JP2018531016A - 腫瘍標的療法のためのｃｘｃｒ６形質導入ｔ細胞 - Google Patents
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Abstract
本発明は、腫瘍標的療法のためのＣＸＣＲ６で形質導入したＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ３＋Ｔ細胞、γδＴ細胞又はナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞などのＴ細胞、このようなＴ細胞を形質導入することができる核酸配列、ベクター、本発明の核酸配列又はベクターを有する形質導入したＴ細胞、本発明の核酸配列又はベクターを含む方法及びキットに関する。本発明はまた、ＣＸＣＬ１６過剰発現が特徴の疾患を治療するための方法における前記形質導入したＴ細胞の使用、並びにＣＸＣＬ１６過剰発現を特徴とする疾患の治療方法において使用するためのＣＸＣＲ６を発現する形質導入したＴ細胞を含む薬学的組成物／医薬を提供する。【選択図】図１
Description
本発明は、腫瘍標的療法のためのＣＸＣＲ６で形質導入したＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ３＋Ｔ細胞、γδＴ細胞又はナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞などのＴ細胞、核酸配列、このようなＴ細胞を形質導入することができるベクター、本発明の核酸配列又はベクターを有する形質導入したＴ細胞、本発明の核酸配列又はベクターを含む方法及びキットに関する。本発明はまた、ＣＸＣＬ１６過剰発現を特徴とする疾患を治療するための方法における前記形質導入したＴ細胞の使用、並びにＣＸＣＬ１６過剰発現を特徴とする疾患の治療方法において使用するためのＣＸＣＲ６を発現する形質導入したＴ細胞を含む薬学的組成物／医薬を提供する。
養子Ｔ細胞療法（ＡＣＴ）は、がん特異的Ｔ細胞を使用する強力な治療手法である（Rosenberg及びRestifo, Science 348(6230) (2015), 62-68）。ＡＣＴでは、天然に存在する腫瘍特異的細胞又はＴ細胞若しくはキメラ抗原受容体を使用する遺伝子操作によって特異的にしたＴ細胞を使用することがある（Rosenberg及びRestifo, Science 348(6230) (2015), 62-68）。養子Ｔ細胞療法（ＡＣＴ）の分野にある国際公開第２０１５／０２８４４４号は、ＣＤ３０陽性がんの治療において使用するための抗ＣＤ３０キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する形質導入したＴ細胞について記載している。さらに、米国特許出願第２０１４／２７１６３５号は、ＣＤ１９の発現と関連した疾患の治療において使用するためのＣＤ１９に特異的なキメラ抗原受容体を発現する組換えＴ細胞を開示している。ＡＣＴでは、急性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫又はメラノーマなどの進行型、そうでなければ治療抵抗性疾患に罹患している患者であっても治療に成功し、寛解を誘導することができる（Dudley等、J Clin Oncol 26(32) (2008), 5233-5239; Grupp等、N Engl J Med 368 (16) (2013), 1509-1518; Kochenderfer等、J Clin Oncol. (2015) 33(6):540-9. doi: 10.1200/JCO.2014.56.2025. Epub 2014 Aug 25）。しかし、長期間にわたって恩恵を受けられるのは一部の患者に限定されており、ほとんどは再発し、抵抗性疾患に屈してしまう。
Ｔ細胞の腫瘍細胞又は組織への接近は、ＡＣＴの成功に必要不可欠であると考えられていた。したがって、Ｔ細胞の進入を可能にする戦略を開発し、実行することが必要である（Gattinoni等、Nat Rev Immunol 6(5) (2006), 383-393）。Ｔ細胞浸潤の増強を実現するために最近最も有効な方法は、全身照射であり、これは腫瘍組織を透過処理し、脈管構造を再構築し、抑制細胞を除去する（Dudley等、J Clin Oncol 23(10) (2005), 2346-2357）。この戦略は臨床治験において有効性が示されたことがあるが、その非特異的な性質が重篤な副作用を誘導したので適用性は限定され、より特異的な戦略が必要とされる（Dudley等、J Clin Oncol 23(10) (2005), 2346-2357）。
Ｔ細胞の組織への進入及び輸送は、インテグリン及びケモカインが中心的な役割を担う、厳重に制御されたプロセスである（Franciszkiewicz等、Cancer Res 72(24) (2012), 6325-6332;Kalos及びJune, Immunity 39(1) (2013), 49-60）。ケモカインは、常在細胞によって分泌され、勾配を形成して、対応する受容体を有する細胞を引き寄せ、細胞進入を制御する（Franciszkiewicz等、Cancer Res 72(24) (2012), 6325-6332）。腫瘍はこの原理を使用して免疫抑制細胞集団を引き寄せる一方、炎症誘発性サブセットを排除する（Curiel等、Nat Med 10(9) (2004), 942-949）。養子Ｔ細胞療法（ＡＣＴ）の分野にあるＷｅｎｎｅｒｂｅｒｇ等、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ６４ （２０１５）、２２５−２３５は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞のエクスビボにおける増殖が、ＣＸＣＲ３受容体の発現増加を引き起こすことを開示している。さらに、Ｗｅｎｎｅｒｂｅｒｇ等では、これらの増殖したＮＫ細胞がＣＸＣＬ１０を分泌する固形腫瘍に向かう遊走能力の改善を示すことが記載されている。しかし、Ｗｅｎｎｅｒｂｅｒｇ等が記載したように、ケモカイン受容体ＣＸＣＲ３を発現するような遺伝子操作はＮＫ細胞には行われなかった。ケモカイン受容体（腫瘍組織内で発現したケモカインが標的とする）のＴ細胞への導入は、抗原特異的Ｔ細胞を再指向させ、腫瘍組織への遊走を増強させるために使用した。ＣＣＲ２、ＣＣＲ４及びＣＸＣＲ２は前臨床モデルで試験された。これらは、ＡＣＴの治療的有効性の増強をもたらすが、全般的に腫瘍を拒絶するには不十分で、腫瘍部位においてＴ細胞の浸潤及び機能性が不足することが示された（Di Stasi等、Blood 113(25) (2009), 6392-6402; Peng等、Clin Cancer Res 16(22) (2010), 5458-5468; Asai等、PLoS One 8(2) (2013), e56820）。さらに、Ｓａｐｏｚｎｉｋ等、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ６１（２０１２）、１８３３−１８４７は、ＣＸＣＲ１を発現するように操作された腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）細胞がケモカインＣＸＣＬ８を分泌するメラノーマ細胞に向かう遊走の増強を示すことを開示している。さらに、マウスのＢ細胞株Ｂａｆ−３細胞のマウスＣＸＣＲ６を有するベクターコンストラクトによるトランスフェクションについて記載された（Matsumura等、J. Immunol. 181 (2013), 3099-3107）。しかし、Ｍａｔｓｕｍｕｒａ等の出版物に記載された実験手法の唯一の目的は、以前に照射によって処置されたマウス腫瘍細胞によって分泌されたＣＸＣＬ１６は機能性があること、すなわち、このようなマウス腫瘍細胞はＣＸＣＲ６陽性細胞の遊走を誘導することができることを証明することであった。したがって、マウスのＢ細胞株Ｂａｆ−３細胞のマウスＣＸＣＲ６を有するベクターコンストラクトによるトランスフェクションは、ＣＸＣＬ１６効果のためであって、ＣＸＣＲ６の影響のためではない機能性のある細胞株を生成するために行われた。上記のように、Ｍａｔｓｕｍｕｒａ等の出版物で記載されたトランスフェクトされた細胞株は、マウスのＢ細胞株、すなわち、Ｔ細胞の機能性及び分化から全く独立した系列である。したがって、本明細書で明示したＣＸＣＲ６で形質導入したＴ細胞の治療的有効性は、Ｍａｔｓｕｍｕｒａ等の出版物で記載されたマウスのＢ細胞株から推測することはできない。さらに、Ｘｉａｏ等、Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ、６（１６）（２０１５）、１４１６５−１４１７８は、ヒト乳腺細胞の形質導入のために完全長ヒトＣＸＣＲ６を発現するベクターの構築を開示している。さらに、Ｄｅｎｇ等、Ｎａｔｕｒｅ ３８８ （１９９７）、２９６−３００は、寄託番号ＡＦ００７５４５で保管されたヒトＣＸＣＲ６配列を有するベクターを開示している。しかし、Ｘｉａｏ等及びＤｅｎｇ等で記載されたベクターは、完全にはその構造の特徴を明らかにされておらず、保管もされなかった。
したがって、腫瘍標的療法、特に養子Ｔ細胞療法は、がん患者の必要性を満たすために改善することが必要である。したがって、ＡＣＴの安全性及び有効性を改善し、前記の不利点を克服する可能性を有する改善された手段を提供することが依然として必要である。
この必要性は、特許請求の範囲で規定したような実施態様を提供することによって、本発明によって解決される。
本発明は、ケモカイン受容体６（ＣＸＣＲ６）活性を有することを特徴とするケモカイン受容体６（ＣＸＣＲ６）又はその断片をコードする核酸を含んでいる／含む、Ｔ細胞（一又は複数）、好ましくは、ＣＤ８＋Ｔ細胞（一又は複数）、ＣＤ４＋Ｔ細胞（一又は複数）、ＣＤ３＋Ｔ細胞（一又は複数）、γδＴ細胞（一又は複数）又はナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞（一又は複数）、最も好ましくはＣＤ８＋Ｔ細胞（一又は複数）を形質導入することができるベクターに関する。
ＣＸＣＲ６は、骨髄細胞だけでなく膵臓がん細胞などの悪性細胞によっても分泌されるＣＸＣＬ１６の受容体である（Gaida等、Clin Exp Immunol 154(2) (2008), 216-223; van der Voort等、J Leukoc Biol 87(6) (2010), 1029-1039）。ＣＸＣＲ６の発現は、ある種のＣＤ４＋Ｔ細胞サブセット、ナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞及び骨髄細胞に限定されるが、細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞には存在しない（Matloubian等、Nat Immunol 1(4) (2000), 298-304; van der Voort等、J Leukoc Biol 87(6) (2010), 1029-1039）。ＣＸＣＲ６のリガンドは、２つの形態、膜結合型ＣＸＬ１６及び分泌性可溶型ＣＸＣＬ１６で存在する。これによってＣＸＣＲ６の２つの機能が説明される。ＣＸＣＲ６は、可溶型ＣＸＣＬ１６に向かう遊走を媒介し、膜結合型による接着を媒介する（Matloubian等、Nat Immunol 1(4) (2000), 298-304; Gough等、J Immunol 172(6) (2004), 3678-3685）。これらの特性のおかげで、ケモカイン受容体の中でもＣＸＣＲ６は独特である。本発明の文脈では、驚くべきことに、そして予想外に、ＣＸＣＲ６はＣＤ８＋Ｔ細胞に形質導入することができ、それによって腫瘍細胞に向かう遊走を媒介することが見いだされた。さらに、本発明の文脈で得られたデータは、ＣＸＣＲ６で形質導入したＴ細胞、好ましくはＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ３＋Ｔ細胞、γδＴ細胞又はナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞、最も好ましくはＣＤ８＋Ｔ細胞は、抗原とは独立した方法で標的腫瘍細胞に接着し、したがって、腫瘍部位で腫瘍細胞認識を支援するというさらなる利点を有することを示す。したがって、本発明は、Ｔ細胞、好ましくは、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ３＋Ｔ細胞、γδＴ細胞又はナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞、最も好ましくはＣＤ８＋Ｔ細胞のＣＸＣＲ６による形質導入、それによるＣＸＣＬ１６を分泌する腫瘍細胞に向かう遊走の媒介に関する。添付の実施例に示されるように、ケモカイン受容体６（ＣＸＣＲ６）を発現する形質導入したＴ細胞による腫瘍の治療は、コントロール実験と比較して腫瘍サイズを有意に低減する（図１７参照）。したがって、驚くべきことに、ケモカイン受容体６（ＣＸＣＲ６）を発現する形質導入したＴ細胞は、膵臓がんなどのＣＸＣＬ１６過剰発現を特徴とする疾患の治療のために使用することができることが発見された。
したがって、有利なことに、Ｔ細胞、好ましくは、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ３＋Ｔ細胞、γδＴ細胞又はナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞、最も好ましくはＣＤ８＋Ｔ細胞のＣＸＣＲ６による形質導入は、改善された養子Ｔ細胞療法をもたらすだろう。したがって、本発明は、ＣＸＣＲ６活性を有することを特徴とするＣＸＣＲ６又はその断片をコードする核酸配列を含んでいる／含む、Ｔ細胞、好ましくは、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ３＋Ｔ細胞、γδＴ細胞又はナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞、最も好ましくはＣＤ８＋Ｔ細胞を形質導入することができるベクターに関する。
本発明の文脈では、ベクターは、完全長ケモカイン受容体６（ＣＸＣＲ６）の断片／ポリペプチド部分をコードする核酸配列を含んでいてもよい。したがって、本明細書で提供したベクターに含まれるケモカイン受容体６（ＣＸＣＲ６）は、完全長ＣＸＣＲ６の断片／ポリペプチド部分である。完全長ケモカイン受容体６（ＣＸＣＲ６）をコードする核酸配列は、本明細書では配列番号１（ヒト）及び３（マウス（murine/mouse））として示す。マウス及びヒト完全長ＣＸＣＲ６のアミノ酸配列は、本明細書ではそれぞれ配列番号４（マウス）及び２（ヒト）として示す（ヒト完全長ＣＸＣＲ６のＵｎｉ Ｐｒｏｔ Ｅｎｔｒｙ ｎｕｍｂｅｒは０００５７４である（項目番号１３９及び配列のバージョン１の寄託番号。）マウス完全長ＣＸＣＲ６のＵｎｉ Ｐｒｏｔ Ｅｎｔｒｙ ｎｕｍｂｅｒはＱ９ＥＱ１６である（項目番号１１１及び配列のバージョン１の寄託番号））。
本発明の文脈では、核酸配列は「ケモカイン受容体６（ＣＸＣＲ６）」をコードする。用語「ケモカイン受容体６（ＣＸＣＲ６）」及び構造及び機能に関連するその科学的意味は当該技術分野では周知で、したがって、本発明の文脈で使用する（Shimaoka等、J Leukoc Biol. 75(2) (2004), 267-274; Alkhatib G等、Nature 388(6639) (1997), 238; Paust等、Nat Immunol. 11(12) (2010), 1127-1135）。本発明のベクター内のケモカイン受容体６（ＣＸＣＲ６）の機能は、前記ケモカイン受容体６（ＣＸＣＲ６）を発現する核酸配列によって形質導入される細胞、好ましくはＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ３＋Ｔ細胞、γδＴ細胞又はナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞などのＴ細胞、最も好ましくはＣＤ８＋Ｔ細胞とケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１６（ＣＸＣＬ１６）を（過剰）発現する標的細胞との間のアトラクター及びコネクターとして作用することである。完全長ＣＸＣＬ１６の核酸配列は、本明細書では配列番号５（ヒト）及び７（マウス）として示す。マウス及びヒト完全長ＣＸＣＬ１６のアミノ酸配列は、本明細書ではそれぞれ配列番号８（マウス）及び６（ヒト）として示す（ヒト完全長ＣＸＣＬ１６のＵｎｉ Ｐｒｏｔ Ｅｎｔｒｙ ｎｕｍｂｅｒはＱ９Ｈ２Ａ７である（項目番号１２９及び配列のバージョン４の寄託番号）。マウス完全長ＣＸＣＬ１６のＵｎｉ Ｐｒｏｔ Ｅｎｔｒｙ ｎｕｍｂｅｒはＱ８ＢＳＵ２である（項目番号１０３及び配列のバージョン２の寄託番号））。したがって、本明細書で記載した核酸配列によってコードされるケモカイン受容体６（ＣＸＣＲ６）を発現する形質導入したＴ細胞は、例えば、前駆疾患細胞、初代細胞株、上皮細胞、神経細胞、リンパ系細胞、幹細胞又は腫瘍細胞などのＣＸＣＬ１６を（過剰）発現する標的細胞に向かって遊走し、結合することができる。
本発明の文脈では、「遊走する」という用語は、ＣＸＣＲ６を（過剰）発現することを特徴とする、（形質導入した）Ｔ細胞が、例えば、前駆疾患細胞、初代細胞株、上皮細胞、神経細胞、リンパ系細胞、幹細胞又は腫瘍細胞などのＣＸＣＬ１６を（過剰）発現する（形質導入した）細胞に向かう能力を意味する。標的細胞の遊走能力は、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、顕微鏡又は任意のその他の適切な装置若しくは系によって測定することができる（Justus等、J. Vis. Exp. (88) (2014), e51046, doi: 10.3791/51046）。簡単に説明すると、このような細胞遊走アッセイは、以下のように行う：形質導入したＴ細胞（例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞）を適切な蛍光色素で標識し、９６ウェルプレート内のトランスウェルインサートの上部ウェル中の無血清培地に播種する。組換えＣＸＣＬ１６を下部チャンバーに添加する。細胞の遊走は３７℃で可能である。その後、下部ウェルに達した細胞を定量する。遊走を測定する方法は、文献で広く知られており（Valster A等、Methods 37(2) (2005), 208-215）、インビトロ分析用のトランスウェルアッセイ、共焦点顕微鏡及びフローサイトメトリーが含まれるが、フローサイトメトリー、生物発光画像処理及び免疫組織化学はインビボ分析のために使用される（さらに詳細については、実施例項目２．５も参照のこと）。
本発明の文脈では、「結合する」という用語は、ケモカイン受容体６（ＣＸＣＲ６）が、例えば、共有結合的又は非共有結合的相互作用を介して、ＣＸＣＬ１６を（過剰）発現することを特徴とする標的細胞に関連する能力を意味する。「共有結合的」相互作用は、原子間、又は原子とその他の共有結合との間で電子対を共有することを特徴とする化学結合の一形態である。共有結合には、例えば、σ結合、π結合、金属対非金属結合、アゴスチック相互作用及び三中心二電子結合などの当該技術分野で周知の多くの種類の相互作用が含まれる。「非共有」結合は、電子対の共有が関与しない化学結合である。非共有結合は、タンパク質及び核酸などの大きい分子の３次元構造の維持に必須で、分子が互いに特異的であるが一過性に結合する多くの生物学的プロセスに関与する。非共有結合には、水素結合、イオン相互作用、ファンデルワールス相互作用、電荷-電荷、電荷-双極子、双極子-双極子結合及び疎水結合などのいくつかの種類がある。非共有結合的相互作用は、例えば、細胞膜上の標的結合部位の位置にリガンドを維持するために、協力して作用するいくつかの異なる種類の非共有結合と関与することが多い。相互作用は、細胞膜の表面に多数存在する電荷又は双極子などの群と生じることがある。好ましくは、相互作用（すなわち、結合）は、（特異的な細胞膜構成物／エピトープが関与する）細胞膜の規定の部位で生じ、少なくとも１つの相互作用の形成、好ましくはいくつかの特異的な相互作用のネットワークの形成と共に進行する。さらにより好ましくは、結合は標的細胞に特異的で、すなわち、結合は標的細胞の細胞膜で生じるが、非標的細胞の細胞膜では生じないか、又はあまり生じない。
本発明の文脈では、細胞を形質導入することができるベクターは、配列番号１（ヒト）及び３（マウス）からなる群から選択される核酸配列、又は配列番号１（ヒト）若しくは３（マウス）の配列と少なくとも８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一で、ケモカイン受容体６（ＣＸＣＲ６）活性を有することを特徴とする核酸配列を含む。したがって、本発明にはまた、配列番号１（ヒト）又は３（マウス）で示した核酸分子／核酸配列と少なくとも８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する核酸分子、核酸配列又は配列セグメントが包含される。このような変異体分子は、その他の種のスプライス型又は相同分子であってもよい。それにも関わらず、これらの変異体核酸分子／核酸配列は指示した機能を有するアミノ酸配列をコードしなければならない、すなわち、配列番号１（ヒト）又は３（マウス）の変異体によってコードされた配列は、本明細書で以下に定義したようなケモカイン受容体６（ＣＸＣＲ６）活性を有することを特徴としなければならないことを理解されたい。
したがって、本発明の文脈では、核酸配列は、配列番号１（ヒト）及び３（マウス）又は配列番号１（ヒト）若しくは３（マウス）の配列と少なくとも８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である核酸配列であってもよい。Ｔ細胞、好ましくはＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ３＋Ｔ細胞、γδＴ細胞又はナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞、最も好ましくはＣＤ８＋Ｔ細胞を形質導入することができる本明細書で提供したベクターが、配列番号１（ヒト）及び３（マウス）からなる群から選択される核酸配列又は配列番号１（ヒト）若しくは３（マウス）の配列と少なくとも８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一な核酸配列を含むならば、前記核酸配列は、ケモカイン６受容体（ＣＸＣＲ６）活性を有することを特徴とする。ケモカイン６受容体（ＣＸＣＲ６）活性は、インビトロ及びインビボにおいてＣＸＣＬ１６生成細胞によって調整されたＣＸＣＬ１６勾配に向かって遊走し、標的部位、すなわち腫瘍部位におけるＣＸＣＲ６陽性Ｔ細胞の蓄積を可能にする能力によって、及び／又はＣＸＣＬ１６結合によって直接的に、又はＣＸＣＬ１６生成腫瘍細胞に対するインテグリン活性化によって間接的に接着を媒介し、それによって腫瘍細胞認識を増大させる能力によって定義される。遊走を測定する方法は、文献で広く知られており（Valster A等、Methods 37(2) (2005), 208-215）、インビトロ分析用にトランスウェルアッセイ、共焦点顕微鏡及びフローサイトメトリーが含まれるが、フローサイトメトリー、生物発光画像処理及び免疫組織化学はインビボ分析のために使用する。
本発明によれば、核酸配列／核酸分子に関連した「少なくとも％同一の」という用語は、アミノ酸配列の全長（又はその比較部分全体）を形成する核酸残基の数と比較して２以上の整列した核酸配列の同一核酸の合致（「ヒット」）の数を示す。その他の用語では、（部分）配列を比較の範囲にわたって、又は当該技術分野で公知の配列比較アルゴリズムを使用して測定した指定領域にわたって最大の一致で比較して整列させたとき、或いは手動で整列させて視覚的に検証したとき、アラインメントを使用して、２以上の配列又は部分配列について、同じである核酸残基のパーセント（例えば、少なくとも８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一）を判定することができる。本発明によって好ましい核酸は、少なくとも１００から１５０ヌクレオチドの長さの領域にわたって、より好ましくは少なくとも２００から４００ヌクレオチドの長さの領域にわたって記載した同一性が存在する核酸である。本発明によってより好ましい核酸は、配列番号１（ヒト）又は３（マウス）で示した核酸配列の全長にわたって記載した配列同一性を有する核酸である。
例えば、ＣＬＵＳＴＡＬＷコンピュータプログラムをベースにしたアルゴリズム（Thompson Nucl. Acids Res. 2 (1994), 4673-4680）又はＦＡＳＴＡ（Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci., 1988, 85; 2444）などのアルゴリズムを使用して配列間（between/among）のパーセント配列同一性を判定する方法は当該技術分野で周知である。ＦＡＳＴＡアルゴリズムは、典型的には、その計算において、配列における内部の一致しない欠失又は付加、すなわち、ギャップを考慮しないが、％配列同一性の過剰評価を回避するために手動で修正することができる。しかし、ＣＬＵＳＴＡＬＷは、その同一性計算において配列ギャップを考慮する。当該技術分野の当業者がまた利用可能なアルゴリズムは、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムである（Altschul, Nucl. Acids Res., 25 (1977), 3389）。核酸配列のためのＢＬＡＳＴＮプログラムは、初期設定としてワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４及び両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、初期設定としてワード長（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０を使用する。ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci., 89 (1989), 10915）は、アラインメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４及び両鎖の比較を使用する。これらのプログラムは全て、本発明のために使用することができる。しかし、好ましくはＢＬＡＳＴプログラムを使用する。したがって、指示した機能を有し、さらに上記で引用した、又は当業者が利用可能な他のプログラムの何れか、好ましくはＢＬＡＳＴプログラムで判定して、少なくとも８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％ｏ、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する核酸分子は全て、本発明の範囲内に入る。
本発明によれば、本明細書ではポリヌクレオチド又は核酸分子とも称する核酸配列には、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡなどのＤＮＡ及びＲＮＡが含まれる。本明細書では、「ＲＮＡ」という用語は、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ及びｒＲＮＡを含むＲＮＡの全形態を含むが、ＲＮＡウイルスのＲＮＡの場合などのゲノムＲＮＡも含むものと理解されたい。好ましくは、「ＲＮＡ」を引用する実施態様はｍＲＮＡを対象とする。さらに、ＤＮＡ又はＲＮＡの合成又は半合成誘導体並びにセンス及びアンチセンス鎖の両方の混合重合体などの当該技術分野で公知の核酸模倣分子を含む。当業者によって容易に理解されるように、さらに非天然の、又は誘導体化したヌクレオチド基も含有することができる。このような本発明による核酸模倣分子又は核酸誘導体には、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロチオエート核酸、ホスホロアミダート核酸、２’−０−メトキシエチルリボ核酸、モルホリノ核酸、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）及びロックド核酸（ＬＮＡ）、リボース環が２’−酸素と４’−炭素の間のメチレン結合によって制限されたＲＮＡ誘導体（例えば、Braasch及びCorey, Chemistry & Biology 8 (2001), 1-7を参照のこと）が含まれる。ＰＮＡは、Ｎｉｅｌｓｅｎ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４（１９９１）：１４９７；及びＥｇｈｏｌｍ等、Ｎａｔｕｒｅ ３６５（１９９３）、６６６によって記載されたように、ＤＮＡ又はＲＮＡの糖−リン酸骨格の代わりにアミド骨格を有する合成ＤＮＡ模倣体である。
本発明の核酸分子／核酸配列は、天然及び合成又は半合成由来であってもよい。したがって、核酸分子は、例えば、有機化学の従来のプロトコールに従って合成された核酸分子であってもよい。当該技術分野の当業者は、このような核酸分子の調製及び使用に慣れている（例えば、Sambrook及びRussel "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (2001)を参照のこと）。
本明細書では、含んでいるという用語は、さらなる配列、成分及び／又は方法工程が、明確に引用した配列、成分及び／又は方法工程に加えて含まれ得ることを意味する。しかし、この用語はまた、請求した主題が確かに引用した配列、成分及び／又は方法工程だけからなることを包含する。
核酸分子が引用した配列（からなる、というより）を含む実施態様では、付加ヌクレオチドが特定の配列の５’末端若しくは３’末端の何れか、又はその両方に伸長している。このような付加ヌクレオチドは、異種性又は相同性であってもよい。相同配列の場合、これらの配列は、５’及び／又は３’末端に１５００個までのヌクレオチド、例えば、１０００個までのヌクレオチドなど、９００個までのヌクレオチドなど、より好ましくは、８００個までのヌクレオチド、７００個までのヌクレオチドなど、例えば、６００個までのヌクレオチドなど、５００個までのヌクレオチドなど、さらにより好ましくは４００個までのヌクレオチド、３００個までのヌクレオチドなど、例えば、２００個までのヌクレオチドなど、１００個までのヌクレオチドなど、より好ましくは５０個までのヌクレオチド、４０個までのヌクレオチドなど、例えば、３０個までのヌクレオチドなど、２０個までのヌクレオチドなど、より好ましくは１０個までのヌクレオチド、最も好ましくは５個までのヌクレオチドを５’及び／又は３’末端に含んでいてもよい。本明細書では、「［．．．］個までのヌクレオチド」という用語は、［．．．］個より下の任意の整数を含み、具体的に引用した数を含むヌクレオチドの数に関する。例えば、「５個までのヌクレオチド」という用語は、１、２、３、４及び５個のヌクレオチドの何れかに関する。さらに、相同配列の場合、これらの実施態様は完全なゲノム又は完全な染色体は含まない。
付加される異種配列は、例えば、本発明のコード配列に動作可能に連結された異種プロモーター、並びに当該技術分野で周知で、本明細書で以下にさらに詳細に記載した調節核酸配列をさらに含んでいてもよい。したがって、本発明の文脈では、核酸配列は調節配列の制御下にあってもよい。したがって、本発明の文脈では、本発明のベクターはさらに、本明細書で記載した核酸配列に動作可能に連結された調節配列を含む。例えば、本明細書で記載したＣＸＣＲ６の誘導発現を可能にするプロモーター、転写エンハンサー及び／又は配列を使用することができる。本発明の文脈では、核酸分子は構成的又は誘導的プロモーターの制御下で発現する。適切なプロモーターは、例えば、ＣＭＶプロモーター（Qin等、PLoS One 5(5) (2010), el0611）、ＵＢＣプロモーター（Qin等、PLoS One 5(5) (2010), el0611）、ＰＧＫ（Qin等、PLoS One 5(5) (2010), el0611）、ＥＦＩＡプロモーター（Qin等、PLoS One 5(5) (2010), el0611）、ＣＡＧＧプロモーター（Qin等、PLoS One 5(5) (2010), el0611）、ＳＶ４０プロモーター（Qin等、PLoS One 5(5) (2010), el0611）、ＣＯＰＩＡプロモーター（Qin等、PLoS One 5(5) (2010), el0611）、ＡＣＴ５Ｃプロモーター（Qin等、PLoS One 5(5) (2010), el0611）、ＴＲＥプロモーター（Qin等、PLoS One. 5(5) (2010), el0611）、Ｏｃｔ３／４プロモーター（Chang等、Molecular Therapy 9 (2004), S367-S367 (doi: 10.1016/j.ymthe.2004.06.904)）又はＮａｎｏｇプロモーター（Wu等、Cell Res. 15(5) (2005), 317-24）である。
「調節配列」という用語は、それらが連結するコード配列の発現を達成するために必要なＤＮＡ配列を意味する。このような制御配列の性質は宿主生物に応じて異なる。原核生物では、制御配列は一般的にプロモーターリボソーム結合部位及びターミネーターを含む。真核生物では、一般的に制御配列は、プロモーター、ターミネーター、場合によっては、エンハンサー、トランス活性化因子又は転写因子を含む。「制御配列」という用語は、最小でも、その存在が発現に必要な成分全てを含むことを意図し、さらに有利な成分を含んでいてもよい。
さらに、さらなる目的のために、核酸分子は、例えば、チオエステル結合及び／又はヌクレオチドアナログを含有することが想定される。前記修飾は、形質導入したＴ細胞において核酸分子をエンド及び／又はエキソヌクレアーゼに対して安定化するために有用であり得る。前記核酸分子は、形質導入したＴ細胞における前記核酸分子の転写を可能にする、キメラ遺伝子を含有する適切なベクターによって転写することができる。これに関して、このようなポリヌクレオチドは「遺伝子標的化」又は「遺伝子療法的」手法のために使用することができることも理解されたい。別の実施態様では、前記核酸配列を標識する。核酸の検出方法、例えば、サザン及びノーザンブロッティング、ＰＣＲ又はプライマー伸長は、当該技術分野では周知である。この実施態様は、遺伝子療法的手法の間に前述した核酸配列がうまく導入されることを実証するスクリーニング方法のために有用であり得る。前記核酸配列は、前述の核酸配列の何れかを単独又は組み合わせて含む、組換えによって生成されたキメラ核酸配列であってもよい。本発明の文脈では、核酸分子は本発明のベクターの一部である。
したがって、本発明はまた、本発明で記載した核酸分子を含むベクターに関する。本明細書では、「ベクター」という用語は、導入した宿主細胞（すなわち、形質導入したＴ細胞）において自律的に複製することができる環状又は直鎖状核酸分子に関する。本明細書では「ベクター」は特に、通常遺伝子操作で使用されるプラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージ及びその他のベクターを意味する。本発明の文脈では、本発明のベクターは、Ｔ細胞、好ましくは、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ３＋Ｔ細胞、γδＴ細胞又はナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞、最も好ましくはＣＤ８＋Ｔ細胞の形質転換のために適切である。したがって、本発明の一態様では、本明細書で提供したベクターは発現ベクターである。発現ベクターは、文献で広く記載されている。特に、本明細書で提供したベクターは、好ましくは、組換えポリヌクレオチド（すなわち、本明細書で記載したようなＣＸＣＲ６活性を有することを特徴とする、ケモカイン受容体６（ＣＸＣＲ６）又はその断片をコードする核酸配列）並びに発現させるヌクレオチド配列に動作可能に連結された発現制御配列を含む。本明細書で提供したベクターは、好ましくはさらにプロモーターを含む。本明細書で記載したベクターはまた、選択マーカー遺伝子及び宿主（すなわち、形質導入したＴ細胞）における複製を確実にする複製開始点を含むことができる。さらに、本明細書で提供したベクターはまた、転写のための終止シグナルを含むことができる。プロモーターと終止シグナルの間には、発現を所望する核酸分子（例えば、本明細書で記載したＣＸＣＲ６をコードする核酸配列）の挿入を可能にする、好ましくは少なくとも１つの制限部位又はポリリンカーがある。当業者であれば、このような挿入を実行する方法を知っている。本発明のベクターを形成するために本発明の核酸分子を含むのに適切なベクターの例は、当該技術分野で公知である。例えば、本発明の文脈では、適切なベクターには、本発明の核酸分子（すなわち、本明細書で記載したようなＣＸＣＲ６活性を有することを特徴とするケモカイン受容体６（ＣＸＣＲ６）又はその断片をコードする核酸配列）を組み込むコスミド、プラスミド（例えば、裸又はリポソームに含まれている）及びウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス）が含まれる。好ましくは、本発明のベクターはウイルスベクターである。より好ましくは、本発明のベクターはレンチウイルスベクターであり、さらにより好ましくは本発明のベクターはレトロウイルスベクター（例えば、ｐＭＰ７１ベクター）である。したがって、本発明の文脈では、ベクターはレンチウイルスベクター又はレトロウイルスベクターである。本発明のベクターは、ケモカイン受容体６（ＣＸＣＲ６）をコードする本発明の核酸配列の構成的又は条件的発現を可能にする。この文脈では、ＣＸＣＲ６発現のために適切なレトロウイルスベクターは当該技術分野で公知である、例えば、ＳＡＭＥＮ ＣＭＶ／ＳＲａ（Clay等、J. Immunol. 163 (1999), 507-513）、ＬＺＲＳ−ｉｄ３−ＩＨＲＥＳ（Heemskerk等、J. Exp. Med. 186 (1997), 1597-1602）、ＦｅＬＶ（Neil等、Nature 308 (1984), 814-820）、ＳＡＸ（Kantoff等、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986), 6563-6567）、ｐＤＯＬ（Desiderio, J. Exp. Med. 167 (1988), 372-388）、Ｎ２（Kasid等、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990), 473-477）、ＬＮＬ６（Tiberghien等、Blood 84 (1994), 1333-1341）、ｐＺｉｐＮＥＯ（Chen等、J. Immunol. 153 (1994), 3630-3638）、ＬＡＳＮ（Mullen等、Hum. Gene Ther. 7 (1996), 1123-1129）、ｐＧｌＸｓＮａ（Taylor等、J. Exp. Med. 184 (1996), 2031-2036）、ＬＣＮＸ（Sun等、Hum. Gene Ther. 8(1997) , 1041-1048）、ＳＦＧ（Gallardo等、Blood 90 (1997)、ＬＸＳＮ（Sun等、Hum. Gene Ther. 8 (1997), 1041-1048）、ＳＦＧ（Gallardo等、Blood 90 (1997), 952-957）、ＨＭＢ−Ｈｂ−Ｈｕ（Vieillard 等、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (1997), 11595-11600）、ｐＭＶ７（Cochlovius等、 Cancer Immunol. Immunother. 46 (1998), 61-66）、ｐＳＴＩＴＣＨ（Weitjens等、Gene Ther 5(1998) , 1195-1203）、ｐＬＺＲ（Yang等、Hum. Gene Ther. 10 (1999), 123-132）、ｐＢＡＧ（Wu等、Hum. Gene Ther. 10 (1999), 977-982）、ｒＫａｔ．４３．２６７ｂｎ（Gilham等、J. Immunother. 25 (2002), 139-151）、ｐＬＧＳＮ（Engels等、Hum. Gene Ther. 14 (2003), 1155-1168）、ｐＭＰ７１（Engels等、Hum. Gene Ther. 14 (2003), 1155-1168）、ｐＧＣＳＡＭ（Morgan等、J. Immunol. 171 (2003), 3287-3295）、ｐＭＳＧＶ（Zhao等、J. Immunol. 174 (2005), 4415-4423）又はｐＭＸ（de Witte等, J. Immunol. 181 (2008), 5128-5136）である。さらに、本発明の文脈では、本発明の核酸配列によってコードされるようなケモカイン受容体６（ＣＸＣＲ６）の発現のために適切なレンチウイルスベクターは、例えば、ＰＬ−ＳＩＮレンチウイルスベクター（Hotta等、Nat Methods. 6(5) (2009), 370-376）、ｐｌ５６ＲＲＬ−ｓｉｎＰＰＴ−ＣＭＶ−ＧＦＰ−ＰＲＥ／ＮｈｅＩ（Campeau等、PLoS One 4(8) (2009), e6529)、ｐＣＭＶＲ８．７４（Ａｄｄｇｅｎｅカタログ番号２２０３６）、ＦＵＧＷ（Lois等、Science 295(5556) (2002), 868-872）、ｐＬＶＸ−ＥＦｌ（Ａｄｄｇｅｎｅカタログ番号６４３６８）、ｐＬＶＥ（Brunger等、Proc Natl Acad Sci U S A 111(9) (2014), E798-806）、ｐＣＤＨｌ−ＭＣＳｌ−ＥＦｌ（Hu等、Mol Cancer Res. 7(11) (2009), 1756-1770）、ｐＳＬＩＫ（Wang等、Nat Cell Biol. 16(4) (2014), 345-356）、ｐＬＪＭｌ（Solomon等、Nat Genet. 45(12) (2013), 1428-30）、ｐＬＸ３０２（Kang等、Sci Signal. 6(287) (2013), rsl3）、ｐＨＲ−ＩＧ（Xie等、J Cereb Blood Flow Metab. 33(12) (2013), 1875-85）、ｐＲＲＬＳＩＮ（Ａｄｄｇｅｎｅカタログ番号６２０５３）、ｐＬＳ（Miyoshi等、J Virol. 72(10) (1998), 8150-8157）、ｐＬＬ３．７（Lazebnik等、J Biol Chem. 283(7) (2008), 11078-82）、ＦＲＩＧ（Raissi等、Mol Cell Neurosci. 57 (2013), 23-32）、ｐＷＰＴ（Ritz-Laser等、Diabetologia. 46(6) (2003), 810-821）、ｐＢＯＢ（Marr等、J Mol Neurosci. 22(1-2) (2004), 5-11）又はｐＬＥＸ（Ａｄｄｇｅｎｅカタログ番号２７９７６）である。
本発明はまた、本発明の核酸配列によってコードされるケモカイン受容体６（ＣＸＣＲ６）を発現する、形質導入したＴ細胞、好ましくは、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ３＋Ｔ細胞、γδＴ細胞又はナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞、最も好ましくはＣＤ８＋Ｔ細胞に関する。したがって、本発明は、（ａ）配列番号１（ヒト）又は３（マウス）の核酸配列、及び（ｂ）配列番号１（ヒト）又は３（マウス）の配列と少なくとも８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一で、ケモカイン受容体６（ＣＸＣＲ６）活性を有することを特徴とする核酸配列からなる群から選択される核酸配列によってコードされたケモカイン受容体（ＣＸＣＲ６）を発現するベクターで形質導入したＴ細胞、好ましくはＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ３＋Ｔ細胞、γδＴ細胞又はナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞、最も好ましくはＣＤ８＋Ｔ細胞に関する。したがって、本発明の文脈では、形質導入したＴ細胞は、ケモカイン受容体６（ＣＸＣＲ６）をコードする本発明の核酸配列又は本発明のベクターを含むことができ、本発明の核酸配列によってコードされるようなケモカイン受容体６（ＣＸＣＲ６）を発現する。したがって、本発明の文脈では、形質導入したＴ細胞は、（ａ）配列番号１（ヒト）又は３（マウス）の核酸配列、及び（ｂ）配列番号１（ヒト）又は３（マウス）の配列と少なくとも８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一で、ケモカイン受容体６（ＣＸＣＲ６）活性を有することを特徴とする核酸配列からなる群から選択される核酸配列によってコードされるケモカイン受容体６（ＣＸＣＲ６）を発現する、形質導入したＴ細胞、好ましくはＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ３＋Ｔ細胞、γδＴ細胞又はナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞、最も好ましくはＣＤ８＋Ｔ細胞に関する。
本発明の文脈では、「形質導入したＴ細胞」という用語は、遺伝子的に修飾されたＴ細胞（すなわち、核酸分子が計画的に導入されたＴ細胞）に関する。本明細書で提供した形質導入したＴ細胞は、本発明のベクターを含むことができる。本発明の文脈では、「形質導入したＴ細胞」という用語は、（ａ）配列番号１（ヒト）又は３（マウス）の核酸配列、及び（ｂ）配列番号１（ヒト）又は３（マウス）の配列と少なくとも８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一で、ケモカイン受容体６（ＣＸＣＲ６）活性を有することを特徴とする核酸配列からなる群から選択される核酸配列によってコードされるケモカイン受容体６（ＣＸＣＲ６）を発現しないことを特徴とするＴ細胞（一又は複数）、好ましくはＣＤ８＋Ｔ細胞（一又は複数）、ＣＤ４＋Ｔ細胞（一又は複数）、ＣＤ３＋Ｔ細胞（一又は複数）、γδＴ細胞（一又は複数）又はナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞（一又は複数）、最も好ましくはＣＤ８＋Ｔ細胞（一又は複数）に関する。好ましくは、本明細書で提供した形質導入したＴ細胞は、ケモカイン受容体６（ＣＸＣＲ６）をコードする本発明の核酸配列及び／又は本発明のベクターを含む。本発明の形質導入したＴ細胞は、一過性に、又は安定的に外来ＤＮＡ（すなわち、Ｔ細胞に導入した核酸分子）を発現するＴ細胞であってもよい。特に、ケモカイン受容体６（ＣＸＣＲ６）をコードする本発明の核酸配列は、レトロウイルス又はレンチウイルス形質導入を使用することによって安定的にＴ細胞のゲノムに組み込むことができる。ｍＲＮＡトランスフェクションを使用することによって、本明細書で記載したＣＸＣＲ６をコードする本発明の核酸分子は一過性に発現することができる。好ましくは、本明細書で提供した形質導入したＴ細胞は、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクター又はレンチウイルスベクター）によってＴ細胞に核酸分子を導入することによって遺伝子的に修飾された。発現は、使用した系に応じて、構成的又は構造的であってもよい。ケモカイン受容体６（ＣＸＣＲ６）は、７膜貫通型受容体であり、それによって受容体の一部のみが空間の空いた細胞内から接近することができる。一旦Ｔ細胞に形質導入したら、形質導入したＴ細胞の表面上でのＣＸＣＲ６発現は、フローサイトメトリー又は顕微鏡によって抗ＣＸＣＲ６抗体を使用して検出することができる。ＣＸＣＲ６検出用の抗体は、文献中に広く記載されており、市販されている。具体的には、抗ＣＸＣＲ６抗体はＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，ＭＮ、ＵＳＡからカタログ番号「ＭＡＢ６９９」として入手可能である。市販の抗ＣＸＣＲ６抗体の完全なリストは、Ｂｉｏｃｏｍｐａｒｅのホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｃｏｍｐａｒｅ．ｃｏｍ／ｐｆｕ／１１０４４７／ｓｏｉｄｓ／３２１７８１／Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ／ＣＸＣＲ６を参照のこと）に見いだすことができる。
Ｔ細胞は、抗原特異的な方法で標的を認識する適応免疫系の細胞である。これらの細胞は、ＣＤ３及びＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の表面発現を特徴としており、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）の場合、コグネイト抗原を認識する。Ｔ細胞はさらに、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞に細分することができる。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、抗原提示細胞によって主に発現されるＭＨＣクラスＩＩ分子の場合にＴＣＲによって抗原を認識する。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ヒトの体のほとんどの細胞に存在するＭＨＣクラスＩ分子の場合に抗原を認識する。ＣＤ４＋Ｔ細胞の主要な機能は、ＣＤ８＋Ｔ細胞などのその他の抗原特異的細胞に「援助」、すなわち、同時刺激要素を提供することであるが、ＣＤ８＋は、ＴＣＲ結合後は標的細胞に対して直接細胞傷害性である。
ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞を検出するための方法は、当技術分野の当業者には周知で、フローサイトメトリー、顕微鏡、免疫組織化学、ＲＴ−ＰＣＲ又はウェスタンブロットが含まれる（Kobold, J Natl Cancer Inst (2015), 107; Kobold, J Natl Cancer Inst 107 (2015), 364）。
本発明の形質導入したＴ細胞は、例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、γδＴ細胞又はナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞であってもよい。好ましくは、本発明の形質導入したＴ細胞は、形質導入したＣＤ８＋Ｔ細胞、形質導入したＣＤ４＋Ｔ細胞、γδＴ細胞又はナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞であり、より好ましくは本発明の形質導入したＴ細胞は、形質導入したＣＤ８＋Ｔ細胞又は形質導入したＣＤ４＋Ｔ細胞であり、最も好ましくは、形質導入したＴ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞である。したがって、本発明の文脈では、形質導入したＴ細胞は、最も好ましくはＣＤ８＋Ｔ細胞である。さらに、本発明の文脈では、形質導入したＴ細胞は自己Ｔ細胞であることも好ましい。
したがって、本発明の文脈では、形質導入したＴ細胞は、好ましくは形質導入した自己ＣＤ８＋Ｔ細胞、形質導入した自己ＣＤ４＋Ｔ細胞、形質導入した自己γδＴ細胞又は形質導入した自己ナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞である。対象から単離した自己Ｔ細胞の使用に加えて、本発明はまた、同種異系Ｔ細胞の使用を含む。したがって、本発明の文脈では、形質導入したＴ細胞はまた、形質導入した同種異系ＣＤ８＋Ｔ細胞などの同種異系Ｔ細胞であってもよい。同種異系Ｔ細胞の使用は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）が、Ｔ細胞によって認識される抗原エピトープと一緒に、特定の応答細胞集団、すなわちＴ細胞集団に限定されるＭＨＣ分子クラスＩ又はクラスＩＩを発現するならば、同種異系Ｔ細胞は外来抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって提示された特定の抗原エピトープを認識することができるという事実に基づく。「同種異系Ｔ細胞」とは、そのドナーがレシピエントと同種であるが、遺伝子的にはレシピエントとは同一ではないＴ細胞である。したがって、同種異系という用語は、個体／対象に適合するヒト白血球抗原（ＨＬＡ）を有し、例えば、本明細書で記載したＣＸＣＲ６を発現する形質導入Ｔ細胞によって処置され、無関係のドナー個体／対象から生じる細胞を意味する。「自己Ｔ細胞」とは、本明細書で記載した形質導入したＴ細胞で処置した対象から本明細書で前述したように単離／入手されるＴ細胞を意味する。したがって、「自己Ｔ細胞」は、ドナー及びレシピエントが同じ個体であるＴ細胞である。
前述した通りに、本発明の形質導入したＴ細胞は核酸配列で形質導入され、本明細書で提供したケモカイン受容体６（ＣＸＣＲ６）を発現する。腫瘍浸潤リンパ細胞（ＴＩＬ、Dudley等、J Clin Oncol. 31(17) (2013), 2152-2159 (doi: 10.1200/JCO.2012.46.6441)）又はフローサイトメトリーで腫瘍特異性によって患者の末梢血から選別された抗原特異的細胞（Hunsucker等、Cancer Immunol Res. 3(3) (2015), 228-235 (doi: 10.1158/2326-6066.CIR-14-0001)）などの天然の抗腫瘍特異性を有する細胞の場合、本明細書で記載した細胞は、本発明のキメラ受容体６（ＣＸＣＲ６）によってのみ形質導入される。しかし、本発明の形質導入したＴ細胞は、さらなる核酸分子、例えば、Ｔ細胞受容体又はキメラ抗原受容体をコードする核酸配列で同時形質導入することができる。
本発明によれば、「Ｔ細胞受容体」という用語は当該技術分野で通常公知である。特に、本明細書では「Ｔ細胞受容体」という用語は、以下の３つの基準：（ｉ）腫瘍特異性、（ｉｉ）（ほとんどの）腫瘍細胞の認識、これは抗原又は標的が（ほとんどの）腫瘍細胞において発現していることを意味する、及び（ｉｉｉ）ＴＣＲが治療する対象のＨＬＡ型に一致することを満たすならば、いかなるＴ細胞受容体をも意味する。この文脈では、ＷＴ１（ウィルムス腫瘍特異的抗原1；配列情報は、例えば、Sugiyama, Japanese Journal of Clinical Oncology 40 (2010), 377-87を参照のこと）、ＭＡＧＥ（配列は、例えば、国際公開題２００７／０３２２５５号及びＰＣＴ／ＵＳ２０１１／５７２７２を参照のこと）、ＳＳＸ（米国特許仮出願第６１／３８８９８３号）、ＮＹ−ＥＳＯ−１（配列情報は、例えば、ＰＣＴ／ＧＢ２００５／００１９２４を参照のこと）及び／又はＨＥＲ２ｎｅｕ（配列情報は、国際公開第２０１１／０２８０８９４号を参照こと）を認識する受容体などの前述の３つの基準を満たす適切なＴ細胞受容体は、当該技術分野で公知である。
「キメラ抗原受容体」又は「キメラ受容体」という用語は、当該技術分野で公知で、ＣＤ３ｚ及びＣＤ２８のシグナルドメインにスペーサー配列によって融合した１本鎖抗体ドメインの細胞外部分から構成される受容体を意味する。さらに、このキメラ抗原受容体は、腫瘍特異性を実現し、ほとんどの腫瘍細胞の認識を可能にする。適切なキメラ受容体には、抗ＥＧＦＲｖ３−ＣＡＲ（配列については国際公開第２０１２／１３８４７５号を参照のこと）、抗ＣＤ２２−ＣＡＲ（国際公開第２０１３／０５９５９３号を参照のこと）、抗ＢＣＭＡ−ＣＡＲ（国際公開第２０１３／１５４７６０号を参照のこと）、抗ＣＤ１９−ＣＡＲ（国際公開第２０１２／０７９０００号又は米国特許出願第２０１４／０２７１６３５号を参照のこと）、抗ＣＤ１２３−ＣＡＲ（米国特許出願第２０１４／０２７１５８２号を参照のこと）、抗ＣＤ３０−ＣＡＲ（国際公開第２０１５／０２８４４４号を参照のこと）又は抗メソテリン−ＣＡＲ（国際公開第２０１３／１４２０３４号を参照のこと）が含まれる。
本発明はまた、本発明の核酸配列によってコードされるケモカイン受容体６（ＣＸＣＲ６）を発現する形質導入したＴ細胞を生成するための方法であって、Ｔ細胞、好ましくはＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞γδＴ細胞又はナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞、最も好ましくは、ＣＤ８＋Ｔ細胞を、本発明のベクターで形質導入する工程、形質導入したＴ細胞を前記形質導入したＴ細胞の中又は上でのＣＸＣＲ６の発現を可能にする条件下で培養する工程、及び形質導入したＴ細胞を回収する工程を含む、方法に関する。
本発明の文脈では、本発明の形質導入したＴ細胞は、好ましくは以下のプロセスによって生成／入手することができる：Ｔ細胞、好ましくは、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、γδＴ細胞又はナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞、最も好ましくはＣＤ８＋Ｔ細胞を、対象、好ましくはヒト患者から単離／入手する。Ｔ細胞、好ましくは、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、γδＴ細胞又はナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞、最も好ましくはＣＤ８＋Ｔ細胞を患者又はドナーから単離／入手する方法は、当該技術分野で周知であり、本発明の文脈では、対象／患者又はドナーのＴ細胞、好ましくは、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、γδＴ細胞又はナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞、最も好ましくはＣＤ８＋Ｔ細胞は、血液採取又は骨髄の除去によって単離することができる。対象／患者又はドナーの試料としてＴ細胞を単離／入手した後、Ｔ細胞を試料のその他の成分から分離する。試料からＴ細胞を分離するいくつかの方法は公知で、限定はしないが、例えば、Ｔ細胞を患者又はドナーの末梢血試料から入手するための白血球除去、ＦＡＣＳｏｒｔ機器を使用したＴ細胞の単離／入手、手動の、又はマイクロマニュピレータの使用による、生きているＴ細胞を有する新鮮な生検標本からの生きている、又は死んだＴ細胞の採取が含まれる（例えば、Dudley, Immunother. 26 (2003), 332-342; Robbins, Clin. Oncol. 29 (201 1), 917-924又はLeisegang, J. Mol. Med. 86 (2008), 573-58を参照のこと）。本明細書では、「新鮮な患者の生検」という用語は、対象から外科的に、又はその他の任意の公知の手段によって取り出された組織、好ましくは腫瘍組織並びに腫瘍細胞株又は腫瘍組織／腫瘍細胞から（単離した）細胞を意味する。単離した／入手したＴ細胞、好ましくはＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、γδＴ細胞又はナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞、最も好ましくは、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、その後培養し、例えば、抗ＣＤ３抗体を使用することによって、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８モノクローナル抗体を使用することによって、及び／又はサイトカイン、例えば、インターロイキン−２（ＩＬ−２）及び／又はインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）の存在下で抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体を使用することによって増殖させる（例えば、Dudley, Immunother. 26 (2003), 332-342又はDudley, Clin. Oncol. 26 (2008), 5233-5239を参照のこと）。
その後の工程では、Ｔ細胞は、当該技術分野で公知の方法によって人工的／遺伝子的に修飾され／形質導入される（例えば、Lemoine, J Gene Med 6 (2004), 374-386を参照のこと）。細胞、特にＴ細胞を形質導入する方法は、当該技術分野で公知で、限定はしないが、核酸又は組換え核酸を形質導入する場合、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、カチオン脂質法又はリポソーム法が含まれる。形質導入する核酸は、従来法で、高い効率で、市販のトランスフェクション試薬、例えば、リポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって製造されている、カタログ番号１１６６８０２７）を使用することによって形質導することができる。ベクターを使用する場合、ベクターは、ベクターがプラスミドベクター（すなわち、本発明の文脈では、ウイルスベクターではないベクター）である限り、前述の核酸と同じ方法で形質導入することができ、Ｔ細胞を形質導入する方法には、レトロウイルス又はレンチウイルスによるＴ細胞形質導入並びにｍＲＮＡトランスフェクションが含まれる。「ｍＲＮＡトランスフェクション」とは、本発明の場合の形質導入するＴ細胞におけるＣＸＣＲ６のように、関心のあるタンパク質を一過性に発現するための当業者に周知の方法を意味する。簡単に説明すると、Ｔ細胞は、エレクトロポレーション系（例えば、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ、Ｂｉｏ−Ｒａｄなど）を使用することによって、本明細書で記載したＣＸＣＲ６をコードするｍＲＮＡでエレクトロポレーションし、その後、前述したような標準的細胞（例えば、Ｔ細胞）培養プロトコールによって培養することができる（Zhao等、Mol Ther. 13(1) (2006), 151-159を参照のこと）。好ましくは、本発明の形質導入したＴ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、γδＴ細胞又はナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞、最も好ましくはＣＤ８＋Ｔ細胞であり、レンチウイルスによって、又は、最も好ましくはレトロウイルスＴ細胞形質導入によって生成する。
この文脈では、Ｔ細胞を形質導入するために適切なレトロウイルスベクターは当該技術分野で公知で、ＳＡＭＥＮ ＣＭＶ／ＳＲａ（Clay等、J. Immunol. 163 (1999), 507-513）、ＬＺＲＳ−ｉｄ３−ＩＨＲＥＳ（Heemskerk等、J. Exp. Med. 186 (1997), 1597-1602）、ＦｅＬＶ（Neil等、Nature 308 (1984), 814-820）、ＳＡＸ（Kantoff等、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986), 6563-6567）、ｐＤＯＬ（Desiderio, J. Exp. Med. 167 (1988), 372-388）、Ｎ２（Kasid等、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990), 473-477）、ＬＮＬ６（Tiberghien等、Blood 84 (1994), 1333-1341）、ｐＺｉｐＮＥＯ（Chen等、J. Immunol. 153 (1994), 3630-3638）、ＬＡＳＮ（Mullen等、Hum. Gene Ther. 7 (1996), 1123-1129）、ｐＧｌＸｓＮａ（Taylor等、J. Exp. Med. 184 (1996), 2031-2036）、ＬＣＮＸ（Sun等、Hum. Gene Ther. 8 (1997), 1041-1048）、ＳＦＧ（Gallardo等、Blood 90 (1997）、ＬＸＳＮ（Sun等、Hum. Gene Ther. 8 (1997), 1041-1048）、ＳＦＧ（Gallardo等、Blood 90(1997) , 952-957）、ＨＭＢ−Ｈｂ−Ｈｕ（Vieillard等、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (1997), 11595-11600）、ｐＭＶ７（Cochlovius等、Cancer Immunol. Immunother. 46 (1998), 61-66）、ｐＳＴＩＴＣＨ（Weitjens等、Gene Ther 5 (1998), 1195-1203）、ｐＬＺＲ（Yang等、Hum. Gene Ther. 10 (1999), 123-132）、ｐＢＡＧ（Wu等、Hum. Gene Ther. 10 (1999), 977-982）、ｒＫａｔ．４３．２６７ｂｎ（Gilham等、J. Immunother. 25 (2002), 139-151）、ｐＬＧＳＮ（Engels等、Hum. Gene Ther. 14 (2003), 1155-1168）、ｐＭＰ７１（Engels等、Hum. Gene Ther. 14 (2003), 1155-1168）、ｐＧＣＳＡＭ（Morgan等、J. Immunol. 171 (2003), 3287-3295）、ｐＭＳＧＶ（Zhao等、J. Immunol. 174 (2005), 4415-4423）又はｐＭＸ（de Witte等、J. Immunol. 181 (2008), 5128-5136）などである。本発明の文脈では、Ｔ細胞を形質導入するために適切なレンチウイルスベクターは、例えば、ＰＬ−ＳＩＮレンチウイルスベクター（Hotta等、Nat Methods. 6(5) (2009), 370-376）、ｐｌ５６ＲＲＬ−ｓｉｎＰＰＴ−ＣＭＶ−ＧＦＰ−ＰＲＥ／ＮｈｅＩ（Campeau等、PLoS One 4(8) (2009), e6529）、ｐＣＭＶＲ８．７４（Ａｄｄｇｅｎｅカタログ番号２２０３６）、ＦＵＧＷ（Lois等、Science 295(5556) (2002), 868-872）、ｐＬＶＸ−ＥＦｌ（Ａｄｄｇｅｎｅカタログ番号６４３６８）、ｐＬＶＥ（Brunger等、Proc Natl Acad Sci U S A 111(9) (2014), E798-806）、ｐＣＤＨｌ−ＭＣＳｌ−ＥＦｌ（Hu等、Mol Cancer Res. 7(11) (2009), 1756-1770）、ｐＳＬＩＫ（Wang等、Nat Cell Biol. 16(4) (2014), 345-356）、ｐＬＪＭｌ（Solomon等、Nat Genet. 45(12) (2013), 1428-30）、ｐＬＸ３０２（Kang等、Sci Signal. 6(287) (2013), rsl3）、ｐＨＲ−ＩＧ（Xie等、J Cereb Blood Flow Metab. 33(12) (2013), 1875-85）、ｐＲＲＬＳＩＮ（Ａｄｄｇｅｎｅカタログ番号６２０５３）、ｐＬＳ（Miyoshi等、J Virol. 72(10)(1998) , 8150-8157）、ｐＬＬ３．７（Lazebnik等、J Biol Chem. 283(7) (2008), 11078-82）、ＦＲＩＧ（Raissi等、Mol Cell Neurosci. 57 (2013), 23-32）、ｐＷＰＴ（Ritz-Laser等、Diabetologia. 46(6) (2003), 810-821）、ｐＢＯＢ（Marr等、J Mol Neurosci. 22(1-2) (2004), 5-11）又はｐＬＥＸ（Ａｄｄｇｅｎｅカタログ番号２７９７６）である。
本発明の形質導入したＴ細胞は、好ましくは制御された条件下で、天然の環境外で増殖させる。特に、「培養する」という用語は、多細胞真核生物、好ましくはヒト患者に由来する細胞（例えば、本発明の形質導入したＴ細胞）をインビトロで増殖させることを意味する。細胞の培養は、元の組織源から分離された細胞を生きたまま維持する研究室技術である。本明細書では、本発明の形質導入したＴ細胞は、前記形質導入したＴ細胞中又は上での本明細書で記載したＣＸＣＲ６の発現を可能にする条件下で培養する。導入遺伝子（すなわち、本明細書で記載したＣＸＣＲ６）の発現を可能にする条件は、当該技術分野で通常公知であり、例えば、アゴニストの抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体並びにインターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン７（ＩＬ−７）、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）及び／又はインターロイキン１５（ＩＬ−１５）などのサイトカインの添加を含む。培養した形質導入したＴ細胞において本明細書で記載したＣＸＣＲ６を発現させた後、形質導入したＴ細胞を培養物から（すなわち、培地から）回収する（すなわち、再抽出する）。
本発明には、本発明の方法によって生成／入手できる本発明の核酸分子によってコードされるようなケモカイン受容体６（ＣＸＣＲ６）を発現する形質導入したＴ細胞も包含される。
さらに、本発明は、本発明の核酸配列によってコードされるケモカイン受容体６（ＣＸＣＲ６）を発現する形質導入したＴ細胞又は前記で開示した方法によって入手／生成したような形質導入したＴ細胞を含む薬学的組成物／医薬を提供する。本発明の文脈では、前記組成物は、任意選択的に、担体、安定剤及び／又は賦形剤に適切な製剤をさらに含む薬学的組成物である。
本発明によれば、「医薬」という用語は、「薬学的組成物」という用語と同義に使用され、患者、好ましくはヒト患者に投与するための組成物に関する。したがって、本発明は、本発明の核酸配列によってコードされるような、又は医薬として使用するために本発明の方法によって生成／入手できるケモカイン受容体６（ＣＸＣＲ６）を発現する、形質導入したＴ細胞、好ましくは、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、γδＴ細胞又はナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞、最も好ましくはＣＤ８＋Ｔ細胞を提供する。本発明の文脈では、医薬／薬学的組成物は、形質導入したＴ細胞を単離／入手した患者に投与する。本発明の文脈では、患者はヒト患者を意味する。さらに、本発明の文脈では、患者はＣＸＣＬ１６過剰発現を特徴とする疾患に罹患している。本発明の文脈では、ＣＸＣＬ１６過剰発現を特徴とする疾患は当該技術分野で公知で、例えば、結腸直腸がん（Wagsater等、Int J Mol Med. 14(1) (2004), 65-69）、脳がん（Ludwig等、J Neurochem. 93(5) (2005), 1293-1303）、卵巣がん（Son等、Cancer Biol Ther. 6(8) (2007), 1302-1312）、前立腺がん（Lu 等、Mol Cancer Res. 6(4) (2008), 546-554）、膵臓がん（Wente等、Int J Oncol. 33(2) (2008), 297-308）、乳がん（Matsumura等、J Immunol. 181(5) (2008), 3099-3107）、腎がん（Gutwein等、Eur J Cancer. 45(3) (2009), 478-89）、鼻咽頭がん腫（Parsonage等、Am J Pathol. 180(3) (2012), 1215-22）、肝細胞がん腫（Gao等、Cancer Res. 72(14) (2012), 3546-3556）、胃がん（Xing等、Hum Pathol. 43(12) (2012), 2299-2307）、子宮頸がん（Huang等、Chin J Cancer. 32(5) (2013), 289-296）、膀胱がん（Lee等、Oncol Lett. 5(1) (2013), 229-235）、リンパ腫（Liu等、Oncol Rep. 30(2) (2013), 783-792）、肉腫（Na等、Hum Pathol. 45(4) (2014), 753-760）又は肺がん（Hu等、PLoS One. 9(6) (2014), e990562014）が含まれる。したがって、本発明の文脈では、ＣＸＣＬ１６過剰発現を特徴とする疾患とは、本発明の文脈では、結腸直腸がん、脳がん、卵巣がん、前立腺がん、膵臓がん、乳がん、腎がん、鼻咽頭がん腫、肝細胞がん腫、胃がん、子宮頸がん、膀胱がん、リンパ腫、肉腫及び肺がんからなる群から選択される疾患を意味する。
本発明の文脈では、本発明の形質導入したＴ細胞又は本発明の方法によって生成／入手可能な形質導入したＴ細胞を含む薬学的組成物は、介在治療プロトコールと組み合わせて投与する。このような介在治療プロトコールの例には、限定はしないが、鎮痛剤の投与、化学療法薬の投与、疾患又はその症候の外科的処置が含まれる。したがって、本明細書で開示した治療レジメンは、本明細書で記載したような、又は当該技術分野で公知のような疾患又はその症候の治療又は予防のために適切な治療プロトコールと一緒にしない、又は１つ若しくは１を超えるそれらの治療プロトコールと一緒にした、本明細書で記載したようなＣＸＣＲ６を発現する形質導入したＴ細胞の投与を包含する。
したがって、本発明の文脈では、本発明の核酸配列によってコードされるようなケモカイン受容体６（ＣＸＣＲ６）を発現する形質導入したＴ細胞は、増殖性疾患、好ましくはがんの治療のために使用することができる。より好ましくは、本明細書で記載したようなケモカイン受容体６（ＣＸＣＲ６）を発現する本明細書で提供した形質導入したＴ細胞は、ＣＸＣＬ１６過剰発現を特徴とする疾患（好ましくは、がん）の治療のために使用される。ケモカイン受容体６（ＣＸＣＲ６）を発現する本明細書で提供した形質導入したＴ細胞で治療することが好ましいがんの種類は、本明細書で前述している。したがって、本明細書で記載した核酸配列によってコードされるケモカイン受容体６（ＣＸＣＲ６）を発現する形質導入したＴ細胞は、腫瘍細胞がＣＸＣＬ１６を過剰発現するいかなる疾患も治療する方法において使用することができる。治療法には、好ましくは、血液採取又は骨髄の除去による細胞の単離／収集のような前述した方法による細胞収集が関与する。その後、単離した細胞は、ウイルスによって、又は融合受容体によるｍＲＮＡエレクトロポレーションによって修飾され、（さらなる核酸分子で、例えば、Ｔ細胞受容体又はキメラ受容体をコードする核酸配列で、任意選択的に同時形質導入され）る。前記で概略を述べたように、細胞増殖後、形質導入したＴ細胞、好ましくは、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、γδＴ細胞又はナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞、最も好ましくはＣＤ８＋Ｔ細胞は患者の静脈内に戻される。さらに、本発明は、Ｔ細胞、好ましくはＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、γδＴ細胞又はナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞、最も好ましくは、ＣＤ８＋Ｔ細胞を対象から単離する工程、前記単離したＴ細胞を本明細書で前述したケモカイン受容体６（ＣＸＣＲ６）をコードする核酸で形質導入する工程、前記単離したＴ細胞をさらなる核酸分子で、例えば、前述のＴ細胞受容体又はキメラ受容体をコードする核酸配列で同時形質導入する工程、形質導入したＴ細胞を増殖させる工程、及び形質導入したＴ細胞を前記対象に投与して戻す工程を含む、疾患を治療するための方法を提供する。本明細書で記載したこの治療方法は、例えば、１週間に１回又は２回反復することができる。
本発明はまた、
（ａ）対象からＴ細胞、好ましくはＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、γδＴ細胞又はナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞、最も好ましくはＣＤ８＋Ｔ細胞を単離する工程、
（ｂ）前記単離したＴ細胞、例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞を、
（ｉ）配列番号１又は３の核酸配列、及び
（ｉｉ）配列番号１又は３の配列と少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一で、ケモカイン受容体６（ＣＸＣＲ６）活性を有することを特徴とする核酸配列
からなる群から選択される核酸配列を含むベクターで形質導入する工程、及び
（ｃ）前記形質導入したＴ細胞、例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞を前記対象に投与する工程
を含む、対象におけるＣＸＣＬ１６過剰発現を特徴とする疾患の治療方法に関する。
（ａ）対象からＴ細胞、好ましくはＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、γδＴ細胞又はナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞、最も好ましくはＣＤ８＋Ｔ細胞を単離する工程、
（ｂ）前記単離したＴ細胞、例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞を、
（ｉ）配列番号１又は３の核酸配列、及び
（ｉｉ）配列番号１又は３の配列と少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一で、ケモカイン受容体６（ＣＸＣＲ６）活性を有することを特徴とする核酸配列
からなる群から選択される核酸配列を含むベクターで形質導入する工程、及び
（ｃ）前記形質導入したＴ細胞、例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞を前記対象に投与する工程
を含む、対象におけるＣＸＣＬ１６過剰発現を特徴とする疾患の治療方法に関する。
本発明の文脈では、前記形質導入したＴ細胞、例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、前記対象に静脈内注入によって投与する。
さらに、本発明は、
（ａ）対象からＴ細胞、好ましくはＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、γδＴ細胞又はナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞、最も好ましくはＣＤ８＋Ｔ細胞を単離する工程、
（ｂ）前記単離したＴ細胞、例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞を、
（ｉ）配列番号１又は３の核酸配列、及び
（ｉｉ）配列番号１又は３の配列と少なくとも８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一で、ケモカイン受容体６（ＣＸＣＲ６）活性を有することを特徴とする核酸配列
からなる群から選択される核酸配列を含むベクターで形質導入する工程、及び
（ｃ）前記単離したＴ細胞、例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞をＴ細胞受容体で同時形質導入する工程、及び
（ｄ）Ｔ細胞、例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞を、例えば、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体によって増殖させる工程、及び
（ｅ）形質導入したＴ細胞、例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞を前記対象に投与する工程
を含む、ＣＸＣＬ１６過剰発現を特徴とする疾患の治療方法を提供する。
（ａ）対象からＴ細胞、好ましくはＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、γδＴ細胞又はナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞、最も好ましくはＣＤ８＋Ｔ細胞を単離する工程、
（ｂ）前記単離したＴ細胞、例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞を、
（ｉ）配列番号１又は３の核酸配列、及び
（ｉｉ）配列番号１又は３の配列と少なくとも８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一で、ケモカイン受容体６（ＣＸＣＲ６）活性を有することを特徴とする核酸配列
からなる群から選択される核酸配列を含むベクターで形質導入する工程、及び
（ｃ）前記単離したＴ細胞、例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞をＴ細胞受容体で同時形質導入する工程、及び
（ｄ）Ｔ細胞、例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞を、例えば、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体によって増殖させる工程、及び
（ｅ）形質導入したＴ細胞、例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞を前記対象に投与する工程
を含む、ＣＸＣＬ１６過剰発現を特徴とする疾患の治療方法を提供する。
「治療」、「治療する」などの用語は、本明細書では全般的に、所望する薬理的及び／又は生理的効果を得ることを意味するために使用する。この効果は、疾患又はその症候を完全に又は部分的に予防する観点から予防的であってもよく、並びに／或いは疾患及び／又は疾患に起因する有害作用の部分的又は完全な治癒の観点から治療的であってもよい。本明細書では、「治療」という用語は、対象における疾患のいかなる治療も含み、（ａ）疾患にかかりやすい可能性がある対象における増殖性疾患（好ましくは、がん）の発生を予防及び／又は好転させること、（ｂ）疾患を阻害すること、すなわち、がんの悪化の阻害のようにその進行を停止させること、又は（ｃ）疾患の軽減、すなわち、がんの抑制のように疾患の退縮を引き起こすことを含む。好ましくは、本明細書では「治療」という用語は、診断されたがんの治療のように、既に発現した障害の医療介入に関する。
本発明において、「対象」（又は「患者」）は、脊椎動物であってもよい。本発明の文脈では、「対象」という用語には、ヒト及びその他の動物の両方、特にほ乳類及びその他の生物体が含まれる。したがって、本明細書で提供した方法は、ヒト用の療法及び獣医学的適用の両方に適用することができる。したがって、前記対象は、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、モルモット、フェレット、ネコ、イヌ、ニワトリ、ヒツジ、ウシ種、ウマ、ラクダ又は霊長類などの動物であってもよい。好ましくは、対象はほ乳類である。最も好ましくは、対象は、人類である。
前述したように、本発明は、本明細書で記載した（本発明の核酸分子によってコードされる）ケモカイン受容体６（ＣＸＣＲ６）を発現する本明細書で提供した形質導入したＴ細胞を含む「薬学的組成物」に関する。前記薬学的組成物はさらに、薬学的に許容される担体、賦形剤及び／又は希釈剤を含むことができる。適切な薬学的担体の例は当該技術分野で周知で、リン酸緩衝生理食塩水溶液、水、油／水エマルジョンなどのエマルジョン、様々な種類の湿潤剤、滅菌溶液などが含まれる。担体は、レシピエントの血液と等張の溶液であってもよい。このような担体を含む組成物は、周知の従来の方法によって製剤化することができる。投薬レジメンは、主治医及び臨床要素によって決定される。医学分野で周知のように、任意の１人の患者のための投薬は、患者のサイズ、体表面積、年齢、投与する特定の化合物、性別、投与時間及び経路、全体的な健康状態並びに同時に投与するその他の薬物を含む多くの要素に左右される。例えば、本発明の薬学的組成物は、１０４から１０１０Ｔ細胞／ｋｇ体重、好ましくは１０５から１０６Ｔ細胞／ｋｇ体重の用量で対象に投与することができる。本発明の文脈では、薬学的組成物は、対象用量を約１０５から１０６Ｔ細胞／ｋｇ体重から開始して、１０１０Ｔ細胞／ｋｇ体重まで上昇させることによって、投与するＴ細胞の増量を実施するような方法で投与することができる。本発明の薬学的組成物は、静脈内（すなわち、静脈内注入によって）に投与することができるが、腹腔内、胸膜内、髄腔内、皮下又は結節内にも投与することができる。静脈内担体には、流体及び栄養素補充剤、電解質補充剤（リンゲルデキストロースをベースにしたものなど）などが含まれ、防腐剤及びその他の添加剤、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガスなども本発明の薬学的組成物に存在させることができる。
本発明の薬学的組成物は、細胞増殖又は細胞刺激のために、例えば、免疫エフェクター細胞に活性化シグナルを提供することができる分子と組み合わせて併用療法で使用することができる。前記分子は、例えば、Ｔ細胞のための他の１次活性化シグナル（例えば、他の共刺激分子：Ｂ７ファミリーの分子、Ｏｘ４０Ｌ、４．１ＢＢＬ、ＣＤ４０Ｌ、抗ＣＴＬＡ−４、抗ＰＤ−１）又は他のサイトカインインターロイキン（例えば、ＩＬ−２）であってもよい。
本発明の文脈では、治療的投与のために使用する薬学的組成物の成分は、好ましくは滅菌されている。無菌状態は、例えば、滅菌濾過膜（例えば、０．２ミクロン膜）による濾過によって容易に実現することができる。本発明の薬学的組成物は、薬学的組成物の成分を液体担体と均一に接触させることによって調製することができる。生成した後で、本発明の薬学的組成物は滅菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射用針によって穿刺可能な栓を備えた静脈内溶液バッグ又はバイアルに入れておくことができる。
本発明はまた、本明細書で記載したような形質導入したＴ細胞を対象に投与することを含む、例えば、結腸直腸がん、脳がん、卵巣がん、前立腺がん、膵臓がん、乳がん、腎がん、鼻咽頭がん腫、肝細胞がん腫、胃がん、子宮頸がん、膀胱がん、リンパ腫、肉腫又は肺がんなどのＣＸＣＬ１６の過剰発現を特徴とする疾患の治療方法に関する。本発明の文脈では、前記患者はヒトである（前述の通り）。本発明の文脈では、Ｔ細胞、好ましくはＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、γδＴ細胞又はナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞、最も好ましくは、ＣＤ８＋Ｔ細胞を対象から単離する工程、前記単離したＴ細胞を本明細書で前述したケモカイン受容体６（ＣＸＣＲ６）をコードする核酸又は本明細書で前述したＣＸＣＲ６をコードする核酸を含むベクターで形質導入する工程、及び前記対象に形質導入したＴ細胞を投与する工程を含む、疾患の治療方法を記載する。本発明の文脈では、前記形質導入したＴ細胞は、前記対象に静脈内注入によって投与する。さらに、本発明は、Ｔ細胞、好ましくはＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、γδＴ細胞又はナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞、最も好ましくは、ＣＤ８＋Ｔ細胞を患者から単離する工程、前記単離したＴ細胞を本明細書で前述したケモカイン受容体６（ＣＸＣＲ６）をコードする核酸で形質導入する工程、前記単離したＴ細胞をさらなる核酸分子で、例えば、前述のＴ細胞受容体又はキメラ受容体をコードする核酸配列で同時形質導入する工程、形質導入したＴ細胞を増殖させる工程、及び形質導入したＴ細胞を前記対象に投与して戻す工程を含む、疾患の治療方法を提供する。
前述した形質導入したＴ細胞の増殖工程は、インターロイキン−２（ＩＬ−２）及び／又はインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）などの（刺激した）サイトカインの存在下で実施することができる。本発明の文脈では、増殖工程はまた、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）及び／又はインターロイキン−２１（ＩＬ−２１）の存在下で実施することができる。本発明によれば、形質導入したＴ細胞の増殖工程はまた、抗ＣＤ３及び／又は抗ＣＤ２８抗体の存在下で実施することができる。
本明細書で記載したように、本発明は、本発明の核酸分子、本発明のベクター及び／又は本発明の形質導入したＴ細胞を含むキットに関する。本発明の文脈では、（ａ）配列番号１の核酸配列、及び（ｂ）配列番号１の配列と少なくとも８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一で、ケモカイン受容体６（ＣＸＣＲ６）活性を有することを特徴とする核酸配列からなる群から選択される核酸配列を本発明のベクターを含むＣＤ８＋Ｔ細胞に組み込むためのキットを提供する。したがって、本明細書で提供した治療法は、このキットを使用することによって実現することができる。本発明のキットはさらに、任意選択的に（ａ）反応バッファー、保存溶液（すなわち、防腐剤）、洗浄液及び／又は本明細書で記載したアッセイを実施するために必要な残りの試薬又は材料を含むことが有利である。さらに、本発明のキットの一部は、バイアル若しくは瓶に個別に、又は容器若しくは複数容器単位に組み合わせて詰めることができる。さらに、キットは使用説明書を含有していてもよい。本発明のキットの製造は、好ましくは、当業者に公知の標準的手法に従う。前述したように、本明細書で提供したキットは、例えば、結腸直腸がん、脳がん、卵巣がん、前立腺がん、膵臓がん、乳がん、腎がん、鼻咽頭がん腫、肝細胞がん腫、胃がん、子宮頸がん、膀胱がん、リンパ腫、肉腫又は肺がんなどのＣＸＣＬ１６の過剰発現を特徴とする疾患を有する対象、好ましくはヒト患者を治療するために有用である。
以下の実施例は本発明を例示する。
概念の実証として例示的に、以下の実施例では、ＣＸＣＲ６（配列番号３（配列番号４で示したようなタンパク質配列をコードするｃＤＮＡ配列））及びＣＸＣＬ１６（配列番号７（配列番号８で示したようなタンパク質配列をコードするｃＤＮＡ配列））のマウスの配列を有するベクターコンストラクトによって実験を実施した。さらに、図２０及び２１で例示したような実験では、ＣＸＣＲ６のヒト配列（配列番号２で示したようなタンパク質配列をコードする配列番号１）をコードするベクターコンストラクトを使用した。
概念の実証として例示的に、以下の実施例では、ＣＸＣＲ６（配列番号３（配列番号４で示したようなタンパク質配列をコードするｃＤＮＡ配列））及びＣＸＣＬ１６（配列番号７（配列番号８で示したようなタンパク質配列をコードするｃＤＮＡ配列））のマウスの配列を有するベクターコンストラクトによって実験を実施した。さらに、図２０及び２１で例示したような実験では、ＣＸＣＲ６のヒト配列（配列番号２で示したようなタンパク質配列をコードする配列番号１）をコードするベクターコンストラクトを使用した。
実施例１： ＣＸＣＲ６ベクターコンストラクト及びＧＦＰコントロールベクターコンストラクトの生成
ＣＤ８＋Ｔ細胞を形質導入することができるＣＸＣＲ６ベクターは、完全長マウスＣＸＣＲ６配列（配列番号３）を増幅し、ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩで２重に消化及びライゲーションした後ｐＭＰ７１ベクター（Schambach等、Mol Ther2(5)(2000), 435- 45; EP-B1 0 955 374）にクローニングすることによって生成した。ＣＤ８＋Ｔ細胞を形質導入することができるＧＦＰベクターは、完全長ＧＦＰ配列（配列番号１１（ｃＤＮＡ）及び配列番号１２（タンパク質））を増幅し、ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩで２重に消化及びライゲーションした後ｐＭＰ７１ベクターにクローニングすることによって生成した。クローニングは、脾細胞ｃＤＮＡからのポリメラーゼ連鎖反応及び前述の配列に対応するＣＸＣＲ６の増幅及び以下のプライマー：５’−ＡＴＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＧＧＡＴＧＡＴＧＧＣＣＡＴＣＡＧＧ−３’（配列番号１３）及び５’−ＧＧＡＡＡＣＣＡＣＣＡＧＣＡＴＧＴＴＴＣＡＧＧＡＡＴＴＣ−３’（配列番号１４）を使用して実施した。ベクターＣＸＣＲ６ＧＦＰは、ＣＸＣＲ６及びＧＦＰベクターに関して前述したのと同じ方法で生成した。簡単に説明すると、マウス完全長マウスＣＸＣＲ６配列（配列番号３）及び完全長ＧＦＰ配列（配列番号１１（ｃＤＮＡ）及び配列番号１２（タンパク質））をｐＭＰ７１ベクターにクローニングした。ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞を形質導入することができるＣＸＣＲ６ベクターの構築は、完全長マウスＣＸＣＲ６配列を有するＣＸＣＲ６ベクターに関して前述したのと同じ方法で実施した。簡単に説明すると、完全長ヒトＣＸＣＲ６配列（配列番号１）をｐＭＰ７１ベクターにクローニングした。
ＣＤ８＋Ｔ細胞を形質導入することができるＣＸＣＲ６ベクターは、完全長マウスＣＸＣＲ６配列（配列番号３）を増幅し、ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩで２重に消化及びライゲーションした後ｐＭＰ７１ベクター（Schambach等、Mol Ther2(5)(2000), 435- 45; EP-B1 0 955 374）にクローニングすることによって生成した。ＣＤ８＋Ｔ細胞を形質導入することができるＧＦＰベクターは、完全長ＧＦＰ配列（配列番号１１（ｃＤＮＡ）及び配列番号１２（タンパク質））を増幅し、ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩで２重に消化及びライゲーションした後ｐＭＰ７１ベクターにクローニングすることによって生成した。クローニングは、脾細胞ｃＤＮＡからのポリメラーゼ連鎖反応及び前述の配列に対応するＣＸＣＲ６の増幅及び以下のプライマー：５’−ＡＴＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＧＧＡＴＧＡＴＧＧＣＣＡＴＣＡＧＧ−３’（配列番号１３）及び５’−ＧＧＡＡＡＣＣＡＣＣＡＧＣＡＴＧＴＴＴＣＡＧＧＡＡＴＴＣ−３’（配列番号１４）を使用して実施した。ベクターＣＸＣＲ６ＧＦＰは、ＣＸＣＲ６及びＧＦＰベクターに関して前述したのと同じ方法で生成した。簡単に説明すると、マウス完全長マウスＣＸＣＲ６配列（配列番号３）及び完全長ＧＦＰ配列（配列番号１１（ｃＤＮＡ）及び配列番号１２（タンパク質））をｐＭＰ７１ベクターにクローニングした。ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞を形質導入することができるＣＸＣＲ６ベクターの構築は、完全長マウスＣＸＣＲ６配列を有するＣＸＣＲ６ベクターに関して前述したのと同じ方法で実施した。簡単に説明すると、完全長ヒトＣＸＣＲ６配列（配列番号１）をｐＭＰ７１ベクターにクローニングした。
実施例２： Ｔ細胞の形質導入及びＣＸＣＬ１６分泌、Ｔ細胞増殖及び殺滅アッセイのためのアッセイ系。
２．１ 細胞株
マウスの膵臓がん細胞株Ｐａｎｃ０２及びオボアルブミンでトランスフェクトされた対応株Ｐａｎｃ０２−ＯＶＡは以前に記載されたことがある（Jacobs等、Int J Cancer 128(4) (2011), 897-907）。Ｐａｎｃ０２細胞株は、発がん物質メチルコラントレンＡを野生型Ｃ５７Ｂ１／６マウスの膵臓に注射し、発がんを誘導することによって生成した。
２．１ 細胞株
マウスの膵臓がん細胞株Ｐａｎｃ０２及びオボアルブミンでトランスフェクトされた対応株Ｐａｎｃ０２−ＯＶＡは以前に記載されたことがある（Jacobs等、Int J Cancer 128(4) (2011), 897-907）。Ｐａｎｃ０２細胞株は、発がん物質メチルコラントレンＡを野生型Ｃ５７Ｂ１／６マウスの膵臓に注射し、発がんを誘導することによって生成した。
腫瘍細胞株Ｔ１１０２９９は、ＰｔｆｌａＣｒｅ；ＫｒａｓＧ１２Ｄ；ｐ５３ｆｌ／Ｒ１７２Ｈマウス２５の原発性膵臓腫瘍から樹立され、Ｄｕｅｗｅｌｌ等、Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ ２１（１２）（２０１４）、１８２５−１８３７（訂正:Cell Death Differ. 21(12) (2014), 161）に記載されている。パッケージング細胞株Ｐｌａｔ−Ｅは、以前にＭｏｒｉｔａ等、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ７（２０００）、１０６３−６によって記載されたことがある。細胞は全て１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳＡ）、１％ペニシリン及びストレプトマイシン（ＰＳ）並びに１％Ｌ−グルタミン（いずれもＰＡＡ製、Ｇｅｒｍａｎｙ）を含むＤＭＥＭで培養した。ピューロマイシン１０μｇ／ｍｌ及びブラストサイジン（Ｓｉｇｍａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）１μｇ／ｍｌをＰｌａｔ−Ｅ培地に添加した。
骨髄由来の樹状細胞は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｊａｎｖｉｅｒ、Ｆｒａｎｃｅ（カタログ番号２０１４−０７−ＤＥ−ＲＭ−２０））から単離した。骨髄細胞は、組換えＧＭ−ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、Ｈａｍｂｕｒｇ）を加えて７日間培養した。骨髄由来樹状細胞（ＢＭ−ＤＣ、ウェル当たり１０４個）を９６ウェルプレート（平底）に播種し、組換えタンパク質（２０ｎｇ／ｍｌ）（ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ又はＩＬ−４、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、Ｈａｍｂｕｒｇ；又はＲ８４８ Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｌｏｒｒａｃｈ）で刺激した。
ＯＴ−１Ｔ細胞は、ＯＴ−１マウスストック番号００３８３１のＴ細胞である。これらのＯＴ−１Ｔ細胞は以下のように生成した。初代脾細胞をＯＴ−１マウスから収集した。脾細胞の単一細胞懸濁液を、Ｔ細胞培地中で一晩抗ＣＤ３（クローン１４５−２ｃ１１ ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、ＵＳＡ）、抗ＣＤ２８（クローン３７．５１、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、ＵＳＡ）及び組換えマウスＩＬ−２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で刺激した。
ヒト膵臓がん細胞株ＰＡ−ＴＵ−８９８８Ｔは、細胞株保管所Ｌｅｉｂｎｉｚ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ＤＳＭＺ−Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓから寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ１６２で入手可能である。保管された細胞株ＰＡ−ＴＵ−８９９８８Ｔの起源はヒト（ホモサピエンス）である。細胞種は、膵臓腺がん腫である。より正確には、細胞株ＰＡ−ＴＵ−８９８８Ｔは１９８５年に６４歳女性の原発性膵臓腺がん腫の肝臓転移から樹立される；ＰＡ−ＴＵ−８９８８Ｓ（ＤＳＭ ＡＣＣ２０４）の姉妹細胞株である。
ヒト膵臓がん細胞株ＭＩＡ ＰａＣａ−２は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から寄託番号ＣＲＭ−ＣＲＬ−１４２０（商標）で入手可能である。保管された細胞株ＭＩＡ ＰａＣａ−２の生物体はヒト（ホモサピエンス）である。細胞種は上皮細胞（Ｋｒａｓ Ｃｒｍ）である。
ヒト膵臓がん細胞株ＰＡＮＣ−１は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から寄託番号ＣＲＬ−１４６９（商標）で入手可能である。保管された細胞株ＰＡＮＣ−１の生物体はヒト（ホモサピエンス）である。組織は膵臓／管である。
ヒト膵臓がん細胞株ＳＵＩＴ−２は、以前にＩｗａｍｕｒａ等、Ｊｐｎ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７８（１）（１９８７）、５４−６２に記載されたことがある。膵臓がん細胞株ＳＵＩＴ−２は、がん胎児性抗原及び糖抗原１９−９を生成することが特徴である。
２．２ 動物
野生型Ｃ５７Ｂ１／６マウスは、Ｈａｒｌａｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（オランダ）から購入した。オボアルブミンに特異的なＴ細胞受容体のために遺伝子組み換えしたマウス（ＯＴ−１）は、Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＵＳＡ（保存番号００３８３１）から入手し、動物施設において特定病原体除去（ＳＰＦ）条件下で飼育した。ＯＴ−１マウスをＣＤ４５．１コンジェニックマーカーマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手、保存番号００２０１４）及びＣＤ９０．１コンジェニックマーカーマウス（保存番号０００４０６）と交配して、それぞれＣＤ４５．１−ＯＴ−１及びＣＤ９０．１−ＯＴ−１マウスを作出した。野生型Ｃ５７Ｂ１／６マウスは、フランスのＪａｎｖｉｅｒから購入した。腫瘍は、腫瘍細胞２×１０６個を皮下注射することによって誘導し、マウスは指示したようにＴ細胞のｉ．ｖ．注射によって治療した。実験は全て無作為化して、盲検で行った。中和実験については、抗ＩＦＮ−γ抗体Ｒ４−６Ａ２（ＢｉｏＸｃｅｌｌ、ＵＳＡ）又はアイソタイプコントロール（ＢｉｏＸｃｅｌｌ、ＵＳＡ）を３日毎に動物１匹当たり２００μｇの用量で４回ｉ．ｐ．投与した。腫瘍増殖及びマウスの状態は１日おきにモニターした。
野生型Ｃ５７Ｂ１／６マウスは、Ｈａｒｌａｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（オランダ）から購入した。オボアルブミンに特異的なＴ細胞受容体のために遺伝子組み換えしたマウス（ＯＴ−１）は、Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＵＳＡ（保存番号００３８３１）から入手し、動物施設において特定病原体除去（ＳＰＦ）条件下で飼育した。ＯＴ−１マウスをＣＤ４５．１コンジェニックマーカーマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手、保存番号００２０１４）及びＣＤ９０．１コンジェニックマーカーマウス（保存番号０００４０６）と交配して、それぞれＣＤ４５．１−ＯＴ−１及びＣＤ９０．１−ＯＴ−１マウスを作出した。野生型Ｃ５７Ｂ１／６マウスは、フランスのＪａｎｖｉｅｒから購入した。腫瘍は、腫瘍細胞２×１０６個を皮下注射することによって誘導し、マウスは指示したようにＴ細胞のｉ．ｖ．注射によって治療した。実験は全て無作為化して、盲検で行った。中和実験については、抗ＩＦＮ−γ抗体Ｒ４−６Ａ２（ＢｉｏＸｃｅｌｌ、ＵＳＡ）又はアイソタイプコントロール（ＢｉｏＸｃｅｌｌ、ＵＳＡ）を３日毎に動物１匹当たり２００μｇの用量で４回ｉ．ｐ．投与した。腫瘍増殖及びマウスの状態は１日おきにモニターした。
２．３ Ｔ細胞形質導入
２．３．１ マウスＴ細胞のＴ細胞形質導入
レトロウイルスベクターｐＭＰ７１（Schambach等、Mol Ther 2(5) (2000), 435-45; EP-B1 0 955 374）をエコトロピックパッケージング細胞株Ｐｌａｔ−Ｅのトランスフェクションのために使用した。形質導入は、Ｌｅｉｓｅｇａｎｇ等、Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ８６（２００８）、５７３；Ｍｕｅｌｌｅｒ等、Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８６（２０１２）、１０８６６−１０８６９；Ｋｏｂｏｌｄ等、Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ １０７（２０１５）、３６４によって記載された方法に従って実施した。簡単に説明すると、パッケージング細胞株Ｐｌａｔ Ｅ（Morita等、Gene Ther 7 (2000), 1063によって記載された通り）を６ウェルプレートに播種し、一晩７０−８０％コンフルエンスまで増殖させた。１日目に、ＤＮＡ１６μｇをＣａＣｌ２（Ｍｅｒｃｋ、Ｇｅｒｍａｎｙ）１００ｍＭ及びクロロキン（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）１２６．７μΜと一緒に混合した。Ｐｌａｔ−Ｅ細胞を低血清培地（３％）中で３０分間飢餓状態にして、その後沈殿させたＤＮＡを加えて６時間インキュベートした。その後、培養培地を除去して、培地を交換した。２日目に、初代脾細胞をＣ５７Ｂ１／６マウス（Ｊａｎｖｉｅｒ）から収集した。脾細胞の単一細胞懸濁液を、Ｔ細胞培地中で一晩抗ＣＤ３（クローン１４５−２ｃ１１ ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、ＵＳＡ）、抗ＣＤ２８（クローン３７．５１、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、ＵＳＡ）及び組換えマウスＩＬ−２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で刺激した。３日目に、２４ウェルプレートを組換えレトロネクチン（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｊａｐａｎ）１２．５μｇ／ｍｌで室温で２時間コーティングし、２％ウシ血清アルブミン（Ｒｏｔｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で３７℃で３０分間ブロックして、ＰＢＳで洗浄した。Ｐｌａｔ−Ｅの上清を収集し、フィルター（４０μｍ、Ｍｉｌｉｐｏｒｅ、ＵＳＡ）を通過させた。次に、新鮮なＴ細胞培地をＰｌａｔ Ｅ細胞に添加した。濾過した上清１ｍｌを各ウェルに分配し、４℃で２時間スピノキュレーションした。その後、上清を２４ウェルプレートから除去した。１０６個のＴ細胞を、ウェル当たりＩＬ−２ １０Ｕ並びに抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）４０００００個を補給したＴ細胞培地１ｍｌに播種し、８００ｇで３２℃で３０分間スピノキュレーションした。４日目に、Ｐｌａｔ Ｅ上清を再度収集して濾過した。１ｍｌを２４ウェルプレートの各ウェルに添加し、８００ｇで３２℃で９０分間スピノキュレーションした。その後細胞を３７℃でさらに６時間インキュベートした。上清１ｍｌを、ＩＬ−２を含むＴ細胞培地と交換した。５日目に、細胞を収集し、細胞数を計数し、１ｍｌ当たりＩＬ−１５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）１０ｎｇを補給したＴ細胞培地に１０６細胞／ｍｌの密度で再播種した。Ｔ細胞は、細胞分析又は機能アッセイを実施する１０日目までこの密度を維持した。
２．３．１ マウスＴ細胞のＴ細胞形質導入
レトロウイルスベクターｐＭＰ７１（Schambach等、Mol Ther 2(5) (2000), 435-45; EP-B1 0 955 374）をエコトロピックパッケージング細胞株Ｐｌａｔ−Ｅのトランスフェクションのために使用した。形質導入は、Ｌｅｉｓｅｇａｎｇ等、Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ８６（２００８）、５７３；Ｍｕｅｌｌｅｒ等、Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８６（２０１２）、１０８６６−１０８６９；Ｋｏｂｏｌｄ等、Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ １０７（２０１５）、３６４によって記載された方法に従って実施した。簡単に説明すると、パッケージング細胞株Ｐｌａｔ Ｅ（Morita等、Gene Ther 7 (2000), 1063によって記載された通り）を６ウェルプレートに播種し、一晩７０−８０％コンフルエンスまで増殖させた。１日目に、ＤＮＡ１６μｇをＣａＣｌ２（Ｍｅｒｃｋ、Ｇｅｒｍａｎｙ）１００ｍＭ及びクロロキン（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）１２６．７μΜと一緒に混合した。Ｐｌａｔ−Ｅ細胞を低血清培地（３％）中で３０分間飢餓状態にして、その後沈殿させたＤＮＡを加えて６時間インキュベートした。その後、培養培地を除去して、培地を交換した。２日目に、初代脾細胞をＣ５７Ｂ１／６マウス（Ｊａｎｖｉｅｒ）から収集した。脾細胞の単一細胞懸濁液を、Ｔ細胞培地中で一晩抗ＣＤ３（クローン１４５−２ｃ１１ ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、ＵＳＡ）、抗ＣＤ２８（クローン３７．５１、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、ＵＳＡ）及び組換えマウスＩＬ−２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で刺激した。３日目に、２４ウェルプレートを組換えレトロネクチン（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｊａｐａｎ）１２．５μｇ／ｍｌで室温で２時間コーティングし、２％ウシ血清アルブミン（Ｒｏｔｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で３７℃で３０分間ブロックして、ＰＢＳで洗浄した。Ｐｌａｔ−Ｅの上清を収集し、フィルター（４０μｍ、Ｍｉｌｉｐｏｒｅ、ＵＳＡ）を通過させた。次に、新鮮なＴ細胞培地をＰｌａｔ Ｅ細胞に添加した。濾過した上清１ｍｌを各ウェルに分配し、４℃で２時間スピノキュレーションした。その後、上清を２４ウェルプレートから除去した。１０６個のＴ細胞を、ウェル当たりＩＬ−２ １０Ｕ並びに抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）４０００００個を補給したＴ細胞培地１ｍｌに播種し、８００ｇで３２℃で３０分間スピノキュレーションした。４日目に、Ｐｌａｔ Ｅ上清を再度収集して濾過した。１ｍｌを２４ウェルプレートの各ウェルに添加し、８００ｇで３２℃で９０分間スピノキュレーションした。その後細胞を３７℃でさらに６時間インキュベートした。上清１ｍｌを、ＩＬ−２を含むＴ細胞培地と交換した。５日目に、細胞を収集し、細胞数を計数し、１ｍｌ当たりＩＬ−１５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）１０ｎｇを補給したＴ細胞培地に１０６細胞／ｍｌの密度で再播種した。Ｔ細胞は、細胞分析又は機能アッセイを実施する１０日目までこの密度を維持した。
レトロウイルスベクターｐＭＸ（de Witte等、J. Immunol. 181 (2008), 5128-5136）による形質導入は、前述のようにベクターｐＭＰ７１による形質導入と同じ方法で実施した。
２．３．２ ヒトＴ細胞の形質導入
レトロウイルスベクターｐＭＰ７１（Schambach等、Mol Ther 2(5) (2000), 435-45; EP-B1 0 955 374）をアンホトロピックパッケージング細胞株Ｐｌａｔ−Ａのトランスフェクションのために使用した。形質導入は、Ｌｅｉｓｅｇａｎｇ等、Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ８６（２００８）、５７３；Ｍｕｅｌｌｅｒ等、Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８６（２０１２）、１０８６６−１０８６９；Ｋｏｂｏｌｄ等、Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ １０７（２０１５）、３６４によって記載された方法に従って実施した。簡単に説明すると、パッケージング細胞株Ｐｌａｔ Ａ（Morita等、Gene Ther 7 (2000), 1063によって記載された通り）を６ウェルプレートに播種し、一晩７０−８０％コンフルエンスまで増殖させた。２日目に、Ｐｌａｔ Ａ細胞を、レトロウイルスベクタープラスミドｐＭＰ７１ １８μｇを加えたリン酸カルシウム沈殿法でトランスフェクトし、次いで６時間インキュベートした。その後、培養培地を除去して、交換した。さらに、初代ＰＢＭＣを単離し、ＣＤ３＋Ｔ細胞をＭＡＣＳソーティング（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ）によって分離した。ＣＤ３＋ヒトＴ細胞は、Ｔ細胞培地中で一晩抗ヒトＣＤ３（クローンＵＣＨＴ１ ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、ＵＳＡ）、抗ヒトＣＤ２８（クローンＣＤ２８，２、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、ＵＳＡ）、組換えＩＬ−１５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）及び組換えマウスＩＬ−２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で刺激した。４日目に、２４ウェルプレートを組換えｒｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｊａｐａｎ）１２．５μｇ／ｍｌで室温で２時間コーティングし、２％ウシ血清アルブミン（Ｒｏｔｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で３７℃で３０分間ブロックして、ＰＢＳで洗浄した。Ｐｌａｔ−Ａの上清を収集し、フィルター（０．４５μｍ、Ｍｉｌｉｐｏｒｅ、ＵＳＡ）を通過させた。次に、新鮮なＴ細胞培地をＰｌａｔ Ａ細胞に添加した。濾過した上清１ｍｌを各ウェルに分配し、４℃で２時間スピノキュレーションした。その後、上清を２４ウェルプレートから除去した。ウェル当たり１０６個のヒトＴ細胞を、ＩＬ−２、ＩＬ−１５及び抗ヒトＣＤ３及び抗ヒトＣＤ２８Ｄｙｎａｂｅａｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を補給したＴ細胞培地１ｍｌに播種し、８００ｇで３２℃で３０分間スピノキュレーションした。５日目に、Ｐｌａｔ Ａ上清を再度収集し、濾過した。１ｍｌを各ウェルに分配し、４℃で２時間スピノキュレーションした。上清を除去し、前日に感染させたＴ細胞を２４ウェルプレートに移し、８００ｇで３２℃で９０分間スピノキュレーションした。その後細胞を３７℃でさらに６時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を収集し、細胞数を計数し、ＩＬ−１５及びＩＬ−２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を補給したＴ細胞培地に１０６細胞／ｍｌの密度で再播種した。Ｔ細胞は、細胞分析又は機能アッセイを実施する１０日目までこの密度を維持した。
レトロウイルスベクターｐＭＰ７１（Schambach等、Mol Ther 2(5) (2000), 435-45; EP-B1 0 955 374）をアンホトロピックパッケージング細胞株Ｐｌａｔ−Ａのトランスフェクションのために使用した。形質導入は、Ｌｅｉｓｅｇａｎｇ等、Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ８６（２００８）、５７３；Ｍｕｅｌｌｅｒ等、Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８６（２０１２）、１０８６６−１０８６９；Ｋｏｂｏｌｄ等、Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ １０７（２０１５）、３６４によって記載された方法に従って実施した。簡単に説明すると、パッケージング細胞株Ｐｌａｔ Ａ（Morita等、Gene Ther 7 (2000), 1063によって記載された通り）を６ウェルプレートに播種し、一晩７０−８０％コンフルエンスまで増殖させた。２日目に、Ｐｌａｔ Ａ細胞を、レトロウイルスベクタープラスミドｐＭＰ７１ １８μｇを加えたリン酸カルシウム沈殿法でトランスフェクトし、次いで６時間インキュベートした。その後、培養培地を除去して、交換した。さらに、初代ＰＢＭＣを単離し、ＣＤ３＋Ｔ細胞をＭＡＣＳソーティング（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ）によって分離した。ＣＤ３＋ヒトＴ細胞は、Ｔ細胞培地中で一晩抗ヒトＣＤ３（クローンＵＣＨＴ１ ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、ＵＳＡ）、抗ヒトＣＤ２８（クローンＣＤ２８，２、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、ＵＳＡ）、組換えＩＬ−１５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）及び組換えマウスＩＬ−２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で刺激した。４日目に、２４ウェルプレートを組換えｒｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｊａｐａｎ）１２．５μｇ／ｍｌで室温で２時間コーティングし、２％ウシ血清アルブミン（Ｒｏｔｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で３７℃で３０分間ブロックして、ＰＢＳで洗浄した。Ｐｌａｔ−Ａの上清を収集し、フィルター（０．４５μｍ、Ｍｉｌｉｐｏｒｅ、ＵＳＡ）を通過させた。次に、新鮮なＴ細胞培地をＰｌａｔ Ａ細胞に添加した。濾過した上清１ｍｌを各ウェルに分配し、４℃で２時間スピノキュレーションした。その後、上清を２４ウェルプレートから除去した。ウェル当たり１０６個のヒトＴ細胞を、ＩＬ−２、ＩＬ−１５及び抗ヒトＣＤ３及び抗ヒトＣＤ２８Ｄｙｎａｂｅａｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を補給したＴ細胞培地１ｍｌに播種し、８００ｇで３２℃で３０分間スピノキュレーションした。５日目に、Ｐｌａｔ Ａ上清を再度収集し、濾過した。１ｍｌを各ウェルに分配し、４℃で２時間スピノキュレーションした。上清を除去し、前日に感染させたＴ細胞を２４ウェルプレートに移し、８００ｇで３２℃で９０分間スピノキュレーションした。その後細胞を３７℃でさらに６時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を収集し、細胞数を計数し、ＩＬ−１５及びＩＬ−２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を補給したＴ細胞培地に１０６細胞／ｍｌの密度で再播種した。Ｔ細胞は、細胞分析又は機能アッセイを実施する１０日目までこの密度を維持した。
２．４ 腫瘍細胞とＴ細胞との同時培養
Ｔ細胞及び腫瘍細胞を１：１又は１０：１の比で前述した培養条件で４８ｈ同時培養した。以下の２．５項に記載したように、上清のＩＦＮ−γをＥＬＩＳＡ（ＢＤ）によって分析した。
Ｔ細胞及び腫瘍細胞を１：１又は１０：１の比で前述した培養条件で４８ｈ同時培養した。以下の２．５項に記載したように、上清のＩＦＮ−γをＥＬＩＳＡ（ＢＤ）によって分析した。
２．５ ＣＸＣＬ１６を生成する腫瘍細胞の存在下でのＣＸＣＲ６で形質導入したＴ細胞の溶解活性
ＬＤＨ放出は、市販のキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって測定した。簡単に説明すると、ＬＤＨは乳酸をピルビン酸に酸化することによって、ＮＡＤ＋のＮＡＤＨ及びＨ＋への還元を触媒する。次に、ジアホラーゼはＮＡＤＨ及びＨ＋と反応して、テトラゾリウム塩（ＩＮＴ）の、４９０ｎｍに吸収のあるホルマザンへの還元を触媒する。
ＬＤＨ放出は、市販のキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって測定した。簡単に説明すると、ＬＤＨは乳酸をピルビン酸に酸化することによって、ＮＡＤ＋のＮＡＤＨ及びＨ＋への還元を触媒する。次に、ジアホラーゼはＮＡＤＨ及びＨ＋と反応して、テトラゾリウム塩（ＩＮＴ）の、４９０ｎｍに吸収のあるホルマザンへの還元を触媒する。
ＩＦＮ−γは、ＥＬＩＳＡによって、捕捉体及び検出抗体として相補的なＩＦＮ−γ結合抗体並びにセイヨウワサビペルオキシダーゼを結合した２次系を使用して測定した。
ＧＦＰを発現する細胞は、フローサイトメーターによって分析し、ＧＦＰは４８８ｎｍで励起し、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩを使用して５３０ｎｍフィルターで検出する。
ＣＸＣＬ１６に向かう遊走は、Ｔ細胞が通過させることができる市販の多孔性膜によってウェルの上部及び下部が分離されている標準的トランスウェル遊走を使用して実施した。ＣＸＣＬ１６をウェルの下部に、細胞を上部に添加した。細胞がＣＸＣＲ６を発現するならば、細胞は孔を通って遊走して、その後、フローサイトメトリーによって測定することができる。
２．６ 統計学的解析
統計については、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアバージョン５．０ｂを使用した。報告した変数は全て連続している。実験条件間の差は、両側独立スチューデントｔ検定を使用して解析した。個々のマウスの実験条件の比較については、マン−ホイットニー検定を使用して、ｐ値＜０．０５は有意とみなした。インビボ実験については、群間の差は、２元配置ＡＮＯＶＡを使用して解析し、ボンフェローニ法によって多重検定を調整した。
統計については、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアバージョン５．０ｂを使用した。報告した変数は全て連続している。実験条件間の差は、両側独立スチューデントｔ検定を使用して解析した。個々のマウスの実験条件の比較については、マン−ホイットニー検定を使用して、ｐ値＜０．０５は有意とみなした。インビボ実験については、群間の差は、２元配置ＡＮＯＶＡを使用して解析し、ボンフェローニ法によって多重検定を調整した。
マウスにおけるＰａｎｃ０２−ＯＶＡ腫瘍増殖の差は、各時点で２元配置ＡＮＯＶＡ及び多重検定の調整を使用して、腫瘍表面（アナログなノギスによって測定した腫瘍の幅に高さを乗じたものと定義した）を比較することによって解析した。
３．特定の実施態様の例
本開示のある種の非限定的実施態様の例を以下に挙げる。特に、本発明は以下の項目に関する：
本開示のある種の非限定的実施態様の例を以下に挙げる。特に、本発明は以下の項目に関する：
１．Ｔ細胞を形質導入することができるベクターであって、
（ａ）配列番号１又は配列番号３の核酸配列、及び
（ｂ）配列番号１又は配列番号３の配列と少なくとも８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一で、ケモカイン受容体６（ＣＸＣＲ６）活性を有することを特徴とする核酸配列
からなる群から選択される核酸配列を含む、ベクター。
（ａ）配列番号１又は配列番号３の核酸配列、及び
（ｂ）配列番号１又は配列番号３の配列と少なくとも８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一で、ケモカイン受容体６（ＣＸＣＲ６）活性を有することを特徴とする核酸配列
からなる群から選択される核酸配列を含む、ベクター。
２．前記ベクターが発現ベクターである、項目１に記載のベクター。
３．前記ベクターがレトロウイルスベクターである、項目１又は項目２に記載のベクター。
４．項目１の前記核酸配列に動作可能に連結された調節配列をさらに含む、項目１から３の何れか一項に記載のベクター。
５．（ａ）配列番号１又は配列番号３の核酸配列、及び
（ｂ）配列番号１又は配列番号３の配列と少なくとも８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一で、ケモカイン受容体６（ＣＸＣＲ６）活性を有することを特徴とする核酸配列
からなる群から選択される核酸配列によってコードされるケモカイン受容体６（ＣＸＣＲ６）を発現する、形質導入したＴ細胞。
（ｂ）配列番号１又は配列番号３の配列と少なくとも８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一で、ケモカイン受容体６（ＣＸＣＲ６）活性を有することを特徴とする核酸配列
からなる群から選択される核酸配列によってコードされるケモカイン受容体６（ＣＸＣＲ６）を発現する、形質導入したＴ細胞。
６．ケモカイン受容体６（ＣＸＣＲ６）が安定してＴ細胞のゲノムに組み込まれている、項目５に記載の形質導入したＴ細胞。
７．ケモカイン受容体６（ＣＸＣＲ６）又はその断片がＴ細胞の表面上で発現する、項目５又は項目６に記載の形質導入したＴ細胞。
８．形質導入したＴ細胞をＴ細胞受容体で同時形質導入する、項目５から７の何れか一項に記載の形質導入したＴ細胞。
９．ケモカイン受容体６（ＣＸＣＲ６）を発現する形質導入したＴ細胞を生成するための方法であって、
（ａ）Ｔ細胞を、
（ｉ）配列番号１又は配列番号３の核酸配列、及び
（ｉｉ）配列番号１又は配列番号３の配列と少なくとも８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一で、ケモカイン受容体６（ＣＸＣＲ６）活性を有することを特徴とする核酸配列
からなる群から選択される核酸配列を含むベクターで形質導入する工程、
（ｂ）前記Ｔ細胞の中又は上でのケモカイン受容体６（ＣＸＣＲ６）の発現を可能にする条件下で形質導入したＴ細胞を培養する工程、及び
（ｃ）形質導入したＴ細胞を培養物から回収する工程
を含む、方法。
（ａ）Ｔ細胞を、
（ｉ）配列番号１又は配列番号３の核酸配列、及び
（ｉｉ）配列番号１又は配列番号３の配列と少なくとも８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一で、ケモカイン受容体６（ＣＸＣＲ６）活性を有することを特徴とする核酸配列
からなる群から選択される核酸配列を含むベクターで形質導入する工程、
（ｂ）前記Ｔ細胞の中又は上でのケモカイン受容体６（ＣＸＣＲ６）の発現を可能にする条件下で形質導入したＴ細胞を培養する工程、及び
（ｃ）形質導入したＴ細胞を培養物から回収する工程
を含む、方法。
１０．形質導入したＴ細胞を抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体によるトランスフェクション後に増殖させる、項目９に記載の方法。
１１．形質導入したＴ細胞の増殖を、サイトカイン、好ましくはインターロイキン−２（ＩＬ−２）及び／又はインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）の存在下で実施する、項目９又は項目１０に記載の方法。
１２．項目９から１１の何れか一項に記載の方法によって得ることができるケモカイン受容体６（ＣＸＣＲ６）を発現する形質導入したＴ細胞。
１３．医薬として使用するための、項目５から８又は１２の何れか一項に記載の、又は項目９から１１の何れか一項に記載の方法によって得ることができる形質導入したＴ細胞。
１４．ＣＸＣＬ１６過剰発現を特徴とする疾患の治療方法において使用するための、項目５から８、１２若しくは１３の何れか一項に記載の、又は項目９から１１の何れか一項に記載の方法によって得ることができる形質導入したＴ細胞。
１５．ケモカイン受容体６（ＣＸＣＲ６）を発現する形質導入したＴ細胞を含む薬学的組成物であって、
（ａ）配列番号１又は配列番号３の核酸配列、及び
（ｂ）配列番号１又は配列番号３の配列と少なくとも８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一で、ケモカイン受容体６（ＣＸＣＲ６）活性を有することを特徴とする核酸配列
からなる群から選択される核酸配列によってコードされる、薬学的組成物。
（ａ）配列番号１又は配列番号３の核酸配列、及び
（ｂ）配列番号１又は配列番号３の配列と少なくとも８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一で、ケモカイン受容体６（ＣＸＣＲ６）活性を有することを特徴とする核酸配列
からなる群から選択される核酸配列によってコードされる、薬学的組成物。
１６．形質導入したＴ細胞が項目１から４の何れか一項に記載のベクターを含む、項目１５に記載の薬学的組成物。
１７．形質導入したＴ細胞は治療する患者から元々得られたＴ細胞である、項目１５又は項目１６に記載の薬学的組成物。
１８．形質導入したＴ細胞を抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体によるトランスフェクション後に増殖させる、項目１５から１７の何れか一項に記載の薬学的組成物。
１９．形質導入したＴ細胞の増殖を、サイトカイン、好ましくはインターロイキン−２（ＩＬ−２）及び／又はインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）の存在下で実施する、項目１８に記載の薬学的組成物。
２０．ＣＸＣＬ１６過剰発現を特徴とする疾患の治療方法において使用するための、項目１５から１９の何れか一項に記載の薬学的組成物。
２１．（ａ）対象からＴ細胞を単離する工程、
（ｂ）前記単離したＴ細胞を、
（ｉ）配列番号１又は配列番号３の核酸配列、及び
（ｉｉ）配列番号１又は配列番号３の配列と少なくとも８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一で、ケモカイン受容体６（ＣＸＣＲ６）活性を有することを特徴とする核酸配列
からなる群から選択される核酸配列を含むベクターで形質導入する工程、及び
（ｃ）前記形質導入したＴ細胞を前記対象に投与する工程
を含む、対象におけるＣＸＣＬ１６過剰発現を特徴とする疾患の治療方法。
（ｂ）前記単離したＴ細胞を、
（ｉ）配列番号１又は配列番号３の核酸配列、及び
（ｉｉ）配列番号１又は配列番号３の配列と少なくとも８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一で、ケモカイン受容体６（ＣＸＣＲ６）活性を有することを特徴とする核酸配列
からなる群から選択される核酸配列を含むベクターで形質導入する工程、及び
（ｃ）前記形質導入したＴ細胞を前記対象に投与する工程
を含む、対象におけるＣＸＣＬ１６過剰発現を特徴とする疾患の治療方法。
２２．前記形質導入したＴ細胞を前記対象に静脈内注入によって投与する、項目２１に記載の方法。
２３．前記形質導入したＴ細胞を抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体によって増殖させる、項目２１又は項目２２に記載の方法。
２４．形質導入したＴ細胞の増殖を、サイトカイン、好ましくはインターロイキン−２（ＩＬ−２）及び／又はインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）の存在下で実施する、項目２３に記載の方法。
２５．前記疾患が、結腸直腸がん、脳がん、卵巣がん、前立腺がん、膵臓がん、乳がん、腎がん、鼻咽頭がん腫、肝細胞がん腫、胃がん、子宮頸がん、膀胱がん、リンパ腫、肉腫及び肺がんからなる群から選択される、項目１４に記載の使用のための項目１４に記載の形質導入したＴ細胞、項目２０に記載の使用のための項目２０に記載の薬学的組成物、又は項目２１から２４の何れか一項に記載の方法。
２６．（ａ）配列番号１又は配列番号３の核酸配列、及び
（ｂ）配列番号１又は配列番号３の配列と少なくとも８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一で、ケモカイン受容体６（ＣＸＣＲ６）活性を有することを特徴とする核酸配列
からなる群から選択される核酸配列を、項目１から４の何れか一項に記載のベクターを含むＴ細胞に組み込むためのキット。
（ｂ）配列番号１又は配列番号３の配列と少なくとも８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一で、ケモカイン受容体６（ＣＸＣＲ６）活性を有することを特徴とする核酸配列
からなる群から選択される核酸配列を、項目１から４の何れか一項に記載のベクターを含むＴ細胞に組み込むためのキット。
２７．Ｔ細胞が、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、γδＴ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞からなる群から選択されるＴ細胞である、項目１から４の何れか一項に記載のベクター、項目５から８、１０、１２若しくは１３の何れか一項に記載の形質導入したＴ細胞、項目９から１１の何れか一項に記載の方法、項目１３若しくは１４に記載の使用のための形質導入した細胞、項目１５から２０の何れか一項に記載の薬学的組成物、項目２１から２５の何れか一項に記載の方法、又は項目２６のキット。
２８．Ｔ細胞がＣＤ８＋Ｔ細胞である、項目２７に記載のベクター、形質導入したＴ細胞、方法、薬学的組成物又はキット。
Claims (17)
- （ａ）配列番号１の核酸配列、及び
（ｂ）配列番号１の配列と少なくとも８４％同一で、ケモカイン受容体６（ＣＸＣＲ６）活性を有することを特徴とする核酸配列
からなる群から選択される核酸配列を含む、Ｔ細胞を形質導入することができるベクター。 - 前記ベクターが発現ベクターである、請求項１に記載のベクター。
- 前記ベクターがレトロウイルスベクターである、請求項１又は２に記載のベクター。
- 請求項１に記載の前記核酸配列に動作可能に連結された調節配列をさらに含む、請求項１から３の何れか一項に記載のベクター。
- （ａ）配列番号１の核酸配列、及び
（ｂ）配列番号１の配列と少なくとも８４％同一で、ケモカイン受容体６（ＣＸＣＲ６）活性を有することを特徴とする核酸配列
からなる群から選択される核酸配列によってコードされるケモカイン受容体６（ＣＸＣＲ６）を発現する、形質導入したＴ細胞。 - ケモカイン受容体６（ＣＸＣＲ６）を発現する形質導入したＴ細胞を生成するための方法であって、
（ａ）Ｔ細胞を、
（ｉ）配列番号１の核酸配列、及び
（ｉｉ）配列番号１の配列と少なくとも８４％同一で、ケモカイン受容体６（ＣＸＣＲ６）活性を有することを特徴とする核酸配列
からなる群から選択される核酸配列を含むベクターで形質導入する工程、
（ｂ）前記Ｔ細胞の中又は上でのケモカイン受容体６（ＣＸＣＲ６）の発現を可能にする条件下で形質導入したＴ細胞を培養する工程、及び
（ｃ）形質導入したＴ細胞を培養物から回収する工程
を含む、方法。 - 形質導入したＴ細胞を抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体によるトランスフェクション後に増殖させる、請求項６に記載の方法。
- 形質導入したＴ細胞の増殖を、サイトカイン、好ましくはインターロイキン−２（ＩＬ−２）及び／又はインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）の存在下で実施する、請求項７に記載の方法。
- 請求項６から８の何れか一項に記載の方法によって得ることができるケモカイン受容体６（ＣＸＣＲ６）を発現する形質導入したＴ細胞。
- 医薬として使用するための、請求項５若しくは９に記載の、又は請求項６から８の何れか一項に記載の方法によって得ることができる形質導入したＴ細胞。
- ＣＸＣＬ１６過剰発現を特徴とする疾患の治療方法において使用するための、請求項５若しくは９に記載の、又は請求項６から８の何れか一項に記載の方法によって得ることができる形質導入したＴ細胞。
- （ａ）配列番号１の核酸配列、及び
（ｂ）配列番号１の配列と少なくとも８４％同一で、ケモカイン受容体６（ＣＸＣＲ６）活性を有することを特徴とする核酸配列
からなる群から選択される核酸配列によってコードされるケモカイン受容体６（ＣＸＣＲ６）を発現する形質導入したＴ細胞を含む薬学的組成物。 - 形質導入したＴ細胞が治療する患者から元々得られたＴ細胞である、請求項５、９若しくは１０の何れか一項に記載の、又は請求項６から８の何れか一項に記載の方法によって得ることができる形質導入した細胞、又は請求項１１に記載の使用のための請求項１１に記載の形質導入したＴ細胞、又は請求項１２に記載の薬学的組成物。
- 請求項５、９、１０若しくは１３の何れか一項に記載の、又は請求項６から８の何れか一項に記載の方法によって得ることができる形質導入した細胞、又は請求項１１若しくは１３に記載の使用のための請求項１１若しくは１３に記載の形質導入したＴ細胞、或いはＣＸＣＬ１６過剰発現を特徴とする疾患の治療方法で使用するための請求項１２又は１３に記載の薬学的組成物。
- 前記疾患が、結腸直腸がん、脳がん、卵巣がん、前立腺がん、膵臓がん、乳がん、腎がん、鼻咽頭がん腫、肝細胞がん腫、胃がん、子宮頸がん、膀胱がん、リンパ腫、肉腫及び肺がんからなる群から選択される、請求項１４に記載の使用のための請求項１４に記載の形質導入したＴ細胞、又は請求項１４に記載の使用のための請求項１４に記載の薬学的組成物。
- （ａ）配列番号１の核酸配列、及び
（ｂ）配列番号１の配列と少なくとも８４％同一で、ケモカイン受容体６（ＣＸＣＲ６）活性を有することを特徴とする核酸配列
からなる群から選択される核酸配列を、請求項１から４の何れか一項に記載のベクターを含むＴ細胞に組み入れるためのキット。 - Ｔ細胞がＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、γδＴ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞からなる群から選択されるＴ細胞である、請求項１から４の何れか一項に記載のベクター、請求項５、９、１０若しくは１３の何れか一項に記載の形質導入したＴ細胞、請求項６から８の何れか一項に記載の方法、請求項１１、１３、１４若しくは１５の何れか一項に記載の使用のための請求項１１、１３、１４若しくは１５の何れか一項に記載の形質導入したＴ細胞、請求項１２若しくは１３に記載の薬学的組成物、請求項１４若しくは１５に記載の使用のための薬学的組成物、又は請求項１６に記載のキット。
Priority Applications (1)
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