JP2005095165A - 培養容器、培養装置および細胞の培養方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】開口部を有する枠状部材と、前記枠状部材の開口部の上部および下部を被覆するガス透過膜と、前記枠状部材および前記ガス透過膜により形成される培養部と、前記培養部内に配置される、両端が開口した少なくとも1以上の中空糸と、を有する培養容器。
【選択図】図1
Description
しかし、これらの細胞培養容器は、培養された細胞自体を使用することを意図したものではない。例えば、特許文献1に記載の細胞培養容器は、付着性動物細胞を中空繊維に付着させて高密度で培養し、抗体等、細胞から産生される物質を得ることを目的としており、培養容器の容積に占める中空繊維の容積の割合を高めるため、その形状は一般に円筒状である。また、特許文献2に記載の細胞培養容器は、細胞の大規模培養を意図しておらず、大規模細胞培養装置における培養条件のスクリーニングツールを提供することを目的としている。そして、大規模細胞培養容器との相違点として、大規模細胞培養容器の場合、中空繊維の外側の空間で細胞を培養するのに対して、同文献に記載の細胞培養容器は、中空繊維の内側の空間で細胞を培養することが挙げられている。
しかし、このような円筒状の細胞培養容器は、浮遊細胞を長期にわたって高密度で静置培養する場合に好ましくない点がある。すなわち、このような円筒状の細胞培養容器は、通常円筒の長軸を水平方向にして、寝かした状態で使用されるため底部が湾曲した状態になっている。浮遊細胞は培養中に重力によって沈殿して細胞培養容器の底部に堆積するが、円筒状の細胞培養容器を使用した場合、細胞が細胞培養容器の湾曲した底部に局所的に堆積してしまう。その結果、培養中の細胞に栄養分および酸素が十分に行き渡らず細胞の培養効率が悪化する。
前記培養部の高さは2mm以下であることがより好ましい。
図1は、本発明の培養容器の一実施形態の平面図である。以下、本明細書において、培養容器の図示されている側を上側と呼び、その裏側を下側と呼ぶ。図2は、図1の培養容器の長手側から見た側面図であり、図3は、図1の培養容器の短手側から見た側面図である。
図1に示すように、本発明の培養容器1は、平面形状が矩形である枠状部材2を有している。枠状部材2は開口部を有しており、該開口部の上側および下側は、ガス透過膜3で被覆されている。本発明の培養容器1は、該開口部とガス透過膜3とによって形成される培養部を有している。すなわち、本発明の培養容器は、側面が枠状部材2によって定義され、上面および底面がガス透過膜3によって定義される培養部を有している。
但し、培養部内に複数本の中空糸4を並列配置するには、枠状部材2の平面形状が矩形であることが好ましい。
中空糸4は、その両端部が開口しており、分岐手段6を介して培地用ポート5と接続されている。培地用ポート5は、枠状部材2の一部を貫通して、外部と中空糸4とを流体連通している。図1に示した態様では、培地用ポート5は、培養容器1(枠状部材2)を短手方向に貫通する中空管であり、その側面から延びる枝管を介して分岐手段6と接続している。分岐手段6は、個々の中空糸4に対応する開口部を有しており、中空糸4の端部と該開口部とは液密に接続している。
本発明の培養容器1において、枠状部材2の形状については、上記した通りである。枠状部材2の材質は、溶媒耐性を有し、細胞毒性がなく、滅菌できる材料であれば特に限定されず、培養容器に従来使用されている材料を広く用いることができる。このような材料としては、具体的には例えば、ポリカーボネート樹脂、ポリスチレン樹脂、アクリル系樹脂、ポリオレフィン系樹脂等の高分子樹脂材料、ステンレスのような金属材料、ガラス、セラミックスのような無機材料であってもよい。中でも、成形が容易であること、破損しにくく取り扱い性に優れること、軽量であること、安価であることから上記例示した高分子樹脂材料が特に好ましい。
但し、上記以外の膜であっても、リンカーを結合させた抗体と、膜上に出ている基(例えば、カルボキシル基、アミノ基等)と、を化学的に結合させることで、抗体を固相化させてもよい。
本発明の培養容器1は、ガス透過膜3を介して培養部のガス交換を行い、中空糸4の半透膜機能により培養部に栄養分を供給する閉鎖系の培養容器1である。
本発明の培養容器1は、後述する本発明の細胞の培養方法に好適である。
培地の劣化を示す指標としては、例えば培地の乳酸値を用いることができる。廃液タンク20からサンプリングして、培地の乳酸値を測定すれば、培地の劣化の程度を把握することが可能である。そして、培地の乳酸値が、予め設定した閾値を超えた場合、培地タンク10からの培地を供給する速度を早く設定して、中空糸4内での培地の滞留時間を短くすることで、中空糸4内に常に新鮮な培地が供給されるようにする。一方、培地の乳酸値が閾値を超えていない場合には、中空糸4における培地の滞留時間に余裕があると考えられるため、培地タンク10からの培地の供給速度をより遅く設定してもよい。
また、培養容器1(中空糸4)内における培地の循環を持続させるために、培地タンク10aおよび10bの位置関係の反転は、培地タンク10a内の培地が全て培地タンク10bへと移動する前、例えば培地タンク10a内の培地量が少量になった時点で実施してもよい。
培地の劣化を表す指標としては、例えば培地の乳酸値を用いることができる。培地タンク10aまたは10bから培地をサンプリングして、培地の乳酸値を測定すれば、培地の劣化の程度を把握することが可能である。そして、培地の乳酸値が、予め設定した閾値を超えた場合、新たな培地が収容された培地タンクに取り替えればよい。なお、培地の乳酸値の測定は、供給ライン11aまたは11bに乳酸値測定用の装置を接続してオンラインで実施してもよい。
更に、図6の培養装置300においても、図5と同様に培地タンク10は、取り替え可能であるように構成されていることが好ましい。培地タンク10内の培地をサンプリングし、培地が劣化している場合、例えば、培地の劣化の指標として使用する乳酸値が閾値を超えている場合は、循環ポンプ30を停止して、培地の循環を停止した後、培地タンク10を新たな培地タンクに取り替えることで、常に新鮮な培地を培養容器1に供給することができる。また、培地タンク10に培地抽出用の弁、および培地導入用の弁を設けておき、培地の循環を停止することなしに、新たな培地への入れ替えを行ってもよい。
さらに、本発明の培養装置100,200,300は、本発明の培養容器1を用いるため、上記した本発明の細胞培養容器の利点を有している。例えば、中空糸4の分画分子量が上記した範囲であるため、細胞の培養に必要な成分、具体的には、血漿や、IL−2等のサイトカインを培養開始時に予め培養部に導入しておけば、培養中にこれら成分を補充する必要がなく、中空糸4には無血清培地を供給することができ、細胞培養に要するコストが削減される。
ここで、培養する細胞は、抗体を固相化させた他の細胞培養容器、例えばフラスコ、でプレ培養してから導入してもよく、または採取した細胞を直接導入して全培養工程を本発明の細胞容器1中で実施してもよい。なお、プレ培養は従来の手順で実施することができ、これについては例えば特開平3−80076号公報に記載されている。また、抗体を固相化させた培養容器を用いてプレ培養した場合、細胞、例えばリンパ球が、すでに活性化されているため、本発明の培養容器1のガス透過膜3には抗体を固相化させなくてもよい。
なお、細胞培養は、静置培養として実施してもよく、振盪培養として実施してもよい。
本発明の方法では、中空糸4を培地が流通するため、使用する培地は液体培地であることが好ましい。本発明では、培養に必要な成分、例えば、血漿、サイトカイン等が培養部内に保持されているため、中空糸4に流通させる培地として、無血清培地を用いることができる。これにより、細胞培養に要するコストが削減される。
IL−2を添加する場合、細胞懸濁液に含めて培養用ポート7から培養部に導入してもよく、または培養中に培養用ポート7から培養部に導入してもよい。IL−2を添加する場合、その量は特に限定されず、培養部の容量、培養する細胞の種類若しくは量、または予定の増殖率等に応じて適宜選択することができる。
・高さが低く、平らな培養部で細胞を培養するため、リンパ球、ハイブリドーマのような浮遊細胞を培養する際に、細胞が培養部の底部に均一に分布し、この状態が長期にわたって保たれる。
・培養部のガス交換が培養部の上面および底面を定義するガス透過膜を介して行われ、かつ高さが低く平らな培養部であるため、培養部の容積に対するガス透過膜の有効面積が大きく、培養部のガス交換特性に優れている。
・中空糸4への培地の供給が連続的に行われるため、中空糸4の半透膜機能によって培養部への培地成分の供給が常時行われる。
また、本発明の方法では、培養容器1のガス透過膜3に抗体が固定化すれば、細胞、例えば、リンパ球を常に刺激して、活性化させつつ培養することができる。
図1〜図3に示す培養容器1を滅菌処理し、生理食塩水で1晩洗浄した。続いて、培養用ポート7から上記実験細胞を3%ヒト血清添加KBM400との懸濁液として培養部に導入した。この時実験細胞の播種密度は、1.0×106 cell/mLであった。なお、KBM400は175U/mLのIL−2を含有している。
培養容器1の仕様は以下の通りであった。
縦:248mm(うち培養部190mm)
横:142mm(うち培養部125mm)
高さ9.1mm
培養部の容積50mL
ガス透過膜:ポリスチレン系フィルム、面積374cm2 、膜厚50μm
中空糸:再生セルロース、内径200μm、外径217μm、4850本、分画分子量約10kDa、有効膜面積0.2m2
なお、培地の循環には、図6に示すように循環ポンプ30を使用した。但し、本実施例では、図6に示すフィルタ40は使用していない。
培養期間中、IL−2を下記条件で培養用ポート7から培養部に導入した。なお、上記したように中空糸4を循環させるKBM400は、175U/mLのIL−2を含有しているが、中空糸4の分画分子量が約10kDaであるため、中空糸4から培養部へのIL−2の流入、およびその反対に培養部から中空糸4へのIL−2の流出はなかった。
培養8日間
培養日数 0 4 6 8
循環培地量(mL) 300 500 500 500
培地添加量(mL) − +200 ±200 −
循環流量(mL/min) 50 50 50 50
IL-2添加量(U/mL) +2700 +2700 +2700 −
培地使用量は合計700 mL、IL-2使用量は合計8100 U/mL 。
培養14日間
培養日数 0 2 4 6 8 10 12 14
循環培地量(mL) 300 500 500 500 500 500 500 500
培地添加量(mL) − +200 ±200 ±200 ±200 ±200 ±200 −
循環流量(mL/min) 50 50 50 50 50 50 50 50
IL-2添加量(U/mL)+2700 +2700 +2700 +2700 +2700 +2700 +2700 −
培地使用量は合計1500 mL 、IL-2使用量は合計18900 U/mL。
培養日数 cell density cell number viability
(日) (x106 cells/mL )(x108 cells/module) (%)
8 31.3 15.6 84.6
14 37.2 18.6 75.8
以上の結果、本発明の方法によれば、ヒト末梢血単核球を高密度かつ大規模培養することができた。
縦:268mm(うち培養部210mm)
横:171mm(うち培養部145mm)
高さ:2mm
培養部の容積 50mL
培養日数 0 1 3 5 7 9 11 14
循環培地量(mL) 300 400 400 400 400 400 400 400
培地添加量(mL) − +100 ±200 ±400 ±400 ±400 ±400 −
循環流量(mL/min) 50 50 50 50 50 50 50 50
IL-2添加量(U/ml) +175 − +2700 +2700 +5400 +5400 +5400 −
培地使用量は合計2200 mL 、IL-2使用量は合計21775 U/mL。
培養14日後に細胞を回収して、細胞数および生存率を測定した結果を以下に示す。
cell density cell number viability
(x106cells/ml) (x108cells/module) ( %)
54.5 27.3 78.6
図1〜図3に示す培養容器1を滅菌し、PBS(−)で一晩洗浄した後、抗CD3抗体(10μg/ml)を培養用ポート7から培養部に導入して、室温で12時間静置してガス透過膜3に抗CD3抗体を固相化させた。続いて、健常人より採取したヒト末梢血単核球を3%ヒト血清添加KBM400培地(50mL)と懸濁させて培養用ポート7から培養部に導入した。この時の播種密度は、0.1×106 cell/mLであった。
実験細胞を導入した後、培養温度37℃、湿度99%、二酸化炭素濃度5%で培養を開始した。培養期間中、培地用ポート5から培地(KBM400)を供給して、中空糸4内を下記条件で循環させて17日間培養させた。ここで、添加量が±で示されている場合、循環ポンプ30を停止して、劣化した培地が入った培地タンク10を、同量の培地が入った新たな培地タンクに取り替えたことを表している。
なお、培地の循環には、図6に示すように循環ポンプ30を使用した。但し、本実施例では、図6に示すフィルタ40は使用していない。
また、培養期間中、IL−2を下記条件で培養用ポート7から培養部に導入した。なお、培養日数0におけるIL−2量は、懸濁液として培養部に導入したKBM400に含有されていた分である。
培養日数 0 4 6 8 10 12 17
循環培地量(mL) − 300 300 500 500 500 500
培地添加量(mL) − − − +200 − ±200 −
循環流量(mL/min) − 50 50 50 50 50 50
IL-2添加量(U/mL)+175 +2100 +1350 +1350 +1350 +1350 −
培地使用量は合計700 mL、IL-2使用量は合計7675 U/mL 。
cell density cell number viability
( x106 cells/mL) (x108 cells/module) (%)
12.68 6.34 70.3
以上の結果より、培養開始時に対して細胞が120倍程度に増殖していることが確認された。従来の培養法では、例えば特開平3−80076号公報に記載されているように、抗CD3抗体の刺激を行うためにフラスコにて培養を開始し、目的とする細胞数を得るために培養液を添加し、培養途中で培養容器を移し変える工程が必要があった。これに対して、本発明の方法では、培養途中で培養容器を移し変えることなしに、単一の培養容器で全培養工程を行うことができ、かつ細胞を高密度培養することができる。単一の培養容器で全培養工程を行うことは細菌汚染やクロスコンタミネーションの防止、培養工程の簡便化などにつながる。
縦:268mm(うち培養部210mm)
横:171mm(うち培養部145mm)
高さ:2mm
培養部の容積 50mL
14日間の培養条件は下記の通りであった。ここで、添加量が±で示されている場合、循環ポンプ30を停止して、劣化した培地が入った培地タンク10を、同量の培地が入った新たな培地タンクに取り替えたことを表している。
培養日数 0 4 7 9 10 11 12 13 14
循環培地量(mL) − 500 500 500 500 500 500 500 500
培地添加量(mL) − +500 ±500 ±500 ±500 ±500 ±500 ±500 −
循環流量(mL/min) − 50 50 50 50 50 50 50 50
IL-2添加量(U/mL)175 − +2700 − +2700 − +2700 − −
培地使用量は合計3500 mL 、IL-2使用量は合計8275 U/mL 。
なお、培養4日目までは循環ポンプを使用せず培地を循環させずに培養した。培養17日後に細胞を回収し、細胞数、生存率を測定した結果を以下に示した。
cell density cell number viability
( x106 cells/mL) (x108 cells/module) (%)
41. 4 20.7 56.8
培養装置200において、培養容器1の仕様は実施例4で使用したものと同一である。培地タンク10a,10bには、ガス透過性を有する市販の細胞培養バッグ(カルチャーバッグ(商品コード87−370)、ニプロ株式会社、ポリオレフィン製、1000mL)を使用した。
培養開始後、図5(a)の培地タンク10a内の培地が小量になった時点で、図5(b)に示すように、培養装置200の上下を反転させることにより、培地タンク10bから培養容器200に培地が供給されるようにした。この操作を繰り返すことで、中空糸内で培地を下記条件で循環させつつ14日間培養を継続した。ここで、添加量が±で示されている場合、劣化培地が入った培地タンクを、同量の培地が入った新たな培地タンクに取り替えたことを表している。
培養日数 0 4 7 10 12 14
循環培地量(mL) − 2000 2000 2000 2000 2000
培地添加量(mL) − +2000 − ±2000 − −
循環流量(mL/min) − 4 4 4 4 4
IL-2添加量(U/mL)+175 − +2700 +2700 +2700 −
培地使用量は合計4000 mL 、IL-2使用量は合計8275 U/mL 。
培養14日後に細胞を回収して、細胞数、生存率を測定した結果を以下に示した。
cell density cell number viability
( x106 cells/mL) (x108 cells/module) (%)
41.1 20.6 65.9
2:枠状部材
3:ガス透過膜
4:中空糸
5:培地用ポート
6:分岐手段
7:培養用ポート
8:ガス透過膜押さえ用の枠
10,10a,10b:培地タンク
11,11a,11b:供給ライン
12:戻りライン
20:廃液タンク
21:排出ライン
30:ポンプ
40:フィルタ
100,200,300:培養装置
Claims (12)
- 開口部を有する枠状部材と、
前記枠状部材の開口部の上部および下部を被覆するガス透過膜と、
前記枠状部材および前記ガス透過膜により形成される培養部と、
前記培養部内に配置される、両端が開口した少なくとも1以上の中空糸と、を有する培養容器。 - 前記培養部の高さは、10mm以下であることを特徴とする請求項1に記載の培養容器。
- 前記培養部の高さは、2mm以下であることを特徴とする請求項1に記載の培養容器。
- 前記培養部の上部および下部を被覆するガス透過膜のうち、少なくとも一方がポリスチレン系の膜であることを特徴とする請求項1ないし3のいずれかに記載の培養容器。
- 前記枠状部材は、平面形状が矩形であることを特徴とする請求項1ないし4のいずれかに記載の培養容器。
- さらに、前記枠状部材の一部を貫通し、外部と、前記中空糸とを流体連通する少なくとも2以上の培地用ポートを有し、
該中空糸の両端部は、各々異なる該培地用ポートと接続されていることを特徴とする請求項1ないし5のいずれかに記載の培養容器。 - さらに、前記枠状部材の一部を貫通し、前記培養部と、外部とを流体連通する少なくとも1以上の培養用ポートを有することを特徴とする請求項1ないし6のいずれかに記載の培養容器。
- 前記中空糸の分画分子量が10kDa以下であることを特徴とする請求項1ないし7のいずれかに記載の培養容器。
- さらに、前記ガス透過膜の外側に該ガス透過膜押さえ用の枠が設けられていることを特徴とする請求項1ないし8のいずれかに記載の培養容器。
- 請求項6ないし9のいずれかに記載の培養容器と、前記培地用ポートを介して該培養容器と接続される培地用タンクと、を含む培養装置。
- 請求項1ないし9の培養容器を用いた細胞の培養方法であって、前記中空糸に培地を連続的に供給することを特徴とする細胞の培養方法。
- さらに、抗体を前記ガス透過膜に固相化することを特徴とする請求項11に記載の細胞の培養方法。
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