CN107267383A - 培养容器的制造方法和固相化装置 - Google Patents
培养容器的制造方法和固相化装置 Download PDFInfo
- Publication number
- CN107267383A CN107267383A CN201710264731.0A CN201710264731A CN107267383A CN 107267383 A CN107267383 A CN 107267383A CN 201710264731 A CN201710264731 A CN 201710264731A CN 107267383 A CN107267383 A CN 107267383A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- culture vessel
- immobilization
- culture
- drop
- lymphocyte
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 123
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 53
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 67
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 67
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 32
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 claims description 15
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 claims description 15
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 12
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 claims description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 4
- 238000012856 packing Methods 0.000 claims description 4
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 claims description 2
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 claims description 2
- 102000007547 Laminin Human genes 0.000 claims description 2
- 108010085895 Laminin Proteins 0.000 claims description 2
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 claims description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 abstract description 119
- 230000004913 activation Effects 0.000 abstract description 46
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 abstract description 16
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 51
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 30
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 29
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 28
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 22
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 19
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 12
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 11
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 10
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 10
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 9
- 238000001125 extrusion Methods 0.000 description 8
- 229920001684 low density polyethylene Polymers 0.000 description 8
- 239000004702 low-density polyethylene Substances 0.000 description 8
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 8
- 102000017420 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Human genes 0.000 description 6
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 6
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 6
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 6
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 6
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 6
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 4
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 4
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 4
- -1 polyethylene Polymers 0.000 description 4
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 210000004885 white matter Anatomy 0.000 description 4
- 229920001342 Bakelite® Polymers 0.000 description 3
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000004637 bakelite Substances 0.000 description 3
- 238000007667 floating Methods 0.000 description 3
- 238000009434 installation Methods 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 238000012549 training Methods 0.000 description 3
- 101150078806 BCAT2 gene Proteins 0.000 description 2
- 102100026413 Branched-chain-amino-acid aminotransferase, mitochondrial Human genes 0.000 description 2
- 101001017516 Drosophila melanogaster Muscle segmentation homeobox Proteins 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- RCEAADKTGXTDOA-UHFFFAOYSA-N OS(O)(=O)=O.CCCCCCCCCCCC[Na] Chemical compound OS(O)(=O)=O.CCCCCCCCCCCC[Na] RCEAADKTGXTDOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 2
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000004388 gamma ray sterilization Methods 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 2
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 2
- 229920005672 polyolefin resin Polymers 0.000 description 2
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 2
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 2
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 239000003570 air Substances 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 238000009738 saturating Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
- C12M23/24—Gas permeable parts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
- C12M23/02—Form or structure of the vessel
- C12M23/14—Bags
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
- C12M23/20—Material Coatings
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
- C12M25/06—Plates; Walls; Drawers; Multilayer plates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0636—T lymphocytes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
- C12N2501/515—CD3, T-cell receptor complex
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2513/00—3D culture
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
- C12N2533/50—Proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
- C12N2533/50—Proteins
- C12N2533/52—Fibronectin; Laminin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
- C12N2533/50—Proteins
- C12N2533/54—Collagen; Gelatin
Abstract
一种培养容器,其特征在于,为用于培养淋巴细胞的培养容器,包含透气性膜,仅在相对的容器内表面的一个面固相化有抗体,具有固相化面和非固相化面,固相化面中,以10~300ng/cm2的浓度固相化有抗CD3抗体。在该培养容器中封入淋巴细胞和培养液,以使培养容器中的固相化面成为底面的方式配置培养容器,使淋巴细胞活化,然后将培养容器反转,以使培养容器中的非固相化面成为底面的方式配置培养容器,使淋巴细胞扩增。另外,这样的固相化有蛋白质的培养容器通过在培养容器中注入溶解有蛋白质的液滴,并使液滴移动到培养容器的内表面上的一部分或全部来制造。
Description
本申请是申请日为2014年12月16日、申请号为201480057477.1、发明名称为“培养容器、淋巴细胞的培养方法、培养容器的制造方法和固相化装置”的申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及细胞的培养技术,特别涉及用于培养淋巴细胞的培养容器、和淋巴细胞的培养方法、固相化有蛋白质的培养容器的制造方法和固相化装置。
背景技术
近年来,在医药品的生产、基因治疗、再生医疗、免疫疗法等领域中,要求在人工环境下高效地大量培养细胞和组织、微生物等。
这样的状况下,在包含透气性膜的培养袋中封入细胞和培养液,在封闭系统中大量培养细胞。
但是,为了使淋巴细胞增殖,最初需要使淋巴细胞活化。因此,在固相化有抗CD3抗体的基材上使淋巴细胞活化,之后将活化的淋巴细胞封入培养袋进行增殖。
此时,一般如图8所示,为了使淋巴细胞活化而使用在底面固相化有抗CD3抗体的烧瓶,在淋巴细胞被活化后,转移至培养袋中,进行淋巴细胞的培养。这样操作的理由是,由于淋巴细胞具有如下的性质:为了进行增殖,需要抗CD3抗体所致的刺激,另一方面,若持续受到抗CD3抗体所致的刺激,则会变得难以进行增殖。因此,在淋巴细胞活化后,需要在没有固相化有抗CD3抗体的容器中进行培养。
作为用于使淋巴细胞活化的培养容器,例如可举出专利文献1所述的封闭系统细胞培养容器等。该封闭系统细胞培养容器在容器内的整个面上固相化有抗CD3抗体(0048段、0057段),能够高效地使淋巴细胞活化。
另外,如上所述,淋巴细胞的活化一般使用抗CD3抗体来进行。即,在固相化有抗CD3抗体的容器内进行淋巴细胞的活化,然后将活化了的淋巴细胞封入未固相化有抗CD3抗体的培养袋内进行淋巴细胞的增殖。
因此,在活化淋巴细胞之前,在用于活化淋巴细胞的容器内需要固相化(涂布)抗CD3抗体。
作为现有的固相化的方法,一般地说为:在含有抗CD3抗体的溶液中浸渍烧瓶内的底面并将其静置后,除去该溶液,由此进行抗CD3抗体的固相化。
具体地,例如专利文献2中记载了:在烧瓶内的底面均匀地浸渍抗CD3抗体,在冰箱中保存过夜后,去除抗CD3抗体,制备抗体固相化烧瓶(0035~0036段、图1)。
另外,专利文献1中记载了:将溶解有抗CD3抗体的溶解液封入容器的收容部,静置规定时间,由此将抗CD3抗体固相化到容器的膜表面(0015段、图1)。
专利文献1:日本特开2007-175028号公报
专利文献2:日本专利第4399710号公报
发明内容
发明要解决的课题
然而,在仅使用专利文献1中记载的封闭系统细胞培养容器进行淋巴细胞培养的情况下,在淋巴细胞活化后也会持续受到抗CD3抗体所致的刺激,因此淋巴细胞受到过量刺激而使增殖受到抑制。因此,为了大量高效地培养淋巴细胞,期望使用该封闭系统细胞培养容器作为活化专用容器,在另外的培养容器中进行细胞的增殖。
因此,该现有技术在要大量高效地培养淋巴细胞的情况下,存在转移活化了的细胞的繁杂性、产生污染风险的问题。
因此,本发明人等经过广泛深入的研究开发了一种用于培养淋巴细胞的培养容器,其包含透气性膜,仅在相对的容器内表面的一个面固相化有抗CD3抗体,,具有固相化面和非固相化面。而且,以使固相化面成为底面的方式配置培养容器进行淋巴细胞的活化,然后以使非固相化面成为底面的方式配置培养容器进行淋巴细胞的增殖,由此能够成功地在单一的容器内高效地进行淋巴细胞的活化和增殖。
即,本发明的目的在于提供能够通过单一的培养容器高效地进行淋巴细胞的活化和增殖的培养容器、和淋巴细胞的培养方法。
另外,专利文献1、2中记载的现有固相化方法中存在如下的问题:为了使抗体充分地固相化而需要很长的静置时间。
进一步,现有方法中存在如下的问题:由于大部分抗体未吸附到容器内而残留在溶液中,因此必须使用量大于固相化量的抗体。例如如后所述存在如下的问题:在将通过现有方法封入有抗体的容器静置1小时的情况下,吸附到容器内的抗体为10%左右,其余约90%未固相化于容器而被废弃。
在此,抗体等蛋白质不耐热,若在高温条件下使其进行吸附,则其功能丧失,因此是不易固相化于容器的材料。另一方面,期望使用少量蛋白质在短时间内实现必要量的固相化。另外,抗体一般而言是高价的,因此期望降低无端废弃的量。
因此,本发明人等经过广泛深入的研究发现,通过将蛋白质溶液的液滴与气体一起封入到容器内、并使该液滴在容器内表面上移动,由此可将集中在液滴的气液界面的蛋白质分子高效地吸附于容器,从而完成了本发明。
即,本发明的目的在于提供一种培养容器的制造方法,在要将蛋白质固相化于容器内表面时,将蛋白质溶液的液滴与气体一起封入到容器内、并使该液滴在容器内表面上移动,由此将蛋白质高效地固相化于容器。本发明的目的还在于提供用于进行上述方法的固相化装置。
解决课题的方法
为了达成上述目的,本发明的培养容器为用于培养淋巴细胞的培养容器,包含透气性膜,仅在相对的容器内表面的一个面固相化有抗体,具有固相化面和非固相化面,上述固相化面中,以10~300ng/cm2的浓度固相化有抗CD3抗体。
另外,本发明的淋巴细胞的培养方法为使用了上述培养容器的淋巴细胞的培养方法,是具有如下工序的方法:活化工序,在上述培养容器中封入淋巴细胞和培养液,以使上述培养容器中的上述固相化面成为底面的方式配置上述培养容器,使淋巴细胞活化;和增殖工序,将上述培养容器反转,以使上述培养容器中的上述非固相化面成为底面的方式配置上述培养容器,使淋巴细胞扩增。
另外,本发明的培养容器的制造方法为固相化有蛋白质的培养容器的制造方法,是如下的方法:在上述培养容器中注入溶解有上述蛋白质的液滴,使上述液滴移动到上述培养容器的内表面上的一部分或全部。
另外,本发明的固相化装置为将蛋白质固相化于培养容器的内表面的固相化装置,其构成在于具备:装载台,载置溶解有蛋白质的液滴和培养容器;以及驱动单元,移动装载台,使培养容器内的液滴在培养容器的内表面上移动。
发明效果
根据本发明,能够仅通过单一的培养容器在不使用专用的培养装置等的情况下高效地进行淋巴细胞的活化和增殖。因此,能够排除更换的繁杂性、并排除污染的风险,所述更换是用于防止抗体所致的对淋巴细胞的过量刺激的操作。另外,根据本发明,能够提供将蛋白质高效地固相化于容器的培养容器的制造方法、和用于进行该方法的固相化装置。
附图说明
图1为示出本发明的实施方式所涉及的培养容器的图。
图2为示出将本发明的实施方式所涉及的培养容器在使容器内表面贴合的状态下保存时的抗体的移动结果的图表的图。
图3A为示出本发明的实施方式所涉及的培养容器的保存形态的图。
图3B为示出本发明的实施方式所涉及的培养容器的保存形态的图。
图4为示出本发明的第一实施方式所涉及的淋巴细胞的培养方法的图。
图5为示出本发明的第二实施方式所涉及的淋巴细胞的培养方法的图。
图6为示出本发明的实施方式所涉及的培养容器、和淋巴细胞的培养方法的实施例和比较例的示意图。
图7为示出本发明的实施方式所涉及的培养容器、和淋巴细胞的培养方法的实施例和比较例的实验结果的图表的图。
图8为示出现有的淋巴细胞的培养方法的图。
图9为用于说明本发明的实施方式所涉及的培养容器的制造方法中的固相化的原理的图。
图10为示出通过本发明的实施方式所涉及的培养容器的制造方法而得到的抗体固相化培养袋的图。
图11为示出本发明的实施方式所涉及的固相化装置的图(俯视图)。
图12为示出本发明的实施方式所涉及的固相化装置的图(主视图)。
图13为示出利用本发明的实施方式所涉及的固相化装置的固相化的样子的图。
图14为示出本发明的实施方式所涉及的固相化装置中的保持单元的图(主视图和侧视图)。
图15为示出本发明的实施方式所涉及的固相化装置中的保持单元的使用形态的图。
图16为示出本发明的实施方式所涉及的培养容器(抗体固相化培养袋)的制造方法的实施例和比较例的示意图。
图17为示出本发明的实施方式所涉及的培养容器(抗体固相化培养袋)的制造方法的实施例和比较例的实验结果的图表的图。
图18为示出本发明的实施方式所涉及的培养容器(抗体固相化烧瓶)的制造方法的实施例和比较例的示意图。
图19为示出本发明的实施方式所涉及的培养容器(抗体固相化烧瓶)的制造方法的实施例和比较例的实验结果的图表的图。
图20为示出本发明的实施方式所涉及的培养容器(纤连蛋白固相化培养袋)的制造方法的实施例和比较例的示意图。
图21为示出本发明的实施方式所涉及的培养容器(纤连蛋白固相化培养袋)的制造方法的实施例和比较例的实验结果的图表的图。
具体实施方式
以下对本发明的培养容器、和淋巴细胞的培养方法的实施方式详细地进行说明。首先,参照图1对本发明的培养容器的一个实施方式进行说明。该图中示出将培养容器载置于装载台(未图示)后从上方观察的简图、和从侧面观察的简图。
[培养容器]
如图1所示,本发明的实施方式所涉及的培养容器10具有上下相对的容器壁。而且,容器内表面的一面成为固相化有抗体20的固相化面11(图1的容器内的底面)。另外,容器内表面的另一面成为未固相化有抗体20的非固相化面12(图1的容器内的顶面)。此外,培养容器10具备管13,由此进行淋巴细胞和培养液向培养容器10内的封入、和所培养的淋巴细胞和培养液的回收。该图的例中,培养容器10具有1根管13,但也可以具有2根以上。
关于培养容器10,使用具有细胞培养所需要的透气性的膜,并形成为袋状(口袋型)。作为这样的培养容器10的材料,可以适当地使用聚乙烯、聚丙烯等聚烯烃类树脂。
作为固相化于固相化面11的抗体20,优选使用抗CD3抗体。淋巴细胞可以被抗CD3抗体活化并进行增殖。
固相化面11中的抗体20的固相化浓度优选设为10~300ng/cm2,更优选设为10~40ng/cm2。
这是因为,若使抗体20的固相化浓度为10ng/cm2以上,则能够有效地使淋巴细胞活化,然后能够高效地使淋巴细胞增殖。另外是因为,即使使抗体20的固相化浓度大于40ng/cm2,在淋巴细胞的增殖效率方面也没有显著的差异,且过量使用抗体会导致容器成本的增大。
固相化面11中的抗CD3抗体的最密填充浓度为300ng/cm2,若为该浓度范围之内,则能够充分地使淋巴细胞活化,然后高效地使淋巴细胞增殖。另一方面,若抗CD3抗体的固相化浓度超过300ng/cm2,则抗CD3抗体漂浮在培养容器10内的培养液中,有时对淋巴细胞造成过量的刺激,因此不优选。
本实施方式的培养容器10例如可以如下所示地进行制造。
首先,使用塑料挤出成形装置将低密度聚乙烯挤出成形,形成膜。然后,使用脉冲热封机由该膜制造袋状的培养容器10。如图1所示,培养容器10以装有管13的方式进行制造。
然后,将培养容器10载置于装载台,封入规定量的气体,并且接着封入溶解有抗体20的缓冲液。然后,通过摇动培养容器10等方式,使缓冲液的液滴在培养容器10内的底面上移动,使缓冲液中含有的抗体20附着到培养容器10内的底面上。由此,使抗体20仅附着于培养容器10内的底面,形成固相化面11。此时,培养容器10内的顶面以未附着有抗体20的非固相化面12的形式形成。
然后,对本实施方式的培养容器10的保存形态进行说明。
本实施方式的培养容器10优选以使固相化面11与非固相化面12不接触的形态保持而保存。
即,在以使固相化面11与非固相化面12接触的形态下、以1.6kg的载荷、37℃的条件将培养容器10保持2小时的情况下,如图2所示,约2成的抗体20从固相化面11转移至非固相化面12。在淋巴细胞活化后进行增殖时,这样地移动到非固相化面12的抗体20对淋巴细胞造成过量刺激,从而成为使增殖率降低的主要原因。因此,优选尽可能抑制抗体20从固相化面11向非固相化面12的移动。
因此,在保存本实施方式的培养容器10时,优选在培养容器10中封入规定量的气体来保持使固相化面11与非固相化面12不接触的形态。
具体地,所封入的气体的量优选每1cm2的培养容器10内的底面积为0.01~4ml。若使所封入的气体的量为这样的范围,则能够防止固相化面11与非固相化面12接触。
作为所封入的气体,没有特别限定,但优选设为不活泼气体,可以使用空气、氮气等。例如可以利用气体供给装置经由管13将这样的气体注入到培养容器10。
作为本实施方式的培养容器10的具体保存形态,如图3A所示,优选利用具有刚性的外装容器60来保持培养容器10的形状。在使用这样的外装容器60来保存培养容器10时,仅将少量的气体封入到培养容器10中,就能够以不使抗体20转移的方式保存培养容器10。
另外,如图3B所示,也优选用气体使培养容器10成为膨胀状态并利用包装容器70进行保存。这样一来,可以简易地包装多个培养容器10,从而以使抗体20不转移的方式进行保存。
如以上所说明的,本实施方式的培养容器10由透气性膜构成,仅在相对的容器内表面的一个面固相化有抗体20,具有固相化面11和非固相化面12。另外,封入到培养容器10中的淋巴细胞聚集到容器内的底部。
因此,在活化淋巴细胞时,以使固相化面11成为底面的方式使用培养容器10,在淋巴细胞增殖时,以使非固相化面12成为底面的方式使用培养容器10,由此可以防止抗体20对淋巴细胞的过量刺激,可以在单一的容器内高效地进行淋巴细胞的活化和增殖。其结果是,能够排除繁杂的转移、污染的风险。另外,从活化到增殖的工序转变为反转容器的简单操作,因此可以在不使用专用装置等的情况下简便地进行。
另外,通过在本实施方式的培养容器10中封入规定量的气体来保持使固相化面11与非固相化面12不接触的形态,由此能够在不降低过量刺激淋巴细胞的防止效果的情况下保存培养容器10。
此外,现有的淋巴细胞的活化中使用的烧瓶中,仅在底面固相化有抗CD3抗体,由此能够使淋巴细胞活化。然而,烧瓶无法以单一容器用于淋巴细胞活化后的增殖工序。其理由在于,烧瓶存在无法使单位面积的细胞数维持在适当密度的问题。即,为了使淋巴细胞在活化后进行增殖,需要扩大培养面积。若为本实施方式,则例如通过用夹子或辊将培养容器的一部分间隔,并配合着细胞的增殖移动或除去夹子或辊等,由此能够将培养面积扩大,但是由于烧瓶中无法进行这样的操作,因此虽然烧瓶能够用于淋巴细胞的活化,但不适于增殖。
[淋巴细胞的培养方法(第一实施方式)]
然后,参照图4对本发明的淋巴细胞的培养方法的第一实施方式进行说明。如该图所示,本实施方式的淋巴细胞的培养方法具有(1)活化工序、和(2)增殖工序。
(1)活化工序
本实施方式的淋巴细胞的培养方法中的活化工序为如下的工序:在培养容器10中封入淋巴细胞30和培养液40,以使固相化面11成为底面的方式配置培养容器10,使淋巴细胞30活化。
如上所述,固相化面11中固相化有抗体20,作为该抗体20,适合使用抗CD3抗体。
淋巴细胞30的种类没有特别限制,可以将NK细胞、B细胞、T细胞和单核细胞等作为培养对象。
培养液40可以使用淋巴细胞30的培养中一般使用的培养液,例如可以适合地使用添加了白介素-2的培养液等。
该活化工序中,对于培养容器10内的淋巴细胞30而言,其受体分子CD3被固相化在固相化面11上的抗CD3抗体刺激,从而被活化。
(2)增殖工序
本实施方式的淋巴细胞的培养方法中的增殖工序为如下的工序:将培养容器10反转,以使非固相化面12成为底面的方式配置培养容器10,使淋巴细胞30扩增。
通过这样地以使非固相化面12成为底面的方式配置培养容器10,由此能够在培养容器10内的非固相化面12侧培养淋巴细胞30。
由此,能够在不受到来自于固相化在固相化面11上的抗CD3抗体的刺激的情况下使淋巴细胞30增殖。因此,能够防止淋巴细胞30受到来自抗CD3抗体的过量刺激时产生的增殖效率降低。
[淋巴细胞的培养方法(第二实施方式)]
然后,参照图5对本发明的淋巴细胞的培养方法的第二实施方式进行说明。如该图所示,本实施方式的淋巴细胞的培养方法具有(1)活化工序、(2)第一增殖工序、(3)容积扩大工序和(4)第二增殖工序。
即,本实施方式的淋巴细胞的培养方法在增殖工序的过程中具有容积扩大工序,由此,与第一实施方式相比能够进一步提高淋巴细胞的增殖效率。因此,本实施方式中,将增殖工序细分为上述(2)~(4)的3个工序并进行说明。关于其他方面,可以与第一实施方式相同。
(1)活化工序
本实施方式的淋巴细胞的培养方法中的活化工序中,首先使用间隔构件50将培养容器10隔开,由此将其区分为培养部10-1和能够扩大部10-2。
培养部10-1为封入淋巴细胞30和培养液40、并进行淋巴细胞30的活化的室。
能够扩大部10-2为未封入有淋巴细胞30和培养液40的室,作为用于伴随淋巴细胞30的增殖将培养部10-1扩大的空间使用。
淋巴细胞30和培养液40无法通过培养部10-1与能够扩大部10-2之间。
在此,细胞一般具有如下性质:在培养初期若不具有一定以上的细胞密度,则难以进行增殖。因此,优选以使培养部10-1的容积在培养初期小,然后增大的方式进行调整。
另外,图5中示出如下的工序:使用夹子作为间隔构件50隔开培养容器10,然后除去该夹子使培养容器10内的整体成为培养部10-1,但培养容器10的间隔方法并不限定于此。例如,也可以使用辊作为间隔构件50,来使培养部10-1能够连续地变更,也能够将培养部10-1多次变更为任意大小。
然后,在培养容器10中的培养部10-1中封入淋巴细胞30和培养液40,以使培养部10-1中的固相化面11成为底面的方式配置培养容器10,使淋巴细胞30活化。
该活化工序中,培养部10-1内的淋巴细胞30被固相化在固相化面11上的抗CD3抗体活化。
(2)第一增殖工序
然后,将培养容器10反转,以使非固相化面12成为底面的方式配置培养容器10,使淋巴细胞30扩增。
即,以使非固相化面12成为底面的方式配置培养容器10,由此能够在培养部10-1中的非固相化面12侧培养淋巴细胞30,从而能够在不受到来自固相化于固相化面11的抗CD3抗体的刺激的情况下使淋巴细胞30增殖。因此,能够在单一的容器内使淋巴细胞高效地增殖。
(3)容积扩大工序
容积扩大工序为如下的工序:通过移动或除去间隔构件50,由此将培养部10-1的容积扩大。
由此,能够根据所增殖的淋巴细胞30的细胞数来调整培养部10-1的容积。因此,能够更进一步地提高淋巴细胞30的增殖效率。
(4)第二增殖工序
第二增殖工序为如下的工序:在将培养容器10中的培养部10-1扩大的状态下连续进行淋巴细胞30的培养。此时,培养容器10为以使非固相化面12成为底面的方式配置的状态。
由此,能够在不受到来自于固相化在固相化面11上的抗CD3抗体的刺激的情况下使淋巴细胞30增殖,并且能够防止由于培养部10-1内的淋巴细胞30的密度过高造成淋巴细胞30的增殖效率降低的情况。
此外,也能够使用多个夹子、辊作为间隔构件50并多次重复(3)和(4),从而阶段性进行培养部10-1的容积扩大。
如以上所说明的,根据本发明的实施方式所涉及的淋巴细胞的培养方法,可以使用本发明的实施方式所涉及的培养容器10,以使固相化面11成为底面的方式配置来进行淋巴细胞30的活化,然后,以使非固相化面12成为底面的方式配置来进行淋巴细胞30的增殖。
因此,能够防止淋巴细胞30受到来自抗体20的过量刺激,能够在单一的容器内高效地进行淋巴细胞30的活化和增殖。
另外,能够根据所增殖的淋巴细胞30的细胞数来调整培养容器10中的培养部10-1的容积,能够更进一步地提高淋巴细胞30的增殖效率。
然后,对本发明的培养容器的制造方法、和固相化装置的一个实施方式详细地进行说明。
[培养容器的制造方法]
本实施方式的培养容器的制造方法的特征在于,为固相化有蛋白质的培养容器的制造方法,在培养容器中注入溶解有所述蛋白质的液滴(drop),使液滴移动到培养容器的内表面上的一部分或全部。
首先,参照图9对本实施方式的培养容器的制造方法中的、能够使蛋白质高效地固相化于培养容器的内表面的原理进行说明。
静置溶解有蛋白质的溶液时,蛋白质具有吸附于该溶液的气液界面的性质(BUNSEKI KAGAKU Vol.59,No.6.pp.437-445(2010))。因此,本实施方式的培养容器的制造方法中,使溶解有蛋白质的液滴在基材上移动,并使集中在气液界面的蛋白质分子积极地与基材接触。
这样地,在容器内滚动液滴,使气液界面在容器内移动,由此在气体、液体、材料的界线上,蛋白质吸附于基材。蛋白质吸附于基材时,液滴中的蛋白质吸附于新生的气液界面。而且,液滴在容器内表面上移动时,通过蛋白质浓度高的气液界面与容器内表面的接触,蛋白质以高概率吸附到容器内表面。
由此,根据本实施方式的培养容器的制造方法,能够使蛋白质高效地固相化于容器内表面。
另外,例如在使蛋白质仅固相化于容器底面的情况下,也能够防止蛋白质向容器顶面的吸附所致的蛋白质的损失。
本实施方式中,培养容器是指细胞培养中使用的整个容器,包括细胞活化和/或细胞增殖中使用的容器。
本实施方式中的培养容器的形态没有特别限制,可以适当地使用由软包装材料构成的袋状的培养袋、玻璃或聚苯乙烯制的烧瓶等。
例如,可以适当地使用在容器内表面具有相对的容器壁的培养袋,使蛋白质固相化于该培养袋的内表面的一面或两面中的一部分或全部,从而可以制造本实施方式中的培养容器。
具体地,如图10所示,可以使培养袋100中的相对的内表面的一个面为固相化有蛋白质200的固相化面110(图10的容器内底面),使培养袋内表面的另一个面为未固相化有蛋白质200的非固相化面120(图10的容器内顶面)。
此外,培养袋100具备管130,经由该管130,可以向培养袋100内导入溶解有蛋白质的液滴和气体,或者将它们除去。该图的例中,培养袋100具有2根管130,但也可以具有1根或3根以上。
另外,培养袋100优选使用具有细胞培养所需要的透气性的膜来形成。作为这样的培养袋100的材料,可以适当地使用聚乙烯和聚丙烯等聚烯烃类树脂。
本实施方式中,作为固相化于培养袋100的蛋白质200,没有特别限制,例如可以使用抗CD3抗体等抗体、或者纤连蛋白、胶原、层粘连蛋白等细胞粘附性蛋白。抗CD3抗体适合用于使淋巴细胞活化。另外,细胞粘附性蛋白适合用于使粘附性细胞高效地粘附到培养基材上。
在要将作为蛋白质200的抗CD3抗体固相化的情况下,抗CD3抗体的固相化浓度优选设为10~300ng/cm2。这是因为,若使抗CD3抗体的固相化浓度为10ng/cm2以上,则能够有效地使淋巴细胞活化,然后能够高效地使淋巴细胞增殖。另一方面,若抗CD3抗体的固相化浓度大于300ng/cm2,则抗CD3抗体漂浮在培养袋100内的培养液中,有时对淋巴细胞造成过量的刺激,因此不优选。
作为本实施方式中的溶解蛋白质的液滴,没有特别限定,但可以适当地使用磷酸缓冲液。
另外,本实施方式中的溶解有蛋白质的液滴的大小(液滴量)优选设为1cc~20cc。这是因为,当液滴在培养袋100的内表面移动时,在液滴与内表面之间产生摩擦力,因此若液滴的大小过小,则无法适宜地进行移动。另外,若液滴过大,则液滴中的蛋白质浓度降低,并且液滴的每单位体积的气液界面的面积减少,因此吸附效率降低。从这样的观点出发,更优选将液滴的大小设为1cc~10cc,进一步优选设为1cc~5cc,更进一步优选设为2cc左右。
本实施方式中,作为封入到培养袋100的气体,没有特别限定,但优选设为不活泼气体,可以使用空气、氮气等。例如可以利用气体供给装置经由管130将这样的气体注入到培养容器100。
另外,封入到培养袋100的气体的量更优选设为每1cm2的培养袋100内的底面积为0.1~4ml,进一步优选设为1~3ml。若使所封入的气体的量为这样的范围,则能够防止培养袋100的内表面中相对的容器壁发生接触,因此能够使溶解有蛋白质200的液滴在培养袋100内高效地移动。
培养袋100例如可以如下所述地进行制造。
首先,使用塑料挤出成形装置将低密度聚乙烯挤出成形,形成膜。然后,使用脉冲热封机由该膜制造培养袋100。如图10所示,培养袋100以装有管130的方式进行制造。
然后,将培养袋100载置于装载台,封入规定量的气体,并且接着封入溶解有蛋白质200的缓冲液。然后,通过摇动培养袋100等方式,使缓冲液的液滴在培养袋100内的底面上移动。由此,可以使缓冲液中含有的蛋白质200附着到培养袋100内的底面上,得到固相化有蛋白质200的培养袋100。
[固相化装置]
然后,参照图11~图15对能够在本实施方式的培养容器的制造方法中适当地使用的本实施方式的固相化装置、和该固相化装置中使用的保持构件进行说明。图11示出固相化装置的俯视图,图12示出其主视图。图13示出利用固相化装置的固相化的样子。图14示出保持单元的主视图和侧视图,图15示出保持单元的使用形态。
图11中,下侧示出固相化装置300的正面侧,上侧示出固相化装置300的背面侧,左侧示出固相化装置300的左侧,右侧示出固相化装置300的右侧。另外,该图中,将左右方向(后述的装载台的长边方向)设为X轴方向,将上下方向(同装载台的短边方向)设为Y轴方向。
固相化装置300具备X轴方向移动用支承台310、和Y轴方向移动用支承台360。培养袋100中封入溶解有蛋白质的液滴和规定量的气体后载置于Y轴方向移动用支承台360。这些X轴方向移动用支承台310与Y轴方向移动用支承台360一体地进行运动。以下,有时将X轴方向移动用支承台310和Y轴方向移动用支承台360总称为装载台。
X轴方向移动用支承台310通过固定于基台400而立设的二个支承柱320在长边方向的中央在正面侧和背面侧这两侧得到支承。
另外,X轴方向移动用支承台310经由X轴方向移动用齿轮箱340与X轴方向移动用伺服电动机330(长边方向移动用驱动单元)连接。
通过驱动该X轴方向移动用伺服电动机330,由此X轴方向移动用支承台310能够以Y轴方向为中心轴左转和右转交替地进行旋转运动。由此,X轴方向移动用支承台310可以左右地进行所谓的跷跷板运动。
因此,载置于装载台的培养袋100内的溶解有蛋白质的液滴可以在培养袋100内从左端至右端左右地进行往复运动。
此时,X轴方向移动用支承台310的旋转运动的角度相对于水平方向可以设为例如-10°~+10°的范围。此外,图11、12中,将左侧变高时称作负(-),将右侧变高时称作正(+)。
另外,X轴方向移动用支承台310的旋转运动的速度可以设为如下的速度:使培养袋100内的溶解有蛋白质的液滴例如以5m/分钟~15m/分钟的速度在培养袋100内进行移动的速度。
Y轴原点限度检测传感器350用于检测Y轴的原点和限度。
Y轴方向移动用支承台360通过立设于X轴方向移动用支承台310的左右端部的二个支承部在短边方向的中央在左侧和右侧这两侧受到支承。
另外,Y轴方向移动用支承台360经由Y轴方向移动用齿轮箱380与Y轴方向移动用伺服电动机370(短边方向移动用驱动单元)连接。
通过驱动该Y轴方向移动用伺服电动机370,由此Y轴方向移动用支承台360能够与X轴方向移动用支承台310一起以X轴方向为中心轴左转和右转交替地进行旋转运动。由此,装载台可以左右地(图11中为上下地)进行所谓的跷跷板运动。
因此,载置于装载台的培养袋100内的溶解有蛋白质的液滴可以在培养袋100内从下端至上端地进行移动。
此时,Y轴方向移动用支承台360的旋转运动的角度相对于水平方向可以设为例如-50°~+50°的范围。此外,图11中,将正面侧变高时称作负(-),将背面侧变高时称作正(+)。
另外,期望液滴沿Y轴方向的移动每次以液滴的大小以下的距离进行。通过这样地使液滴在Y轴方向上移动、并且在X轴方向上在培养袋100内从左端至右端地移动,由此能够使液滴移动到培养袋100内的整个底面,能够使液滴中含有的蛋白质高效地吸附到培养袋100。
X轴原点限度检测传感器390用于检测X轴的原点和限度。
然后,对使用了本实施方式的固相化装置300的培养袋100的制造方法进行说明。
首先,将培养袋100载置于装载台后封入规定量的空气,接着注入溶解有蛋白质的液滴。然后,驱动Y轴方向移动用伺服电动机370,如图13所示,以X轴方向为中心轴使装载台向正面侧旋转移动,使液滴移动到培养袋100内的正面侧端部。
然后,驱动X轴方向移动用伺服电动机330,以Y轴方向为中心轴,使装载台左右地旋转运动,从而使液滴在培养袋100内在左端与右端之间左右地移动。
然后,驱动Y轴方向移动用伺服电动机370,使装载台向背面侧稍微旋转移动,使液滴向背面侧稍稍移动,然后,再次驱动X轴方向移动用伺服电动机330,使装载台左右地旋转运动,从而使液滴在培养袋100内在左端与右端之间左右地移动。重复进行以上的动作,直至液滴移动到培养袋100内的背面侧端部,从而在左端与右端之间左右地移动。
这样地使用固相化装置300使蛋白质吸附到培养袋100内,由此能够进一步提高蛋白质的固相化效率。
此外,本实施方式的固相化装置300不仅能够适合地用于在培养袋100中将蛋白质固相化的情况,也能够适合地用于在烧瓶、其他容器中将蛋白质固相化的情况。
然后,对本实施方式的固相化装置中使用的保持构件进行说明。
保持构件为用于以使培养容器的底面形成半圆筒形状的方式保持培养容器的构件,保持构件被固定于装载台,或者与装载台一体地形成。
如图14所示,保持构件500具备主体部510、上盖部520和挤压部530。
主体部510具备用于使培养袋100弯曲地保持的半圆筒形状的凹部510-1。上盖部520覆盖该凹部510-1地安装于主体部510。上盖部520向主体部510的安装方法没有特别限制,例如可以进行螺丝固定。
在上盖部520安装有用于从外面挤压培养袋100的挤压部530。通过使该挤压部530向下方移动,由此对配置于主体部510的凹部510-1的培养袋100进行挤压,从而能够使培养袋100的底面稳定地呈半圆筒形状。
关于挤压部530向上盖部520的安装,只要能够使挤压部530向下方移动从而挤压培养袋100,则没有特别限定,例如可以通过将上盖部520与挤压部530螺丝缔合。
另外,挤压部530的形状并不限定为图14所示的棒状,也可以为其他形状。例如,也优选使挤压部530的下方前端部分枝、或者为使下方呈曲面的半球状,由此将培养袋100的底面进一步稳定地维持为半圆筒形状。
另外,图14中示出在上盖部520安装了3个挤压部530的状态,但挤压部530的安装个数没有特别限制,也可以为1个、2个或4个以上。
图15示出保持构件500的使用形态,示出了使培养袋100保持于保持构件500的样子。
首先,在保持构件500的主体部510的凹部510-1配置培养袋100。此时,以使培养袋100的底面沿凹部510-1成为曲而的方式进行配置。
然后,在主体部510安装上盖部520,使挤压部530向下方移动。由此,能够将培养袋100的底面维持为半圆筒形状。
保持构件500以使凹部510-1的半圆筒形状的中心轴的方向与装载台的长边方向为相同方向的方式固定于固相化装置300的装载台后使用。另外,也可以以这样的位置关系将保持构件500与装载台一体地形成。
将培养袋100的底面维持为半圆筒形状地保持于这样的保持构件500、并使培养袋100内的液滴沿Y轴方向移动时,液滴通常位于保持构件500中凹部510-1的最下部,因此能够精密地控制液滴在Y轴方向上的移动。
如以上所说明的,根据本发明的培养容器的制造方法,能够将蛋白质高效地固相化于培养容器内表面,能够缩短固相化所需要的时间,并能够提高向培养容器的吸附率,能够以少量的蛋白质进行必要量的固相化。因此,能够降低未固相化而被废弃的蛋白质量。另外,通过使用本实施方式的固相化装置,能够更进一步提高蛋白质的固相化效率。进一步,通过使用保持构件,能够更精密地控制液滴的移动,能够更进一步提高蛋白质的固相化效率。
实施例
以下参照图6和图7对本发明的实施方式所涉及的培养容器、和淋巴细胞的培养方法的实施例和比较例进行说明。图6为示出实施例和比较例的示意图,图7为示出实施例和比较例的实验结果的图表的图。此外,图6为用于示出实施例和比较例的区别的图,省略了培养部容积的扩大。
[实验1:培养容器的制造]
(实施例1)
使用Labo Plasto Mill(株式会社东洋精机制作所制)作为塑料挤出成形装置,将低密度聚乙烯挤出成形,成形出厚度100μm的膜。然后,使用脉冲热封机,用该膜制作11cm×22.5cm(约225cm2)的袋,对该袋进行γ射线灭菌后供于实验。
然后,在该袋中封入空气约600ml,并且接着封入溶解有50μg的抗CD3抗体(Miltenyi Biotec株式会社制)的磷酸缓冲液(Japan Life Technologies株式会社制)10ml。此时,以使磷酸缓冲液的液滴仅与袋内表面的一面(固相化面)接触的方式进行。
然后,在26℃的条件下手动摇动袋1分钟,使磷酸缓冲液的液滴以10m/分钟的速度在袋内的底面上移动,在袋内形成固相化面,制造培养容器。
此外,制造2个该培养容器,一个用于固相化浓度的测定,另一个用于淋巴细胞的培养试验。其他实施例和比较例也与此相同。
以下述方式进行固相化浓度的测定。
首先,除去培养容器内的液体,使固相化面与包含1%十二烷基硫酸钠(日本西格玛奥德里奇合同会社制)的磷酸缓冲液(同上)500μl接触,静置30分钟后,用Present Mixer(Tietech株式会社制)施加强振动,剥离所吸附的抗体。使用Micro BCATM Protein AssayKit(Thermo Fisher Scientific株式会社制)测定剥离液中的抗体量,并用其除以固相化面积,由此算出吸附浓度。
实施例1的培养容器中,仅在其内侧的一面固相化有抗CD3抗体。
关于实施例1的培养容器的固相化浓度的测定结果是,固相化面中的抗CD3抗体的浓度为40ng/cm2。
(实施例2)
与实施例1同样地制作11cm×22.5cm(约225cm2)的袋。
然后,在该袋中封入空气约600ml,并且接着封入溶解有5μg的抗CD3抗体(Miltenyi Biotec株式会社制)的磷酸缓冲液(Japan Life Technologies株式会社制)10ml。此外进行与实施例1同样的处理,制造实施例2的培养容器。
实施例2的培养容器中,仅在其内侧的一面固相化有抗CD3抗体。
关于实施例2的培养容器的固相化浓度的测定结果,固相化面中的抗CD3抗体的浓度为11ng/em2。
(比较例1)
与实施例1同样地制作11cm×22.5cm(约225cm2)的袋。
然后,在该袋中封入溶解有50μg的抗CD3抗体(Miltenyi Biotec株式会社制)的磷酸缓冲液(Japan Life Technologies株式会社制)10ml,使磷酸缓冲液的液滴与袋内的上下两面接触,在26℃静置60分钟。然后,用磷酸缓冲液40ml进行3次袋内的清洗,制造比较例1的培养容器。
比较例1的培养容器在其内侧的两面固相化有抗CD3抗体。
关于比较例1的培养容器的固相化浓度的测定结果,容器内表面的抗CD3抗体的浓度为25ng/cm2。
(比较例2)
与实施例1同样地制作11cm×22.5cm(约225cm2)的袋。
然后,在该袋中封入空气约600ml,并且接着封入溶解有5μg的抗CD3抗体(Miltenyi Biotec株式会社制)的磷酸缓冲液(Japan Life Technologies株式会社制)10ml。此时,以使磷酸缓冲液的液滴仅与袋内表面的一面(固相化面)接触的方式进行。
然后,在26℃的条件下手动摇动袋1分钟,使磷酸缓冲液的液滴以10m/分钟的速度在袋内的底面上移动,在袋内形成固相化面。进一步,用磷酸缓冲液10ml进行3次袋内的清洗,制造比较例2的培养容器。
比较例2的培养容器中,仅在其内侧的一面固相化有抗CD3抗体。
关于比较例2的培养容器的固相化浓度的测定结果,固相化面中的抗CD3抗体的浓度为8ng/cm2。
[实验2:淋巴细胞的培养]
(活化工序)
对于由实验1的实施例1、2和比较例1、2得到的培养容器,使用夹子分别以使培养部为5cm×11cm的方式进行划分。
然后,将人末梢血单核细胞(Cell Applications株式会社制)5.8×104个悬浮于加入有10%小牛血清(Japan Life Technologies株式会社制)的ALyS505N-7培养基(株式会社细胞科学研究所制),将4ml封入培养容器。然后,直接在37℃静置75小时,进行淋巴细胞的活化工序。
此时,实施例1、2和比较例2以使培养容器的固相化面朝下的方式进行。此外,如上所述,比较例1的培养容器中在其内侧的上下两面固相化有同量的抗CD3抗体,没有上下的区别,即没有固相化面与非固相化面的区别。
(增殖工序)
在结束了活化工序的培养容器中追加上述培养基4ml,将培养容器上下反转,直接在37℃静置26小时,进行淋巴细胞的增殖(第二实施方式中的第一增殖工序)。
然后,去掉夹子,将培养容器培养部的容积扩大(第二实施方式中的容积扩大工序),追加上述培养基20ml,直接在37℃静置62小时,继续进行淋巴细胞的增殖(第二实施方式中的第二增殖工序)。
在距离培养开始的上述各操作的时刻(75小时后、75+26(=101)小时后、75+26+62(=163)小时后)、以及去掉夹子后的18小时后(75+26+18(=119)),计数各培养容器中的淋巴细胞数目。其结果如图7所示。
如图7所示,仅在培养容器内的一面分别固相化有40ng/cm2、11ng/cm2的抗CD3抗体的实施例1、2中,在增殖工序中能够使淋巴细胞显著增殖。此时,在固相化浓度为40ng/cm2的情况(实施例1)与11ng/cm2的情况(实施例2)之间,在增殖效率方面没有看到显著的差异。
另一方面,在培养容器内的两面固相化有抗CD3抗体的比较例1中,与实施例1、2相比,可知增殖工序中的淋巴细胞的增殖效率大幅降低。
另外,与实施例2相比稍微减少了所固相化的抗CD3抗体的浓度的比较例2中,在增殖工序中几乎无法使淋巴细胞增殖。由此可知,优选使固相化于培养容器的固相化面的抗CD3抗体的浓度为约10ng/cm2以上。
然后,参照图16~图21对本发明的实施方式所涉及的培养容器的制造方法的实施例和比较例进行说明。图16、18、20为示出实施例和比较例的示意图,图17、19、21为示出实施例和比较例的实验结果的图表的图。
[实验3:抗体固相化培养袋的制造]
(实施例3)
使用Labo Plasto Mill(株式会社东洋精机制作所制)作为塑料挤出成形装置,将低密度聚乙烯挤出成形,成形出厚度100μm的膜。然后,使用脉冲热封机,用该膜制作11cm×22.5cm(约225cm2)的袋,对该袋进行γ射线灭菌后供于实验。
然后,将该袋载置于装载台后封入空气约600ml,并且接着以液滴的状态封入溶解有50μg的抗CD3抗体(Miltenyi Biotec株式会社制)的磷酸缓冲液(Japan LifeTechnologies株式会社制)10ml。此时,以使该磷酸缓冲液的液滴仅与袋内表面的底面接触的方式进行。
然后,在26℃的条件下手动摇动袋1分钟,使磷酸缓冲液的液滴以10m/分钟的速度在袋内的底面上移动,使抗体吸附于袋内的底面,制造抗体固相化培养袋。
固相化浓度的测定以下述方式进行。
首先,除去培养容器内的液滴,使固相化面与包含1%十二烷基硫酸钠(日本西格玛奥德里奇合同会社制)的磷酸缓冲液(同上)500μl接触,静置30分钟后,用Present Mixer(Tietech株式会社制)施加强振动,剥离所吸附的抗体。使用Micro BCATM Protein AssayKit(Thermo Fisher Scientific株式会社制)测定剥离液中的抗体量,并用其除以固相化面积,由此算出单位面积的蛋白质吸附量(以下称为吸附浓度)。
实施例3的培养容器中,仅在其内侧的一面(底面)固相化有抗CD3抗体。关于实施例3的培养容器的固相化浓度的测定结果,抗CD3抗体的吸附浓度为41.5ng/cm2。
(实施例4)
与实施例3同样地制作11cm×22.5cm(约225cm2)的袋。
然后,在该袋中封入空气约600ml,并且接着以液滴的状态封入溶解有50μg的抗CD3抗体(Miltenyi Biotec株式会社制)的磷酸缓冲液(Japan Life Technologies株式会社制)10ml。
然后,在26℃的条件下手动摇动袋2.5分钟,使磷酸缓冲液的液滴以10m/分钟的速度在袋内的底面上移动,使抗体吸附于袋内的底面。然后,将袋上下反转,再次手动摇动袋2.5分钟,使上述液滴以10m/分钟的速度在袋内的底面(上下反转前的顶面)上移动。由此,使抗体吸附于袋内壁的两面,制造抗体固相化培养袋。
实施例4的培养容器在其内侧的两面固相化有抗CD3抗体。关于实施例4的培养容器的固相化浓度的测定结果,抗CD3抗体的吸附浓度为31.2ng/cm2。
(比较例3)
与实施例3同样地制作11cm×22.5cm(约225cm2)的袋。
然后,在不在该袋中封入空气的情况下封入溶解有50μg的抗CD3抗体(MiltenyiBiotec株式会社制)的磷酸缓冲液(Japan Life Technologies株式会社制)10ml,使该磷酸缓冲液与袋内的上下两面接触,在26℃静置60分钟。然后,用磷酸缓冲液40ml进行3次袋内的清洗,制造抗体固相化培养袋。
比较例3的培养容器在其内侧的两面固相化有抗CD3抗体。关于比较例3的培养容器的固相化浓度的测定结果,抗CD3抗体的吸附浓度为26.1ng/cm2。
(比较例4)
与实施例3同样地制作11cm×22.5cm(约225cm2)的袋。
然后,在不在该袋中封入空气的情况下以液滴的状态封入溶解有50μg的抗CD3抗体(Miltenyi Biotec株式会社制)的磷酸缓冲液(Japan Life Technologies株式会社制)10ml。然后,在26℃的条件下手动摇动袋5分钟,使磷酸缓冲液的液滴以10m/分钟的速度在袋内移动,使抗体吸附于袋的内表面。进一步,用磷酸缓冲液10ml进行3次袋内的清洗,制造抗体固相化培养袋。
比较例4的培养容器在其内侧的两面固相化有抗CD3抗体。关于比较例4的培养容器的固相化浓度的测定结果,抗CD3抗体的吸附浓度为23.8ng/cm2。
如图17所示,实施例3、实施例4、比较例3和比较例4中抗体对培养容器底面的单位面积的吸附效率(吸附浓度×225cm2/50000ng×100)分别为19%、14%、12%、11%。
即,根据实施例3的方法,即使固相化时间为1分钟,与固相化时间为60分钟的比较例3的结果相比,吸附效率也增大60%左右。
另一方面,在不在培养容器中封入气体的情况下使液滴移动从而进行固相化的比较例4中,与比较例3的结果相比,吸附效率小。
另外,认为实施例4的吸附效率之所以小于实施例3的吸附效率,是因为实施例4的吸附面积为实施例3的吸附面积的2倍。
进一步,对实施例4与比较例4的结果进行比较可知,通过在培养容器中放入气体的基础上使液滴移动来进行固相化,由此能够将吸附效率提高30%左右。
这样地,根据本实施方式的培养容器的制造方法,即使在与以往相比更短的时间内,也能够将更多的抗体固相化于培养容器。另外,也能够使用比以往更少量的抗体将更多的抗体固相化于培养容器。
[实验4:抗体固相化烧瓶的制造]
(实施例5)
在漂浮培养用烧瓶800(Sumimoto Bakelite,聚苯乙烯制,底面积225cm2)中以液滴的状态封入溶解有50μg的抗CD3抗体(Miltenyi Biotec株式会社制)的磷酸缓冲液(Japan Life Technologies株式会社制)10ml。在26℃的条件下手动摇动烧瓶5分钟,使磷酸缓冲液的液滴以10m/分钟的速度在袋内的底面上移动,使抗体吸附于烧瓶内的底面,制造抗体固相化烧瓶。实施例5的抗体固相化烧瓶的抗CD3抗体的浓度为27.9ng/cm2。
(比较例5)
在漂浮培养用烧瓶800(Sumimoto Bakelite,聚苯乙烯制,底面积225cm2)中装入溶解有50μg的抗CD3抗体(Miltenyi Biotec株式会社制)的磷酸缓冲液(Japan LifeTechnologies株式会社制)10ml,使抗体溶液遍布整个底面,在26℃静置60分钟。由此,使抗体吸附于烧瓶的底面,制造抗体固相化烧瓶。比较例5的抗体固相化烧瓶的抗CD3抗体的浓度为27.6ng/cm2。
(比较例6)
在漂浮培养用烧瓶800(Sumimoto Bakelite,聚苯乙烯制,底面积225cm2)中装入溶解有50μg的抗CD3抗体(Miltenyi Biotec株式会社制)的磷酸缓冲液(Japan LifeTechnologies株式会社制)10ml,使抗体溶液遍布整个底面,在26℃静置5分钟。由此,使抗体吸附于烧瓶的底面,制造抗体固相化烧瓶。比较例6的抗体固相化烧瓶的抗CD3抗体的浓度为21.8ng/cm2。
如图19所示,实施例5、比较例5和比较例6中,烧瓶的单位面积的抗体吸附效率分别为13%、12%、10%。
即,如比较例5所示,现有的基于静置的抗体的固相化方法中,在固相化时间为60分钟的条件下,吸附效率为12%,与此相对,如实施例5所示,本实施方式的培养容器的制造方法中,能够在固相化时间为5分钟的条件下使吸附效率为13%。
因此可知,根据本实施方式的培养容器的制造方法,即使在将蛋白质固相化于烧瓶的情况下,也能够以比现有方法更短的时间将同等量的蛋白质固相化。
[实验5:纤连蛋白固相化培养袋的制造]
(实施例6)
与实施例3同样地制作11cm×22.5cm(约225cm2)的袋。
然后,在该袋中封入空气约600ml,并且接着以液滴的状态封入溶解有50μg来自于人血浆的纤连蛋白(日本西格玛奥德里奇合同会社制)的磷酸缓冲液(Japan LifeTechnologies株式会社制)10ml。
然后,在26℃的条件下手动摇动袋1分钟,使磷酸缓冲液的液滴以10m/分钟的速度在袋内的底面上移动,使抗体吸附于袋内的底面,制造纤连蛋白固相化培养袋。
实施例6的培养容器中,仅在其内侧的一面(底面)固相化有纤连蛋白。关于实施例6的培养容器的固相化浓度的测定结果,纤连蛋白的吸附浓度为53.6ng/cm2。
(比较例7)
与实施例3同样地制作11cm×22.5cm(约225cm2)的袋。
然后,在不在该袋中封入空气的情况下封入溶解有50μg来自于人血浆的纤连蛋白(日本西格玛奥德里奇合同会社制)的磷酸缓冲液(Japan Life Technologies株式会社制)10ml,使磷酸缓冲液的液滴与袋内的上下两面接触,在26℃静置60分钟。然后,用磷酸缓冲液40ml进行3次袋内的清洗,制造纤连蛋白固相化培养袋。
比较例7的培养容器在其内侧的两面固相化有纤连蛋白。关于比较例7的培养容器的固相化浓度的测定结果,纤连蛋白的吸附浓度为30.7ng/cm2。
如图21所示,实施例6和比较例7中,培养容器的单位面积的抗体吸附效率分别为24%、14%。
即,使用纤连蛋白作为蛋白质的情况下,根据本实施方式的培养容器的制造方法,能够以比现有方法高70%以上的吸附效率将纤连蛋白固相化于培养容器。
因此可知,根据本实施方式的培养容器的制造方法,即使是抗体以外的蛋白质,也能够在短时间内将其高效地固相化于培养容器。
[实验6:使用了固相化装置的抗体固相化培养袋的制造]
(实施例7)
与实施例3同样地制作8cm×20cm(约160cm2)的袋。
然后,将该袋载置于固相化装置中的保持构件,使用挤压部,以使底面为半圆筒状的方式进行固定。然后,封入空气约280ml,并且接着以液滴的状态封入溶解有10μg抗CD3抗体(Miltenyi Biotec株式会社制)的磷酸缓冲液(Japan Life Technologies株式会社制)2ml。
然后,如图13所示,将固相化装置中的装载台在Y轴方向上倾斜-50°(以X轴方向为中心轴进行旋转移动),使液滴达到培养袋内的端部,然后在X轴方向上以-10°~10°的范围旋转装载台(以Y轴方向为中心轴进行旋转移动),使液滴在X轴方向上移动,使其从培养袋内的左端至右端左右地往复移动。
然后,在Y轴方向上使装载台旋转10°,使液滴稍微向背面侧移动,然后再次在X轴方向上在-10°~10°的范围旋转装载台,使液滴在X轴方向上移动,使其从培养袋内的左端至右端左右地往复移动。
重复以上的动作直至Y轴方向的旋转角(X轴旋转角)达到50°,使液滴在培养袋的整个底面移动。将其作为1个循环,进行4个循环(固相化时间为3.5分钟,温度26℃),测定固相化量。
实施例7的培养容器中,仅在其内侧的一面(底面)固相化有抗CD3抗体。关于实施例7的培养容器的固相化浓度的测定结果是,抗CD3抗体的吸附浓度为30.1ng/cm2。
因此,实施例7的培养容器中,单位面积的抗体吸附效率(吸附浓度×160cm2/10000ng×100)为48%。这与比较例3的培养容器的该吸附效率12%相比,达到4倍。
可见,通过使用本实施方式的固相化装置来制造培养容器,由此能够在短时间内得到显示出以往无法实现水平的高吸附效率的培养容器。
本发明并不限定于以上的实施方式或实施例,自然可以在本发明的范围内实施各种变更。
例如,能够将培养容器的大小、淋巴细胞的种类、培养基和蛋白质的种类等适当变更为与实施例不同的情况。
产业上可利用性
本发明能够适当地用于通过使用单一的培养容器,来在排除活化后细胞的更换的繁杂性、污染风险的同时,大量培养淋巴细胞的情况。另外,本发明能够适当地用于在短时间内高效地制造在内表面固相化有蛋白质的培养容器。
符号说明
10 培养容器
11 固相化面
12 非固相化面
13 管
20 抗体
30 淋巴细胞
40 培养液
50 间隔构件
60 外装容器
70 包装容器
100 培养袋
110 固相化面
120 非固相化面
130 管
200 蛋白质
300 固相化装置
310 X轴方向移动用支承台
320 支承柱
330 X轴方向移动用伺服电动机
340 X轴方向移动用齿轮箱
350 Y轴原点限度检测传感器
360 Y轴方向移动用支承台
370 Y轴方向移动用伺服电动机
380 Y轴方向移动用齿轮箱
390 X轴原点限度检测传感器
400 基台
500 保持构件
510 主体部
510-1 凹部
520 上盖部
530 挤压部
Claims (12)
1.一种培养容器的制造方法,其特征在于,
其为固相化有蛋白质的培养容器的制造方法,
在所述培养容器中注入溶解有所述蛋白质的液滴,
使所述液滴移动到所述培养容器的内表面上的一部分或全部。
2.如权利要求1所述的培养容器的制造方法,其特征在于,具有:
在由软包装材料形成的所述培养容器中封入气体的工序,
在封入了气体的所述培养容器中注入溶解有所述蛋白质的液滴的工序,和
使所述液滴移动到所述培养容器的内表面上的一部分或全部的工序。
3.如权利要求1或2所述的培养容器的制造方法,其特征在于,
使所述液滴进行移动的区域仅为所述培养容器的内表面中相对的容器壁中的一方。
4.如权利要求1或2所述的培养容器的制造方法,其特征在于,
以每1cm2的所述培养容器内的底面积为0.1~4ml的范围将所述气体封入所述培养容器。
5.如权利要求1或2所述的培养容器的制造方法,其特征在于,
所述蛋白质为抗体或细胞粘附性蛋白。
6.如权利要求5所述的培养容器的制造方法,其特征在于,
所述抗体为抗CD3抗体。
7.如权利要求5所述的培养容器的制造方法,其特征在于,
所述细胞粘附性蛋白选自纤连蛋白、胶原、层粘连蛋白。
8.一种固相化装置,其特征在于,
其为将蛋白质固相化于培养容器的内表面的固相化装置,具备:
装载台,载置溶解有所述蛋白质的液滴和培养容器,和
驱动单元,移动所述装载台,使所述培养容器内的所述液滴在所述培养容器的内表面上移动。
9.如权利要求8所述的固相化装置,其特征在于,
作为所述驱动单元,具备:
长边方向移动用驱动单元,使所述装载台以短边方向为中心轴旋转运动,使所述液滴在所述培养容器的内表面上沿长边方向移动,和
短边方向移动用驱动单元,使所述装载台以长边方向为中心轴旋转运动,使所述液滴在所述培养容器的内表面上沿短边方向移动。
10.如权利要求8或9所述的固相化装置,其特征在于,
具备保持构件,所述保持构件用于以使所述培养容器的底面形成半圆筒形状的方式保持所述培养容器,所述保持构件具有半圆筒形状的凹部,
所述保持构件被固定于所述装载台,或者与所述装载台一体地形成。
11.如权利要求10所述的固相化装置,其特征在于,
所述保持构件以使所述保持构件的半圆筒形状的中心轴的方向与所述装载台的长边方向为相同方向的方式被固定于所述装载台,或者
所述保持构件与所述装载台一体地形成。
12.如权利要求10所述的固相化装置,其特征在于,
所述保持构件具备挤压部,
所述挤压部用于以使所述培养容器的底面形成半圆筒形状的方式挤压所述培养容器。
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2013-261181 | 2013-12-18 | ||
JP2013261181A JP6241257B2 (ja) | 2013-12-18 | 2013-12-18 | 培養容器、及びリンパ球の培養方法 |
JP2013267082A JP6326811B2 (ja) | 2013-12-25 | 2013-12-25 | 培養容器の製造方法、及び固相化装置 |
JP2013-267082 | 2013-12-25 | ||
CN201480057477.1A CN105658784B (zh) | 2013-12-18 | 2014-12-16 | 培养容器、淋巴细胞的培养方法、培养容器的制造方法和固相化装置 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201480057477.1A Division CN105658784B (zh) | 2013-12-18 | 2014-12-16 | 培养容器、淋巴细胞的培养方法、培养容器的制造方法和固相化装置 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN107267383A true CN107267383A (zh) | 2017-10-20 |
Family
ID=53402409
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201710264731.0A Pending CN107267383A (zh) | 2013-12-18 | 2014-12-16 | 培养容器的制造方法和固相化装置 |
CN201480057477.1A Active CN105658784B (zh) | 2013-12-18 | 2014-12-16 | 培养容器、淋巴细胞的培养方法、培养容器的制造方法和固相化装置 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201480057477.1A Active CN105658784B (zh) | 2013-12-18 | 2014-12-16 | 培养容器、淋巴细胞的培养方法、培养容器的制造方法和固相化装置 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (4) | US11884907B2 (zh) |
EP (2) | EP3085767B1 (zh) |
KR (1) | KR101828926B1 (zh) |
CN (2) | CN107267383A (zh) |
ES (1) | ES2703227T3 (zh) |
WO (1) | WO2015093041A1 (zh) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP5892216B1 (ja) * | 2014-09-17 | 2016-03-23 | 東洋製罐グループホールディングス株式会社 | 細胞培養システムにおける送液方法、及び細胞培養システム |
JP7102734B2 (ja) * | 2018-01-09 | 2022-07-20 | 東洋製罐グループホールディングス株式会社 | 細胞培養方法及び装置 |
US11047849B2 (en) * | 2018-10-17 | 2021-06-29 | Mandom Corporation | Method for observing sebaceous gland and use thereof |
TWI822534B (zh) * | 2022-12-28 | 2023-11-11 | 財團法人工業技術研究院 | 細胞培養裝置 |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20070243634A1 (en) * | 2006-04-18 | 2007-10-18 | Pamula Vamsee K | Droplet-based surface modification and washing |
WO2007136386A2 (en) * | 2005-06-06 | 2007-11-29 | The Regents Of The University Of California | Droplet-based on-chip sample preparation for mass spectrometry |
WO2008023771A1 (fr) * | 2006-08-23 | 2008-02-28 | Takara Bio Inc. | RÉcipient DE CULTURE, ET PROCÉDÉ D'INTRODUCTION DE GÈNE ET PROCÉDÉ DE CULTURE CELLULairE UTILISANT LE RÉcipient |
CN101668843A (zh) * | 2007-04-27 | 2010-03-10 | 东洋制罐株式会社 | 细胞培养装置、细胞培养体系及细胞培养方法 |
US20100068764A1 (en) * | 2007-02-09 | 2010-03-18 | Advanced Liquid Logic, Inc. | Droplet Actuator Devices and Methods Employing Magnetic Beads |
Family Cites Families (16)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
ES2302726T3 (es) | 2000-02-24 | 2008-08-01 | Invitrogen Corporation | Estimulacion y concentracion simultanea de celulas. |
JP4399710B2 (ja) | 2003-08-13 | 2010-01-20 | 株式会社リンフォテック | 閉鎖系細胞培養用容器及び該容器を用いた細胞の増殖培養方法、ならびに細胞増殖培養用キット |
JP4668568B2 (ja) | 2003-08-26 | 2011-04-13 | 株式会社メディネット | 培養容器、培養装置および細胞の培養方法 |
PL1663321T3 (pl) | 2003-09-22 | 2013-07-31 | Baxter Int | Wysokociśnieniowa sterylizacja do końcowego sterylizowania preparatów farmaceutycznych i wyrobów medycznych |
JP2007104975A (ja) | 2005-10-14 | 2007-04-26 | Toyo Seikan Kaisha Ltd | 培養容器および培養方法 |
CA2629532C (en) * | 2005-11-18 | 2016-08-09 | University Health Network | Method of expanding double negative t cells |
JP2007175028A (ja) | 2005-12-28 | 2007-07-12 | Koojin Bio Kk | 閉鎖系細胞培養容器、閉鎖系細胞培養用キット、及び閉鎖系細胞培養容器の製造方法 |
CN101472940B (zh) * | 2006-04-18 | 2012-11-28 | 先进液体逻辑公司 | 基于小滴的生物化学 |
CA2680061C (en) | 2006-04-18 | 2015-10-13 | Duke University | Droplet-based biochemistry |
CN101302491B (zh) * | 2007-05-09 | 2011-09-14 | 王歈 | 高效扩增活化淋巴细胞的方法和培养系统 |
JP2009055894A (ja) * | 2007-09-03 | 2009-03-19 | J-Arm Co Ltd | 活性化リンパ球を簡便に大量培養し継代する方法、およびこれに用いる培養バックへのcd3抗体の固相化方法 |
JP5464641B2 (ja) * | 2008-01-21 | 2014-04-09 | 国立大学法人 東京大学 | 制御性t細胞製造方法及び制御性t細胞増幅装置 |
WO2011052638A1 (ja) * | 2009-10-28 | 2011-05-05 | タカラバイオ株式会社 | サイトカイン誘導キラー細胞の製造方法 |
JP5740841B2 (ja) | 2010-05-19 | 2015-07-01 | 東洋製罐グループホールディングス株式会社 | 細胞培養方法、細胞培養装置、及び細胞培養装置の制御方法 |
JPWO2012008368A1 (ja) * | 2010-07-16 | 2013-09-09 | 株式会社日立製作所 | 細胞培養容器、および細胞培養装置 |
WO2016103570A1 (ja) * | 2014-12-25 | 2016-06-30 | 東洋製罐グループホールディングス株式会社 | 培養容器、及び培養容器の製造方法 |
-
2014
- 2014-12-16 KR KR1020167015319A patent/KR101828926B1/ko active IP Right Grant
- 2014-12-16 CN CN201710264731.0A patent/CN107267383A/zh active Pending
- 2014-12-16 EP EP14871598.0A patent/EP3085767B1/en active Active
- 2014-12-16 WO PCT/JP2014/006252 patent/WO2015093041A1/ja active Application Filing
- 2014-12-16 CN CN201480057477.1A patent/CN105658784B/zh active Active
- 2014-12-16 EP EP18188496.6A patent/EP3421587B1/en active Active
- 2014-12-16 ES ES14871598T patent/ES2703227T3/es active Active
-
2016
- 2016-06-16 US US15/184,649 patent/US11884907B2/en active Active
-
2022
- 2022-01-06 US US17/570,021 patent/US20220127556A1/en active Pending
- 2022-01-06 US US17/569,901 patent/US20220127554A1/en active Pending
- 2022-01-06 US US17/569,943 patent/US20220127555A1/en active Pending
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2007136386A2 (en) * | 2005-06-06 | 2007-11-29 | The Regents Of The University Of California | Droplet-based on-chip sample preparation for mass spectrometry |
US20070243634A1 (en) * | 2006-04-18 | 2007-10-18 | Pamula Vamsee K | Droplet-based surface modification and washing |
WO2008023771A1 (fr) * | 2006-08-23 | 2008-02-28 | Takara Bio Inc. | RÉcipient DE CULTURE, ET PROCÉDÉ D'INTRODUCTION DE GÈNE ET PROCÉDÉ DE CULTURE CELLULairE UTILISANT LE RÉcipient |
US20100068764A1 (en) * | 2007-02-09 | 2010-03-18 | Advanced Liquid Logic, Inc. | Droplet Actuator Devices and Methods Employing Magnetic Beads |
CN101668843A (zh) * | 2007-04-27 | 2010-03-10 | 东洋制罐株式会社 | 细胞培养装置、细胞培养体系及细胞培养方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US11884907B2 (en) | 2024-01-30 |
KR101828926B1 (ko) | 2018-02-13 |
EP3085767B1 (en) | 2018-10-31 |
US20220127554A1 (en) | 2022-04-28 |
EP3421587B1 (en) | 2021-05-19 |
CN105658784A (zh) | 2016-06-08 |
US20160289624A1 (en) | 2016-10-06 |
EP3421587A1 (en) | 2019-01-02 |
CN105658784B (zh) | 2018-12-11 |
WO2015093041A1 (ja) | 2015-06-25 |
KR20160077209A (ko) | 2016-07-01 |
US20220127556A1 (en) | 2022-04-28 |
EP3085767A1 (en) | 2016-10-26 |
EP3085767A4 (en) | 2017-11-01 |
ES2703227T3 (es) | 2019-03-07 |
US20220127555A1 (en) | 2022-04-28 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20220127556A1 (en) | Culture container, method for culturing lymphocytes, culture-container production method, and solid-phasing apparatus | |
KR101489014B1 (ko) | 세포배양장치, 세포배양시스템 및 세포배양방법 | |
JP5740841B2 (ja) | 細胞培養方法、細胞培養装置、及び細胞培養装置の制御方法 | |
JP2016504024A (ja) | 細胞培養のための受容体 | |
KR880002997A (ko) | 세포 배양방법 및 그의 기구 | |
CN111511898A (zh) | 细胞培养方法及装置 | |
JP2014128247A (ja) | 細胞培養容器、細胞培養用具、及び細胞培養方法 | |
JP2007097407A (ja) | 細胞製造方法及び細胞培養装置 | |
JP6241257B2 (ja) | 培養容器、及びリンパ球の培養方法 | |
JP6844260B2 (ja) | 培養容器、及び培養容器の製造方法 | |
CN205216828U (zh) | 一种多通道并行筛选活性物质的装置 | |
CN103207232A (zh) | 一种利用周期脉动磁场研究蛋白质结晶的装置 | |
JP6452020B1 (ja) | ビトリゲル膜乾燥体の製造方法及び製造装置 | |
WO2018066287A1 (ja) | 細胞培養容器、細胞培養システム、細胞培養方法、及び細胞培養容器の製造方法 | |
JP6326811B2 (ja) | 培養容器の製造方法、及び固相化装置 | |
CN115747059A (zh) | 一种细胞组织培养环境模拟装置 | |
RU2021350C1 (ru) | Установка для культивирования клеток или микроорганизмов | |
Juergensmeyer et al. | Effect of vibration on bacterial growth and antibiotic resistance | |
TW201303010A (zh) | 固定化發酵材料之製造方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |