JP2003180334A

JP2003180334A - 三次元高密度細胞培養用モジュール

Info

Publication number: JP2003180334A
Application number: JP2001383737A
Authority: JP
Inventors: Mutsumi Takagi; 睦高木; Toshiomi Yoshida; 敏臣吉田
Original assignee: Japan Science and Technology Corp
Current assignee: Japan Science and Technology Agency
Priority date: 2001-12-17
Filing date: 2001-12-17
Publication date: 2003-07-02

Abstract

(57)【要約】【課題】培養必須成分の供給と代謝老廃物の除去
を連続的に行い、同時に細胞分泌物は保持しながら細胞
を三次元的に、かつ高密度に培養するための方法を提供
する。【解決手段】細胞を三次元的に、かつ高密度に培養す
るためのモジュールであって、少なくとも (a)中空糸膜と、該中空糸膜に連結した培養液導入口、
該中空糸膜に連結した培養液排出口、および開閉可能な
細胞接種用を有する中空糸膜モジュールと、(b)細胞を
培養するための担体であって中空糸膜モジュール中に設
けられた多孔性担体と、(c)通気手段および攪拌手段を
有する培養液貯槽と、(d)該培養液貯槽から該多孔性担
体を有する中空糸膜モジュールの培養液導入口に培養液
を導入するための送液手段と、(e)培養液排出口から排
出された培養液を培養液貯槽に戻すための送液手段を有
することを特徴とする三次元高密度細胞培養用モジュー
ルを用いる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】この出願の発明は、造血細胞
などの細胞培養において、三次元的かつ高密度で細胞を
培養するためのモジュールに関するものである。さらに
詳しくは、この出願の発明は、造血幹細胞等の細胞の培
養において、栄養成分や酸素等の細胞培養必須成分の供
給と代謝老廃物の除去とを連続的に行いながら、同時に
蛋白質等の細胞分泌物を保持することをも可能とする三
次元高密度細胞培養用モジュールに関するものである。

【０００２】

【従来の技術とその課題】動植物は、体に損傷を受ける
とその部位を再生したり、変態したりする。すなわち、
細胞は各部位に応じた三次元構造を構築できるのであ
る。近年、細胞工学や分子生物学等の分野では、このよ
うな細胞の高次な組織形成能に関して多くの研究が進め
られている。細胞の高次な組織形成機構が解明され、そ
の再現や制御が可能になれば、従来の合成材料による人
工組織や人工臓器に比べ、生体適合性が高い各種代替組
織の生産が可能となることから、この技術は移植医療の
面からも注目される。

【０００３】また、近年、癌や白血病の治療法として造
血幹細胞移植法が注目されているが、入手可能な造血幹
細胞の量が極端に少ないことから、造血幹細胞の大量増
殖技術が研究されている。

【０００４】細胞の高次組織形成機構の解明や造血幹細
胞等の増殖においては、細胞を三次元的に高密度で培養
する方法が求められる。例えば、高密度で細胞を培養す
る手段としては、多孔性担体に細胞を吸着、包含、ある
いは接着させる三次元培養方法があるが、このような方
法においては、物質移動が重要な問題となる。

【０００５】細胞培養において大きな問題となる細胞死
には、一般に、ネクローシスとアポトーシスの２種類が
あり、そのうちアポトーシスが主な原因であることが知
られている。アポトーシスは、アンモニアや乳酸などの
有害な代謝老廃物の蓄積、グルコースやアミノ酸といっ
た栄養分の不足、その両方による培養環境の悪化、サイ
トカインなどの増殖因子の欠乏、必須因子除去による細
胞周期阻害などによって起こると考えられている（生物
工学会誌第７７巻第１号第２〜１１頁、１９９９
年）。すなわち、アポトーシスを抑制し、細胞を三次元
的に高密度で培養するためには、培養液中の栄養成分
（糖、アミノ酸、ビタミンなど）や溶存酸素等の細胞培
養における必須成分の十分な供給と、代謝老廃物（有機
酸、アンモニアなど）の速やかな除去が必要となるので
ある。

【０００６】必須成分の供給と代謝老廃物の除去を行い
ながら細胞培養を行う方法としては、これまでに、大き
く分けて２種類の手段が知られている。第１には、細胞
を固定した多孔性担体を攪拌混合槽中の液体培地に懸濁
する方法で、必須成分の供給や代謝老廃物の除去は多孔
性担体内部と培養液本体との間での対流移動により行わ
れ、培養液本体中の必須成分濃度が低下したり、老廃物
濃度が高くなったりした場合には、培養液の上清を新鮮
な培養液と交換するというものである。また、深部通気
や表面通気を行うことにより、培養液へのガスの溶解と
溶存ガスの対流移動による多孔性担体内部への移動が起
こる。

【０００７】第２には、細胞を固定した多孔性担体を充
填したカラム等に培養液を連続的に流通する方法であ
り、この場合にも、栄養分や溶存ガスの供給と代謝老廃
物の除去が速やかに行われる。

【０００８】しかし、これら従来の方法においては、い
ずれも担体周辺及び内部での培養液の対流があるため、
多孔性担体からの細胞の脱離が生じやすく、脱離した細
胞が培養液中に浮遊した場合には、流出液流により多孔
性担体近傍から除去されてしまうという問題があった。
また、代謝老廃物の除去の際には、培地に含まれる栄養
成分や酸素等の細胞培養必須成分や細胞が自己分泌する
増殖因子などの蛋白質が多孔性担体内部や近傍から流
出、除去されてしまうという問題もあった。

【０００９】さらに、近年では、中空糸膜モジュールを
用いて連続的に培養液と気体を供給しながら細胞培養を
行う方法も検討されている。例えば特開平５−１１１３
７９には、ガスは透過できるが培養液は透過しない多孔
性中空糸膜の内側に細胞を入れ、該中空糸膜に培養液を
流通させる中空糸膜型細胞培養装置が開示されており、
中空糸膜モジュール内部にガスを導入することにより、
ガスが中空糸膜を透過して培養液中に交換され、細胞を
増殖、維持できることが記載されている。しかし、この
ような方法においても、細胞は培養液中に流出し、除去
されてしまう場合があり、さらに、細胞分泌物の保持も
できなかったのが実情である。

【００１０】この出願の発明は、以上のとおりの事情を
鑑みてなされたものであり、従来技術の問題点を解決
し、培養必須成分の供給と代謝老廃物の除去を連続的に
行い、同時に蛋白質等の細胞分泌物は保持しながら細胞
を三次元的に、かつ高密度に培養するための方法を提供
することを課題としている。

【００１１】

【課題を解決するための手段】この出願の発明は、上記
の課題を解決するものとして、まず第１には、細胞を三
次元的に、かつ高密度に培養するためのモジュールであ
って、少なくとも (a)中空糸膜と、該中空糸膜の一端に連結した培養液導
入口、該中空糸膜の他方の一端に連結した培養液排出
口、および開閉可能な細胞接種用口を有する中空糸膜モ
ジュールと、(b)細胞を培養するための担体であって中
空糸膜モジュール中の中空糸膜下流に設けられた多孔性
担体と、(c)通気手段および攪拌手段を有する培養液貯
槽と、(d)該培養液貯槽から該多孔性担体を有する中空
糸膜モジュールの培養液導入口に培養液を導入するため
の送液手段と、(e)培養液排出口から排出された培養液
を培養液貯槽に戻すための送液手段を有することを特徴
とする三次元高密度細胞培養用モジュールを提供する。

【００１２】この出願の発明は、第２には、排出された
培養液を浄化するための培養液浄化手段を有する三次元
高密度細胞培養用モジュールを、また、第３には、培養
液に細胞培養における培養必須成分を補充するための補
充手段を有する三次元高密度細胞培養用モジュールを提
供する。

【００１３】第４には、この出願の発明は、前記の発明
の中空糸膜モジュールにおいて、中空糸膜が膜面に0.1
〜100Åの細孔を有する分画分子量10〜10,000の中空限
外濾過膜である三次元高密度細胞培養用モジュールを、
また第５には、前記中空糸膜モジュールにおいて、中空
糸膜は親水性高分子材料からなるものである三次元高密
度細胞培養用モジュールを提供する。

【００１４】この出願の発明は、第６には、細胞培養必
須成分の供給と代謝老廃物の除去を連続的に行いながら
細胞を三次元的かつ高密度に培養する方法であって、前
記いずれかの三次元高密度細胞培養用モジュールにおい
て、多孔性担体に細胞を接種した後、該三次元高密度細
胞培養用モジュール中に培養液を循環させて細胞を培養
することを特徴とする三次元高密度細胞培養方法を提供
する。

【００１５】そして、この出願の発明は、第７には、前
記第６の発明の方法によって製造される造血細胞群をも
提供する。

【００１６】

【発明の実施の形態】この出願の発明の三次元高密度細
胞培養用モジュールは、細胞の高次組織形成や造血細胞
の増殖において、細胞を三次元的に高密度で培養するこ
とを可能とするものであり、細胞の培養において、細胞
培養必須成分の供給と代謝老廃物の除去とを連続的に行
いながら、同時に蛋白質等の細胞分泌物を保持すること
をも可能とするものである。

【００１７】この出願の発明者らは、これまでに、不織
布や織布を支持体として敷いた培地でマウス骨髄細胞を
培養できること（Cytotechnology, 34, 121-130 (200
0)）や、特定の造血細胞接種濃度およびストロマ細胞接
種濃度の範囲において、とくに造血幹細胞や造血前駆細
胞等の造血細胞群が増殖されることを明らかにしている
（特願２０００−３７１８３２）。また、この出願の発
明者らは、細胞培養時のアポトーシス制御を可能とする
の細胞培養用培地をも提供している（特願２０００−３
５０１９２）。この出願の発明の三次元高密度細胞培養
用モジュールは、発明者らの細胞培養に関するこれらの
知見に基づき、発明、考案されたものである。

【００１８】図１にこの出願の発明の三次元高密度細胞
培養用モジュールの構成を示す概略模式図を示した。も
ちろん、この出願の発明の三次元高密度細胞培養用モジ
ュールは、図１のものに限定されず、様々な態様のもの
とすることができることはいうまでもない。

【００１９】まず、この出願の発明の三次元高密度細胞
培養用モジュール（１）は、少なくとも (a)中空糸膜（２１）と、該中空糸膜（２１）の一端に
連結された培養液導入口（２２）、該中空糸膜（２１）
の他方の一端に連結された培養液排出口（２３）、およ
び開閉可能な細胞接種用口（２４）を有する中空糸膜モ
ジュール（２）と、(b)細胞を培養するための担体であ
って中空糸膜モジュール（２）中に設けられた多孔性担
体（２５）と、(c)通気手段（３１）および攪拌手段
（３２）を有する培養液貯槽（３）と、(d)該培養液貯
槽（３）から該中空糸膜モジュール（２）の培養液導入
口（２２）に培養液（４）を導入するための送液手段
（４１）と、(e)培養液排出口（２３）から排出された
培養液（４）を培養液貯槽に戻すための送液手段（４
２）を有することを特徴とするものである。

【００２０】すなわち、この出願の発明の三次元高密度
細胞培養用モジュール（１）は、大きく分ければ、多孔
性担体（２５）を含有する中空糸膜モジュール（２）と
培養液貯槽（３）と培養液（４）を中空糸膜モジュール
（２）と培養液貯槽（３）の間で循環させるための送液
手段（４１、４２）を有するものである。

【００２１】「中空糸膜モジュール」とは、一般に、中
空糸膜の束が他の部材とともに、液入口、液出口等を備
え、中空糸膜とその周辺部で物質の移動が起こるように
モジュールとして組み立てられたものをいう。このよう
な中空糸膜モジュールは、従来、人工腎臓（人工透
析）、人工心肺、あるいは海水の淡水化や水道水の浄化
等に使用されており、各社から様々な形状、材質、大き
さのものが市販されている。

【００２２】一般的には、中空糸膜モジュール中の中空
糸膜は数μｍ以下の径の中空を有する糸状に形成させた
多孔膜であり、膜自体が耐圧性を有するものである。液
入口側から溶液が導入されると、溶液は中空を流通し、
液出口から排出される。このとき、中空糸膜は膜表面に
分子レベルの細孔を有するため、この細孔より小さな分
子は中空糸膜を透過し、中空糸膜外部へ浸透する。ま
た、中空糸膜を流通する溶液が加圧されたり、中空糸膜
内外の溶液に濃度差があったりしなければ、中空糸膜外
部からも同様に分子が中空糸膜を透過でき、中空を流通
し、排出される。

【００２３】さらに、中空糸膜としては、中空の径や膜
表面の細孔径（すなわち透過できる分子の分子量）、材
質、あるいは膜の層数の異なる様々なものが知られてい
る。

【００２４】前記のとおりの構成を有するこの出願の発
明の三次元高密度細胞培養用モジュール（１）におい
て、中空糸膜モジュール（２）は、少なくとも中空糸膜
（２１）の束とその一端に連結した培養液導入口（２
２）、他方の一端に連結した培養液排出口（２３）、そ
して、開閉可能な細胞接種用口（２４）を有するもので
あればよく、その具体的な形状、構造、大きさ等はとく
に限定されない。

【００２５】この出願の発明の三次元高密度細胞培養用
モジュール（１）において用いられる中空糸膜（２１）
は、アミノ酸やビタミン等の栄養成分や酸素、窒素、二
酸化炭素等のガスを透過させ、蛋白質に代表される高分
子量の細胞分泌物は透過しないものとして、膜面に0.1
〜100Åの細孔を有する分画分子量10〜10,000の中空限
外濾過膜とすることが好ましい。また、中空糸膜（２
１）の形状は、中空を有するものであれば、単層中空糸
膜であっても、異なる材料からなる膜や膜面に異なる径
の細孔を有する膜を層状に複数有する多層複合中空糸膜
であってもよい。

【００２６】さらに、中空糸膜（２１）の材質もとくに
限定されず、各種の高分子材料からなるものが選択され
る。具体的には、ＰＴＦＥ等のフッ素系高分子、架橋全
芳香族ポリアミドやアリル−アルキルポリアミド等のポ
リアミド系高分子、ポリピペラジンアミド、ポリプロピ
レン、ポリウレア、架橋ポリエーテル、ポリアクリロニ
トリル、ポリスルホン、セルロースアセテートやセルロ
ースジアセテート等のセルロース系高分子、親水性ポリ
エチレンなどが例示される。通液する培養液（４）との
親和性を考慮すれば、中空糸膜（２１）の材質は親水性
高分子材料からなるものが特に好ましく、具体的には、
ポリスルホン、セルロース系高分子、親水性ポリエチレ
ンなどが好ましく例示される。中でもセルロース系高分
子は、入手が容易で親水性も高いことから、特に好まし
いといえる。また、中空糸膜（２１）は、多数が束にな
って中空糸膜モジュール（２）中に設置されたものであ
ればよく、その本数や長さもとくに限定されない。培養
液（４）の流量、培養時間、培養条件等に応じて適宜選
択でき、例えば、1〜50,000本の中空糸膜（２１）を有
する中空糸膜モジュール（２）とすることができる。

【００２７】また、この出願の発明の三次元高密度細胞
培養用モジュール（１）では、中空糸膜モジュール
（２）には、細胞を培養するための担体として多孔性担
体（２５）が設置される。このような多孔性担体（２
５）の材質、形状、大きさは、とくに限定されない。例
えば、セルロース、コラーゲン、アガロースなどからな
る発泡体や凍結乾燥体、セルロースなどの天然繊維、ポ
リエステルやポリプロピレンなどの合成繊維、あるいは
これらの混紡繊維などからなる織布や不職布が挙げられ
る。このとき、繊維の太さや繊維間の間隔、布の厚さ等
は培養される細胞の細胞密度に応じて適宜選択でき、繊
維はコラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン等の天然
の細胞外マトリックスやエチレンビニルアルコール共重
合体等の合成マトリックスによってコーティングされて
親水化されたものや、ジエチルアミン、ジエチルアミノ
エチルなどにより修飾されたもの、あるいはプラズマ放
電処理などにより表面に荷電基を導入したものであって
もよい。また、多孔性担体（２５）は、延伸によりミク
ロフィブリル状の孔が形成されたポリエーテルやポリエ
ステル、ポリプロピレン等の樹脂フィルムであってもよ
い。

【００２８】さらに、このような多孔性担体（２５）
は、前記の中空糸膜モジュール（２）中に設置されてい
ればよく、その形状や大きさはとくに限定されない。例
えば、円形、長方形などの任意の形状に切断されていて
もよいし、円柱状、環状、立方体状などに成形された
り、複数枚重ねられたりしていてもよい。

【００２９】そして、この出願の発明の三次元高密度細
胞培養用モジュール（１）は、通気手段（３１）と攪拌
手段（３２）を有する培養液貯槽（３）を有し、培養液
（４）は、この培養液貯槽（３）から送液手段（４１）
を介して前記中空糸膜モジュール（２）に送液される。
通気手段（３１）としては、細胞培養用のガス（酸素、
窒素、二酸化炭素、これらの混合気体等）を培養液
（４）中に通気するための管が例示される。このような
通気手段（３１）は１つであってもよいし、異なる複数
のガスに対応した複数のものであってもよい。もちろ
ん、切り替えバルブ等の設備を具備し、ガス種を適宜変
更できるものであってもよい。一方、攪拌手段（３２）
としては、マグネティックスターラーと攪拌子、攪拌機
等、一般的に液体の混合・攪拌に使用される各種のもの
が例示される。このような培養液貯槽（３）から中空糸
膜モジュール（２）に培養液（４）を送液する方法とし
ては、配管が例示される。このような配管には、培養液
（４）を循環させるためのポンプ等が接続されていても
よいし、培養液貯槽（３）と中空糸膜モジュール（２）
の高低差によって培養液（４）が導入、排出されるよう
にしてもよい。前記のとおりにポンプを利用する場合に
は、中空糸膜（２１）内外に圧力差が生じないようにす
ることが必要である。

【００３０】この出願の発明の三次元高密度細胞培養用
モジュール（１）は、少なくとも以上のとおりの構成を
有していればよいものであるが、これらの各構成要件以
外にも、図２に例示されるように、中空糸膜モジュール
（２）の培養液排出口（２３）から排出された培養液
（４）から代謝老廃物を除去するための培養液浄化手段
（５）や培養液貯槽（３）に細胞培養必須成分を補充す
るための補充手段（６）、あるいは使用後の培養液を廃
棄するための廃液タンク（７）、恒温手段（８）、さら
には、培養された細胞を中空糸膜モジュール（２）から
搬出するための搬出口（２６）等を有していてもよい。
補充手段（６）としては、例えば栄養成分貯槽に接続さ
れたバルブつき配管やシリンジが考慮される。また、恒
温手段（８）としては、中空糸膜モジュール（２）全体
を覆うマントルヒーターや中空糸膜モジュール内に設け
られたヒーターが例示される。例えば培養液貯槽（３）
や通液手段（４１、４２）をも恒温し、培養液全体の温
度を一定とするものであってもよい。また、搬出口（２
６）は、前記の細胞接種用口（２５）と共有のものであ
ってもよいし、より大きな開口部を有するものを別途設
けてもよい。

【００３１】次に、以上のとおりのこの出願の発明の三
次元高密度細胞培養用モジュール（１）を用いて、細胞
の三次元高密度培養を行う方法を説明する。

【００３２】この出願の発明の三次元高密度細胞培養方
法では、まず、細胞接種用口（２４）からマイクロピペ
ット等を用いて多孔性担体（２５）に細胞を接種する。
次に、任意の組成とした培養液（４）に通気手段（３
１）により適当な気体を通気しながら攪拌手段（３２）
により攪拌し、該培養液（４）を送液手段（４１）を介
して培養液導入口（２２）から中空糸膜モジュール中
（２）に導入する。

【００３３】導入された培養液（４）は、中空糸膜（２
１）の中空を流通しながら、中空糸膜（２１）を透過
し、中空糸膜モジュール（２）全体に導入される。この
とき、培養液（４）に含まれるビタミン、アミノ酸、糖
および溶存ガスなどは、中空糸膜（２１）を拡散・透過
し、中空糸膜外部位（２７）に導入され、多孔性担体
（２５）に輸送される。

【００３４】培養液（４）を連続的に中空糸膜モジュー
ル（２）に導入、排出し、三次元高密度細胞培養用モジ
ュール（１）を恒温手段（８）により一定温度に保温
し、細胞培養を行う。このとき発生するアンモニアや有
機酸等の代謝老廃物は、中空糸膜（２１）を拡散・透過
し、中空糸膜（２１）を通じて培養液排出口（２３）か
ら排出、除去される。しかし、細胞が自己分泌する増殖
因子等の蛋白質は、分子量が大きいために、中空糸膜
（２１）を透過できず、中空糸膜外部位（２７）、すな
わち多孔性担体（２５）周辺に保持される。

【００３５】以上のとおりの操作は、目標の細胞密度が
得られるまで続けられる。このとき、培養液（４）中の
培養必須成分は、細胞培養により消耗されるため、時間
の経過に伴って濃度が徐々に減少する。一方、代謝老廃
物の濃度は、時間経過に伴い、徐々に増大する。

【００３６】そのため、目標の細胞密度に到達するまで
の時間を考慮し、培養液貯槽（３）の容量を十分に大き
なものとすることが好ましい。これにより、循環する培
養液（４）の量が十分に多くなり、このような培養液
（４）中の培養必須成分濃度の低下や代謝老廃物濃度の
上昇の影響をほとんど受けなくなる。あるいは、培養液
排出口（２３）から排出される培養液（４）から代謝老
廃物を除去するための培養液浄化手段（５）を培養液貯
槽（３）までの送液手段（４２）の途中に設けたり、培
養液貯槽（３）に栄養成分等の細胞培養必須成分を補充
するための補充手段（６）を設けたりすれば、半永久的
に細胞培養を継続させることが可能となる。

【００３７】この出願の発明において、以上のとおりの
三次元高密度細胞培養方法により培養される細胞はとく
に限定されず、各種の動植物細胞に対して適用できる。
とくに、造血細胞群はこの発明の方法を適用することに
より従来よりも効率的に培養できる。

【００３８】この出願の発明の三次元高密度細胞培養方
法では、培養に用いられる培養液（４）は、培養される
細胞の種類等に応じて適宜選択されるものであり、とく
に限定されない。一般的に動物細胞の培養に用いられる
種々の培養液が好ましく、具体的には、イスコフ培地、
ＲＰＭＩ培地、ダルベッコＭＥＭ培地などが例示され
る。このような培地は、動物細胞培養に適した条件に調
整することが好ましく、例えばウシ血清、ヒト血清、ウ
シ胎児血清等の血清成分や塩類、アミノ酸類等を添加し
てもよい。さらに、ヒトを含めた動物細胞の増殖や分化
の調節に有用とされる種々の造血増殖因子を添加しても
よい。例えばＩＬ−１、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＭＧＦ
（ＳＣＦ）、ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−３から選択される１
種のサイトカイン（特表平６−５０８９８７）やＩＬ−
１、１Ｌ−３、ＩＬ−６、ＥＰＯを組み合わせたサイト
カイン（特表平５−５０２３８５）、さらには、ＩＬ−
３、ＩＬ−２、ＳＣＦを組み合わせたサイトカイン（特
開平７−１３５９６９）等、種々の公知の組成としても
よい。

【００３９】この出願の発明の三次元高密度細胞培養方
法においては、細胞は、多孔性担体（２５）毎に１種の
みであってもよいし、複数の異なる細胞を複数の多孔性
担体（２５）に各々接種してもよい。また、造血幹細胞
とともにストロマ細胞等の接着性細胞を接種させてもよ
い。ストロマ細胞とは、骨髄や臍帯の中に存在する造血
細胞や血液細胞以外の接着性の細胞をいい、造血細胞の
培養においては、表面のリガンドとストロマ細胞表面の
受容体を介して両者が接触することにより造血が調節さ
れると考えられている。このようなストロマ細胞として
は、造血細胞群を増殖させることのできる哺乳動物由来
の種々のものが例示される。具体的には、ヒト、サル、
ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、マウスなどの骨髄、臍帯、
脾臓、子宮、胎盤、血管等に由来する繊維芽細胞、内皮
細胞、脂肪細胞、マクロファージなどが挙げられる。ま
た、これらの細胞は、初代細胞であっても、株化細胞で
あってもよい。

【００４０】培養液（４）の組成やその他の条件は、一
般的に動物細胞を培養する際に適用されるｐＨや温度を
選択すればよい。例えば培養温度は、２０〜３９℃、好
ましくは３３〜３７℃とすることができる。

【００４１】この出願の発明は、以上のとおりの三次元
高密度細胞培養方法により得られる造血細胞群をも提供
する。この出願の発明において、「造血細胞群」とは、
自己再生可能な造血幹細胞と造血幹細胞から分化した造
血前駆細胞を指す。このとき、造血前駆細胞とは造血幹
細胞から分化した血球のうち、分化の初期段階に含まれ
る細胞を意味する。具体的には、骨髄球系前駆細胞、リ
ンパ球系前駆細胞、赤芽球系前駆細胞などが含まれる。
患者または提供者から採取された骨髄中の造血細胞が、
培地に接種された段階で造血幹細胞であるか造血前駆細
胞であるかを厳密に知ることはほとんど不可能である。
そのため、この出願の発明では、これらの総称として
「造血細胞群」と呼ぶ。つまり、この出願の発明の三次
元高密度細胞培養方法においては、ヒトから採取された
骨髄、末梢血、および臍帯血そのもの、さらには、これ
らの血液から遠心分離器により分離された細胞、フィル
ターにより不要細胞を除去した細胞、免疫磁気ビーズ等
のモノクローナル抗体固定細胞分離器により不要細胞を
除去した細胞、ＣＤ３４陽性細胞に精製した細胞等を原
料として培養することにより、造血細胞群が得られるの
である。

【００４２】そして、この造血細胞群は、そのままの状
態、あるいは遠心分離やモノクローナル抗体固定細胞分
離器による不要細胞の除去をおこなった後、さらには、
種々の公知の方法による必要細胞の精製、遺伝子導入等
の必要な操作をおこなった後、患者に輸注できるもので
ある。好ましくは、感染症等の予防のためにも、精製さ
れた状態のものを輸注、あるいは輸血用に保存する。こ
のような造血細胞群は、患者の体内において正常に作用
し、分化して血液細胞を製造できるものである。

【００４３】以上のとおりの方法により三次元で高密度
に培養された造血細胞群からは、血液細胞、すなわち、
造血幹細胞から分化した血球まで、すべての段階の細胞
が得られる。具体的には、造血幹細胞から自己再生され
た造血幹細胞、分化された骨髄球系前駆細胞、リンパ球
系前駆細胞、赤芽球、巨核球、前Ｂリンパ球、前Ｔリン
パ球、骨髄芽球、前骨髄球、骨髄球、好中球、好酸球、
好塩基球、赤血球、血小板、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、
形質細胞、ナチュラルキラー細胞、単球、マクロファー
ジ、樹状細胞、破骨細胞、幹クッパー細胞などが分化さ
れる。

【００４４】この出願の発明の三次元高密度細胞培養方
法により得られる血液細胞は、得られた状態のまま、あ
るいは遠心分離やモノクローナル抗体固定細胞分離器に
よる不要細胞の除去をおこなった後、さらには、種々の
公知の方法による必要細胞の精製、遺伝子導入等の必要
な操作をおこなった後、患者に輸注できるものである。
もちろん、輸血用として保存されてもよい。

【００４５】以下、実施例を示し、この発明の実施の形
態についてさらに詳しく説明する。もちろん、この発明
は以下の例に限定されるものではなく、細部については
様々な態様が可能であることは言うまでもない。

【００４６】

【実施例】＜実施例１＞中空糸膜（２１）としてセルロ
ース限外濾過膜（分画分子量：14,000）１５０本を含む
中空糸膜モジュール（２）（長さ：180 mm、外部容積：
1.5 ml）に多孔性担体（２５）としてポリエステル製不
職布円盤ファイブラセル（ＦＣ）（ＮＢＳ社製、直径：
6 mm、厚さ：0.7 mm）を１０枚入れた。

【００４７】培養液（４）としてウシ胎児血清（12.5
%）およびウマ血清（12.5%）含有McCoy's 5A培地を用
い、マイトマイシンＣで前処理して増殖を停止させた骨
髄ストロマ細胞（ＳＴ２、ＲＣＢ０２２４）2.5×10⁶ c
ellsをＦＣへ接種した。

【００４８】培養液貯槽（３）に培養液（４）を入れ、
攪拌しながら５％ＣＯ₂／空気を通気し、この培養液貯
槽（３）から中空糸膜モジュール（２）へ50mlの培地を
循環しながら、３３℃で２４時間培養した。

【００４９】次にマウス初代骨髄単核細胞7.5×10⁵ cel
lsを接種し、同様の条件で培養を続けた。

【００５０】１週間ごとに中空糸膜モジュール（２）中
の中空糸膜外部位（２７）から培養液を0.5mlずつサン
プリングし、骨髄単核細胞数を計算するとともにグルコ
ース濃度を測定した。

【００５１】図３にグルコース濃度の経時的変化を、図
４に骨髄単核細胞数の経時的変化を示した。＜比較例１＞浮遊培養用２４穴マルチウェルプレートの
ウェル（底面積1.8 cm²）にＦＣを２枚入れ、実施例１
と同様の培養液1 mlとともに骨髄ストロマ細胞を5×10⁵
cells接種した。５％ＣＯ₂雰囲気下、３３℃で静置培
養した後、マウス初代骨髄単核細胞5×10⁵ cellsを接種
し、培養を続けた。

【００５２】１週間ごとに中空糸膜モジュール（２）中
の中空糸膜（２１）外部位（２７）から培養液を0.5ml
ずつサンプリングし、骨髄単核細胞密度を計算するとと
もにグルコース濃度を測定した。

【００５３】図３にグルコース濃度の経時的変化を、図
４に骨髄単核細胞密度の経時的変化を示した。

【００５４】図３〜４より、静置培養では、培養開始か
ら３週間後以降培地中のグルコースが枯渇したのに対
し、この出願の発明の三次元高密度細胞培養用モジュー
ルを用いた培養では、１g/L以上の高い値が維持された
ことが確認された。（図３）また、静置培養では、開始から２週間以降、培養液体積
あたりの骨髄単核細胞密度が5×10⁴ cells/ml前後まで
低下したのに対して、この出願の発明の三次元高密度細
胞培養用モジュールを用いた培養では、中空糸膜モジュ
ール（２）における中空糸膜外部位（２７）の体積あた
り1.2×10⁵ cells/ml以上と高く維持されることが示さ
れた。（図４）

【００５５】

【発明の効果】以上詳しく説明したとおり、この発明に
よって、細胞を三次元で高密度に培養するための効果的
な方法とそのための三次元高密度細胞培養用モジュール
が提供される。また、この発明により、培養必須成分の
供給と代謝老廃物の除去を連続的に行い、同時に細胞分
泌物は保持しながら細胞を三次元的に、かつ高密度に培
養する方法が提供される。

【図面の簡単な説明】

【図１】この出願の発明の三次元高密度細胞培養用モジ
ュールを例示した概略模式図である。

【図２】この出願の発明の三次元高密度細胞培養用モジ
ュールの一態様を示した概略模式図である。

【図３】この出願の発明の実施例におけるグルコース濃
度の経時的変化を示した図である。

【図４】この出願の発明の実施例における骨髄単核細胞
密度の経時的変化を示した図である。

【符号の説明】

１三次元高密度細胞培養用モジュール２中空糸膜モジュール２１中空糸膜２２培養液導入口２３培養液排出口２４細胞接種用口２５多孔性担体２６搬出口２７中空糸膜外部位３培養液貯槽３１通気手段３２攪拌手段４培養液４１送液手段（導入）４２送液手段（排出）５培養液浄化手段６補充手段７廃液タンク８恒温手段

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】細胞を三次元的に、かつ高密度に培養す
るためのモジュールであって、少なくとも (a)中空糸膜と、該中空糸膜の一端に連結した培養液導
入口、該中空糸膜の他方の一端に連結した培養液排出
口、および開閉可能な細胞接種用口を有する中空糸膜モ
ジュールと、(b)細胞を培養するための担体であって中
空糸膜モジュール中に設けられた多孔性担体と、(c)通
気手段および攪拌手段を有する培養液貯槽と、(d)該培
養液貯槽から該多孔性担体を有する中空糸膜モジュール
の培養液導入口に培養液を導入するための送液手段と、
(e)培養液排出口から排出された培養液を培養液貯槽に
戻すための送液手段を有することを特徴とする三次元高
密度細胞培養用モジュール。
【請求項２】排出された培養液を浄化するための培養
液浄化手段を有する請求項１の三次元高密度細胞培養用
モジュール。
【請求項３】培養液貯槽には、培養液に細胞培養にお
ける培養必須成分を補充するための補充手段を有する請
求項１または２の三次元高密度細胞培養用モジュール。
【請求項４】中空糸膜モジュールにおいて、中空糸膜
は膜面に0.1〜100Åの細孔を有する分画分子量10〜10,0
00の中空限外濾過膜である請求項１ないし３のいずれか
の三次元高密度細胞培養用モジュール。
【請求項５】中空糸膜モジュールにおいて、中空糸膜
は親水性高分子材料からなるものである請求項１ないし
４のいずれかの三次元高密度細胞培養用モジュール。
【請求項６】細胞培養必須成分の供給と代謝老廃物の
除去を連続的に行いながら細胞を三次元的かつ高密度に
培養する方法であって、請求項１ないし５のいずれかの
三次元高密度細胞培養用モジュールにおいて、多孔性担
体に細胞を接種した後、該三次元高密度細胞培養用モジ
ュール中に培養液を循環させて細胞を培養することを特
徴とする三次元高密度細胞培養方法。
【請求項７】請求項６の三次元高密度細胞培養方法に
より培養される造血細胞群。