JP2005110695A - 中空糸付き器具及びその使用方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 中空糸内部で細胞を培養又は保存するための簡便な中空糸付き器具及びその使用方法を提供する。
【解決手段】 一端が開口した長さ１〜60mmの細胞懸濁液流通管１と；細胞懸濁液流通管の他端に設けられた中空糸固定部３と；一端が封止され他端が開口しているとともに、開口端が細胞懸濁液流通管１と連通し中空糸固定部３に液体が漏れない状態で貫通している１〜1000本の、長さ0.5〜20cmの中空糸４とを備える中空糸付き器具。
【選択図】 図３

Description

本発明は、細胞培養、組織培養等の分野において、中空糸内で細胞を培養又は保存するための中空糸付き器具及びその使用方法に関する。

従来、接着性の動物細胞の一般的な培養法として広く用いられる単層培養法は、生体内で有していた細胞本来の分化機能を維持することが困難であり、細胞は生存または増殖するものの、急速に分化機能を消失することがよく知られている。このため、いったん生体外に分離した細胞を使用して、組織を生体外で再構築させることにより細胞の分化機能発現を高める方法として、スフェロイド（球状組織体）培養方法やコラーゲンゲルを利用した３次元培養方法などの培養方法等が種々開発されている。

生体外で組織を再構築する細胞培養方法の１つとして、透過性膜からなる中空糸の内腔において培養対象となる細胞を培養する方法がある。この方法は、細胞や細胞を含むコラーゲンゲルまたはアガロースゲルなどを中空糸内腔に封入した状態で細胞を培養することにより、細胞又は組織を３次元培養できる方法である。この方法では、中空糸内腔に細胞を入れた状態で、中空糸の外側に培養液を灌流することにより、効率良く細胞に栄養を供給するとともに細胞が排出する老廃物を除去することができる。また、細胞が中空糸膜に覆われることで、細胞を培養液の流れによる物理的傷害から守ることができるというメリットもある。

しかし、これらの培養方法は何れも生体外人工臓器を想定した大掛かりな灌流装置を使用することが必要である。すなわち、中空糸外部に培養液を灌流させるためには、中空糸を覆うハウジングや培養液の灌流を行うポンプをはじめとする特別な装置を必要とすることから、細胞の機能や代謝を調べるための試験には非常に利用し難かった。

本発明は、中空糸内腔で細胞を培養又は保存するための簡便な中空糸付き器具及びその使用方法を提供することを主目的とする。

本発明は、以下の各項の中空糸付き器具及びその使用方法を提供する。

項１． 一端が開口した細胞懸濁液流通管と；細胞懸濁液流通管の他端に設けられた中空糸固定部と；一端が封止され他端が開口しているとともに、開口端が細胞懸濁液流通管と連通し中空糸固定部に液体が漏れない状態で貫通している１本又は複数本の中空糸とを備える中空糸付き器具。

項２． 細胞懸濁液流通管の開口端が、細胞注入用器具の排液口と嵌め合わせ可能な形状を有する項１に記載の器具。

項３． 細胞懸濁液流通管が着脱可能に連結された流入側流通管と流出側流通管とからなる項１又は２に記載の器具。

項４． さらに、内部に中空糸を配置できる遠心容器を備え、遠心容器の蓋が細胞懸濁液流通管に支持されている項１又は２に記載の器具。

項５． さらに、内部に中空糸を配置できる遠心容器を備え、遠心容器の蓋が細胞懸濁液流通管の流入側流通管に支持されている項３に記載の器具。

項６． 項１から５のいずれかに記載の中空糸付き器具の細胞懸濁液流通管の開口端から細胞懸濁液を注入することにより中空糸内腔に細胞を堆積させ、細胞が堆積した中空糸を細胞培養用液又は細胞保存用液に浸漬させた状態で細胞を培養又は保存する中空糸付き器具の使用方法。

項７． 内腔に細胞が堆積した中空糸を器具の他の部分から分離して、分離した中空糸を細胞培養用液又は細胞保存用液に浸漬させた状態で細胞を培養又は保存する項６に記載の方法。

項８． 項４又は５に記載の中空糸付き器具の細胞懸濁液流通管の開口端から細胞懸濁液を注入することにより中空糸内腔に細胞を堆積させ、遠心容器内に中空糸を配置した状態で中空糸内腔の細胞に遠心力をかけることにより中空糸内腔に細胞の凝集体を形成し、細胞凝集体を保持した中空糸を細胞培養用液又は細胞保存用液に浸漬させた状態で細胞を培養又は保存する中空糸付き器具の使用方法。

項９． 内腔に細胞凝集体が形成された中空糸を器具の他の部分から分離して、分離した中空糸を細胞培養用液又は細胞保存用液に浸漬させた状態で細胞を培養又は保存する項８に記載の方法。

本発明によると、中空糸内部で細胞を培養又は保存するための簡便な中空糸付き器具及びその使用方法が提供される。

さらにいえば、本発明の器具は、従来の中空糸付き細胞培養器と異なり小型で、しかも実験用器具として汎用されている注射器、マイクロピペットのチップ等の排出口に適合できる注入口を有するため、注射器などを用いて中空糸内腔に簡単に細胞を注入することができる。

また、従来の中空糸付き細胞培養器と異なり中空糸がハウジング内に固定されておらず、細胞注入後に簡単に中空糸を露出することができるため、細胞注入後に中空糸をそのまま又は切り離して培養液又は細胞保存用液に浸漬するだけで、簡単に中空糸内腔での細胞の培養や保存を行うことができる。特に、中空糸を簡単に切り離すことができ、これにより培養又は保存し易い容器に移して培養又は保存に供することができる点が本発明の器具の特徴の一つである。すなわち、中空糸を覆うハウジングや還流装置などを必要とせず、中空糸内腔での安定した細胞培養を簡便に行うことができ、その結果、従来の単層培養やスフェロイド培養などの培養系では得られなかった細胞の長期にわたる高度な機能発現を利用した試験研究が可能となる。

また、本発明の中空糸付き器具が遠心容器を備える場合には、中空糸内腔に細胞を注入した後に、簡便に遠心力を加えることができ、これにより、容易に中空糸内腔に細胞凝集体を形成することができる。

このように、本発明の器具は、簡単に使用できるため、細胞の機能や代謝能力を調べる試験（実験）等に好適に使用できる。また、中空糸内腔での細胞の保存を簡単に行えることからも実験室レベルでの使用に適する。

以下、本発明を詳細に説明する。
（１）本発明の中空糸付き器具
基本的構成
本発明の中空糸付き器具は、一端が開口した細胞懸濁液流通管と；細胞懸濁液流通管の他端に設けられた中空糸固定部と；一端が封止され他端が開口しているとともに、開口端が細胞懸濁液流通管と連通した状態で中空糸固定部に液体が漏れない状態で貫通している１本又は複数本の中空糸とを備えることを特徴とする。
中空糸
中空糸は、細胞は通過させないが水、塩類、蛋白質などの培養液成分は通過させる通孔を有する透過性膜からなるものを採用できる。物質交換の効率を高くするため、平均孔径はできるだけ大きいことが望ましく、通常０．１〜５μｍ程度、特に０．２〜３μｍ程度が好適に採用されるが、特にこの範囲に限定されるものではない。

中空糸の内径は、特に制限されないが、通常２０〜１０００μｍ程度、特に５０〜５００μｍ程度が好ましい。中空糸の内径が余りに大きいと中空糸中心部付近の細胞における各種物質交換が困難となり、余りに小さいと充分な細胞数の注入が困難となる。本発明の範囲であればこのような問題は生じない。

中空糸を構成する半透膜の厚さは、中空糸の適度の強度及び良好な物質透過性が保たれる範囲であればよく、特に制限されないが、通常１０〜２００μｍ程度、特に２０〜１００μｍ程度が好ましい。

中空糸の長さは、特に制限されないが、通常０．５〜２０ｃｍ程度、特に１〜１０ｃｍ程度が好ましい。中空糸が余りに長いとハンドリングや細胞の注入が困難となり、余りに短いと注入できる細胞数が少なくなる。本発明の範囲であればこのような問題は生じない。

また、中空糸数は、特に限定されないが、１〜１０００本程度が好適に使用される。

中空糸は、一端が開口し他端が封止されている。封止方法は特に限定されず、例えば、後述する中空糸固定部を構成する樹脂と同様の樹脂を用いて封止したり、結紮により封止することができる。

中空糸の材料は、細胞毒性を有さず、滅菌、洗浄、培養液との接触などにより変質、分解などしない材料であればよく、特に限定されない。例えばセルロース系樹脂、ポリエチレン、ポリプロピレンのようなポリオレフィン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、フッ素樹脂、ポリカーボネート、アクリル樹脂等を採用できる。
細胞懸濁液流通管
細胞懸濁液流通管（以下、「流通管」という）は、細胞懸濁液を中空糸内腔に注入するための管である。流通管は一端に中空糸固定部が形成されており、他端が開口し細胞懸濁液注入口となっている。流通管の内径は中空糸束の太さに応じて定めればよいが、通常１〜３０ｍｍ程度とすることができる。また、流通管の長さは、１〜６０ｍｍ程度、特に２〜４０ｍｍ程度であることが好ましい。短か過ぎると中空糸内腔に細胞を均一に注入することが困難となり、長すぎると中空糸内腔に細胞を注入した後に流通管内に残ってしまう細胞数が多くなり、その分の細胞が無駄になる。本発明の範囲であればこのような問題は生じない。

流通管は、柔軟性又は可撓性を有するものであってもよく、柔軟性又は可撓性を有さない硬質のものであってもよい。

流通管の開口部の形状は、細胞懸濁液を注入するための器具（例えば注射器、マイクロピペットチップ、分注管等）の排液口に外嵌又は内嵌により連結できる形状であればよい。開口部が細胞懸濁液注入用器具の排液口と連結できない形状のものである場合には、流通管の開口部に、該開口部と細胞懸濁液注入用器具の排液口とを連結するためのアダプターを備えることができる。アダプターは、流通管の開口端に固定されていてもよく、着脱可能に連結されていてもよい。特に、アダプターは流通管の開口部に着脱可能に連結されていることが好ましく、この場合には、後述するように細胞注入後に遠心容器を取り付けて遠心機にかける際にアダプターを取り外すことができ、その分遠心時の取り扱いが容易になる。

また、流通管は、着脱可能に連結された二つの管（流入側流通管及び流出側流通管）からなるものとすることができる。この場合には、中空糸が固定された流出側流通管と、流入側流通管とを別々に滅菌処理することができるメリットがある。流入側流通管と流出側流通管とは、螺合できるものであってもよく、単に嵌め合わせられるものであってもよい。いずれにしても、細胞懸濁液が漏れ出ないように連結されていればよい。

流通管（流入側流通管と流出側流通管とを連結するための連結部材を含む）及びアダプターを構成する材料は、細胞毒性を示さず、滅菌、洗浄、培養液との接触等により変質、分解などしない材質であればよく、特に限定されない。例えばポリオレフィン樹脂、ポリエステル樹脂、ポリスチレン樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリアミド樹脂等を採用できる。

また、本発明の中空糸付き器具は、流通管の開口端を覆うキャップを備えることができる。細胞懸濁液を流通管から注入した後、流通管の開口部をキャップで覆うことにより、細胞の微生物汚染等を防止できる。
中空糸固定部
中空糸固定部は、中空糸を流通管と連通した状態で、流通管に固定するための部分である。中空糸固定部は、例えばシーラント材として公知の樹脂であって、細胞毒性を示さず、かつ滅菌、洗浄又は培養液との接触により変質又は分解しないものにより形成することができる。このような樹脂としては、例えばポリウレタン系樹脂、シリコーン系樹脂、エポキシ樹脂、ポリサルファイド系樹脂、アクリル系樹脂などの硬化型の樹脂が挙げられる。

中空糸は流通管内部と連通した状態で、中空糸固定部に液密状態（液体が漏れない状態）で貫通している。

例えば複数本の中空糸を使用して、次のようにして中空糸固定部を形成することができる。すなわち、中空糸の開口端を引き揃えてシーラント材でまとめる。次いで、シーラント材でまとめられた中空糸束を流通管の内径と同じ外径を有する樹脂チューブ内に挿入した状態で、中空糸束と樹脂チューブとの間隙をシーラント材で埋める。次いで、樹脂チューブごと中空糸を切断することにより中空糸の開口部を露出させる。さらに、中空糸が固定された樹脂チューブを中空糸の開口端を流通管内に向けて流通管内に挿入して、シーラント材で流通管と樹脂チューブとの間を封止する。
遠心容器
本発明の中空糸付き器具は、さらに、内部に中空糸を配置できる大きさを有する遠心容器を備えたものとすることができる。遠心容器内に中空糸を配置できる大きさとは、中空糸を曲げずに配置できる大きさのほか、中空糸が折れない程度に曲げた状態で配置できる大きさが含まれる。遠心容器は通常本体と蓋とからなり、蓋が流通管に支持されている。流通管が流入側流通管と流出側流通管とからなる場合には、遠心容器の蓋は流入側流通管に支持されていることが好ましい。遠心時には、遠心容器の本体に蓋を閉めることにより、中空糸を本体内部に配置した状態でそのまま遠心機にかけることができる。

本発明の中空糸付き器具は遠心容器を備えることにより、中空糸内部に細胞を注入した後に、簡便に遠心力をかけて後述する細胞凝集体を形成することができる。また、中空糸内腔に細胞懸濁液を注入する場合にも、遠心容器内に中空糸を配置した状態で簡便に注入操作を行うことができる。
（２）本発明の中空糸付き器具の使用方法
基本的構成
本発明の中空糸付き器具の第１の使用方法は、流通管の開口端から細胞懸濁液を注入することにより中空糸内腔に細胞を堆積させ、細胞が堆積した中空糸を細胞培養用液又は細胞保存用液に浸漬させた状態で細胞を培養又は保存する方法である。

本発明の中空糸付き器具の第２の使用方法は、流通管の開口端から細胞懸濁液を注入することにより中空糸内腔に細胞を堆積させ、遠心容器内に中空糸を配置した状態で中空糸内腔の細胞に遠心力をかけることにより細胞の凝集体を形成し、細胞凝集体を保持した中空糸を細胞培養用液又は細胞保存用液に浸漬させた状態で細胞を培養又は保存する方法である。
細胞
本発明方法の対象となる細胞としては、接着性の動物細胞が好適である。細胞の由来は特に限定されず、ヒト、マウス、ラット等のいずれの動物由来のものも使用できる。また、接着性の動物細胞であれば、初代培養細胞及び株化細胞の双方を対象とすることができる。初代培養細胞は、肝臓、腎臓、神経、肺等のいずれの組織由来のものであってもよいが、特に、単層培養により急激に分化機能を失うヒト肝細胞が本発明方法の対象細胞として好適である。株化細胞は、特に限定されず、ＣＨＯ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＭＲＣ−５細胞、ＢＨＫ細胞、Ｈｅｌａ細胞などの公知の細胞株やこれらの細胞に外来遺伝子を導入した細胞株などを使用できる。
前処理
中空糸内腔を培養液が円滑に通過できるようにするために、本発明の中空糸付き器具の使用前に、中空糸を親水化処理することが好ましい。親水化処理は、例えば、注射器などを用いて、流通管の開口部から７０％程度に水で希釈したエタノール、次いで水を注入することにより行える。

次いで、通常、本発明の中空糸付き器具を滅菌処理する。滅菌処理は、例えば中空糸付き器具を高圧蒸気滅菌することにより行うことができる。流通管が流入側流通管と流出側流通管とからなる場合には、両者を離した状態で滅菌することができる。これにより例えば、流入側流通管は通常の高圧蒸気滅菌を行い、中空糸を備えた流出側流通管は蒸留水に浸した状態で高圧蒸気滅菌を行うことができる。
細胞懸濁液の注入
細胞懸濁液の注入前に、中空糸内腔に細胞培養用液体培地、臓器保存用液などの細胞保存用液又は適当なバッファー等を満たしておくことが好ましい。この場合には、注射器等を用いて流通管の開口部から液体培地等を注入することにより中空糸内腔に液体培地等を満たすこともできるが、中空糸を液体培地に浸漬した状態で注射器等を用いて流通管内部を吸引することにより液体培地等を中空糸内腔に満たすこともできる。

次いで、細胞培養用液体培地、細胞保存用液又は適当なバッファー等に細胞を懸濁した細胞懸濁液を、流通管の開口部から中空糸内腔に注入する。好ましくは、中空糸内腔に予め満たした液体培地、細胞保存用液又はバッファーを用いて細胞懸濁液を調製すればよい。特に同じ組成の液体培地を使用するのが好ましい。

細胞培養用液体培地は、細胞に適したものを適宜選択すればよい。例えば、ダルベッコ改変イーグル培地、RPMI-1640培地、HamのF-12培地などの公知の基礎培地に血清、成長因子などの対象となる細胞の生育に必要な因子を添加したものを使用できる。

細胞保存用液としては、例えばEuro-Collins液、Ficoll-Collins液、ＵＷ液（特公平７−６８０８２号公報）、ラフィノース溶液等の公知の臓器保存用液等を使用することができる。

細胞懸濁液の注入は、それには限定されないが、例えば注射器、マイクロピペット又は分注器等を用いて行うことができる。細胞懸濁液を流通管の開口部から注入すると、中空糸先端が封止されているため、液体培地等が中空糸の通孔から流出し、細胞が中空糸内腔に堆積する。中空糸内腔に堆積した細胞密度は、細胞の大きさ及び中空糸の内径などにより異なるが、例えば肝細胞の場合は概ね１×１０⁷〜８×１０⁷個／ｍｌ程度となる。

遠心容器を備えた器具を用いて遠心容器内に中空糸を配置した状態で、細胞懸濁液を注入する場合には、遠心容器の蓋をゆるめた状態で注入すればよい。これにより注入操作時に他の容器を汚さずにすみ、簡便に注入操作を行うことができる。
遠心力の負荷
中空糸内腔に細胞を注入した後、中空糸付き器具に遠心容器を取り付け、遠心容器ごと遠心機にかけることにより、中空糸内腔の細胞に遠心力を負荷することができる。この場合には、遠心容器内に液体培地等を満たすことにより中空糸を液体培地等に浸漬した状態で細胞に遠心力をかけることが好ましい。これにより、遠心時に細胞が気相に曝されないため、その分細胞へのダメージが少なくなる。遠心力をかけることにより、容易に、中空糸内腔に細胞の凝集体を形成することができる。

本発明において、細胞の凝集体とは、分散された細胞の自発的な凝集ではなし得ない程度に、細胞同士が高度に接着した状態又は高頻度に接着した状態をいう。

遠心力は、細胞の凝集体を形成できるのであれば特に限定されず、細胞の種類に応じて細胞に傷害を与えない範囲で定めればよい。細胞の種類によって異なるが、概ね２〜２０００×Ｇ程度、特に４〜５００×Ｇ程度の遠心力をかけることが好ましい。例えば初代ラット肝細胞の場合、通常１５００×Ｇ以下、特に４００×Ｇ以下とすることが好ましい。初代ラット肝細胞の場合、遠心力の下限は、細胞の凝集体を形成できる範囲であればよく特に限定されないが、５×Ｇ程度である。遠心時間は、細胞凝集体を形成できる範囲で適宜設定すればよい。例えばラット肝細胞では、５０×Ｇ程度で９０秒間程度遠心力を負荷することにより５×１０⁷〜１×１０⁸cells/ml程度の密度の細胞凝集体が得られる。
細胞の培養
中空糸内腔に細胞を注入した後、あるいはさらに遠心力を負荷して中空糸内腔に細胞凝集体を形成させた後、細胞を培養に供することができる。この場合は、細胞を保持した中空糸付き器具のままで中空糸部分を培養液に浸漬して細胞培養することもできるが、中空糸を切り出した後に中空糸ごと培養液に浸漬して細胞培養することもできる。特に、細胞に好適な条件で培養を実施するため、また培養操作が容易であるために、中空糸を切り離してこれを汎用される培養用容器に移して細胞培養することが好ましい。本発明の器具では、中空糸がハウジング内に固定されている従来の中空糸付き培養器と異なり、中空糸部分を簡単に露出でき、すなわち必要とする中空糸部分を簡単に切り離せる構造をもつため、中空糸内での細胞培養を簡単に行うことができる。培養温度は、細胞の種類によっても異なるが通常３７℃程度とすればよい。

例えば、初代ラット肝細胞を中空糸内腔に注入し、遠心力を加えて中空糸内腔に細胞凝集体を形成させた後に、メスなどを用いて中空糸束を約３０ｍｍの長さに切断すれば、細胞培養に汎用されている内径３５ｍｍの培養皿内に細胞を保持した中空糸を入れて培養を行うことができる。内径２９０μｍの中空糸６本を束にして使用する場合には、中空糸内腔にある総細胞数は、約５×１０⁵個となる。

また、中空糸の切断端部をピンセットなどを用いて押し潰すことにより、中空糸内腔の細胞が外部に漏れ出てくることを防ぐこともできる。
細胞の保存
中空糸内腔に細胞を注入し、或いはさらに細胞凝集体を形成した後、中空糸を細胞培養用液体培地又は臓器保存用液のような細胞保存用液に浸漬した状態で、常温下で、細胞保存することができる。この場合は、細胞を保持した中空糸付き器具のままで中空糸部分を保存用液に浸漬して保存することもできるが、中空糸を切り出した後に中空糸ごと保存用液に浸漬して保存することもできる。特に、保存効率を上げるため、また取り扱いが容易であるために、中空糸を切り離して保存することが好ましい。本発明の器具は中空糸を容易に切り離すことができる。

保存は開放容器内で行うこともできるが、密閉容器内で行うこともできる。保存用液の種類によっても異なるが、初代ラット肝細胞の場合には、細胞凝集体の状態で少なくとも５日間程度まで細胞の諸機能を維持したままで保存することができる。

以下、本発明の実施の形態を図面を参照して説明する。

図１は、本発明の１実施形態である中空糸付き器具の断面図である。この中空糸付き器具は、円筒形の細胞懸濁液流通管１を備え、流通管１の開口端には、図示しない細胞注入用器具（ここではディスポーザブル注射器）の排液口と嵌め合わせるためのアダプター２が内嵌されている。また、流通管１の他端には硬化型樹脂で形成された中空糸固定部３が内嵌されている。また、中空糸４の束が固定部３を貫通し、各中空糸４は流通管１の内部と連通している。また、各中空糸４の他端は、硬化型樹脂５で封止されている。

この中空糸付き器具を使用するにあたっては、予め親水化処理されさらに蒸留水に浸した状態でオートクレーブ滅菌された中空糸付き器具の中空糸４を液体培地等に浸漬した状態で、図示しない注射器の排液口をアダプター２の注入口２１に嵌めて吸引する。これにより液体培地等が中空糸４及び流通管１内部に満たされる。次いで、細胞懸濁液を注射器で注入口２１から注入する。細胞懸濁液は、流通管１の内腔を通り中空糸４の開口部４１から中空糸４の内腔に入り、液体培地が中空糸４の通孔から流出し、中空糸４の内腔に細胞が堆積する。

細胞充填後に中空糸４を適当な長さに切断し、別途用意した液体培地中に中空糸４ごと浸漬して培養に供することができる。

図２は、本発明の他の実施形態である中空糸付き器具の断面図である。この中空糸付き器具は、図１の中空糸付き器具において、流通管１が、着脱可能に連結された流入側流通管１１と流出側流通管１２とからなるものである。流入側流通管１１は、可撓性材料（例えばシリコーン）からなるチューブ１１ａ及びそれに連結されたオス形状コネクター１１ｂからなる。また流出側流通管１２は可撓性材料（例えばシリコーン）からなるチューブ１２ａ及びそれに連結されたメス形状コネクター１２ｂからなる。チューブ１２ａのコネクター１２ｂが接続された側とは反対側の端に中空糸固定部３が形成されている。オス形状コネクター１１ｂとメス形状コネクター１２ｂとはここでは螺合できるものである。その他の構成は図１の中空糸付き器具と同じであり、同じ部品には同じ参照符号を付している。

この中空糸付き器具は、使用に当たり、流通管１を、中空糸４が接続された流出側流通管１２と流入側流通管１１とに分離して、各別に滅菌することができる。その後、コネクター1１ｂとコネクター１２ｂとを連結して、図１の中空糸付き器具と同様にして使用すればよい。

図３は、本発明のさらに他の実施形態である中空糸付き器具の断面図である。この中空糸付き器具は、図２の中空糸付き器具において、遠心容器６を備えたものである。遠心容器６は、本体６１と蓋６２とからなり、蓋６２は、蓋６２に設けられた孔６２ａに流通管１の流入側流通管１１のチューブ１１ａが貫通した状態でチューブ１１ａに固定されている。また、遠心容器６の本体６１は、中空糸４を内部に配置できる容積を有する。

この中空糸付き器具を使用するにあたっては、図１又は２の中空糸付き器具の場合と同様にして細胞を中空糸内腔に充填し、中空糸４を遠心容器６の本体６１内に入れて蓋６２を閉め、遠心機にかける。また、細胞充填後、遠心力の負荷前に注入口２１に図示しないキャップを被せることにより、細胞の微生物汚染を防ぐことができる。
実施例
以下、実施例を示して本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
＜中空糸付き器具の作製例＞
中空糸は、セルローストリアセテート製の血漿分離用中空糸（東洋紡績社製ＡＰ２５０Ｎ１５タイプ；内径２８５μｍ、外径３８７μｍ、膜厚５１μｍ、ポアサイズ０．２μｍ）を用いた。長さ約７ｃｍの６本の中空糸の一端をシリコンボンドで封止し、封止部５とした。他端をシリコーンボンドで接着して束ねた後、外径４ｍｍの封止部用シリコーンチューブ内に挿入した。次いで、メスで切断することにより中空糸３の開口部３１を形成した。中空糸が固定された封止部用シリコーンチューブを流出側流通管１２ａとして用いる内径４ｍｍ、長さ１５ｍｍのシリコーンチューブ内に嵌め、両管の間隙をシリコーン樹脂で埋めた。次いで、シリコンチューブ１２ａをメス形状コネクター１２ｂ（アイシス社製）に接続した。次いで、別途用意した内径２ｍｍ、長さ２０ｍｍの流入側流通管１１ａ用シリコーンチューブ及びオス形状コネクター１１ｂ（アイシス社製）からなる部分と連結した。流入側流通管１１ａ用シリコーンチューブは、内径１４ｍｍ、長さ１２０ｍｍの遠心チューブ（ファルコン社製）の蓋に設けられた孔を貫通して蓋に固定されている。

注射器を用いて７０％エタノール３ｍｌと蒸留水１０ｍｌとを中空糸３側から順次吸引することにより、中空糸３内腔を親水化処理した。次いで、コネクター部分で切り離して、流出側部分と流入側部分とを別々にオートクレーブにて滅菌処理した。流出側部分は、中空糸を蒸留水に浸した状態で滅菌した。各別に滅菌された部分をコネクター部分で接続した。

細胞凝集体の培養
遠心チューブの中に、Dulbecco's modified eagle medium（ＤＭＥＭ；ギブコ社製）１３．５ｇ／Ｌ、60ｍｇ／Ｌ プロリン、50ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ（東洋紡績社製）、１０ｍｇ／Ｌ インシュリン（シグマ社製）、７．５ｍｇ／Ｌ ヒドロコルチゾン（シグマ社製）、５０μｇ／Ｌ リノール酸（シグマ社製）、１０万Ｕ／Ｌ ペニシリンＧカリウム（ナカライテスク社製）、１００ｍｇ／Ｌ ストレプトマイシン硫酸塩（ナカライテスク社製）、１．０５ｇ／Ｌ 炭酸水素ナトリウム（ナカライテスク社製）、１．１９ｇ／Ｌ ＨＥＰＥＳ（ナカライテスク社製）からなる無血清培地（ＨＳＦＭ）を10ml入れた。これに上記例により作製した中空糸付き器具の中空糸束を浸漬し、注射器で吸引することにより中空糸内腔の気泡を除去するとともに中空糸内腔の水をＨＳＦＭに置換した。

コラゲナーゼ消化法により調製した初代ラット肝細胞を上記ＨＳＦＭに懸濁した懸濁液を作製し、総数１．０×１０⁷個の細胞を注射器を用いて、注入口から注入した。細胞注入後、注入口にキャップをし、遠心チューブごと遠心機にかけ、６０×Ｇで９０秒間の遠心力を細胞に負荷することによって中空糸内腔に細胞凝集体を形成させた。

次いで、コネクター部分で、中空糸束側の部分を取り外し、中空糸の封止された先端部分から３ｃｍの箇所で中空糸を切り取り、これを直ちに、ＨＳＦＭ２ｍｌを入れた直径３５ｍｍディッシュ（イワキガラス社製）に入れ、５％炭酸ガス、９５％大気の雰囲気下、振盪をしながら培養を行った。

比較例１

単層培養
対照として、実施例１と同じ初代ラット肝細胞の５．０×１０⁵個を、コラーゲンコートした直径３５ｍｍディッシュ（イワキガラス社製）に播種して、実施例１と同じＨＳＦＭの２ml中で実施例１と同じ条件で単層培養を行った。
＜アンモニア代謝能・アルブミン産生能の評価＞
実施例１及び比較例１のＨＳＦＭに、それぞれ１ｍＭの濃度になるようにアンモニアを添加しアンモニア濃度を自動分析機で経時的に定量することによりアンモニア代謝能を測定した。また、ＨＳＦＭ中に分泌されるアルブミン濃度を抗ラットアルブミン抗体を用いたＥＩＡ法で経時的に定量することでアルブミン産生能を測定した。

アンモニア代謝能の測定結果を図３に示し、アルブミン産生能の測定結果を図４に示す。図３及び図４から明らかなように、実施例１の細胞凝集体では、アンモニア代謝能およびアルブミン産生能とも、初期に比べて低下するものの、２ヶ月間以上の長期にわたり各機能が維持された。一方、比較例１の単層培養においては、初期の活性は実施例１の細胞凝集体と同程度であるが、培養開始１０日間後には活性が速やかに消失した。

本発明の中空糸付き器具を用いて細胞を培養することにより、長期にわたり細胞の機能を維持したままで細胞培養を行うことができることが分かる。すなわち、本発明の中空糸付き器具は、細胞の機能試験、代謝能力試験又は細胞による物質の生産試験等を行うための細胞培養又は細胞の保存に好適に使用できることが分かる。

本発明の中空糸付き器具の１実施形態の断面図である。 本発明の中空糸付き器具の他の実施形態の断面図である。 本発明の中空糸付き器具のさらに他の実施形態の断面図である。 本発明の中空糸付き器具を用いて中空糸内腔に作製した細胞凝集体（実施例１）及び単層培養による細胞（比較例１）のアンモニア代謝能の変化を示すグラフである。 本発明の中空糸付き器具を用いて中空糸内腔に作製した細胞凝集体（実施例１）及び単層培養による細胞（比較例１）のアルブミン産生能の変化を示すグラフである。

符号の説明

１ 細胞懸濁液流通管
１１ 流入側流通管
１１ａ 流入側チューブ
１１ｂ オス形状コネクター
１２ 流出側流通管
１２ａ 流出側チューブ
１２ｂ メス形状コネクター
２ アダプター
２１ 注入口
３ 中空糸固定部
４ 中空糸
５ 封止部
６ 遠心容器
６１ 遠心容器本体
６２ 遠心容器蓋
６２ａ 孔

Claims (9)

1. 一端が開口した長さ１〜60mmの細胞懸濁液流通管と；細胞懸濁液流通管の他端に設けられた中空糸固定部と；一端が封止され他端が開口しているとともに、開口端が細胞懸濁液流通管と連通し中空糸固定部に液体が漏れない状態で貫通している１〜1000本の、長さ0.5〜20cmの中空糸とを備えることを特徴とする中空糸付き器具。
2. 細胞懸濁液流通管の開口端が、細胞注入用器具の排液口と嵌め合わせ可能な形状を有する請求項１に記載の器具。
3. 細胞懸濁液流通管が着脱可能に連結された流入側流通管と流出側流通管とからなる請求項１又は２に記載の器具。
4. さらに、内部に中空糸を配置できる遠心容器を備え、遠心容器の蓋が細胞懸濁液流通管に支持されている請求項１又は２に記載の器具。
5. さらに、内部に中空糸を配置できる遠心容器を備え、遠心容器の蓋が細胞懸濁液流通管の流入側流通管に支持されている請求項３に記載の器具。
6. 請求項１から５のいずれかに記載の中空糸付き器具の細胞懸濁液流通管の開口端から細胞懸濁液を注入することにより中空糸内腔に細胞を堆積させ、細胞が堆積した中空糸を細胞培養用液又は細胞保存用液に浸漬させた状態で細胞を培養又は保存することを特徴とする中空糸付き器具の使用方法。
7. 内腔に細胞が堆積した中空糸を器具の他の部分から分離して、分離した中空糸を細胞培養用液又は細胞保存用液に浸漬させた状態で細胞を培養又は保存する請求項６に記載の方法。
8. 請求項４又は５に記載の中空糸付き器具の細胞懸濁液流通管の開口端から細胞懸濁液を注入することにより中空糸内腔に細胞を堆積させ、遠心容器内に中空糸を配置した状態で中空糸内腔の細胞に遠心力をかけることにより中空糸内腔に細胞の凝集体を形成し、細胞凝集体を保持した中空糸を細胞培養用液又は細胞保存用液に浸漬させた状態で細胞を培養又は保存することを特徴とする中空糸付き器具の使用方法。
9. 内腔に細胞凝集体が形成された中空糸を器具の他の部分から分離して、分離した中空糸を細胞培養用液又は細胞保存用液に浸漬させた状態で細胞を培養又は保存する請求項８に記載の方法。

Images