GK1.5, BioLegend, San Diego, CA, EE. UU.), CD8a conjugado con Pacific Blue (clon 53-6.7, BioLegend, San Diego, CA, EE. UU.), CD19 conjugado con PerCp-Cy5.5 (clon 6D5, BioLegend, San Diego, CA, EE. UU.) y NKp46 conjugado con PECy7 (clon 29A1.4, BioLegend, San Diego, CA, EE. UU.). (2.) Panel mieloide: NKp46 conjugado con PE-Cy7, CD11b conjugado con APC-Cy7 (clon M1/70, BioLegend, San Diego, CA, EE. UU.), CD11c conjugado con PE (clon N418, BioLegend, San Diego, Ca , EE. UU.), Gr1 conjugado con FITC (clon RB6-8C5, BioLegend, San Diego, c A, EE. UU.), Ly-6C conjugado conPerCp-Cy5.5 (clon HK1.4, BioLegend, San Diego, CA, EE. UU.) y F4/80 conjugado con Pacific Blue (clon BM8, BioLegend, San Diego, CA, EE. UU.). El nivel de expresión de CXCR6 se analizó usando un anticuerpo anti-CXCR6 de ratón conjugado con APC (FAB2145A, R&D Systems, Inc., MN, EE. UU.) y el isotipo correspondiente (IgG2B de rata, RTK4530, BioLegend, San Diego, CA, EE. UU.). Todos los datos de citometría de flujo se adquirieron en un instrumento BD FACS CantoII y se analizaron usando el software FlowJo. Como se muestra en la figura 13, CXCR6 no puede detectarse en niveles significativos en la superficie de las células inmunitarias analizadas (células T CD8, células T CD4, células T NK y células B CD19) por citometría de flujo.
Figura 14: migración de células T transducidas con CXCR6 y GFP hacia el sobrenadante de células de cáncer pancreático
(A) : Se compararon células T CD8+ transducidas con CXCR6 (SEQ ID NO: 3 (ADNc); 4 (proteína)) y células T CD8+ transducidas con GFP por su capacidad para migrar hacia un gradiente de CXCL16. Se usó medio de migración (BSA al 0,5 % en medio RPM i) con o sin CXCL16 recombinante (SEQ ID NO: 9; diluciones en serie desde 50 ng/ml hasta 3,125 ng/ml) (Peprotech, Hamburgo) en la cámara inferior y células T en la cámara superior (1 x 106 células/pocillo) de una placa de 96 pocillos Transwell. Después de 3 horas, las células T migradas se resuspendieron con perlas de recuento (Life Techonologies, Carlsbad, CA, EE. UU.) para la cuantificación. La capacidad migratoria se analizó como número de células y expresión de GFP por citometría de flujo (BD FACS Canto II). Como se muestra en la figura 4, las células T transducidas con CXCR6 (SEQ ID NO: 3 (ADNc); 4 (proteína)) migran específica y dependientemente de la dosis hacia CXCL16, lo que no se observa en las células T que solo se transdujeron con GFP (SEQ ID NO: 11 (ácido nucleico); 12 (proteína)).
(B) : Se sembraron células tumorales (es decir, células Panc02-OVA o T110299) en una placa de 6 pocillos (1 x 106 células/pocillo) y se estimularon con IFN-y y TNF-a recombinantes (20 ng/ml) (Peprotech, Hamburgo). Después de 48 horas, los sobrenadantes se incubaron 30 min con o sin un anticuerpo neutralizante anti-CXCL16 (2 |ig/ml) (R&D Systems, Inc., MN, EE. UU., policlonal). Se sembraron células T CD8+ transducidas con CXCR6 (SEQ ID No : 3 (ADNc); 4 (proteína)) y células T Cd 8+ transducidas con GFP (SEQ ID NO: 11 (ADNc); 12 (proteína)) a una concentración de 1 x 106 células/pocillo. Después de 3 horas, las células T migradas se resuspendieron con perlas de recuento (Life Techonologies, Carlsbad, CA, EE. UU.) para la cuantificación. La migración se cuantificó como número de células y expresión de GFP por citometría de flujo. Como se muestra en la figura 14B, las células T transducidas con CXCR6 (SEQ ID NO: 3 (ADNc); 4 (proteína)) migran específicamente hacia los sobrenadantes de células
T110299, lo que no se observa con células T transducidas con GFP (SEQ ID NO: 11 (ADNc); 12 (proteína)). Los valores de p se representan en la figura, *** p < 0,001.
Figura 15: Internalización y reciclaje de CXCR6 debido a la unión a CXCL16
Se trataron células T CD8+ transducidas con CXCR6 (SEQ ID NO: 3 (ADNc); 4 (proteína)) (5 x 105 células) con 200 ng de CXCL16 recombinante (Peprotech, Hamburgo) y se analizaron mediante microscopía de fluorescencia en vivo a intervalos de tiempo de 5 minutos durante un período de 1 hora. La obtención de imágenes confocales se realizó con un microscopio confocal Leica SP2 AOBS. Como se muestra en la figura 15, la estimulación con CXCL16 dio como resultado una internalización y reexpresión de CXCR6 dentro de un intervalo de tiempo de 30 minutos.
Figura 16: Adhesión de células T transducidas con CXCR6 a CXCL16 recombinante
Se compararon células T CD8+ transducidas con CXCR6 (SEQ ID NO: 3 (ADNc); 4 (proteína)) y células T CD8+ transducidas con GFP (SEQ ID NO: 11 (ADNc); 12 (proteína)) por su capacidad para adherirse a CXCL16 recombinante inmovilizado. En primer lugar, las células T se tiñeron con calceína (Life Technologies, Carlsbad, CA, EE. UU.) y se preincubaron con o sin 2 |ig/ml de anticuerpo neutralizante anti-CXCL16 de ratón (R&D Systems, Inc., MN, EE. UU., policlonal). Se preincubaron placas de 96 pocillos recubiertas con níquel (número de cat. 15442, ThermoScientific, Darmstadt) con 9 pmol de CXCL16 marcada con His (número de cat. 50142-M08H, SinoBiological, Pekín, China) o 9 pmol de BSA. Las células T preestimuladas se transfirieron a la placa de níquel recubierta con CXCL16 o BSA. Después de 25 minutos de incubación y una etapa de lavado, las células unidas se lisaron usando tampón RIPA. La calceína se detectó con el lector de microplacas multimodo Mithras LB 940 (Berthold Technologies, Bad Wildbad), donde la intensidad de la señal fluorescente es proporcional a la cantidad de células adherentes. Como se muestra en la figura 16, las células T transducidas con Cx CR6 (SEQ ID NO: 3 (ADNc); 4 (proteína)) se unen específicamente a CXCL16. Los valores de p se representan en la figura, ** p < 0,01; *** p < 0,001.
Figura 17: Tratamiento de tumores Panc02-OVA establecidos en ratones con células T OT-1 transducidas con GFP o CXCR6
A ratones hembra C57BL/6J (5 por grupo) (Janvier, Francia (número de cat. 2014-07-DE-RM-20)) se les inyectaron células tumorales Panc02-OVA (2 x 106/ratones) o células tumorales T110299-OVA (4 x 106/ratones) por vía subcutánea. Después de 5 días, las células T se transfirieron adoptivamente a través de la vena de la cola (10 x 106 células por ratón). La eficacia terapéutica se midió como crecimiento tumoral cada dos días. Como se muestra en las figuras 17A y 17B, el tratamiento de tumores Panc02-OVA establecidos o células tumorales T110299-OVA con células T OT-1 transducidas con CXCR6 (SEQ ID NO: 3 (ADNc); 4 (proteína)) conduce a una actividad antitumoral superior en comparación con células T OT-1 transducidas con GFP (SEQ ID NO: 11 (ADNc); 12 (proteína)). Los valores de p se representan en la figura, *** p < 0,001.
Figura 18: Cuantificación de células T OT-1 transducidas con iRFP (proteína fluorescente roja) o CXCR6 infiltrantes de tumor
A ratones hembra C57BL/6J (Janvier, Francia (número de cat. 2014-07-DE-RM-20)) se les inyectaron células tumorales Panc02-OVA (2 x 106/ratones) por vía subcutánea. Después de 5 días, las células T se transfirieron adoptivamente a través de la vena de la cola (10 x 106 células por ratón). Los órganos y tumores se aislaron y procesaron el día 10 de inducción (cinco días después de la transferencia de células T). 15 minutos antes de la extracción de órganos, se inyectó por vía intravenosa anticuerpo anti-CD31 de ratón conjugado con eFluor® 450 (4 |ig/ratones, clon 390, eBioscience, Frankfurt) a través de la vena de la cola. Para el análisis de citometría de flujo, las células se tiñeron con anticuerpo anti-CD8a de ratón conjugado con Pacific Blue (clon 53-6.7, BioLegend, San Diego, CA, EE. UU.) y se analizaron con perlas de recuento (Life Techonologies, Carlsbad, CA, EE. UU.) para la cuantificación. Para microscopía de 2 fotones, los tumores se incrustaron en agarosa al 1,5 % y se realizó la obtención de imágenes de 2 fotones con el sistema Leica “SP5II MP” equipado con un láser pulsado de Ti:Sa “Spectra Physics MaiTai DeepSee”. Como se muestra en la figura 20, las células T transducidas con CXCR6 (SEQ ID NO: 3 (ADNc); 4 (proteína)) no solo están específicamente enriquecidas en tejido tumoral, sino que también tienen la capacidad de migrar hacia áreas tumorales con pocos vasos sanguíneos.
Figura 19: Cuantificación de células T OT-1 transducidas con iRFP (proteína fluorescente roja) o CXCR6 infiltrantes de tumor mediante citometría de flujo.
A ratones hembra C57BL/6J (Janvier, Francia (número de cat. 2014-07-DE-RM-20) se les inyectaron células tumorales Panc02-OVA (2 x 106/ratones) por vía subcutánea. Después de 5 días, las células T se transfirieron adoptivamente a través de la vena de la cola (10 x 106 células por ratón). Los órganos y tumores se aislaron y procesaron el día 10 de inducción (cinco días después de la transferencia de células T). Para el análisis de citometría de flujo, las células se tiñeron con anticuerpo anti-CD8a de ratón conjugado con Pacific Blue (clon 53-6.7, BioLegend, San Diego, CA, EE. UU.) y se analizaron con perlas de recuento (Life Techonologies, Carlsbad, CA, EE. UU.) para la cuantificación. La figura 19 demuestra un enriquecimiento específico de células T transducidas con CXCR6 con respecto a células T transducidas con iRFP.
Figura 20: Secreción de CXCL16 por células de cáncer pancreático humano
Se sembraron células tumorales, es decir, líneas celulares de cáncer pancreático humano PA-TU-8988T (DSM ACC 162), SUIT-2 clone7 (Iwamura et al., Jpn J Cancer Res 78(1) (1987), 54-62), MIA PaCa-2 (ATCC® CRM-CRL-1420™), y PANC-1 (ATCC® CRM-CRL-1420TM) en una placa de 6 pocillos (fondo plano) a una concentración de 0,2 x 106/pocillo. Los sobrenadantes se recogieron después de 72 horas. La secreción de CXCL16 humana se midió con un kit de ELISA de hCXCL16 (R&D Systems, Inc., MN, EE. UU.). Como se muestra en la figura 19, las líneas celulares de cáncer pancreático humano PA-TU-8988T (DSM ACC 162), SUIT-2 clone7 (Iwamura et al., Jpn J Cancer Res 78(1) (1987), 54-62), MIA PaCa-2 (ATCC® CRM-CRL-1420™) y PANC-1 (ATCC® CRM-CRL-1420™) liberan hCXCL16.
Figura 21: Formación de esferas por células de cáncer pancreático humano
Se recubrieron placas de 96 pocillos (fondo plano) con agarosa al 1,5 %. Se sembraron las líneas celulares de cáncer pancreático humano PaTu8988T, Suit-2 clone7, MiaPaCa2 y Panc1 (100 y 500 células/pocillo) en la placa de 96 pocillos recubierta con agarosa (fondo plano). Se observó la formación de esferas por células tumorales PaTu8988T, Suit-2 clone7, MiaPaCa2 y Panc1. Los sobrenadantes se recogieron después de nueve días y la producción de CXCL16 humana se midió con un kit de ELISA de hCXCL16 (R&D Systems, Inc., MN, EE. UU.).
Figura 22: Migración de células T humanas transducidas con CXCR6 hacia hCXCL16 recombinante
Se compararon células T humanas CD8+ transducidas con CXCR6 y células T humanas CD8+ transducidas con GFP por su capacidad para migrar hacia hCXCL16. Se usó medio de migración (BSA al 0,5 % en medio RPMI) con o sin hCXCL16 recombinante (50 ng/ml) (Peprotech, Hamburgo) en la cámara inferior y células T en la cámara superior (1 x 106 células/pocillo) de una placa de 96 pocillos Transwell. Después de 3 horas, las células T migradas se resuspendieron con perlas de recuento (Life Techonologies, Carlsbad, CA, EE. UU.) para la cuantificación. La capacidad migratoria se analizó como número de células y expresión de GFP por citometría de flujo (BD FACS Canto II). Como se muestra en la figura X, las células T humanas transducidas con CXCR6 migran específicamente hacia hCXCL16, lo que no se observa con células T transducidas con GFP. Los valores de p se representan en la figura, * indica p < 0,05.
Los siguientes ejemplos ilustran la invención
Ilustrativamente, como prueba del concepto, en los siguientes ejemplos, los experimentos se llevaron a cabo mediante constructos de vector que albergaban las secuencias de ratón/murinas de CXCR6 (SEQ ID NO: 3 (secuencia de ADNc que codifica la secuencia de proteína como se muestra en la SEQ ID NO: 4)) y CXCL16 (SEQ ID NO: 7 (secuencia de ADNc que codifica la secuencia de proteína como se muestra en la SEQ ID NO: 8)). Además, en los experimentos ejemplificados en las figuras 20 y 21 se usaron constructos de vector que codifican las secuencias humanas de CXCR6 (SEQ ID NO: 1 que codifica la secuencia de proteína como se muestra en la SEQ ID NO: 2).
Ejemplo 1: Generación del constructo de vector de CXCR6 y el constructo de vector de control de GFP
El vector de CXCR6 capaz de transducir células T CD8+ se generó mediante amplificación de la secuencia de CXCR6 murino de longitud completa (SEQ ID NO: 3) y se clonó en el vector pMP71 (Schambach et al., Mol Ther 2(5) (2000), 435-45; EP-B1 0955 374) después de la doble digestión con EcoRI y NotI y la ligación. El vector de GFP capaz de transducir células T CD8+ se generó mediante amplificación de la secuencia de GFP de longitud completa (SEQ ID NO: 11 (ADNc) y SEQ ID NO: 12 (proteína)) y se clonó en el vector pMP71 después de la doble digestión con EcoRI y NotI y la ligación. La clonación se realizó usando la reacción en cadena de la polimerasa a partir de ADNc de esplenocitos y la amplificación de CXCR6 correspondiente a la secuencia mencionada anteriormente y los siguientes cebadores: 5-ATTAGCGGCCGCATGGATGATGGCCATCAGG-3' (SEQ ID NO: 13) y 5'-GGAAACCACCAGCATGTTTCAGGAATTC-3' (SEQ ID NO: 14). El vector CXCR6GFP se generó de la misma manera que se describió anteriormente con respecto al vector de CXCR6 y GFP. En resumen, la secuencia de CXCR6 murino de longitud completa murina (SEQ ID NO: 3) y la secuencia de GFP de longitud completa (SEQ ID NO: 11 (ADNc) y SEQ ID NO: 12 (proteína)) se clonaron en el vector pMP71. La construcción del vector de CXCR6 capaz de transducir células T CD8+ humanas se realizó de la misma manera que se describió anteriormente con respecto al vector de CXCR6 que alberga la secuencia de CXCR6 murino de longitud completa. En resumen, la secuencia de CXCR6 humano de longitud (SEQ ID NO: 1) se clonó en el vector pMP71.
Ejemplo 2: Transducción de células T y sistemas de ensayo para los ensayos de secreción de CXCL16, proliferación de células T y destrucción
2.1 Líneas celulares
La línea celular de cáncer pancreático murino Panc02 y su homólogo transfectado con ovoalbúmina Panc02-OVA se han descrito previamente (Jacobs et al., Int J Cancer 128(4) (2011), 897-907). La línea celular Panc02 se generó a través de la inyección del carcinógeno meticolantreno A en el páncreas de ratones C57B1/6 de tipo silvestre para
inducir carcinogénesis.
La línea celular tumoral T110299 se desarrolló a partir de un tumor pancreático primario de un ratón PtflaCre; KrasG12D; p53fl/R172H 25 y se describe en Duewell et al., Cell Death Differ 21(12) (2014), 1825-1837 (fe de erratas en: Cell Death Differ. 21(12) (2014), 161). La línea celular de empaquetamiento Plat-E se ha descrito previamente por Morita et al., Gene Ther 7 (2000), 1063-6). Todas las células se cultivaron en DMEM con suero bovino fetal al 10 % (FBS, Life Technologies, EE. UU.), 1 % de penicilina y estreptomicina (PS) y 1 % de L-glutamina (todos de PAA, Alemania). Se añadieron 10 |ig/ml de puromicina y 1 |ig/ml de blasticidina (Sigma, Alemania) al medio Plat-E.
Se aislaron células dendríticas derivadas de médula ósea de un ratón C57BL/6J (Janvier, Francia (número de cat.
2014-07-DE-RM-20)). Se cultivaron células de médula ósea con GM-CSF recombinante (20 ng/ml) (Peprotech, Hamburgo) durante siete días. Se sembraron células dendríticas derivadas de médula ósea (BM-DC, 104 por pocillo) en una placa de 96 pocillos (fondo plano) y se estimularon con proteínas recombinantes (20 ng/ml) (TNF-a, IFN-y o IL-4, Peprotech, Hamburgo; o R848 Enzo Life Science, Lorrach).
Las células T OT-1 son células T de ratones OT-1 con número de reserva 003831. Estas células T OT-1 se produjeron de la siguiente manera. Se recogieron esplenocitos primarios de ratones OT-1. Se estimularon suspensiones de células individuales de esplenocitos con anticuerpo anti-CD3 (clon 145-2c11 BD Pharmingen, EE. UU.), anticuerpo anti-CD28 (clon 37.51, b D Pharmingen, EE. UU.) e IL-2 murina recombinante (Peprotech, Alemania) en medio de células T durante la noche.
La línea celular de cáncer pancreático humano PA-TU-8988T puede obtenerse del depositario de líneas celulares Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures con el número de registro DSM ACC 162. El origen de la línea celular depositada PA-TU-89988T es humano (Homo sapiens). El tipo de célula es el adenocarcinoma de páncreas. Más precisamente, la línea celular PA-TU-8988T se estableció en 1985 a partir de la metástasis hepática de un adenocarcinoma pancreático primario de una mujer de 64 años; línea celular hermana de PA-TU-8988S (DSM ACC 204).
La línea celular de cáncer pancreático humano MIA PaCa-2 puede obtenerse de la American Type Culture Collection (ATCC) con el número de registro CRM-CRL-1420™. El organismo de la línea celular depositada MIA PaCa-2 es humano (Homo sapiens). El tipo de célula es una célula epitelial (Kras Crm).
La línea celular de cáncer pancreático humano PANC-1 puede obtenerse de la American Type Culture Collection (ATCC) con el número de registro CRL-1469™. El organismo de la línea celular depositada PANC-1 es humano (Homo sapiens). El tejido es páncreas/conducto.
La línea celular de cáncer pancreático humano SUIT-2 se ha descrito previamente en Iwamura et al., Jpn J Cancer Res. 78(1) (1987), 54-62. La línea celular de cáncer pancreático SUIT-2 se caracteriza por producir antígeno carcinoembrionario y antígeno de hidratos de carbono 19-9.
2.2 Animales
Se adquirieron ratones C57B1/6 de tipo silvestre de Harlan laboratories (Países Bajos). Se obtuvieron ratones transgénicos para un receptor de células T específico para ovoalbúmina (OT-1) del Jackson laboratory, EE. UU. (número de referencia 003831) y se criaron en las instalaciones para animales en condiciones libres de patógenos específicos (SPF). Los ratones OT-1 se cruzaron con ratones con marcador congénico CD45.1 (obtenidos del Jackson laboratory, número de reserva 002014) y con ratones con marcador congénico CD90.1 (número de reserva: 000406) para generar ratones CD45.1-OT-1 y CD90.1-OT-1, respectivamente. Se adquirieron ratones C57B1/6 de tipo silvestre de Janvier, Francia. Se indujeron tumores mediante inyección subcutánea de 2 x 106 células tumorales y los ratones se trataron mediante inyección i.v. de células T como se indica. Todos los experimentos fueron aleatorizados y con ocultamiento. Para experimentos de neutralización, se aplicó anticuerpo anti-IFN-y R4-6A2 (BioXcell, EE. UU.) o control de isotipo (BioXcell, EE. UU.) por vía i.p. a una dosis de 200 |ig por animal cada tres días durante cuatro dosis. El crecimiento tumoral y el estado de los ratones se monitorizaron cada dos días.
2.3 Transducción de células T
2.3.1 Transducción de células T de células T murinas/de ratón
Se usó el vector retroviral pMP71 (Schambach et al., Mol Ther 2(5) (2000), 435-45; EP-B1 0955374) para la transfección de la línea celular de empaquetamiento ecotrófica Plat-E. La transducción se realizó según el método descrito por Leisegang et al. J Mol Med 86 (2008), 573; Mueller et al. J Virol 86 (2012), 10866-10869; Kobold et al., J Natl Cancer Inst 107 (2015), 364. En resumen, se sembró la línea celular de empaquetamiento Plat E (como se describe por Morita et al. Gene Ther 7 (2000), 1063) en placas de 6 pocillos y se cultivó durante la noche hasta el 70 80 % de confluencia. El día uno, se mezclaron 16 |ig de ADN junto con CaCl2 100 mM (Merck, Alemania) y cloroquina 126,7 |iM (Sigma, EE. UU.). Las células Plat-E se privaron de alimento durante 30 minutos en medio bajo en suero
(3 %) y luego se incubaron durante 6 h con el ADN precipitado. Luego se retiró el medio y se intercambió por medio de cultivo. En el día dos, se recogieron esplenocitos primarios de ratones C57B1/6 (Janvier). Se estimularon suspensiones de células individuales de esplenocitos con anticuerpo anti-CD3 (clon 145-2c11 BD Pharmingen, EE. UU.), anticuerpo anti-CD28 (clon 37.51, BD Pharmingen, EE. UU.) e IL-2 murina recombinante (Peprotech, Alemania) en medio de células T durante la noche. El día 3, se recubrieron placas de 24 pocillos con 12,5 |ig/ml de retronectina recombinante (Takara Biotech, Japón) durante 2 h a temperatura ambiente, se bloquearon con albúmina sérica bovina al 2 % (Roth, Alemania) durante 30 min a 37°C y se lavaron con PBS. El sobrenadante de Plat-E se recogió y se hizo pasar a través de un filtro (40 |im, Milipore, EE. UU.). Luego se añadió medio de células T nuevo a las células Plat E. Se distribuyó 1 ml de sobrenadante filtrado en cada pocillo y se sometió a inoculación centrífuga durante 2 horas a 4°C. Luego se retiró el sobrenadante de la placa de 24 pocillos. Se sembraron 106 células T en un ml de medio de células T complementado con 10 U de IL-2 y 400.000 perlas anti-CD3 y anti-CD28 (Invitrogen, Alemania) por pocillo y se sometió a inoculación centrífuga a 800 g durante 30 min a 32°C. En el día cuatro, el sobrenadante de Plat E se recogió nuevamente y se filtró. Se añadió 1 ml a cada pocillo de la placa de 24 pocillos y se sometió a inoculación centrífuga a 800 g durante 90 min a 32°C. Las células se incubaron posteriormente durante 6 horas adicionales a 37°C. Se reemplazó 1 ml de sobrenadante por medio de células T con IL-2. En el día cinco, se recogieron las células, se contaron y volvieron a sembrarse a 106 células/ml de densidad en medio de células T complementado con 10 ng de IL-15 por ml (Peprotech, Alemania). Las células T se mantuvieron a esta densidad hasta el día 10 cuando se realizaron análisis celulares o ensayos funcionales.
La transducción con el vector retroviral pMX (de Witte et al., J. Immunol. 181 (2008), 5128-5136) se realizó de la misma manera que la transducción con el vector pMP71 como se describió anteriormente.
2.3.2 Transducción de células Thumanas
Se usó el vector retroviral pMP71 (Schambach et al., Mol Ther 2(5) (2000), 435-45; EP-B1 0955374) para la transfección de la línea celular de empaquetamiento anfotrófica Plat-A. La transducción se realizó según el método descrito por Leisegang et al. J Mol Med 86 (2008), 573; Mueller et al. J Virol 86 (2012), 10866-10869; Kobold et al., J Natl Cancer Inst 107 (2015), 364. En resumen, se sembró la línea celular de empaquetamiento Plat A (como se describe por Morita et al. Gene Ther 7 (2000), 1063) en placas de 6 pocillos y se cultivó durante la noche hasta el 70 80 % de confluencia. El día dos, las células Plat A se transfectaron con el método de precipitación con fosfato de calcio con 18 |ig del plásmido de vector retroviral pMP71 y luego se incubaron durante 6 h. Luego se retiró el medio y se intercambió por medio de cultivo. Además, se aislaron PBMC primarias y las células T CD3+ se separaron mediante clasificación MACS (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach). Se estimularon células T humanas CD3+ con anticuerpo anti-CD3 humano (clon UCHT1 BD Pharmingen, EE. UU.), anticuerpo anti-CD28 humano (clon CD28.2, Bd Pharmingen, EE. UU.), IL-15 recombinante (Peprotech, Alemania) e IL-2 murina recombinante (Peprotech, Alemania) en medio de células T durante la noche. El día cuatro, se recubrieron placas de 24 pocillos con 12,5 |ig/ml de retronectina recombinante (Takara Biotech, Japón) durante 2 h a temperatura ambiente, se bloquearon con albúmina sérica bovina al 2 % (Roth, Alemania) durante 30 min a 37°C y se lavaron con PBS. Se recogió el sobrenadante de Plat-A y se hizo pasar a través de un filtro (0,45 |im, Milipore, EE. UU.). Luego se añadió medio de células T nuevo a las células Plat A. Se distribuyó 1 ml de sobrenadante filtrado en cada pocillo y se sometió a inoculación centrífuga durante 2 horas a 4°C. Luego se retiró el sobrenadante de la placa de 24 pocillos. Se sembraron 106 células T humanas en un ml de medio de células T complementado con IL-2, IL-15 y Dynabeads anti-CD3 humano y anti-CD28 humano (Invitrogen, Alemania) por pocillo y se sometieron a inoculación centrífuga a 800 g durante 30 min a 32°C. El día cinco, el sobrenadante de Plat A se recogió nuevamente y se filtró. Se distribuyó 1 ml en cada pocillo y se sometió a inoculación centrífuga durante 2 horas a 4°C. Se retiró el sobrenadante y las células T infectadas del día anterior se transfirieron a la placa de 24 pocillos y se sometieron a inoculación centrífuga a 800 g durante 90 min a 32°C. Las células se incubaron posteriormente durante 6 horas adicionales a 37°C. Después de la incubación, se recogieron las células, se contaron y volvieron a sembrarse a una densidad de 106 células/ml en medio de células T complementado con IL-15 e IL-2 (Peprotech, Alemania). Las células T se mantuvieron a esta densidad hasta el día 10 cuando se realizaron análisis celulares o ensayos funcionales.
2.4 Cocultivo de células tumorales con células T
Se cocultivaron células T y células tumorales durante 48 h a una razón de 1:1 o 10:1 en las condiciones de cultivo descritas anteriormente. Los sobrenadantes se analizaron para determinar IFN-y mediante ELISA (BD) como se describe en la sección 2.5, a continuación.
2.5 Actividad lítica de células T transducidas con CXCR6 en presencia de células tumorales productoras de CXCL16
Se midió la liberación de LDH mediante un kit comercial (Promega). En resumen, la LDH cataliza la reducción de NAD+ a NADH y H+ por oxidación de lactato a piruvato. A continuación, la diaforasa reacciona con NADH y H+ para catalizar la reducción de una sal de tetrazolio (INT) a formazán que absorbe a 490 nm.
El IFN-y se mide por ELISA usando anticuerpos complementarios de unión a IFN-y como anticuerpos de captura y de detección y un sistema secundario acoplado a peroxidasa de rábano picante.
Claims (11)
- REIVINDICACIONESi . Un vector de expresión para su uso en el tratamiento de una enfermedad caracterizada por la sobreexpresión de CXCL16, en el que dicho vector es capaz de transducir células T y comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en:(a) una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, y(b) una secuencia de ácido nucleico que es al menos el 84 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 1 y que se caracteriza por tener una actividad de receptor de quimiocinas 6 (CXCR6).
- 2. Una célula T que expresa un receptor de quimiocinas 6 (CXCR6), célula T que se transduce con un vector de expresión que codifica dicho CXCR6, en la que dicho vector comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en:(a) una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, y(b) una secuencia de ácido nucleico que es al menos el 84 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 1 y que se caracteriza por tener una actividad de receptor de quimiocinas 6 (CXCR6).
- 3. Un método in vitro para la producción de una célula T transducida que expresa un receptor de quimiocinas 6 (CXCR6) que comprende las siguientes etapas:(a) transducir una célula T con un vector de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en:(i) una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, y(ii) una secuencia de ácido nucleico, que es al menos el 84 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 1 y que se caracteriza por tener una actividad de receptor de quimiocinas 6 (CXCR6);(b) cultivar la célula T transducida en condiciones que permiten la expresión del receptor de quimiocinas 6 (CXCR6) en o sobre dicha célula T; y(c) recuperar la célula T transducida del cultivo.
- 4. El método según la reivindicación 3, en el que la célula T transducida se expande después de la transfección por anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28, y/o en presencia de citocinas, preferiblemente interleucina-2 (IL-2) y/o interleucina-15 (IL-15).
- 5. La célula T transducida que expresa un receptor de quimiocinas 6 (CXCR6) obtenible por el método de la reivindicación 3 o 4.
- 6. La célula T transducida según la reivindicación 2 o la reivindicación 5 para su uso como medicamento.
- 7. Una composición farmacéutica que comprende una célula T que expresa un receptor de quimiocinas 6 (CXCR6), célula T que se transduce con un vector de expresión que codifica dicho CXCR6, en la que dicho vector comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en:(a) una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, y(b) una secuencia de ácido nucleico que es al menos el 84 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 1 y que se caracteriza por tener una actividad de receptor de quimiocinas 6 (CXCR6).
- 8. La célula transducida según una cualquiera de las reivindicaciones 2, 5 y 6, o la composición farmacéutica según la reivindicación 7, en la que la célula T transducida es una célula T que se ha obtenido originalmente del paciente que va a tratarse.
- 9. La célula transducida según una cualquiera de las reivindicaciones 2, 5, 6 y 8, o la composición farmacéutica según la reivindicación 7 o la reivindicación 8 para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad caracterizada por la sobreexpresión de CXCL16.
- 10. La célula T transducida según la reivindicación 9 para su uso según la reivindicación 9, o la composición farmacéutica según la reivindicación 9 para su uso según la reivindicación 9, en la que dicha enfermedad se selecciona del grupo que consiste en cáncer colorrectal, cáncer cerebral, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer pancreático, cáncer de mama, cáncer renal, carcinoma nasofaríngeo, carcinoma hepatocelular, cáncer gástrico, cáncer de cuello uterino, cáncer de vejiga, linfoma, sarcoma y cáncer de pulmón.
- 11. El vector según la reivindicación 1 para el uso según la reivindicación 1, célula T transducida según una cualquiera de las reivindicaciones 2, 5, 6 y 8, método según la reivindicación 3 o 4, célula T transducida según la reivindicación 9 o 10 para el uso según la reivindicación 9 o 10, composición farmacéutica según la reivindicación 7 u 8, o composición farmacéutica para el uso según la reivindicación 9 o 10, en el que la célula T es una célula T seleccionada del grupo que consiste en una célula T CD8+, célula T CD4+, célula T yS y células T citolíticas naturales (NK).
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