JP2003503022A5

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Publication number: JP2003503022A5
Application number: JP2001505675A
Authority: JP
Filing date: 2000-06-21
Publication date: 2010-09-30
Anticipated expiration: 2020-06-21

Description

【特許請求の範囲】
【請求項１】肝細胞を培養する方法であって：
第１の表面および第２の表面を有する気体透過性かつ液体不透過性の膜を提供し；
前記気体透過性かつ液体不透過性の膜の第１の表面上に、膜に直接あるいは該膜の表面に施された分子レベルの厚さのコーティング上に直接、肝細胞を播種し；
肝細胞と栄養素含有培地とを直接接触させ；
前記第１の表面上に播種された細胞に膜透過酸素供給をもたらすのに十分な圧力で、前記気体透過性かつ液体不透過性の膜の第２の表面に酸素化流体を提供し；さらに
肝細胞の生存性および機能を促進させる条件下で肝細胞を培養する：
各工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】前記酸素化流体中に含まれる酸素が、酸素の臨界分圧以上であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】 2x10⁹−2ｘ10¹⁰の肝細胞が播種された装置において肝細胞を培養することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】前記肝細胞が、ブタ、ウマ、ヒツジ、ウシ、ウサギ、ラット、イヌ、ネコ、またはマウスの肝細胞であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項５】前記肝細胞がヒト肝細胞であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項６】前記播種される肝細胞が保存肝細胞であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項７】前記保存肝細胞が、低温保存、低体温保存、または凍結乾燥によって保存された肝細胞であることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項８】前記気体透過性かつ液体不透過性の膜の材料は、ポリスチレン、ポリオレフィン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリフッ化ビニリデン、ポリカーボネート、疎水性処理ナイロン、ポリウレタン、ポリエステル、スチレン−ブタジエン−スチレン／酢酸エチルビニル／スチレン−ブタジエン−スチレンの積層体、及びスチレン−ブタジエン−スチレン／ポリエチレンの積層体からなる群から選択されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項９】前記気体透過性かつ液体不透過性の膜の前記第１の表面が、コロナ放電処理されていることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１０】前記気体透過性かつ液体不透過性の膜の前記第１の表面が、分子レベルの厚さのコラーゲンコーティングで被覆されていることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１１】前記酸素化流体中の酸素濃度は、１．３８×１０ ^４ −３．４５×１０ ^４Ｐａ（２−５ｐｓｉ）で０％〜９０％酸素の間であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１２】前記酸素化流体中の酸素濃度は、１．３８×１０ ^４ −３．４５×１０ ^４Ｐａ（２−５ｐｓｉ）で１９％〜６０％酸素の間であることを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項１３】前記酸素化流体中の酸素濃度は、１．３８×１０ ^４ −３．４５×１０ ^４Ｐａ（２−５ｐｓｉ）で４０％〜６０％酸素の間であることを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項１４】前記酸素化流体中の酸素濃度を制御して細胞の機能を促進または抑制することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１５】前記栄養含有培地を灌流させることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１６】前記栄養素含有培地が血漿を含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１７】前記肝細胞が、前記膜の上方より膜全体にわたって播種されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１８】前記肝細胞が、前記気体透過性かつ液体不透過性の膜上に直接播種されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１９】流動細胞培養装置であって、
酸素化流体の流入口及び酸素化流体の流出口、液体流入口及び液体流出口、ならびに室を形成する第１及び第２の壁を有するハウジングと、
前記第１の壁と第２の壁との間に配されて前記室を酸素化流体の入口及び酸素化流体の出口を有する酸素化流体区画と、液体の入口及び液体の出口を有する液体区画とに分割する気体透過性かつ液体不透過性の膜と、
壁と前記気体透過性かつ液体不透過性の膜との間に配されて、前記液体区画を細胞区画と液体灌流区画とに分割する液体透過性の膜とを備え、
肝細胞が、前記気体透過性かつ液体不透過性の膜の表面上に直接あるいは該膜の表面に施された分子レベルの厚さのコーティング上に直接播種され、
前記酸素化流体流入口から流入する酸素化流体が前記酸素化流体入口より流入し、前記酸素化流体区画を通過して前記酸素化流体出口より該酸素化流体区画から流出し、前記酸素化流体流出口よりハウジングから流出するように前記酸素化流体流入口及び酸素化流体流出口は配され、
前記液体流入口から流入する液体が前記液体入口より流入し、前記液体灌流区画を通過して前記液体出口より前記液体灌流区画から流出し、前記液体流出口よりハウジングから流出するように前記液体流入口及び液体流出口は配されることを特徴とする流動細胞培養装置。
【請求項２０】前記肝細胞が、前記気体透過性かつ液体不透過性の膜の表面上に直接播種され、該気体透過性かつ液体不透過性膜と前記液体透過性膜との間の空間は１個の細胞よりも大きいことを特徴とする請求項１９記載の装置。
【請求項２１】前記気体透過性かつ液体不透過性膜と前記液体透過性膜との間の空間は、１個の細胞の大きさにほぼ等しいことを特徴とする請求項１９記載の装置。
【請求項２２】前記肝細胞が、前記気体透過性かつ液体不透過性の膜の表面上に直接、及び前記液体透過性膜上に播種され、前記気体透過性かつ液体不透過性膜と前記液体透過性膜との間の空間は隣接細胞２個分の大きさにほぼ等しいことを特徴とする請求項１９記載の装置。
【請求項２３】前記液体区画内に配される液体透過性の中空繊維を更に備えることを特徴とする請求項１９記載の装置。
【請求項２４】装置の積み重ねが可能であるように前記ハウジングが構成されていることを特徴とする請求項１９記載の装置。
【請求項２５】患者から前記ハウジングの流入口へと血漿を流すための第１の導管と、
前記細胞培養装置から前記患者へと血漿を流すための第２の導管と、
前記導管及び細胞培養装置を通じて血漿を搬送するためのポンプとを更に備えることを特徴とする請求項１９記載の流動細胞培養装置。
【請求項２６】前記細胞培養装置を通じて流される血漿を得るために全血から血液細胞を除去する血漿分離要素を更に備えることを特徴とする請求項２５記載の装置。
【請求項２７】前記第１の導管内の血漿が細胞培養装置に流入する以前に該血漿から気泡を除去するための気泡捕獲要素を更に備えることを特徴とする請求項２５記載の装置。
【請求項２８】免疫隔離装置と、
患者から免疫隔離装置へと血漿を流すための第１の導管と、
前記免疫隔離装置から前記患者へと血漿を流すための第２の導管と、
前記細胞培養装置から前記免疫隔離装置へと液体培地を流すための第３の導管と、
前記免疫隔離装置から前記患者へと液体培地を流すための第４の導管と、
前記導管及び細胞培養装置を通じて血漿を搬送するためのポンプとを更に備えることを特徴とする請求項１９記載の流動細胞培養装置。
【請求項２９】流動細胞培養装置であって、
液体流入口及び液体流出口、酸素化流体流入口及び酸素化流体流出口、ならびに室を形成する第１及び第２の壁を有するハウジングと、
前記壁の間に配されて前記室を酸素化流体の入口及び酸素化流体の出口を有する酸素化流体区画と液体の入口及び液体の出口を有する液体区画とに分割する気体透過性かつ液体不透過性の膜とを備え、
肝細胞が、前記気体透過性かつ液体不透過性の膜の表面上に直接、あるいは該膜の表面に施された分子レベルの厚さのコーティング上に直接播種され、
前記液体流入口から流入する生物学的液体が前記液体入口より流入し、前記液体区画を通過して前記液体出口より前記液体区画から流出し、前記液体流出口よりハウジングから流出するように前記液体流入口及び液体流出口は配され、
前記酸素化流体流入口から流入する酸素化流体が前記酸素化流体入口より流入し、前記酸素化流体区画を通過して前記酸素化流体出口より該酸素化流体区画から流出し、前記酸素化流体流出口よりハウジングから流出するように前記酸素化流体流入口及び酸素化流体流出口は配される流動細胞培養装置。
【請求項３０】前記気体透過性かつ液体不透過性の膜は、多孔性または無孔性であることを特徴とする請求項２９記載の装置。
【請求項３１】前記気体透過性かつ液体不透過性の膜は、ポリスチレン、ポリオレフィン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリフッ化ビニリデン、ポリウレタン、ポリ（スチレン−ブタジエン−スチレン）、ポリ（酢酸エチルビニル）、ナイロン、シリコーンゴム、ポリ（テトラフルオロエチレン）、またはこれらの複合体、混合物、もしくは共重合体からなることを特徴とする請求項２９記載の装置。
【請求項３２】前記気体透過性かつ液体不透過性の膜が、表面処理されていることを特徴とする請求項２９記載の装置。
【請求項３３】前記気体透過性かつ液体不透過性の膜が、コロナ放電によって処理されていることを特徴とする請求項２９記載の装置。
【請求項３４】前記気体透過性かつ液体不透過性の膜が、細胞外基質のコーティングにて表面処理されていることを特徴とする請求項２９記載の装置。
【請求項３５】患者から前記ハウジングの流入口へと血漿を流すための第１の導管と、
前記細胞培養装置から前記患者へと血漿を流すための第２の導管と、
前記導管及び細胞培養装置を通じて血漿を搬送するためのポンプとを更に備えることを特徴とする請求項２９記載の流動細胞培養装置。

次に、膜に細胞を播種した。ある実験では、細胞を播種する前に、水に溶解させた40μg/mLのI型コラーゲンの滅菌溶液4mLで膜３０を４５分間予めコートし、次にその溶液を吸引除去し、さらに、等容量の滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄した。細胞を播種する前に、細胞を含有する容器を旋回させ、さらに滅菌ピペットで複数回懸濁液をピペッティングすることによって、培地１１中において懸濁液を均一に懸濁させた。ほとんどの実験において、装置１当たり2x10⁶細胞の開始密度で細胞を播種した。しかしながら、一部の実験では、さらに高い密度で実験した（実施例１３を参照）。装置１のカバー１００を取り除き、4mLの細胞懸濁液を膜上にピペットで載せ、膜の表面上に均一に液体を配分させるために装置を注意深く攪拌し、さらにカバーを元に戻した。細胞を播種した装置を培養器（37℃、85％の相対湿度に維持した）に移し、そこでは、１．３８×１０ ^４ −３．４５×１０ ^４Ｐａ（２−５ｐｓｉ）、１．０ｍｌ／分以下で、10％ CO₂および0−90％の範囲の濃度の酸素を供給するガスタンク４に下側ハウジング７０にある出入口１５０の１つを介してガスチャンバー２０が接続している。