JP5097856B2 - サイトカイン誘導キラー細胞の製造方法 - Google Patents
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Description
なお、本願は、2009年10月28日出願の日本国特許出願第2009−247347号に対して優先権を主張するものであり、日本国特許出願第2009−247347号の全内容を本願に組み込むものである。
また、本発明の第6の態様は、疾患の治療に用いるための、本発明の第2の態様のサイトカイン誘導キラー細胞に関する。
(1)本発明のCIK細胞の製造方法
本発明の製造方法は、CIK細胞、すなわちCD3陽性かつCD56陽性として特徴づけられる亜細胞集団を高含有する細胞集団を製造する方法である。本発明のCIK細胞の製造方法は、(a)CD3陽性CD56陽性細胞に分化しうる細胞及び/又はCD3陽性CD56陽性細胞を含有する細胞集団をCD3リガンド存在下で培養する工程、(b)工程(a)により得られた細胞集団をCD3リガンドの非存在下で培養する工程、及び(c)工程(b)により得られた細胞集団をCD3リガンド存在下で培養する工程を包含する。
本発明は、上記の本発明のCIK細胞の製造方法で得ることができるCIK細胞を提供する。本発明のCIK細胞は、従来の方法で製造されたCIK細胞に比べてCD3陽性CD56陽性細胞を高比率に含んでいることから、生体内でより強力な細胞傷害活性を発揮することで、高い治療効果を奏する。
本発明は、CIK細胞を有効成分として含有する医薬(治療剤又は予防剤)を提供する。当該CIK細胞を含有する前記治療剤は、免疫療法への使用に適している。免疫療法においては、患者の治療に適したCIK細胞が、例えば、注射又は点滴による投与方法によって、経静脈、経動脈、皮下、腹腔内等の経路で患者に投与される。本発明の治療剤は、本発明を特に限定するものではないが、例えば、癌、白血病、悪性腫瘍、肝炎、感染性疾患(例えば、インフルエンザ、結核、AIDS、MRSA感染症、VRE感染症もしくは深在性真菌症)等のCIK細胞に感受性を有する疾患の治療において非常に有用である。また、当該治療剤は、骨髄移植、放射線照射後等の免疫不全状態での感染症予防又は再発白血病の寛解を目的としたドナーリンパ球輸注、抗がん剤治療、放射線治療、抗体療法、温熱療法、他の免疫療法等の従来の治療法と組み合わせて利用できる。
本発明はまた、対象に、有効量の前述の方法により得ることができるCIK細胞を投与することを含む、疾患の治療方法又は予防方法を提供する。本明細書中において対象とは、例えば前述のような疾患に罹患した患者を示す。
(1)PBMCの分離及び保存
インフォームド・コンセントの得られたヒト健常人ドナーA、ドナーB及びドナーCより、それぞれ成分採血を実施した(ここでいう成分採血とは、単核球採取を目的とした採血である)。得られた成分採血液をダルベッコPBS(インビトロジェン社製又は日水製薬社製;以下、DPBSと記載する)又は1%ヒト血清アルブミン(製剤名 ブミネート:バクスター社製、以下、HSAと記載する)を含む生理食塩水(以下、1%HSA/生理食塩水と記載する)で約2倍希釈した後、Ficoll−Paque PREMIUM又はFicoll−Paque PLUS(いずれもGEヘルスケア バイオサイエンス社製)15mLの上に希釈した成分採血液を30mLずつそれぞれ重層して、700×g、室温で20分間遠心した。遠心後、分離した層のうち、PBMC層をピペットで回収し、RPMI1640(インビトロジェン社製、シグマ社製又は和光純薬社製)又は1%HSA/生理食塩水を用いて45mLにフィルアップした後、650×g、4℃にて10分間遠心し、上清を除去した。同様の洗浄操作を、600×g、500×gと段階的に遠心加速度を落としながら計3回行った。
12穴細胞培養プレート(コーニング社製)に終濃度5μg/mL又は1μg/mLの抗ヒトCD3抗体(製剤名:オルソクローンOKT3注、ヤンセンファーマ社製)、及び終濃度5μg/mLのレトロネクチン(登録商標、タカラバイオ社製)を含むACD−A液(テルモ社製)を0.45mL/ウェルずつ添加した。次に、5%CO2存在下37℃で5時間インキュベートした後、各ウェルよりACD−A液を除去することにより、抗CD3抗体及びレトロネクチンが固定化された細胞培養プレートを得た。また、終濃度5μg/mL又は1μg/mLの抗ヒトCD3抗体を含み、レトロネクチンを含まないACD−A液を用いる以外は上記と同様の操作を行うことにより、抗CD3抗体が固定化された細胞培養プレート(レトロネクチンが固定化されていないプレート)も作製した。なお、ここで作製した各プレートは、DPBSで2回、及びRPMI1640で1回洗浄した後に以下の各実験に使用した。
0.5%HumanAB型血清(Lonza社製)及び0.2%HSAを含むGT−T503(以下、0.5%HAB/0.2%HSA/GT−T503と記載する)に0.53×106cells/mLとなるように実施例1−(1)で調製したドナーA由来のPBMCを懸濁した。実施例1−(2)で作成した各種固定化培養プレートに、上記PBMC懸濁液を1mL/ウェルずつ添加し、さらに0.5%HAB/0.2%HSA/GT−T503を0.75mL/ウェルずつ添加して、計1.75mL/ウェルとした。次に、各ウェルにIL−2(製剤名 プロロイキン:カイロン社製又はノバルティス社製)及びIFN−γ(製剤名 イムノマックス―γ注:塩野義製薬社製)をそれぞれ終濃度1000U/mLとなるように添加し、これらのプレートを5%CO2存在下37℃で培養を開始した(培養0日目)。培養4日目に、各ウェルの細胞液の一部を0.5%HAB/0.2%HSA/GT−T503を用いて12.5倍希釈し、希釈液10mLをT−25細胞培養フラスコ(培養面積10cm2、コーニング社製)を立てたものに注ぎ、ここに終濃度500U/mLとなるようにIL−2を添加した後、このフラスコにて培養を継続した。培養8日目に、各フラスコ内の細胞液の一部を0.5%HAB/0.2%HSA/GT−T503を用いて4倍希釈し、希釈液10mLを新たなT−25細胞培養フラスコ(立てたもの)に注ぎ、ここに終濃度500U/mLとなるようにIL−2を添加し、さらに終濃度50ng/mLとなるように遊離の抗ヒトCD3抗体を添加した(抗ヒトCD3抗体再刺激群)。この際、対照群として抗ヒトCD3抗体を添加しない群を設定した。抗ヒトCD3抗体再刺激群及び対照群について培養を継続し、培養11日目に、各群の各フラスコ内の細胞液の一部を0.5%HAB/0.2%HSA/GT−T503を用いて4倍希釈し、希釈液10mLを新たなT−25細胞培養フラスコ(立てたもの)に注ぎ、ここに終濃度500U/mLとなるようにIL−2を添加した後、このフラスコにて培養を継続した。
実施例1−(3)で調製した培養開始後14日目の細胞について、CD3+CD56+細胞含有比率及びCD8+細胞含有比率をフローサイトメーター(Cytomics FC500:ベックマンコールター社製)で解析した。すなわち、培養開始後14日目の細胞をDPBSで洗浄した後、細胞を1%ウシ血清アルブミン(シグマ社製、以下、BSAと記載する)を含むDPBS(以下、1%BSA/DPBSと記載する)中に懸濁し、PC5標識マウス抗ヒトCD3抗体、FITC標識マウス抗ヒトCD8及びRD1標識マウス抗ヒトCD56抗体(全てベックマンコールター社製)を添加した。同様に各細胞集団の一部には、ネガティブコントロールとしてFITC標識マウスIgG1/RD1標識マウスIgG1/PC5標識マウスIgG1(全てベックマンコールター社製)を添加した。各々の抗体を添加後、4℃で30分インキュベートした。インキュベート後、細胞を0.1%BSAを含むDPBS(以下、0.1%BSA/DPBSと記載する)で洗浄し、再度DPBSに懸濁した。これらの細胞をフローサイトメトリーに供し、CD3+CD56+細胞含有比率及びCD8+細胞含有比率を算出した。結果を表2に示す。
実施例1−(1)で調製したドナーA由来のPBMC、及び実施例1−(3)で調製した培養開始後14日目の細胞それぞれについて、実施例1−(4)と同様の方法でCD3+CD56+細胞含有比率を測定した。ただし、PBMCにおいては赤血球の混入を考慮し、FITC標識マウス抗ヒトCD3抗体、RD1標識マウス抗ヒトCD56抗体及びPC5標識マウス抗ヒトCD45抗体(全てベックマンコールター社製)を使用し、CD45陽性CD3+CD56+細胞を培養開始時のCD3+CD56+細胞と定義した。
(1)Autologous−irradiated cell(以下、AICと記載する)の調製
実施例1−(1)で調製したドナーA由来のPBMCを0.5%HAB/0.2%HSA/GT−T503に懸濁後、X線照射装置を使用し3400R(29.8Gy)のX線を照射した(以下、このX線照射後の細胞をPBMC AICと記載する)。この調製したPBMC AICを1.06×106cells/mLとなるように再度0.5%HAB/0.2%HSA/GT−T503に懸濁した。
0.5%HAB/0.2%HSA/GT−T503に1.06×106cells/mLとなるように実施例1−(1)で調製したドナーA由来のPBMCを懸濁した(IFN−γ前日無処理群と記載)。ただし、培養開始前日に同様に調製したPBMCを一晩IFN-γ(終濃度1000U/mL)存在下で培養した後、培養開始時に上記細胞濃度になるように懸濁した群も設定した(以下、IFN−γ前日処理群と記載する)。
実施例1−(4)と同様の方法で、実施例2−(2)で調製した培養開始後14日目の細胞についてCD3+CD56+細胞含有比率及びCD8+細胞含有比率を解析した。結果を表5に示す。
実施例1−(1)で調製したドナーA由来のPBMC及び細胞実施例2−(2)で調製した培養開始後14日目の細胞それぞれについて、実施例1−(4)と同様の方法でCD3+CD56+細胞含有比率を測定した。
(1)PBMC AICの調製
PBMC AICを、ドナーA由来のPBMCの代わりにドナーB由来のPBMC又はドナーC由来のPBMCを用いる以外は、実施例2−(1)と同様の方法で調製した。
実施例2−(2)と同様の方法でCIK細胞を培養した。ただし、PBMCとしては、ドナーB由来のPBMC又はドナーC由来のPBMC(実施例3−(1)で使用したドナーと同じドナー由来PBMCを使用)を用い、IFN−γ前日処理は行わなかった。また、培養開始8日目の抗ヒトCD3抗体による再刺激の際の抗ヒトCD3抗体の濃度を50ng/mL又は200ng/mLとした。
実施例1−(4)と同様の方法で、実施例3−(2)で調製した培養開始後14日目の細胞についてCD3+CD56+細胞含有比率を解析した。結果を表8に示す。
実施例1−(1)で調製したドナーB由来のPBMC、ドナーC由来のPBMC及び細胞実施例3−(2)で調製した培養開始後14日目の細胞それぞれについて、実施例1−(4)と同様の方法でCD3+CD56+細胞含有比率を測定した。
(1)抗ヒトCD3抗体及びレトロネクチン固定化CultiLife 215の作製
培養面積を86cm2になるようにシールしたガス透過性培養バッグCultiLife(登録商標) 215(タカラバイオ社製)に終濃度0.1または0.3μg/mLの抗ヒトCD3抗体、及び終濃度5μg/mLのレトロネクチン(登録商標)を含むACD−A液を10.4mL添加し、5%CO2存在下、37℃で5時間インキュベートした。なお、こうして作製した抗CD3抗体/レトロネクチン固定化CultiLife 215は、使用直前に1%HSA/生理食塩水で3回洗浄した。
実施例4−(1)で作製した抗CD3抗体/レトロネクチン固定化CultiLife 215に、実施例1−(1)で調製したPBMCを1.2×107cellsずつ添加し、終濃度1000U/mLとなるようにIL−2を、終濃度1000U/mLとなるようにIFN−γをそれぞれ添加し、0.5%自己血漿(PBMCドナー由来の非働化処理済み血漿)及び0.2%HSAを含むGT−T503(以下、0.5%血漿/0.2%HSA/GT−T503と記載する)を用いて最終的に総液量を40mLとした。細胞液を添加した培養バッグを5%CO2存在下、37℃で培養を開始した(培養0日目)。培養開始4日目には、培養面積を300cm2になるようにシールしたガス透過性培養バッグCultiLife(登録商標) Eva(タカラバイオ社製)に細胞液23.4mLを移し、終濃度500U/mLとなるようにIL−2を添加した後、0.5%血漿/0.2%HSA/GT−T503を用いて最終的に総液量を300mLとした。8日目には、CultiLife(登録商標) Eva内の細胞液75mLを、新たに培養面積を300cm2になるようにシールしたガス透過性培養バッグCultiLife(登録商標) Evaに移し替え、0.5%血漿/0.2%HSA/GT−T503を用いて4倍希釈し総液量を300mLとした後、終濃度500U/mLとなるようにIL−2を添加した。さらに終濃度50ng/mLとなるように抗ヒトCD3抗体を添加することで再刺激を行った。11日目には、0.5%血漿/0.2%HSA/GT−T503を用いて2倍希釈し総液量を600mLとした後、終濃度500U/mLとなるようにIL−2を添加した。培養は15日目まで継続した。培養開始後15日目にサンプリングした細胞についてトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較して拡大培養率を算出した。また、実施例1−(4)と同様の方法で、CD3+CD56+細胞含有比率を測定した。結果を表10に示す。
(1)抗ヒトCD3抗体及びレトロネクチン固定化プレートの作成
実施例1−(2)と同様の方法で抗ヒトCD3抗体及びレトロネクチン固定化プレートを作製した。ただし、抗ヒトCD3抗体は終濃度0.1μg/mLとなるようにした。
実施例5−(1)で作成した抗ヒトCD3抗体及びレトロネクチン固定化プレートを用いて、実施例2−(2)と同様の方法で培養を行った。ただし、IFN−γ前日処理群は設定せず、すべての群に終濃度0.05KE/mLとなるようにOK−432(製剤名 ピシバニール:中外製薬社製)を添加した。また、AIC添加の影響についても検討した。培養は15日目まで継続した。培養開始後15日目にサンプリングした細胞についてトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較して拡大培養率を算出した。また、実施例1−(4)と同様の方法で、CD3+CD56+細胞含有比率を測定した。結果を表11に示す。
実施例5−(2)で調製した培養開始後15日目の細胞について、細胞傷害活性を測定した。細胞傷害活性は、Calcein−AMを用いた細胞傷害活性測定法〔リヒテンフェルズ R.ら(Lichtenfels R.et al.)、J. Immunol. Methods、第172巻、第2号、第227〜239頁(1994)〕にて評価した。すなわち、慢性骨髄性白血病細胞株K562細胞及び肺がん細胞株A549細胞をそれぞれ(1〜2)×106cells/mLとなるように5%ウシ胎児血清(HyClone社製)を含むRPMI1640に懸濁した後で、終濃度25μMとなるようにCalcein−AM(同仁化学研究所社製)を添加し、37℃で1時間培養した。こうして得られた細胞をCalcein−AMを含まない培地にて洗浄したものを、Calcein標識標的細胞とした。
(1)抗ヒトCD3抗体及びレトロネクチン固定化プレートの作成
実施例1−(2)と同様の方法で抗ヒトCD3抗体及びレトロネクチン固定化プレートを作製した。ただし、抗ヒトCD3抗体は終濃度0.3μg/mLとなるようにした。
AcGFP発現ベクターMT−AcGFPを以下のように調製した。pIRES2−AcGFP1(Clontech社製)を鋳型とし、配列表の配列番号10に記載の核酸配列からなるAcGFP5プライマー及び配列表の配列番号11に記載の核酸配列からなるAcGFP3プライマーを用いてPCRを行い、増幅断片をpMTベクター[ジーン セラピー 第7巻、第797−804項(2000)に記載されるpMベクター]に挿入してMT−AcGFPプラスミドを調製した。
Retrovirus Packaging Kit(タカラバイオ社製)に含まれているプラスミドpGP、pE−eco及び実施例6−(1)で調製したMT−AcGFPで形質転換された293T細胞よりエコトロピックエンベロープを持つレトロウイルスを作製した。得られたレトロウイルスをプロデューサー細胞PG13(ATCC#:CRL−10686)に3回感染させた後、限界希釈にて複数のクローンを取得した。リアルタイムPCRによる培養上清中のウイルスRNA量の測定結果と、上清と接触させた培養細胞についてフローサイトメトリーで測定したAcGFPの陽性細胞率の結果を指標に1株のクローンを選択し、これをレトロウイルスベクタープロデューサー細胞として以下の実験に用いた。
実施例6−(3)で作製したプロデューサー細胞の培養上清を除き、DPBSで1回洗浄した後、Trypsin/EDTAで処理して細胞を剥離し、10%牛胎児血清(インビトロジェン社製)及び50U/mLペニシリン/50mg/mLストレプトマイシン(ナカライテスク社製)含有D−MEM(シグマアルドリッチ社製)に懸濁した後、100mm dish(イワキ社製)に細胞密度が25000細胞/cm2となるように播種した。24時間培養した後で培養上清を除き、新たな培地8mLを添加した。さらに24時間の培養を行い、上清を回収して0.45μmのフィルターでろ過し、−80℃で保存した。
12穴ノントリートメントプレート(コーニング社製)に終濃度5μg/mLの抗ヒトCD3抗体及び終濃度25μg/mLのレトロネクチン(登録商標)を含むDPBS液を0.95mL/ウェルずつ添加した。次に、5%CO2存在下37℃で5時間インキュベートした後、各ウェルよりDPBS液を除去することにより、抗CD3抗体及びレトロネクチンが固定化された細胞培養プレートを得た。なお、ここで作製したプレートは、DPBSで3回洗浄した後に以下の各実験に使用した。
実施例6−(5)で作製したプレートに実施例6−(4)で作製したウイルス液を1mL/ウェルずつ添加し、32℃、1000×gで2時間遠心した。ただし、ウイルス液を添加しないウェルも作製した。このときウイルスを含まないウイルス希釈液(5%ウシ胎児血清を含むD−MEM)を1mL/ウェルずつ添加し、同様に遠心した。遠心後はウイルス液を吸引除去し、1.5%HSAを含むDPBSを1mL/ウェルずつ添加しすることで、洗浄した。
実施例6−(1)で作成した抗ヒトCD3抗体及びレトロネクチンの固定化プレートを用いて、実施例2−(2)と同様の方法で培養を行った。ただし、IFN−γ前日処理群は設定しなかった。さらに、培養開始4日目に遺伝子導入(以下、1回感染群と記載する)、培養開始4及び5日目に連続して遺伝子導入(以下、2回感染群と記載する)、またそれぞれの感染群に対してウイルスを感染させない非遺伝子導入群(以下、対照群と記載する)を設定した。すなわち、1回感染群では、培養開始4日目に、実施例6−(6)で作製したプレートに細胞液0.4mLを移し、0.5%HAB/0.2%HSA/GT−T503を4.6mL添加し、12.5倍希釈した後に終濃度500U/mLとなるようにIL−2を添加した。このプレートにて8日目まで培養を継続した。2回感染群では、培養開始4日目に実施例6−(6)で作製したプレートに細胞液1.5mLを移し、0.5%HAB/0.2%HSA/GT−T503を1.5mL添加し、2倍希釈した後に、終濃度500U/mLとなるようにIL−2を添加した。さらに培養開始5日目に実施例6−(6)で作製したプレートに細胞液0.8mLを移し、0.5%HAB/0.2%HSA/GT−T503を4.2mL添加し、6倍希釈した後に終濃度500U/mLとなるようにIL−2を添加した。このプレートにて8日目まで培養を継続した。対照群では、1回感染群及び2回感染群ともにウイルスを固定していないプレートを用いて、同様の操作を行った。培養は14日目まで継続した。培養開始後14日目にサンプリングした細胞についてトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較して拡大培養率を算出した。また、実施例1−(4)と同様の方法でCD3+CD56+細胞含有比率を測定した。さらに、遺伝子導入により発現したタンパク質AcGFPの発現率を、遺伝子導入効率としてフローサイトメーターで解析した。結果を表13に示す。
SEQ ID NO:2 ; Partial region of fibronectin named III-10.
SEQ ID NO:3 ; Partial region of fibronectin in III-10.
SEQ ID NO:4 ; Fibronectin fragment named C-274.
SEQ ID NO:5 ; Fibronectin fragment named H-271.
SEQ ID NO:6 ; Fibronectin fragment named H-296.
SEQ ID NO:7 ; Fibronectin fragment named CH-271.
SEQ ID NO:8 ; Fibronectin fragment named CH-296.
SEQ ID NO:9 ; Fibronectin fragment named C-CS1.
SEQ ID NO:10 ; Designed oligonucleotide primer to amplify DNA fragment encodeing AcGFP.
SEQ ID NO:11 ; Designed oligonucleotide primer to amplify DNA fragment encodeing AcGFP.
Claims (5)
- 下記工程(a)〜(c)を包含する、サイトカイン誘導キラー細胞の製造方法:
(a)末梢血単核細胞を抗CD3抗体存在下で培養する工程;
(b)工程(a)により得られた細胞集団を抗CD3抗体の非存在下で培養する工程;及び
(c)工程(b)により得られた細胞集団を抗CD3抗体存在下で培養する工程。 - 工程(a)〜(c)のうち少なくとも一つの工程における細胞集団の培養が、インターフェロン−γ及び/又はインターロイキン−2の存在下で実施される、請求項1記載の製造方法。
- 工程(a)における培養が、フィブロネクチンフラグメントと抗CD3抗体との共存下で実施される、請求項1に記載の製造方法。
- フィブロネクチンフラグメントが、下記からなる群より選択される領域を含有する、請求項3に記載の製造方法:
VLA−4結合領域;
VLA−5結合領域;及び
ヘパリン結合領域。 - 下記工程(A)〜(D)を包含する、サイトカイン誘導キラー細胞の製造方法:
(A)末梢血単核細胞を、抗CD3抗体を含有する培地中で培養する工程;
(B)前記培地の抗CD3抗体濃度を低下させる工程;
(C)抗CD3抗体濃度が低下した培地中で細胞集団を培養する工程;及び
(D)培地に抗CD3抗体を添加し、さらに細胞集団を培養する工程。
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JPN6012039428; THE JOURNAL OF DERMATOLOGY Vol. 28, No. 12, 2001, pp. 746-752 * |
JPN6012039429; 香川県立中央病院医学雑誌 第25巻, 20060331, 第25-29頁 * |
JPN6012046980; Biology of Blood and Marrow Transplantation Vol. 11, No. 3, 2005, pp. 181-187 * |
JPN6012046981; 第62回日本癌学会総会 p. 438, 20030825 * |
JPN6012046983; Chinese Journal of Biotechnology Vol. 24, No. 8, 20080825, pp. 1373-1380 * |
JPN6012046985; Biotherapy Vol. 22, No. 5, 200809, pp. 297-302 * |
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