TW202043465A - Cd28 t 細胞培養物、組合物及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

一種用於產生改善過繼免疫療法療效的T細胞的方法，包括：從患者或供體中獲得CD8+ T細胞群、確定所獲得細胞群中CD28+ CD8+ T細胞的百分比、用抗CD3抗體和抗CD28抗體激活確定的細胞群(前提是確定的細胞群包含至少50%的CD28+ CD8+ T細胞)或在沒有抗CD28抗體的情況下用抗CD3抗體激活確定的細胞群(前提是確定的細胞群包含少於50%的CD28+ CD8+ T細胞)、用病毒載體轉導激活的細胞群以及擴增轉導的細胞群，其中，轉導和擴增在存在至少一種細胞因數的情況下進行。

Description

CD28 T細胞培養物、組合物及其使用方法
1.技術領域
本公開提出了改善T細胞療效的方法。一方面，本公開進一步提出了增強和預測T細胞產物的最終倍數擴增、CD8：CD4 T細胞的比率、相對最終端粒長度和克隆豐富度的方法。本公開還提出了有此需要受試者的癌症治療方法以及透過本文描述的方法產生的T細胞群。
2.背景
免疫療法已成為治療癌症的非常有前途的方法。免疫療法可細分為細胞療法和小分子/抗體療法。在細胞療法領域內，嵌合抗原受體T(CAR-T)細胞療法已對液態腫瘤顯示出強大的臨床療效，而基於T細胞受體T(TCR-T)細胞的療法已對各種實體瘤適應症顯示出具有前景的早期效果。臨床產品的療效可能受到其體內特性驅動，這些體內特性大多可能在離體製造過程中印記。
US 8,383,099描述了一種透過培養自體T細胞以及使用OKT3抗體、IL-2和飼養淋巴細胞來擴增培養T細胞從而促進受試者癌症消退的方法。
US 9,074,185描述了一種產生T細胞輸注產物來促進受試者癌症消退的方法，該方法包括培養自體T細胞、使培養T細胞富集CD8+ T細胞、使用OKT3抗體、IL-2和飼養淋巴細胞來擴增培養T細胞數量從而提供擴增數量的T細胞。
對於癌症患者，仍然需要改善T細胞的療效和ACT的結果。權利要求中所表徵的實施方案提供了該技術問題的解決方案。
本公開提出了產生療效改善的T細胞的方法，例如：
●從患者或供體中獲得T細胞群，
●確定所獲得T細胞群中CD28+ CD8+ T細胞的百分比，
●用抗CD3抗體和/或抗CD28抗體激活確定的T細胞群，以及
●其中，確定的細胞群包括至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、 至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%的CD28+ CD8+ T細胞。
本公開進一步提出了產生療效改善的T細胞的方法，例如：
●從患者或供體中獲得T細胞群，
●確定所獲得T細胞群中CD28+ CD8+ T細胞的百分比，
●在不存在抗CD28抗體的情況下，用抗CD3抗體激活確定的T細胞群，以及
●其中確定的細胞群包括小於約50%、小於約45%、小於約40%、小於約35%、小於約30%、小於約25%、小於約20%、小於約15%、小於約10%、小於約9%、小於約8%、小於約7%、小於約6%、小於約5%、小於約4%、小於約3%、小於約2%或小於約1%的CD28+ CD8+ T細胞。
本公開進一步提出了產生療效改善的T細胞的離體方法，例如：
●確定所分離T細胞群中CD28+ CD8+ T細胞的百分比，
●用抗CD3抗體和/或抗CD28抗體激活確定的T細胞群，以及
●前提是，確定的細胞群包括至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少 93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的CD28+ CD8+ T細胞。
本公開進一步提出了產生療效改善的T細胞的離體方法，例如：
●確定所分離T細胞群中CD28+ CD8+ T細胞的百分比，
●在不存在抗CD28抗體的情況下，用抗CD3抗體激活確定的T細胞群，以及
●前提是，確定的細胞群包括小於50%、小於45%、小於40%、小於35%、小於30%、小於25%、小於20%、小於15%、小於10%、小於9%、小於8%、小於7%、小於6%、小於5%、小於4%、小於3%、小於2%或小於1%的CD28+ CD8+ T細胞。
一方面，用病毒載體轉導激活的T細胞群，並擴增轉導的T細胞群。另一方面，轉導和擴增可在存在至少一種細胞因數的情況下進行。
另一方面，本公開涉及用於產生改善免疫療法療效的T細胞的方法，包括：
●從患者或供體中獲得CD8+ T細胞群，
●確定所獲得細胞群中CD28+ CD8+ T細胞的百分比，
●用抗CD3抗體和抗CD28抗體激活確定的細胞群，以及
●其中，確定的細胞群包括至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、 至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%的CD28+ CD8+ T細胞，
●用病毒載體轉導激活的T細胞群，和
●擴增轉導的T細胞群。
另一方面，本公開涉及用於產生改善免疫療法療效的T細胞的離體方法，包括：
●確定所分離CD8+ T細胞群中CD28+ CD8+ T細胞的百分比，
●用抗CD3抗體和抗CD28抗體激活確定的細胞群，以及
●前提是，確定的細胞群包括至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的CD28+ CD8+ T細胞，
●用病毒載體轉導激活的T細胞群，和
●擴增轉導的T細胞群。
另一方面，本公開涉及用於產生改善免疫療法療效的T細胞的方法，包括：
●從患者或供體中獲得CD8+ T細胞群，
●確定所獲得細胞群中CD28+ CD8+ T細胞的百分比，
●在不存在抗CD28抗體的情況下，用抗CD3抗體激活確定的細胞群，但是前提是，確定的細胞群包括小於約50%、小於約45%、小於約40%、小於約35%、小於約30%、小於約25%、小於約20%、小於約15%、小於約10%、小於約9%、小於約8%、小於約7%、小於約6%、小於約5%、小於約4%、小於約3%、小於約2%或小於約1%的CD28+ CD8+ T細胞，
●用病毒載體轉導激活的T細胞群，和
●擴增轉導的T細胞群。
另一方面，本公開涉及用於產生改善免疫療法療效的T細胞的離體方法，包括：
●確定所分離CD8+ T細胞群中CD28+ CD8+ T細胞的百分比，
●在不存在抗CD28抗體的情況下，用抗CD3抗體激活確定的細胞群，但是前提是，確定的細胞群包括小於約50%、小於約45%、小於約40%、小於約35%、小於約30%、小於約25%、小於約20%、小於約15%、小於約10%、小於約9%、小於約8%、小於約7%、小於約6%、小於約5%、小於約4%、小於約3%、小於約2%或小於約1%的CD28+ CD8+ T細胞，
●用病毒載體轉導激活的T細胞群，和
●擴增轉導的T細胞群。
另一方面，轉導和擴增可在存在至少一種細胞因數的情況下進行。
一方面，激活可能包括用抗CD3抗體和抗CD28抗體將T細胞固定於固相支撐物上。
另一方面，抗CD3抗體和/或抗CD28抗體各自的濃度為約0.1μg/ml至約10.0μg/ml、約0.1μg/ml至約8.0μg/ml、約0.1μg/ml至約6.0μg/ml、約0.1μg/ml至約4.0μg/ml、約0.1μg/ml至約2.0μg/ml、約0.1μg/ml至約1.0μg/ml、約0.1μg/ml至約0.5μg/ml、約0.5μg/ml至約10.0μg/ml、約2μg/ml至約8μg/ml、約3μg/ml至約7μg/ml、約2μg/ml至約5μg/ml、約0.5μg/ml至約2.0μg/ml或約0.5μg/ml至約2.5μg/ml。
另一方面，激活可能在約1小時至約120小時、約1小時至約108小時、約1小時至約96小時、約1小時至約84小時、約1小時至約72小時、約1小時至約60小時、約1小時至約48小時、約1小時至約36小時、約1小時至約24小時、約2小時至約24小時、約4小時至約24小時、約6小時至約24小時、約8小時至約24小時、約10小時至約24小時、約12小時至約24小時、約12小時至約72小時、約24小時至約72小時、約6小時至約48小時、約24小時至約48小時、約6小時至約72小時或約1小時至約12小時的時間段內進行。
另一方面，至少一種細胞因數可選自白介素(IL)-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-21或其組合物。
另一方面，至少一種細胞因數包括IL-7、IL-15或IL-7和IL-15的組合物。
另一方面，IL-7的濃度為約1ng/ml至90ng/ml、約1ng/ml至80ng/ml、約1ng/ml至70ng/ml、約1ng/ml至60ng/ml、約1ng/ml至50ng/ml、約1ng/ml至40ng/ml、約1ng/ml至30ng/ml、約1ng/ml至20ng/ml、約1ng/ml至15ng/ml、約1ng/ml至10ng/ml、約2ng/ml至10ng/ml、約4ng/ml至10ng/ml、約6ng/ml至10ng/ml或約5ng/ml至10ng/ml。
另一方面，IL-15的濃度可能為約5ng/ml至500ng/ml、約10ng/ml至400ng/ml、約15ng/ml至300ng/ml、約5ng/ml至200ng/ml、約5ng/ml至150ng/ml、約5ng/ml至100ng/ml、約10ng/ml至100ng/ml、約20ng/ml至100ng/ml、約30ng/ml至100ng/ml、約40ng/ml至100ng/ml、約50ng/ml至100ng/ml、約60ng/ml至100ng/ml、約70ng/ml至100ng/ml、約80ng/ml至100ng/ml、約90ng/ml至100ng/ml、約10ng/ml至50ng/ml、約1ng/ml至50ng/ml、約5ng/ml至50ng/ml或約20ng/ml至50ng/ml。
另一方面，轉導可能在約1小時至120小時、約12小時至96小時、約24小時至96小時、約24小時至72小時、約10小時至48小時、約1小時至36小時、約1小時至24小時、約2小時至24小時、約4小時至24小時、約6小時至24小時、約8小時至24小時、約10小時至24小時、約1小時至12小時、約14小時至24小時、約1小時至12小時、約6至約18小時的時間段內進行。
另一方面，病毒載體可能是表達T細胞受體(TCR)的逆轉錄病毒載體。
另一方面，病毒載體可能是表達TCR的慢病毒載體。
另一方面、擴增可能在約1天至約30天、約5至約30天、約1天至約25天、約2天至約20天、約5天至約15天、約2天至約10天、約3天至約15天、約3天至約20天、約4天至約10天、約5天至約10天、約6天至約10天、約7天至約25天、約8天至約25天或約9天至約12天的時間段內進行。
另一方面，本公開涉及一種用於產生改善過繼免疫療法療效的T細胞的方法，包括：例如，從患者或供體中獲得CD8+ T細胞群、從所得細胞群中分離CD28+ CD8+ T細胞(其中分離的細胞包含至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、 至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%的CD28+ CD8+ T細胞)、用抗CD3抗體和抗CD28抗體激活分離的細胞、用病毒載體轉導激活的細胞群以及擴增轉導的細胞群(其中轉導和擴增可在存在至少一種細胞因數的情況下進行)。
另一方面，本公開涉及透過本公開的方法產生的T細胞。
另一方面，本公開涉及可用本公開的方法獲得的T細胞，優選為T細胞群，更優選為基因轉導的T細胞。本公開的另一方面，T細胞，優選為T細胞群，更優選為基因轉導的T細胞可使用本公開的方法直接獲得。
一方面，透過本文所述方法提出的包含至少約50% CD28+ CD8+ T細胞的基因轉導T細胞與從包含少於約50%的CD28+ CD8+ T細胞的確定細胞群產生的T細胞相比，可表現出至少約1.2倍、至少約1.5倍、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約3倍、至少約3.5倍、至少約4倍、至少約4.5倍或至少約5倍更高的倍數擴增。
一方面，透過本文所述方法提出的包含至少約50% CD28+ CD8+ T細胞的基因轉導T細胞與從包含少於約50%的CD28+ CD8+ T細胞的確定細胞群產生的T細胞相比，可表現出至少約1.2倍、至少約1.5倍、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約3倍、至少約 3.5倍、至少約4倍、至少約4.5倍或至少約5倍更高的CD8：CD4 T細胞比率。
一方面，透過本文所述方法提出的包含至少約50% CD28+ CD8+ T細胞的基因轉導T細胞與從包含少於約50%的CD28+ CD8+ T細胞的確定細胞群產生的T細胞相比，可表現出至少約1.2倍、至少約1.5倍、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約3倍、至少約3.5倍、至少約4倍、至少約4.5倍或至少約5倍更長的端粒長度。
一方面，透過本文所述方法提出的包含至少約50% CD28+ CD8+ T細胞的基因轉導T細胞與從包含少於約50%的CD28+ CD8+ T細胞的確定細胞群產生的T細胞相比，可表現出至少約1.2倍、至少約1.5倍、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約3倍、至少約3.5倍、至少約4倍、至少約4.5倍或至少約5倍更高的克隆豐富度。
另一方面，透過本文所述的方法產生的基因轉導T細胞與從包含小於約50%、小於約45%、小於約40%、小於約35%、小於約30%、小於約25%、小於約20%、小於約15%、小於約10%、小於約9%、小於約8%、小於約7%、小於約6%、小於約5%、小於約4%、小於約3%、小於約2%或小於約1%的CD28+ CD8+ T細胞的確定細胞群產生的T細胞相比，表現出一倍或多倍更 高的倍數擴增、更高的CD8：CD4 T細胞比率、更長的端粒長度和/或更高的克隆豐富度。
另一方面，選自包含至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%的CD28+ CD8+ T細胞的確定細胞群的基因轉導T細胞與從包含小於約50%、小於約45%、小於約40%、小於約35%、小於約30%、小於約25%、小於約20%、小於約15%、小於約10%、小於約9%、小於約8%、小於約7%、小於約6%、小於約5%、小於約4%、小於約3%、小於約2%或小於約1%的CD28+ CD8+ T細胞的確定細胞群產生的T細胞相比，表現出一倍或多倍更高的倍數擴增、更高的CD8：CD4 T細胞比率、更長的端粒長度和/或更高的克隆豐富度。
另一方面，本公開涉及一種組合物，例如：藥物組合物，其包含可透過本文所述方法獲得的基因轉導T細胞以及藥用載體。一方面，本公開涉及治療患有癌症的患者的方法，包括給予患者透過前述各方面中任一方面中的方法產生的有效治療量的T細胞，其中所述癌症選自肝細胞癌(HCC)、結直腸癌(CRC)、膠質母細胞瘤(GB)、胃癌(GC)、食道癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、胰腺癌(PC)、腎細胞癌(RCC)、良性攝護腺增生(BPH)、攝護 腺癌(PCA)、卵巢癌(OC)、黑色素瘤、乳腺癌、慢性淋巴細胞白血病(CLL)、梅克爾細胞癌(MCC)、小細胞肺癌(SCLC)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性骨髓性白血病(AML)、膽囊癌和膽管癌(GBC、CCC)、膀胱癌(UBC)、急性淋巴細胞白血病(ALL)、多發性骨髓瘤(MM)和子宮癌(UEC)組成的組。
另一方面，本公開涉及一種用作藥劑的組合物，例如：藥物組合物，其包含可透過前述各方面中任一方面中的方法獲得的基因轉導T細胞。
另一方面，本公開涉及一種用於治療癌症的組合物，例如：藥物組合物，其包含可透過前述各方面中任一方面中的方法獲得的轉導T細胞，其中所述癌症選自肝細胞癌(HCC)、結直腸癌(CRC)、膠質母細胞瘤(GB)、胃癌(GC)、食道癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、胰腺癌(PC)、腎細胞癌(RCC)、良性攝護腺增生(BPH)、攝護腺癌(PCA)、卵巢癌(OC)、黑色素瘤、乳腺癌、慢性淋巴細胞白血病(CLL)、梅克爾細胞癌(MCC)、小細胞肺癌(SCLC)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性骨髓性白血病(AML)、膽囊癌和膽管癌(GBC、CCC)、膀胱癌(UBC)、急性淋巴細胞白血病(ALL)、多發性骨髓瘤(MM)和子宮癌(UEC)組成的組。
另一方面，本公開涉及一種組合物(例如：藥物組合物，其包含可透過前述各方面中任一方面中的方法獲得的轉導T細胞)在治療癌症中的用途，其中所述癌症選 自肝細胞癌(HCC)、結直腸癌(CRC)、膠質母細胞瘤(GB)、胃癌(GC)、食道癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、胰腺癌(PC)、腎細胞癌(RCC)、良性攝護腺增生(BPH)、攝護腺癌(PCA)、卵巢癌(OC)、黑色素瘤、乳腺癌、慢性淋巴細胞白血病(CLL)、梅克爾細胞癌(MCC)、小細胞肺癌(SCLC)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性骨髓性白血病(AML)、膽囊癌和膽管癌(GBC、CCC)、膀胱癌(UBC)、急性淋巴細胞白血病(ALL)、多發性骨髓瘤(MM)和子宮癌(UEC)組成的組。
另一方面，本公開涉及一種治療癌症患者的方法，包括從患者中獲得CD8+ T胞群、確定所得細胞群中CD28+ CD8+ T細胞的百分比、用抗CD3抗體和抗CD28抗體激活確定的細胞群(前提是確定的細胞群包含至少約50%的CD28+ CD8+ T細胞)或在沒有抗CD28抗體的情況下用抗CD3抗體激活確定的細胞群(前提是確定的細胞群包含少於約50%的CD28+ CD8+ T細胞)、用病毒載體轉導激活的T細胞群、擴增轉導的T細胞群以及給予患者擴增的T細胞群，其中所述癌症選自肝細胞癌(HCC)、結直腸癌(CRC)、膠質母細胞瘤(GB)、胃癌(GC)、食道癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、胰腺癌(PC)、腎細胞癌(RCC)、良性攝護腺增生(BPH)、攝護腺癌(PCA)、卵巢癌(OC)、黑色素瘤、乳腺癌、慢性淋巴細胞白血病(CLL)、梅克爾細胞癌(MCC)、小細胞肺癌(SCLC)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性骨髓性白血 病(AML)、膽囊癌和膽管癌(GBC、CCC)、膀胱癌(UBC)、急性淋巴細胞白血病(ALL)、多發性骨髓瘤(MM)和子宮癌(UEC)組成的組。
另一方面，本公開涉及與和主要組織相容性複合物(MHC)分子複合的肽相結合的TCR，其中所述肽包含選自由SEQ ID NO：1-158組成組的氨基酸序列。
另一方面，病毒載體可能是表達嵌合抗原受體(CAR)的逆轉錄病毒載體。
另一方面，病毒載體可能是表達CAR的慢病毒載體。
另一方面，CAR可能為CD19 CAR。
另一方面，本公開涉及一種治療癌症患者的方法，包括從患者中獲得CD8+ T細胞群、確定所得細胞群中CD28+ CD8+ T細胞的百分比、用抗CD3抗體和抗CD28抗體激活確定的細胞群(前提是確定的細胞群包含至少約50%的CD28+ CD8+ T細胞)或在沒有抗CD28抗體的情況下用抗CD3抗體激活確定的細胞群(前提是確定的細胞群包含少於約50%的CD28+ CD8+ T細胞)、用病毒載體轉導激活的T細胞群、擴增轉導的T細胞群、確定擴增T細胞群的倍數擴增、給予患者擴增的T細胞群(前提是倍數擴增大於10倍)，其中所述癌症選自肝細胞癌(HCC)、結直腸癌(CRC)、膠質母細胞瘤(GB)、胃癌(GC)、食道癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、胰腺癌(PC)、腎細胞癌(RCC)、良性攝護腺增生 (BPH)、攝護腺癌(PCA)、卵巢癌(OC)、黑色素瘤、乳腺癌、慢性淋巴細胞白血病(CLL)、梅克爾細胞癌(MCC)、小細胞肺癌(SCLC)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性骨髓性白血病(AML)、膽囊癌和膽管癌(GBC、CCC)、膀胱癌(UBC)、急性淋巴細胞白血病(ALL)、多發性骨髓瘤(MM)和子宮癌(UEC)組成的組。
另一方面，倍數擴增可以為約2至約50倍、約5至約50倍、約10至約50、約2至約30倍、約10至約20倍、約2至約25倍、約5至約25倍、約7至約20倍、約2至約10倍、約2至約5倍。另一方面，倍數擴增可以為大於2倍、大於3倍、大於4倍、大於5倍、大於8倍、大於10倍或大於20倍。
為了進一步理解本公開的本質、目的和優點，應參考以下詳細描述並結合以下附圖，其中類似的元件符號表示類似的元件。
圖1A顯示了根據本公開一實施方案在較大年齡跨度內健康人PBMC的CD8區室中CD28表達百分比。供體的CD28表達透過流式細胞術進行了分析。根據Graphpad Prism 7中線性回歸法確定，觀察到CD8 T細胞中起始CD28表達之間呈線性相關性(R2=0.7124)。
圖1B顯示了根據本公開一實施方案在7天製造結束時，CD3區室(即，CD8陽性和CD4陽性區室)內CD8陽性細胞的最終百分比。起始CD28百分比和最終CD8百分比透過流式細胞術計算。根據Graphpad Prism 7中線性回歸法確定，起始CD28百分比和最終CD8百分比之間的R2相關性為0.8121。
圖1C顯示了根據本公開一實施方案7天完成的倍數擴增。起始CD28百分比透過流式細胞術計算。計算轉導日至培養期第7天的總倍數擴增。根據Graphpad Prism 7中線性回歸法確定，起始CD28百分比和最終倍數擴增之間的R2相關性為0.8579。
圖1D顯示了根據本公開一實施方案透過流式細胞術測得的最終端粒長度。根據Graphpad Prism 7中線性回歸法確定，起始CD28百分比和最終端粒長度之間的R2相關性為0.9581。
圖2顯示了根據本公開一實施方案所述之T細胞擴增動力學的特徵分析。在3名健康供體中，與PBMC的CD8區室中CD28表達中等(Mid)(例如54.3%)和較低(Low)(例如31.1%)的供體相比，PBMC的CD8區室中CD28表達較高(Hi)(例如93.4%)的供體包含更多可以進行早期擴增的T細胞克隆物，如第4天的細胞數相較於第2天的細胞數所定義(用CD3/CD28激活後2天)。
圖3顯示了根據本公開一實施方案，克隆物的收縮和擴增與起始CD28百分比相關。在3名健康供體中，進行了單分子DNA測序，並隨時間變化追蹤了各個T細胞克隆物。差異豐富的百分比表示相對於激活後，截至擴增第10天擴增或收縮可評價T細胞克隆總數的所有T細胞克隆物的部分。CD28表達細胞的百分比根據起始PBMC透過流式細胞術計算。根據Graphpad Prism 7中線性回歸法確定，起始CD28百分比和差異豐富的百分比之間的R2相關性為0.9726。
圖4顯示了根據本公開一實施方案所述之低CD28表達供體表現出負值克隆分裂的延遲T細胞擴增。細胞群增長可基於總活細胞進行計算，並可表示倍數增長。克隆分裂計算為log2(克隆倍數擴增)，代表獲得的中位值，當培養物中克隆頻率收縮時，獲得負值(即，虛線以下)，而當培養物中克隆頻率擴增時，則獲得正值(即，虛線以上)。所有點均相對於激活後基線，並計算至T細胞擴增過程第4天。
圖5顯示了根據本公開另一實施方案所述之T細胞擴增動力學的特徵分析。根據每個T細胞克隆的log2(倍數增長)所估計已經歷的分裂次數，對T細胞克隆物進行分組。早期、中期和後期擴增分別對應於製造過程的第4、7和10天。圖例包含當時的中位(Med)和平均(Avg)克隆分裂以及細胞總數(Tot)。
圖6顯示了根據本公開另一實施方案所述之T細胞擴增動力學的特徵分析。達到1億個細胞所需的分裂次數按後期擴增時間點根據平均分裂進行計算。
圖7顯示了根據本公開另一實施方案所述之T細胞擴增動力學的特徵分析。計算經歷正值或負值早期擴增(第2天至第4天)的T細胞克隆之間的平均最終克隆分裂次數。*P<0.05，**P<.0001。
圖8顯示了根據本公開另一實施方案所述之T細胞擴增動力學的特徵分析。刺激後獨特克隆爆發後，較低CD28(例如，中等CD28+和低CD28+)的供體中獨特克隆不斷減少。獨特T細胞克隆可源自T細胞受體(TCR)CDR3區獨特DNA分子讀數的數量。數值為1的虛線表示T細胞克隆數少於激活後存在數的點。在T細胞製造過程中，分別在早期(第4天)、中期(第7天)和後期(第10天)測量克隆多樣性(獨特克隆的數量)。所有值均標準化為在激活後(第2天)時間點獨特T細胞克隆的數量。
使用基因改造的T細胞進行過繼性T細胞療法已經成為幾種惡性腫瘤的潛在治療方案。細胞療法產生的核心是使用刺激、基因工程和擴增方法學組合進行的製造。在此框架內，細胞擴增至治療相關劑量與保持「活藥物」增殖可能性的需求之間可能存在一種微妙的平衡。
如本文所述，本公開提出了改善T細胞療效的方法以及增強和預測T細胞產物的最終倍數擴增、CD8：CD4 T細胞的比率、相對最終端粒長度和克隆豐富度的方法。本公開還提出了有此需要受試者的癌症治療方法以及透過本文描述的方法產生的T細胞群。
CD28是在T細胞上表達的分子之一，這些分子提供T細胞激活所需的共刺激信號。CD28是B7.1(CD80)和B7.2(CD86)的受體。被Toll樣受體配體激活時，B7.1表達在抗原呈遞細胞(APC)中上調。抗原呈遞細胞上的B7.2表達為組成性表達。CD28是在幼稚T細胞上組成性表達的唯一B7受體。除了TCR之外，透過CD28的刺激可以為T細胞提供有效的共刺激信號，以產生各種白介素(特別是IL-2和IL-6)。
當延長擴增T細胞時，儘管存在多種增殖細胞因數，它們仍可能喪失其增殖可能性並在功能上衰老。此外，CD28的表達可能與多個製造指標相關，包括最終T細胞倍數擴增。因此，CD28表達的喪失可能為T細胞擴增帶來瓶頸，其中某些T細胞克隆相較於製造過程中的其他克隆可能受到極大的青睞。綜合多種相關性，可用臨床試驗資料的薈萃分析顯示，年輕患者似乎對涉及CD28共刺激的T細胞製造反應更好，而老年患者似乎對缺乏CD28共刺激的T細胞製造反應更好。
本公開的一方面，CD28陽性CD8+ T細胞的起始百分比可以用作生物標誌物，以便能夠準確預測最終 T細胞產物的1)T細胞擴增倍數，2)CD8：CD4 T細胞的比率(或CD3陽性細胞中CD8陽性細胞百分比)，以及3)相對端粒長度。另外，CDR3 DNA測序可用於追蹤來自供體的具有不同起始CD28表達水平的克隆細胞群。根據這項分析，CD28起始表達水平不同可能會導致在整個T細胞製造過程中克隆擴增動力學存在顯著差異。
T細胞製造工藝依賴於PBMC衍生T細胞的分離、激活和擴增。激活可透過抗CD3和CD28的固定激動性抗體、然後在細胞因數環境中擴增來完成。製造過程中，可能會追蹤產品特徵(例如，T細胞擴增倍數和CD8+與CD4+細胞的比率)，因為這些因素可能會影響治療效果並達到最低閾值。因此，可能需要更深入地瞭解可能影響這些指標並影響臨床製造結果的因素。
例如，T細胞產物製造過程通常可分為五個步驟：(1)白細胞分離術，分離患者的外周血單核細胞(PBMC)，(2)激活，(3)用非病毒或病毒編碼TCR/CAR載體對來自PBMC的T細胞進行基因修飾；(4)擴增T細胞，以產生臨床相關劑量；以及(5)輸注T細胞之前對患者進行可選性淋巴清除，並將修飾的T細胞輸注至患者體內。激活T細胞區室可主要透過使用激動性αCD3抗體(進行或不進行αCD28抗體共刺激)、然後通常在IL-2中擴增來實現，儘管IL-7+IL-15可能會產生幼稚T細胞最終產物。
擴增過程中，由於撤回TCR刺激，T細胞可能在增長和收縮之間達到平衡。製造過程中，T細胞向終末分化效應細胞進行分化，這一過程可能取決於PBMC的起始分化狀態。來自老年供體的PBMC可能富含CD28陰性CD8+ T細胞。此外，基於非細胞凋亡外在Fas的T細胞與T細胞相互作用可能會驅動幼稚T細胞的分化。這些觀察結果提示，T細胞離體擴增過程中，某些T細胞可能競爭贏過其他T細胞。因此，可能需要在克隆水平上闡明這種收縮和擴增的動力學。
在某些方面，本公開的T細胞可能包括原代人T細胞，例如：源自人外周血單核細胞(PBMC)、用G-CSF刺激後收集PBMC、骨髓或臍帶血的T細胞。條件可能包括使用mRNA和DNA以及電穿孔。轉染後，可能立即輸注細胞或者可能儲存細胞。在某些方面，轉染後，細胞可能在基因轉移入細胞後約1、約2、約3、約4、約5天或更長時間內離體繁殖數天、數週或數月作為主體群。
另一方面，轉染後，可能克隆轉染子，並可能離體擴增證明存在單個整合或附加體型維持的表達盒或質粒且表達TCR的克隆。選擇用於擴增的克隆可能證明特異性識別和裂解肽表達靶細胞的能力。可透過用與共同γ鏈結合的IL-2或其他細胞因數(例如：IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-21等)刺激來擴增重組T細胞。可透過用人工抗原呈遞細胞刺激來擴增重組T細胞。重組T細胞可在人工抗原呈遞細胞上進行擴增，或者用抗體(如： OKT3，其與T細胞表面上的CD3交聯)進行擴增。重組T細胞亞群可在人工抗原呈遞細胞上進行刪除，或者用抗體(如：Campath，其與T細胞表面上的CD52結合)進行刪除。另一方面，可冷凍保存基因修飾的細胞。
術語「激活」系指T細胞已被充分刺激而誘導可檢測細胞增殖的狀態。在特定的實施方案中，激活還可與誘導細胞因數產生和可檢測的效應子功能相關。術語「激活的T細胞」尤其系指正在增殖的T細胞。僅透過TCR產生的信號不足以完全激活T細胞，還需要一種或多種次級信號或共刺激信號。因此，T細胞激活包括透過TCR/CD3複合體的初級刺激信號以及一種或多種次級共刺激信號。共刺激可以透過已經接受主要激活信號的T細胞的增殖和/或細胞因數產生來證明，例如透過CD3/TCR複合體或透過CD2的刺激。
在某些方面，本公開可能包括製備和/或擴增抗原特異性重定向T細胞的方法，其包括用含有編碼TCR的DNA構建體的表達載體來轉染T細胞，然後，任選地用抗原陽性細胞、重組抗原或受體抗體來刺激細胞，而使細胞增殖。
另一方面，提出了使用裸DNA或RNA透過電穿孔或其他非病毒基因轉移(例如但不限於聲孔作用)來穩定地轉染和重定向T細胞的方法。大多數研究者已使用病毒載體將異源基因攜帶入T細胞中。透過使用裸DNA或RNA，可以減少產生重定向T細胞所需的時間。 「裸DNA或RNA」系指以適當表達方向包含於表達盒或載體中的編碼TCR的DNA或RNA。本公開的電穿孔方法產生穩定的轉染子，其在其表面上表達並攜帶TCR。
在某些方面，TCR構建體可以作為裸DNA或在合適的載體中引入受試者自身T細胞中。本領域中使用裸DNA透過電穿孔穩定轉染T細胞的方法，請參見，例如，美國專利號6,410,319，其內容透過引用整體併入。裸DNA通常系指以適當表達方向包含於質粒表達載體中的編碼本公開TCR的DNA。有利的情況是，使用裸DNA減少產生表達本公開TCR的T細胞所需的時間。
或者，可以使用病毒載體(例如，逆轉錄病毒載體、腺病毒載體、腺相關病毒載體或慢病毒載體)將TCR構建體引入T細胞。根據本公開的方法使用的合適載體在受試者的T細胞中為非複製型。已知有大量基於病毒的載體，其中細胞中維持的病毒拷貝數足夠低，可維持細胞的存活性。示例性載體包括：pFB-neo載體(STRATAGENE®)以及基於HIV、SV40、EBV、HSV或BPV的載體。
一旦確立轉染或轉導T細胞能夠將TCR構建體表達為具有所需調節和所需水平的表面膜蛋白，則可以確定TCR在宿主細胞中是否具有提供所需信號誘導的功能。隨後，將轉導的T細胞重新引入或給予受試者以激活受試者的抗腫瘤反應。
為了便於用藥，可以將根據本公開所述的轉導T細胞製成藥物組合物或製成適於體內給藥的植入體，同時具有合適的載劑或稀釋劑，其還可以為藥用型的。本領域已經描述了製備這種組合物或植入物的方法(參見，例如，Remington's Pharmaceutical Sciences,16th Ed.,Mack,ed.(1980年，其內容透過引用整體併入本文))。在合適的時候，可按照其各自的給藥途徑以常規方法將轉導T細胞配製成半固體或液體形式的製劑，例如：膠囊、溶液、注射劑、吸入劑或氣霧劑。可利用本領域已知的方法來防止或最小化組合物到達靶組織或器官之前的釋放和吸收，或確保組合物定時釋放。但是，理想的情況是，使用不妨礙細胞表達TCR的藥用形式。因此，理想的情況是，轉導T細胞可以製成含有平衡鹽溶液(優選為Hanks平衡鹽溶液)或生理鹽水的藥物組合物。
本公開的方法可用於擴增選擇的T細胞群以用於治療傳染病或癌症。得到的T細胞群可以進行基因轉導並用於免疫療法，或者可用於進行感染因子的體外分析。在T細胞群擴增至足夠數量後，可將擴增的T細胞恢復至個體。本公開的方法還可提供可再生的T細胞來源。因此，來自個體的T細胞可以離體擴增，一部分擴增的細胞群可重新給予個體，而另一部分則可等分冷凍長期保存，隨後擴增和給予個體。類似地，可從患有癌症的個體中獲得腫瘤浸潤淋巴細胞群，並刺激T細胞增殖至足夠數量並恢復至個體。
一方面，T細胞的擴增和/或激活在存在一種或多種IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-21的情況下發生。另一方面，T細胞的擴增和/或激活於單獨的IL-2、單獨的IL-7、單獨的IL-15、IL-2和IL-15組合或IL-7和IL-15組合的情況下發生。
本公開還可能涉及的組合物含有向T細胞提供共刺激信號以用於T細胞擴增的製劑(例如，抗CD28抗體、B7-1或B7-2配體)，其與固相表面偶聯，該組合物可能另外包括與相同的固相表面偶聯的向T細胞提供主要激活信號的製劑(例如，抗CD3抗體)。這些製劑可能優選附著於珠或燒瓶或袋上。包含每種製劑與不同固相表面偶聯(即，提供主要T細胞激活信號的製劑與第一固相表面偶聯和提供共刺激信號的製劑與第二固相表面偶聯)的組合物也可能在本公開的範圍內。
本發明的組合物的形式可以為單位劑型，其中每個劑量單位(例如：注射劑)可能含有預定量的組合物，其單獨或與其他活性劑適當組合使用。本文所用的單位劑型術語系指適合作為人和動物受試者單位劑量的物理離散單位，每個單位單獨含有或與其他活性劑組合含有預定量的本發明組合物，該預定量經計算為足以產生所需效果的量，適當情況下與藥用稀釋劑、載劑(carrier或vehicle)相關。本公開新單位劑型的規格取決於特定受試者中與藥物組合物相關的特定藥效學。
理想的情況是，有效量或足夠量的分離轉導T細胞存在於組合物中並引入受試者中，從而可能確立長期、特異性抗腫瘤反應，相較於這種治療不存在將導致的情況降低腫瘤大小或消除腫瘤生長或再生長。理想的情況是，與除了不存在轉導T細胞以外相同的條件相比，重新引入受試者的轉導T細胞數量可能使腫瘤大小降低約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%、約98%或約99%。
因此，轉導T細胞的給予量應考慮給予途徑，並且應該使得引入足夠數量的轉導T細胞以實現所需的治療反應。此外，本文所述組合物中所含每種活性劑的量(例如，依照每種待接觸細胞的量或依照特定體重的量)在不同應用中可能不同。一般來說，轉導T細胞的理想濃度應該足以在接受治療的受試者中提供至少約1×106至約1×109個轉導T細胞/患者m2(或kg)，更理想的情況是，約1×107至約5×108個轉導T細胞/患者m2(或kg)，但是可使用任何超出，例如，大於5×108個細胞/患者m2(或kg)，或低於，例如，小於1×107個細胞/患者m2(或kg)的合適的量。給藥方案可以基於公認的基於細胞的療法(參見，例如，美國專利號4,690,915，其內容透過引用整體併入本文)，或者可採用交替連續輸注策略。
這些值可能為在優化實施本發明的本公開方法後醫師所使用的轉導T細胞範圍提供了一般指導。本文中 對這些範圍的敍述絕不排除使用更高或更低量的組分，因為這在特定應用中可能是必要的。例如，根據組合物是否與其他藥物組合物聯合使用，或根據藥代動力學、藥物分佈和代謝的個體間差異，實際劑量和方案可能會不同。本領域技術人員可根據特定情況的緊急需要進行任何必要的調整。
一方面，能夠與本文所述的方法和實施方案一起使用的腫瘤相關抗原(TAA)肽包括，例如，美國專利公開號20160187351、美國專利公開號20170165335、美國專利公開號20170035807、美國專利公開號20160280759、美國專利公開號20160287687、美國專利公開號20160346371、美國專利公開號20160368965、美國專利公開號20170022251、美國專利公開號20170002055、美國專利公開號20170029486、美國專利公開號20170037089、美國專利公開號20170136108、美國專利公開號20170101473、美國專利公開號20170096461、美國專利公開號20170165337、美國專利公開號20170189505、美國專利公開號20170173132、美國專利公開號20170296640、美國專利公開號20170253633、美國專利公開號20170260249、美國專利公開號20180051080和美國專利公開號20180164315所述的TAA肽，本文所述的這些專利公開內容和序列表透過引用整體併入本文。
一方面，本文所述的T細胞選擇性地識別呈遞上述一個或多個專利和公開內容中所述TAA肽的細胞。
另一方面，能夠與本文所述的方法和實施方案一起使用的TAA包括選自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：158的至少一種。一方面，T細胞選擇性地識別呈遞SEQ ID NO：1-158或本文所述任何專利或申請中所述TAA肽的細胞。
Figure 109108977-A0202-12-0029-1
Figure 109108977-A0202-12-0030-2
Figure 109108977-A0202-12-0031-3
一方面，能夠與本文所述方法一起使用的T細胞受體包括，例如，美國專利公開號20170267738、美國專利公開號20170312350、美國專利公開號20180051080、美國專利公開號20180164315、美國專利公開號20180161396、美國專利公開號20180162922、美國專利公開號20180273602、美國專利公開號20190002556、美國專利公開號20180135039中所述的T細胞受體，這些專利公開的各項內容透過引用整體併入本文。
透過本文所述方法產生的基因轉導T細胞可改善療效，更特別地，可改善免疫療法(例如，過繼免疫療法)的療效，因為本領域技術人員會理解，透過本文所述方法產生的基因轉導T細胞與從包含小於約50%、小於約45%、小於約40%、小於約35%、小於約30%、小於約25%、小於約20%、小於約15%、小於約10%、小於約9%、小於約8%、小於約7%、小於約6%、小於約5%、小於約4%、小於約3%、小於約2%或小於約1%的CD28+ CD8+ T細胞的確定細胞群產生的T細胞相比，表現出一倍或多倍更高的倍數擴增、更高的CD8：CD4 T細胞比率、更長的端粒長度和/或更高的克隆豐富度。
實施例：
在設計T細胞製造方案時，擴增T細胞以滿足所期望細胞數量的需要和保持最終T細胞產物的增殖可能性之間可能存在平衡。在此模式內，基於初始PBMC細胞群的屬性來預測製造結果可能會有好處。
所觀察到的T細胞表達特徵的異質性提示可能存在選擇性壓力的必要標準。從理論上講，這種壓力可能會限制特定T細胞群的複製潛能。根據對共刺激分子的分析，在起始CD8細胞和整個T細胞擴增方案中可能喪失CD28表達。合理情況是，這將產生兩種類型CD8 T細胞，一種將從既定的CD28共刺激中受益，另一種將不受 益。以下實施例說明了CD28的固有重要性，以及起始CD28表型與多項製造指標之間的相關性。
實施例1
T細胞製造
健康供體全血購自Hemacare，PBMC透過Ficoll梯度分離。將PBMC以1x 106個活PBMC/mL接種於用溶於PBS(Lonza 17-516F)的1ug/mL抗-CD3(eBioscience 16-0037-85)和1μg/mL抗-CD28(eBioscience 16-0289-85)抗體在4攝氏度下包覆過夜的組織培養瓶上，在補充有5%人AB血清(Gemini 100-318)培養基的TexMACS(Miltenyi 130-097-196)中激活16-24小時。次日，分離總細胞並重懸至1x 106個活細胞/ml，並將5ml接種入Grex24孔板(Wilson Wolf 80192M)的孔中。在10ng/ml IL-7(peprotech 200-07)、100ng/ml IL-15(peprotech 200-15)和10μg/ml魚精蛋白硫酸鹽存在下，使細胞經空白(mock)轉導或用TCR慢病毒構建體(由Lentigen生產)轉導。次日，向細胞中加入35ml補充有上述濃度IL-7和IL-15的完全TexMACS。讓細胞再生長2、5或8天，具體時間取決於所需的製造時間(即，總共4天、7天或10天)。製造完成後，進行細胞計數，以5 x 106/ml在Cyrostore10中冷凍，在-80攝氏度下放置16-24小時，然後在LN2氣相下長期保存直至需要使用。
PkH67染色
按照製造商的方案進行PkH67(Sigma PKH67GL)染色，例外情況是，第4天製造的細胞以2X濃度染色以把與第7天或第10天製造的細胞相比細胞大小更大的因素考慮進去。在流式細胞術存活性染料染色之前進行PkH染色。
CDR3測序(Adaptive Biotech)和T細胞受體可變β鏈測序分析
使用immunoSEQ® Assay(Adaptive Biotechnologies,Seattle,WA)法對人TCR β鏈的CDR3區進行免疫測序。在偏差得到控制的多重PCR中擴增提取的基因組DNA，然後進行高通量測序。將序列塌陷並過濾，以鑒定和定量每個獨特TCRβ CDR3區域的絕對豐度，以用於進一步的分析。
流式細胞儀染色和採集
對活細胞進行定量並重懸成為於PBS中的1-2 x 106個活細胞/ml，然後根據製造商的方案用Live-Dead aqua(Thermo Fisher L34957)染色法進行染色。然後用流動緩衝液洗滌細胞，之後以所需的抗體混合物(CD3 PerCp-Cy5.5 Biolegend 300328、Vb8 PE Biolegend 348104、CD45Ro PE-Cy7 Biolegend 304230、CD95 APC-fire750 Biolegend 305638、CD8 BV605 BD 564116、CD27 BV650 Biolegend 302827、CD62L BV785 Biolegend 304830)進行重懸，並在4攝氏度下避光染色15-30分鐘，例外情況是，在剩餘的表面染色之前，CCR7(CCR7 BV41 Biolegend 353208)染色在37攝氏度下在沒有血清的RPMI中進行。然後用流動緩衝液洗滌細胞並重懸於固定緩衝液中，在4攝氏度下保存直至在BD Fortessa或Miltenyi MACSQuant分析儀上採集。
端粒長度測定
根據製造商的說明(Dako/Agilent K5327)測定相對端粒長度。簡言之，將T細胞以1：1的比例與對照1301腫瘤細胞(4N基因組)混合。然後通透細胞，將端粒PNA FITC探針雜交過夜。次日，進行對比碘化丙啶染色以區分完整的細胞，並透過流式細胞術採集細胞。測試細胞的端粒長度計算為與對照1301腫瘤細胞系端粒長度之比。
實施例2
CD8+ T細胞上的CD28表達作為用IL-7和IL-15進行離體T細胞擴增的生物標誌物。
CD8 T細胞中年齡相關的CD28喪失
對於供體之間的選擇性壓力，供體之間可能存在固有異質性。從PBMC中製造T細胞產物依賴於有效激活和擴增抗原特異性溶細胞CD8 T細胞的能力。在此過程中，可能需要用最小劑量追蹤細胞的生長。通常可以基於臨床試驗設計來滿足這種需求。CD28陰性CD8+ T 細胞在血液中累積可能會使從老年PBMC製造T細胞產品變得複雜。
圖1A顯示，根據CD28特徵分析，供體年齡越大，表達CD28的CD8細胞起始百分比就越低，R2相關性為0.7124(透過Graphpad Prism 7中的線性回歸法確定)。這些細胞對同源肽和透過CD3/CD28刺激的增殖潛能可能降低。
與T細胞擴增期間使用IL-2相比，IL-7和IL-15可保留T細胞的幼稚性。因此，IL-7和IL-15可能是用於臨床製造的優選方法。此外，CD28陰性CD8+ T細胞與其CD28陽性對應物相比，可能增殖以回應IL15。為了比較在存在IL-7和IL-15的情況下CD28表達如何影響PBMC衍生T細胞的製造，使用臨床類似方法製造了從6名健康供體中獲得的T細胞。
T細胞擴增期間，CD28起始百分比與最終CD8百分比相關
由於CD8區室中CD28表達可能與年齡相關，因此依賴於CD28表達的其他製造指標也可能存在偏差。T細胞擴增結束時，可測量CD8與CD4細胞的比率(或CD3陽性細胞中CD8陽性細胞的百分比)，這是因為，儘管細胞溶解CD4細胞已被確定，主要還是CD8區室執行腫瘤細胞溶解功能。因此，CD8細胞中的起始CD28表達與細胞的最終百分比之間可能存在相關性。
圖1B顯示，培養第7天(中期擴增)時，CD8+ T細胞區室中CD28表達的起始百分比與CD3陽性細胞中的最終CD8陽性細胞百分比之間存在相關性，R2相關性為0.8121。這些結果表明，CD28表達可作為CD8+ T細胞選擇性壓力的驅動力。
CD28起始百分比與倍數擴增相關
臨床T細胞擴增方案通常測量終產物的倍數擴增，作為瞭解已經發生的細胞群倍增次數。
圖1C顯示，截至第7天(中期擴增)，在擴增方案中，倍數擴增與起始CD28表達水平之間存在明顯的相關性，R2相關性為0.8579。CD8+細胞生長超過CD4+細胞與CD8+ T細胞上CD28表達的起始百分比密切相關。這些結果對製造工藝的開發具有影響，因為這可基於PBMC的起始表型來預測臨床擴增是否會成功。
端粒長度減少與起始CD28表達相關
端粒長度的損失標誌著細胞功能失調，因為這樣它們會高度分化並最終衰老。CD3+CD28刺激後，端粒酶的表達可能僅限於CD4或CD8區室的CD28表達細胞。因此，最終相對端粒長度也可對應於細胞的該CD28表達部分。
圖1D顯示，T細胞產物的最終相對端粒長度可能與起始培養物中CD8+ T細胞上CD28表達水平密切相關，並且PBMC中細胞起始CD28百分比與最終相對端粒長度之間的R2相關性為0.9581。該分析使用來自 多名健康供體和多名非小細胞肺癌患者的PBMC進行。資料表明，可以在培養開始之前預測基於IL-7/IL-15的T細胞製造結果，並且該結果可能對過繼T細胞製造方案的設計產生重要影響。例如，由於注入細胞治療產品的持久性可能與癌症患者的臨床結局相關，因此注入腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)臨床產品的最終端粒長度可能與T細胞克隆的持久性有關。
綜上所述，透過測量起始CD8+ T細胞的CD28表達，可以合理地預測用IL-7和IL-15製造的T細胞產物的最終CD8百分比、倍數擴增和相對端粒長度。請注意，在CD4+ T細胞背景下，可能找不到相同的與CD28表達的相關性，與CD8+ T細胞相比，CD4+ T細胞在衰老過程中可能保持較高水平的CD28表達。
實施例3
CD8+ T細胞上的CD28表達與T細胞克隆的偏差增殖有關
起始PBMC中CD28表達增加為T細胞製造過程中帶來有利的生長動力學
為了分析T細胞擴增過程中克隆細胞群擴增的特徵，在製造過程中透過克隆DNA測序和每個克隆細胞群內的絕對數目來追蹤單個T細胞克隆的擴增動力學。追蹤單個克隆時，分別在擴增過程的早期(第4天)、中期(第7天)和後期(第10天)測量T細胞克隆群內的克隆分裂以及T細胞絕對數量。
例如，為了透過基於CD28低(31.1%)、CD28中(54.3%)或CD28高(93.4%)表達水平的CD8+ T細胞的CDR3 DNA測序來分析克隆T細胞擴增和收縮的動力學特徵，PBMC用激動性CD3/CD28抗體刺激過夜，進行空白轉導，然後在製造過程中第4天、第7天和第10天時的擴增過程中取樣。由於在每個採樣點都進行了細胞計數，並且在每個克隆細胞群內都計算了T細胞的數量，因此可使用以下公式計算克隆分裂次數：克隆倍數擴增=(最終克隆數/起始克隆數)
每克隆的估計分裂數=Log2(克隆倍數擴增)。
除了定量某些CD8+ T細胞群的擴增之外，還可能定量克隆細胞群的收縮，這使用基於增殖染料的技術不可能實現。
圖2顯示，起始PBMC中CD28高(93.4%)具有早期生長優勢，近三分之二(63.41%)的T細胞克隆物在製造的激活步驟(第2天)至第4天之間擴增。相反，CD28表達較低的起始細胞群表現出大多數T細胞克隆物在此製造早期階段收縮的動力學，其中CD28中(54.3%)和CD28低(31.1%)細胞群分別包含23.74%和1.19%的早期擴增克隆物。也就是說，在早期擴增階段，分別有76.26%和98.81%的CD28中和CD28低表達樣本收縮。這與這兩個細胞群在此階段的負值倍數擴增相符，而CD28高樣本顯示出正值倍數擴增。因此，透過在克隆水平上分析T細胞製造的特徵發現，擴增過程早期 T細胞克隆物可能顯著收縮，這可能與表達CD28的CD8+ T細胞的起始百分比呈負相關。
克隆物的收縮和擴增與起始CD28百分比相關
從單一培養物，追蹤各個T細胞克隆頻率，並與激活後(第2天)時間點進行比較。透過該比較，評估了頻率顯著上升和下降的克隆物，總和為差異豐富的百分比。
圖3顯示差異豐富的百分比與起始CD28百分比之間密切相關(R2=0.9726)。起始樣本中CD28數量越少，變成差異豐富的克隆物百分比就越高。這表明，在某一細胞群中缺乏CD28會為其他克隆的長入創造生態利基，而缺乏CD28會帶來可能在T細胞擴增延長方案期間死亡的細胞群。
CD28表達較低的供體顯示T細胞擴增延遲以及克隆分裂中位值為負數
如果T細胞培養中存在CD28瓶頸，則基於表達CD28的細胞起始百分比，預期T細胞群擴增會延遲。同樣，如果所有的T細胞克隆都能立即擴增，則在擴增方案早期每個克隆物的分裂數預期就會為正數。
圖4顯示，對於CD28低和中等表達的培養物(例如：CD28中和CD28低)，在激活後(第2天)和擴增第4天之間存在負細胞群增長，這表明，兩個時間點之間的細胞數量有收縮並符合瓶頸事件的定義。另外，僅對於CD28高表達的培養物(例如：CD28高)，觀察到 總體正值克隆分裂，表明在該培養物中高百分比的T細胞克隆能立即分裂。
圖5顯示，追蹤克隆細胞群的分裂時，CD28低樣本在擴增結束時顯示出非正態分佈的分裂模式，而CD28中和CD28高細胞群顯示出較為正態分佈的特徵，即，在整個製造過程中克隆分裂呈正態分佈，如相似的平均和中位克隆分裂所示。
與收縮增加和早期擴增減少一致的是，CD28低細胞群可能需要更多次的克隆分裂來達到培養中既定的擴增水平。也就是說，起始CD28表達越低，達到相同數目的T細胞可能需要進行更多次的分裂。
圖6顯示，CD28低細胞群需要1.96次克隆分裂才能達到1 x 108個細胞的擴增，而對於相同數目的細胞，CD28中細胞群需要1.64次克隆分裂，CD28高細胞群僅分裂0.96次。
總而言之，該資料顯示，高CD28起始細胞群可能進行更有利的T細胞擴增，且特徵為T細胞收縮減少和必需的T細胞分裂次數減少。
這些結果表明，T細胞群的CD28表達越高，早期T細胞克隆擴增的可能性就越大。另外，每個限定數目的細胞中T細胞分裂次數減少，這表明CD28表達增加可保留T細胞增殖潛能。
為了確定某些克隆細胞群的早期擴增是否可以在整個擴增過程中得以維持，對發生正值或負值早期擴增(第 2天至第4天)的T細胞克隆物(例如：CD28高、CD28中和CD28低)之間的平均最終克隆分裂次數進行計算。
圖7顯示，在所有T細胞群中，無論CD28表達如何，在擴增過程(第2天至第4天)結束時，早期擴增的克隆物在統計學上來說更可能分裂。
CD28表達較低的供體中擴增期間透過DNA克隆測序法測得獨特的T細胞克隆物減少
在製造激活階段，可能發生激活誘導的細胞死亡(AICD)，並且與較老的效應子樣細胞相比，年輕、更幼稚樣的T細胞增殖潛能可能更高。因此，這些因素可能導致T細胞製造存在瓶頸，例如，從總細胞群中除去T細胞克隆細胞群而讓其他細胞群保留在最終產物中。為了研究AICD對T細胞產物的影響，將整個製造過程中的克隆多樣性(或豐富度)確定為衡量獨特T細胞克隆細胞群相對數量的指標。
追蹤整個培養物中獨特T細胞克隆物數量，如果存在瓶頸，則瓶頸事件後獨特T細胞克隆的數量預期會有大的波動。克隆豐富度可為用於計算標準化為測序後DNA分子數量讀數的獨特T細胞克隆數量的測量。
圖8顯示，對於所有的T細胞群，無論CD28表達如何，從激活後(第2天)到早期擴增(第4天)的克隆豐富度(或克隆多樣性)有增加，這可能代表對以前無法檢測到的、低頻克隆的擴增。請注意，在擴增過程這一早期階段可實現最大的克隆多樣性，這是可能與對檢 查點療法和化療的臨床反應有所改善有關的指標。在此早期爆發後，CD28低和CD28中表達細胞群的克隆多樣性顯著下降，這表示製造過程中無法存活的獨特T細胞克隆物發生了收縮。這種早期和晚期擴增時間點之間(第4天至第10天)克隆多樣性下降表明，隨著擴增繼續，存在大量的克隆消除。相比之下，CD28高細胞群在整個製造過程中保持著相似水平的克隆。這些結果表明，起始PBMC培養物中的CD28表達水平可能與CD8+ T細胞區室的不同擴增動力學密切相關。這些結果可能影響T細胞產物的療效，因為缺乏克隆多樣性與瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)的4年生存期差有關。T細胞持久性可促進T細胞產物的療效。非同源TCR-pMHC較弱的相互作用可促進T細胞的穩態增殖和持久性。因此，最終T細胞產物(例如，使用CD28較低表達的起始T細胞製備的產物)中缺乏克隆多樣性的缺點可能包括：因遇到自我維持非同源TCR-pMHC生存信號的可能性降低而導致T細胞穩態增殖減少。
實施例4
用CD28共刺激製造時，較年輕患者對CD19CAR療法的反應改善
為了進一步探索所提出離體T細胞擴增瓶頸的重要性，進行了一項臨床試驗薈萃分析，以研究老年患者中CD28表達喪失是否會出現臨床趨勢。根據之前的資料， 基於T細胞製造(CD3單用或與CD28聯合使用)，老年患者的表現與年輕患者不同。
已有40項T細胞療法的臨床試驗發表。其中很多是用未經證實的部分(例如，未檢測的新TCR或CAR分子)進行的早期試驗。薈萃分析需要篩選步驟來創建統一的可比較資料集。經篩選和彙編後，分析了針對CD19惡性腫瘤的7項臨床試驗，共計107個患者資料點。此分析顯示，與單用CD3(44.44%)相比，使用CD3+CD28方法製造細胞時，45歲以下的患者臨床預後更好(66.67%)。相比之下，當患者年齡超過45歲時，單用CD3(71.43%)而不是使用CD3+CD28方法(30.00%)進行製造會帶來利益(表1)。
表1
Figure 109108977-A0202-12-0044-4
表1：CD28共刺激的不同作用。資料來自4項CD19 CAR試驗的薈萃分析，共計47個數據點。在製造中給予CD28共刺激時，45歲以下患者的表現優於45歲以上的患者，而當不給予CD28共刺激時後者表現更好。也就是說，45歲以下的患者可能受益於T細胞製 造的CD3+CD28方法，而45歲以上的患者可能受益於T細胞製造的單用CD3方法。CR=完全緩解，PR=部分緩解，SD=疾病穩定，NR/PD=無緩解/疾病進展，NE=無法評估。每次臨床反應都根據原始臨床試驗分析來定義。
可用臨床試驗資料的本次薈萃分析顯示，較年輕患者(例如，45歲以下)似乎對涉及CD28共刺激的T細胞製造反應更好，而較老患者(例如，45歲以上)似乎對缺乏CD28共刺激的T細胞製造反應更好。
多發性骨髓瘤臨床試驗中，臨床反應率與離體倍數增長相關
多項臨床和臨床前研究表明，與較老的較高分化T細胞產物相比，表型上更年輕的較低分化T細胞表現優異。基於製造資料(圖1和2)，CD28高表達(較年輕的)起始PBMC可達到更高的離體倍數擴增，並產生表型上較低分化的最終產物。因此，可以透過在同一時期使用更年輕、較低分化的起始PBMC來製造T細胞並對其進行培養以實現更高的倍數擴增，從而獲得較低分化的、效力更強的臨床產品。
表2顯示，根據αBCMA多發性骨髓瘤CAR臨床試驗，當細胞培養物達到大於10倍的離體擴增時，反應率為57%。相比之下，當培養物未達到10倍擴增時，反應率為0%。這些觀察結果為翻譯相關性和製造中心模型在預測T細胞效力方面提供了進一步的支持。
表2
Figure 109108977-A0202-12-0046-5
表2：離體製造指標與多發性骨髓瘤的臨床反應相關·來自臨床製造的資料與臨床反應率合併，並按照製造過程中達到的CD3+細胞倍數擴增進行分類。反應率計算為相對於該組患者總人數達到PR或CR的患者人數。PR=部分緩解，SD=疾病穩定，CR=完全緩解。
本公開的優點可能包括：透過測量起始CD8+ T細胞的CD28表達來預測T細胞產物的最終CD8百分 比、倍數擴增和相對端粒長度，以及基於CD28+ CD8+ T細胞群中CD28表達的起始百分比的個性化療法。另外，本公開的製造可透過可變的製造週期、起始細胞數量、刺激條件和不同的生長培養基實現個性化。這可改善體外製造指標(例如，倍數擴增)，且可能與更好的臨床結果相關。本公開的細胞療法製造可能具有高度的患者特異性，特定組基於彼等之起始細胞表型，對製造的反應可能更好或更差。
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<400> 18
Figure 109108977-A0202-12-0051-32
<210> 19
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 19
Figure 109108977-A0202-12-0051-33
<210> 20
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 20
Figure 109108977-A0202-12-0052-34
<210> 21
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 21
Figure 109108977-A0202-12-0052-35
<210> 22
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 22
Figure 109108977-A0202-12-0052-36
<210> 23
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 23
Figure 109108977-A0202-12-0052-39
<210> 24
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 24
Figure 109108977-A0202-12-0052-37
<210> 25
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 25
Figure 109108977-A0202-12-0052-40
<210> 26
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 26
Figure 109108977-A0202-12-0053-41
<210> 27
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 27
Figure 109108977-A0202-12-0053-42
<210> 28
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 28
Figure 109108977-A0202-12-0053-45
<210> 29
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 29
Figure 109108977-A0202-12-0053-43
<210> 30
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 30
Figure 109108977-A0202-12-0053-44
<210> 31
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 31
Figure 109108977-A0202-12-0054-46
<210> 32
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 32
Figure 109108977-A0202-12-0054-47
<210> 33
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 33
Figure 109108977-A0202-12-0054-48
<210> 34
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 34
Figure 109108977-A0202-12-0054-49
<210> 35
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 35
Figure 109108977-A0202-12-0054-50
<210> 36
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 36
Figure 109108977-A0202-12-0055-51
<210> 37
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 37
Figure 109108977-A0202-12-0055-52
<210> 38
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 38
Figure 109108977-A0202-12-0055-53
<210> 39
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 39
Figure 109108977-A0202-12-0055-54
<210> 40
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 40
Figure 109108977-A0202-12-0055-55
<210> 41
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 41
Figure 109108977-A0202-12-0056-56
<210> 42
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 42
Figure 109108977-A0202-12-0056-57
<210> 43
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 43
Figure 109108977-A0202-12-0056-58
<210> 44
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 44
Figure 109108977-A0202-12-0056-59
<210> 45
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 45
Figure 109108977-A0202-12-0056-60
<210> 46
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 46
Figure 109108977-A0202-12-0057-61
<210> 47
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 47
Figure 109108977-A0202-12-0057-62
<210> 48
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 48
Figure 109108977-A0202-12-0057-63
<210> 49
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 49
Figure 109108977-A0202-12-0057-64
<210> 50
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 50
Figure 109108977-A0202-12-0057-65
<210> 51
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 51
Figure 109108977-A0202-12-0057-66
Figure 109108977-A0202-12-0058-67
<210> 52
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 52
Figure 109108977-A0202-12-0058-68
<210> 53
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 53
Figure 109108977-A0202-12-0058-69
<210> 54
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 54
Figure 109108977-A0202-12-0058-70
<210> 55
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 55
Figure 109108977-A0202-12-0058-71
<210> 56
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 56
Figure 109108977-A0202-12-0058-72
<210> 57
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 57
Figure 109108977-A0202-12-0059-73
<210> 58
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 58
Figure 109108977-A0202-12-0059-74
<210> 59
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 59
Figure 109108977-A0202-12-0059-75
<210> 60
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 60
Figure 109108977-A0202-12-0059-76
<210> 61
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 61
Figure 109108977-A0202-12-0059-77
<210> 62
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 62
Figure 109108977-A0202-12-0060-78
<210> 63
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 63
Figure 109108977-A0202-12-0060-79
<210> 64
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 64
Figure 109108977-A0202-12-0060-80
<210> 65
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 65
Figure 109108977-A0202-12-0060-81
<210> 66
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 66
Figure 109108977-A0202-12-0060-82
<210> 67
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 67
Figure 109108977-A0202-12-0061-83
<210> 68
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 68
Figure 109108977-A0202-12-0061-84
<210> 69
<211> 13
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 69
Figure 109108977-A0202-12-0061-85
<210> 70
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 70
Figure 109108977-A0202-12-0061-86
<210> 71
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 71
Figure 109108977-A0202-12-0061-87
<210> 72
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 72
Figure 109108977-A0202-12-0062-88
<210> 73
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 73
Figure 109108977-A0202-12-0062-89
<210> 74
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 74
Figure 109108977-A0202-12-0062-90
<210> 75
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 75
Figure 109108977-A0202-12-0062-92
<210> 76
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 76
Figure 109108977-A0202-12-0062-93
<210> 77
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 77
Figure 109108977-A0202-12-0063-94
<210> 78
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 78
Figure 109108977-A0202-12-0063-95
<210> 79
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 79
Figure 109108977-A0202-12-0063-96
<210> 80
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 80
Figure 109108977-A0202-12-0063-98
<210> 81
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 81
Figure 109108977-A0202-12-0063-97
<210> 82
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 82
Figure 109108977-A0202-12-0063-99
<210> 83
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 83
Figure 109108977-A0202-12-0064-100
<210> 84
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 84
Figure 109108977-A0202-12-0064-101
<210> 85
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 85
Figure 109108977-A0202-12-0064-103
<210> 86
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 86
Figure 109108977-A0202-12-0064-102
<210> 87
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 87
Figure 109108977-A0202-12-0064-104
<210> 88
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 88
Figure 109108977-A0202-12-0065-105
<210> 89
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 89
Figure 109108977-A0202-12-0065-106
<210> 90
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 90
Figure 109108977-A0202-12-0065-107
<210> 91
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 91
Figure 109108977-A0202-12-0065-109
<210> 92
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 92
Figure 109108977-A0202-12-0065-108
<210> 93
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 93
Figure 109108977-A0202-12-0066-110
<210> 94
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 94
Figure 109108977-A0202-12-0066-111
<210> 95
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sgpiens
<400> 95
Figure 109108977-A0202-12-0066-112
<210> 96
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 96
Figure 109108977-A0202-12-0066-113
<210> 97
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 97
Figure 109108977-A0202-12-0066-114
<210> 98
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 98
Figure 109108977-A0202-12-0067-115
<210> 99
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 99
Figure 109108977-A0202-12-0067-116
<210> 100
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 100
Figure 109108977-A0202-12-0067-117
<210> 101
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 101
Figure 109108977-A0202-12-0067-119
<210> 102
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 102
Figure 109108977-A0202-12-0067-118
<210> 103
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 103
Figure 109108977-A0202-12-0068-120
<210> 104
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 104
Figure 109108977-A0202-12-0068-121
<210> 105
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 105
Figure 109108977-A0202-12-0068-122
<210> 106
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 106
Figure 109108977-A0202-12-0068-123
<210> 107
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 107
Figure 109108977-A0202-12-0068-124
<210> 108
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 108
Figure 109108977-A0202-12-0068-125
Figure 109108977-A0202-12-0069-126
<210> 109
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 109
Figure 109108977-A0202-12-0069-127
<210> 110
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 110
Figure 109108977-A0202-12-0069-128
<210> 111
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 111
Figure 109108977-A0202-12-0069-129
<210> 112
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 112
Figure 109108977-A0202-12-0069-130
<210> 113
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 113
Figure 109108977-A0202-12-0069-131
<210> 114
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 114
Figure 109108977-A0202-12-0070-132
<210> 115
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 115
Figure 109108977-A0202-12-0070-133
<210> 116
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 116
Figure 109108977-A0202-12-0070-134
<210> 117
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 117
Figure 109108977-A0202-12-0070-135
<210> 118
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 118
Figure 109108977-A0202-12-0070-136
<210> 119
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 119
Figure 109108977-A0202-12-0071-137
<210> 120
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 120
Figure 109108977-A0202-12-0071-138
<210> 121
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 121
Figure 109108977-A0202-12-0071-139
<210> 122
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 122
Figure 109108977-A0202-12-0071-140
<210> 123
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 123
Figure 109108977-A0202-12-0071-141
<210> 124
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 124
Figure 109108977-A0202-12-0072-142
<210> 125
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 125
Figure 109108977-A0202-12-0072-143
<210> 126
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 126
Figure 109108977-A0202-12-0072-144
<210> 127
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 127
Figure 109108977-A0202-12-0072-145
<210> 128
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 128
Figure 109108977-A0202-12-0072-146
<210> 129
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 129
Figure 109108977-A0202-12-0073-147
<210> 130
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 130
Figure 109108977-A0202-12-0073-148
<210> 131
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 131
Figure 109108977-A0202-12-0073-149
<210> 132
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 132
Figure 109108977-A0202-12-0073-150
<210> 133
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 133
Figure 109108977-A0202-12-0073-151
<210> 134
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 134
Figure 109108977-A0202-12-0074-152
<210> 135
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 135
Figure 109108977-A0202-12-0074-153
<210> 136
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 136
Figure 109108977-A0202-12-0074-154
<210> 137
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 137
Figure 109108977-A0202-12-0074-155
<210> 138
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 138
Figure 109108977-A0202-12-0074-156
<210> 139
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 139
Figure 109108977-A0202-12-0074-157
<210> 140
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 140
Figure 109108977-A0202-12-0075-158
<210> 141
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 141
Figure 109108977-A0202-12-0075-159
<210> 142
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 142
Figure 109108977-A0202-12-0075-160
<210> 143
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 143
Figure 109108977-A0202-12-0075-161
<210> 144
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 144
Figure 109108977-A0202-12-0075-162
<210> 145
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 145
Figure 109108977-A0202-12-0076-163
<210> 146
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 146
Figure 109108977-A0202-12-0076-164
<210> 147
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 147
Figure 109108977-A0202-12-0076-165
<210> 148
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 148
Figure 109108977-A0202-12-0076-167
<210> 149
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 149
Figure 109108977-A0202-12-0076-166
<210> 150
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 150
Figure 109108977-A0202-12-0077-168
<210> 151
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 151
Figure 109108977-A0202-12-0077-169
<210> 152
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 152
Figure 109108977-A0202-12-0077-170
<210> 153
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 153
Figure 109108977-A0202-12-0077-171
<210> 154
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 154
Figure 109108977-A0202-12-0077-172
<210> 155
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 155
Figure 109108977-A0202-12-0078-173
<210> 156
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 156
Figure 109108977-A0202-12-0078-174
<210> 157
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 157
Figure 109108977-A0202-12-0078-175
<210> 158
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 158
Figure 109108977-A0202-12-0078-176

Claims (47)

  1. 一種治療癌症患者的方法，其包括
    從患者中獲得CD8+ T細胞群，
    確定所獲得細胞群中CD28+ CD8+ T細胞的百分比，
    用抗CD3抗體和抗CD28抗體激活確定的細胞群(前提是確定的細胞群包含至少約50%的CD28+ CD8+ T細胞)，或
    在沒有抗CD28抗體的情況下用抗CD3抗體激活確定的細胞群(前提是確定的細胞群包含少於約50%的CD28+ CD8+ T細胞)，
    用病毒載體轉導激活的T細胞群，
    擴增轉導的T細胞群，以及
    給予患者擴增的T細胞群，
    其中所述癌症選自肝細胞癌(HCC)、結直腸癌(CRC)、膠質母細胞瘤(GB)、胃癌(GC)、食道癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、胰腺癌(PC)、腎細胞癌(RCC)、良性攝護腺增生(BPH)、攝護腺癌(PCA)、卵巢癌(OC)、黑色素瘤、乳腺癌、慢性淋巴細胞白血病(CLL)、梅克爾細胞癌(MCC)、小細胞肺癌(SCLC)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性骨髓性白血病(AML)、膽囊癌和膽管癌(GBC、CCC)、膀胱癌(UBC)、急性淋 巴細胞白血病(ALL)、多發性骨髓瘤(MM)和子宮癌(UEC)組成的組。
  2. 權利要求1的方法，其中，確定的細胞群用抗CD3抗體和抗CD28抗體激活，但前提是，確定的細胞群包含至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%的CD28+ CD8+ T細胞。
  3. 權利要求1的方法，其中，確定的細胞群在不存在抗CD28抗體的情況下，用抗CD3抗體激活，但前提是，確定的細胞群包含小於約45%、小於約40%、小於約35%、小於約30%、小於約25%、小於約20%、小於約15%、小於約10%、小於約9%、小於約8%、小於約7%、小於約6%、小於約5%、小於約4%、小於約3%、小於約2%或小於約1%的CD28+ CD8+ T細胞。
  4. 權利要求1至3中任一項所述的方法，其中病毒載體是表達T細胞受體(TCR)的逆轉錄病毒載體。
  5. 權利要求1至3中任一項所述的方法，其中病毒載體是表達TCR的慢病毒載體。
  6. 權利要求4至5中任一項所述的方法，其中TCR與主要組織相容性複合物(MHC)分子複合的肽相結合，其中所述肽包含選自由SEQ ID NO：1-158組成組的氨基酸序列。
    【請求項6】權利要求1至3中任一項所述的方法，其中病毒載體為表達嵌合抗原受體(CAR)的逆轉錄病毒載體或慢病毒載體。
  7. 權利要求6的方法，其中CAR為CD19 CAR。
  8. 一種治療癌症患者的方法，其包括
    從患者中獲得CD8+ T細胞群，
    確定所獲得細胞群中CD28+ CD8+ T細胞的百分比，
    用抗CD3抗體和抗CD28抗體激活確定的細胞群(前提是確定的細胞群包含至少約50%的CD28+ CD8+ T細胞)，或
    在沒有抗CD28抗體的情況下用抗CD3抗體激活 確定的細胞群(前提是確定的細胞群包含少於約50%的CD28+ CD8+ T細胞)，
    用病毒載體轉導激活的T細胞群，
    擴增轉導的T細胞群，
    確定擴增T細胞群的倍數擴增，
    給予患者擴增的T細胞群(前提是，倍數擴增大於10倍)，
    其中所述癌症選自肝細胞癌(HCC)、結直腸癌(CRC)、膠質母細胞瘤(GB)、胃癌(GC)、食道癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、胰腺癌(PC)、腎細胞癌(RCC)、良性攝護腺增生(BPH)、攝護腺癌(PCA)、卵巢癌(OC)、黑色素瘤、乳腺癌、慢性淋巴細胞白血病(CLL)、梅克爾細胞癌(MCC)、小細胞肺癌(SCLC)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性骨髓性白血病(AML)、膽囊癌和膽管癌(GBC、CCC)、膀胱癌(UBC)、急性淋巴細胞白血病(ALL)、多發性骨髓瘤(MM)和子宮癌(UEC)組成的組。
  9. 權利要求8所述的方法，其中倍數擴增為約10至約50。
  10. 一種用於產生改善過繼免疫療法療效的T 細胞的方法，包括：
    從患者或供體中獲得CD8+ T細胞群，
    確定所獲得細胞群中CD28+ CD8+ T細胞的百分比，和
    用抗CD3抗體和抗CD28抗體激活確定的細胞群(前提是確定的細胞群包含至少約50%的CD28+ CD8+ T細胞)，或
    在沒有抗CD28抗體的情況下用抗CD3抗體激活確定的細胞群(前提是確定的細胞群包含少於約50%的CD28+ CD8+ T細胞)。
  11. 權利要求10的方法，其中，確定的細胞群用抗CD3抗體和抗CD28抗體激活，但前提是，確定的細胞群包含至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%的CD28+ CD8+ T細胞。
  12. 權利要求10的方法，其中，確定的細胞群在不存在抗CD28抗體的情況下，用抗CD3抗體激活，但前提是，確定的細胞群包含小於約45%、小於約40%、小於約35%、小於約30%、小於約25%、小 於約20%、小於約15%、小於約10%、小於約9%、小於約8%、小於約7%、小於約6%、小於約5%、小於約4%、小於約3%、小於約2%或小於約1%的CD28+ CD8+ T細胞。
  13. 權利要求10至12中任一項所述的方法，還包括用病毒載體轉導激活的T細胞群以及擴增轉導的T細胞群。
  14. 權利要求13所述的方法，其中，所述轉導和擴增在存在至少一種細胞因數的情況下進行。
  15. 權利要求14所述的方法，其中，至少一種細胞因數選自白介素(IL)-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15和IL-21。
  16. 權利要求14或15所述的方法，其中，所述至少一種細胞因數包括IL-7和IL-15。
  17. 權利要求15或16所述的方法，其中IL-7的濃度為約1ng/ml至90ng/ml、約1ng/ml至80ng/ml、約1ng/ml至70ng/ml、約1ng/ml至60ng/ml、約1ng/ml至50ng/ml、約1ng/ml至40ng/ml、約1ng/ml至30ng/ml、約1ng/ml 至20ng/ml、約1ng/ml至15ng/ml、約1ng/ml至10ng/ml、約2ng/ml至10ng/ml、約4ng/ml至10ng/ml、約6ng/ml至10ng/ml或約5ng/ml至10ng/ml。
  18. 權利要求15至17中任一項所述的方法，其中IL-15的濃度為約5ng/ml至500ng/ml、約5ng/ml至400ng/ml、約5ng/ml至300ng/ml、約5ng/ml至200ng/ml、約5ng/ml至150ng/ml、約5ng/ml至100ng/ml、約10ng/ml至100ng/ml、約20ng/ml至100ng/ml、約30ng/ml至100ng/ml、約40ng/ml至100ng/ml、約50ng/ml至100ng/ml、約60ng/ml至100ng/ml、約70ng/ml至100ng/ml、約80ng/ml至100ng/ml、約90ng/ml至100ng/ml、約10ng/ml至50ng/ml、約20ng/ml至50ng/ml、約30ng/ml至50ng/ml或約40ng/ml至50ng/ml。
  19. 權利要求13至18中任一項所述的方法，其中轉導在約1小時至120小時、約1小時至108小時、約1小時至96小時、約1小時至72小時、約1小時至48小時、約1小時至36小時、約1小時至24小時、約2小時至24小時、約4小時至24小時、約6小時至24小時、約8小時至24小時、 約10小時至24小時、約12小時至24小時、約14小時至24小時、約16小時至24小時、約18小時至24小時、約20小時至24小時或約22小時至24小時的時間段內進行。
  20. 權利要求13至19中任一項所述的方法，其中病毒載體是表達T細胞受體(TCR)的逆轉錄病毒載體。
  21. 權利要求13至20中任一項所述的方法，其中病毒載體是表達TCR的慢病毒載體。
  22. 權利要求13至21中任一項所述的方法，其中所述擴增在約1天至約30天、約1天至約25天、約1天至約20天、約1天至約15天、約1天至約10天、約2天至約10天、約3天至約10天、約4天至約10天、約5天至約10天、約6天至約10天、約7天至約10天、約8天至約10天或約9天至約10天的時間段內進行。
  23. 權利要求10至22中任一項所述的方法，其中，激活包括用抗CD3抗體和/或抗CD28抗體將T細胞固定於固相支撐物上。
  24. 權利要求10至23中任一項所述的方法，其中，抗CD3抗體和抗CD28抗體各自的濃度為約0.1μg/ml至約10.0μg/ml、約0.1μg/ml至約8.0μg/ml、約0.1μg/ml至約6.0μg/ml、約0.1μg/ml至約4.0μg/ml、約0.1μg/ml至約2.0μg/ml、約0.1μg/ml至約1.0μg/ml、約0.1μg/ml至約0.8μg/ml、約0.1μg/ml至約0.6μg/ml、約0.1μg/ml至約0.5μg/ml、約0.1μg/ml至約0.25μg/ml、約0.2μg/ml至約0.5μg/ml、約0.2μg/ml至約0.3μg/ml、約0.3μg/ml至約0.5μg/ml、約0.3μg/ml至約0.4μg/ml或約0.4μg/ml至約0.5μg/ml。
  25. 權利要求10至24中任一項所述的方法，其中，激活在約1小時至約120小時、約1小時至約108小時、約1小時至約96小時、約1小時至約84小時、約1小時至約72小時、約1小時至約60小時、約1小時至約48小時、約1小時至約36小時、約1小時至約24小時、約2小時至約24小時、約4小時至約24小時、約6小時至約24小時、約8小時至約24小時、約10小時至約24小時、約12小時至約24小時、約12小時至約72小時、約24小時至約72小時、約6小時至約48小時、約24小時至約48小時、約6小時至約72小時或 約1小時至約12小時的時間段內進行。
  26. 一種用於產生改善過繼免疫療法療效的T細胞的方法，包括：
    從患者或供體中獲得CD8+ T細胞群，和
    從所獲得細胞群中分離CD28+ CD8+ T細胞，
    其中，分離的細胞包含至少50%的CD28+ CD8+ T細胞，
    用抗CD3抗體和抗CD28抗體激活分離的細胞。
  27. 權利要求26的方法，其中，分離的細胞包含至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%的CD28+ CD8+ T細胞。
  28. 權利要求26或27所述的方法，還包括用病毒載體轉導激活的T細胞群以及擴增轉導的T細胞群。
  29. 權利要求28所述的方法，其中，所述轉導和擴增在存在至少一種細胞因數的情況下進行。
  30. 權利要求29所述的方法，其中，至少一種細胞因數選自白介素(IL)-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15和IL-21。
  31. 權利要求29或30所述的方法，其中，所述至少一種細胞因數包括IL-7和IL-15。
  32. 權利要求30或31所述的方法，其中IL-7的濃度為約1ng/ml至90ng/ml、約1ng/ml至80ng/ml、約1ng/ml至70ng/ml、約1ng/ml至60ng/ml、約1ng/ml至50ng/ml、約1ng/ml至40ng/ml、約1ng/ml至30ng/ml、約1ng/ml至20ng/ml、約1ng/ml至15ng/ml、約1ng/ml至10ng/ml、約2ng/ml至10ng/ml、約4ng/ml至10ng/ml、約6ng/ml至10ng/ml或約5ng/ml至10ng/ml。
  33. 權利要求30至32中任一項所述的方法，其中IL-15的濃度為約5ng/ml至500ng/ml、約5ng/ml至400ng/ml、約5ng/ml至300ng/ml、約5ng/ml至200ng/ml、約5ng/ml至150ng/ml、約5ng/ml至100ng/ml、約10ng/ml至100ng/ml、約20ng/ml至100ng/ml、約30ng/ml至100ng/ml、約40ng/ml至100ng/ml、約50 ng/ml至100ng/ml、約60ng/ml至100ng/ml、約70ng/ml至100ng/ml、約80ng/ml至100ng/ml、約90ng/ml至100ng/ml、約10ng/ml至50ng/ml、約20ng/ml至50ng/ml、約30ng/ml至50ng/ml或約40ng/ml至50ng/ml。
  34. 權利要求28至33中任一項所述的方法，其中轉導在約1小時至120小時、約1小時至108小時、約1小時至96小時、約1小時至72小時、約1小時至48小時、約1小時至36小時、約1小時至24小時、約2小時至24小時、約4小時至24小時、約6小時至24小時、約8小時至24小時、約10小時至24小時、約12小時至24小時、約14小時至24小時、約16小時至24小時、約18小時至24小時、約20小時至24小時或約22小時至24小時的時間段內進行。
  35. 權利要求28至34中任一項所述的方法，其中病毒載體是表達T細胞受體(TCR)的逆轉錄病毒載體。
  36. 權利要求28至35中任一項所述的方法，其中病毒載體是表達TCR的慢病毒載體。
  37. 權利要求28至36中任一項所述的方法，其中所述擴增在約1天至約30天、約1天至約25天、約1天至約20天、約1天至約15天、約1天至約10天、約2天至約10天、約3天至約10天、約4天至約10天、約5天至約10天、約6天至約10天、約7天至約10天、約8天至約10天或約9天至約10天的時間段內進行。
  38. 權利要求26至37中任一項所述的方法，其中，激活包括用抗CD3抗體和/或抗CD28抗體將T細胞固定於固相支撐物上。
  39. 權利要求26至38中任一項所述的方法，其中，抗CD3抗體和抗CD28抗體各自的濃度為約0.1μg/ml至約10.0μg/ml、約0.1μg/ml至約8.0μg/ml、約0.1μg/ml至約6.0μg/ml、約0.1μg/ml至約4.0μg/ml、約0.1μg/ml至約2.0μg/ml、約0.1μg/ml至約1.0μg/ml、約0.1μg/ml至約0.8μg/ml、約0.1μg/ml至約0.6μg/ml、約0.1μg/ml至約0.5μg/ml、約0.1μg/ml至約0.25μg/ml、約0.2μg/ml至約0.5μg/ml、約0.2μg/ml至約0.3μg/ml、約0.3μg/ml至約0.5μg/ml、約0.3μg/ml至約0.4μg/ml或約0.4μg/ml至約0.5μg/ml。
  40. 權利要求26至39中任一項所述的方法，其中，激活在約1小時至約120小時、約1小時至約108小時、約1小時至約96小時、約1小時至約84小時、約1小時至約72小時、約1小時至約60小時、約1小時至約48小時、約1小時至約36小時、約1小時至約24小時、約2小時至約24小時、約4小時至約24小時、約6小時至約24小時、約8小時至約24小時、約10小時至約24小時、約12小時至約24小時、約12小時至約72小時、約24小時至約72小時、約6小時至約48小時、約24小時至約48小時、約6小時至約72小時或約1小時至約12小時的時間段內進行。
  41. 一種基因轉導T細胞，其透過權利要求10至40中任一項所述的方法產生。
  42. 一種根據權利要求10至40中任一項所述的方法產生的基因轉導T細胞，其中，從包含至少約50% CD28+ CD8+ T細胞的確定細胞群產生的T細胞與從包含少於約50%的CD28+ CD8+ T細胞的確定細胞群產生的T細胞相比，包含至少約1.2倍、至少約1.5倍、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約3倍、至少約3.5倍、至少約4倍、至少約4.5倍 或至少約5倍更高的倍數擴增。
  43. 一種根據權利要求10至40中任一項所述的方法產生的基因轉導T細胞，其中，從包含至少約50% CD28+ CD8+ T細胞的確定細胞群產生的T細胞與從包含少於約50%的CD28+ CD8+ T細胞的確定細胞群產生的T細胞相比，包含至少約1.2倍、至少約1.5倍、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約3倍、至少約3.5倍、至少約4倍、至少約4.5倍或至少約5倍更高的CD8：CD4 T細胞比率。
  44. 一種根據權利要求10至40中任一項所述的方法產生的基因轉導T細胞，其中，從包含至少約50% CD28+ CD8+ T細胞的確定細胞群產生的T細胞與從包含少於約50%的CD28+ CD8+ T細胞的確定細胞群產生的T細胞相比，包含至少約1.2倍、至少約1.5倍、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約3倍、至少約3.5倍、至少約4倍、至少約4.5倍或至少約5倍更長的端粒長度。
  45. 一種根據權利要求10至40中任一項所述的方法產生的基因轉導T細胞，其中，從包含至少約50% CD28+ CD8+ T細胞的確定細胞群產生的T細胞與從包含少於約50%的CD28+ CD8+ T細胞的 確定細胞群產生的T細胞相比，包含至少約1.2倍、至少約1.5倍、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約3倍、至少約3.5倍、至少約4倍、至少約4.5倍或至少約5倍更高的克隆豐富度。
  46. 一種藥物組合物，其包含權利要求41至45任一項中所述的基因轉導T細胞和藥用載劑。
  47. 一種治療癌症患者的方法，其包含給予患者權利要求46所述的藥物組合物，其中所述癌症選自肝細胞癌(HCC)、結直腸癌(CRC)、膠質母細胞瘤(GB)、胃癌(GC)、食道癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、胰腺癌(PC)、腎細胞癌(RCC)、良性攝護腺增生(BPH)、攝護腺癌(PCA)、卵巢癌(OC)、黑色素瘤、乳腺癌、慢性淋巴細胞白血病(CLL)、梅克爾細胞癌(MCC)、小細胞肺癌(SCLC)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性骨髓性白血病(AML)、膽囊癌和膽管癌(GBC、CCC)、膀胱癌(UBC)、急性淋巴細胞白血病(ALL)、多發性骨髓瘤(MM)和子宮癌(UEC)組成的組。
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