JP4399710B2 - 閉鎖系細胞培養用容器及び該容器を用いた細胞の増殖培養方法、ならびに細胞増殖培養用キット - Google Patents
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Description
図1にあらわしたような閉鎖系本体容器1からなる培養用フラスコに10cm×8cmの大きさで天面の一部を電気カッターで切り取って方形の開口部を開口させる。 さらにフラスコ容器本体1内に空気を吹き付けて切り屑を取り除いた後、上記開口部上に13cm×10cmのフィルター(三菱化学株式会社社製:エクセポール(商品名):KH2055M)を切り取った穴をふさぐように接着剤にて貼り合わせた。
ダルベッコりん酸緩衝液(以下PBS(−)と略すこともある)で5μg/mlに調製しておいたOKT3溶液(ヤンセン協和株式会社製)を、上記1で作製した培養用閉鎖系フラスコ内に10ml入れ、底面に溶液を均一に浸した。
ダルベッコりん酸緩衝液で5μg/mlに調製しておいたOKT3溶液を、前記した閉鎖系培養用フラスコ内に10ml入れ、底面に溶液を均一に浸した。 一晩冷蔵庫で保存後、開放系フラスコのOKT3溶液を抜き取った。 生理食塩水50mlをフラスコに注ぎ込み激しく振った後、液を捨てた。再度、生理食塩水50mlをフラスコに注ぎ込み激しく振った後、液を捨て、使用直前まで冷蔵庫で使用直前まで保存した。
健常人から末梢血50mlをヘパリン加採血した。
上記4で採血した末梢血に等量のRPMI1640培地を加え、予め数本の遠心管(15ml)に分注しておいたリンホセパールI(免疫生物研究所製)に重層し、1800rpmで15分間遠心した。 遠心後、リンパ球層をピペットにより集め、RPMI1640培地30mlと混和後、2本に分注し、遠心分離を行なった(1800rpm、10分間)。
上記5.において、細胞数測定用にサンプリングした細胞懸濁液10μlを20μlのトリパンブルー溶液と混合し、血球計算版に10μlアプライし、顕微鏡下で細胞数を測定した。
上記5.において16日目の細胞懸濁液をサンプリングし、遠心機を用い、6000rpm、4℃で5分間遠心し、細胞を沈殿させた。 上清をきれいに吸い取った後、PBS(−)8μl、CD3/HLA―DR抗体8μlとCD4/CD8抗体8μlをそれぞれのチューブに入れ良く攪拌した後、4℃で30分間反応させた。
2 気体透過性シート
3 ネジ蓋
4 チューブ
5 サンプリング口
6 培地供給ユニット
Claims (15)
- 閉鎖系容器本体とネジ蓋を有する閉鎖系細胞培養用容器において閉鎖系容器本体の少なくとも一部が気体透過性シートによって形成されており、かつネジ蓋上の穴に固定して培地供給用チューブを設け、該チューブの途中にサンプリング口が設けられていることを特徴とした閉鎖系細胞培養用容器。
- 気体透過性シートのポアサイズが0.01μm〜1.2μmの範囲内である請求項1記載の閉鎖系細胞培養用容器。
- 気体透過性シートのポアサイズが0.1μm〜0.2μmの範囲内である請求項1記載の閉鎖系細胞培養用容器。
- 気体透過性シートが透明性を有する請求項1〜3のいずれか1に記載の閉鎖系細胞培養用容器。
- 気体透過性シートがポリオレフィン類等のプラスチック材であるところの請求項1〜4のいずれか1に記載の閉鎖系細胞培養用容器。
- ネジ蓋上の穴に固定した培地供給用チューブが他端を培地供給ユニット内に臨ませているところの請求項1〜5のいずれか1に記載の閉鎖系細胞培養用容器。
- 閉鎖系容器本体の内底面には抗体を固相化できるものであるところの請求項1〜6に記載の閉鎖系細胞培養用容器。
- 閉鎖系容器本体の内底面に固相化できる抗体が、抗CD3抗体であるところの請求項7に記載の閉鎖系細胞培養用容器。
- 閉鎖系容器本体の少なくとも一部が気体透過性シートによって形成されている請求項1〜8に記載の閉鎖系細胞培養用容器において、閉鎖系容器本体にCD3抗体を固相化し、培養用培地を入れて細胞の増殖をおこなうようにした細胞の増殖培養方法。
- インターロイキンー2の存在下に細胞の増殖培養をすることを特徴とする請求項9に記載の細胞の増殖培養方法。
- 増殖培養を行なう細胞が末梢血由来細胞または臍帯血由来細胞あるいは骨髄由来細胞である請求項9および10に記載の細胞の増殖培養方法。
- 増殖培養を行なう細胞がTリンパ球である請求項9〜11のいずれか1に記載の細胞の増殖培養方法。
- 閉鎖系細胞培養用容器において閉鎖系容器本体の少なくとも一部が気体透過性シートによって形成されており、かつネジ蓋上の穴に固定して培地供給用チューブを設け、該チューブの途中にはサンプリング口が設けられていることを特徴とした閉鎖系細胞培養用容器と、細胞培養用培地とからなる細胞増殖培養用キット。
- 培養用培地がインターロイキンー2を含有するものである請求項13に記載の細胞増殖培養用キット。
- 閉鎖系細胞培養用容器において閉鎖系容器本体の少なくとも一部が気体透過性シートによって形成されている閉鎖系細胞培養用容器と、細胞培養用培地と、インターロイキンー2を含有する培養補助剤とからなる細胞増殖培養用キット。
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