CN106047690A - 细胞培养装置 - Google Patents

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野田雄郎
野田雄一郎
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Abstract

一种细胞培养器，其具备：流路，其具有导入液体的导入端和底面，所述液体在其中流动，和多个凹部，其形成于所述流路的所述底面，用于收容细胞，所述多个凹部密集地配置于所述流路的所述底面。

Description

细胞培养装置
技术分野
本发明涉及细胞培养器、及细胞培养系统。
背景技术
作为糖尿病、特别是1型糖尿病的治疗手段，胰脏移植、胰岛移植是有效的，但是，脏器供体数量少、必须服用用于抑制免疫排斥的免疫抑制剂等方面成为严峻的课题。另一方面，正在使用来自于小鼠、人的细胞，广泛进行由诱导多能干细胞(iPS细胞)等多能干细胞来分化诱导胰岛细胞的研究。
专利文献1公开了使用TGF-β等刺激因子诱导内胚层细胞、特别是胰岛细胞的方法。但是，该文献虽然公开了将细胞的命运诱导为内胚层系统、特别是胰岛细胞所必须的刺激因子，但是对于诱导时的细胞群的形态是维持平面结构还是形成立体聚集块则没有公开，此外，对于此时的细胞群的尺寸的控制方法等也没有公开。
专利文献2中公开了：在包含带正电的纳米尺寸的纤维或粒子的基质上培养胚胎干细胞(ES细胞)或iPS细胞，不使用饲养细胞地由多能干细胞诱导胰岛细胞的方法。但是，对于形成聚集体则没有记载和教导。
非专利文献1中公开了：由人多能干细胞分化诱导胰岛细胞后，使其形成细胞聚集体、制作模拟胰岛的方法。此外公开了：通过移植该模拟胰岛，糖尿病模型小鼠的糖尿病状态得到改善。该文献中，在使细胞于培养皿底面上进行贴壁培养的状态下进行分化诱导，在该过程中使细胞群从培养皿底面分离进行非贴壁培养(悬浮培养)，从而形成聚集体。但是，聚集体的形成依赖于悬浮培养中细胞群彼此的偶然性粘附，因此其尺寸是不可控的。
专利文献3公开了：利用细胞无法贴壁的水凝胶基材构成凹部、使接种于其中的细胞形成聚集块的方法及器件。但是，该文献中并未公开用于由多能干细胞开始的分化诱导的方法。此外存在如非专利文献2、非专利文献3中记载那样的、通过搅拌培养法形成的聚集体状态的胰岛细胞分化诱导法。
专利文献4中列举了在利用表面改性而抑制了细胞贴壁的培养皿中形成细胞聚集块的方法、及作为有助于聚集块的尺寸的因子的接种细胞的密度、培养液中的血清浓度。列举了如下方法：通过在培养皿底面中限制可发生细胞贴壁的区域，结果限制所生成的聚集块的尺寸。但是，该文献中并未公开用于分化诱导的方法。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：美国专利第8859286号说明书
专利文献2：日本特开2011-115161号公报
专利文献3：日本专利第5039715号说明书
专利文献4：日本特开2007-135593号公报
非专利文献
非专利文献1：DIABETES,VOL.61,AUGUST 2012,2016-2029
非专利文献2：PLoS ONE.,VOL.7,May 2012,e37004,Thomas C.Schulz等，乔治亚大学、USA
非专利文献3：Cell.VOL.159,Oct 2014,428-439,Felicia W Pagliuca等，Harvard University,USA
发明内容
发明所要解决的问题
本发明的课题在于，提供一种适合于高效地形成聚集体并进行培养的培养器及培养系统。
本发明的课题还在于，提供一种适合于高效地形成聚集体并进行培养的培养器和培养系统。即、在对部分细胞种类进行分化诱导时，有时需要形成聚集体。在形成聚集体时，聚集体的中心部依靠扩散来供给细胞的生存所必须的氧气、营养，因此期望将聚集体的大小控制为均匀。但是，专利文献1中虽然公开了将细胞的命运诱导为内胚层系统、特别是胰岛细胞所必须的刺激因子，但是对于聚集体的大小的控制方法等则没有公开。非专利文献1～3的方法中，聚集体的形成是通过细胞间的接触而随机发生的，因此难以控制聚集体的大小，此外在更换培养基时需要通过离心分离进行沉淀操作。专利文献3中没有公开简单地更换培养液的方法。因此，本发明的目的在于，提供能够培养聚集体的技术。
用于解决问题的方法
为了高效地形成聚集体并进行培养，可以采用以下的培养器。但是，以下的培养器及培养系统也可以用于模拟胰岛的制造以外的用途中，还可以用于要求形成聚集体的细胞种类(細胞種)的制造。
本发明的培养器的第1方式为一种细胞培养器，其具备：
流路，其具有导入液体的导入端和底面，前述液体在其中流动，和
多个凹部，其形成于前述流路的前述底面，用于收容细胞，
前述多个凹部密集地配置于前述流路的前述底面。
根据第1方式，能够控制接种细胞数、在1个凹部(即，以不与其它细胞聚集体接触的状态)制作1个细胞聚集体，且能够在将其维持于各孔中的状态下依次更换培养液。通过使多个凹部处于密集状态，能够抑制在凹部以外的部分生成细胞聚集体，此外能够将培养液大致均匀地供给到该多个凹部中，制作尺寸大致均匀的聚集体。
本发明的培养器的第2方式为一种细胞培养器，其中，
前述流路具有排出前述液体的排出端，
前述流路包含第1区域，所述第1区域的宽度从前述导入端起扩大到规定的长度，
前述第1区域具有与前述流路的底面正交的2个侧壁面，
前述2个侧壁面的任一位置的切面与从导入端向着排出端的方向所成的角度为45度以下。
根据第2方式，能够将液体同样地供给到各凹部，能够在各凹部形成尺寸大致均匀的细胞聚集体。
本发明的培养器的第3方式为一种细胞培养器，其中，
前述多个凹部在前述流路的前述底面所占的面积为前述底面的面积的一半以上。
根据第3方式，能够抑制在凹部以外的部分生成细胞聚集体，能够在凹部内形成尺寸大致均匀的细胞聚集体。
本发明的培养器的第4方式为一种细胞培养器，其中，
导入前述流路的培养液的速度为10cm/s以下。
根据第4方式，能够对收容于凹部的细胞同样地供给新鲜的培养液，能够在各凹部形成尺寸大致均匀的细胞聚集体。
本发明的培养器的第5方式为一种细胞培养器，其中，
前述凹部的周缘进行了倒角。
根据第5方式，细胞不易滞留在凹部以外的部分，不易在凹部以外的部分生成细胞聚集体，能够无损耗地、高效地形成尺寸大致均匀的细胞聚集体。
本发明的培养器的第6方式为一种细胞培养器，其中，
前述凹部的宽度为100μm以上且5mm以下，
前述凹部的高度为100μm以上且5mm以下。
根据第6方式，能够在各凹部形成规定尺寸的大致均匀的细胞聚集体。
本发明的培养器的第7方式为细胞培养系统，其具备：
上述任意细胞培养器，
调整向前述细胞培养器中导入的前述培养液的量的供给装置，和
收容由前述细胞培养器排出的细胞及培养液的收容装置。
根据第7方式，能够以期望的速度将培养液导入细胞培养器，能够在各凹部形成规定尺寸的大致均匀的细胞聚集体。
发明效果
根据本发明的培养器，能够提供能培养出大致均匀的细胞聚集体的技术。
附图说明
图1为示出本实施方式的细胞培养系统的构成例的图。
图2为示出细胞培养器的构成例的分解立体图。
图3为示出本实施方式的细胞培养器的构成例的图。
图4为示出图3的X1－X1线处的、细胞培养器的剖面图的例子的图。
图5为示出图3的Y1－Y1线处的、细胞培养器的剖面图的例子的图。
图6为示出多个孔的剖面形状的例子的图。
图7为示出孔的剖面形状的例子的图。
图8为示出底面部上的孔的形状的例子的图。
图9为示出流路的形状的例子的图。
图10为示出盖的变形例的细胞培养器的剖面图。
图11为示出孔的配置的例子的图。
图12为示出细胞培养器的变形例的图。
图13为示出本实施方式的细胞培养系统的变形例1的图。
图14为示出本实施方式的细胞培养系统的变形例2的图。
具体实施方式
以下参照附图对本发明的培养器的实施方式进行说明。但是，实施方式的构成是一个例子，本发明的构成并非仅限于实施方式的具体构成。
〔实施方式〕
对于作为本发明的实施方式的、包含形成细胞聚集体的细胞培养器的细胞培养系统进行说明。使用细胞培养系统形成的聚集体被用于例如胰岛细胞的分化诱导中。其中，实施方式的细胞培养系统中，可以根据目标分化诱导的种类来选择对细胞给予刺激的培养液种类，从而能够在形成用来获得包含胰岛细胞的各种分化诱导的聚集体时使用。
(构成例)
图1为示出本实施方式的细胞培养系统的构成例的图。图1的细胞培养系统1包含袋2、泵3、细胞培养器4、用于废液保存的袋5。袋2和泵3之间通过管6而连接，泵3和细胞培养器4之间通过管7而连接，细胞培养器4和袋5之间通过管8而连接。
袋2用于收容供给到细胞培养器4中的培养液。培养液为包含细胞的存活所必需的氧气、营养、或者用于提供使细胞分化为期望的细胞的刺激的物质的液体。此外，作为培养液，可以使用包含细胞培养器4中的作为培养对象的多个细胞的培养液。包含细胞的培养液也称为细胞悬液。以下，在对于培养液和细胞悬液不作区分时，使用“培养液”这样的表述。此外，还可以使用并非为培养液的生理盐水等其它液体来代替培养液。作为袋2，准备收容了根据细胞培养条件而调整了成分的多种培养液或细胞悬液的多个袋2。袋2可以在适当的时机更换。例如，在将细胞接种到细胞培养器4时，更换为包含细胞悬液的袋2。袋2例如使用树脂形成。还可以使用可收容培养液的瓶等其它容器来代替袋2。袋2、可收容培养液的容器为收容装置的例子。
泵3设置在袋2和细胞培养器4之间。泵3将通过管6由袋2抽吸的培养液向管7排出。泵3的每单位时间内的排出量是可调整的，通过调整排出量，能够控制导入到细胞培养器4的培养液的量(流量)。泵3还可以使培养液的排出停止。此时，培养液的速度暂时变为零。作为泵3，可使用例如管式泵。作为泵3，还可以使用旋转泵、齿轮泵等其它种类的泵。泵3为供给装置的一个例子。需要说明的是，有时也可以应用将泵3配置在细胞培养器4和袋5之间、将来自袋2的培养液引入细胞培养器4内的构成。作为袋2及泵3，还可以使用将收容培养液的袋及排出培养液的泵融为一体的注射泵等。
细胞培养器4具有包含导入端和排出端的流路。细胞及培养液从导入端导入，从排出端排出。导入端通过管等配管与泵3连接。排出端通过管等配管与袋5连接。流路具有用于收容并培养细胞的多个孔(培养孔)。孔为凹部的一个例子。细胞培养器4容后详述。
用于保存废液的袋5通过管8与细胞培养器4的排出端连接，用于收容(回收)从细胞培养器4的排出端排出的培养液。作为袋5，可使用树脂制袋。还可以使用可收容培养液的树脂制瓶等其它容器来代替袋5。袋5、可收容培养液的容器是收容装置的例子。
管6为将袋2和泵3之间连接的配管，其一端连接于袋2，另一端连接于泵3。管7为将泵3和细胞培养器4之间连接的配管，其一端连接于泵3，另一端连接于培养器4。管8是将细胞培养器4和袋5之间连接的配管，其一端连接于细胞培养器4，另一端连接于袋5。作为管6、7、8，例如可使用树脂制的管。作为管6、7、8，还可以使用可输送培养液的树脂制管等其它配管。
(细胞培养器的构成例)
图2为示出细胞培养器的构成例的分解立体图。图3为细胞培养器4的主体9的俯视图。图4是示出图3的X1－X1线处的、细胞培养器的剖面图的例子的图。图5为示出图3的Y1－Y1线处的、细胞培养器的剖面图的例子的图。以下使用图2～图5对细胞培养器4的构成进行说明。
如图2所示，细胞培养器4具备主体9和盖10。主体9形成为具有长度方向(图2的X方向)和与长度方向正交的宽度方向(图2的Y方向)的平板状。主体9的上表面中，沿着长度方向形成有沟槽11。沟槽11由一端部(导入端)12和另一端部(排出端)13、中间部14、锥形部15、以及锥形部16形成。一端部12形成于主体9的一端部9a，另一端部13形成于主体9的另一端部9b，中间部14形成于主体9的一端部9a和另一端部9b之间。锥形部15与一端部12和中间部14连接，锥形部16与中间部14和另一端部13连接。中间部14的宽度长度为一端部12及另一端部13的宽度以上，锥形部15的宽度从一端部12向着中间部14扩大，锥形部16的宽度从中间部14向着另一端部13逐渐变窄。细胞培养器4包含由沟槽11形成的流路，所述沟槽11从一端部12经由锥形部15、中间部14、锥形部16直至另一端部。锥形部15、中间部14、锥形部16分别为第1区域、第2区域、第3区域的一个例子。
沟槽11的底面从一端部12直至另一端部13形成为在同一水平面的平面，在锥形部15、中间部14、锥形部16的底面形成有作为孔的多个凹部17(也称为孔17)。各孔17按照相邻的孔17之间的距离小的方式而形成。各孔17不仅在中间部14密集地配置，在锥形部15、锥形部16也密集地配置。本例中，配置在锥形部15、锥形部16的多个孔17中的一部分沿着该锥形部的壁面配置。此外，沿着液体的流动方向排列的孔17的列按照与相邻的列的孔17的中心彼此错开的方式配置。
图3所示的例子中，孔17的开口部的形状在俯视下为圆形。此外，如图4及图5的剖面图所示，孔17的纵剖面为半椭圆形。但是，孔17的形状并非限定于此。
孔17具有能够形成规定尺寸的聚集体的大小。为了细胞容易沉积在孔的底部、形成聚集体，从孔17的开口部向着底部，平行于孔17的开口部的面的剖面积逐渐地减小。孔17的直径的下限优选100μm，更优选200μm，可以为400μm。孔17的直径的上限优选5mm，更优选3mm，可以为800μm。孔的高度(深度)的下限优选100μm，更优选200μm，可以为400μm。孔的高度(深度)的上限优选5mm，更优选1mm，可以为800μm。孔17的大小包括孔17的直径、高度、容量等。孔17的直径为孔17的宽度的一个例子。孔17的容积优选0.001μl/孔～10μl/孔，更优选0.001～1μl/孔，可以为0.005～0.1μl/孔。
图11是示出孔的配置的例子的图。图11为孔17的俯视图。如图11所示，例如，在沟槽11的锥形部15、中间部14、锥形部16的底面上记载假想的等边三角形格子的格子点。该等边三角形格子的格子间隔设为孔17的直径以上。在此，孔17的圆的中心配置在该等边三角形格子的格子点的位置。通过这样设置，可以将孔17在沟槽11的锥形部15、中间部14、锥形部16的底面同样地配置。此时，通过将等边三角形格子的格子间隔设为与孔17的直径大致相等，从而能够减小沟槽11的底面的水平部20(沟槽11的底面中不存在孔17的部分)，能够将孔17彼此相邻接且密集地配置。孔17在沟槽11的锥形部15、中间部14、锥形部16的底面中与其它孔17相邻接地同样配置。沟槽11中的孔17的配置并非仅限于这里所示的方式。作为图11的例子的替代，可以将孔17的圆的中心配置在具有孔17的直径以上的格子间隔的正方形格子的格子点的位置。沟槽11中的孔17的配置既可以如图11所示那样具有周期性，也可以是非周期的。孔17在沟槽11的锥形部15、中间部14、锥形部16的底面中所占的面积至少为该底面面积的一半以上。
如图3所示，与锥形部15的底面正交的壁面(侧壁面)将一端部12和中间部14之间以平面相连。将该壁面与X轴所成的角度设为45度以下，从而使由一端部12侧导入的培养液能够到达壁面。关于锥形部16的壁面和X轴所成的角度也同样。通过以这样的角度形成锥形部15及锥形部16的壁面，导入流路的培养液与流路同样地扩展开并流动。
图6为示出多个孔的剖面形状的例子的图。在图6(a)的例子中，孔17和孔17之间、孔17的周围表现为水平部20。在细胞培养中，细胞通过细胞悬液而接种在细胞培养器4中时，有时细胞不进入孔17而是被载置于水平部20。此时，载置有细胞的水平部20中，有可能会制作出尺寸与孔17内形成的细胞团块不同的细胞团块。即，有细胞培养器4内形成的聚集体的尺寸变得不均匀之虞。因此，沟槽11的底面中，孔17的周围的水平部20的面积小更为理想。由此，降低了在孔17内之外的位置生成聚集体的可能性。
在图6(b)的例子中，孔17的周缘(上端部)进行了倒角，与图6(a)水的水平部20的平面的面积(例如，图6(a)的A)相比，水平部20的平面的面积(例如，图6(b)的B)变小。通过如图6(b)那样对孔17的周缘进行倒角，从而即使在孔17和孔17之间载置有细胞，细胞进入(滚下)任一孔17的可能性也高。即，细胞不易停留在孔17以外的部分。此时，由于不易在孔17以外的部分进行细胞培养，因此容易形成均匀的细胞聚集体。此外，尽可能地在沟槽11的锥形部15、中间部14、锥形部16的底面配置孔17，从而能够减小水平部20的面积。
盖10为立方体的板状，用于覆盖主体9的沟槽11。盖10中形成有作为贯通孔的第1孔18、第2孔19。在盖10安装于主体9的状态下，第1孔18为使沟槽11的一端部12对外部开口的状态，第2孔19为使沟槽11的另一端部13对外部开口的状态。第1孔18与管7的另一端连接。第2孔19与管8的一端连接。盖10既可以按照相对于主体9自由拆装的方式安装，也可以相对于主体9固定。
通过向主体9安装盖10，第1孔18及第2孔19分别作为培养液的导入口(导入端)、排出口(排出端)使用。通过在盖10设置培养液的导入口、排出口，主体9的沟槽11被作为流路使用。作为一个例子，流路中按照被培养液充满的方式从导入端导入培养液，收容不了的培养液从第2孔19溢出，通过管8而被回收到袋5。因此，为了避免导入到流路中的培养液泄露到外部，主体9的上表面和盖10的下表面被胶粘剂、密封材、或利用螺栓固定而严密地接合。在从导入口将培养液导入流路时，流路的上部也可以存在空气层。此时，例如，在主体9的侧面形成培养液的排出口，使得沟槽11内的液面高度达到规定高度时培养液可从排出口溢出。
为了在孔17内进行非贴壁培养，主体9及盖10而言，可以对其培养表面进行非贴壁处理，优选由能够以非贴壁状态培养细胞的材料制造。作为这样的材料，优选具有三维结构且无细胞毒性的亲水性材料，进而为了容易观察培养状态而优选透明的材料。此外，细胞培养器4由于在二氧化碳气氛下使用，因此优选可渗透二氧化碳的材料。更具体而言，优选水凝胶。
作为用于制作水凝胶的材料，可以列举聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙二醇、聚甲基丙烯酸-2-羟基乙基酯、聚丙烯酸-2-羟基乙基酯、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸等合成高分子的化学交联体、通过射线照射而形成的交联体、以及构成上述高分子的单体的共聚物的交联体等可形成水凝胶的各种合成高分子材料。此外，还可以使用作为天然高分子的琼脂糖、海藻酸、葡聚糖、纤维素等多糖及其衍生物、以及明胶、白蛋白等蛋白质及其衍生物的交联体等。
就主体9而言，例如，使用可形成图2的主体9的模具制作PDMS(二甲基聚硅氧烷，dimethylpolysiloxane)等树脂制模，进而向PDMS转印而制作。主体9的包含孔17的底面(培养表面)优选进行了非贴壁处理。此外，主体9及盖10还可以通过3D打印而一体形成。
为了容易从外部观察孔17内的细胞(聚集体)，作为主体9及盖10，使用透明材料是理想的。进而，为了在对细胞进行免疫染色、观察时观察到清晰的图像，作为主体9及盖10，使用树脂自身不发出荧光的所谓没有内源荧光(自家蛍光)的材料是理想的。PDMS的可见光区的波长的光的透射率高、透明性高且基本没有内源荧光，因此是非常优异的材料。近年，PDMS已经能够注射成形，因此通过使用PDMS还能够以低成本大量地进行生产。
此外，作为与PDMS具有同样特性的材料，可以列举环烯烃聚合物、环烯烃共聚物。此外，作为能通过注射成形大量生产的透明材料，可以列举丙烯酸类、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚碳酸酯、ABS树脂、玻璃等。这些材料可以作为主体9、盖10的材料使用。
主体9中，包含孔17的底面部分(底面的表面部分)可以用水凝胶来制作，流路部分(除了底面的表面部分以外的部分)可以用PDMS等制作。此时，主体9可以通过例如使由水凝胶形成的底面部分嵌入由PDMS等形成的流路部分而形成。通过以这种方式形成，能够抑制水凝胶的干燥。
(细胞培养系统的使用例)
对本实施方式的细胞培养系统1的使用例进行说明。通过细胞培养系统1，细胞聚集体形成并被培养。细胞培养器4例如使用CO2培养箱等被置于5％二氧化碳气氛中。此外，细胞培养器4按照底面保持水平的方式来设置。最初，管7是从细胞培养器4拆下的。
使用者通过移液器等将细胞悬液直接导入细胞培养器4的导入端，从而将细胞接种在细胞培养器4内。导入到细胞培养器4的细胞悬液的量为比细胞培养器4的流路的容积多的量。通过将比细胞培养器4的流路的容积多的量的细胞悬液导入细胞培养器，能够使细胞培养器4的流路整体充满细胞培养液。此外，多余的细胞悬液从排出端排出，经由管8被回收到袋5。关于将细胞培养液导入细胞培养器4的速度，与细胞培养液在细胞培养器4中静置的时间相比为足够短的时间(例如，2秒左右)。通过用足够短的时间将细胞培养液导入细胞培养器4，能够使细胞均等地遍及各孔17。
需要说明的是，细胞悬液可以通过导入到细胞培养器4的上游部而向着细胞培养器4导入。即，细胞悬液既可以导入袋2、经由泵3而向细胞培养器4导入，也可以在管7、细胞培养器4中设置入口部，由该入口部用注射器导入。
本发明中，对使用的细胞的来源、种类没有特别限制，可以使用真核细胞或原核细胞，优选使用来自于哺乳动物的细胞，例如，诱导多能干(iPS)细胞、胚胎干(ES)细胞等多能干细胞。含有多能干细胞的细胞悬液按照下述方式来生成。最初，将预先以贴壁状态培养的多能干细胞从培养皿剥离，并使其分离为单个细胞。其中，对剥离细胞的方法没有特别限制，可以使用例如胰蛋白酶、EDTA等试剂。然后，将分离成单个细胞的多能干细胞以目标细胞密度悬浮于培养液等中，从而制备出细胞悬液。
将细胞悬液导入细胞培养器4，静置一会(例如，10分钟～1小时)，则细胞悬液中所含的细胞在细胞培养器4的沟槽11中发生沉淀，被收容到孔17中。细胞悬液的静置时间与将细胞悬液导入细胞培养器4的时间相比足够长。此时，由于各孔17的大小相等，因此各孔17中收容有大致等量的细胞。此外，由于按照沟槽11的底面的水平部20的面积小的方式来形成，因此细胞不易沉淀在孔17以外的位置。孔17内细胞彼此接触，自发形成聚集体。孔17内形成的聚集体保持在孔17内。聚集体的尺寸可以通过细胞悬液的细胞浓度和孔的尺寸来控制。此外，通过使用尺寸均匀的孔17，可以形成尺寸均匀的聚集体。
然后，使用者将管7的另一端与细胞培养器4的导入端连接。然后，使用者基于规定的细胞培养条件将规定种类的培养液(这里设为培养液A)放置于袋2，操作泵3，使排出的培养液A的流量达到规定的流量(流速)。从泵3排出的培养液A被导入细胞培养器4，培养液A被供给到各孔17内的细胞。进而，使用者基于规定的细胞培养条件将规定种类的培养液(这里设为培养液B)放置于袋2，操作泵3，使排出的培养液B的流量达到规定的流量(流速)。从泵3排出的培养液B被导入细胞培养器4，培养液B被供给到各孔17的细胞。其中，在将培养液B导入细胞培养器4时，先导入的培养液A被后导入的培养液B推出，从细胞培养器4的排出端排出。排出的培养液被回收到袋5。导入培养液的时机、量取决于细胞培养条件。由此能够将细胞培养器4内的培养液从培养液A更换为培养液B。通过细胞培养器4，不使用离心分离等复杂的操作也能够进行培养液的更换。根据需要，能够同样地进一步进行细胞培养器4内的培养液的更换。此外，通过将培养液连续导入细胞培养器4，能够对孔17内的细胞连续地供给新鲜的培养液。例如，通过用泵3控制培养液的流量、使培养液在细胞培养器4的流路中的流动速度(流速)为10cm/s以下，将新鲜的培养液供给细胞。前記流速(10cm/s以下)为一个例子，优选1cm/s以下。也可以暂时停止培养液的导入、使培养液的流速暂时为0。关于培养液的输送，在与沟槽11仅在不含孔17这点不同的、与沟槽11同样的流路结构中，优选在形成层流的条件下将培养液导入细胞培养器4，使用本实施方式的细胞培养器4可以实现这样的条件。其中，层流是指流体的流线与流路的方向平行，意味着并非紊流的流场。能够实现这样的层流的条件为例如雷诺数(Re)为10以下的条件，此外，为例如雷诺数(Re)为1以下的条件。
雷诺数是由下述式规定的无因次数，Re＜2320时为层流(不产生紊流)。
Re = ρ υ d μ = υ d v
式中，ρ为流体的密度(kg/m3)，υ(m/s)为管剖面内平均速度，d(m)为管内径，μ(kg/ms)为流体的粘性系数，ν(m2/s)表示流体的运动粘性系数。
上述式中，假定培养液的密度及粘性系数为常数，则Re的值依赖于培养液所通过的管的内径和培养液的供给速度而确定。因此，例如，可以通过在细胞培养部内设置流路、选择合适的流路的内径的尺寸和输送到流路内的培养液的流速，从而能够在层流条件下将培养液输送到细胞培养部内。
需要说明的是，对流路(沟槽11)的尺寸没有特别限制，例如，可以将与流路的长度方向垂直的剖面的最长部分的长度设定在0.1mm～300mm的范围内，例如在该流路为圆筒形时，可以将内径设定在0.1mm～300mm的范围内，此外，例如在该流路为多角筒形时，可以将流路的纵向宽度(高度)和/或横向宽度(粗度)设定在0.1mm～300mm的范围内。例如，与流路的长度方向垂直的剖面的最长部分的长度优选在1mm～100mm的范围内，例如，在该流路为圆筒形时，该流路的内径优选在1mm～100mm的范围内，此外例如在该流路为方筒形时，优选将该流路的纵向宽度(高度)和/或横向宽度(粗度)设定在1mm～100mm的范围内。
由此，通过在接种了细胞的细胞培养器4中依次导入规定的培养液，从而能够使多能干细胞分化为目标细胞、并且以尺寸均匀的聚集体形式获得期望分化状态的细胞。例如，在接种了多能干细胞的细胞培养器4中按照分化诱导为胰岛细胞的条件依次导入规定的培养液，从而能够以尺寸均匀的聚集体形式获得胰岛细胞。通过将细胞聚集体的尺寸控制为一定，能够实现均匀的分化诱导效率，能够实现较高细胞存活率。此外，通过以细胞聚集体的状态进行分化诱导，从而无需在诱导过程中进行聚集体化，操作得以简化。认为细胞培养器4的孔17中的聚集体的培养更接近于形成立体结构地进行的生物体中的发育过程，因此，可能能够诱导出与现有技术相比具有更接近生物体的胰岛的性质的胰岛细胞(模拟胰岛)。
在从细胞培养器4取出细胞聚集体时，例如，将细胞培养器4上下颠倒，使聚集体从孔17落到沟槽11中，进而，从导入端导入培养液，从而可以从排出端取出包含细胞聚集体的培养液。此外，还可以将盖10从主体9拆下，从各孔17取出细胞聚集体。
上述例子中，细胞悬液是直接导入细胞培养器4中的，但也可以使用袋2。使用者将管7的另一端与细胞培养器4的导入端连接，在袋2中加入细胞悬液，操作泵3，由此从袋2中抽吸细胞培养液并向着细胞培养器4排出。通过经由管7向细胞培养器4导入细胞悬液，细胞被接种到细胞培养器4中。按照以例如2秒左右使细胞悬液遍及细胞培养器4的沟槽11的整体的方式，将细胞悬液导入。然后，在细胞悬液被导入细胞培养器4后静置时，停止泵3的动作。
(变形例)
上述实施方式中，孔17的形状在俯视下为圆形，纵剖面为半椭圆形，其还可以为如下的变形。
图7为示出孔的剖面形状的例子的图。图7(a)的例子中，孔17的剖面形状呈三角形。此时，孔17的整体的形状为锥形。图7(b)的例子中，孔17的剖面形状为半圆形。此时，孔17的整体的形状为半球形。图7(c)的例子中，孔的剖面形状是底的部分为圆角的长方形。此时，孔17的整体的形状是圆柱状，底部为球状。
孔17的剖面形状不限于图7的例子，优选向着底部逐渐变细。这是为了使细胞在孔17的底的部分聚集、容易形成聚集体。
图8是沟槽的底面的孔的俯视图的例子。图8中示出了孔17的形状的变形例。图8(a)的例子中，各孔17的形状在俯视下为等边三角形。图8(b)的例子中，各孔17的形状在俯视下为正方形。图8(c)的例子中，各孔17的形状在俯视下为菱形。图8(a)(b)(c)的例子中，在沟槽11的底面中，邻接的孔17之间被孔17铺满。这些例子中，各孔17与邻接的孔17接触，与图3那样的圆形的孔17不同，在孔17和孔17之间不存在如图6(a)那样的水平部20。因此，在孔17以外的部分细胞不易被培养，因此容易形成均匀的细胞团块。这些孔17的各边的长度优选100μm～5mm。孔17的高度(深度)优选100μm～5mm。孔17的各边的长度是孔17的大小的一个例子。此外，孔17的形状不限于上述例子，也可以是孔17周边的水平部分较小或者该水平部分不存在的其它形状。孔17的边的长度是孔17的宽度的一个例子。
此外，图8(d)的例子中，各孔17的形状为长方形，在沟槽11的底面没有空隙地铺满了孔17。通过以这种方式构成孔17而形成圆柱状的细胞团块。长方形的孔17的短边的长度优选100μm～5mm。孔17的高度(深度)优选100μm～5mm。长方形的孔17的短边的长度是孔17的宽度的一个例子。即使是圆柱状的细胞团块，只要从圆柱的侧面至聚集体的中心部的距离是细胞存活所需的氧气、营养能够扩散的距离即可。
此外，上述的实施方式中，流路采用了图3等的沟槽11那样的形状，其还可以为如下的变形。
图9为示出流路的形状的例子的图。图9是中间部14的俯视图的例子。中间部14中的流路的形状不限于图3的例子，也可以为其它形状。
如图9(a)所示，也可以是中间部14与一端部12和另一端部13的宽度相同，不存在锥形部15、16。通过采取该形状，导入到导入端的培养液即使比图3那样的流路中的流速快，也能够可靠地遍及中间部14的两侧壁面。如图9(b)所示，按照锥形部15的2个侧壁面的切线(切面)与由导入端向排出端的方向(X方向)所成的角度为45度以下的方式来形成锥形部15。优选锥形部15的2个侧壁面的任意位置的切线(切面)与X方向所成的角度为45度以下。通过这种方式，从导入端导入的培养液可遍及锥形部15的端部(侧壁面)。此时，锥形部15的侧壁面的形状可以为平面，也可以为曲面。也可以如图9(c)所示，不存在中间部14而是锥形部15和锥形部16连续。
此外，上述实施方式中说明的盖10可以是如下的变形。
图10是示出盖的变形例的细胞培养器的剖面图。图10的细胞培养器4的剖面图为与图5的剖面图的位置相同处的剖面图。图5等所示的细胞培养器4的盖10为平板，盖10也可以如图10所示那样为向外侧鼓起的圆顶型。此外，也可以以将盖10拆下的状态来使用。
此外，只要培养液同样地流过沟槽11，则也可以形成将一端部12和外部连接的沟槽，且使管7与该沟槽和外部的连接部分进行连接。同样地，也可以形成将另一端部13和外部连接的沟槽，且使管8与该沟槽和外部的连接部分进行连接。此时，盖10不设置第1孔18及第2孔。
此外，盖10可以为覆盖锥形部15、中间部14、锥形部16的形状，且为一端部12及另一端部13露出的构成。此时，盖10不设置第1孔18及第2孔19，管7及管8分别与作为导入端的一端部12及作为排出端的另一端部13连接。此时，一端部12及另一端部13分别配合管7及管8的外形而形成，使得与各管连接时培养液不会泄露到外部。
此外，对于上述的实施方式的袋2及管6而言，可以为如下的变形。
在管6的途中设置能够对管的连接端进行切换的切换阀门，可以使多个用于收容培养液的袋2与该切换阀门连接。此时，可以通过操作切换阀门容易地进行培养液的更换。
此外，上述的实施方式中说明的细胞培养器4可以为如下的变形。
图12是示出细胞培养器的变形例的图。图12为细胞培养器4的主体9的变形例的俯视图。图3的细胞培养器4中，锥形部15、中间部14、锥形部16中形成有孔17，图12的细胞培养器4中，锥形部15及锥形部16中不形成孔17，在中间部14中形成有孔17。在使培养液流入细胞培养器4时，锥形部15及锥形部16与中间部14的宽度不同，因此培养液的流速有时是不同的。因此，通过在锥形部15及锥形部16中不形成孔17、在中间部14中形成孔17，能够使各孔17中的培养条件更均匀。由于中间部14的宽度是均匀的，因此，在中间部14内，培养液以均匀的速度流动。在中间部14中，靠近锥形部15或锥形部16的区域也可以不形成孔17。
图13是示出本实施方式的细胞培养系统的变形例1的图。图13的细胞培养系统1具有袋2、泵3、作为分支部的切换阀门41、多个细胞培养器4、多个废液保存用的袋5。袋2和泵3之间以管6连接，泵3和切换阀门41之间以管7连接，切换阀门41和细胞培养器4之间以管42连接，细胞培养器4和袋5之间以管8连接。切换阀门41对由管7流出的培养液等液体的流动目标进行切换。各管8可以与1个袋5连接。其中，细胞培养器4按照在水平方向上并排的方式排列。通过这种方式，可以一次性地培养更多的细胞。此外，根据培养条件而无需不断向细胞培养器4持续流入培养液时，通过用切换阀门41的连接端对流入培养液的细胞培养器4进行切换，能够高效地同时培养较多的细胞。图13中是排列有3个细胞培养器4的情况，细胞培养器4的数量不限于3个。
图14是示出本实施方式的细胞培养系统的变形例2的图。图14的细胞培养系统1具有袋2、泵3、作为分支部的切换阀门41、多个细胞培养器4、多个废液保存用的袋5。其中，细胞培养器4按照在垂直方向上重叠的方式排列。通过这种方式，可以一次性地培养较多的细胞。其中，按照与管42或管8连接的孔位于细胞培养器4的侧面的方式配置细胞培养器4。通过将孔配置在侧面，可以使细胞培养器4在垂直方向上重叠。此外，根据培养条件而无需不断向细胞培养器4持续流入培养液时(可以间歇性地供给培养液时)，通过用切换阀门41对流入培养液的细胞培养器4进行切换，能够高效地同时培养较多的细胞。图14中是排列有3个细胞培养器4的情况，细胞培养器4的数量不限于3个。
进而，通过将变形例1及变形例2组合，在水平方向和垂直方向都排列细胞培养器4，从而能够培养更多的细胞。
实施方式、变形例中，锥形部15、中间部14、锥形部16的壁面的高度优选10μm以上且100mm以下。更优选100μm以上且10mm以下。进一步优选200μm以上且1mm以下。壁面的高度过低时，难以使新鲜的培养液遍及各孔17。此外，壁面的高度过低时，培养液的流动速度变快，有使细胞从孔17脱离之虞。另一方面，壁面的高度过高时，会流入超过培养各孔17内的细胞所需的培养液，白白浪费培养液。此外，壁面的高度过高时，难以使培养液保持恒定的流动速度，难以维持层流。因此，壁面的高度优选在上述所示的范围内。
对于培养细胞的孔17而言，需要以与细胞的营养消耗、废物蓄积的速度相适应的速度、频度注入培养液(培养基)。壁面的高度(培养液流经的流路的高度)需要低至使流速不会增大到影响孔内的细胞聚集体的程度。此外，壁面的高度需要高至在改变培养液的种类时不产生浪费的程度。
上述实施方式的细胞培养系统1可以用于要求形成均一尺寸的细胞聚集体的所有情况下。即，作为要求形成这样的聚集体的细胞种类，可以列举例如胰岛细胞，但本发明的细胞培养系统也可以用于胰岛细胞以外的细胞种类，例如胚状体、肝脏、心肌、神经、肾脏、肺、软骨、视网膜、丝胞等，除了胰岛细胞以外，可以特别有效地用于胚状体、肝脏、心肌和神经。
(实施方式的作用、效果)
细胞培养系统1是在细胞培养器4中接种细胞、导入培养液并培养细胞的。细胞培养系统1的细胞培养器4中形成有包含多个孔17的流路，可以容易地对细胞培养器4进行培养液的导入、排出。通过细胞培养系统1，能够容易地进行培养液的导入、排出，从而即使不进行离心分离等也能够容易地进行培养液的更换。
细胞培养器4中，多个相同大小的孔17是按照与其它孔17邻接、减小沟槽11的底面的水平部20的面积的方式设置的。根据细胞培养器4，通过设置相同大小的孔17，能够形成尺寸均匀的细胞聚集体。此外，通过减小沟槽11的底面的水平部20，从而不易在孔17内之外的位置形成细胞聚集体，进而能够形成尺寸更均匀的细胞聚集体。
可以将以上的实施方式、变形例的构成在可能的范围内组合而实施。
符号说明
1 细胞培养系统
2 袋
3 泵
4 细胞培养器
5 袋
6 管
7 管
8 管

Claims (11)

1.一种细胞培养器，其具备：
流路，其具有导入液体的导入端和底面，所述液体在其中流动，和
多个凹部，其形成于所述流路的所述底面，用于收容细胞，
所述多个凹部密集地配置于所述流路的所述底面。
2.根据权利要求1所述的细胞培养器，
所述流路具有排出所述液体的排出端，
所述流路包含第1区域，所述第1区域的宽度从所述导入端起扩大到规定的长度，
所述第1区域具有与所述流路的底面正交的2个侧壁面，
所述2个侧壁面的切面与从导入端向着排出端的方向所成的角度为45度以下。
3.根据权利要求1或2所述的细胞培养器，其中，所述多个凹部在所述流路的所述底面所占的面积为所述底面的面积的一半以上。
4.根据权利要求1或2所述的细胞培养器，其中，所述凹部的周缘进行了倒角。
5.根据权利要求1或2所述的细胞培养器，其中，所述凹部的宽度为100μm以上且5mm以下，所述凹部的高度为100μm以上且5mm以下。
6.一种细胞培养系统，其具备：
权利要求1～5中任一项所述的细胞培养器，
调整向所述细胞培养器中导入的液体的量的供给装置，和
收容由所述细胞培养器排出的细胞及液体的收容装置。
7.一种细胞培养方法，其为使用权利要求1～5中任一项所述的细胞培养器的细胞培养方法，其包含：
在所述凹部中接种细胞、制作规定尺寸的聚集体的工序、和
以从所述导入端导入的培养液培养所述聚集体的工序。
8.根据权利要求7所述的细胞培养方法，其中，导入所述流路的液体的流速为10cm/s以下。
9.根据权利要求7所述的细胞培养方法，其中，所述培养通过所述流路中的所述培养液的层流来进行。
10.根据权利要求7～9中任一项所述的细胞培养方法，接种到所述凹部的所述细胞为多能干细胞。
11.根据权利要求10所述的细胞培养方法，其中，所述多能干细胞分化为胰岛细胞。
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