JP2016202180A - 細胞培養器、及び、細胞培養システム - Google Patents

Abstract

【課題】凝集体を培養できる技術を提供する。【解決手段】液体が導入される導入端と底面とを有し、前記液体が流れる流路と、前記流路の前記底面に形成される、細胞を収容する複数の凹部とを備え、前記複数の凹部は、前記流路の前記底面に密集して配置される、細胞培養器とする。【選択図】図２

Description

本発明は、細胞培養器、及び、細胞培養システムに関する。

糖尿病、特に１型糖尿病の治療手段として膵臓移植や膵島移植が有効であるとされる。しかし、臓器提供数の少なさや、免疫拒絶を阻害するための免疫抑制剤を服用する必要がある点などが問題とされている。膵島は、膵臓内に存在する、膵島細胞（α細胞、β細胞などの内分泌細胞をさす）が寄り集まって凝集体様の構造をした単純な組織であり、機能を果たす為に高次構造を必要としない。このため、人工的に擬似膵島を作製できる可能性が高い。

なお、本明細書中、「擬似膵島」は、生体の膵臓から摘出される膵島に対して、生体外において幹細胞から作製された組織を指す。擬似膵島は、少なくともインスリン分泌細胞をその内部に含み、例えば、細胞塊構造をとる。擬似膵島としては、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）などの幹細胞から作製されるものが挙げられるが、生体に含まれる幹細胞などその他の多能性幹細胞から作製されるものも、「擬似膵島」に含まれる。

多能性幹細胞（ＥＳ細胞（embryonic stem cells）、ｉＰＳ細胞（induced pluripotent stem cells））から膵島細胞を分化誘導する研究は、マウスやヒトに由来する細胞を用いて広くなされている。患者由来ヒトｉＰＳ細胞から膵島細胞を誘導できれば、免疫拒絶が生じない移植用膵島を作製できる可能性が高い。分化誘導は、基本的に、生体の発生段階が進行する際に生じる刺激と同様の刺激因子を含んだ培養液を培養中の多能性幹細胞へ順次供給することで実現される。

分化誘導に関する背景技術として、例えば、特許文献１に記載されたような、ＴＧＦ−βなどの刺激因子を用いて内胚葉細胞、特に膵島細胞を誘導する手法がある。また、非特許文献１や非特許文献２に記載されたような、撹拌培養法により形成した凝集体状態での膵島細胞分化誘導法がある。また、非特許文献３に記載されたような、ヒト多能性幹細胞から膵島細胞を分化誘導し、凝集体を形成させて擬似膵島を作製する方法がある。また、特許文献２に記載されたような、細胞が接着できないヒドロゲル基材によって凹部を構成し、当該凹部に播種された細胞に凝集体を形成させる方法及びデバイスがある。

米国特許第８９５９２８６号公報 特許第５０３９７１５号公報

PLoS ONE., VOL. 7, May 2012, e37004, Thomas C. Schulz 他、ジョージア大学、USA Cell. VOL. 159, Oct 2014, 428-439, Felicia W Pagliuca 他、Harvard University, USA DIABETES, VOL. 61, AUGUST 2012, 2016-2029, Alireza Rezania 他、Univ. of British Columbia, Canada

本発明は、凝集体を効率よく形成させて培養するのに適した培養器および培養システムを提供することを課題とする。一部の細胞種を分化誘導する際には、凝集体の形成を要することがある。凝集体形成の際には、凝集体の中心部は、細胞の生存に必要な酸素や栄養の供給を拡散に頼ることになるため、凝集体の大きさを均一に制御することが望ましい。

しかし、特許文献１では、細胞の運命を内胚葉系列、特に、膵島細胞へと誘導するのに必要な刺激因子は示されているが、凝集体の大きさの制御方法などについては示されていない。非特許文献１〜３の方法では、凝集体形成が細胞間の接触によってランダムに発生するため、凝集体の大きさを制御することが難しく、また、培地を交換する際に遠心分離による沈殿操作が必要とされる。特許文献２では、簡易に培養液を交換する方法について示されていない。

そこで、本発明は、凝集体を培養できる技術を提供することを目的とする。

上記課題を解決するために、以下の手段を採用する。
第１の態様は、
液体が導入される導入端と底面とを有し、前記液体が流れる流路と、
前記流路の前記底面に形成される、細胞を収容する複数の凹部とを備え、
前記複数の凹部は、前記流路の前記底面に密集して配置される、
細胞培養器である。
第１の態様によると、播種細胞数を制御し、１つの凹部に１つの細胞凝集体を（すなわち、別の細胞凝集体とは接触しない状態で）作製することができ、かつそれを各ウェルに維持した状態で培養液を逐次入れ替えることができる。複数の凹部が密集していることで、凹部以外の部分での細胞の凝集体の生成を抑え、また培養液を当該複数の凹部に略均一に供給でき、略均一の大きさの凝集体を作成できる。

第２の態様は、さらに、
前記流路は、前記液体が排出される排出端を有し、
前記流路は、幅が前記導入端から所定の長さに広がる第１領域を含み、
前記第１領域は、前記流路の底面と直交する２つの側壁面を有し、
前記２つの側壁面のいずれの位置の接面と、導入端から排出端に向かう方向とのなす角が、４５度以下である、
細胞培養器である。
第２の態様によると、液体を各凹部に一様に供給でき、略均一の大きさの細胞凝集体を各凹部に形成することができる。

第３の態様は、さらに、
前記複数の凹部の前記流路の前記底面に占める面積は、前記底面の面積の半分以上である
細胞培養器である。
第３の態様によると、凹部以外の部分での細胞の凝集体の生成を抑えて略均一の大きさの細胞凝集体を凹部内に形成することができる。

第４の態様は、さらに、
前記流路に導入される培養液の速さは、１０ｃｍ／ｓ以下である、
細胞培養器である。
第４の態様によると、凹部に収容される細胞に新鮮な培養液を一様に供給でき、略均一の大きさの細胞凝集体を各凹部に形成することができる。

第５の態様は、さらに
前記凹部の周縁が面取りされている、
細胞培養器である。
第５の態様によると、凹部以外の部分で細胞が留まりにくくなり、凹部以外の部分で細胞の凝集体が生成されにくくなり、略均一の大きさの細胞凝集体をロスを抑えて効率的に形成することができる。

第６の態様は、さらに、
前記凹部の幅は、１００μｍ以上５ｍｍ以下であり、
前記凹部の高さは、１００μｍ以上５ｍｍ以下である、
細胞培養器である。
第６の態様によると、所定の大きさの略均一の細胞凝集体を各凹部に形成することができる。

第７の態様は、
上記のいずれかの細胞培養器と、
前記細胞培養器へ導入される前記培養液の量を調整する供給装置と、
前記細胞培養器から排出される細胞及び培養液を収容する収容装置と、
を備える細胞培養システムである。
第７の態様によると、培養液を所望の速さで細胞培養器に導入でき、所定の大きさの略均一の細胞凝集体を各凹部に形成することができる。

本発明によれば、略均一の細胞凝集体を培養できる技術を提供することができる。

図１は、本実施形態の細胞培養システムの構成例を示す図である。 図２は、細胞培養器の構成例を示す分解斜視図である。 図３は、本実施形態の細胞培養器の構成例を示す図である。 図４は、図３のＸ１−Ｘ１線における、細胞培養器の断面図の例を示す図である。 図５は、図３のＹ１−Ｙ１線における、細胞培養器の断面図の例を示す図である。 図６は、複数のウェルの断面形状の例を示す図である。 図７は、ウェルの断面形状の例を示す図である。 図８は、底面部上のウェルの形状の例を示す図である。 図９は、流路の形状の例を表す図である。 図１０は、蓋の変形例を示す細胞培養器の断面図である。 図１１は、ウェルの配置の例を示す図である。 図１２は、細胞培養器の変形例を示す図である。 図１３は、本実施形態の細胞培養システムの変形例１を示す図である。 図１４は、本実施形態の細胞培養システムの変形例２を示す図である。

以下、図面を参照して実施形態について説明する。実施形態の構成は例示であり、本発明の構成は、実施形態の具体的構成に限定されない。

〔実施形態〕
本発明の実施形態として、細胞の凝集体を形成する細胞培養器を含む細胞培養システム
について説明する。細胞培養システムを用いて形成される凝集体は、例えば、膵島細胞の分化誘導に使用される。但し、実施形態に係る細胞培養システムは、目的とする分化誘導の種類に応じて細胞に刺激を与える培養液の種類を選択することで、膵島細胞を含む様々な分化誘導を得るための凝集体形成に使用可能である。すなわち、本発明の培養器及び培養システムは疑似膵島の製造以外にも使用可能であり、凝集体の形成が要求される細胞種の製造にも使用できる。

（構成例）
図１は、本実施形態の細胞培養システムの構成例を示す図である。図１の細胞培養システム１は、バッグ２、ポンプ３、細胞培養器４、廃液保存用のバッグ５を含む。バッグ２とポンプ３との間はチューブ６、ポンプ３と細胞培養器４との間はチューブ７、細胞培養器４とバッグ５との間はチューブ８により接続されている。

バッグ２は、細胞培養器４に供給される培養液を収容する。培養液は、細胞の生存に必要な酸素や栄養を含む、あるいは、細胞を所望の細胞に分化させるための刺激を与える物質を含む液体である。また、培養液として、細胞培養器４での培養対象の複数の細胞を含む培養液を用いることができる。細胞を含む培養液は、細胞懸濁液とも呼ばれる。以下、培養液と細胞懸濁液とを区別しない場合には、「培養液」との表記を用いる。また、培養液の代わりに、培養液ではない生理食塩水等の他の液体が使用されてもよい。バッグ２として、細胞培養条件に応じて成分が調整された複数種類の培養液あるいは細胞懸濁液を収容した複数のバッグ２が用意される。バッグ２は、適宜のタイミングで交換される。例えば、細胞を細胞培養器４に播種する場合に、細胞懸濁液を含むバッグ２に交換される。バッグ２は、例えば樹脂を用いて形成される。バッグ２の代わりに、培養液を収容しうるボトル等の他の容器を使用し得る。バッグ２、培養液を収容しうる容器は、収容手段の例である。

ポンプ３は、バッグ２と細胞培養器４との間に設置される。ポンプ３は、バッグ２からチューブ６を介して吸引した培養液をチューブ７に吐出する。ポンプ３の単位時間あたりの吐出量は調整可能となっており、吐出量の調整により、細胞培養器４に導入される培養液の量（流量）を制御することができる。ポンプ３は、培養液の吐出を停止することもできる。この場合、培養液の速さは一時的にゼロとなる。ポンプ３として、例えば、チュービングポンプが使用される。ポンプ３として、ロータリーポンプ、ギヤーポンプ等の他の種類のポンプが使用されてもよい。ポンプ３は、供給装置の一例である。なお、ポンプ３を細胞培養器４とバッグ５との間に配置して、バッグ２からの培養液を細胞培養器４内に引き込む構成を適用することもあり得る。バック２およびポンプ３として、培養液を収容するバッグおよび培養液を吐出するポンプが一体となったシリンジポンプ等が使用されてもよい。

細胞培養器４は、導入端と排出端とを有する流路を有する。細胞及び培養液が、導入端から導入され、排出端から排出される。導入端は、ポンプ３とチューブ等の配管を介して接続される。排出端は、バッグ５とチューブ等の配管を介して接続される。流路は、細胞が収容され培養される複数のウェル（培養ウェル）を有する。ウェルは、凹部の一例である。細胞培養器４については、後に詳述する。

廃液保存用のバッグ５は、細胞培養器４の排出端と、チューブ８を介して接続され、細胞培養器４の排出端から排出された培養液を収容（回収）する。バッグ５として、樹脂製バッグが使用され得る。バッグ５の代わりに、培養液を収容しうる樹脂製ボトル等の他の容器が使用されてもよい。バッグ５、培養液を収容しうる容器は、収容装置の例である。

チューブ６は、バッグ２とポンプ３との間を接続する配管であり、その一端がバッグ２
に接続され他端がポンプ３に接続されている。チューブ７は、ポンプ３と細胞培養器４との間を接続する配管であり、その一端がポンプ３に接続され、他端が培養器４に接続されている。チューブ８は、細胞培養器４とバッグ５との間を接続する配管であり、その一端が細胞培養器４に接続され他端がバッグ５に接続されている。チューブ６、７、８として、例えば、樹脂製のチューブが使用され得る。チューブ６、７、８として、培養液を送液しうる樹脂製のパイプ等の他の配管が使用されてもよい。

（細胞培養器の構成例）
図２は、細胞培養器の構成例を示す分解斜視図である。図３は、細胞培養器４の本体９の上面図である。図４は、図３のＸ１−Ｘ１線における、細胞培養器の断面図の例を示す図である。図５は、図３のＹ１−Ｙ１線における、細胞培養器の断面図の例を示す図である。以下、図２から図５を用いて細胞培養器４の構成について説明する。

図２に示すように、細胞培養器４は、本体９と蓋１０を備える。本体９は、長手方向（図２のＸ方向）と長手方向に直交する幅方向（図２のＹ方向）とを有する平板状に形成されている。本体９の上面には、長手方向に溝１１が形成されている。溝１１は、一端部（導入端）１２と他端部（排出端）１３と、中間部１４と、テーパ部１５と、テーパ部１６とで形成されている。一端部１２は、本体９の一端部９ａに形成されており、他端部１３は本体９の他端部９ｂに形成されており、中間部１４は、本体９の一端部９ａと他端部９ｂとの間に形成されている。テーパ部１５は、一端部１２と中間部１４とを接続し、テーパ部１６は、中間部１４と他端部１３とを接続している。中間部１４の幅の長さは一端部１２及び他端部１３の幅以上であり、テーパ部１５の幅は一端部１２から中間部１４に向かって広がっており、テーパ部１６の幅は中間部１４から他端部１３に向かって徐々に狭くなっている。細胞培養器４は、一端部１２より、テーパ部１５、中間部１４、テーパ部１６を通って他端部に至る溝１１による流路を含む。テーパ部１５、中間部１４、テーパ部１６は、それぞれ、第１領域、第２領域、第３領域の一例である。

溝１１の底面は、一端部１２から他端部１３にわたって面一な平面に形成されており、テーパ部１５、中間部１４、テーパ部１６の底面にウェルとしての複数の凹部１７（ウェル１７ともいう）が形成されている。各ウェル１７は、隣り合うウェル１７との間の距離が小さくなるようにされている。各ウェル１７は、中間部１４だけでなく、テーパ部１５やテーパ部１６にも密集して配置されている。本例では、テーパ部１５やテーパ部１６に配置されている複数のウェル１７は、その一部が、当該テーパ部の壁面に沿うように配置されている。また、液の流れ方向に並ぶウェル１７の列は、その隣の列のウェル１７と、その中心が互いにずれるように配置されている。

図３に示す例では、ウェル１７の開口部の形状は、平面視で円形である。また、図４及び図５の断面図に示すように、ウェル１７の縦断面は、半楕円形である。但し、ウェル１７の形状は、これに限定されるものではない。

ウェル１７は、所定の大きさの凝集体を形成させることができるサイズを有する。細胞がウェルの底部に沈んで凝集体を形成し易いように、ウェル１７の開口部から底部に向かうに従って、ウェル１７の開口部に平行な面の断面積が小さくなっている。ウェル１７の直径の下限は、好ましくは、１００μｍであり、より好ましくは２００μｍであり、４００μｍであってもよい。ウェル１７の直径の上限は、好ましくは５ｍｍであり、より好ましくは３ｍｍであり、８００μｍであってもよい。ウェルの高さ（深さ）の下限は、好ましくは、１００μｍであり、より好ましくは２００μｍであり、４００μｍであってもよい。ウェルの高さ（深さ）の上限は、好ましくは５ｍｍであり、より好ましくは１ｍｍであり、８００μｍであってもよい。ウェル１７のサイズには、ウェル１７の直径、高さ、容量等が含まれる。ウェル１７の直径は、ウェル１７の幅の一例である。ウェル１７の容
積は、好ましくは０．００１μｌ／ｗｅｌｌ〜１０μｌ／ｗｅｌｌであり、より好ましくは０．００１〜１μｌ／ｗｅｌｌであり、０．００５〜０．１μｌ／ｗｅｌｌであってもよい。

図１１は、ウェルの配置の例を示す図である。図１１は、ウェル１７の上面図である。図１１のように、例えば、溝１１のテーパ部１５、中間部１４、テーパ部１６の底面に想定上の正三角格子の格子点を記載する。当該正三角格子の格子間隔はウェル１７の直径以上とする。ここでは、ウェル１７の円の中心が、当該正三角格子の格子点の位置に配置される。このようにすることで、ウェル１７を溝１１のテーパ部１５、中間部１４、テーパ部１６の底面に一様に配置することができる。このとき、正三角格子の格子間隔をウェル１７の直径とほぼ等しくすることで、溝１１の底面の水平部２０（溝１１の底面においてウェル１７が存在しない部分）を小さくすることができ、ウェル１７同士を隣接して密集して配置することができる。ウェル１７は、溝１１のテーパ部１５、中間部１４、テーパ部１６の底面において、他のウェル１７と隣接して一様に配置される。溝１１におけるウェル１７の配置は、ここに示すものに限定されない。図１１の例の代わりに、ウェル１７の円の中心が、ウェル１７の直径以上の格子間隔を有する正方格子の格子点の位置に、配置されてもよい。溝１１におけるウェル１７の配置は、図１１に示すように周期的であってもよいし、非周期的であってもよい。溝１１のテーパ部１５、中間部１４、テーパ部１６の底面において、ウェル１７が占める面積は、少なくとも当該底面の面積の半分以上である。

図３に示すように、テーパ部１５の底面に直交する壁面（側壁面）は、一端部１２と中間部１４との間を平面で繋いでいる。当該壁面とＸ軸とのなす角は、一端部１２側から導入される培養液が壁面まで達するように、４５度以下とする。テーパ部１６の壁面とＸ軸とのなす角についても同様である。このような角度でテーパ部１５及びテーパ部１６の壁面を形成することで、流路に導入される培養液が流路に一様に広がって流れる。

図６は、複数のウェルの断面形状の例を示す図である。図６（ａ）の例では、ウェル１７とウェル１７との間やウェル１７の周囲に水平部２０が現れている。細胞培養において、細胞が細胞懸濁液によって細胞培養器４に播種されたときに、細胞が、ウェル１７に入らずに、水平部２０に載ることがある。このとき、細胞が載った水平部２０では、ウェル１７内で形成される細胞塊と異なる大きさの細胞塊が作製されるおそれがある。即ち、細胞培養器４内で形成される凝集体の大きさが均一にならないおそれがある。そこで、溝１１の底面においてウェル１７の周囲の水平部２０の面積が小さいことが望ましい。これにより、ウェル１７内以外で、凝集体が生成される可能性が小さくなる。

図６（ｂ）の例では、ウェル１７の周縁（上端部）が面取りされており、図６（ａ）水の水平部２０の平面の面積（例えば、図６（ａ）のＡ）に比べ、水平部２０の平面の面積（例えば、図６（ｂ）のＢ）が小さくなっている。図６（ｂ）のようにウェル１７の周縁を面取りすることで、ウェル１７とウェル１７との間に細胞が載ったとしても、いずれかのウェル１７に細胞が入る（転がり落ちる）可能性が高い。即ち、ウェル１７以外の部分において、細胞が留まりにくくなる。このとき、ウェル１７以外の部分で細胞が培養されにくくなるため、均一の細胞の凝集体が形成されやすくなる。また、ウェル１７は、溝１１のテーパ部１５、中間部１４、テーパ部１６の底面に、可能な限り配置されることで、水平部２０の面積を小さくすることができる。

蓋１０は、直方体の板状であり、本体９の溝１１を覆う。蓋１０には、貫通孔である第１孔１８、第２孔１９が形成されている。蓋１０が本体９に取り付けられた状態において、第１孔１８は溝１１の一端部１２を外部に開口させた状態となり、第２孔１９は溝１１の他端部１３を外部に開口させた状態となる。第１孔１８には、チューブ７の他端が接続
される。第２孔１９には、チューブ８の一端が接続される。蓋１０は、本体９に対して着脱自在に取り付けられるようにしてもよく、本体９に対して固定されてもよい。

蓋１０の本体９への取り付けによって、第１孔１８及び第２孔１９は、それぞれ、培養液の導入口（導入端）、排出口（排出端）として使用される。蓋１０に培養液の導入口、排出口が設けられることで、本体９の溝１１が流路として使用される。一例として、流路は、培養液で満たされるように培養液が導入端から導入され、収容しきれいない培養液は第２孔１９から溢れ出て、チューブ８を介してバッグ５に回収される。このため、本体９の上面と蓋１０の下面とは、流路に導入される培養液が外部に漏れ出ないように、接着剤やシール材、若しくはボルト締めにより、密着して接合される。導入口から流路に培養液が導入された際に、流路の上部に空気層が存在してもよい。この場合、例えば、本体９の側面に培養液の排出口を形成し、溝１１内の液面の高さが所定の高さに達したときに、排出口から培養液が溢れ出るように構成される。

本体９及び蓋１０は、ウェル１７内で非接着培養を行うため、培養表面が非接着処理されているものでもよいが、細胞を非接着状態で培養できるような素材でできていることが好ましい。そのような素材としては、三次元構造を有する細胞毒性のない親水性素材が好ましく、さらには、培養状態を観察しやすくするために透明の素材であることが好ましい。また、細胞培養器４は、二酸化炭素雰囲気中で使用されることがあるため、二酸化炭素を浸透する素材であることが好ましい。より具体的には、ハイドロゲルが好ましい。

ハイドロゲルを作製するのに用いる材料としては、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、ポリ-2- ヒドロキシエチルメタクリレート、ポリ-2- ヒドロキシエチルアクリレート、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸などの合成高分子の化学架橋体や放射照射による架橋体、さらに、上記高分子を構成するモノマーの共重合体の架橋体など、ハイドロゲルを形成することのできる各種合成高分子材料を挙げることができる。また、天然高分子であるアガロース、アルギン酸、デキストラン、セルロースなどの多糖やその誘導体、また、ゼラチンやアルブミンなどのタンパクやその誘導体の架橋体なども用いることができる。

本体９は、例えば、図２の本体９のように形成された金型を用いてＰＤＭＳ（dimethylpolysiloxane）等の樹脂製モールドを作製し、さらに、ＰＤＭＳへ転写して作製される。本体９のウェル１７を含む底面（培養表面）は、非接着処理されていることが好ましい。また、本体９及び蓋１０は、３Ｄプリンタにより一体形成されてもよい。

ウェル１７内の細胞（凝集体）を外部から観察しやすくするために、本体９及び蓋１０として、透明材料が使用されることが望ましい。さらに、細胞を免疫染色して観察する場合には、鮮明な像を観察するために、本体９及び蓋１０として、樹脂自体が蛍光を発するいわゆる自家蛍光のない材料が望ましい。ＰＤＭＳは、可視光領域の波長の光透過率が高く透明性が高い上、自家蛍光をほとんど発しないため非常に優れた材料である。近年、ＰＤＭＳの射出成形が可能となっているため、ＰＤＭＳを用いることにより低コストで大量生産することも可能である。

また、ＰＤＭＳと同様の特性を持った材料として、シクロオレフィンポリマー、シクロオレフィンコポリマーが挙げられる。このほか、射出成形で大量生産可能な透明材料として、アクリル、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポイカーボネート、ＡＢＳ樹脂、ガラス等が挙げられる。これらの材料は、本体９や蓋１０の材料として使用され得る。

本体９は、ウェル１７を含む底面部分（底面の表面部分）をハイドロゲルで作製され、
流路部分（底面の表面部分を除く部分）をＰＤＭＳ等で作製されてもよい。このとき、本体９は、例えば、ハイドロゲルによる底面部分をＰＤＭＳ等による流路部分にはめ込むことにより形成される。このように形成されることで、ハイドロゲルの乾燥を抑制することができる。

（細胞培養システムの使用例）
本実施形態の細胞培養システム１の使用例について説明する。細胞培養システム１では、細胞の凝集体が形成されて、培養される。細胞培養器４は、例えば、ＣＯ₂インキュベータなどを用いて、５％二酸化炭素雰囲気中に置かれる。また、細胞培養器４は、底面が水平になるように設置される。最初は、細胞培養器４からチューブ７が外されている。

使用者が、細胞懸濁液を、ピペット等によって、細胞培養器４の導入端に、直接、導入することにより、細胞培養器４内に細胞を播種する。細胞培養器４に導入される細胞懸濁液の量は、細胞培養器４の流路の容積よりも多い量である。細胞培養器４の流路の容積よりも多い量の細胞懸濁液を細胞培養器に導入することで、細胞培養器４の流路全体を細胞培養液で満たすことができる。また、余った細胞懸濁液は、排出端から排出されて、チューブ８を通って、バッグ５で回収される。細胞培養液を細胞培養器４に導入する速さは、細胞培養液を細胞培養器４に静置させる時間よりも十分短い時間（例えば、２秒程度）である。十分短い時間で細胞培養液を細胞培養器４に導入することで、各ウェル１７に均等に細胞を行き渡らせることができる。
なお、細胞懸濁液は、細胞培養器４の上流部に導入されることで、細胞培養器４へ導入できる。すなわち、細胞懸濁液は、バッグ２に導入され、ポンプ３を経由して細胞培養器４へ導入されてもよいし、チューブ７や細胞培養器４にポートを設け、当該ポートから、シリンジを用いて導入してもよい。

ここで使用される細胞の由来や種類は特に制限されず、真核細胞でも原核細胞でも使用できるが、哺乳動物由来の細胞が好ましく、例えば、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞や胚性幹（ＥＳ）細胞などの多能性幹細胞である。多能性幹細胞を含む細胞懸濁液は、次のように生成される。最初に、あらかじめ、接着状態で培養しておいた多能性幹細胞を培養皿で剥離し、単一細胞に解離させる。ここで、細胞を剥離する手法は特に限定されないが、例えば、トリプシンやＥＤＴＡなどの薬剤を使用することができる。そして、単一細胞に解離させられた多能性幹細胞を、目的とした細胞密度で、培養液などの中へ懸濁することにより、細胞懸濁液が調製される。

細胞懸濁液が細胞培養器４に導入されて、しばらく静置（例えば、１０分〜１時間）されると、細胞懸濁液に含まれる細胞が、細胞培養器４の溝１１において沈殿し、ウェル１７に収容される。細胞懸濁液が静置される時間は、細胞懸濁液を細胞培養器４に導入する時間よりも十分に長い。このとき、各ウェル１７のサイズが等しいので、各ウェル１７に、ほぼ等量の細胞が収容される。また、溝１１の底面の水平部２０の面積を小さくするように形成されているので、ウェル１７以外の場所に細胞は沈殿しにくい。ウェル１７内では、細胞同士が接触して、自発的に凝集体が形成される。ウェル１７内で形成された凝集体は、ウェル１７内で保持される。凝集体の大きさは、細胞懸濁液の細胞濃度と、ウェルの大きさにより制御され得る。また、均一の大きさのウェル１７が使用されることで、均一の大きさの凝集体を形成することができる。

次に、使用者は、細胞培養器４の導入端にチューブ７の他端を接続する。続いて、使用者は、所定の細胞培養条件に基づいて、所定の種類の培養液（ここでは培養液Ａとする）をバッグ２にセットし、ポンプ３を操作して、吐出される培養液Ａの流量が所定の流量（流速）になるようにする。ポンプ３から吐出される培養液Ａは、細胞培養器４に導入され、各ウェル１７内の細胞に培養液Ａが供給される。さらに、使用者は、所定の細胞培養条
件に基づいて、所定の種類の培養液（ここでは培養液Ｂとする）をバッグ２にセットし、ポンプ３を操作して、吐出される培養液Ｂの流量が所定の流量（流速）になるようにする。ポンプ３から吐出される培養液Ｂは、細胞培養器４に導入され、各ウェル１７の細胞に培養液Ｂが供給される。ここで、細胞培養器４に、培養液Ｂを導入したとき、先に導入されていた培養液Ａは、後から導入される培養液Ｂによって、押し出され、細胞培養器４の排出端から排出される。排出された培養液は、バッグ５にて回収される。培養液を導入する時刻や量は、細胞培養条件に基づいている。これによって、細胞培養器４内の培養液を、培養液Ａから培養液Ｂに交換することができる。細胞培養器４によれば、培養液の交換を、遠心分離等の複雑な作業を用いることなく行うことができる。必要に応じて、同様にして、細胞培養器４内の培養液の交換をさらに行うことができる。また、培養液を細胞培養器４に導入し続けることで、ウェル１７内の細胞に新鮮な培養液を供給し続けることができる。例えば、ポンプ３で培養液の流量を制御して、細胞培養器４の流路を培養液が流れる速さ（流速）を、１０ｃｍ／ｓ以下とすることで、新鮮な培養液が細胞に供給される。前記流速（１０ｃｍ／ｓ以下）は、一例であり、１ｃｍ／ｓ以下が好ましい。培養液の導入が一時的に停止されて、培養液の流速が一時的に０とされてもよい。培養液の送液については、ウェル１７を含まない点でのみ溝１１と相違する、溝１１と同様の流路構造において、層流となる条件で、培養液を細胞培養器４に導入するのが好ましく、本実施形態の細胞培養器４を用いて、このような条件を実現できる。ここで、層流とは、流体の流線が流路の方向と平行であることを意味し、乱流ではない流れ場を意味する。このような層流を実現可能な条件は、例えば、レイノルズ数（Ｒｅ）が１０以下である条件であり、また、例えば、レイノルズ数（Ｒｅ）が１以下である条件である。

レイノルズ数は、下記式で与えられる無次元数であり、Ｒｅ＜２３２０であると層流である（乱流が発生しない）とされている。

式中、ρは流体の密度（ｋｇ／ｍ³）であり、υ（ｍ／ｓ）は管断面内平均速度であり、ｄ（ｍ）は管内径であり、μ（ｋｇ／ｍｓ）は流体の粘性係数であり、ν（ｍ²／ｓ）は流体の動粘性係数を示す。

上記式において、培養液の密度及び粘性係数が定数であると仮定すると、Ｒｅの値は培養液が通過する管の内径と培養液の供給速度に依存して定まる。従って、例えば、細胞培養部内に流路を設け、流路の内径の大きさと流路内に送液される培養液の流速とを適切に選択することによって、細胞培養部内に層流条件で培養液を送液することができる。

なお、流路（溝１１）のサイズは、特に制限されないが、例えば、流路の長さ方向に対して垂直な断面の最も長い部分の長さを、０．１ｍｍ〜３００ｍｍの範囲内とすることができ、例えば、当該流路が円筒形の場合は、内径０．１ｍｍ〜３００ｍｍの範囲内とすることができ、また、例えば、当該流路が角筒形の場合は、当該流路の縦幅（高さ）および/または横幅（太さ）を０．１ｍｍ〜３００ｍｍの範囲内とすることができる。例えば、流路の長さ方向に対して垂直な断面の最も長い部分の長さは、１ｍｍ〜１００ｍｍの範囲内であることが好ましく、例えば、当該流路が円筒形の場合は、当該流路の内径が１ｍｍ〜１００ｍｍの範囲内であることが好ましく、また、例えば、当該流路が角筒形の場合は
、当該流路の縦幅（高さ）および/または横幅（太さ）を１ｍｍ〜１００ｍｍの範囲内とすることが好ましい。

このように、細胞を播種した細胞培養器４に、所定の培養液を順次導入することにより、多能性幹細胞を目的の細胞に分化させつつ、所望の分化状態の細胞を、均一の大きさの凝集体で得ることができる。例えば、多能性幹細胞を播種した細胞培養器４に、膵島細胞に分化誘導させる条件で、順次、所定の培養液を導入することにより、膵島細胞を、均一の大きさの凝集体で得ることができる。細胞凝集体の大きさを一定に制御することで、均一な分化誘導効率を実現でき、高い細胞生存率を実現できる。また、細胞凝集体の状態で分化誘導することで、誘導過程で凝集体化する必要がなくなり、操作が簡略化される。細胞培養器４のウェル１７における凝集体の培養は、立体的構造を形成して進行する生体の発生により近いと考えられるため、従来技術よりも生体膵島に近い性質を持った膵島細胞（擬似膵島）を誘導できる可能性がある。

細胞培養器４から細胞の凝集体を取り出す際、例えば、細胞培養器４を上下逆さにしてウェル１７から溝１１に凝集体を落とし、さらに、培養液を導入端から導入することにより、排出端から細胞の凝集体を含む培養液を取り出すことができる。また、蓋１０を本体９から取り外して、各ウェル１７より細胞の凝集体を取り出してもよい。

上記の例では、細胞懸濁液が、直接、細胞培養器４に導入されたが、バッグ２が使用されてもよい。使用者が、細胞培養器４の導入端にチューブ７の他端を接続して、バッグ２に細胞懸濁液を入れて、ポンプ３を操作することにより、細胞培養液が、バッグ２から吸引されて細胞培養器４に向けて吐出される。チューブ７を介して細胞培養器４に細胞懸濁液が導入されることにより、細胞が細胞培養器４に播種される。細胞培養器４の溝１１の全体に例えば２秒程度で細胞懸濁液が行き渡るように、細胞懸濁液が導入される。この後、細胞懸濁液が細胞培養器４に導入されて静置されるとき、ポンプ３の動作は停止される。

（変形例）
上記の実施形態では、ウェル１７の形状は、平面視で円形で、縦断面は半楕円形であったが、以下の様な変形が可能である。

図７は、ウェルの断面形状の例を示す図である。図７（ａ）の例では、ウェル１７の断面形状は、三角形をしている。このとき、ウェル１７の全体の形状は、錐形である。図７（ｂ）の例では、ウェル１７の断面形状は、半円形である。このとき、ウェル１７の全体の形状は、半球形である。図７（ｃ）の例では、ウェルの断面形状は、底の部分で角の丸い長方形をしている。このとき、ウェル１７の全体の形状は、円柱状で底部がボウル状になっている。

ウェル１７の断面形状は、図７の例に限定されず、底に向かうほど細くなっていることが好ましい。ウェル１７の底の部分で、細胞が集まり、凝集体が形成されやすくなるからである。

図８は、溝の底面のウェルの上面図の例である。図８では、ウェル１７の形状の変形例が示される。図８（ａ）の例では、各ウェル１７の形状は、平面視で、正三角形である。図８（ｂ）の例では、各ウェル１７の形状は、平面視で、正方形である。図８（ｃ）の例では、各ウェル１７の形状は、平面視で、ひし形である。図８（ａ）（ｂ）（ｃ）の例では、溝１１の底面に、隣接するウェル１７の間にウェル１７が敷き詰められている。これらの例では、各ウェル１７は、隣接するウェル１７と接触しており、図３のような円形状のウェル１７と異なり、ウェル１７とウェル１７との間に、図６（ａ）のような水平部２
０が存在しない。従って、ウェル１７以外の部分で細胞が培養されにくくなるため、均一の細胞塊が形成されやすくなる。これらのウェル１７の各辺の長さは、好ましくは、１００μｍから５ｍｍである。ウェル１７の高さ（深さ）は、好ましくは、１００μｍから５ｍｍである。ウェル１７の各辺の長さは、ウェル１７のサイズの一例である。また、ウェル１７の形状は、上記の例に限定されず、ウェル１７周辺の水平部分が小さい若しくは存在しない他の形状であってもよい。ウェル１７の辺の長さは、ウェル１７の幅の一例である。

また、図８（ｄ）の例では、各ウェル１７の形状は、長方形であり、溝１１の底面に隙間なくウェル１７が敷き詰められている。このようにウェル１７を構成することで、円柱状の細胞塊が形成される。長方形のウェル１７の短辺の長さは、好ましくは、１００μｍから５ｍｍである。ウェル１７の高さ（深さ）は、好ましくは、１００μｍから５ｍｍである。長方形のウェル１７の短辺の長さは、ウェル１７の幅の一例である。円柱状の細胞塊であっても、円柱の側面から凝集体の中心部までの距離が、細胞の生存に必要な酸素や栄養が拡散可能な距離であれば、よい。

また、上記の実施形態では、流路は、図３などの溝１１のような形状を採用したが、以下の様な変形が可能である。
図９は、流路の形状の例を表す図である。図９は、中間部１４の上面図の例である。中間部１４における流路の形状は、図３の例に限定されず、他の形状であってもよい。
図９（ａ）に示すように、中間部１４と、一端部１２及び他端部１３との幅が、同じであって、テーパ部１５、１６が存在しなくてもよい。このようにすることにより、導入端に導入された培養液が、図３のような流路における流速よりも速くても、中間部１４の両側壁面まで確実に行き渡る。図９（ｂ）に示すように、テーパ部１５の２つの側壁面の接線（接面）と、導入端から排出端に向かう方向（Ｘ方向）とのなす角が、４５度以下であるように、テーパ部１５が、形成される。テーパ部１５の２つの側壁面のいずれの位置の接線（接面）と、Ｘ方向とのなす角が４５度以下であることが好ましい。このようにすることにより、導入端より導入された培養液がテーパ部１５の端（側壁面）まで行き渡る。このとき、テーパ部１５の側壁面の形状は、平面であっても、曲面であってもよい。図９（ｃ）に示すように、中間部１４が存在せずに、テーパ部１５とテーパ部１６とが連続してもよい。

また、上記の実施形態で説明した蓋１０は、以下のような変形が可能である。
図１０は、蓋の変形例を示す細胞培養器の断面図である。図１０の細胞培養器４の断面図は、図５の断面図と同様の位置における断面図である。図５などに示される細胞培養器４の蓋１０は平板であるが、蓋１０は、図１０のように、外側に膨らんだドーム型であってもよい。また、蓋１０は、取り外されて使用されもよい。

また、培養液が溝１１を一様に流れる限りにおいては、一端部１２と外部とを接続する溝が形成され、当該溝と外部との接続部分にチューブ７が接続されてもよい。同様に、他端部１３と外部とを接続する溝が形成され、当該溝と外部との接続部分にチューブ８が接続されてもよい。このとき、蓋１０には、第１孔１８及び第２孔が設けられない。

また、蓋１０は、テーパ部１５、中間部１４、テーパ部１６を覆う形状であって、一端部１２及び他端部１３が露出する構成であってもよい。このとき、蓋１０には、第１孔１８及び第２孔１９が設けられず、チューブ７及びチューブ８は、それぞれ、導入端としての一端部１２及び排出端としての他端部１３に、接続される。このとき、一端部１２及び他端部１３は、それぞれ、チューブ７及びチューブ８の外形に合わせて形成されて、各チューブと接続されたときに、培養液が外部に漏れないようにされる。

また、上記の実施形態のバッグ２及びチューブ６に対して、以下のような変形が可能である。
チューブ６の途中に、チューブの接続先を切り替えることができる切替バルブを設け、当該切替バルブに、複数の培養液を収容するバッグ２を接続してもよい。このとき、培養液の交換を、切替バルブを操作することにより容易にできる。

また、上記の実施形態で説明した細胞培養器４は、以下のような変形が可能である。
図１２は、細胞培養器の変形例を示す図である。図１２は、細胞培養器４の本体９の変形例の上面図である。図３の細胞培養器４では、テーパ部１５、中間部１４、テーパ部１６において、ウェル１７が形成されたが、図１２の細胞培養器４では、テーパ部１５及びテーパ部１６において、ウェル１７が形成されず、中間部１４において、ウェル１７が形成される。細胞培養器４に培養液を流したときに、テーパ部１５及びテーパ部１６と、中間部１４とでは、幅が異なるため、培養液の流れる速さが異なることがある。そこで、テーパ部１５及びテーパ部１６にウェル１７を形成せずに、中間部１４にウェル１７を形成することで、各ウェル１７における培養条件をより均一にすることができる。中間部１４の幅は均一であるため、中間部１４内では、培養液は均一の速さで流れることになる。中間部１４において、テーパ部１５またはテーパ部１６に近い領域については、ウェル１７を形成しなくてもよい。

図１３は、本実施形態の細胞培養システムの変形例１を示す図である。図１３の細胞培養システム１は、バッグ２、ポンプ３、分岐部としての切替バルブ４１、複数の細胞培養器４、複数の廃液保存用のバッグ５を含む。バッグ２とポンプ３との間はチューブ６、ポンプ３と切替バルブ４１の間はチューブ７、切替バルブ４１と細胞培養器４との間はチューブ４２、細胞培養器４とバッグ５との間はチューブ８により接続されている。切替バルブ４１は、チューブ７から流れる培養液等の液体を流す先を切り替える。各チューブ８は、１つのバグ５に接続されてもよい。ここでは、細胞培養器４が水平方向に並列に並べられている。このようにすることにより、一度により多くの細胞を培養することができる。また、培養条件によっては、細胞培養器４に常に培養液を流し続ける必要が無い場合には、切替バルブ４１の接続先で培養液を流す細胞培養器４を切り替えることで、効率的に、同時に多くの細胞を培養することができる。図１３では、３つの細胞培養器４が並べられているが、細胞培養器４の数は３つに限定されるものではない。

図１４は、本実施形態の細胞培養システムの変形例２を示す図である。図１４の細胞培養システム１は、バッグ２、ポンプ３、分岐部としての切替バルブ４１、複数の細胞培養器４、複数の廃液保存用のバッグ５を含む。ここでは、細胞培養器４が垂直方向に積み重ねて並べられている。このようにすることにより、一度により多くの細胞を培養することができる。ここでは、細胞培養器４を、チューブ４２またはチューブ８と接続する穴は、細胞培養器４の側面に配置されている。穴を、側面に配置することで、細胞培養器４を垂直方向に重ねることができる。また、培養条件によっては、細胞培養器４に常に培養液を流し続ける必要が無い場合（培養液を間欠的に供給すればよい場合）には、切替バルブ４１で培養液を流す細胞培養器４を切り替えることで、効率的に、同時に多くの細胞を培養することができる。図１４では、３つの細胞培養器４が並べられているが、細胞培養器４の数は３つに限定されるものではない。

さらに、変形例１及び変形例２を組み合わせて、水平方向にも垂直方向にも細胞培養器４を並べることで、より多くの細胞を培養することができる。

実施形態、変形例において、テーパ部１５、中間部１４、テーパ部１６の壁面の高さは、１０μｍ以上１００ｍｍ以下であることが好ましい。より好ましくは、１００μｍ以上１０ｍｍ以下である。さらに好ましくは、２００μｍ以上１ｍｍ以下である。壁面の高さ
が低くなりすぎると、各ウェル１７に新鮮な培養液を行き渡らせることが難しくなる。また、壁面の高さが低くなりすぎると、培養液が流れる速さが速くなって細胞がウェル１７から抜け出るおそれがある。一方、壁面の高さが高くなりすぎると、各ウェル１７内の細胞を培養するのに不要な培養液まで流すことになり培養液を無駄に消費することになる。また、壁面の高さが高くなりすぎると、培養液が流れる速さを一定に保つことが難しく、層流を維持することが困難になる。よって、壁面の高さは、ここに示す範囲内であることが好ましい。

細胞を培養するウェル１７には、細胞の栄養消費、老廃物蓄積の速度に応じた速度、頻度で培養液（培地）を注入することが求められる。ウェル内の細胞の凝集体に影響が出るほどに流速が上がらない程度に壁面の高さ（培養液が流れる流路の高さ）が低いことが求められる。また、培養液の種類を変更する際に無駄が生じない程度に壁面の高さが高いことが求められる。

（実施形態の作用、効果）
細胞培養システム１は、細胞培養器４に、細胞を播種し、培養液を導入して、細胞を培養する。細胞培養システム１の細胞培養器４には、複数のウェル１７を含む流路が形成されて、細胞培養器４に対する培養液の導入排出を、容易に行うことができる。細胞培養システム１によれば、培養液の導入排出が容易に行うことができることで、培養液の交換を、遠心分離等をすることなく、容易に行うことができる。

細胞培養器４には、複数の同じサイズのウェル１７が、他のウェル１７と隣接して、溝１１の底面の水平部２０の面積が小さくなるように、設けられる。細胞培養器４によれば、同じサイズのウェル１７が設けられることで、均一の大きさの細胞の凝集体を形成することができる。また、溝１１の底面における水平部２０を小さくすることで、ウェル１７内以外で細胞の凝集体が形成されにくくなり、さらに、より均一の大きさの細胞の凝集体を形成することができる。

以上の実施形態、変形例の構成は、可能な限り組み合わせて実施され得る。

上記実施形態の細胞培養システム１は、均一の大きさの細胞の凝集体の形成が要求されるあらゆる場面で使用できる。すなわち、このような凝集体の形成が要求される細胞種として、例えば、膵島細胞が挙げられるが、本発明の細胞培養システムは、膵島細胞以外の細胞種、例えば、胚様体、肝臓、心筋、神経、腎臓、肺、軟骨、網膜、毛胞等についても、適用でき、膵島細胞以外では、特に、胚様体、肝臓、心筋および神経に効果的に適用できる。

１ 細胞培養システム
２ バッグ
３ ポンプ
４ 細胞培養器
５ バッグ
６ チューブ
７ チューブ
８ チューブ

Claims (11)

1. 液体が導入される導入端と底面とを有し、前記液体が流れる流路と、
   前記流路の前記底面に形成される、細胞を収容する複数の凹部とを備え、
   前記複数の凹部は、前記流路の前記底面に密集して配置される、
   細胞培養器。
2. 前記流路は、前記液体が排出される排出端を有し、
   前記流路は、幅が前記導入端から所定の長さに広がる第１領域を含み、
   前記第１領域は、前記流路の底面と直交する２つの側壁面を有し、
   前記２つの側壁面の接面と、導入端から排出端に向かう方向とのなす角が、４５度以下である、
   請求項１に記載の細胞培養器。
3. 前記複数の凹部の前記流路の前記底面に占める面積は、前記底面の面積の半分以上である
   請求項１または２に記載の細胞培養器。
4. 前記流路に導入される液体の流速は、１０ｃｍ／ｓ以下である、
   請求項１から３のいずれか１つに記載の細胞培養器。
5. 前記凹部の周縁が面取りされている、
   請求項１から４のいずれか１つに記載の細胞培養器。
6. 前記凹部の幅は、１００μｍ以上５ｍｍ以下であり、
   前記凹部の高さは、１００μｍ以上５ｍｍ以下である、
   請求項１から５のいずれか１つに記載の細胞培養器。
7. 請求項１から６のいずれか１つに記載の細胞培養器と、
   前記細胞培養器へ導入される液体の量を調整する供給装置と、
   前記細胞培養器から排出される細胞及び液体を収容する収容装置と、
   を備える細胞培養システム。
8. 請求項１から６のいずれか１つに記載の細胞培養器を用いた細胞の培養方法であって、
   前記凹部に細胞を播種し、所定のサイズの凝集体を作製する工程と、
   前記凝集体を前記導入端から導入される培養液で培養する工程と、
   を含む細胞の培養方法。
9. 前記培養は、前記流路における前記培養液の層流によって行われる
   請求項８に記載の細胞の培養方法。
10. 前記凹部に播種される前記細胞は、多能性幹細胞である、
    請求項８又は９に記載の細胞の培養方法。
11. 前記多能性幹細胞は、膵島細胞に分化される、
    請求項１０に記載の細胞の培養方法。

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