JP6043934B2 - 抗原特異的細胞傷害性t細胞の調製キット - Google Patents
抗原特異的細胞傷害性t細胞の調製キット Download PDFInfo
- Publication number
- JP6043934B2 JP6043934B2 JP2009166630A JP2009166630A JP6043934B2 JP 6043934 B2 JP6043934 B2 JP 6043934B2 JP 2009166630 A JP2009166630 A JP 2009166630A JP 2009166630 A JP2009166630 A JP 2009166630A JP 6043934 B2 JP6043934 B2 JP 6043934B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- antigen
- port
- cells
- medium
- container
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims description 249
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims description 249
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims description 249
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 title claims description 198
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 114
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 208
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 claims description 152
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 120
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 109
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 109
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 claims description 92
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 88
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 70
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 claims description 57
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 52
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 41
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 33
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims description 29
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims description 23
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 23
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 claims description 17
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 15
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 14
- 102000003812 Interleukin-15 Human genes 0.000 claims description 13
- 108090000172 Interleukin-15 Proteins 0.000 claims description 13
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000003860 storage Methods 0.000 claims description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 28
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 23
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 20
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 11
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 11
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 11
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 10
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 10
- -1 NY -ESO-1 Proteins 0.000 description 9
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 9
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 8
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 8
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 8
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 7
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 7
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 7
- 108091008048 CMVpp65 Proteins 0.000 description 6
- 108010075704 HLA-A Antigens Proteins 0.000 description 6
- 102000011786 HLA-A Antigens Human genes 0.000 description 6
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 6
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 6
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 5
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 5
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 5
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 5
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 5
- 108010013476 HLA-A24 Antigen Proteins 0.000 description 4
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 4
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 4
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 4
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 3
- 101000914484 Homo sapiens T-lymphocyte activation antigen CD80 Proteins 0.000 description 3
- 102100027222 T-lymphocyte activation antigen CD80 Human genes 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- 108010021994 cytomegalovirus matrix protein 65kDa Proteins 0.000 description 3
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 3
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 3
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 2
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 2
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 2
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- LKKMLIBUAXYLOY-UHFFFAOYSA-N 3-Amino-1-methyl-5H-pyrido[4,3-b]indole Chemical compound N1C2=CC=CC=C2C2=C1C=C(N)N=C2C LKKMLIBUAXYLOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710163881 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid oxidase Proteins 0.000 description 1
- 102100035526 B melanoma antigen 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100035793 CD83 antigen Human genes 0.000 description 1
- 102100024423 Carbonic anhydrase 9 Human genes 0.000 description 1
- 241001227713 Chiron Species 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 102100039717 G antigen 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100039701 G antigen 2B/2C Human genes 0.000 description 1
- 108010074032 HLA-A2 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 102000025850 HLA-A2 Antigen Human genes 0.000 description 1
- 101000874316 Homo sapiens B melanoma antigen 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000946856 Homo sapiens CD83 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101000910338 Homo sapiens Carbonic anhydrase 9 Proteins 0.000 description 1
- 101000914324 Homo sapiens Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5 Proteins 0.000 description 1
- 101000914321 Homo sapiens Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 7 Proteins 0.000 description 1
- 101000886137 Homo sapiens G antigen 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000886151 Homo sapiens G antigen 2A Proteins 0.000 description 1
- 101001011441 Homo sapiens Interferon regulatory factor 4 Proteins 0.000 description 1
- 101001055157 Homo sapiens Interleukin-15 Proteins 0.000 description 1
- 101001002657 Homo sapiens Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000578784 Homo sapiens Melanoma antigen recognized by T-cells 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001005728 Homo sapiens Melanoma-associated antigen 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001005718 Homo sapiens Melanoma-associated antigen 2 Proteins 0.000 description 1
- 101001005719 Homo sapiens Melanoma-associated antigen 3 Proteins 0.000 description 1
- 101001005722 Homo sapiens Melanoma-associated antigen 6 Proteins 0.000 description 1
- 101001057131 Homo sapiens Melanoma-associated antigen D4 Proteins 0.000 description 1
- 101001131670 Homo sapiens PWWP domain-containing DNA repair factor 3A Proteins 0.000 description 1
- 101000617725 Homo sapiens Pregnancy-specific beta-1-glycoprotein 2 Proteins 0.000 description 1
- 101001094545 Homo sapiens Retrotransposon-like protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100030126 Interferon regulatory factor 4 Human genes 0.000 description 1
- 102100031413 L-dopachrome tautomerase Human genes 0.000 description 1
- 101710093778 L-dopachrome tautomerase Proteins 0.000 description 1
- 102100022430 Melanocyte protein PMEL Human genes 0.000 description 1
- 102100028389 Melanoma antigen recognized by T-cells 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100025050 Melanoma-associated antigen 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100025081 Melanoma-associated antigen 2 Human genes 0.000 description 1
- 102100025082 Melanoma-associated antigen 3 Human genes 0.000 description 1
- 102100025075 Melanoma-associated antigen 6 Human genes 0.000 description 1
- 108010037274 Member 9 Tumor Necrosis Factor Receptor Superfamily Proteins 0.000 description 1
- 102000011769 Member 9 Tumor Necrosis Factor Receptor Superfamily Human genes 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101710160107 Outer membrane protein A Proteins 0.000 description 1
- 102100021768 Phosphoserine aminotransferase Human genes 0.000 description 1
- 102100022019 Pregnancy-specific beta-1-glycoprotein 2 Human genes 0.000 description 1
- 108010072866 Prostate-Specific Antigen Proteins 0.000 description 1
- 101800001271 Surface protein Proteins 0.000 description 1
- 102000003627 TRPC1 Human genes 0.000 description 1
- 102000003425 Tyrosinase Human genes 0.000 description 1
- 108060008724 Tyrosinase Proteins 0.000 description 1
- 108700025316 aldesleukin Proteins 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 230000000139 costimulatory effect Effects 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008260 defense mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000009795 derivation Methods 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 1
- 102000056003 human IL15 Human genes 0.000 description 1
- 108010036050 human cationic antimicrobial protein 57 Proteins 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000012792 lyophilization process Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 1
- 238000003672 processing method Methods 0.000 description 1
- 229940087463 proleukin Drugs 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
- C12M23/02—Form or structure of the vessel
- C12M23/14—Bags
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0636—T lymphocytes
- C12N5/0638—Cytotoxic T lymphocytes [CTL] or lymphokine activated killer cells [LAK]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M33/00—Means for introduction, transport, positioning, extraction, harvesting, peeling or sampling of biological material in or from the apparatus
- C12M33/04—Means for introduction, transport, positioning, extraction, harvesting, peeling or sampling of biological material in or from the apparatus by injection or suction, e.g. using pipettes, syringes, needles
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0636—T lymphocytes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/515—Animal cells
- A61K2039/5158—Antigen-pulsed cells, e.g. T-cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/23—Interleukins [IL]
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Hematology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Sustainable Development (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Clinical Laboratory Science (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
そこで本発明は、抗原特異的CTLの調製における操作性、経済性及び安全性の更なる改善を図り、CTL療法の実用化を促すことを課題とする。
[1]抗原特異的細胞傷害性T細胞を誘導する第1工程と、抗原提示用活性化T細胞を調製する第2工程と、前記第1工程によって誘導された抗原特異的細胞傷害性T細胞と前記第2工程によって調製された抗原提示用活性化T細胞を用いて抗原特異的細胞傷害性T細胞を増殖させる第3工程とを含む抗原特異的細胞傷害性T細胞調製法に用いる調製キットであって、
前記第1工程用の構成要素として、
(1−1)注入容器に収容された抗原ペプチド含有培地と、
(1−2)少なくとも二つの、注入容器に収容されたIL-2含有培地と、
(1−3)別途調製される末梢血単核球注入用の第1ポートと、前記抗原ペプチド含有培地注入用の第2ポートと、前記IL-2含有培地の数と少なくとも同数の、前記IL-2含有培地注入用の第3ポートと、誘導された抗原特異的細胞傷害性T細胞移出用の第4ポートとを備えた密封型培養容器と、を備え、
前記第2工程用の構成要素として、
(2−1)注入容器に収容された抗CD3抗体含有培地と、
(2−2)少なくとも二つの、注入容器に収容されたIL-2含有培地と、
(2−3)注入容器に収容された抗原ペプチド含有培地と、
(2−4)別途調製される末梢血単核球注入用の第1ポートと、前記抗CD3抗体含有培地注入用の第2ポートと、前記IL-2含有培地の数と少なくとも同数の、前記IL-2含有培地注入用の第3ポートと、前記抗原ペプチド含有培地注入用の第4ポートと、調製された抗原提示用活性化T細胞移出用の第5ポートとを備えた密封型培養容器と、を備え、
前記第3工程用の構成要素として、
(3−1)注入容器に収容された抗原特異的細胞傷害性T細胞分離用培地と、
(3−2)注入容器に収容された抗原提示用活性化T細胞分離用培地と、
(3−3)誘導された抗原特異的細胞傷害性T細胞移入用の第1ポートと、排液用の第2ポートと、前記抗原特異的細胞傷害性T細胞分離用培地注入用の第3ポートと、分離後の抗原特異的細胞傷害性T細胞移出用の第4ポートとを備えた第1密封型分離容器と、
(3−4)調製された抗原提示用活性化T細胞移入用の第1ポートと、排液用の第2ポートと、前記抗原提示用活性化T細胞分離用培地注入用の第3ポートと、分離後の抗原提示用活性化T細胞移出用の第4ポートとを備えた第2密封型分離容器と、
(3−5)少なくとも二つの、注入容器に収容された増殖用培地であって、IL-2又はIL-15或いはこれら両方を含有する増殖用培地と、
(3−6)分離後の抗原特異的細胞傷害性T細胞移入用の第1ポートと、分離後の抗原提示細胞移入用の第2ポートと、別途調製される血清又は血漿注入用の第3ポートと、前記増殖用培地の数と少なくとも同数の、前記増殖用培地注入用の第4ポートと、増殖した抗原特異的細胞傷害性T細胞移出用の第5ポートとを備えた密封型培養容器と、を備える、調製キット。
[2]前記(1−2)のIL-2含有培地の数が3〜5である、[1]に記載の調製キット。
[3]前記(2−2)のIL-2含有培地の数が3〜6である、[1]又は[2]に記載の調製キット。
[4]前記(3−1)の抗原特異的細胞傷害性T細胞分離用培地と前記(3−2)の抗原提示用活性化T細胞分離用培地がIL-2含有培地である、[1]〜[3]のいずれか一項に記載の調製キット。
[5]前記(1−3)の密封型培養容器の第1ポート〜第3ポート、前記(2−4)の密封型培養容器の第1ポート〜第4ポート、並びに前記(3−6)の密封型培養容器の第3ポート及び第4ポートのそれぞれについて2種類のキャップが備えられ、該2種類のキャップは、未使用時に装着されているキャップと、該キャップと識別可能なキャップであって、使用後に装着されるキャップとからなる、請求項1〜4のいずれか一項に記載の調製キット。
[6]前記(1−3)の密封型培養容器の第3ポート、前記(2−4)の密封型培養容器の第3ポート、及び前記(3−6)の密封型培養容器の第4ポートがそれぞれ分岐型ポートである、[1]〜[5]のいずれか一項に記載の調製キット。
[7]前記(1−3)の密封型培養容器、前記(2−4)の密封型培養容器、及び前記(3−6)の密封型培養容器がそれぞれ予備用ポートを備える、[1]〜[6]のいずれか一項に記載の調製キット。
[8]容器に収容された末梢血単核球調製用培地を更に備える、[1]〜[7]のいずれか一項に記載の調製キット。
[9]末梢血単核球調製用の容器を更に備える、[8]に記載の調製キット。
[10]第3工程によって増殖した抗原特異的細胞傷害性T細胞を分離するための分離容器を更に備える、[1]〜[9]のいずれか一項に記載の調製キット。
[11]前記分離容器を用いて分離した細胞を凍結保存するための保存容器を更に備える、[10]に記載の調製キット。
[12]抗原特異的細胞傷害性T細胞を誘導する第1工程と、抗原提示細胞を調製する第2工程と、前記第1工程によって誘導された抗原特異的細胞傷害性T細胞と前記第2工程によって調製された抗原提示細胞を用いて抗原特異的細胞傷害性T細胞を増殖させる第3工程とを含む抗原特異的細胞傷害性T細胞調製法に用いる調製キットであって、
前記第1工程用の構成要素として、
(1−1)注入容器に収容された抗原ペプチド含有培地と、
(1−2)少なくとも二つの、注入容器に収容されたIL-2含有培地と、
(1−3)別途調製される末梢血単核球注入用の第1ポートと、前記抗原ペプチド含有培地注入用の第2ポートと、前記IL-2含有培地の数と少なくとも同数の、前記IL-2含有培地注入用の第3ポートと、誘導された抗原特異的細胞傷害性T細胞移出用の第4ポートとを備えた密封型培養容器と、を備え、
前記第2工程用の構成要素として、容器に収容された凍結乾燥状態の抗原提示細胞を備え、
前記第3工程用の構成要素として、
(3−1)注入容器に収容された抗原特異的細胞傷害性T細胞分離用培地と、
(3−2)誘導された抗原特異的細胞傷害性T細胞移入用の第1ポートと、排液用の第2ポートと、前記抗原特異的細胞傷害性T細胞分離用培地注入用の第3ポートと、分離後の抗原特異的細胞傷害性T細胞移出用の第4ポートとを備えた第1密封型分離容器と、
(3−3)少なくとも二つの、注入容器に収容された増殖用培地であって、IL-2又はIL-15或いはこれら両方を含有する増殖用培地と、
(3−4)分離後の抗原特異的細胞傷害性T細胞移入用の第1ポートと、調製した抗原提示細胞移入用の第2ポートと、別途調製される血清又は血漿注入用の第3ポートと、前記増殖用培地の数と少なくとも同数の、前記増殖用培地注入用の第4ポートと、増殖した抗原特異的細胞傷害性T細胞移出用の第5ポートとを備えた密封型培養容器と、を備える、調製キット。
[13][1]〜[12]のいずれか一項に記載の調製キットを用いることを特徴とする、抗原特異的細胞傷害性T細胞の調製法。
この工程では末梢血単核球より、特定の抗原に特異的なCTLを誘導する。当該工程の実施のため、本発明の調製キットは少なくとも以下の要素(1−1)〜(1−3)を含む。
(1−1)注入容器に収容された抗原ペプチド含有培地
(1−2)少なくとも二つの、注入容器に収容されたIL-2含有培地
(1−3)別途調製される末梢血単核球注入用の第1ポートと、前記抗原ペプチド含有培地注入用の第2ポートと、前記IL-2含有培地の数と少なくとも同数の、前記IL-2含有培地注入用の第3ポートと、誘導された抗原特異的細胞傷害性T細胞移出用の第4ポートとを備えた密封型培養容器
注入容器の形態は、培地を保持できるとともに、収容物である培地を後述の密封型培養容器に注入可能である限り特に限定されない。例えば密栓可能な注射器(シリンジ)を注入容器として利用すればよい。
eagle medium)等)に抗原ペプチドを添加することによって抗原ペプチド含有培地を調製することができる。血清、血漿、血清アルブミン、抗生物質、L-glutamine等も添加することにしてもよい。培地中の抗原ペプチドの量は例えば0.01μg/mL〜100μg/mLである。抗原ペプチド含有培地の量については例えば5 mL〜50 mLとする。抗原ペプチド含有培地の量に合わせて注入容器の大きさを決定すればよい。例えば、5mLの抗原ペプチド含有培地を用いるのであれば5mL用の注射器を注入容器として採用すればよい。
注入容器の構成は(1−1)の場合と同様であるのでその説明を省略する。注入容器にはIL-2含有培地が収容されている。T細胞の培養に適した培地(例えばRPMI1640、AIM-V、ダルベッコ変法イーグル培地(Dulbecco's modified eagle medium)、X-VIVO(BioWhittaker社)、ALyS505N((株)細胞科学研究所)等)にIL-2を添加することによってIL-2含有培地を調製することができる。血清、血漿、血清アルブミン、抗生物質、L-glutamine等も添加することにしてもよい。IL-2として組換えヒトIL-2(例えばChiron社が提供するPROLEUKIN)を用いることが好ましい。IL-2の含量は例えば10 IU/mL〜1,000IU/mLである。
密封型培養容器は少なくとも4種類のポート(第1〜第4ポート)を備える。第1ポートは、別途調製される末梢血単核球の注入用ポートである。同様に、第2ポートは抗原ペプチド含有培地の注入用ポートであり、第3ポートはIL-2含有培地の注入用ポートであり、第4ポートは誘導された抗原特異的細胞傷害性T細胞移出用の注入用ポートである。
この工程では末梢血単核球より、抗原提示用活性化T細胞を調製する。当該工程の実施のため、本発明の調製キットは少なくとも以下の要素(2−1)〜(2−4)を含む。尚、「抗原提示用活性化T細胞」とは、末梢血単核球に対して特定の刺激を加えることによって細胞表面に副刺激因子を発現する細胞であって、抗原特異的CTLの増殖を促す抗原提示細胞として機能する細胞である。本発明の調製キットを用いた場合、抗CD3抗体の使用によって抗原提示用活性化T細胞が調製されることになる。尚、説明の便宜上、以下では「抗原提示用活性化T細胞」を「抗原提示細胞」と略称する。
(2−1)注入容器に収容された抗CD3抗体含有培地
(2−2)少なくとも二つの、注入容器に収容されたIL-2含有培地
(2−3)注入容器に収容された抗原ペプチド含有培地
(2−4)別途調製される末梢血単核球注入用の第1ポートと、前記抗CD3抗体含有培地注入用の第2ポートと、前記IL-2含有培地の数と少なくとも同数の、前記IL-2含有培地注入用の第3ポートと、前記抗原ペプチド注入用の第4ポートと、調製された抗原提示用活性化T細胞移出用の第5ポートとを備えた密封型培養容器
抗CD3抗体含有培地に使用する抗CD3抗体は、CD3分子又はその一部を用いた免疫学的手法により調製することができる。市販の抗CD3抗体を用いることもできる。市販の抗CD3抗体の例はOKT-3抗体(ヤンセンファーマ株式会社)である。安全性の点から薬事承認を受けているOKT-3抗体を用いることが好ましい。尚、抗CD3抗体はモノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよい。但し、特異性や効率の点を考慮すれば、モノクローナル抗体である抗CD3抗体を用いることが好ましい。2種類以上の抗CD3抗体を併用することも可能である。
(1−2)のIL-2含有培地と同様に二つ以上のIL-2含有培地が備えられる。好ましくはIL-2含有培地の数を3以上とする。更に好ましくはIL-2含有培地の数を4以上とする。具体的には例えばIL-2含有培地の数を3〜6とする。IL-2含有培地の数が増えれば、抗原提示細胞の調製工程において培地を追加できる回数が増加する。これによって調製効率の向上及び/又は調製される細胞数の増加が図られる。
当該抗原ペプチド含有培地については、(1−1)の抗原ペプチド含有培地と同様であるのでその説明を省略する。
この密封型容器は少なくとも5種類のポート(第1〜第5ポート)を備える。第1ポートは、別途調製される末梢血単核球の注入用ポートである。同様に、第2ポートは抗CD3抗体含有培地注入用のポートであり、第3ポートはIL-2含有培地の注入用ポートであり、第4ポートは抗原ペプチド含有培地の注入用ポートであり、第5ポートは調製された抗原提示用活性化T細胞の移出用ポートである。
この工程では、第1工程によって誘導された抗原特異的CTLと第2工程によって調製された抗原提示細胞とを用いて抗原特異的CTLを増殖させる。当該工程の実施のため、本発明の調製キットは少なくとも以下の要素(3−1)〜(3−6)を含む。
(3−1)注入容器に収容された抗原特異的細胞傷害性T細胞(CTL)分離用培地
(3−2)注入容器に収容された抗原提示細胞分離用培地
(3−3)誘導された抗原特異的細胞傷害性T細胞移入用の第1ポートと、排液用の第2ポートと、前記抗原特異的細胞傷害性T細胞分離用培地注入用の第3ポートと、分離後の抗原特異的細胞傷害性T細胞移出用の第4ポートとを備えた第1密封型分離容器
(3−4)調製された抗原提示細胞移入用の第1ポートと、排液用の第2ポートと、前記抗原提示細胞分離用培地注入用の第3ポートと、分離後の抗原提示細胞移出用の第4ポートとを備えた第2密封型分離容器
(3−5)少なくとも二つの、注入容器に収容された増殖用培地であって、IL-2又はIL-15或いはこれら両方を含有する増殖用培地
(3−6)分離後の抗原特異的細胞傷害性T細胞移入用の第1ポートと、分離後の抗原提示細胞移入用の第2ポートと、別途調製される血清又は血漿注入用の第3ポートと、前記増殖用培地の数と少なくとも同数の、前記増殖用培地注入用の第4ポートと、増殖した抗原特異的細胞傷害性T細胞移出用の第5ポートとを備えた密封型培養容器
抗原特異的CTL分離用培地及び抗原提示細胞分離用培地はいずれも、T細胞の培養に適した培地(例えばRPMI1640、AIM-V、ダルベッコ変法イーグル培地(Dulbecco's modified
eagle medium)、X-VIVO(BioWhittaker社)、ALyS505N((株)細胞科学研究所)等)であればよい。好ましくはIL-2又はIL-15が添加された培地を用いる。IL-2とIL-15の両者が添加された培地を用いることにしてもよい。IL-2を添加する場合、その含量は例えば10 IU/mL〜1,000 IU/mLである。IL-15を添加する場合、その含量は例えば10 ng/mL〜100 ng/mLである。IL-15として組換えヒトIL-15(例えばCellGenix社が提供するCellGro IL-15)を用いることが好ましい。血清、血漿、血清アルブミン、抗生物質、L-glutamine等も添加された培地を用いることにしてもよい。抗原特異的CTL分離用培地及び抗原提示細胞分離用培地の組成が同一である必要はない。典型的には、抗原特異的CTL分離用培地と抗原提示細胞分離用培地を各一つ用意するが、後述のように分離の際に洗浄工程を実施する場合には、それに合わせて必要な数の培地を用意する。
第1密封型分離容器は、誘導された抗原特異的CTLの分離に利用される。第1密封型分離容器は少なくとも4種類のポート(第1〜第4ポート)を備える。第1ポートは誘導された抗原特異的CTLの移入用ポートである。同様に、第2ポートは排液用のポートであり、第3ポートは抗原特異的細胞傷害性T細胞分離用培地の注入用ポートであり、第4ポートは分離後のCTLの移出用ポートである。各ポートの形態等は特に限定されない。例えば、第3ポートをルアーロックタイプのポートとする。
第2密封型分離容器は、調製された抗原提示細胞の分離に利用される。第2密封型分離容器は少なくとも4種類のポート(第1〜第4ポート)を備える。第1ポートは、調製された抗原提示細胞の移入用ポートである。同様に、第2ポートは排液用のポートであり、第3ポートは抗原提示細胞分離用培地の注入用ポートであり、第4ポートは分離後の抗原提示細胞の移出用ポートである。第1密封型分離容器と同様、各ポートの形態等は特に限定されない。例えば、第3ポートをルアーロックタイプのポートとする。尚、ここでの「分離」については、第1密封型分離容器の場合と同様であるのでその説明を省略する。
二つ以上の増殖用培地が備えられる。好ましくは当該培地の数を3以上とする。具体的には例えば当該培地の数を5〜7とする。培地の数が増えれば、CTL増殖工程において培地を追加できる回数が増加する。これによって増殖効率の向上及び/又は回収される細胞の数の増加が図られる。増殖用培地は、IL-2又はIL-15或いはこれら両方を含有する。IL-2の含量は例えば10 IU/mL〜1,000
IU/mLである。他方、IL-15の含量は例えば10
ng/mL〜100 ng/mLである。
この密封型容器は少なくとも5種類のポート(第1〜第5ポート)を備える。第1ポートは分離後の抗原特異的CTLの移入用ポートである。同様に、第2ポートは分離後の抗原提示細胞の移入用ポートであり、第3ポートは別途調製される血清又は血漿の注入用ポートであり、第4ポートは増殖用培地の注入用ポートであり、第5ポートは増殖した抗原特異的CTLの移出用ポートである。
この工程では最初に、第1ポートから末梢血単核球を、第2ポートから抗原ペプチド含有培地(1−1)をそれぞれ密封型培養容器(1−3)に注入する。この操作の後、T細胞の培養に適した条件(典型的には37℃、5%CO2)に設定したインキュベータ内へ密封型培養容器を移す。所定時間(例えば1日〜4日)経過後、インキュベータから密封型培養容器を取り出し、第3ポートの一つからIL-2含有培地(1−2)を注入する。インキュベータ内で所定時間(例えば2〜7日)培養した後、第3ポートの一つ(但し未使用のもの)からIL-2含有培地(1−2)を再び密封型培養容器に注入する。その後、インキュベータ内での培養を継続する。IL-2含有培地を二つ含む調製キットを使用する場合は、この後、後述の抗原特異的CTLの増殖工程に移る。IL-2含有培地を三つ以上含む調製キットを使用する場合には、抗原特異的CTLの増殖工程に移る前に、IL-2含有培地の注入操作及びそれに続く培養が所定回数(IL-2含有培地の数に合わせて1回又は2回以上)繰り返されることになる。IL-2含有培地の注入操作を行ってから次のIL-2含有培地の注入操作を行うまでの間隔は例えば1日〜6日である。1回目の注入操作と2回目の注入操作の間隔を5日とし、2回目の注入操作と3回目の注入操作の間隔を3日とする例のように、ここでの間隔を必ずしも統一する必要はない。尚、末梢血単核球の調製は常法で行えばよい。但し、末梢血単核球の調製用の要素を含むキットの場合は、末梢血単核球の調製の際にもキットを利用することになる。
この工程では最初に、第1ポートから末梢血単核球を、第2ポートから抗CD3抗体含有培地(2−1)をそれぞれ密封型培養容器(2−4)に注入する。この操作の後、T細胞の培養に適した条件(典型的には37℃、5%CO2)に設定したインキュベータ内へ密封型培養容器を移す。所定時間(例えば1日〜4日)経過後、インキュベータから密封型培養容器を取り出し、第3ポートの一つからIL-2含有培地(2−2)を密封型培養容器に注入する。好ましくは、ここでの注入操作には、後に使用するIL-2含有培地よりもIL-2濃度が低いものを使用する。インキュベータ内で所定時間(例えば2〜7日)培養した後、第3ポートの一つ(但し未使用のもの)からIL-2含有培地(2−2)を再び注入する。その後、インキュベータ内での培養を継続する。IL-2含有培地を二つ含む調製キットを使用する場合は、この後、第4ポートを用いて抗原ペプチド含有培地の注入操作を行う。当該注入操作の後、密封型培養容器を所定時間(例えば30分〜2時間)放置する。この間、密封型培養容器を傾けるなどして所定間隔(例えば15分間隔)で撹拌するとよい。この後、後述の抗原特異的CTLの増殖工程に移る。IL-2含有培地を三つ以上含む調製キットを使用する場合には、抗原ペプチド含有培地の注入操作の前に、IL-2含有培地の注入操作及びそれに続く培養が所定回数(IL-2含有培地の数に合わせて1回又は2回以上)繰り返されることになる。尚、IL-2含有培地の注入操作を行ってから次のIL-2含有培地の注入操作を行うまでの間隔は例えば1日〜6日である。1回目の注入操作と2回目の注入操作の間隔を3日とし、2回目の注入操作と3回目の注入操作の間隔を2日とする例のように、ここでの間隔を必ずしも統一する必要はない。
この工程では最初に、抗原特異的CTLの誘導工程で誘導された抗原特異的CTLと抗原提示細胞の調製工程で調製された抗原提示細胞をそれぞれ回収する。抗原特異的CTLの回収には、密封型培養容器(1−3)の第4ポートを用いる。通常は、チューブなどを利用して当該第4ポートを第1密封型分離容器(3−3)の第1ポートに連結し、直接、第1密封型分離容器内に抗原特異的CTLを回収する。第4ポートにチューブが付属された密封型培養容器(1−3)を用いた場合、別途チューブを用意することなく抗原特異的CTLの回収を行うことができる。
この工程では、凍結乾燥状態の抗原提示細胞を浸潤状態に復元する。この処理のことを本明細書では「再構成」とも呼ぶ。当該工程の実施のため、本発明の調製キットは少なくとも、凍結乾燥状態の抗原提示細胞を含む。「凍結乾燥状態の抗原提示細胞」とは、所定の抗原による誘導化によって抗原提示能を獲得した細胞であって凍結乾燥状態のものをいう。「凍結乾燥状態の抗原提示細胞」は、抗原提示細胞の調製及びそれに続く凍結乾燥処理によって調製することができる。例えば、樹状細胞や末梢血単核球より常法に従って抗原提示細胞を調製することができる。また、K562細胞等より抗原提示細胞を調製することもできる。好ましくは、所定のHLA(例えばHLA-A24)、CD80、CD83及びCD86を発現させたK562細胞を抗原提示細胞として用いる。抗原提示細胞の凍結乾燥処理は、細胞懸濁液中にトレハロースが存在する条件下で行うと良い。抗原提示細胞の調製及び凍結乾燥処理の具体例を後述の実施例の欄に示す。凍結乾燥処理の一例が米国特許5,059,518に記載されている。当該処理方法に準じて凍結乾燥処理を実施することにしてもよい。尚、当該文献の内容は参照により本明細書に組み込まれる。
この工程では、第1工程によって誘導された抗原特異的CTLと第2工程によって調製された抗原提示細胞とを用いて抗原特異的CTLを増殖させる。当該工程の実施のため、本発明の調製キットは少なくとも以下の要素(3−1)〜(3−4)を含む。
(3−1)注入容器に収容された抗原特異的細胞傷害性T細胞分離用培地
(3−2)誘導された抗原特異的細胞傷害性T細胞移入用の第1ポートと、排液用の第2ポートと、前記抗原特異的細胞傷害性T細胞分離用培地注入用の第3ポートと、分離後の抗原特異的細胞傷害性T細胞移出用の第4ポートとを備えた第1密封型分離容器
(3−3)少なくとも二つの、注入容器に収容された増殖用培地であって、IL-2又はIL-15或いはこれら両方を含有する増殖用培地
(3−4)分離後の抗原特異的細胞傷害性T細胞移入用の第1ポートと、調製した抗原提示細胞移入用の第2ポートと、別途調製される血清又は血漿注入用の第3ポートと、前記増殖用培地の数と少なくとも同数の、前記増殖用培地注入用の第4ポートと、増殖した抗原特異的細胞傷害性T細胞移出用の第5ポートとを備えた密封型培養容器
培養用バッグ1・・1個
ルアーロックシリンジに収容された抗原ペプチド含有培地10(0.01% ヒト血清アルブミン及び2μg/mL
CMVpp65(抗原ペプチド)含有のHepes緩衝RPMI1640)5 mL・・1本
ルアーロックシリンジに収容されたIL-2含有培地11(0.01%ヒト血清アルブミン及び100 IU/mL IL-2含有のHepes緩衝RPMI1640)10 mL・・1本
ルアーロックシリンジに収容されたIL-2含有培地12(100 IU/mL IL-2含有のALyS505N((株)細胞科学研究所)20
mL・・3本
培養用バッグ21・・1個
ルアーロックシリンジに収容された抗CD3抗体含有培地30(0.01% ヒト血清アルブミン及び2 μg/mL OKT-3(抗CD3抗体)含有のHepes緩衝RPMI1640)5 mL・・1本
ルアーロックシリンジに収容されたIL-2含有培地31(100 IU/mL IL-2含有のHepes緩衝RPMI1640)10
mL・・1本
ルアーロックシリンジに収容された抗原ペプチド含有培地32(0.01% ヒト血清アルブミン及び2μg/mL
CMVpp65(抗原ペプチド)含有のHepes緩衝RPMI1640)10 mL・・1本
ルアーロックシリンジに収容されたIL-2含有培地33(1000 IU/mL IL-2含有のALyS505N((株)細胞科学研究所))20 mL・・4本
分離用バッグ(41a、41b)・・2個
ルアーロックシリンジに収容されたIL-2含有培地50(100 IU/mL IL-2含有のALyS505N((株)細胞科学研究所))20
mL・・2本
培養用バッグ51・・1個
ルアーロックシリンジに収容された増殖用培地61(1000 IU/mL IL-2含有のALyS505N((株)細胞科学研究所))20 mL・・3本
分離用バッグ(41a、41b)の材質はポリエチレンとした。
(1)CTL誘導工程(図6)
(a)末梢血単核球(PBMC)の単離
HLA-A24陽性健常人より末梢血を、ヘパリンを少量加えた注射筒を用いて50 mL 採取し、フィコール比重遠心分離法にてPBMCを単離した(4×107)。
PBMCを単離する際、血漿を採取し、56℃、20分間、加熱処理した後、2500rpmで10分間遠心処理した。
図示の通り、バッグ培地(0.01% ヒト血清アルブミン及び10μg/mLゲンタシン含有のHepes緩衝RPMI1640培地)を用いてPBMCを洗浄した後、バッグ培地を4mL採取し、PBMCと懸濁させた。さらに、自己血漿を1mL加えた(PBMC濃度 6×106/mL)。
RPMI1640培地に懸濁したPBMCを、ルアーロックシリンジを用いてポート2より培養用バッグ1に注入した(図1を参照)。続いて抗原ペプチド含有培地10を3分岐ポート3(又は3分岐ポート4)のいずれかのポートより培養用バッグ1に注入した後、培養用バッグ1を37℃、5%CO2のCO2インキュベータ内に移した(培養開始)。尚、一度使用したポートについてはキャップ6に代えてキャップ7が装着され、再び使用されることはない。
(a)RPMI1640培地へのPBMCの懸濁
(1)の(a)で用意したPBMC(0.5mL)にバッグ培地を3.6mLと自己血漿を0.9mL添加した(PBMC濃度 6×105/mL)。
RPMI1640培地に懸濁したPBMCを、ルアーロックシリンジを用いてポート22より培養用バッグ21に注入した(図2を参照)。続いて抗CD3抗体含有培地30を3分岐ポート23(又は3分岐ポート24)のいずれかのポートより培養用バッグ21に注入した後、培養用バッグ21を37℃、5%CO2のCO2インキュベータ内に移した(培養開始)。尚、一度使用したポートについてはキャップ26に代えてキャップ27が装着され、再び使用されることはない。
抗原ペプチド含有培地32を3分岐ポート23(又は3分岐ポート24)のいずれかのポート(但し、使用済みポートを除く)から培養用バッグ21に注入した。その後、室温で1時間インキュベートした。
(a)抗原提示細胞と抗原特異的CTLの分離
分離用バッグ41bのポート42bに連結されたプラスチック針を培養用バッグ21のポート25に挿入し、培養用バッグ21の内容物を分離用バッグ41bに移した(図3を参照)。ポート42bのクランプを閉じた後(チューブをシーラーなどで溶着することにしてもよい)、分離用バッグ41bを遠心処理に供した。2分岐ポート43bのクランプを開いた状態でバッグを押圧し、2分岐ポートの排液口45bより上清を廃棄した後、IL-2含有培地50を2分岐ポートの注入口46bより分離用バッグ41bに注入した。一方、分離用バッグ41aのポート42aに連結されたプラスチック針を、上記工程(1)を経た後の培養用バッグ1のポート5に挿入し、培養用バッグ1の内容物を分離用バッグ41aに移した後、上記操作と同様の操作(遠心処理、排液、IL-2含有培地50の注入)を行った。
培養用バッグ51のポート54に連結されたプラスチック針の片方59を分離用バッグ41aのポート44aに挿入し、分離用バッグ41aの内容物を培養用バッグ51に移した(図3及び4を参照)。同様に、プラスチック針60を分離用バッグ41bのポート44bに挿入し、分離用バッグ41bの内容物を培養用バッグ51に移した。続いて、工程(1)の(b)で用意した自己血漿を、ルアーロックシリンジを用いてポート52より培養用バッグ51に注入した後、培養用バッグ51を37℃、5%CO2のCO2インキュベータ内に移した(培養開始)。1日後に培養用バッグ51を取り出した。次に、増殖用培地61を3分岐ポート53のいずれかのポートより培養用バッグ51に注入した。尚、一度使用したポートについてはキャップ56に代えてキャップ57が装着され、再び使用されることはない。CO2インキュベータ内で3日間培養した後、増殖用培地61を3分岐ポート53のいずれかのポート(但し、使用済みポートを除く)より培養用バッグ51に注入した。その後、培養(2日間)、増殖用培地61の注入、及び培養(1日間)をこの順序で行った。以上の操作により、工程(1)及び(2)における培養開始から21日という短時間で抗原特異的CTLを得た。得られた細胞をフローサイトメトリー解析に供した。その結果、純度74.39%のHLA-A24拘束性CMV pp65抗原特異的CTLが3.26×108個得られていることがわかった(図10)。即ち、21日間(但し、PBMC及び血漿の調製に要する時間を除く)という短時間にも拘わらず高純度の抗原特異的CTLの調製に成功した。
培養用バッグ1・・1個
ルアーロックシリンジに収容された抗原ペプチド含有培地10(0.01% ヒト血清アルブミン及び2μg/mL
CMVpp65(抗原ペプチド)含有のHepes緩衝RPMI1640)5 mL・・1本
ルアーロックシリンジに収容されたIL-2含有培地11(0.01%ヒト血清アルブミン及び100 IU/mL IL-2含有のHepes緩衝RPMI1640)10 mL・・1本
ルアーロックシリンジに収容されたIL-2含有培地12(100 IU/mL IL-2含有のALyS505N((株)細胞科学研究所)20
mL・・3本
容器(この例ではバイアル)に収容された凍結乾燥状態の抗原提示細胞70・・1本
(1)末梢血単核球の単離
ヘパリンを少量加えた注射筒を用い、HLA-A24陽性の健常人より末梢血を採取した。そして、フィコール比重遠心分離法にて末梢血単核球を単離した。
(2)培養開始
10mL
RPMI1640で3回洗浄した後、4×105/mLとなるように末梢血単核球を10mL
RPMI1640(10% 自己血漿及び1μg/mL OKT-3を含有する)に再懸濁し、培養バッグに注入した。CO2インキュベータ内で37℃にて培養を開始した。
(3)IL-2の添加
2日後、10mL RPMI1640(100 IU/mL IL-2を1μg/mL含有する)を注入し、3日間、CO2インキュベータ内(37℃)にて培養した。
(4)ALyS505N(IL-2を1000 IU/mL含有する)培地の添加
ALyS505N(IL-2を1000 IU/mL含有する)培地を20mL添加した後、3日おきにALyS505N(IL-2を1000 IU/mL含有する)培地(20mL)を加えながら9日間、CO2インキュベータ内(37℃)で培養した(総培養日数14日間)。
(5)細胞数の測定
細胞数を測定した結果、1.53×108個の細胞が得られていた。
(6)CD80、CD86の検出
細胞表面抗原の発現を調べた結果、80%の細胞がCD80陽性であり、85%の細胞がCD86陽性であった(結果を図示せず)。
(7)エピトープペプチドのパルス
上記で調製した抗原提示細胞をPRMI1640に2×106/mLとなるように再懸濁した後、HLA-A24拘束性CMV pp65抗原エピトープペプチド(QYDPVLAALF)を10μg/mLとなるように添加した。室温で30分間インキュベーションした後、10 mL RPMI1640で3回洗浄した。
(8)凍結乾燥
ペプチドをパルスした細胞を2×106/mLとなるように、10%トレハロースを含有するISOTON(登録商標)IIIに再懸濁した。1 mLずつ凍結乾燥用バイアルに分注した後、図19に示す条件で凍結乾燥を実施した。
分離用バッグ41a・・1個
ルアーロックシリンジに収容されたIL-2含有培地50(100 IU/mL IL-2含有のALyS505N((株)細胞科学研究所))20
mL・・1本
培養用バッグ71・・1個
ルアーロックシリンジに収容された増殖用培地61(1000 IU/mL IL-2含有のALyS505N((株)細胞科学研究所))20 mL・・3本
(1)脱イオン水の添加
バイアル70に1 mLの脱イオン水を加え、5分間室温で放置する。
(2)洗浄
1mL のRPMI1640(0.05% HSA)の入った15mL 遠心チューブに移し、1200rpm 10分間、室温で遠心する。上清を吸引除去後、1mLのRPMI1640(5%自己血漿)を添加し、細胞を懸濁させる。
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
2 ルアーロックポート
3、4 3分岐ルアーロックポート
5 移出用ポート
6、7、8 キャップ
10 抗原ペプチド含有培地(5 mL)
11 IL-2含有培地(10 mL)
12 IL-2含有培地(20 mL)
21 培養用バッグ
22 ルアーロックポート
23、24 3分岐ルアーロックポート
25 移出用ポート
26、27、28 キャップ
30 抗CD3抗体含有培地(5 mL)
31 IL-2含有培地(10 mL)
32 抗原ペプチド含有培地(10 mL)
33 IL-2含有培地(20 mL)
41a、41b 分離用バッグ
42a、42b 移入用ポート
43a、43b 2分岐ルアーロックポート
44a、44b 移出用ポート
50 IL-2含有培地
51 培養用バッグ
61 増殖用培地
62 移入・移出用チューブ
63 分注用3分岐チューブ
70 バイアル(凍結乾燥状態の抗原提示細胞を含む)
Claims (13)
- 抗原特異的細胞傷害性T細胞を誘導する第1工程と、抗原提示用活性化T細胞を調製する第2工程と、前記第1工程によって誘導された抗原特異的細胞傷害性T細胞と前記第2工程によって調製された抗原提示用活性化T細胞を用いて抗原特異的細胞傷害性T細胞を増殖させる第3工程とを含む抗原特異的細胞傷害性T細胞調製法に用いる調製キットであって、
前記第1工程用の構成要素として、
(1−1)注入容器に収容された抗原ペプチド含有培地と、
(1−2)少なくとも二つの、注入容器に収容されたIL-2含有培地と、
(1−3)別途調製される末梢血単核球注入用の第1ポートと、前記抗原ペプチド含有培地注入用の第2ポートと、前記IL-2含有培地の数と少なくとも同数の、前記IL-2含有培地注入用の第3ポートと、誘導された抗原特異的細胞傷害性T細胞移出用の第4ポートとを備えた密封型培養容器と、を備え、
前記第2工程用の構成要素として、
(2−1)注入容器に収容された抗CD3抗体含有培地と、
(2−2)少なくとも二つの、注入容器に収容されたIL-2含有培地と、
(2−3)注入容器に収容された抗原ペプチド含有培地と、
(2−4)別途調製される末梢血単核球注入用の第1ポートと、前記抗CD3抗体含有培地注入用の第2ポートと、前記IL-2含有培地の数と少なくとも同数の、前記IL-2含有培地注入用の第3ポートと、前記抗原ペプチド含有培地注入用の第4ポートと、調製された抗原提示用活性化T細胞移出用の第5ポートとを備えた密封型培養容器と、を備え、
前記第3工程用の構成要素として、
(3−1)注入容器に収容された抗原特異的細胞傷害性T細胞分離用培地と、
(3−2)注入容器に収容された抗原提示用活性化T細胞分離用培地と、
(3−3)誘導された抗原特異的細胞傷害性T細胞移入用の第1ポートと、排液用の第2ポートと、前記抗原特異的細胞傷害性T細胞分離用培地注入用の第3ポートと、分離後の抗原特異的細胞傷害性T細胞移出用の第4ポートとを備えた第1密封型分離容器と、
(3−4)調製された抗原提示用活性化T細胞移入用の第1ポートと、排液用の第2ポートと、前記抗原提示用活性化T細胞分離用培地注入用の第3ポートと、分離後の抗原提示用活性化T細胞移出用の第4ポートとを備えた第2密封型分離容器と、
(3−5)少なくとも二つの、注入容器に収容された増殖用培地であって、IL-2又はIL-15或いはこれら両方を含有する増殖用培地と、
(3−6)分離後の抗原特異的細胞傷害性T細胞移入用の第1ポートと、分離後の抗原提示細胞移入用の第2ポートと、別途調製される血清又は血漿注入用の第3ポートと、前記増殖用培地の数と少なくとも同数の、前記増殖用培地注入用の第4ポートと、増殖した抗原特異的細胞傷害性T細胞移出用の第5ポートとを備えた密封型培養容器と、を備える、調製キット。 - 前記(1−2)のIL-2含有培地の数が3〜5である、請求項1に記載の調製キット。
- 前記(2−2)のIL-2含有培地の数が3〜6である、請求項1に記載の調製キット。
- 前記(3−1)の抗原特異的細胞傷害性T細胞分離用培地と前記(3−2)の抗原提示用活性化T細胞分離用培地がIL-2含有培地である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の調製キット。
- 前記(1−3)の密封型培養容器の第1ポート〜第3ポート、前記(2−4)の密封型培養容器の第1ポート〜第4ポート、並びに前記(3−6)の密封型培養容器の第3ポート及び第4ポートのそれぞれについて2種類のキャップが備えられ、該2種類のキャップは、未使用時に装着されているキャップと、該キャップと識別可能なキャップであって、使用後に装着されるキャップとからなる、請求項1〜4のいずれか一項に記載の調製キット。
- 前記(1−3)の密封型培養容器の第3ポート、前記(2−4)の密封型培養容器の第3ポート、及び前記(3−6)の密封型培養容器の第4ポートがそれぞれ分岐型ポートである、請求項1〜5のいずれか一項に記載の調製キット。
- 前記(1−3)の密封型培養容器、前記(2−4)の密封型培養容器、及び前記(3−6)の密封型培養容器がそれぞれ予備用ポートを備える、請求項1〜6のいずれか一項に記載の調製キット。
- 容器に収容された末梢血単核球調製用培地を更に備える、請求項1〜7のいずれか一項に記載の調製キット。
- 末梢血単核球調製用の容器を更に備える、請求項8に記載の調製キット。
- 第3工程によって増殖した抗原特異的細胞傷害性T細胞を分離するための分離容器を更に備える、請求項1〜9のいずれか一項に記載の調製キット。
- 前記分離容器を用いて分離した細胞を凍結保存するための保存容器を更に備える、請求項10に記載の調製キット。
- 抗原特異的細胞傷害性T細胞を誘導する第1工程と、抗原提示細胞を調製する第2工程と、前記第1工程によって誘導された抗原特異的細胞傷害性T細胞と前記第2工程によって調製された抗原提示細胞を用いて抗原特異的細胞傷害性T細胞を増殖させる第3工程とを含む抗原特異的細胞傷害性T細胞調製法に用いる調製キットであって、
前記第1工程用の構成要素として、
(1−1)注入容器に収容された抗原ペプチド含有培地と、
(1−2)少なくとも二つの、注入容器に収容されたIL-2含有培地と、
(1−3)別途調製される末梢血単核球注入用の第1ポートと、前記抗原ペプチド含有培地注入用の第2ポートと、前記IL-2含有培地の数と少なくとも同数の、前記IL-2含有培地注入用の第3ポートと、誘導された抗原特異的細胞傷害性T細胞移出用の第4ポートとを備えた密封型培養容器と、を備え、
前記第2工程用の構成要素として、容器に収容された凍結乾燥状態の抗原提示細胞を備え、
前記第3工程用の構成要素として、
(3−1)注入容器に収容された抗原特異的細胞傷害性T細胞分離用培地と、
(3−2)誘導された抗原特異的細胞傷害性T細胞移入用の第1ポートと、排液用の第2ポートと、前記抗原特異的細胞傷害性T細胞分離用培地注入用の第3ポートと、分離後の抗原特異的細胞傷害性T細胞移出用の第4ポートとを備えた第1密封型分離容器と、
(3−3)少なくとも二つの、注入容器に収容された増殖用培地であって、IL-2又はIL-15或いはこれら両方を含有する増殖用培地と、
(3−4)分離後の抗原特異的細胞傷害性T細胞移入用の第1ポートと、調製した抗原提示細胞移入用の第2ポートと、別途調製される血清又は血漿注入用の第3ポートと、前記増殖用培地の数と少なくとも同数の、前記増殖用培地注入用の第4ポートと、増殖した抗原特異的細胞傷害性T細胞移出用の第5ポートとを備えた密封型培養容器と、を備える、調製キット。 - 請求項1〜12のいずれか一項に記載の調製キットを用いることを特徴とする、抗原特異的細胞傷害性T細胞の調製法。
Priority Applications (6)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2009166630A JP6043934B2 (ja) | 2008-10-31 | 2009-07-15 | 抗原特異的細胞傷害性t細胞の調製キット |
EP09823325.7A EP2351826A4 (en) | 2008-10-31 | 2009-10-29 | KIT FOR THE PREPARATION OF A CYTOTOXIC T-LYMPHOCYTE SPECIFIC TO ANTIGEN |
US12/998,550 US20110318828A1 (en) | 2008-10-31 | 2009-10-29 | Kit for preparation of antigen-specific cytotoxic lymphocytes |
PCT/JP2009/005723 WO2010050212A1 (ja) | 2008-10-31 | 2009-10-29 | 抗原特異的細胞傷害性t細胞の調製キット |
CN2009801434700A CN102203240A (zh) | 2008-10-31 | 2009-10-29 | 抗原特异性细胞毒性t细胞的制备试剂盒 |
US14/137,133 US20140127805A1 (en) | 2008-10-31 | 2013-12-20 | Method for preparation of antigen-specific cytotoxic t lymphocytes |
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2008280786 | 2008-10-31 | ||
JP2008280786 | 2008-10-31 | ||
JP2009166630A JP6043934B2 (ja) | 2008-10-31 | 2009-07-15 | 抗原特異的細胞傷害性t細胞の調製キット |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2010130999A JP2010130999A (ja) | 2010-06-17 |
JP6043934B2 true JP6043934B2 (ja) | 2016-12-14 |
Family
ID=42128583
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2009166630A Active JP6043934B2 (ja) | 2008-10-31 | 2009-07-15 | 抗原特異的細胞傷害性t細胞の調製キット |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US20110318828A1 (ja) |
EP (1) | EP2351826A4 (ja) |
JP (1) | JP6043934B2 (ja) |
CN (1) | CN102203240A (ja) |
WO (1) | WO2010050212A1 (ja) |
Families Citing this family (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US9206394B2 (en) | 2010-02-03 | 2015-12-08 | The University Of Tokyo | Method for reconstructing immune function using pluripotent stem cells |
JP6164746B2 (ja) * | 2012-05-22 | 2017-07-19 | 国立大学法人 東京大学 | 抗原特異的t細胞の製造方法 |
AR097781A1 (es) * | 2013-09-30 | 2016-04-13 | Weyerhaeuser Nr Co | Cosecha de cultivo en sistema biorreactor automatizado |
CN107002018B (zh) * | 2014-12-25 | 2019-12-03 | 东洋制罐集团控股株式会社 | 培养容器以及培养容器的制造方法 |
JP3203186U (ja) * | 2015-12-28 | 2016-03-17 | 株式会社北里バイオファルマ | 密度勾配遠心分離法用精子洗浄濃縮キット |
WO2020032179A1 (ja) * | 2018-08-10 | 2020-02-13 | 国立大学法人京都大学 | Cd3陽性細胞の製造方法 |
JP7414002B2 (ja) * | 2018-08-16 | 2024-01-16 | ニプロ株式会社 | 培地容器包装品 |
CN109593703B (zh) * | 2018-11-07 | 2021-06-29 | 广州瑞贝斯药业有限公司 | 一种细胞培养方法及系统 |
EP4174163A4 (en) | 2020-07-28 | 2024-01-24 | University of Yamanashi | FROZEN EGG CULTURE APPARATUS AND FROZEN EGG CULTURE METHOD |
Family Cites Families (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4829002A (en) * | 1986-05-12 | 1989-05-09 | Baxter International Inc. | System for metering nutrient media to cell culture containers and method |
US4937194A (en) * | 1986-05-12 | 1990-06-26 | Baxter International Inc. | Method for metering nutrient media to cell culture containers |
US5059518A (en) | 1988-10-20 | 1991-10-22 | Coulter Corporation | Stabilized lyophilized mammalian cells and method of making same |
US5712137A (en) * | 1990-03-05 | 1998-01-27 | Smith & Nephew Plc | Laminate of a culture substrate on a carrier for producing an apertured wound dressing |
US5512480A (en) * | 1994-03-11 | 1996-04-30 | Baxter International Inc. | Flow-through bioreactor with grooves for cell retention |
DE19707497A1 (de) * | 1996-08-16 | 1998-02-19 | Boehringer Mannheim Gmbh | Reaktionsbeutelvorrichtung zur Durchführung von mehrstufigen Kultivierungs/Separations-Vorgängen und/oder Reaktionen |
CA2430771A1 (en) * | 2000-12-07 | 2002-06-13 | I.D.M. Immuno-Designed Molecules | Dehydrated antigen presenting cells usable for vaccination |
US7491526B2 (en) * | 2002-08-19 | 2009-02-17 | Olympus Corporation | Incubator and culture device |
AU2004234627A1 (en) * | 2003-05-02 | 2004-11-11 | Insception Bioscience, Inc. | Apparatus and methods for amplification of blood stem cell numbers |
JP4399710B2 (ja) * | 2003-08-13 | 2010-01-20 | 株式会社リンフォテック | 閉鎖系細胞培養用容器及び該容器を用いた細胞の増殖培養方法、ならびに細胞増殖培養用キット |
WO2008023786A1 (fr) * | 2006-08-25 | 2008-02-28 | Medical & Biological Laboratories Co., Ltd. | Procédé destiné à produire des lct virus-spécifiques |
JP4377927B2 (ja) | 2007-05-11 | 2009-12-02 | 三井住商建材株式会社 | 木質建築部材の接合構造体 |
JP2009166630A (ja) | 2008-01-15 | 2009-07-30 | Mitsubishi Cable Ind Ltd | 車両用電装システム |
GB0817990D0 (en) * | 2008-10-02 | 2008-11-05 | Reinnervate Ltd | Cell culture vessel |
JP2012147678A (ja) * | 2009-05-14 | 2012-08-09 | Otake:Kk | 一検体用多重培養装置 |
-
2009
- 2009-07-15 JP JP2009166630A patent/JP6043934B2/ja active Active
- 2009-10-29 WO PCT/JP2009/005723 patent/WO2010050212A1/ja active Application Filing
- 2009-10-29 EP EP09823325.7A patent/EP2351826A4/en not_active Withdrawn
- 2009-10-29 CN CN2009801434700A patent/CN102203240A/zh active Pending
- 2009-10-29 US US12/998,550 patent/US20110318828A1/en not_active Abandoned
-
2013
- 2013-12-20 US US14/137,133 patent/US20140127805A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20110318828A1 (en) | 2011-12-29 |
JP2010130999A (ja) | 2010-06-17 |
EP2351826A4 (en) | 2013-09-04 |
CN102203240A (zh) | 2011-09-28 |
WO2010050212A1 (ja) | 2010-05-06 |
EP2351826A1 (en) | 2011-08-03 |
US20140127805A1 (en) | 2014-05-08 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6043934B2 (ja) | 抗原特異的細胞傷害性t細胞の調製キット | |
US11618878B2 (en) | Aseptic tissue processing method, kit and device | |
AU2020408017A1 (en) | Devices and methods for isolating tumor infiltrating lymphocytes and uses thereof | |
ES2626492T3 (es) | Procedimiento para la expansión de células t | |
US10927344B2 (en) | Semi-static cell culture | |
US20180250379A1 (en) | Generation of hpv-specific t-cells | |
CN109628397B (zh) | 一种nk细胞体外扩增培养的方法 | |
CN106177931B (zh) | 免疫检测点双阻断ctl高效率杀伤细胞制剂的制备方法 | |
CN108379569B (zh) | 高效荷载肿瘤抗原的dc疫苗及其诱导扩增肿瘤抗原特异性ctl的方法 | |
WO2021223274A1 (zh) | 免疫细胞体外培养、诱导、激活、冻存方法及其细胞库建立 | |
US20100092445A1 (en) | Adoptive immune cells for tumor vaccines | |
WO1998007829A1 (de) | Anwendung von flexiblen plastikgefässen in der gentherapie | |
KR20210095157A (ko) | 개선된 표현형 속성을 갖는 t 세포 조성물 | |
JP2014516538A (ja) | 調節された免疫優勢療法 | |
AU2011291477B2 (en) | Cells expressing Th1 characteristics and cytolytic properties | |
WO2008023786A1 (fr) | Procédé destiné à produire des lct virus-spécifiques | |
WO2023178845A1 (zh) | 纯化t细胞的方法及其用途 | |
Elias et al. | Closed system generation of dendritic cells from a single blood volume for clinical application in immunotherapy | |
Pira et al. | Positive selection and expansion of cytomegalovirus-specific CD4 and CD8 T cells in sealed systems: potential applications for adoptive cellular immunoreconstitution | |
Senesac et al. | Dendritic cells transfected with adenoviral vectors as vaccines | |
CN113728231A (zh) | 提供免疫细胞的方法 | |
CN109722386A (zh) | 一种dc-cik细胞的诱导活化试剂盒及其应用方法 | |
WO2001077302A1 (en) | Method for obtaining specific t-lymphocytes, and for identifying unknown epitopes | |
WO2006011681A1 (ja) | 白血球培養用血液の保存方法、輸送方法、末梢血単核球の保存方法、輸送方法及びそれらを用いた白血球の培養方法 | |
Stroncek et al. | CAR T-Cell: Cell Processing Laboratory Considerations |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20120517 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20121005 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20131203 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20140714 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20150224 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20150522 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20150529 |
|
A912 | Re-examination (zenchi) completed and case transferred to appeal board |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A912 Effective date: 20150731 |
|
A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20161008 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20161008 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20161011 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6043934 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |