JP6998883B2 - バイオ人工限外濾過装置及びそれに関連する方法 - Google Patents
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Description
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年３月７日に出願された米国仮出願６２／３０４，７５８号及び２０１６年４月２７日に出願された米国仮出願第６２／３２８，２９８号の優先権を主張し、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１６年３月７日に出願された米国仮出願６２／３０４，７５８号及び２０１６年４月２７日に出願された米国仮出願第６２／３２８，２９８号の優先権を主張し、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）は、ランゲルハンスの膵島内のインスリン産生β細胞の自己免疫破壊に由来する。受容者の肝臓のポータル門脈内への死体膵島の直接注入による膵島移植は、Ｔ１Ｄ糖尿病１を有する患者の非侵襲性治癒を提供する。しかしながら、ドナーの利用可能性、不良な生着、及び全体的な免疫抑制の副作用は、このアプローチのより幅広い適用の障害として残る。更に、注入された膵島の最大６０％は、外科送達の数日後に生存不能になり、長期インスリン非依存性がしばしば、移植後５年で失われる。先天性及び適応免疫応答の活性化は、膵島移植片不全の主な原因の一つである。膵島をカプセル化することで、多くの関心をもたらした。しかしながら、機能を維持し、かつ患者の免疫系から保護されているカプセル化膵島を提供するための改善された装置及び方法が必要である。
対象における細胞の移植のためのバイオ限外濾過装置を開示する。これらの装置は、細胞集団に隣接した複数のチャネルを提供しながら細胞集団をカプセル化する骨格を含む。特定の実施形態では、複数のチャネルと細胞と複数のチャネルに隣接した細胞との間の分子の交換を容易にするための平面骨格が開示される。平面骨格は、第１の表面及び第２の表面を備える固体平面基質と、固体平面基質内の空隙であって、第１の表面から第２の表面まで延在している、空隙と、空隙内に配置され、第１の表面から第２の表面まで延在するマトリックスであって、マトリックスは第１の表面から第２の表面まで延在する複数のチャネルと及び複数のチャネルに隣接した細胞集団を備える、マトリックスと、を含み得る。
特定の実施形態では、固体基質は、０．１ｍｍ～１０ｍｍの厚さ、例えば０．５ｍｍ～５ｍｍ、または０．５ｍｍ～３ｍｍを有し、第１及び第２の表面の各々は、１ｃｍ２～１００ｃｍ２の表面積を有する。マトリックスは、１ｍｍ２～１０，０００ｍｍ２の表面積、例えば、１ｍｍ２～５０００ｍｍ２、１ｍｍ２～１０００ｍｍ２、１ｍｍ２～１００ｍｍ２を有し得る。特定の実施形態では、マトリックスは、最大２５，０００個のチャネルを備える．特定の実施形態では、チャネルは、５ミクロン～１０００ミクロンの幅、例えば１０ミクロン～２００ミクロンの幅を備える。特定の実施形態では、チャネルは、円形であり、幅は、チャネルの直径を指す。特定の実施形態では、チャネルは、長方形である。特定の実施形態では、チャネルの長さは、１００ミクロン～１０００ミクロンの範囲内である。特定の実施形態では、細胞集団は、５００ミクロン以下、例えば、４００ミクロン以下、または３００ミクロン以下などの距離だけ隣接するチャネルから分離される。細胞集団は、インスリン分泌細胞であってもよい。細胞集団は、膵島、膵臓細胞、膵島ベータ細胞、膵臓細胞、または膵島の細胞から単離された膵臓細胞であってもよい。インスリン分泌細胞は、幹細胞、例えば、誘発多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の分化によって生成されてもよい。
骨格は、骨格の第１の表面上に配設され、第１の表面上のマトリックスを被覆する半透濾過膜を含み得る。特定の実施形態では、限外濾過半透膜は、骨格の第２の表面上に配設され、第２の表面上のマトリックスを被覆することができる。限外濾過半透膜は、マトリックスにカプセル化された細胞を免疫単離するようにサイズ決定され得る。
平面骨格は、例えば細胞の生存率を維持するために、細胞集団を培養するために使用され得る。平面骨格は、本明細書に記載されるように、バイオ人工限外濾過装置を製造するために使用され得る。
特定の実施形態では、バイオ人工限外濾過装置は、細胞集団及び細胞集団に隣接した複数のチャネルを備えるマトリックスを備える平面骨格であって、チャネルは、平面骨格の第１の表面から第２の表面まで延在する、平面骨格と、平面骨格の第１の表面上に配置された第１の限外濾過半透膜と、平面骨格の第１の表面に隣接し、第１の限外濾過半透膜を介して平面骨格と流体連通し、入口及び出口を備える第１の区画と、平面骨格の第２の表面に隣接しており、出口を備える第２の区画とを含み得て、第１の限外濾過半透膜は、５ｎｍ～５ミクロンの範囲の幅を有する複数の孔を備え、第１の限外濾過半透膜は、第１の区画から複数のチャネルへの限外濾過液の輸送を可能にし、限外濾過液は、複数のチャネルから第２の区画へと横断する。
特定の実施形態では、装置は、平面骨格の第２の表面上に配設された第２の半透濾過膜を更に含み得て、限外濾過液は、第２の限外濾過半透膜を通して複数のチャネルから第２の区画へと横断する。第２の限外濾過半透膜は、５ｎｍ～５ミクロンの範囲の幅を有する複数の孔を含み得る。特定の実施形態では、第１及び第２の限外濾過半透膜は、０．１ミクロン～２ミクロンの範囲の幅を有する複数の孔を含み得る。
特定の実施形態では、第２の限外濾過半透膜は、第１の限外濾過半透膜中の複数の孔の幅よりも大きい幅を有する複数の孔を備える。特定の実施形態では、第２の限外濾過半透膜は、第１の限外濾過半透膜中の複数の孔の幅よりも小さい幅を有する複数の孔を備える。
特定の実施形態では、第１の区画の入口は、対象の血管を接続するための導管に取り付け可能である。特定の例では、この血管は、装置が移植される対象の動脈であり得る。
特定の実施形態では、第１の区画の出口は、対象の血管を接続するための導管に取り付け可能である。特定の例では、この血管は、対象の静脈または動脈であり得る。特定の場合では、出口は、入口が接続される動脈と同じまたは異なる動脈であり得る動脈に接続されてもよい。
特定の例では、第１の区画は、（ｉ）対象の複数の異なる血管または（ｉｉ）単一の血管の複数の接続部位との接続のために導管に各々取り付け可能な複数の出口を備える。
特定の例では、第２の区画の出口は、対象の血管または体腔への接続のために導管に取り付け可能である。特定の場合では、第２の区画の出口は、対象の複数の血管または体腔に限外濾過液を提供する。特定の場合では、第２の区画の出口は、対象の複数の静脈への接続のために管に取り付け可能である。さらに他の場合において、第２の区画の出口は、対象の複数の動脈への接続のために管に取り付け可能である。場合によっては、第２の区画の出口が、分析物分析装置に取り付け可能である。更に他の実施形態において、第２の区画は、少なくとも１つの対象の血管または対象の体腔に限外濾過液を提供するための複数の出口を備える。場合によっては第２の区画は、限外濾過液を分析物分析装置に提供するための複数の出口を備える。
別の実施形態では、バイオ人工限外濾過装置は、各々が、細胞集団及び細胞集団に隣接した複数のチャネルを含むマトリックスを備える第１の平面骨格及び第２の平面骨格であって、チャネルは、平面骨格の各々の第１の表面から第２の表面まで延在する、第１の平面骨格及び第２の平面骨格と、第１及び第２の平面骨格の第１の表面上に配置された第１の限外濾過半透膜と、第１及び第２の平面骨格の第１の表面に隣接して挟まれており、入口及び出口を備える第１の区画であって、第１の限外濾過半透膜は、限外濾過液を第１の区画から骨格に輸送することを可能にする第１の区画と、第１の平面骨格の第２の表面に隣接しており、出口を備える第２の区画と、第２の平面骨格の第２の表面に隣接しており、出口を備える第３の区画とを含み得て、第１の限外濾過半透膜は、５ｎｍ～５ミクロンの範囲の幅を有する複数の孔を備え、限外濾過液は、骨格の複数のチャネルから第２の区画及び第３の区画へと横断する。特定の実施形態では、第２の限外濾過半透膜は、５ｎｍ～５ミクロンの範囲の幅を有する複数の孔を含み得て、第２の限外濾過半透膜は、第１及び第２の平面骨格の第２の表面上に配設され、限外濾過液は、骨格内の複数のチャネルから第２の限外濾過半透膜を介して第２の区画及び第３の区画へと横断する。
特定の実施形態では、第１の限外濾過半透膜は、０．１ミクロン～２ミクロンの範囲の範囲の幅を有する複数の孔を備える。特定の実施形態では、第２の限外濾過半透膜は、０．１ミクロン～２ミクロンの範囲の範囲の幅を有する複数の孔を備える。特定の実施形態では、第２の限外濾過半透膜は、第１の限外濾過半透膜中の複数の孔の幅よりも大きい幅を有する複数の孔を備える。特定の実施形態では、第２の限外濾過半透膜は、第１の限外濾過半透膜中の複数の孔の幅よりも小さい幅を有する複数の孔を備える。
特定の実施形態では、第１の区画の入口は、対象の動脈への接続のための導管に接続可能である。特定の実施形態では、第１の区画の出口は、対象の動脈または静脈への接続のための導管に接続可能である。特定の実施形態では、第２の区画の出口は、少なくとも対象の１つの血管及び／または分析物分析装置への接続のための導管（例えば、管）に接続可能である．特定の実施形態では、第３の区画の出口は、少なくとも対象の血管及び／または分析物分析装置への接続のための管に接続可能である。特定の実施形態では、第３の区画の出口は、少なくとも対象の静脈及び／または分析物分析装置への接続のための管に接続可能である。特定の実施形態では、第２の区画の出口及び第３の区画の出口は、少なくとも対象の血管及び／または分析物分析装置への接続のために単一の管に接続される。
特定の実施形態では、第１の半透性膜内の複数の孔は、０．２μｍ～０．５μｍの範囲の幅を有し、第２の半透性膜内の複数の孔は、０．２μｍ～０．５μｍの範囲の幅を有する。特定の実施形態では、第１の限外濾過半透膜の厚さは、０．１ミクロン～１０００ミクロンの範囲内であり、第２の限外濾過半透膜の厚さは、０．１ミクロン～１０００ミクロンの範囲内である。
特定の実施形態では、第１及び第２の半透性膜の表面積は、１ｃｍ２～１００ｃｍ２の範囲内である。特定の実施形態では、第１及び第２の半透性膜の表面積は、１５ｃｍ２～３０ｃｍ２の範囲内である。
本明細書に記載のように、複数の孔は、円形状であってもよく、幅が孔の直径を指す。一部の実施形態において、複数の孔は、スリット形状であり、孔の長さが０．１ミクロン～５ミクロンの範囲内、例えば、１μｍ～３μｍである。
装置中の細胞は、インスリン産生細胞であってもよい。例えば、インスリン産生細胞は、幹細胞の分化に由来するか、または膵島から単離された膵臓細胞である。細胞は、装置が移植される対象に対して自家性、同種性、または異種性であってもよい。
本明細書に開示されるバイオ人工限外濾過装置のさらなる実施形態は、細胞集団及び細胞集団に隣接した複数のチャネルを備えるマトリックスを備える平面骨格であって、チャネルは、平面骨格の第１の表面から第２の表面まで延在する、平面骨格と、第１の表面上に配置された第１の限外濾過半透膜と、平面骨格の第２の表面上に配置された第２の限外濾過半透膜と、第１の入口及び第１の出口を備える第１の区画であって、平面骨格の第１の表面に隣接している第１の区画と、第２の入口及び第２の出口を備える第２の区画であって、平面骨格の第２の面に隣接している、第２の区画を含み、第１の入口は対象の動脈に接続するように構成され、第１の出口は第２の区画の第２の入口に接続され、第２の区画の出口は、対象の静脈に接続するように構成され、限外濾過半透膜は、５ｎｍ～５ミクロンの範囲の幅を有する複数の孔を備え、第１の限外濾過半透膜は、第１の区画から骨格への限外濾過液の輸送を可能にし、第２の限外濾過半透膜は、骨格内の複数のチャネルから限外濾過液の第２の区画への輸送を可能にする。装置中に存在する細胞は、本明細書に記載の細胞を産生するインスリンを有することができる。特定の場合では、複数の孔は０．２μｍ～０．５μｍの範囲の幅を有する。
一部の実施形態では、第２の限外濾過半透膜中の複数の孔は、第１の限外濾過半透膜中の複数の孔の幅よりも大きい幅を有する。一部の実施形態では、第２の限外濾過半透膜中の複数の孔は、第１の限外濾過半透膜中の複数の孔の幅よりも小さい幅を有する。
一部の実施形態では、限外濾過半透膜の厚さは、０．１ミクロン～１０００ミクロンの範囲内、例えば２００μｍ～１０００μｍである。限外濾過半透膜の表面積は、１ｃｍ２～１００ｃｍ２の範囲内、例えば、１５ｃｍ２～３０ｃｍ２である。
本明細書に記載のように、複数の孔は、円形状であってもよく、幅が孔の直径を指す。
一部の実施形態において、複数の孔は、スリット形状であり、孔の長さは、１ミクロン～５ミクロン、例えば、１μｍ～３μｍの範囲内である。
また、対象用途に提供される装置を患者に移植するための方法も本明細書に開示される。特定の場合では、細胞を備えるバイオ人工限外濾過装置を、それを必要とする対象に提供する方法は、バイオ人工限外濾過装置であって、細胞集団及び細胞集団に隣接した複数のチャネルを含むマトリックスを含む平面骨格であって、チャネルは、平面骨格の第１の表面から第２の表面まで延在する、平面骨格と、平面骨格の第１の表面上に配置された第１の限外濾過半透膜と、平面骨格の第１の表面に隣接しており、第１の限外濾過半透膜を介して平面骨格と流体連通し、入口及び出口を備える第１の区画と、平面骨格の第２の表面に隣接しており、出口を備える第２の区画と、を備え、第１の限外濾過半透膜は、５ｎｍ～５ミクロンの範囲の幅を有する複数の孔を備え、第１の限外濾過半透膜は、第１の区画から複数のチャネルへの限外濾過液の輸送を可能にし、限外濾過液は、複数のチャネルから第２の区画へと横断する、バイオ人工限外濾過装置を対象に接続することを含み、接続は、第１の区画の入口を対象の動脈に接続し、第１の区画の出口を対象の血管に接続すること、及び第２の区画の出口を対象の血管もしくは体腔に接続すること、または第２の区画の出口を分析物分析装置に接続することを含む。
特定の実施形態において、細胞を必要とする対象に細胞を含むバイオ人工限外濾過装置を提供する方法は、各々が、細胞集団及び細胞集団に隣接した複数のチャネルを含むマトリックスを備える第１の平面骨格と第２の平面骨格であって、チャネルは、平面骨格の各々の第１の表面から第２の表面まで延在する、第１の平面骨格及び第２の平面骨格と、平面骨格の第１の表面上に配置された第１の限外濾過半透膜と、第１及び第２の平面骨格の第１の表面に隣接して挟まれており、入口及び出口を備える第１の区画であって、第１の限外濾過半透膜は、限外濾過液を第１の区画から骨格に輸送することを可能にする、第１の区画と、第１の平面骨格の第２の表面に隣接しており、出口を備える第２の区画と、第２の平面骨格の第２の表面に隣接しており、出口を備える第３の区画とを備え、第１の限外濾過半透膜は、５ｎｍ～５ミクロンの範囲の幅を有する複数の孔を備え、限外濾過液は、骨格の複数のチャネルから第２の区画及び第３の区画へと横断する、バイオ人工限外濾過装置を対象に接続することを含み、接続は、第１の区画の入口を対象の動脈に接続し、第１の区画の出口を対象の血管に接続することを含み、または第２及び第３の区画の出口を対象の血管または体腔に接続すること、または第２及び第３の区画の出口を分析物分析装置に接続すること、または第２の区画の出口を対象の血管または体腔に接続し、第３の区画の出口を分析物分析装置に接続すること、または第２の区画の出口を分析物分析装置に接続し、第３の区画の出口を対象の第２の静脈に接続することを含む。
別の実施形態では、細胞を必要とする対象に細胞を含むバイオ人工限外濾過装置を提供する方法は、バイオ人工限外濾過装置であって、細胞集団及び細胞集団に隣接した複数のチャネルを備えるマトリックスを含む平面骨格であって、チャネルは、平面骨格の第１の表面から第２の表面まで延在する、平面骨格と、第１の表面上に配置された第１の限外濾過半透膜及び平面骨格の第２の表面上に配置された第２の限外濾過半透膜と、第１の入口及び第１の出口を備える第１の区画であって、平面骨格の第１の表面に隣接している第１の区画と、第２の入口及び第２の出口を備える第２の区画であって、平面骨格の第２の表面に隣接している第２の区画を備え、第１の入口は対象の動脈に接続するように構成され、第１の出口は第２の区画の第２の入口に接続され、第２の区画の第２の出口は対象の静脈に接続するように構成され、限外濾過半透膜は、５ｎｍ～５ミクロンの範囲の幅を有する複数の孔を含み、第１の限外濾過半透膜は、第１の区画から骨格への限外濾過液の輸送を可能にし、第２の限外濾過半透膜は、骨格内の複数のチャネルから第２の区画への対象に対する限外濾過液の輸送を可能にする、バイオ人工限外濾過装置を対象に接続することを含み、接続は、第１の入口を対象の動脈に接続すること、及び第２の出口を対象の静脈に接続することを含む。
一部の実施形態では、本方法は、インスリンを対象に提供することを含み、細胞は、インスリン産生細胞を含む。場合によっては、このインスリン産生細胞は、幹細胞の分化に由来するか、または膵島から単離された膵島ベータ細胞等の膵臓細胞である。いくつかの例では、細胞は、膵臓細胞であり、例えば、細胞は、膵島から単離された膵島中に存在し得る。細胞は、対象に対して自家性、同種性、または異種性であってもよい。特定の実施形態では、バイオ人工装置を、それを必要とする対象に接続することは、骨格における細胞の生存率の増加をもたらす。特定の実施形態では、限外濾過液は複数のグルコース及び酸素を含む。特定の実施形態では、限外濾過液は、グルコース及び酸素のうちの複数を含み、インスリン産生細胞は、限外濾過液中のグルコースの存在に応答してインスリンを排出し、複数のチャネルはインスリンを第２の区画及び／または第３の区画に輸送する。特定の実施形態では、排出されたインスリンは、骨格の複数のチャネルに輸送される。
特定の実施形態では、限外濾過半透膜は、免疫系成分の骨格内への通過、例えば、骨格内への抗体の通過、サイトカイン（例えば、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、及び／またはＩＬ－１β）の骨格内への通過を低減または防止する。
定義
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が関係する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様または同等の任意の方法及び材料もまた、本教示の実施または試験において使用され得るが、いくつかの例示的な方法及び材料は現在説明されている。
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が関係する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様または同等の任意の方法及び材料もまた、本教示の実施または試験において使用され得るが、いくつかの例示的な方法及び材料は現在説明されている。
本明細書で使用される場合、「濾過」という用語は、微粒子を通過させない培地（例えば、半透性膜）を通して流体キャリアを通過することによって、空気または液体のような、流体から粒子状物質を流体から分離するプロセスを指す。
本明細書で使用される場合、「限外濾過」という用語は、濾過に流体を供することを指し、濾過材料が非常に小さく、典型的には、流体は、コロイド、溶解溶質、または非常に微細な固体材料を含み、濾過は、微小多孔性またはナノ多孔性である。フィルタは、膜、例えば半透性膜であってもよい。濾過される流体は、「供給流体」と称される。特定の実施形態では、供給流体は、動脈血液であってもよい。限外濾過中、供給流体は、フィルタを通して濾過される「透過液」または「濾液」あるいは「超濾液」、膜を通って濾過されなかった供給流体の一部である「保留物」に分離される。
本明細書で使用される場合、「対象」または「患者」という用語は、霊長類（例えば、ヒトまたは非ヒト霊長類）、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコ、または齧歯類などの哺乳類を指す。特定の実施形態では、対象または患者はヒトであり得る．特定の実施形態では、対象または患者は、前糖尿病であってもよく、または、例えば、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）または２型糖尿病などの糖尿病であってもよい。用語「対象」、「患者」とは、本明細書において互換的に使用される。
本明細書で使用される場合、「治療」、「処置」、「治療する」、及び同様の用語は、所望の薬理学的及び／または生理学的効果を取得することを指す。この効果は、疾患またはその症状を完全にまたは部分的に予防する点で予防的であり得て、及び／または疾患の部分的または完全な治癒及び／または疾患に起因する有害作用の点で治療的であり得る。本明細書で使用される「治療」という用語は、対象、特にヒトにおける疾患のいかなる治療もカバーし、以下を備える。（ａ）疾患に予備配設され得るが、罹患していると診断されていない対象において疾患の発生防止することを防止すること、（ｂ）疾患を阻害すること、すなわちその発症を阻止すること、（ｃ）疾患を緩和すること、例えば、疾患の退行を引き起こすこと、例えば、疾患の症状を完全にまたは部分的に除去すること。
本明細書において使用される場合、本開示の装置の文脈において使用される「層」、「フィルム」、または「膜」及びその複数形は、例えば、グラフェン、ケイ素、モリブデン硫酸塩（ＭｏＳ２）、等、またはそれらの組み合わせ、またはポリマーなどのケイ素膜、窒化ケイ素、シリカ、原子的に薄い膜から形成され得る装置の個々の層を指す。本開示の多孔質層を製造するために使用される「層」、「フィルム」または「膜」は、典型的には多孔性であり、ナノ多孔性または微孔性であり得る。「ナノ多孔性層」、「ナノ孔層」、「ナノ多孔性膜」、「ナノ孔多孔性膜」、及び「ナノ孔膜」、及び「ナノ多孔性フィルム」、及び「ナノ孔フィルム」は、ナノ孔が作製されたポリマー層を指す。ナノ多孔性層は、層を支持するフレームを備えることができる。「微多孔性層」、「微孔層」、「微多孔性膜」、「微孔膜」、「微多孔性フィルム」、及び「微孔フィルム」とは互換的に使用されている。微多孔性層は、層を支持するフレームを備えることができる。
本明細書で使用される場合、本明細書に記載の骨格のマトリックスに配設された細胞の状況で使用される「カプセル化された」という用語である。骨格は、本明細書に提供される装置に含まれ得る。細胞は、カプセル化細胞に隣接した複数のチャネルを備えるマトリックス内にカプセル化され得る。細胞は、生体適合性重合性ポリマーを備えるマトリックス中にカプセル化され得る。
本発明が更に説明される前に、本発明は、記載される特定の実施形態に限定されず、当然のことながら、変化する可能性があることを理解されたい。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を記載するためのものであるにすぎず、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲のみによって限定されるため、限定的であることは意図されないこともまた理解されたい。
範囲の値が提供される場合、文脈上明確に指示されていない限り、下限の単位の１０分の１まで、それぞれの介在値は、その範囲の上限と下限との間であり、記載された他の値またはその記載された範囲内のまたは介在値は、本発明に包含されることを理解されたい。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、独立して、より小さな範囲に含めることができ、本発明の範囲内に更に包含され、記載された範囲内で特に除外された制限を受ける。述べられる範囲が限界の一方または両方を備える場合、それらの含まれる限界のうちのいずれかまたは両方を除外する範囲もまた、本発明に含まれる。
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者に一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様または同等の任意の方法及び材料はまた、本発明の実施または試験においても使用することができるが、好ましい方法及び材料をここで説明する。本明細書で言及される全ての公開物は、公開物が引用されるものとの関連で方法及び／または材料を開示し、記載するために、参照によって本明細書に組み込まれる。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が別途明確に指示しない限り、複数の参照を含むことに留意すべきである。したがって、例えば「チャネル」への言及は、そのような複数のチャネルを含み、「アガロース－細胞領域」への言及は、当業者に公知の複数のアガロース－細胞領域及びその等価物への言及を含む。特許請求の範囲は、いかなる任意の要素も除外するように立案され得ることに更に留意されたい。したがって、この記述は、特許請求の要素の列挙に関連して「専ら」、「唯一の」等のような排他的な用語の使用または「否定的な」制限の使用のための先行基準としての役割を果たすことを意図している。
明瞭さのために別の実施形態の文脈中で記載された、本発明の特定の特徴は、また単一の実施形態と組み合わせて提供され得ることが認識される。逆に、簡潔にするために、単一の実施形態の文脈で説明される本発明の様々な特徴は、更に、別々にまたは任意の適切なサブコンビネーションで提供されてもよい。本発明に係る実施形態の全ての組み合わせは、本発明によって具体的に包含され、まさに各及び全ての組み合わせが個々にまたは明示的に開示されているかのように本明細書に開示される。加えて、様々な実施形態及びその要素の全てのサブコンビネーションもまた、本発明によって特異的に包含され、まさにそのようなサブコンビネーションが本明細書に個別に、明示的に開示されているかのように、本明細書に開示されている。
本明細書に論じられる公開物は専ら、本出願の出願日前のそれらの開示のためだけに提供される。本明細書内のいずれのものも、先行の発明という理由によりそのような公開物に先立する権利がないという了解として解釈されるべきではない。更に、示されている公開日は、実際の公開日とは異なる場合があり、別個に確認する必要がある。
上記に要約されるように、細胞集団を備えるバイオ人工限外濾過装置が開示される。装置を作製するための方法及び装置を使用する方法も本明細書に記載される。本明細書に提供されるバイオ人工装置は、半透性多孔性膜にわたって血液の濾過によって産生された限外濾過液を提供するために使用され得る。限外濾過液は、細胞集団に提供され得て、例えば、酸素及びグルコースなどの栄養素を細胞に提供し得る。限外濾過液は、インスリン及び他の代謝産物などの細胞によって分泌される分子を取り、限外濾過液を血液に戻すことができる。限外濾過液は、細胞によって包囲されるチャネル内に封入され得て、分子の交換速度を増加させる。本開示の装置は、様々な構成及び使用を有し得る。以下の節は、本明細書に開示される装置の様々な実施形態及び使用の詳細な説明を提供する。
細胞骨格
マトリックスにカプセル化された細胞集団を支持する骨格を本明細書に提供する。特定の実施形態では、平面骨格は３次元であり、第２の表面に反対の第１の表面を備える。平面骨格は、細胞集団及び複数のチャネルを支持するマトリックスを含有する空隙が作製された固体基質のシートを含み得る。
マトリックスにカプセル化された細胞集団を支持する骨格を本明細書に提供する。特定の実施形態では、平面骨格は３次元であり、第２の表面に反対の第１の表面を備える。平面骨格は、細胞集団及び複数のチャネルを支持するマトリックスを含有する空隙が作製された固体基質のシートを含み得る。
固体基質は、生体適合性ポリマー等の任意の好適な材料、例えば、ポリマーからなることができる。骨格の固体基質領域のための材料の非限定的な例は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，１３２，２１０号を参照されたい。骨格の固体基質領域のための材料の非限定的な例は、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ＰＬＧＡポリマー、ポリエステル、ポリ（アリルアミン）（ＰＡＭ）、ポリ（アクリレート）、変性スチレンポリマー、プルロニックポリオール、ポリオキサマー、ポリ（ウロン酸）、ポリ（ビニルピロリドン）、アルギン酸塩、ポリエチレングリコール、フィブリン、及びポリ（メチルメタクリレート）ならびに上記のいずれかのコポリマーまたは移植片コポリマーである。特定の実施形態では、骨格の固体基質は、アクリレートで構成される。特定の実施形態では、アクリレートは、アクリレートシートの形態である。
特定の実施形態では、固体基質は、レーザー－切断されて空隙を作製できる。特定の実施形態では、固体基質のシートは、レーザー切断されて空隙領域を作製する。特定の実施形態では、固体基質のシートは、個々の片に切断され得る２つ以上の空隙領域を作製するためにレーザー切断される。空隙または切り取りは、略真っ直ぐなまたは波打っているエッジを有する正方形または長方形、または略滑らかな周辺部を有する円形のような任意の形状を有することができる。空隙は、複数のチャネル及び複数のチャネルに隣接した細胞集団を収容するのに十分なサイズのものであってもよい。空隙のサイズは、装置のサイズに比例することができる。特定の場合では、固体表面は、０．１ｍｍ～１０ｍｍの厚さ、例えば０．５ｍｍ～５ｍｍ、または０．５ｍｍ～３ｍｍであり得て、立方体または直方体の形状であってもよく、第１の表面及び第２の表面の表面積は、１ｃｍ２～２００ｃｍ２、例えば、１ｃｍ２～１００ｃｍ２、１ｃｍ２～５０ｃｍ２、１ｃｍ２～２５ｃｍ２、または５ｃｍ２～５０ｃｍ２であってもよい。マトリックスは、１ｍｍ２～１０，０００ｍｍ２の表面積、例えば、１ｍｍ２～５０００ｍｍ２、１ｍｍ２～１０００ｍｍ２、１ｍｍ２～１００ｍｍ２を有し得る。特定の場合では、空隙は１００ｃｍ２またはそれ以下の表面積、例えば１５ｃｍ２またはそれ以下、１０ｃｍ２またはそれ以下、５ｃｍ２またはそれ以下、１ｃｍ２またはそれ以下、０．５ｃｍ２またはそれ以下、例えば、２０ｃｍ２～０．５ｃｍ２、１５ｃｍ２～０．３ｃｍ２、１０ｃｍ２～０．５ｃｍ２、５ｃｍ２～０．５ｃｍ２、または１ｃｍ２～０．５ｃｍ２を有し得る。空隙の深さ及びその中に配設されたマトリックスは、骨格を形成するために使用される固体基質の厚さによって決定され、２００ミクロン～１０００ミクロンの範囲内、例えば、２００ミクロン～９００ミクロン、２００ミクロン～８００ミクロン、３００ミクロン～７００ミクロン、２００ミクロン～７００ミクロン、または３００ミクロン～６００ミクロンであってもよい。特定の実施形態では、空隙は、約１～５ｍｍ（長さ）×１～５ｍｍ（幅）×０．５－１ｍｍ（深さ）、例えば、１ｍｍ×３ｍｍ×１ｍｍ、２ｍｍ×３ｍｍ×１ｍｍ、３ｍｍ×３ｍｍ×１ｍｍ、または４ｍｍ×４ｍｍ×１ｍｍを有してもよい。
特定の実施形態では、平面骨格はマトリックスを備える。特定の実施形態では、マトリックスは、複数のチャネル及び細胞集団を備える。特定の実施形態では、マトリックスは、空隙が作製された固体基質の第１及び第２の表面に垂直な方向に細長い支柱が配向される、複数の細長い支柱を空隙に配置することによって形成される。特定の実施形態では、細長い支柱は、管またはワイヤ、例えば、ポリテトラフルオロエレン（ＰＦＴＥ）コーティングワイヤなどであってもよい。特定の実施形態では、細長い支柱は、略円柱形状であり得る。細長い支柱の直径が、５０ミクロン～５００ミクロン、５０ミクロン～３００ミクロン、５０ミクロン～２００ミクロン、７５ミクロン～２００ミクロン、７５～１５０ミクロンなどの２５ミクロン～５００ミクロンの範囲内、例えば、直径１００μｍであってもよい。他の場合では、細長い支柱は長方形または不規則な形状を有し得る。マトリックスは、カプセル化細胞の生存率を支持する重合性生体適合性ポリマーから形成され得る。例えば、マトリックスは、細胞へ及び細胞からの分子（例えば、グルコース、酸素、インスリン）の輸送を可能にし得る。特定の実施形態では、マトリックスは、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（乳頭－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）ポリマー、アルギネート、アルギン酸誘導体、ゼラチン、コラーゲン、フィブリン、アガロース、ヒアルロン酸、ヒドロゲル、マトリゲル、天然多糖類、合成多糖、ポリアミノ酸、ポリエステル、ポリ無水物、ポリリン酸塩、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（アルキレンオキシド）、変性スチレンポリマー、プルロニックポリオール、ポリオキサマー、ポリ（ウロン酸）、またはポリ（ビニルピロリドン）ポリマーを備える。特定の実施形態では、マトリックスは、アガロースポリマー、細胞外マトリックス、ヒドロゲル、マトリゲル、またはこれらの混合物を備える。特定の実施形態では、マトリックスは、細胞集団を更に備える。特定の実施形態では、マトリックスは、本明細書に開示される非重合ポリマー及び細胞集団を備える組成物を、骨格の固体基質の空隙領域に配置することにより形成され、この空隙領域は細長い支柱を備える。次いで、組成物を重合し、細長い支柱を除去し、細胞集団及びワイヤの除去によって作製される複数のチャネルを備えるマトリックスを提供する。特定の実施形態では、複数のチャネルは、円筒形チャネルである。特定の実施形態では、チャネルは、長方形、円筒形、または正方形状である。特定の実施形態では、チャネルは、少なくとも直径２０μｍ、３０μｍ、４０μｍ、５０μｍ、６０μｍ、７０μｍ、８０μｍ、９０μｍ、１００μｍ、１１０μｍ、１２０μｍ、１３０μｍ、１４０μｍ、または１５０μｍである。特定の実施形態では、チャネルの直径は３０～２００μｍまたは５０～１５０μｍである。特定の実施形態では、チャネルは、平面骨格の第１の表面から第２の表面まで延在する。マトリックスは、チャネルが細胞集団に隣接している、３～２５，０００、５～１０，０００、１０～１０，０００、３０～１０，０００、５０～１０，０００、１００～１０，０００、１０００～１０，０００、１００～３０００、３～１００、３～７０、３～５０、３～２５、３～２０、５～１００、６～７５、７～５０、または８～２０などの２つ以上のチャネルを含み得る。マトリックスは、チャネル内の濾過液と細胞間の分子の効率的な交換を容易にするために、細胞から５００μｍ未満の距離で分離されるように構成される。
特定の実施形態では、骨格は、チャネルのうちの少なくとも１つが、細胞の六角形配列によって包囲される複数のチャネルを備える。特定の実施形態では、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、または少なくとも２０個のチャネルが、細胞の六角形配列によって取り囲まれている。特定の実施形態では、細胞は、細胞が４００ミクロン、３００ミクロン、または２００ミクロンなどの５００未満の距離だけチャネルから分離されるように、複数のチャネルのうちの少なくとも１つに隣接した。チャネルに隣接した細胞の存在は、少なくとも１つのチャネルから分子５００ミクロンの拡散を促進する。特定の実施形態では、マトリックスは、六角形の集団の細胞によって囲まれたチャネルの構成を備える。特定の実施形態では、骨格は、少なくとも５容積％、１０％（５，７００細胞等価／ｃｍ２）、２０％（１１，４００細胞等価／ｃｍ２）以上の細胞密度を含んでもよい。バイオ人工装置のマトリックスにおける細胞数は異なり得るし、また経験的に決定され得る。場合によっては、骨格は、少なくとも１０３細胞、１０５細胞、１０６細胞、１０１０細胞、例えば１０３～１０１０細胞、１０５～１０８細胞、１０３～１０６細胞、または１０５～１０６細胞を含み得る。特定の実施形態では、マトリックスは、細胞集団によって囲まれた複数のチャネルを含み、ここで、チャネル細胞領域の直径は、１００μｍ、２００μｍ、３００μｍ、４００μｍ、５００μｍ、６００μｍ、７００μｍ、８００μｍ、９００μｍ、または１０００μｍ、例えば、８００μｍ～１０００μｍの範囲内である。特定の実施形態では、骨格は、８つの１００μｍの直径の円柱状チャネルを有する８つの８００μｍのチャネル細胞領域を備える。従って、骨格は、未重合ポリマーと細胞との混合物を備える組成物の重合後に細胞がカプセル化されるマトリックスを備える。
特定の場合では、平面骨格で支持されたマトリックスは、図４５Ａ～Ｃに描写されるように構成され得る。図４５Ａは、平面骨格空洞内に配置される６ｍｍ×６ｍｍ×１．２ｍｍのマトリックスの等角図を示す。図４５Ｂは、複数の流体チャネル（ＦＣ）及び限外濾過液流の方向を有するマトリックス角の拡大を示す。図４５Ｃは、寸法と共に標識された膵島チャンバの膵島容量（ＩＶ）、構造容量（ＳＶ）、ＦＣ領域の上面図を示す。
特定の場合では、インスリン分泌細胞（膵臓細胞と称される）のマトリックスは、図４６に列挙される寸法を備える図４７に示される配置に従って構成され得る。例えば、インスリン分泌細胞は、５００～２０００ミクロンの厚さを有するマトリックスにカプセル化され得て、マトリックスは、限外濾過液の流れのための周期的配置の定義された構成を含み得るが、チャネルは、マトリックスの厚さを横断し、１０～１００ミクロンの幅を有し得る。
本明細書に記載の装置に含まれ得る細胞集団としては、骨髄細胞に限定されずに、間葉系幹細胞、間質細胞、多能性幹細胞（例えば、誘導された多能性幹細胞または胚性幹細胞）、血管細胞、アジピート組織由来の前駆細胞、前駆細胞由来の骨髄、腸細胞、膵島、ベータ細胞、膵島の前駆細胞、ベータ細胞の前駆細胞、末梢血前駆細胞、成体組織から単離された幹細胞、網膜前駆細胞、心臓前駆細胞、骨前駆細胞、神経前駆細胞、及び遺伝的に形質転換された細胞、またはそれらの組み合わせが挙げられる。細胞集団は、対象（自家性細胞）、別のドナー（同種細胞）、または他の種（異種細胞）からのものであってもよい。細胞は、骨格に導入され得て、骨格は、対象に直ちに（１日以内に）移植され得るか、または細胞は、より長い期間、例えば、１日以上培養できて、移植前に細胞増殖を可能にする。
特定の実施形態では、マトリックス中の細胞集団は幹細胞である。特定の実施形態では、マトリックス中の細胞集団は、膵島前駆細胞である。特定の実施形態では、マトリックス中の細胞集団は、膵島から単離された膵臓細胞である。特定の実施形態では、マトリックス中の細胞集団は、膵島から単離される膵島である。特定の実施形態では、マトリックス中の細胞集団は、ランゲルハンス膵島のような組織片の形態であってもよく、装置を受ける対象または別の対象から単離されてもよい。
特定の実施形態では、本明細書に開示される装置は、糖尿病、例えば、１型糖尿病を治療するために使用されてもよい。装置は、膵臓細胞を含み得るか、またはインスリン産生膵臓細胞に分化することができる幹細胞を含み得る。特定の実施形態では、多能性幹細胞（ＰＳＣｓ）は、装置の内部のインスリン産生膵臓細胞に分化され、次いで、分化されたインスリン産生膵臓細胞を含有するバイオ人工装置を対象に配置する（例えば、膵島または肝臓、腎臓、肺、または心臓または皮下に隣接した大網で、例えば、腕部または腹部に）。場合によっては、装置は、ＰＳＣを含み、装置を対象の膵島または肝臓に隣接して埋め込むことができる。
バイオ人工限外濾過装置
特定の実施形態では、バイオ人工限外濾過装置は、本明細書に記載される平面骨格、例えば、細胞集団の集団及び細胞集団に隣接した複数のチャネルを含むマトリックスを備える平面骨格であって、チャネルは、平面骨格の第１の表面の第１の表面から第２の表面まで延在する平面骨格と、平面骨格の第１の表面上に配置された第１の限外濾過半透膜と、平面骨格の第１の表面に隣接し、第１の限外濾過半透膜を介してのみ平面骨格と流体連通し、入口及び出口を備える第１の区画と、平面骨格の第２の表面に隣接しており、出口を備える第２の区画と、を含み得て、第１の限外濾過半透膜は、５ｎｍ～５ミクロンの範囲の幅を有する複数の孔を含み、第１の限外濾過半透膜は、第１の区画から複数のチャネルへの限外濾過液の輸送を可能にし、限外濾過液は、複数のチャネルから第２の区画へと横断する。
特定の実施形態では、バイオ人工限外濾過装置は、本明細書に記載される平面骨格、例えば、細胞集団の集団及び細胞集団に隣接した複数のチャネルを含むマトリックスを備える平面骨格であって、チャネルは、平面骨格の第１の表面の第１の表面から第２の表面まで延在する平面骨格と、平面骨格の第１の表面上に配置された第１の限外濾過半透膜と、平面骨格の第１の表面に隣接し、第１の限外濾過半透膜を介してのみ平面骨格と流体連通し、入口及び出口を備える第１の区画と、平面骨格の第２の表面に隣接しており、出口を備える第２の区画と、を含み得て、第１の限外濾過半透膜は、５ｎｍ～５ミクロンの範囲の幅を有する複数の孔を含み、第１の限外濾過半透膜は、第１の区画から複数のチャネルへの限外濾過液の輸送を可能にし、限外濾過液は、複数のチャネルから第２の区画へと横断する。
特定の実施形態では、バイオ人工装置は、動脈血液を含有する区画を挟む２つの平面骨格を含み得る。例えば、装置は、各々が、細胞集団及び細胞集団に隣接した複数のチャネルを含むマトリックスを備える第１の平面骨格及び第２の平面骨格であって、チャネルは、平面骨格の各々の第１の表面から第１の表面から第２の表面まで延在する第１の平面骨格及び第２の平面骨格と、第１及び第２の平面骨格の第１の表面上に配置された第１の限外濾過半透膜と、第１及び第２の平面骨格の第１の表面に隣接して挟まれており、入口及び出口を備える第１の区画であって、第１の限外濾過半透膜は、限外濾過液を第１の区画から骨格に輸送することを可能にする、第１の区画と、第１の平面骨格の第２の表面に隣接しており、出口を備える第２の区画と、第２の平面骨格の第２の表面に隣接しており、出口を備える第３の区画と、を含み得て、第１の限外濾過半透膜は、５ｎｍ～５ミクロンの範囲の幅を有する複数の孔を備え、限外濾過液は、骨格の複数のチャネルから第２の区画及び第３の区画へと横断する。
本開示の態様は、細胞集団及び細胞集団に隣接した複数のチャネルを含むマトリックスを備える平面骨格であって、チャネルは、平面骨格の第１の表面から第２の表面まで延在する、平面骨格と、第１の表面上に配置された第１の限外濾過半透膜と、平面骨格の第２の表面上に配置された第２の限外濾過半透膜と、第１の入口及び第１の出口を備える第１の区画であって、平面骨格の第１表面に隣接している第１の区画と、第２の入口及び第２の出口を備える第２の区画であって、平面骨格の第２の表面に隣接している第２の区画と、を含むバイオ人工装置を含み、第１の入口は対象の動脈に接続するように構成され、第１の出口は第２の区画の第２の入口に接続され、第２の区画の第２の出口は対象の静脈に接続するように構成され、限外濾過半透膜は、５ｎｍ～５ミクロンの範囲の幅を有する複数の孔を備え、限外濾過半透膜は、第１の区画内の動脈血液から濾過された限外濾過液を骨格に輸送し、骨格内の複数のチャネルから限外濾過液を第２の区画に輸送することを可能にする。特定の場合では、第１の出口は、第２の区画への血液の流速を低減するための手段を含み得る。場合によっては、手段は、圧力低減マニホールドを含み得る。場合によっては、第２の区画への血液の流速の低減のための手段は、圧力低減チャネルを含み得る。場合によっては、第２の区画を通る血液の流速は、第１の区画の幅と比較して低減された幅を有するチャネルを通して血液を導くことによって制御され得る。場合によっては、第２の区画を通る血液の流速は、第１の区画の幅と比較して低減された幅を有するように第２の区画をサイズ決定することによって制御され得る。
場合によっては、血液が装置に導入される第１の区画は、血液の限外濾過を容易にするために好適な寸法を有し得る。例えば、第１の区画は、１００ミクロン～６ｍｍの高さ、例えば５００ミクロン～４ｍｍ、１ｍｍ～３ｍｍ、または２ｍｍ～３ｍｍを有することができる。
特定の実施形態では、バイオ人工装置は、対象の体腔内に適合するように寸法決定される。装置は、長方形または円筒形であってもよい。特定の場合では、装置は１０～３０ｃｍ２、１０～２５ｃｍ２、１５～２５ｃｍ２、２０～２５ｃｍ２，１５～３０ｃｍ２などの５０ｃｍ２またはそれ以下の表面積を有し得る。特定の場合では、装置は、長方形であってもよく、及び３ｃｍ×１ｃｍ×０．５ｃｍから６ｃｍｘ４ｃｍｘ１ｃｍ、例えば、３ｃｍ×１ｃｍ×０．５ｃｍ、５ｃｍ×２ｃｍ×１ｃｍ、または６ｃｍｘ４ｃｍｘ１ｃｍの寸法（長さｘ幅ｘ高さ）などの３ｃｍ～１０ｃｍの長さ、１ｃｍ～６ｃｍの幅、０．３ｃｍ～２ｃｍの高さを有してもよい。
本明細書に記載されるように、本明細書に開示される装置は、少なくとも１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１年、３年、５年、１０年または５０年までかそれ以上、例えば、１ヶ月～５０年、１年～２５年、５年～５０年、５年～２５年、１０年～５０年、または１５年～２５年の機能的及び生存状態で移植された細胞を維持してもよい。
特定の実施形態では、本明細書に開示される装置は、対象に配置されたときに分解または融解しない不活性材料から作製されたハウジングに封入され得る。対象に置かれた医療用装置に承認された任意の材料は、医療グレードのプラスチック、不活性金属、例えば、チタニウム、ステンレス鋼等を備えるがこれらに限定されないで利用され得る。
特定の実施形態では、バイオ人工装置は、複数の限外濾過半透膜を備える。特定の実施形態では、限外濾過半透膜は、第１の表面上に配設され、平面骨格の第２の表面に配置される。骨格の第１の表面上に配設された半透濾過膜は、骨格の第２の表面上に配設された限外濾過半透膜と同じであってもよく、または異なってもよい。例えば、動脈血液を含有する区画に隣接した限外濾過半透膜は、マトリックス内のチャネルを通って流れている濾過液を含有する区画に隣接した限外濾過半透膜のより小さい孔を有し得る。場合によっては、動脈血液を含有する区画に隣接した限外濾過半透膜は、マトリックス内のチャネルを通って流れる限外濾過液を含有する区画に隣接した限外濾過半透膜よりも大きい孔を有し得る。特定の実施形態では、半透性膜は、動脈血液を含有する区画からの限外濾過液の濾過を可能にし、限外濾過液は骨格の複数のチャネルに輸送される。複数のチャネルは、細胞によって放出される分子を備える限外濾過液中の分子の効率的な交換を提供する細胞に隣接した。これらの分子は、チャネルの管腔と細胞周囲のマトリックスとの間の濃度依存性様式で拡散する。例えば、酸素、グルコース、脂質、ビタミン、等の分子、及びミネラルはチャネルの管腔からマトリックスへと細胞に拡散し、尿素、二酸化炭素、インスリンなどの細胞によって分泌された分子はチャネルの管腔に輸送される。一部の実施形態では、限外濾過液における分子のいくつかの拡散及び交換は、チャネルに入ることなく、マトリックスを透過する濾過液等でチャネルの外側に生じ得ることが理解される。
特定の実施形態では、限外濾過半透膜は、５ｎｍ～５ミクロンの範囲の幅を有する複数の孔を備える。一部の実施形態では、本開示は、画定された寸法及び構造、並びに密度の加工孔を備える膜を提供する。特定の実施形態では、膜の複数の表面は、タンパク質吸着を制限するように処理され得る。そのような処置は、特定の細胞型の接着を促進する、表面電荷、表面の遊離エネルギー、または処理を変化させる、またはそれを付与する処置を含み得る。特定の実施形態では、膜の少なくとも１つの孔は、表面処理の任意の組み合わせを備える。表面処理はかかる孔を通過し得る溶質のサイズ及び静電荷の制限をもたらすように機能する。表面処理の例は、例えば、米国特許出願公開第２００９０１３１８５８号（参照により全体が本明細書に組み込まれる）で検索できる。
特定の実施形態では、限外濾過半透膜は、生体液の濾過のために構成される。特定の実施形態では、膜は、孔の形状及びサイズが制御される複数のナノ孔を備える。特定の実施形態では、膜は、複数の孔を備える。特定の実施形態では、複数の孔は、微孔で有り得て、０．１μｍ～５μｍ、例えば、０．１μｍ～３μｍ、０．１μｍ～０．５μｍ、０．５μｍ～１μｍ、１μｍ～１．５μｍ、１．５μｍ～２μｍ、０．１μｍ～１μｍ、０．１μｍ～０．８μｍ、０．２μｍ～０．７μｍ、０．２μｍ～０．６μｍ、０．２μｍ～０．５μｍの範囲の幅を有してもよい。特定の実施形態では、複数の孔は、ナノ孔であってもよく、１ｎｍ～５００ｎｍの幅、例えば、１ｎｍ～９０ｎｍ、２ｎｍ～５０ｎｍ、３ｎｍ～４０ｎｍ、４ｎｍ～５０ｎｍ、４ｎｍ～４０ｎｍ、５ｎｍ～５０ｎｍ、５ｎｍ～２０ｎｍ、４ｎｍ～２０ｎｍ、７ｎｍ～１００ｎｍ、１２ｎｍ～２０ｎｍ、または５ｎｍ～１０ｎｍを有してもよい。特定の実施形態では、複数の孔は、スリット形状であり、本明細書に列挙される幅を有し、１μｍ～１０μｍの範囲の長さ、例えば、２μｍ～３μｍ、３μｍ～４μｍ、４μｍ～５μｍ、５μｍ～６μｍ、６μｍ～７μｍ、７μｍ～８μｍ、８μｍ～９μｍ、または９μｍ～１０μｍを有してもよい。特定の場合では、長方形の孔は、１００～１０００ｎｍの深さ、３ｎｍ～５０ｎｍの幅、及び１ミクロン～５ミクロンの長さを有してもよく、例えば、幅×長さ×深さが５ｎｍ～５０ｎｍ×１～２ミクロン×２００ｎｍ～５００ｎｍである。
特定の実施形態では、本開示の装置は、６ｍｍ×６ｍｍ、５ｍｍ×５ｍｍ、７ｍｍ×７ｍｍ、８ｍｍ×８ｍｍ、９ｍｍ×９ｍｍ、１０ｍｍ×１０ｍｍ、１０ｃｍ×１０ｃｍの寸法、例えば、１０ｍｍ×１０ｍｍ～１０ｃｍ×１０ｃｍを有する限外濾過半透膜を備える。一部の実施形態では、限外濾過半透膜は、長方形であってもよい。
特定の実施形態では、限外濾過半透膜は、０．５～１００ｃｍ２の範囲の表面積、例えば、３０～１００ｃｍ２、１０～３０ｃｍ２、１５～３０ｃｍ２、１５～２０ｃｍ２、２０～２５ｃｍ２、２５～３０ｃｍ２、０．５～１０ｃｍ２、０．７５～５ｃｍ２、０．７５～３ｃｍ２、または０．７５～２ｃｍ２を有する。
特定の実施形態では、本明細書に開示される装置は略平面であり得て、２０～１００ｃｍ２（各平面側面上）の範囲の表面積及び１ｃｍ～３ｃｍの厚さを有するように寸法決定され得る。特定の実施形態では、本明細書に開示される装置は、最大５００ｃｍ３の容積、例えば、５０～５００ｃｍ３、１００～５００ｃｍ３、１００～３００ｃｍ３、１００～１５０ｃｍ３を有し得る。特定の場合では、装置は、５～７５ｃｍ２の表面、例えば、５～５０ｃｍ２、１０～３０ｃｍ２、または１５～３０ｃｍ２を有する半透性膜を含み得る。膜中の孔のサイズは、１０ｎｍ～１００ｎｍ、例えば、１０ｎｍ～２０ｎｍであってもよい。
本開示の限外濾過半透膜は、生体液の濾過で使用するのに好適な任意の膜材料を含み、膜は、孔形成を構造的に支持することができる。好適な膜材料の例は、当該技術分野で既知であり、本明細書に記載される。
特定の実施形態では、膜材料は、合成、生物学的、及び／または生体適合性（例えば、身体の外側または内部に使用するための）である。材料は、限定されずに生体適合性のケイ素、コーティングされたケイ素材料、ポリシリコン、ケイ素超音波結晶性ダイヤモンド、ダイヤモンド様カルボン（ＤＬＣ）、ケイ素二酸化物、ＰＭＭＡ、ＳＵ－８、及びＰＴＦＥを備える。他の可能な材料としては、金属（例えば、チタン）、セラミックス（例えば、シリカまたは窒化ケイ素）、及びポリマー（ポリテトラフルオロエチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリスチレン、及びケイ素）を備える。膜用材料は、例えば、米国特許出願公開第２００９０１３１８５８号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）で検索できる。
本開示の限外濾過半透膜は、複数の孔を含み、孔形状は、直線、正方形、長方形（スリット形状）、円形、卵形、楕円形、または他の形状を備える。本明細書で使用される場合、孔の幅は、孔が円形、卵形、または楕円形である直径を指す。特定の実施形態では、膜は、単一の形状または形状の任意の組み合わせを備える孔を備える。特定の実施形態では、孔のサイズは、均一の高さである。特定の実施形態では、孔は、微細機械加工され、例えば、スリット形状の孔の寸法間が２０％未満、サイズ変動性、１０％未満サイズ変動性、または５％未満サイズ変動性である。特定の実施形態では、適切な孔径及び形状を決定する要因は、透水率と溶質の選択性との間のバランスを備える。特定の実施形態では、複数の孔は、膜を横断する分子の効率的な輸送を可能にする最適な流動効率を提供するスリット形状の孔である。特定の実施形態では、膜は、スリット－形状のナノ孔を備える。特定の実施形態では、限外濾過半透膜は、例えば、１ｃｍ２、０．５ｃｍ２、または０．４ｃｍ２の膜表面積上でおよそ１０３～１０８長方形スリット形状のナノ孔（例えば、１０４～１０８、または１０５～１０７）を有する。特定の実施形態では、限外濾過半透膜上のスリット形状ナノ孔の数は、膜が毛細灌流圧力で生理学的に十分な限外濾過容積を生成することを可能にするのに十分である。特定の実施形態では、限外濾過半透膜の多孔性は、約１％～５０％であり、例えば、１０％～５０％、２０％～５０％、または２０％～７５％等である。
特定の実施形態では、本開示は、例えば、ケイ素バルク及び表面ミクロン機械加工技術（例えば、Ｆｉｓｓｅｌｌ Ｗ Ｈ、及びその他の者、ＪＡｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ２００２；１３：６０２Ａを参照されたい、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を使用して製造される単一分散スリット形状の孔のスパースアレイを備える一連の膜を提供する。特定の実施形態では、限外濾過半透膜は、ミクロン電気機械系（ＭＥＭＳ）技術を使用するプロトタイプ型である。特定の実施形態では、プロセスは、４００μｍの厚さの二重側面研磨（ＤＳＰ）ケイ素ウエハ上の薄いＳｉＯ２（酸化物）の成長を使用し、ポリシリコン（約５００ｎｍ）の低圧化学蒸着（ＬＰＣＶＤ）が続く。特定の実施形態では、ウエハは、次いで、具体的にパターン化され、乾燥酸化、湿潤エッチングされ、第２のポリシリコン層を堆積され、４００ｎｍのポリシリコンが残り、基礎となる垂直酸化物層が曝露されるまで最後にブランケットエッチングされる。特定の実施形態では、垂直犠牲酸化物層は、膜の臨界ナノスケール孔径を定義する。特定の実施形態では、低温酸化物（ＬＴＯ）（約１μｍ）は、膜保護のための硬質マスクとして機能するために、ウエハのポリシリコン上に堆積される。特定の実施形態では、深い反応性イオンエッチング（ＤＲＩＥ）は、膜が開示されるまで各ウィンドウの背面を除去する。特定の実施形態では、犠牲酸化物は、製作プロセスの最終工程中に４９％フッ化水素酸（ＨＦ）中でエッチングされ、開いたナノスケールスリット孔を残す。特定の実施形態では、ウエハは、その後、それぞれ１５００のウィンドウを含有する６ｍｍ２×６ｍｍ２の有効領域で１ｃｍ×１ｃｍのチップに切断され、膜当たり合計１０６の孔を備える。特定の実施形態では、各長方形の孔は、７ｎｍの幅、３００ｎｍの深さ、及び２μｍの長さである。特定の実施形態では、ケイ素微孔膜（ＳμＭ）は、同様のプロセスを使用して、スリット１０００ｎｍ幅を有する４μｍ長の長方形のスリット孔により、５００ｎｍの深さのウエハ規模のアレイを生成するために製造される。特定の実施形態では、ウエハは、それぞれ１５００のウィンドウを含有する６×６ｍｍ２の有効領域を有する１ｃｍ×１ｃｍのチップを形成するためにダイスカットされ、膜当たり合計３．１２×１０６の孔を備える。特定の実施形態では、全ての膜を、従来の「ピラニア」洗浄手順を使用して洗浄してもよく、３：１硫酸（Ｈ２ＳＯ４）／過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）混合物に２０分間浸漬した後、脱イオン（ＤＩ）水中で十分にすすぐ。
特定の実施形態では、限外濾過半透膜は、ＰＥＧで変性される。ＰＥＧによって変性するための技法は、当該技術分野、例えば、Ｐａｐｒａ ｅｔ ａｌ．２００１（Ｐａｐｒａ、Ａ、ｅｔ ａｌ、Ｌａｎｇｍｕｉｒ ２００１、１７（５）、１４５７－１４６０）で周知されている。特定の実施形態では、限外濾過半透膜は、ＰＥＧで共有的に変性される。特定の実施形態では、ＰＥＧを用いた表面変性は、膜表面上のタンパク質汚染を防止または最小化する。特定の実施形態では、ＰＥＧ付着に使用される技法は、ケイ素表面シラノール基（Ｓｉ－ＯＨ）を、Ｓｉ－Ｏ－Ｓｉ－ＰＥＧ配列を形成するトリメトキシシラン基を通るＰＥＧポリマーの鎖に共有結合させる単一の反応工程を伴う。そのような実施形態において、限外濾過半透膜を、３ｍＭ２－［メトキシ（ポリエチレンオキシ）プロピル］トリメトキシシラン（ＰＥＧ－シラン）（Ｇｅｌｅｓｔ）ＳＩＭ６４９２．７）の溶液に７０℃でトルエンで２時間浸漬させた。特定の実施形態では、トルエン、エタノール、及びＤＩ水を伴う一連の広範な洗浄工程を使用して、未結合のＰＥＧ残基を洗い流した。
特定の実施形態では、開示される装置の区画は、装置に含まれる限外濾過半透膜及び骨格（複数可）と適合性のある任意の適切な形状及び構成である。
特定の実施形態では、本開示の装置は、図２１及び２２Ａ～２２Ｂに示されているとおりであり得る。図２１に示される装置は、動脈に接続するための管１２に接続された入口、及び対象の静脈または動脈に接続するために管１３に接続された出口を有する第１の区画を備える。第１の区画は、立方または直方体として略成形され、入口の開口、出口の開口及び第１の側面の開口以外の全ての側面で閉鎖される。この開口第１の側面は、本明細書に記載される半透性膜１０’を使用して閉鎖される。半透性膜は、第１の区画と骨格１１との間の制限された流体接続を可能にする。第１の区画は、不透過性の生体適合性材料を有する全ての他の側面に封入される。半透性膜１０’は、ゴム支持体又はガスケットなどの可撓性圧縮材料を使用して、第１の区画の開口第１の側面上に配設され得る。複数のチャネルを備える骨格と細胞集団は、半透性膜１０’に配設され得る。第２の半透性膜１０は、可撓性圧縮材料のフレームによって支持され得て、骨格１１に配設され得る。立方または直方体として略成形される第２の区画であって、出口（例えば、限外濾過液中のグルコース及び／またはインスリンの濃度を測定するために、対象の静脈または体腔あるいは分析物検出装置に接続するために）、半透性膜１０に隣接した第１の開口表面以外の全側面で閉じている。図２２Ａは、動脈に接続するために構成された管１２、または対象の動脈または静脈との接続のために構成された管１３、あるいは対象の第２の静脈または体腔もしくは分析物分析装置への接続のための限外濾過出口を備える組み立て装置を示す。本明細書で説明されるように、第１の区画は、平面骨格１１の第１の表面と流体連通している。特定の実施形態では、第２の区画２０は、平面骨格１１の第２の表面と流体連通している。特定の実施形態では、第１の区画は、膜１０’の孔によってのみ、平面骨格１１の第１の表面と流体連通している。特定の実施形態では、第２の区画は、膜１０内の孔によってのみ、平面骨格１１の第２の表面と流体連通している。特定の場合では、第２の半透性膜１０は、第１の半透性膜１０’の孔より大きいサイズである孔を含み得る。特定の場合では、第２の半透性膜１０は、第１の半透性膜１０’の孔より小さいサイズである孔を含み得る。特定の場合では、装置は、第２の半透性膜１０を含まない場合がある。これらの実施形態において、限外濾過液は、骨格において複数のチャネルから第２の区画まで流れ得る。
特定の実施形態では、装置は、増加した量の限外濾過液を提供するための２つの骨格を含み得る。例えば、かかる装置は、図２３Ａ及び２３Ｂ並びに３６Ａ～３６Ｂに描写されるように構成されてもよい。装置２５は、血液を第１の区画の入口を介して、第１の区画２６まで供給するために構成された管１２を備える。管は、動脈に接続されてもよい。装置は、血液を対象に戻すための管１３を含み得て、第１の区画２６の出口に接続され、または対象の動脈または静脈に接続されてもよい。装置２５はまた、限外濾過チャンバ３０ａ及び３０ｂに接続された限外濾過出口から限外濾過液を輸送するための管９も備える。図２３Ｂは、図２３Ａの装置の垂直断面を示す。図２３Ｂは、動脈血液が入る入口、及び血液から対象へ出るための出口を備える血液チャネル（第１の区画２６）を示す。第１の区画２６は、限外濾過液が限外濾過チャンバ（第２の区画３０ａ及び第３区画３０ｂ）内に移動する、２つの骨格１１ａと１１ｂとの間に挟まれている。また、第１の区画隣接した２６膜（１０ａ）及び限外濾過区画（第２の区画３０ａ及び第３の区画３０ｂ）隣接した第２の膜（１０ｂ）が示される。限外濾過区画（第２の区画３０ａ及び第３の区画３０ｂ）は、単一のチャネル３３に統合し、対象の静脈に接続するための導管９への接続のために構成される、チャネル３１ａ及び３１ｂに接続される。本明細書に記載されるように、一部の実施形態では、装置は、第２の膜１０ｂを含まない場合がある。一部の実施形態では、第２の膜１０ｂは、第１の膜１０ａの孔よりも幅よりも大きい孔を有し得る。一部の実施形態では、第２の膜１０ｂは、第１の膜１０ａの孔よりも幅が小さい孔を有し得る。
別の例示的な装置が図６に示される。装置４０は、対象の動脈に接続するための入口４１と、その入口４３を介して第２の区画５０に接続された出口４２とを備えた第１の区画４９を備える。第２の区画５０は、血液を対象の静脈に戻すための出口４４を備える。この実施形態において、限外濾過液は、第２の膜４８ａを通じて横断した後、第２の区画５０を介して対象に戻る。限外濾過液は、第１の膜４８ｂにわたる動脈血の濾過によって産生される。限外濾過液は、第２の区画５０の中に骨格４５内の細胞と交換される代謝産物を運ぶ。本明細書に記載されるように、一部の実施形態では、装置は、第２の膜４８ａを含まない場合がある。一部の実施形態では、第２の膜４８ａは、第１の膜４８ａの孔よりも幅が大きい孔を有し得る。
特定の態様では、骨格は、更に膵島チャンバ（ＩＣ）または細胞骨格と称され得て、図２０Ａ～２０Ｄに描写されるように形成され得る。図２０Ａは、支持基質１４上に配設された略平面の固体基質１５を示す。固体基質１５は、固体基質１５の一部分を除去することによって形成された空隙２を備える。支持基質は、細長い支柱（例えば、ワイヤまたは管）を略直線状の配向（固体基質１５の第１及び第２の表面に垂直な）で保持するための複数の穴またはインデント（３）を備える。図２０Ｂは、支持層１５の穴３に挿入されたワイヤ４を示す。空隙の外周は、境界１によってマークされる。図２０Ｃは、重合及び／または固化された（例えば、より低い温度で）マトリックス５で充填された空隙を例示する。前述の節で考察されるように、マトリックスは、細胞集団も備える。マトリックスが設定された後（例えば、重合を介して）、ワイヤ４は、骨格１１の第１の表面７から第２の表面８まで延在する複数のチャネル６を明らかにするために除去される（図２０Ｄ）。特定の態様では、複数のチャネルは、図４７Ａ～４７Ｃなどの長方形の外周を有し得る。図４７Ａ～４７Ｃは、細胞集団に隣接した複数の長方形状のチャネルを備える本開示の骨格の領域の概略図を示す。
図５５Ａ及び５５Ｂは、移植片を開示される装置に接続するためのコネクタの概略図を示す。カプセル－移植片コネクタは、バイオ人工装置を血管移植片に取り付け、装置と動脈及び静脈両端の両方の血管移植片との間の血液流路を提供する。図５５Ａは、装置－移植片コネクタの設計を示し、図５５Ｂは、この設計の断面図である。部品１は、コネクタを装置の血液ポートに接着させる（入口）。部品２は、血管移植片から装置への血液流路を提供し、より大きい直径の血管移植片から装置のより小さい直径の血液ポート（入口、図示せず）に徐々に移行するテーパ状管腔を有し得る。部品３は、部品２に血管移植片を圧縮することによって、血管移植片（部品４）を部品２に接着させる。部品４（血管移植片）は、装置－移植片コネクタと動脈もしくは静脈血管吻合部位のいずれかの間の血液経路を提供する（図示せず）。
特定の実施形態において、本明細書に提供される装置は、拡散により過度に対流することによって限外濾過液の形成を提供し、それによって、限外濾過液形成及び／または限外濾過液の流れの効率を増加させる。
方法
方法
本開示のバイオ人工装置は、装置における細胞集団を備える平面骨格に栄養素を輸送するために使用され得て、細胞によって対象に分泌される分子を含有する限外濾過液流を放出する。特定の実施形態では、細胞は前駆細胞である。特定の実施形態では、細胞は、膵島から単離された、または幹細胞（例えば、誘導された多能性幹細胞）の分化に由来するインスリン産生細胞等の膵臓細胞である。特定の実施形態では、細胞はインスリンを除外する。特定の実施形態では、細胞は、限外濾過流体へのインスリンを放出する。
特定の実施形態では、孔を備える限外濾過半透膜を有する本開示のバイオ人工装置は、対象の免疫系による攻撃から本明細書に記載される骨格にカプセル化された細胞を保護するために使用される。特定の実施形態では、本開示のバイオ人工装置は、細胞、免疫因子などの免疫系構成成分、例えば抗体及びサイトカインなどの通過を低減することができる。特定の実施形態では、本開示のバイオ人工装置は、免疫因子の通過を低減することができる。特定の実施形態では、本開示のバイオ人工装置は、サイトカインの通過を低減することができる。特定の実施形態では、本開示のバイオ人工装置は、装置の対象の血液から細胞への栄養素の輸送を可能にする一方で、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、及び／またはＩＬ－１βの通過を低減することができる。特定の実施形態では、本開示のバイオ人工装置は、少なくとも５０％（例えば、６０％～８０％）により免疫系の成分（例えば、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、及び／またはＩＬ－１βなどの免疫細胞、抗体、サイトカイン）の通過を低減することができる。特定の実施形態では、ナノ孔（例えば、ＰＥＧ表面コーティングを有するスリット形状のナノ孔膜）を備える限外濾過半透膜を有する本開示のバイオ人工装置は、栄養素及び小分子の細胞集団への交換に使用される。特定の実施形態では、バイオ人工装置は、限外濾過半透膜を通じたサイトカイン及び免疫グロブリンの拡散を制限し得る。
特定の実施形態では、本開示のバイオ人工装置は、マトリックス内の膵臓細胞の細胞生存率を増加させるマトリックスの膵臓細胞集団を備える。
本開示のバイオ人工装置は、それを必要とする対象の治療のためのバイオ人工装置内の細胞の有効数を収容するようにサイズ決定される。例えば、対象は、機能的細胞の欠如によって引き起こされる状態に苦しんでいる可能性があり、例えば、機能的細胞によって典型的に分泌された分子は、結果として生じる状態のレベルで分泌されないか、または分泌される。本開示のバイオ人工装置内に機能的細胞を提供することは、状態を緩和し得る。例示的な条件としては、１型糖尿病、パーキンソン病、筋ジストロフィーなどを備える。
装置は、皮下、腹腔内、または脳内、脊髄、膵島、肝臓、子宮、皮膚、膀胱、腎臓、筋肉などの身体の任意の好適な位置に移植されてもよい。移植部位は、治療を必要とする疾患／損傷した組織に基づいて選択され得る。真性糖尿病（ＤＭ）等の疾患の治療に関して、装置は、皮下空間または大網等の臨床的に便利な部位に配置され得る。装置は、本明細書に記載されるように、対象の血管系に接続されてもよい。場合によっては、装置は、血管移植片にインラインで接続されてもよい。場合によっては、装置は、限外濾過液を対象の動脈、静脈、体腔（例えば、腹腔内空洞）またはそれらの組み合わせに供給するために、対象に接続されてもよい。場合によっては、装置はカテーテルに接続されてもよく、接続されているカテーテルへの静脈に限外濾過液を供給する。
特定の場合では、装置は、対象の動脈に接続されてもよく、また、限外濾過液を同じ動脈に戻して供給することができる（例えば、動脈が装置に接続された部位の下流にある接続部で）。特定の場合では、装置は、対象の動脈に接続されてもよく、対象の静脈に限外濾過液を供給することができる。特定の場合では、装置は、対象の動脈に接続されてもよく、対象の体腔に限外濾過液を供給することができる。一部の実施形態では、装置は、例えば、限外濾過液中のインスリン及び／またはグルコースの濃度を測定するための分析物分析装置を使用して限外濾過液をサンプリングするためのサンプリングポートを含み得る。
特定の実施形態では、本明細書に開示されるバイオ人工装置は、糖尿病、例えば、１型糖尿病である患者を治療するために使用できる。装置は、膵臓細胞を含み得るか、膵臓細胞内に分化することができる幹細胞を含み得る。特定の実施形態では、多能性幹細胞（ＰＳＣ）は、装置内部の膵臓細胞内に分化され得る。場合によっては、装置は、ＰＳＣを含み、装置を対象の膵島または肝臓に隣接して埋め込むことができる。
本明細書に記載されるように、本明細書に開示される装置は、少なくとも１カ月及び最大２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、または１年以上の機能的及び生存状態で移植された細胞を維持してもよい。一部の実施形態において、本装置は、膵島、ベータ細胞、及び他のインスリン産生細胞を糖尿病の治療のために生存性及び機能的に維持することができるように、必須成分の供給を支持しながら、免疫隔離を提供する。
本明細書に開示される方法及び装置は、ヒト臨床及び獣医学的用途の両方に使用され得る。したがって、バイオ人工装置が投与される対象または患者は、人間であり得るか、または獣医学的用途の場合、実験、農業、家畜、または野生動物であり得る。対象装置及び方法は、ヒト、実験動物、例えば、サル及びチンパンジー、イヌ及びネコなどの飼育動物、ウシ、馬、ブタ、ヒツジ、ヤギなどの家畜、熊、パンダ、ライオン、トラ、ヒョウ、ゾウ、シマウマ、キリン、ゴリラ、イルカ、クジラなどの捕獲された野生動物などを備えるがこれらに限定されない動物に適用され得る。
動作中、血液は、患者の脈管構造（すなわち、動脈）からバイオ人工装置の第１の区画の入口へ向けられる。血液は、バイオ人工装置の第１の区画を通って流れ、栄養素及び小分子は、血液から限外濾過半透膜を通過し、一方、血液内の免疫グロブリン及びサイトカイン等の大きな分子は、装置の細胞への接触を予防する。栄養及び小分子は、制限を受けずにグルコース、酸素、及びインスリンを備える。限外濾過半透膜を通過する小分子及び栄養素を濾過して、細胞集団を備える装置のマトリックスに接触する限外濾過を形成する。特定の実施形態では、細胞集団はインスリンを限外濾過中に放出する。次いで、限外濾過液は、マトリックスの限外濾過チャネルを通過し、次いで、第２の限外濾過半透膜を通過する。任意に、第２の区画の出口は、カテーテルに接続するように構成され得る。特定の実施形態では、カテーテルは第２の静脈に接続する。
開示される装置は、血流の生理学的速度、１～１５ｍｌ／分の速度で限外濾過液を作り出す高速の限外濾過を提供する。
以下の実施例は、当業者に、完全な開示及び本発明の製造方法並びに使用方法を提供するように記載され、発明者がそれらの発明とみなす範囲を限定することは意図されず、以下の実験が全てであるか、または実験のみが行われることを表示するのを意図しない。使用された数字（例えば、量、温度など）に対する精度を確保する努力がなされたが、ある程度の実験誤差及び偏差が考慮されるべきである。別段の指示がない限り、部分は、重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏であり、圧力は大気圧またはそれに近い圧力である。標準的な略語を使用できて、例えば室温（ＲＴ）、塩基対（ｂｐ）、キロベース（ｋｂ）、ピコリットル（ｐｌ）、秒（ｓまたはｓｅｃ）、分（ｍまたはｍｉｎ）、時間（ｈまたはｈｒ）、日（ｄ）、週（ｗｋまたはｗｋｓ）、ナノリットル（ｎｌ）、ミクロンリットル（ｕｌ）、ミリリットル（ｍｌ）、リットル（Ｌ）、ナノグラム（ｎｇ）、ミクロングラム（μｇ）、ミリグラム（ｍｇ）、グラム（質量の意味で（ｇ））、キログラム（ｋｇ）、重力の等価物（（ｇ）、遠心分離の意味で）、ナノモル（ｎＭ）、ミクロンモル（μＭ）、ミリモル（ｍＭ）、モル（Ｍ）、アミノ酸（ａａ）、キロベース（ｋｂ）、塩基対（ｂｐ）、ヌクレオチド（ｎｔ）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、腹腔内（ｉ．ｐ．）、皮下（ｓ．ｃ．）等が挙げられる。
実施例１：
炎症誘発性サイトカインの通過を制限することによって中央分子選択性を提供するように、およそ７ｎｍ幅のスリット孔を用いて設計された、限外濾過半透膜、ケイ素ナノ孔膜（ＳＮＭ）の新生成の発達及び特性が示される。ＳＮＭにわたる圧力差を有する対流輸送の使用は、ナノメートルスケールの孔による拡散に関連する質量移動限界を克服する。ＳＮＭは、１３０ｍｌ／ｈｒ／ｍ２／ｍｍＨｇの透水率を呈した。ふるい係数の分析は、対流輸送下のＳＮＭを通ったサイトカイン通路の８０％の低減を明らかにした。ＳＮＭは浸潤サイトカインからカプセル化膵島を保護し、６時間かけて膵島生存率を保持し、非カプセル化対照とは異なるグルコースレベルの変化に応答して残った。これらの概念は、免疫構成成分の通過を防止しながら、カプセル化膵島の機能を支持するように、限外濾過を生成し、ＳＮＭを通るグルコース、インスリン、及び他の小分子の輸送を駆動するために、動脈と静脈との間の圧力差を使用することを伴う。ＳＮＭ設計及び製造、続いて、対流輸送によるサイトカイン負荷に対するその免疫の特性評価、及びＳＮＭカプセル化膵島生存率及びグルコースインスリン応答の評価を開発した。具体的には、ＳＮＭの透水率測定及び溶質選択性を決定した。マウス膵島は、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、及びＩＦＮ－γを備える炎症誘発性サイトカインのカクテルの存在下で、シミュレーションされた生理学的圧力差の下で、閉鎖模擬ループ流体回路内のＳＮＭ間にカプセル化された（図７）。膵島生存率及びグルコース刺激インスリン産生を評価して、対流性輸送下の膵島免疫単離のためのカプセル化材料としてＳＮＭの潜在性を示した。これらのデータは共に、膜膵島移植療法に対する前述の透水率及び免疫保護を呈する新しい膜を実証する。
炎症誘発性サイトカインの通過を制限することによって中央分子選択性を提供するように、およそ７ｎｍ幅のスリット孔を用いて設計された、限外濾過半透膜、ケイ素ナノ孔膜（ＳＮＭ）の新生成の発達及び特性が示される。ＳＮＭにわたる圧力差を有する対流輸送の使用は、ナノメートルスケールの孔による拡散に関連する質量移動限界を克服する。ＳＮＭは、１３０ｍｌ／ｈｒ／ｍ２／ｍｍＨｇの透水率を呈した。ふるい係数の分析は、対流輸送下のＳＮＭを通ったサイトカイン通路の８０％の低減を明らかにした。ＳＮＭは浸潤サイトカインからカプセル化膵島を保護し、６時間かけて膵島生存率を保持し、非カプセル化対照とは異なるグルコースレベルの変化に応答して残った。これらの概念は、免疫構成成分の通過を防止しながら、カプセル化膵島の機能を支持するように、限外濾過を生成し、ＳＮＭを通るグルコース、インスリン、及び他の小分子の輸送を駆動するために、動脈と静脈との間の圧力差を使用することを伴う。ＳＮＭ設計及び製造、続いて、対流輸送によるサイトカイン負荷に対するその免疫の特性評価、及びＳＮＭカプセル化膵島生存率及びグルコースインスリン応答の評価を開発した。具体的には、ＳＮＭの透水率測定及び溶質選択性を決定した。マウス膵島は、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、及びＩＦＮ－γを備える炎症誘発性サイトカインのカクテルの存在下で、シミュレーションされた生理学的圧力差の下で、閉鎖模擬ループ流体回路内のＳＮＭ間にカプセル化された（図７）。膵島生存率及びグルコース刺激インスリン産生を評価して、対流性輸送下の膵島免疫単離のためのカプセル化材料としてＳＮＭの潜在性を示した。これらのデータは共に、膜膵島移植療法に対する前述の透水率及び免疫保護を呈する新しい膜を実証する。
１．１ 材料及び方法
実験の概要
ＳＮＭを作製して約７ｎｍの幅、３００ｎｍの深さ、及び２μｍの長さを備える約１０６長方形スリット孔からなる活性膜領域（６×６ｍｍ）を産出した。
（図１）。その後、ＳＮＭの表面を、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で変性し、タンパク質汚染を最小限に抑えた。この研究における全てのＳＮＭ膜を、約７ｎｍの平均孔径で試験した。小溶質の輸送は、圧力駆動濾過アセンブリを使用して、単一のＳＮＭを介してサイトカインを含んで最初に分析された（図８）。生理学的圧力における対流限外濾過を用いて提案されるバイオ膵島装置、２つの封入されたＳＮＭ（図９）を有する３層のフローセルからなるベンチトップ型模擬ループ回路の構造を模倣するために、上、中、及び下の区画は、それぞれ、「動脈」、「カプセル化膵島チャンバ」、及び「静脈」を再現した。その後、サイトカイン、グルコース、及びインスリンの割合は、模擬ループ装置の異なる場所内に特徴付けられた。最後に、循環サイトカインを用いた模擬ループ回路におけるＳＮＭカプセル化マウスの生存率及びグルコース－インスリン応答を試験した。
実験の概要
ＳＮＭを作製して約７ｎｍの幅、３００ｎｍの深さ、及び２μｍの長さを備える約１０６長方形スリット孔からなる活性膜領域（６×６ｍｍ）を産出した。
（図１）。その後、ＳＮＭの表面を、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で変性し、タンパク質汚染を最小限に抑えた。この研究における全てのＳＮＭ膜を、約７ｎｍの平均孔径で試験した。小溶質の輸送は、圧力駆動濾過アセンブリを使用して、単一のＳＮＭを介してサイトカインを含んで最初に分析された（図８）。生理学的圧力における対流限外濾過を用いて提案されるバイオ膵島装置、２つの封入されたＳＮＭ（図９）を有する３層のフローセルからなるベンチトップ型模擬ループ回路の構造を模倣するために、上、中、及び下の区画は、それぞれ、「動脈」、「カプセル化膵島チャンバ」、及び「静脈」を再現した。その後、サイトカイン、グルコース、及びインスリンの割合は、模擬ループ装置の異なる場所内に特徴付けられた。最後に、循環サイトカインを用いた模擬ループ回路におけるＳＮＭカプセル化マウスの生存率及びグルコース－インスリン応答を試験した。
１．２ 基質調製
１．２．１ ケイ素ナノ孔膜（ＳＮＭ）アーキテクチャ及び製作
ケイ素ナノ孔膜（ＳＮＭ）は、いくつかの変性と共に以前に報告されたＭＥＭＳ技術によりケイ素基質から試作された（図２Ａ～Ｉ）。簡潔に言うと、プロセスは、４００μｍの厚さの二重側面研磨（ＤＳＰ）ケイ素ウエハ上の薄いＳｉＯ２（酸化物）の成長を使用し、ポリシリコン（約５００ｎｍ）の低圧化学蒸着（ＬＰＣＶＤ）が続く。次いで、ウエハは、第２のポリシリコン層で具体的にパターン化され、乾燥酸化され、ウェットエッチングされ、堆積され、４００ｎｍのポリシリコンが残ったままであり、基礎となる垂直酸化物層が曝露されるまで最後にブランケットエッチングされた。垂直犠牲酸化物層は、膜の臨界ナノスケール孔径を定義した。低温酸化物（ＬＴＯ）（約１μｍ）を、膜保護のための硬質マスクとして機能するために、ウエハのポリシリコン上に堆積した。深度反応イオンエッチング（ＤＲＩＥ）は、膜が開示されるまで各ウィンドウの背面を除去した。最終的に、犠牲酸化物は、製作プロセスの最終工程中に４９％のフッ化水素酸（ＨＦ）中でエッチングされて、開口ナノスケールスリット孔を残す。その後、ウエハ、１５００ウィンドウをそれぞれ含有する有効領域６×６ｍｍ２で１×１ｃｍチップに切断し、膜当たり合計１０６孔を備える。各長方形の孔は、７ｎｍの幅、３００ｎｍの深さ、及び２μｍの長さであった。全ての膜を、従来の「ピラニア」洗浄手順を使用して洗浄し、３：１の硫酸（Ｈ２ＳＯ４）／過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）混合物に２０分間浸漬した後、脱イオン（ＤＩ）水で十分にすすいだ。走査電子顕微鏡（平均値の標準誤差）（Ｌｅｏ１５５０）を使用してＳＮＭの画像を得た（図１）。
１．２．１ ケイ素ナノ孔膜（ＳＮＭ）アーキテクチャ及び製作
ケイ素ナノ孔膜（ＳＮＭ）は、いくつかの変性と共に以前に報告されたＭＥＭＳ技術によりケイ素基質から試作された（図２Ａ～Ｉ）。簡潔に言うと、プロセスは、４００μｍの厚さの二重側面研磨（ＤＳＰ）ケイ素ウエハ上の薄いＳｉＯ２（酸化物）の成長を使用し、ポリシリコン（約５００ｎｍ）の低圧化学蒸着（ＬＰＣＶＤ）が続く。次いで、ウエハは、第２のポリシリコン層で具体的にパターン化され、乾燥酸化され、ウェットエッチングされ、堆積され、４００ｎｍのポリシリコンが残ったままであり、基礎となる垂直酸化物層が曝露されるまで最後にブランケットエッチングされた。垂直犠牲酸化物層は、膜の臨界ナノスケール孔径を定義した。低温酸化物（ＬＴＯ）（約１μｍ）を、膜保護のための硬質マスクとして機能するために、ウエハのポリシリコン上に堆積した。深度反応イオンエッチング（ＤＲＩＥ）は、膜が開示されるまで各ウィンドウの背面を除去した。最終的に、犠牲酸化物は、製作プロセスの最終工程中に４９％のフッ化水素酸（ＨＦ）中でエッチングされて、開口ナノスケールスリット孔を残す。その後、ウエハ、１５００ウィンドウをそれぞれ含有する有効領域６×６ｍｍ２で１×１ｃｍチップに切断し、膜当たり合計１０６孔を備える。各長方形の孔は、７ｎｍの幅、３００ｎｍの深さ、及び２μｍの長さであった。全ての膜を、従来の「ピラニア」洗浄手順を使用して洗浄し、３：１の硫酸（Ｈ２ＳＯ４）／過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）混合物に２０分間浸漬した後、脱イオン（ＤＩ）水で十分にすすいだ。走査電子顕微鏡（平均値の標準誤差）（Ｌｅｏ１５５０）を使用してＳＮＭの画像を得た（図１）。
１．２．２ ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）でＳＮＭの表面変性。
ＳＮＭは、いくつかの変性を用いて、以前に報告されたプロトコルを使用してＰＥＧで共有的に変性し、膜表面上のタンパク質汚染を防止する。ＰＥＧ付与に使用される技法は、ケイ素表面シラノール基（Ｓｉ－ＯＨ）をＳｉ－Ｏ－Ｓｉ－ＰＥＧ配列を形成する三重メトキシシラン基を介してＰＥＧポリマーの鎖に共有結合させる単一の反応工程を伴う。簡潔に言うと、ＳＮＭを３ｍＭ２［メトキシ（ポリエチレンオキシ）プロピル］トリメトキシシラン（ＰＥＧシラン）の溶液に（Ｇｅｌｅｓｔ：ＳＩＭ６４９２．７）トルエンで２時間にわたって７０℃で浸した。トルエン、エタノール、及びＤＩ水を備える一連の広範な洗浄工程を使用して、未結合のＰＥＧ残基を洗い流した。
ＳＮＭは、いくつかの変性を用いて、以前に報告されたプロトコルを使用してＰＥＧで共有的に変性し、膜表面上のタンパク質汚染を防止する。ＰＥＧ付与に使用される技法は、ケイ素表面シラノール基（Ｓｉ－ＯＨ）をＳｉ－Ｏ－Ｓｉ－ＰＥＧ配列を形成する三重メトキシシラン基を介してＰＥＧポリマーの鎖に共有結合させる単一の反応工程を伴う。簡潔に言うと、ＳＮＭを３ｍＭ２［メトキシ（ポリエチレンオキシ）プロピル］トリメトキシシラン（ＰＥＧシラン）の溶液に（Ｇｅｌｅｓｔ：ＳＩＭ６４９２．７）トルエンで２時間にわたって７０℃で浸した。トルエン、エタノール、及びＤＩ水を備える一連の広範な洗浄工程を使用して、未結合のＰＥＧ残基を洗い流した。
１．２．３ ＳＮＭ孔径特徴の透水率
自動化された質量及び圧力測定システムが、接線流濾過操作下で、ＳＮＭを介して液体流量を特徴付けるために利用された。ＳＮＭの孔径は、次の式１：
を使用した濾過フローパラメータに関連付けることができ、式中、ｈは孔の幅であり、Ｈは粘度であり、ｌは膜厚であり、Ｑは容積流量であり、ｎは膜当たりの孔数であり、ｗは孔の長さであり、ΔＰは、膜貫通圧力である。ＳＮＭ孔径特性評価（図９）の全体的なシステムを組み立てるために、空気をシリンジポンプ（Ｓｉｇｍａ：Ｚ６７５７０９）を通って貯水槽へ加える。水を蠕動ポンプ（マスターフレックス：０７５５１－００）により差圧トランスデューサ（Ｏｍｅｇａ：ＰＸ４２９ ０１５ＧＩ）を通って、カプセル化膜を有するフローセルによって循環され、元の貯水槽に戻される。フローセルを水下で水没したＳＮＭで組み立てて、全ての区画から気泡を除去した。具体的には、膜の上部に位置付けられたカスタマイズされたケイ素ガスケットと対向するポリシリコンインターフェースを用いて膜が配置され、ガスケットの頂部に濾液チャンバの最終配置が続く。全てのセクションを一緒に固定し、ガスケットが視覚的に圧縮されるまで手で締め付けられた六角ボルトで基部に固定された。膜を通して浸透した限外濾過透過は、精密質量バランス上に置かれた液体収集容器に送られた（Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ：ＸＳ２０５）。差圧トランスデューサ及び質量バランスからの測定値は、データ取得用ノートパソコンで自動的に収集された。典型的な膜透水率試験は、５ｍｌ／分の流量及び４圧力サイクル（５、１、５、及び１ｐｓｉ）からなり、それぞれ１５０秒の期間かかった。
自動化された質量及び圧力測定システムが、接線流濾過操作下で、ＳＮＭを介して液体流量を特徴付けるために利用された。ＳＮＭの孔径は、次の式１：
個々のウエハ設計に基づいて提供される孔長、膜厚、及び孔の総数の仕様を用いて、式１を使用して計算した。この研究における全てのＳＮＭ膜は、ＰＥＧで表面変性され、約７ｎｍの平均孔径を呈した。
１．３ ＳＮＭ免疫単離インビトロの評価
１．３．１ 膜圧力駆動濾過下の膜ふるい係数
流体は、差圧トランスデューサ、密閉されたＳＮＭを備えるポリカーボネートフローセル、３方向バルブ、及び流体リザーバから構成された回路を通して、蠕動ポンプによって循環された（図８）。フローセルは、単一ＳＮＭ及びケイ素ガスケットを挟む２つの別個のフローセル区画からなる。頂部濾液チャンバは、液体収集容器に浸透された限外濾過液をルーティングし、この基部チャンバは３方向バルブに接続された。３％ウシ血清アルブミンの溶液（ＢＳＡ）（Ｓｉｇｍａ：Ａ－７０３０）を使用して、実験前に全体を平面化した。３％のＢＳＡ溶液中マウスサイトカインＴＮＦ－α（１０００Ｕ／ｍｌ）（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ：３１５－０１Ａ）、ＩＦＮ－γ（１０００Ｕ／ｍｌ）（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ：３１５－０５）、ＩＬ－１β（５０Ｕ／ｍｌ）（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ：２１１－１１Ｂ）３７、グルコース（４００ｍｇ／ｄＬ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ：Ｇ８２７０）、及びインスリン（１５０ｍＵ／Ｌ）（Ｎｏｖｏノルディスク：０１６９～１８３３－１１）からなる溶液は、次いで、生理学的圧力差約２ｐｓｉ３８で５ｍｌ／分で回路に切り替えられた。ＳＮＭを介して透過した限外濾過液を、最大６時間の様々な時点で回収し、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ：５６０４７８＿＆５５８２５８、Ｔｈｅｒｍｏ Ｐｉｅｒｃｅ： ＥＭ２ＩＬ１Ｂ）。ＳＮＭにわたる溶質のふるい係数を、次の式２：
を使用して計算し、Ｓは、ふるい係数であり、Ｃｆは、濾液中の溶質の濃度であり、Ｃｂはバルクレトチン酸溶液中の分子濃度である。
１．３．１ 膜圧力駆動濾過下の膜ふるい係数
流体は、差圧トランスデューサ、密閉されたＳＮＭを備えるポリカーボネートフローセル、３方向バルブ、及び流体リザーバから構成された回路を通して、蠕動ポンプによって循環された（図８）。フローセルは、単一ＳＮＭ及びケイ素ガスケットを挟む２つの別個のフローセル区画からなる。頂部濾液チャンバは、液体収集容器に浸透された限外濾過液をルーティングし、この基部チャンバは３方向バルブに接続された。３％ウシ血清アルブミンの溶液（ＢＳＡ）（Ｓｉｇｍａ：Ａ－７０３０）を使用して、実験前に全体を平面化した。３％のＢＳＡ溶液中マウスサイトカインＴＮＦ－α（１０００Ｕ／ｍｌ）（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ：３１５－０１Ａ）、ＩＦＮ－γ（１０００Ｕ／ｍｌ）（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ：３１５－０５）、ＩＬ－１β（５０Ｕ／ｍｌ）（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ：２１１－１１Ｂ）３７、グルコース（４００ｍｇ／ｄＬ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ：Ｇ８２７０）、及びインスリン（１５０ｍＵ／Ｌ）（Ｎｏｖｏノルディスク：０１６９～１８３３－１１）からなる溶液は、次いで、生理学的圧力差約２ｐｓｉ３８で５ｍｌ／分で回路に切り替えられた。ＳＮＭを介して透過した限外濾過液を、最大６時間の様々な時点で回収し、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ：５６０４７８＿＆５５８２５８、Ｔｈｅｒｍｏ Ｐｉｅｒｃｅ： ＥＭ２ＩＬ１Ｂ）。ＳＮＭにわたる溶質のふるい係数を、次の式２：
１．３．２ 模擬ループ回路における溶質分布
最終バイオ人工膵島装置のアーキテクチャを模倣するための細胞なしの３つのフローセル成分を有する模擬ループ回路アセンブリである。簡潔に言うと、カスタマイズされたケイ素ガスケットフレームを備える２つのＳＮＭは、３つのフローセル成分の間に挟まれた。中央フローセルは、２つの膜を分離する円柱チャンバから構成されるカプセル化チャンバであった。蠕動ポンプは、「動脈」を模倣するフローセルの上部を通り、次いで「静脈」に似ているフローセルの底部にわたって、最終的に元のリザーバに戻る流体を駆動した。対流実験に関して、３方向バルブを使用して、フローセルの上部と底部区画との間の生理学的圧力差約２ｐｓｉのためのフロー抵抗を生成した。限外濾過は、この圧力差において中央カプセル化チャンバで起こった。３層バイオ人工膵島装置を通したサイトカインの輸送を研究するために、３％ＢＳＡ中マウスサイトカインＴＮＦ－α（１０００Ｕ／ｍｌ）、ＩＦＮ－γ（１０００Ｕ／ｍｌ）、及びＩＬ－１β（５０Ｕ／ｍｌ）、グルコース（４００ｍｇ／ｄＬ）、インスリン（１５０ｍＵ／Ｌ）からなる溶液を、５ｍｌ／分の流速で回路を通して循環させた。１０００ｎｍ幅スリット孔（ＳμＭ）を有するケイ素膜を対照として使用した。上、中、及び下チャンバについては、溶液を回収し、６時間の実験の終わりにＥＬＩＳＡで分析した。
最終バイオ人工膵島装置のアーキテクチャを模倣するための細胞なしの３つのフローセル成分を有する模擬ループ回路アセンブリである。簡潔に言うと、カスタマイズされたケイ素ガスケットフレームを備える２つのＳＮＭは、３つのフローセル成分の間に挟まれた。中央フローセルは、２つの膜を分離する円柱チャンバから構成されるカプセル化チャンバであった。蠕動ポンプは、「動脈」を模倣するフローセルの上部を通り、次いで「静脈」に似ているフローセルの底部にわたって、最終的に元のリザーバに戻る流体を駆動した。対流実験に関して、３方向バルブを使用して、フローセルの上部と底部区画との間の生理学的圧力差約２ｐｓｉのためのフロー抵抗を生成した。限外濾過は、この圧力差において中央カプセル化チャンバで起こった。３層バイオ人工膵島装置を通したサイトカインの輸送を研究するために、３％ＢＳＡ中マウスサイトカインＴＮＦ－α（１０００Ｕ／ｍｌ）、ＩＦＮ－γ（１０００Ｕ／ｍｌ）、及びＩＬ－１β（５０Ｕ／ｍｌ）、グルコース（４００ｍｇ／ｄＬ）、インスリン（１５０ｍＵ／Ｌ）からなる溶液を、５ｍｌ／分の流速で回路を通して循環させた。１０００ｎｍ幅スリット孔（ＳμＭ）を有するケイ素膜を対照として使用した。上、中、及び下チャンバについては、溶液を回収し、６時間の実験の終わりにＥＬＩＳＡで分析した。
１．３．３ 模擬ループ回路内の膜カプセル化膵島の培養物
マウス膵島の単離を伴う記述された全ての手順を、カリフォルニア大学サンフランシスコ校（ＵＣＳＦ）の施設内動物管理及び使用委員会（ＩＡＣＵＣ）が承認したプロトコルに従って実施した。マウス膵島を以前に記載されたプロトコル４０に基づく８から１０週齢の雄Ｂ６マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から単離した。回収された膵島を、Ｌ－グルタミン及び１１．１ｍＭのグルコース（Ｇｉｂｃｏ：１１８７５－０９３）、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ： １６０００）、及び１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）（ＵＣＳＦ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ：ＣＣＦＧＫ００３）を含むＰＲＭＩ１６４０での懸濁培養に維持した。５００マウス膵島の群を、模擬ループ装置の中央カプセル化チャンバに導入した（図７）。サイトカイン曝露した細胞性能を評価するために、回路リザーバは、６時間、ＴＮＦ－α（１０００Ｕ／ｍｌ）、ＩＦＮ－γ（１０００Ｕ／ｍｌ）、及びＩＬ－１β（５０Ｕ／ｍｌ）で添加される培養培地と交換された。サイトカイン曝露を伴うまたは伴わない静的培養条件を対照として用いた。その後、マウス膵島を生存試験及びグルコース負荷のために単離した。
マウス膵島の単離を伴う記述された全ての手順を、カリフォルニア大学サンフランシスコ校（ＵＣＳＦ）の施設内動物管理及び使用委員会（ＩＡＣＵＣ）が承認したプロトコルに従って実施した。マウス膵島を以前に記載されたプロトコル４０に基づく８から１０週齢の雄Ｂ６マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から単離した。回収された膵島を、Ｌ－グルタミン及び１１．１ｍＭのグルコース（Ｇｉｂｃｏ：１１８７５－０９３）、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ： １６０００）、及び１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）（ＵＣＳＦ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ：ＣＣＦＧＫ００３）を含むＰＲＭＩ１６４０での懸濁培養に維持した。５００マウス膵島の群を、模擬ループ装置の中央カプセル化チャンバに導入した（図７）。サイトカイン曝露した細胞性能を評価するために、回路リザーバは、６時間、ＴＮＦ－α（１０００Ｕ／ｍｌ）、ＩＦＮ－γ（１０００Ｕ／ｍｌ）、及びＩＬ－１β（５０Ｕ／ｍｌ）で添加される培養培地と交換された。サイトカイン曝露を伴うまたは伴わない静的培養条件を対照として用いた。その後、マウス膵島を生存試験及びグルコース負荷のために単離した。
１．３．４ 膵島の生存率
膵島生存率を、アレルギー及び感染性疾患の国立研究所（ＮＩＡＩＤ）からプロトコルにより記述されるようにフルオレセインジアセタート（ＦＤＡ）（Ｓｉｇｍａ：Ｆ７３７８）及びプロピジウムヨウ化物（ＰＩ）（Ｓｉｇｍａ：２８７０７５）の二重染色によって評価された（ＳＯＰドキュメント：３１０４、Ａ０２）。簡潔に言うと、マウス膵島を、３０分間、０．０６７ＨＭ ＦＤＡ及び４．０ＨＭ ＰＩを含有するリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中でインキュベートし、過剰な染色を除去するためにＰＢＳで広範囲に洗浄した。マウス膵島の画像を、レーザー走査ＮｉｋｏｎスペクトルＣ１ｓｉ共焦点顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して取得した。膵島の生存率は、膵島中の生細胞の数とその範囲内の比に基づいて計算された。
膵島生存率を、アレルギー及び感染性疾患の国立研究所（ＮＩＡＩＤ）からプロトコルにより記述されるようにフルオレセインジアセタート（ＦＤＡ）（Ｓｉｇｍａ：Ｆ７３７８）及びプロピジウムヨウ化物（ＰＩ）（Ｓｉｇｍａ：２８７０７５）の二重染色によって評価された（ＳＯＰドキュメント：３１０４、Ａ０２）。簡潔に言うと、マウス膵島を、３０分間、０．０６７ＨＭ ＦＤＡ及び４．０ＨＭ ＰＩを含有するリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中でインキュベートし、過剰な染色を除去するためにＰＢＳで広範囲に洗浄した。マウス膵島の画像を、レーザー走査ＮｉｋｏｎスペクトルＣ１ｓｉ共焦点顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して取得した。膵島の生存率は、膵島中の生細胞の数とその範囲内の比に基づいて計算された。
１．３．５ インスリン分泌アッセイで刺激されたグルコース
模擬ループ回路の中央チャンバから取り出されたマウス膵島を、３０ｍｇ／ｄＬのグルコース（Ｇｉｂｃｏ：１１８７９）を含有するＲＰＭＩ１６４０に、１５分間３００ｍｇ／ｄＬの培地に曝露される前に１５分間置かれた。グルコース刺激の後、次いで、膵島を３ｏｍｇ／ｄＬグルコースを含有する培地に戻した。一連のインキュベーション中に５分毎に上清を収集し、インスリン含有量をマウスインスリンＥＬＩＳＡキット（Ｍｅｒｃｏｄｉａ：１０～１２４７－０１）で測定し、抽出された総タンパク質濃度（Ｔｈｅｒｍｏ：７８５０５、２３２２５）により正規化した。
模擬ループ回路の中央チャンバから取り出されたマウス膵島を、３０ｍｇ／ｄＬのグルコース（Ｇｉｂｃｏ：１１８７９）を含有するＲＰＭＩ１６４０に、１５分間３００ｍｇ／ｄＬの培地に曝露される前に１５分間置かれた。グルコース刺激の後、次いで、膵島を３ｏｍｇ／ｄＬグルコースを含有する培地に戻した。一連のインキュベーション中に５分毎に上清を収集し、インスリン含有量をマウスインスリンＥＬＩＳＡキット（Ｍｅｒｃｏｄｉａ：１０～１２４７－０１）で測定し、抽出された総タンパク質濃度（Ｔｈｅｒｍｏ：７８５０５、２３２２５）により正規化した。
１．４ 統計的分析
スチューデントのｔ検定を使用して試料対を分析した。複数の試料を、一方向または二方向分散分析（ＡＮＯＶＡ）で評価し、続いてＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いてＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ及び複数の比較を行った。Ａのｐ値＜０．０５は、すべての分析において統計的に有意であると認められた。
スチューデントのｔ検定を使用して試料対を分析した。複数の試料を、一方向または二方向分散分析（ＡＮＯＶＡ）で評価し、続いてＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いてＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ及び複数の比較を行った。Ａのｐ値＜０．０５は、すべての分析において統計的に有意であると認められた。
１．５ 結果
ＭＥＭＳ製作技術は、免疫構成成分の通過を選択的に遮断することができる制御された孔寸法を操作するための再現性及び精度における比類のない潜在性を提供し、一方、包まれた細胞の生存率を維持するために小分子（例えば、グルコース及びインスリン）の輸送を可能にする。本研究において、ＳＮＭの透過性及び選択性は、サイトカイン浸潤を防止しすることを特徴とし、対流輸送において模擬ループ装置のＳＮＭ－カプセル化マウス膵島の機能的性能を評価した。
ＭＥＭＳ製作技術は、免疫構成成分の通過を選択的に遮断することができる制御された孔寸法を操作するための再現性及び精度における比類のない潜在性を提供し、一方、包まれた細胞の生存率を維持するために小分子（例えば、グルコース及びインスリン）の輸送を可能にする。本研究において、ＳＮＭの透過性及び選択性は、サイトカイン浸潤を防止しすることを特徴とし、対流輸送において模擬ループ装置のＳＮＭ－カプセル化マウス膵島の機能的性能を評価した。
１．５．１ ＳＮＭ設計及び製作
半透性膜、ＳＮＭの新生成物は、Ｄｅｓａｉら、２６、２７によって最初に研究されたスリット－孔設計を有する。ＳＮＭは、約１％の孔径分布を呈し、５～１５ｎｍの範囲の一貫した孔径制御は操作されてきた（図１）。ＳＮＭのスリット孔ミクロンアーキテクチャは、二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）（図２Ｄ）の成長のためのポリシリコンの乾燥酸化によって達成され、各膜ウィンドウに垂直側壁をもたらした深いイオン反応性エッチング（ＤＲＩＥ）を備えた裏面パターン化を介して達成された（図２Ｈ）。このプロセスは、面積当たり多数の曝露されたナノ孔を有する膜の製造を可能にする。移動経路は、薄いフィルム低圧化学蒸着（ＬＰＣＶＤ）（図２Ｂ）または乾燥エッチングプロセス（図２Ｇ）によって容易に制御され得る膜の厚さを低下させることによって更に最適化され得る。
半透性膜、ＳＮＭの新生成物は、Ｄｅｓａｉら、２６、２７によって最初に研究されたスリット－孔設計を有する。ＳＮＭは、約１％の孔径分布を呈し、５～１５ｎｍの範囲の一貫した孔径制御は操作されてきた（図１）。ＳＮＭのスリット孔ミクロンアーキテクチャは、二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）（図２Ｄ）の成長のためのポリシリコンの乾燥酸化によって達成され、各膜ウィンドウに垂直側壁をもたらした深いイオン反応性エッチング（ＤＲＩＥ）を備えた裏面パターン化を介して達成された（図２Ｈ）。このプロセスは、面積当たり多数の曝露されたナノ孔を有する膜の製造を可能にする。移動経路は、薄いフィルム低圧化学蒸着（ＬＰＣＶＤ）（図２Ｂ）または乾燥エッチングプロセス（図２Ｇ）によって容易に制御され得る膜の厚さを低下させることによって更に最適化され得る。
ナノ孔を画定するための犠牲層の利用は、分子が移動するための短い距離を示す直線スリット孔経路を有する膜をもたらした。限外濾過のための透過性－選択性分析は、スリット形状の孔を備える膜が、１００ｎｍ以下の孔径を有する円筒形の孔を備える膜よりも透過性の所与の値においてより高い性能及びより高い選択性を示したことを実証した。遅い濃度依存性拡散が、サイズ制限ナノ多孔性膜で発生するのを回避するために、対流支配輸送を使用する概念は、膜貫通圧力勾配の下でより迅速な溶媒移動をもたらすのに有利であり、膜を通るグルコース及びインスリンなどの小分子をカプセル化細胞に効率的にドラッグする。
１．５．２ ＳＮＭ透過性及び選択性特性評価
ＳＮＭの透過性及び選択性は、接線流濾過操作において平面ナノ多孔性膜を通る液体流量を使用する透水率試験設定（図９）を特徴とした。７ｎｍの孔径を有するＳＮＭは、１３０ｍｌ／ｈｒ／ｍ２／ｍｍＨｇの透水率を生成したことが実証され、それは、前のバイオ人工膵島装置で使用される従来のポリマー膜（約４０ｍｌ／ｈｒ／ｍ２／ｍｍＨｇ）と比較してはるかに大きい。免疫単離のためのＳＮＭの実行可能性を更に示すために、膜選択性を、圧力駆動限外濾過システムを使用して、サイトカイン及び小分子の輸送に対して特徴付けた（図８）。溶質輸送を約２ｐｓｉの駆動圧力で評価して、動脈と静脈３８との間の典型的な生理学的圧力差を模倣し、約４ｕｌ／分の限外濾過速度をもたらす。圧力駆動限外濾過システムのための膜Ｐｅｃｌｅｔ数（Ｐｅ）は、１よりも著しく大きく、対流輸送が優勢であることを示唆している。観察されたふるい係数（計算された等式．２）を使用し、膜の拒絶特性を反映する必要がある。６時間後、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、及びＩＬ－１βのふるい係数は、それぞれ０．１６、０．２７、及び０．２７であった（図５）。対照的に、グルコース及びインスリンのふるい係数は迅速に１に達した（図５）。これらのデータは、ＳＮＭが、サイトカインの通過を約８０％拒絶し、一方で、小分子の完全な輸送を可能にすることを実証する。濃度偏光及び膜貫通拡散は、この実験システムにおいて無視できるため、観察されたふるい係数は、溶液分配係数（Ф）及び対流障害因子（Ｋｃ）の製品と等しくなるべきである。以前にＤｅｃｈａｄｉｌｏｋ及びＤｅｅｎは、ΦＫｃの積に関する分析的説明を導出し、それは、スリット形状の孔を通過する剛性球体を次の式（方程式３）で説明する。
ここで、λは、分子の直径とスリット－孔チャネルの幅との間の比を示す相対溶質サイズである。サイトカインの観察されたふるい係数（図５）に基づき、Ｄｅｅｎのモデルからの対応する相対的なサイズλ（方程式３）は、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、及びＩＬ－１βが、それぞれ０．８３、０．７４、及び０．７４で計算され得る。これらのサイトカインの実験の相対溶質サイズは、Ｓｔｏｋｅｓ－Ｅｉｎｓｔｅｉｎの半径１４によって示されるように、理論値よりも大きい（図１０）。実験値と理論値との相対溶質サイズのこの差異は、サイトカインが厳密に球面でないという事実によって説明され得る。ＴＮＦ－αは、β－シート構造を用いて形成された三量体からなる充填立体形状であり、ＩＦＮ－γは、平坦化楕円形サブユニット５２を有するグロブリン二量体であり、ＩＬ－１βは、テトラヘドロン様式で巻き付けられる。更に、荷電タンパク質の周りの拡散電気的二重層（ＥＤＬ）と関連付けられる静電相互作用もまた、全体的な分子サイズを増加させ、それにより実験相対溶質サイズを過大評価する。
ＳＮＭの透過性及び選択性は、接線流濾過操作において平面ナノ多孔性膜を通る液体流量を使用する透水率試験設定（図９）を特徴とした。７ｎｍの孔径を有するＳＮＭは、１３０ｍｌ／ｈｒ／ｍ２／ｍｍＨｇの透水率を生成したことが実証され、それは、前のバイオ人工膵島装置で使用される従来のポリマー膜（約４０ｍｌ／ｈｒ／ｍ２／ｍｍＨｇ）と比較してはるかに大きい。免疫単離のためのＳＮＭの実行可能性を更に示すために、膜選択性を、圧力駆動限外濾過システムを使用して、サイトカイン及び小分子の輸送に対して特徴付けた（図８）。溶質輸送を約２ｐｓｉの駆動圧力で評価して、動脈と静脈３８との間の典型的な生理学的圧力差を模倣し、約４ｕｌ／分の限外濾過速度をもたらす。圧力駆動限外濾過システムのための膜Ｐｅｃｌｅｔ数（Ｐｅ）は、１よりも著しく大きく、対流輸送が優勢であることを示唆している。観察されたふるい係数（計算された等式．２）を使用し、膜の拒絶特性を反映する必要がある。６時間後、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、及びＩＬ－１βのふるい係数は、それぞれ０．１６、０．２７、及び０．２７であった（図５）。対照的に、グルコース及びインスリンのふるい係数は迅速に１に達した（図５）。これらのデータは、ＳＮＭが、サイトカインの通過を約８０％拒絶し、一方で、小分子の完全な輸送を可能にすることを実証する。濃度偏光及び膜貫通拡散は、この実験システムにおいて無視できるため、観察されたふるい係数は、溶液分配係数（Ф）及び対流障害因子（Ｋｃ）の製品と等しくなるべきである。以前にＤｅｃｈａｄｉｌｏｋ及びＤｅｅｎは、ΦＫｃの積に関する分析的説明を導出し、それは、スリット形状の孔を通過する剛性球体を次の式（方程式３）で説明する。
要約すると、ＳＮＭは、より高いレベルの限外濾過液産生を可能にし、サイトカインの様な中間分子に対して選択的な拒絶を実証する。したがって、ＳＮＭに膵島をカプセル化することによって、栄養素及びグルコースの増加した対流質量輸送が、膵島生存率及びインスリン産生を支援し得る一方で、免疫成分の選択的拒絶は免疫単離を可能にし得ることが仮定された。
１．５．３ 模擬ループ回路下で培養されたＳＮＭカプセル化膵島の評価
対流輸送を使用して埋め込み可能なＳＮＭカプセル化型バイオ人工膵島装置を配置する実行可能性は、模擬ループ設定を使用して実証された。中央細胞チャンバは、２つの膜の間に挟まれて、インビボ状態を密接に模倣し、ＳＮＭ－カプセル化膵島が動脈－静脈（ＡＶ）移植片として載置される（図６）。動脈と静脈との間の圧力差は、限外濾過を生成し、ＳＮＭを通る水、塩、グルコース、インスリン、及び他の小分子の輸送を駆動し、一方、サイトカインなどの免疫成分の通過はブロックされることになる。サイトカイン含有媒体を、加えられる生理学的圧力約２ｐｓｉ３８で６時間、リザーバから模擬ループ回路を通過させた後で、フローセル装置の上部、中央、及び底部チャンバから収集した試料は、リザーバ濃度と比較された。サイトカインＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、及びＩＬ－１βのレベルは、中央チャンバの中で３０％、３５％、及び３４％に著しく低減し、一方、小分子インスリン及びグルコースは、両方の膜を完全に（約１００％）に通った（図１１）。提案された模擬ループ回路における対流輸送の下でＳＮＭカプセル化膵島を更に検査するために、マウス膵島は、６時間、サイトカイン循環を有するか、またはサイトカイン循環なしで中央チャンバに装填した。サイトカインと共にインキュベートされた静的培養物は、サイトカインなしの静的培養物、サイトカインなしの模擬ループ装置及びサイトカインを有する模擬ループフローセル装置と比較して、２．２倍の細胞死の増加を示した（図３）。更に、サイトカインなしの静的培養物、サイトカインなしの模擬ループ装置及びサイトカイン（図３）を有する模擬ループフローセル装置の間で膵島生存率の著しい変化は認められなかった。これは、膵島生存率を維持する炎症誘発性サイトカイン攻撃から膵島を保護するＳＮＭの有効性を実証した。
対流輸送を使用して埋め込み可能なＳＮＭカプセル化型バイオ人工膵島装置を配置する実行可能性は、模擬ループ設定を使用して実証された。中央細胞チャンバは、２つの膜の間に挟まれて、インビボ状態を密接に模倣し、ＳＮＭ－カプセル化膵島が動脈－静脈（ＡＶ）移植片として載置される（図６）。動脈と静脈との間の圧力差は、限外濾過を生成し、ＳＮＭを通る水、塩、グルコース、インスリン、及び他の小分子の輸送を駆動し、一方、サイトカインなどの免疫成分の通過はブロックされることになる。サイトカイン含有媒体を、加えられる生理学的圧力約２ｐｓｉ３８で６時間、リザーバから模擬ループ回路を通過させた後で、フローセル装置の上部、中央、及び底部チャンバから収集した試料は、リザーバ濃度と比較された。サイトカインＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、及びＩＬ－１βのレベルは、中央チャンバの中で３０％、３５％、及び３４％に著しく低減し、一方、小分子インスリン及びグルコースは、両方の膜を完全に（約１００％）に通った（図１１）。提案された模擬ループ回路における対流輸送の下でＳＮＭカプセル化膵島を更に検査するために、マウス膵島は、６時間、サイトカイン循環を有するか、またはサイトカイン循環なしで中央チャンバに装填した。サイトカインと共にインキュベートされた静的培養物は、サイトカインなしの静的培養物、サイトカインなしの模擬ループ装置及びサイトカインを有する模擬ループフローセル装置と比較して、２．２倍の細胞死の増加を示した（図３）。更に、サイトカインなしの静的培養物、サイトカインなしの模擬ループ装置及びサイトカイン（図３）を有する模擬ループフローセル装置の間で膵島生存率の著しい変化は認められなかった。これは、膵島生存率を維持する炎症誘発性サイトカイン攻撃から膵島を保護するＳＮＭの有効性を実証した。
更に、サイトカインなしの静的培養物、サイトカインなしの模擬ループ装置、ならびにサイトカインを備えた模擬ループフローセル装置は、それぞれ低グルコース負荷の間に分泌されたものと比較して高グルコース負荷中に分泌されたインスリンの量で、それぞれ３．０倍、２．６倍及び４．１倍の変化を実証した（図４）。しかしながら、サイトカインと共にインキュベートされた静的培養物は、インスリンの生存率の損失に起因するグルコースレベル（図４）の変化において、インスリン分泌においてほとんど変化を呈しなかった（図３）。グルコース負荷は、ＳＮＭカプセル化マウス膵島がグルコースレベルの変化に適切に応答することを実証し、一方、サイトカイン浸潤マウス膵島は、グルコース刺激を感知するそれらのインスリン分泌能力を損失した。これらのデータは、カプセル化膵島の生存率及び機能的性能を支持するように所望の免疫単離を提供するためにＳＮＭの有用性を確認した。
１．４ 結論
対流下の膵島のカプセル化のための改善されたケイ素ナノ孔膜、ＳＮＭが開発され特徴付けられた。ＳＮＭ構造は、非常に高い透水率を有するナノメートル範囲において十分に定義されたスリット孔を得るように特異的に設計された。更に、ＳＮＭは、対流性輸送下でサイトカイン等の中間分子に対して高い分子選択性を達成し、十分な濾液を生成する間にカプセル化膵島に十分な免疫保護を提供し、カプセル化膵島の生存率及び機能性を支持する。
対流下の膵島のカプセル化のための改善されたケイ素ナノ孔膜、ＳＮＭが開発され特徴付けられた。ＳＮＭ構造は、非常に高い透水率を有するナノメートル範囲において十分に定義されたスリット孔を得るように特異的に設計された。更に、ＳＮＭは、対流性輸送下でサイトカイン等の中間分子に対して高い分子選択性を達成し、十分な濾液を生成する間にカプセル化膵島に十分な免疫保護を提供し、カプセル化膵島の生存率及び機能性を支持する。
実施例２：
半透性膜カプセルは、グルコース、インスリン及び他の小分子の交換を提供しながら、ホストの免疫成分の通過を遮断することにより、移植された膵島を免疫保護することができる。しかしながら、カプセル系拡散輸送は、しばしば、酸素及び栄養輸送の速度を低減することによって虚血性損傷を悪化させる。新たに開発された半透性濾過膜、対流駆動輸送の下でのケイ素ナノ孔膜（ＳＮＭ）の有効性は、ナノメートルスケールの孔を通る拡散に関連する質量移動限界を克服しながら、炎症誘発性サイトカインの通過を制限する。ＳＮＭ－カプセル化マウス膵島は、それぞれ、大きさ（刺激指数の１．４９倍の増加及び停止指数の３．８６倍の減少）及びインスリン分泌速度（高グルコース負荷及び低グルコース負荷の際にはそれぞれ１．１９倍の増加及び６．４５倍減少）の点で、拡散条件下でのそれらを上回った対流下で培養溶液中で灌流される。対流下のＳＮＭ－カプセル化マウス膵島は、サイトカイン曝露下でも、健常な膵島生存率を更に保持しながら、生理学的に関連する時間規模での迅速なグルコースインスリン感知を実証した。対流下でのＳＮＭを用いた膵島のカプセル化は、移植片機能及び生存を改善する。
半透性膜カプセルは、グルコース、インスリン及び他の小分子の交換を提供しながら、ホストの免疫成分の通過を遮断することにより、移植された膵島を免疫保護することができる。しかしながら、カプセル系拡散輸送は、しばしば、酸素及び栄養輸送の速度を低減することによって虚血性損傷を悪化させる。新たに開発された半透性濾過膜、対流駆動輸送の下でのケイ素ナノ孔膜（ＳＮＭ）の有効性は、ナノメートルスケールの孔を通る拡散に関連する質量移動限界を克服しながら、炎症誘発性サイトカインの通過を制限する。ＳＮＭ－カプセル化マウス膵島は、それぞれ、大きさ（刺激指数の１．４９倍の増加及び停止指数の３．８６倍の減少）及びインスリン分泌速度（高グルコース負荷及び低グルコース負荷の際にはそれぞれ１．１９倍の増加及び６．４５倍減少）の点で、拡散条件下でのそれらを上回った対流下で培養溶液中で灌流される。対流下のＳＮＭ－カプセル化マウス膵島は、サイトカイン曝露下でも、健常な膵島生存率を更に保持しながら、生理学的に関連する時間規模での迅速なグルコースインスリン感知を実証した。対流下でのＳＮＭを用いた膵島のカプセル化は、移植片機能及び生存を改善する。
この研究は、ＳＮＭ及びそれぞれ７ｎｍ及び１０００ｎｍ幅のスリット形状の孔を有するケイ素微孔膜（ＳμＭ）を、サイトカイン曝露有り、無しの拡散して対流する条件下でマウス膵島をカプセル化するために使用した。次いで、膵島はリザーバ培養培地の内側で様々な濃度のグルコースに曝露され、グルコース刺激されたインスリン応答及び膵島生存率を評価した。加えて、膜の免疫保護効果を決定するために、炎症誘発性サイトカインの高度に濃縮されたカクテルが循環系に添加されて、カプセル化膵島を困難にした。
材料及び方法
ＳＮＭは、幅７ｎｍ、長さ２μｍ、深さ３００ｎｍの平均孔径を有する約１０６長方形からなる活性膜領域（６×６ｍｍ）を有するように設計された（図１）。ＳＮＭの表面を、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）でコーティングし、タンパク質汚染を最小限に抑えた。この研究において使用される全てのＳＮＭは、ペグ化後、約７ｎｍの測定された平均孔径を呈した。制御ケイ素微孔膜（ＳμＭ）は同じ設計を有したが、１０００ｎｍの平均孔径を備える。この研究において、カプセル化膵島が、対流輸送（約２ｐｓｉの膜貫通圧力）または圧力駆動式濾過回路を使用する拡散輸送（０ｐｓｉ膜貫通圧力）下で単一のケイ素膜にわたってグルコース濃度の変化に応答したかどうかが観察された。グルコースインスリン応答は、回路において高度に濃縮されたサイトカイン溶液を使用することによって更に試験された。カプセル化膵島のそれぞれの刺激指数（ＳＩ）及び停止指数（ＳＤＩ）は、対流及び拡散条件で続いて分析される。インスリン産生の変化率は、更に、グルコース濃度変化として分泌されるインスリンの速さを説明するためにグルコースインスリン動態グラフ上に適合された曲線の傾斜に基づいて試験された。最後に、カプセル化膵島の生存率は、様々な質量移動及びサイトカイン曝露条件下で、圧力駆動濾過アセンブリを特徴とした。
ＳＮＭは、幅７ｎｍ、長さ２μｍ、深さ３００ｎｍの平均孔径を有する約１０６長方形からなる活性膜領域（６×６ｍｍ）を有するように設計された（図１）。ＳＮＭの表面を、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）でコーティングし、タンパク質汚染を最小限に抑えた。この研究において使用される全てのＳＮＭは、ペグ化後、約７ｎｍの測定された平均孔径を呈した。制御ケイ素微孔膜（ＳμＭ）は同じ設計を有したが、１０００ｎｍの平均孔径を備える。この研究において、カプセル化膵島が、対流輸送（約２ｐｓｉの膜貫通圧力）または圧力駆動式濾過回路を使用する拡散輸送（０ｐｓｉ膜貫通圧力）下で単一のケイ素膜にわたってグルコース濃度の変化に応答したかどうかが観察された。グルコースインスリン応答は、回路において高度に濃縮されたサイトカイン溶液を使用することによって更に試験された。カプセル化膵島のそれぞれの刺激指数（ＳＩ）及び停止指数（ＳＤＩ）は、対流及び拡散条件で続いて分析される。インスリン産生の変化率は、更に、グルコース濃度変化として分泌されるインスリンの速さを説明するためにグルコースインスリン動態グラフ上に適合された曲線の傾斜に基づいて試験された。最後に、カプセル化膵島の生存率は、様々な質量移動及びサイトカイン曝露条件下で、圧力駆動濾過アセンブリを特徴とした。
１．１基質調製
１．１．１ケイ素ナノ孔膜（ＳＮＭ）及びケイ素微孔膜（ＳμＭ）のアーキテクチャ及び製作
ケイ素ナノ孔膜（ＳＮＭ）は、以前に報告された１９，３６－３７のＭＥＭＳ技術によってケイ素基板から試作され、いくつかの変性を有する（図２Ａ－Ｉ）。簡潔に言うと、このプロセスは、４００μｍ厚の二重側面ケイ素研磨（ＤＳＰ）ウエハでの薄いＳｉＯ２（酸化物）層の成長を使用し、ポリシリコン（約５００ｎｍ）の低圧化学蒸着（ＬＰＣＶＤ）が続く。次いで、ウエハは、第２のポリシリコン層で具体的にパターン化され、乾燥酸化され、ウェットエッチングされ、最後に、ポリシリコンが４００ｎｍ残存し、その下にある垂直酸化物層が曝露するまでブランケットエッチングされる。垂直犠牲酸化物層は、膜の臨界ナノスケール孔径を定義した。低温酸化物（ＬＴＯ）（約１μｍ）を、膜保護のための硬質マスクとして機能するために、ウエハのポリシリコン上に堆積した。深度反応イオンエッチング（ＤＲＩＥ）は、膜が開示されるまで各ウィンドウの背面を除去した。最終的に、犠牲酸化物は、製作プロセスの最終工程中に４９％のフッ化水素酸（ＨＦ）中でエッチングされて、開口ナノスケールスリット孔を残す。その後、ウエハを１５００ウィンドウを備える６×６ｍｍ２の有効面積で１×１ｃｍチップに切断し、１つの膜当たり合計１０６個の孔を備える。各長方形の孔は、７ｎｍの幅、３００ｎｍの深さ、及び２μｍの長さであった。ケイ素微孔膜（ＳμＭ）を製造して、同様のプロセスを用いて１０００ｎｍのスリット幅を有する５００ｎｍ×４μｍの長方形スリット孔のウエハスケールアレイを産出した。ウエハをダイシングして、１×１ｃｍのチップを形成し、それぞれ１５００個のウィンドウを備える６×６ｍｍ２の有効面積を有し、膜当たり合計３．１２６の孔を備えた。全ての膜を、従来の「ピラニア」洗浄手順を使用して洗浄し、３：１の硫酸（Ｈ２ＳＯ４）／過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）混合物に２０分間浸漬した後、脱イオン（ＤＩ）水で十分にすすいだ。電子顕微鏡の走査（ＳＥＭ）を使用してＳＮＭの画像を得た（Ｌｅｏ１５５０）（図２Ａ－Ｉ）。
１．１．１ケイ素ナノ孔膜（ＳＮＭ）及びケイ素微孔膜（ＳμＭ）のアーキテクチャ及び製作
ケイ素ナノ孔膜（ＳＮＭ）は、以前に報告された１９，３６－３７のＭＥＭＳ技術によってケイ素基板から試作され、いくつかの変性を有する（図２Ａ－Ｉ）。簡潔に言うと、このプロセスは、４００μｍ厚の二重側面ケイ素研磨（ＤＳＰ）ウエハでの薄いＳｉＯ２（酸化物）層の成長を使用し、ポリシリコン（約５００ｎｍ）の低圧化学蒸着（ＬＰＣＶＤ）が続く。次いで、ウエハは、第２のポリシリコン層で具体的にパターン化され、乾燥酸化され、ウェットエッチングされ、最後に、ポリシリコンが４００ｎｍ残存し、その下にある垂直酸化物層が曝露するまでブランケットエッチングされる。垂直犠牲酸化物層は、膜の臨界ナノスケール孔径を定義した。低温酸化物（ＬＴＯ）（約１μｍ）を、膜保護のための硬質マスクとして機能するために、ウエハのポリシリコン上に堆積した。深度反応イオンエッチング（ＤＲＩＥ）は、膜が開示されるまで各ウィンドウの背面を除去した。最終的に、犠牲酸化物は、製作プロセスの最終工程中に４９％のフッ化水素酸（ＨＦ）中でエッチングされて、開口ナノスケールスリット孔を残す。その後、ウエハを１５００ウィンドウを備える６×６ｍｍ２の有効面積で１×１ｃｍチップに切断し、１つの膜当たり合計１０６個の孔を備える。各長方形の孔は、７ｎｍの幅、３００ｎｍの深さ、及び２μｍの長さであった。ケイ素微孔膜（ＳμＭ）を製造して、同様のプロセスを用いて１０００ｎｍのスリット幅を有する５００ｎｍ×４μｍの長方形スリット孔のウエハスケールアレイを産出した。ウエハをダイシングして、１×１ｃｍのチップを形成し、それぞれ１５００個のウィンドウを備える６×６ｍｍ２の有効面積を有し、膜当たり合計３．１２６の孔を備えた。全ての膜を、従来の「ピラニア」洗浄手順を使用して洗浄し、３：１の硫酸（Ｈ２ＳＯ４）／過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）混合物に２０分間浸漬した後、脱イオン（ＤＩ）水で十分にすすいだ。電子顕微鏡の走査（ＳＥＭ）を使用してＳＮＭの画像を得た（Ｌｅｏ１５５０）（図２Ａ－Ｉ）。
１．１．２ ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）でＳＮＭの表面変性。
ＳＮＭは、以前に報告されたプロトコル３８を使用してＰＥＧで共有的に変性し、膜表面上のタンパク質汚染を防止する。ＰＥＧ付与に使用される技法は、ケイ素表面シラノール基（Ｓｉ－ＯＨ）をＳｉ－Ｏ－Ｓｉ－ＰＥＧ配列を形成する三重メトキシシラン基を介してＰＥＧポリマーの鎖に共有結合させる単一の反応工程を伴う。簡潔に言うと、ＳＮＭを３ｍＭ２－［メトキシ（ポリエチレンオキシ）プロピル］トリメトキシシラン（ＰＥＧ－シラン）（Ｇｅｌｅｓｔ：ＳＩＭ６４９２．７）トルエンで２時間にわたって７０℃で浸した。トルエン、エタノール、及びＤＩ水を備える一連の広範な洗浄工程を使用して、未結合のＰＥＧ残基を洗い流した。
ＳＮＭは、以前に報告されたプロトコル３８を使用してＰＥＧで共有的に変性し、膜表面上のタンパク質汚染を防止する。ＰＥＧ付与に使用される技法は、ケイ素表面シラノール基（Ｓｉ－ＯＨ）をＳｉ－Ｏ－Ｓｉ－ＰＥＧ配列を形成する三重メトキシシラン基を介してＰＥＧポリマーの鎖に共有結合させる単一の反応工程を伴う。簡潔に言うと、ＳＮＭを３ｍＭ２－［メトキシ（ポリエチレンオキシ）プロピル］トリメトキシシラン（ＰＥＧ－シラン）（Ｇｅｌｅｓｔ：ＳＩＭ６４９２．７）トルエンで２時間にわたって７０℃で浸した。トルエン、エタノール、及びＤＩ水を備える一連の広範な洗浄工程を使用して、未結合のＰＥＧ残基を洗い流した。
１．１．３ ＳＮＭ孔特性評価の透水率
自動質量及び圧力測定システムは、接線流濾過操作の下でＳＮＭを通る液体流量を特徴付けるために利用された。ＳＮＭの孔径は、（式１）を使用する濾過流量パラメータに関連し得て、ｈは孔幅、μは粘度、ｌは膜厚、Ｑは容積流量、ｎは膜当たりの孔の数、ｗは孔の長さ、ΔＰは膜間圧力である。ＳＮＭ孔径特性評価（図９）の全体的なシステムを組み立てるために、空気をシリンジポンプ（Ｓｉｇｍａ：Ｚ６７５７０９）を通って貯水槽へ加える。水を蠕動ポンプ（マスターフレックス：０７５５１－００）により差圧トランスデューサ（Ｏｍｅｇａ：ＰＸ４２９ ０１５ＧＩ）を通って、カプセル化膜を有するフローセルによって循環され、元の貯水槽に戻される。フローセルを水下で水没したＳＮＭで組み立てて、全ての区画から気泡を除去した。具体的には、膜の上部に位置付けられたカスタマイズされたケイ素ガスケットと対向するポリシリコンインターフェースを用いて配置され、ガスケットの頂部に濾液チャンバの最終配置が続く。ガスケットが視覚的に圧縮されるまで、全てのセクションを一緒に固定し、手で締め付けられた六角ボルトに固定させた。膜を通して浸透した限外濾過透過は、精密質量バランス上に置かれた液体収集容器に送られた（Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ：ＸＳ２０５）。差圧トランスデューサ及び質量バランスからの測定値は、データ取得用ノートパソコンで自動的に収集された。典型的な膜透水率試験は、５ｍｌ／分の流量及び４圧力サイクル（５、１、５、及び１ｐｓｉ）からなり、それぞれ１５０秒の期間かかった。個々のウエハ設計に基づいて提供される孔長、膜厚、及び孔の総数の仕様を用いて、式１を使用してＳＮＭの平均孔径を計算した。この研究における全てのＳＮＭ膜は、ＰＥＧで表面変性され、約７ｎｍの平均孔径を呈した。
自動質量及び圧力測定システムは、接線流濾過操作の下でＳＮＭを通る液体流量を特徴付けるために利用された。ＳＮＭの孔径は、（式１）を使用する濾過流量パラメータに関連し得て、ｈは孔幅、μは粘度、ｌは膜厚、Ｑは容積流量、ｎは膜当たりの孔の数、ｗは孔の長さ、ΔＰは膜間圧力である。ＳＮＭ孔径特性評価（図９）の全体的なシステムを組み立てるために、空気をシリンジポンプ（Ｓｉｇｍａ：Ｚ６７５７０９）を通って貯水槽へ加える。水を蠕動ポンプ（マスターフレックス：０７５５１－００）により差圧トランスデューサ（Ｏｍｅｇａ：ＰＸ４２９ ０１５ＧＩ）を通って、カプセル化膜を有するフローセルによって循環され、元の貯水槽に戻される。フローセルを水下で水没したＳＮＭで組み立てて、全ての区画から気泡を除去した。具体的には、膜の上部に位置付けられたカスタマイズされたケイ素ガスケットと対向するポリシリコンインターフェースを用いて配置され、ガスケットの頂部に濾液チャンバの最終配置が続く。ガスケットが視覚的に圧縮されるまで、全てのセクションを一緒に固定し、手で締め付けられた六角ボルトに固定させた。膜を通して浸透した限外濾過透過は、精密質量バランス上に置かれた液体収集容器に送られた（Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ：ＸＳ２０５）。差圧トランスデューサ及び質量バランスからの測定値は、データ取得用ノートパソコンで自動的に収集された。典型的な膜透水率試験は、５ｍｌ／分の流量及び４圧力サイクル（５、１、５、及び１ｐｓｉ）からなり、それぞれ１５０秒の期間かかった。個々のウエハ設計に基づいて提供される孔長、膜厚、及び孔の総数の仕様を用いて、式１を使用してＳＮＭの平均孔径を計算した。この研究における全てのＳＮＭ膜は、ＰＥＧで表面変性され、約７ｎｍの平均孔径を呈した。
１．２ 圧力駆動濾過アセンブリにおける膜カプセル化膵島の培養物
マウス膵島の単離を伴う記述された全ての手順を、カリフォルニア大学サンフランシスコ校（ＵＣＳＦ）の施設内動物管理及び使用委員会（ＩＡＣＵＣ）が承認したプロトコルに従って実施した。マウス膵島を以前に記載されたプロトコルに基づいて、８～１０週齢の雄のＢ６マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から単離した。回収された膵島を、Ｌ－グルタミン及び１１．１ｍＭのグルコース（Ｇｉｂｃｏ：１１８７５－０９３）、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ：１６０００）、及び１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）（ＵＣＳＦ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ：ＣＣＦＧＫ００３）を含むＰＲＭＩ１６４０での懸濁培養に維持した。
マウス膵島の単離を伴う記述された全ての手順を、カリフォルニア大学サンフランシスコ校（ＵＣＳＦ）の施設内動物管理及び使用委員会（ＩＡＣＵＣ）が承認したプロトコルに従って実施した。マウス膵島を以前に記載されたプロトコルに基づいて、８～１０週齢の雄のＢ６マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から単離した。回収された膵島を、Ｌ－グルタミン及び１１．１ｍＭのグルコース（Ｇｉｂｃｏ：１１８７５－０９３）、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ：１６０００）、及び１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）（ＵＣＳＦ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ：ＣＣＦＧＫ００３）を含むＰＲＭＩ１６４０での懸濁培養に維持した。
模擬ループ回路を２つのフローセル成分で組み立てた。簡潔に言うと、カスタマイズされたケイ素ガスケットフレームを備える１つのＳＮＭは、２つのフローセル成分の間に挟まれた。４０～５０マウス膵島のグループが、上部チャンバ中の循環流体（５ｍｌ／分）からＳＮＭによって分離された底部チャンバに導入された。蠕動ポンプは、流体セル構成成分の上部を通して流体を駆動し、最後に元の培地リザーバに戻した。対流実験に関して、３方向バルブを使用して、フローセルの上部と底部区画との間の生理学的圧力差約２ｐｓｉのためのフロー抵抗を生成した。圧力駆動限外濾過システムのための膜Ｐｅｃｌｅｔ数（Ｐｅ）は、１よりも著しく大きく、対流輸送が優勢であることを示唆している。拡散実験については、膜貫通圧力は、システム全体を通して誘導されず、流体は依然として循環している。ＳＮＭ－カプセル化膵島に対するサイトカインの効果を研究するために、マウスサイトカインＴＮＦ－α（２，０００Ｕ／ｍｌ）、ＩＦＮ－γ（１，０００Ｕ／ｍｌ）、ＩＬ－１β（１０，０００Ｕ／ｍｌ）からなる溶液を元のリザーバに添加した。調節された圧力（約０．１２７ｐｓｉ）及び流量（約２０μｌ／分）で対照として１μｍのスリット孔（ＳμＭ）を有するケイ素膜を使用し、この模擬ループ系のＳＮＭとして同量の限外濾過液を生成した。静的条件下で培養された裸のマウス膵島も、対照として使用した。
１．２．１ 圧力駆動型濾過ループ系におけるグルコース負荷
模擬ループ系中の膜カプセル化マウス膵島は、一連の低（１．６ｍＭ）、高（１６．６ｍＭ）、及び低（１．６ｍＭ）グルコース（Ｇｉｂｃｏ：１１８７９）刺激に各３０分間曝露した。上清は、一連のグルコース負荷の間に下部膵島チャンバから１０分毎にサンプリングした。対流実験のために、約３．５ｕｌ／分の限外濾過速度が、約７ｎｍの孔径のＳＮＭについて観察され、同じ限外濾過速度を、低下膜貫通膜圧力及びシステム流量に対して得た。拡散実験に関して、膵島チャンバは個々のサンプリング後に再充填され、膵島チャンバの容積が常に一定で保持されたことを確実にした。この工程は、システム内の質量移動を妨げ得るプロセス中に潜在的に形成され得るあらゆる気泡を最小化する。インスリン含有量は、説明された希釈でマウスインスリン酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）キット（Ｍｅｒｃｏｄｉａ：１０～１２４７－０１）で測定され、抽出された全タンパク質濃度７８５０５、２３２２５）により正規化した。裸のマウス膵島もまた、対照として静的培養条件下で困難になった。膵島毎に約７～１０μＬのチャンバ流体を全ての場合で使用した。
模擬ループ系中の膜カプセル化マウス膵島は、一連の低（１．６ｍＭ）、高（１６．６ｍＭ）、及び低（１．６ｍＭ）グルコース（Ｇｉｂｃｏ：１１８７９）刺激に各３０分間曝露した。上清は、一連のグルコース負荷の間に下部膵島チャンバから１０分毎にサンプリングした。対流実験のために、約３．５ｕｌ／分の限外濾過速度が、約７ｎｍの孔径のＳＮＭについて観察され、同じ限外濾過速度を、低下膜貫通膜圧力及びシステム流量に対して得た。拡散実験に関して、膵島チャンバは個々のサンプリング後に再充填され、膵島チャンバの容積が常に一定で保持されたことを確実にした。この工程は、システム内の質量移動を妨げ得るプロセス中に潜在的に形成され得るあらゆる気泡を最小化する。インスリン含有量は、説明された希釈でマウスインスリン酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）キット（Ｍｅｒｃｏｄｉａ：１０～１２４７－０１）で測定され、抽出された全タンパク質濃度７８５０５、２３２２５）により正規化した。裸のマウス膵島もまた、対照として静的培養条件下で困難になった。膵島毎に約７～１０μＬのチャンバ流体を全ての場合で使用した。
１．２．２ 刺激指数（ＳＩ）及び停止指数（ＳＤＩ）の分析
基礎インスリン分泌に対して刺激されたインスリン分泌の比として刺激指数を計算した。研究において、刺激指数（ＳＩ）は、（１）高グルコース相における最初のインスリン採取から前の低グルコース相の最後のインスリン採取点まで（即時刺激）、（２）高グルコース相における最高のインスリン分泌から前の低グルコース相の最後のインスリン採取点（最大刺激）の比率であった。停止指数（ＳＤＩ）は、（１）続く低グルコース相の最初のインスリン採取点から高グルコース相の最後のインスリン採取点まで（即時停止）、（２）その後の低グルコース相における最も低いインスリン分泌から高グルコース相における最後のインスリン採取点（最大遮断）までの比率として計算された。刺激指数は、より高い濃度のグルコースによって刺激として放出されるインスリンの大きさを示し、一方で停止指数は、一旦、グルコース濃度が正常に戻ると、インスリン産生の中止の大きさを反映する。
基礎インスリン分泌に対して刺激されたインスリン分泌の比として刺激指数を計算した。研究において、刺激指数（ＳＩ）は、（１）高グルコース相における最初のインスリン採取から前の低グルコース相の最後のインスリン採取点まで（即時刺激）、（２）高グルコース相における最高のインスリン分泌から前の低グルコース相の最後のインスリン採取点（最大刺激）の比率であった。停止指数（ＳＤＩ）は、（１）続く低グルコース相の最初のインスリン採取点から高グルコース相の最後のインスリン採取点まで（即時停止）、（２）その後の低グルコース相における最も低いインスリン分泌から高グルコース相における最後のインスリン採取点（最大遮断）までの比率として計算された。刺激指数は、より高い濃度のグルコースによって刺激として放出されるインスリンの大きさを示し、一方で停止指数は、一旦、グルコース濃度が正常に戻ると、インスリン産生の中止の大きさを反映する。
１．２．３ インスリン分泌の変化率の分析
インスリン分泌の変化率は刺激及び停止相について計算された。刺激相に関して、高グルコース曝露中に生成されたインスリンの最高点への低グルコース曝露の間に生成されたインスリンの最後の点を有するグルコース－インスリン動態グラフに曲線を当てはめた。停止相に関して、曲線は、低いグルコース曝露中に生成されたインスリンの第１の点への高グルコース曝露中に生成されたインスリンの最終点でグルコース－インスリン動態グラフに適合された。変化率は、グルコース濃度の変化中に分泌されるインスリンの迅速性を研究するために、それらの曲線の導関数を用いることにより取得した。
インスリン分泌の変化率は刺激及び停止相について計算された。刺激相に関して、高グルコース曝露中に生成されたインスリンの最高点への低グルコース曝露の間に生成されたインスリンの最後の点を有するグルコース－インスリン動態グラフに曲線を当てはめた。停止相に関して、曲線は、低いグルコース曝露中に生成されたインスリンの第１の点への高グルコース曝露中に生成されたインスリンの最終点でグルコース－インスリン動態グラフに適合された。変化率は、グルコース濃度の変化中に分泌されるインスリンの迅速性を研究するために、それらの曲線の導関数を用いることにより取得した。
１．２．４．膵島生存率
膵島生存率を、生存緑色及び死赤色の溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ：Ｒ３７６０１）により評価した。簡潔に言うと、マウス膵島を、生存グリーン及び死赤色の溶液の中に室温で１５分間インキュベートし、続いて、過剰な染色を除去するためにＰＢＳ中の広範な洗浄を行った。マウス膵島の画像を、レーザー走査ＮｉｋｏｎスペクトルＣ１ｓｉ共焦点顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して取得した。膵島の生存率は、ウィスコンシン大学マディソン校で移植外科部門からの蛍光染料による膵島生存率の評価に関するプロトコルによって説明されるように、膵島中の生細胞の割合に基づいて計算された。
膵島生存率を、生存緑色及び死赤色の溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ：Ｒ３７６０１）により評価した。簡潔に言うと、マウス膵島を、生存グリーン及び死赤色の溶液の中に室温で１５分間インキュベートし、続いて、過剰な染色を除去するためにＰＢＳ中の広範な洗浄を行った。マウス膵島の画像を、レーザー走査ＮｉｋｏｎスペクトルＣ１ｓｉ共焦点顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して取得した。膵島の生存率は、ウィスコンシン大学マディソン校で移植外科部門からの蛍光染料による膵島生存率の評価に関するプロトコルによって説明されるように、膵島中の生細胞の割合に基づいて計算された。
１．３ 統計的分析
スチューデントのｔ検定を使用して試料対を分析した。複数の試料を、１方向または２方向分散分析で評価し（ＡＮＯＶＡ）、続いてＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用してＢｏｎｆｅｒｏｎｉ及び複数の比較を用いて、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉと複数比較を行った。Ａのｐ値＜０．０５は、すべての分析において統計的に有意であると認められた。
スチューデントのｔ検定を使用して試料対を分析した。複数の試料を、１方向または２方向分散分析で評価し（ＡＮＯＶＡ）、続いてＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用してＢｏｎｆｅｒｏｎｉ及び複数の比較を用いて、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉと複数比較を行った。Ａのｐ値＜０．０５は、すべての分析において統計的に有意であると認められた。
結果及び考察
循環流体から膵島を分離する単一の膜からなるベンチトップ型ループ回路の構造である（図７）。このシステムを使用して、ＳＮＭ－及びＳμＭ－カプセル化膵島のグルコース刺激インスリン分泌の動態は、両方の対流及び拡散輸送モダリティの両方を特徴とした。サイトカイン曝露の効果は、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、及びＩＦＮ－γを備える炎症誘発性サイトカインの高度に濃縮されたカクテルを回路に添加することによって、ＳＮＭ及びＳμＭカプセル化膵島の機能に対して更に分析された。膜カプセル化膵島が、グルコース濃度の変化時にインスリンを分泌する能力は、以下によって特徴づけられる。（１）グルコース濃度の変化の関数として刺激の大きさ及び停止インスリン応答を反映する刺激指数（ＳＩ）及び停止指数（ＳＤＩ）を計算すること、（２）周囲の流体が低から高へ、及び高から低へグルコース濃度が変化する際のインスリン分泌の変化率を特徴付けることとである。カプセル化膵島の生存率も、様々な実験条件の終わりに模擬ループ回路で評価した。
循環流体から膵島を分離する単一の膜からなるベンチトップ型ループ回路の構造である（図７）。このシステムを使用して、ＳＮＭ－及びＳμＭ－カプセル化膵島のグルコース刺激インスリン分泌の動態は、両方の対流及び拡散輸送モダリティの両方を特徴とした。サイトカイン曝露の効果は、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、及びＩＦＮ－γを備える炎症誘発性サイトカインの高度に濃縮されたカクテルを回路に添加することによって、ＳＮＭ及びＳμＭカプセル化膵島の機能に対して更に分析された。膜カプセル化膵島が、グルコース濃度の変化時にインスリンを分泌する能力は、以下によって特徴づけられる。（１）グルコース濃度の変化の関数として刺激の大きさ及び停止インスリン応答を反映する刺激指数（ＳＩ）及び停止指数（ＳＤＩ）を計算すること、（２）周囲の流体が低から高へ、及び高から低へグルコース濃度が変化する際のインスリン分泌の変化率を特徴付けることとである。カプセル化膵島の生存率も、様々な実験条件の終わりに模擬ループ回路で評価した。
２．１ 膜製作及び特性
ＳＮＭのスリット孔ミクロンアーキテクチャは、二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）の成長のためのポリシリコンの乾燥酸化によって産生され、各膜ウィンドウの垂直壁を生成する深いイオン反応性エッチング（ＤＲＩＥ）を用いた裏面パターン化が続く（図２Ａ）。ＳＮＭウエハは、それぞれ、約７ｎｍ幅、３００ｎｍの深さ、及び２μｍの厚さを備える約１０６の長方形スリットからなる活性膜領域（６×６ｍｍ）を有する１ｃｍ×１ｃｍのチップにダイスカットされる（図２Ｂ－Ｃ）。同様の製作技術を使用して、ケイ素微孔膜（ＳμＭ）チップを生成し、それぞれ、幅５００ｎｍ、深さ５００ｎｍ、及び４μｍの長さを有する３．１２×１０６の長方形スリット孔からなる活性膜面積（６×６ｍｍ）を備える（図２Ｄ～Ｅ）。以前に、約７ｎｍの孔径を有するＳＮＭが、他のバイオ人工膵島装置で使用される従来のポリマー膜と比較して、３．２５倍の透水率をもたらしたことが実証された。ＳμＭは全ての分子の完全な通過を許容したが、ＳＮＭは、サイトカイン通路の約８０％拒絶でサイズ選択性を実証し、一方、グルコース及びインスリンの完全な輸送を可能にした。
ＳＮＭのスリット孔ミクロンアーキテクチャは、二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）の成長のためのポリシリコンの乾燥酸化によって産生され、各膜ウィンドウの垂直壁を生成する深いイオン反応性エッチング（ＤＲＩＥ）を用いた裏面パターン化が続く（図２Ａ）。ＳＮＭウエハは、それぞれ、約７ｎｍ幅、３００ｎｍの深さ、及び２μｍの厚さを備える約１０６の長方形スリットからなる活性膜領域（６×６ｍｍ）を有する１ｃｍ×１ｃｍのチップにダイスカットされる（図２Ｂ－Ｃ）。同様の製作技術を使用して、ケイ素微孔膜（ＳμＭ）チップを生成し、それぞれ、幅５００ｎｍ、深さ５００ｎｍ、及び４μｍの長さを有する３．１２×１０６の長方形スリット孔からなる活性膜面積（６×６ｍｍ）を備える（図２Ｄ～Ｅ）。以前に、約７ｎｍの孔径を有するＳＮＭが、他のバイオ人工膵島装置で使用される従来のポリマー膜と比較して、３．２５倍の透水率をもたらしたことが実証された。ＳμＭは全ての分子の完全な通過を許容したが、ＳＮＭは、サイトカイン通路の約８０％拒絶でサイズ選択性を実証し、一方、グルコース及びインスリンの完全な輸送を可能にした。
２．２ カプセル化膵島のグルコース－刺激されたインスリン分泌の動態
２．２．１ サイトカイン曝露なし
適用された生理学的膜貫通圧力（図９）下で、膜－カプセル化膵島を組み込んだベンチトップフローループ回路を使用した。カプセル化膵島が、このフローセルを使用する対流輸送（約２ｐｓｉ膜間圧）または拡散輸送（０ｐｓｉ膜間圧）下で単一のケイ素膜にわたってグルコース濃度の変化に応答したかどうかが観察された。静的条件下で培養された未カプセル化膵島を対照として使用した。全ての条件下では、膵島は、より多くのインスリン（４０分間の時点、図１３Ａ）を生成することによって、最初の１０分内の高グルコース濃度（１６．６ｍＭ）に迅速に反応する。静止培養物下での未カプセル化膵島及び拡散条件下でのＳＮＭ－カプセル化膵島は、高グルコース曝露後の応答２０分のピークに達し、対流下のＳＮＭカプセル化されたＳＮＭ－カプセル化膵島のインスリン分泌は、高グルコース負荷の３０分間の全期間中に継続して増加した（図１３Ａ）。高グルコース曝露の５～１０分以内の迅速インスリン応答は、二塩基様式でインスリンを放出する正常な機能膵島と一致した（例えば、第１のインスリン相が５～１０分以内に見出され、第２の持続相が続く）。更に、それぞれ、高グルコース相における最初のインスリン採取物と前回の低グルコース相における最後のインスリン採取物（即時刺激）との比として計算される刺激指数（ＳＩ）は、静的条件下での裸の膵島と、対流及び拡散のケースでのＳＮＭでカプセル化膵島との間で略比較され、それぞれ３．９２±１．０７、６．３８±０．４４及び５．６２±１．５１（図１３Ｂ）であった。しかしながら、高グルコース相からのインスリン分泌の最高レベルを使用して刺激の大きさ（最大刺激）を計算した場合、静的下で裸の膵島及び対流及び拡散ケースでのＳＮＭーカプセル化膵島が、５．２９±０．６９、８．９２±１．３５、５．９７±１．１６のＳＩを示した（図１３Ｂ）。対流下のＳＮＭ－カプセル化膵島のＳＩは、拡散の１．４９倍の増加を示した。
２．２．１ サイトカイン曝露なし
適用された生理学的膜貫通圧力（図９）下で、膜－カプセル化膵島を組み込んだベンチトップフローループ回路を使用した。カプセル化膵島が、このフローセルを使用する対流輸送（約２ｐｓｉ膜間圧）または拡散輸送（０ｐｓｉ膜間圧）下で単一のケイ素膜にわたってグルコース濃度の変化に応答したかどうかが観察された。静的条件下で培養された未カプセル化膵島を対照として使用した。全ての条件下では、膵島は、より多くのインスリン（４０分間の時点、図１３Ａ）を生成することによって、最初の１０分内の高グルコース濃度（１６．６ｍＭ）に迅速に反応する。静止培養物下での未カプセル化膵島及び拡散条件下でのＳＮＭ－カプセル化膵島は、高グルコース曝露後の応答２０分のピークに達し、対流下のＳＮＭカプセル化されたＳＮＭ－カプセル化膵島のインスリン分泌は、高グルコース負荷の３０分間の全期間中に継続して増加した（図１３Ａ）。高グルコース曝露の５～１０分以内の迅速インスリン応答は、二塩基様式でインスリンを放出する正常な機能膵島と一致した（例えば、第１のインスリン相が５～１０分以内に見出され、第２の持続相が続く）。更に、それぞれ、高グルコース相における最初のインスリン採取物と前回の低グルコース相における最後のインスリン採取物（即時刺激）との比として計算される刺激指数（ＳＩ）は、静的条件下での裸の膵島と、対流及び拡散のケースでのＳＮＭでカプセル化膵島との間で略比較され、それぞれ３．９２±１．０７、６．３８±０．４４及び５．６２±１．５１（図１３Ｂ）であった。しかしながら、高グルコース相からのインスリン分泌の最高レベルを使用して刺激の大きさ（最大刺激）を計算した場合、静的下で裸の膵島及び対流及び拡散ケースでのＳＮＭーカプセル化膵島が、５．２９±０．６９、８．９２±１．３５、５．９７±１．１６のＳＩを示した（図１３Ｂ）。対流下のＳＮＭ－カプセル化膵島のＳＩは、拡散の１．４９倍の増加を示した。
回路が６０～９０分の低グルコース濃度（１．６ｍＭ）に切り替えられると、対流下のＳＮＭカプセル化膵島は、インスリン産生の急速な停止を呈し、一方、拡散モードでは、カプセルのために発生したインスリン産生が徐々に減少した。上記の低グルコース相における最初のインスリン採取と以前の高グルコース相における最後のインスリン採取（即時停止）の比率として計算された停止指数（ＳＤＩ）は、静的培養物（０．５９±０．１７）下の裸の膵島及び拡散下（０．９３±０．１９）のＳＮＭカプセル化膵島と比較して、対流（０．２０±０．０３）下のＳＮＭカプセル化膵島のインスリンの量は著しく減少したことを示した（図１３Ｃ）。後続のグルコース相からの最低レベルのインスリン分泌を使用して、停止の大きさ（最大停止）を計算したとき、ＳＤＩは、静的培養物（０．４０±０．０９）下の裸の膵島及び拡散（０．４２±０．１１）下のＳＮＭカプセル化膵島と比較して、対流（０．１１±０．０２）下のＳＮＭカプセル化膵島の分泌インスリン量が著しく減少したことを示した。対流下のＳＮＭカプセル化膵島のＳＤＩは、拡散下のものと比較して３．８６倍の減少を示した。拡散輸送に関連する遅いインスリン活性化及び遅延停止応答は、以前の研究と一致する。対流下のＳＮＭカプセル化膵島は、インスリン産生を迅速に活性化及び停止する能力を示した。
図１８の表１に図示されるように、インスリン産生の変化率は、状態が低高から高低グルコース相から遷移したときに監視された。インスリン活性化及び中止の変化率は、拡散（それぞれ刺激については０．８６及び０．８４、非活性化については－０．７１及び－０．４２、図１８）でＳＮＭカプセル化膵島のように静的培養物下の裸の膵島において同じ規模であった。対流下のＳＮＭ－カプセル化膵島は、グルコース刺激インスリン応答の速度が１．１６倍及び１．１９倍増加し、静的培養物下の裸の膵島及び拡散下のＳＮＭカプセル膵島と比較してインスリン停止率が３．８２倍及び６．４５倍低下したことを示した。要するに、グルコース刺激インスリン分泌の大きさは、静的培養物下の裸の膵島及びＳＩによって示されるような拡散下のＳＮＭカプセル化膵島と比較して対流下のＳＮＭカプセル化膵島のためにより高くなった（図１３Ｂ）。対流下のＳＮＭカプセル化膵島は、他の２つの条件（表１）と比較して、最も速いインスリン産生（約１正規化インスリン含有量最小１（Ｘ１０－２））を示し、中止（約－２．７正規化インスリン含有量最小１（Ｘ１０－２））を示した。
対流下のケイ素微孔膜（ＳμＭ）－カプセル化膵島とのさらなる比較は、孔径（１μｍ）が大きくなると、圧力駆動された対流がより迅速な質量輸送をもたらすことを示した。静的培養物下の裸の膵島、対流下のＳＮＭ－カプセル化膵島、及び対流下のＳμＭカプセル化膵島は、４０～６０分の高グルコース曝露中により多くのインスリンをより迅速に放出した（図１４Ａ）。インスリンのレベルが裸の膵島にある場合、分泌インスリンの量は、５０～６０分の対流下でＳＮＭ－カプセル化膵島において増加した。しかしながら、対流下のＳμＭ－カプセル化膵島は、５０分で分泌インスリンの最大レベルを示し、６０分の即時濃度低下が続いた。高グルコース負荷時の対流下のＳＮＭとＳμＭカプセル化との間の差異は、以下により説明することができる。（１）同じ量の限外濾過液を取得するために両方の膜を調整する努力にもかかわらず、限外濾過速度における変形は、２つの異なる種類の膜によって生成され（セクション４．２）、（２）ＳＮＭ１９，３０に対するタンパク質吸着の可能性があり、その結果、さらなる耐汚染性のためにインスリン分泌３１の負のフィードバック阻害が生じた。更に、前刺激及び刺激（即時刺激）中のインスリン分泌の大きさを示すＳＩは、静的条件下での裸の膵島と比較して対流下でのＳＮＭ及びＳμＭカプセル化の方が高く、それぞれ６．３８±０．４４、６．４４±１．４１、及び３．９２±１．０７であった（図１４Ｂ）。高グルコース相における最高量のインスリン分泌物を使用してＳＩ（最大刺激）を計算した場合、対流（８．９２±１．３４）下のＳμＭ－カプセル化及び対流（１１．８±１．６４）下のＳμＭカプセル化は、静的条件（５．２９±０．６９）の裸の膵島と比較して著しく高いＳＩを示した。対流下のＳＮＭ及びＳμＭカプセル化用に刺激後のインスリン分泌及び刺激（即時停止）から計算されたＳＤＩは、０．２０±０．０３及び０．２５±０．０９であり、裸の膵島（０．５９±０．１７）と比較して低グルコース曝露中に分泌されるインスリンの大きさの有意な減少を示した（図１４Ｃ）。ＳＤＩを、刺激後及び刺激の最も低いインスリン分泌の比（最大停止）に基づいて計算した（図１４Ｃ）場合、この傾向は、対流下（０．１１±０．０２）でＳＮＭカプセル化、対流下（０．１１±０．０１）での裸の膵島（０．４０±０．０９）で観察された。
加えて、低グルコース状態から高グルコース状態（３．１５正規化インスリン含有量最小１（Ｘ１０－２））への切り替え、高グルコース状態から低グルコース状態（－３．３６正規化インスリン含有量最小１（Ｘ１０－２））へ切り替えた場合、対流下にあるＳμＭ－カプセル化膵島は、最も速い応答を示した（図１８）。対流下のＳμＭ－カプセル化膵島は、グルコース刺激インスリン応答速度の３．６６倍及び３．１５倍の増加を示し、それぞれ静止培養物下の裸の膵島及び対流下のＳＮＭカプセル化膵島と比較してインスリン停止率が４．７３倍及び１．２４倍低下した（図１８）。インスリン産生及び中止の全ての変化率は、静的培養物下の裸の膵島、拡散下のＳＮＭ－カプセル化膵島、及び拡散下のＳμＭ－カプセル化膵島間で同等であった（図１８）。顕著に、拡散シナリオにおける膜カプセル化は、高濃度のグルコースで刺激されるとよりゆっくりとインスリン応答を示した（図２４Ａ～Ｃ、図２５Ａ～Ｃを含む）。これは、ナノスケールの孔内１９，３０の分子の吸着による境界層の潜在的な形成に起因する可能性がある。膜の選択及び膵島（拡散対流）を刺激する方法に依存して、全ての実験条件は２．８９～６．４４（図２４Ａ～Ｃ及び図２５Ａ～Ｃを含む）のＳＩを有し、これは健康なマウスの膵島の典型的な値（２～２０）と一致する。グルコース－インスリン活性化及び停止段階の間、純粋な拡散シナリオよりもＳＮＭ及びＳμＭカプセル化による３２対流条件が優れていた。具体的には、ＳμＭカプセル化を用いた対流輸送は、インスリン活性化において優れた応答を実証し、一方、インスリンは、対流下でＳＮＭ及びＳμＭの両方のカプセル化に関して同様であることが観察された。
２．２．２ サイトカイン曝露
ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、及びＩＬ－１βからなる炎症誘発性サイトカインの高度に濃縮された溶液を使用して、ＳＮＭ－カプセル化膵島のグルコース－インスリン動態がサイトカイン曝露によりどのような影響を受けるかを調査した。高グルコース濃度でチャレンジした場合、対流下のＳＮＭ－カプセル化膵島は、最初の１０分以内に最大レベルに直ちにインスリンを分泌し、次の２０分間におけるインスリン分泌のわずかな減少が続く（図１５ａ）。しかしながら、拡散下のＳＮＭ－カプセル化膵島は、高いグルコース曝露中にインスリン分泌中の増分を示した。高グルコース負荷中の静的培養物下の裸の膵島でのインスリン分泌レベルの増加も観察されたが、インスリン分泌の最大レベルは、他の２つの条件と同じく増幅されなかった。更に、事前刺激及び刺激（即時刺激）中のインスリン分泌の大きさは、静止条件下で裸の膵島、及びＳＩによって示された対流及び拡散下のＳＮＭカプセル化の間で著しく異なり、それぞれ２．９８±０．０６、６．２２±０．６９、４．２９±０．３４であった（図１５Ａ）。高グルコース相における最高量のインスリン分泌を使用してＳＩ（最大刺激）を計算した場合、対流下（６．５０±０．４２）でのＳＮＭカプセル化は、対流下（４．９９±０．５１）のＳＮＭ－カプセル化、及び静的条件下（３．８５±１．５１）の裸の膵島と比較してＳＩの増加を示した（図１５Ｂ）。回路を低グルコース濃度に切り替えたとき、対流下のＳＮＭ－カプセル化膵島は、拡散（図１５Ａ）下の裸の膵島及びＳＮＭカプセル化と比較して、インスリン分泌の最も顕著な降下を示した（図１５Ａ）。ＳＤＩは、裸の膵島の刺激後及び刺激（即時停止）からのインスリン分泌の比に基づいて計算し、対流及び拡散下でのＳＮＭカプセル化は、それぞれ１．１±０．３６、０．４２±０．１９及び０．８±０．１２であった（図１５Ｃ）。刺激後及び刺激（最大停止）から最も低いインスリン分泌の比（最大停止）に基づいてＳＤＩを計算した場合、同様の傾向が、対流（０．２６±０．０２）下のＳＮＭカプセル化、拡散（０．５７±０．１５）下のＳＮＭカプセル化、及びの裸の膵島（０．７０±０．１２）で観察された（図１５Ｃ）。低グルコース刺激から高グルコース刺激へのインスリン産生の変化率のさらなる分析は、対流下のＳＮＭカプセル化膵島が、２．８９正規化インスリン含有量最小１（Ｘ１０－２）を生成したことを示し、一方で、静的条件下での裸の膵島及び拡散下のＳＮＭカプセル化膵島は、０．２２及び０．７３の正規化されたインスリン含有量最小１（Ｘ１０－２）を産生したことを示した（表２）。対流下のＳＮＭカプセル化膵島の高から低グルコース中止のインスリン産生の変化率は、１．７６正規化インスリン含有量最小であり（Ｘ１０－２）、一方、静的培養物下の裸の膵島及び拡散下のＳＮＭカプセル化膵島は、－０．０９２及び－０．３２の正規化されたインスリン含有量最小１（Ｘ１０－２）であった。対流下のＳＮＭカプセル化膵島は、それぞれ、サイトカインにより条件が、低グルコース曝露から高グルコース曝露に変化したときに、それぞれ拡散下の裸の膵島及びＳＮＭカプセル化と比較して、インスリン産生速度の１３．１～３．９６倍の増加を呈した。対流下のＳＮＭカプセル化膵島は、拡散において裸の膵島及びＳＮＭカプセル化と比較して、高から低グルコース条件下でインスリン分泌を停止する速度で１９．１～５．５倍の増加を実証した。要約すると、対流下のＳＮＭ－カプセル化膵島は、高レベルのグルコース及びインスリンが生成され、グルコース濃度の変化により停止した速度で刺激されたときに生成されたインスリンの大きさの観点から（図１５Ｂ～Ｃ）、拡散下での裸の膵島及びＳＮＭカプセル化の両方を超過した（図１９）。
ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、及びＩＬ－１βからなる炎症誘発性サイトカインの高度に濃縮された溶液を使用して、ＳＮＭ－カプセル化膵島のグルコース－インスリン動態がサイトカイン曝露によりどのような影響を受けるかを調査した。高グルコース濃度でチャレンジした場合、対流下のＳＮＭ－カプセル化膵島は、最初の１０分以内に最大レベルに直ちにインスリンを分泌し、次の２０分間におけるインスリン分泌のわずかな減少が続く（図１５ａ）。しかしながら、拡散下のＳＮＭ－カプセル化膵島は、高いグルコース曝露中にインスリン分泌中の増分を示した。高グルコース負荷中の静的培養物下の裸の膵島でのインスリン分泌レベルの増加も観察されたが、インスリン分泌の最大レベルは、他の２つの条件と同じく増幅されなかった。更に、事前刺激及び刺激（即時刺激）中のインスリン分泌の大きさは、静止条件下で裸の膵島、及びＳＩによって示された対流及び拡散下のＳＮＭカプセル化の間で著しく異なり、それぞれ２．９８±０．０６、６．２２±０．６９、４．２９±０．３４であった（図１５Ａ）。高グルコース相における最高量のインスリン分泌を使用してＳＩ（最大刺激）を計算した場合、対流下（６．５０±０．４２）でのＳＮＭカプセル化は、対流下（４．９９±０．５１）のＳＮＭ－カプセル化、及び静的条件下（３．８５±１．５１）の裸の膵島と比較してＳＩの増加を示した（図１５Ｂ）。回路を低グルコース濃度に切り替えたとき、対流下のＳＮＭ－カプセル化膵島は、拡散（図１５Ａ）下の裸の膵島及びＳＮＭカプセル化と比較して、インスリン分泌の最も顕著な降下を示した（図１５Ａ）。ＳＤＩは、裸の膵島の刺激後及び刺激（即時停止）からのインスリン分泌の比に基づいて計算し、対流及び拡散下でのＳＮＭカプセル化は、それぞれ１．１±０．３６、０．４２±０．１９及び０．８±０．１２であった（図１５Ｃ）。刺激後及び刺激（最大停止）から最も低いインスリン分泌の比（最大停止）に基づいてＳＤＩを計算した場合、同様の傾向が、対流（０．２６±０．０２）下のＳＮＭカプセル化、拡散（０．５７±０．１５）下のＳＮＭカプセル化、及びの裸の膵島（０．７０±０．１２）で観察された（図１５Ｃ）。低グルコース刺激から高グルコース刺激へのインスリン産生の変化率のさらなる分析は、対流下のＳＮＭカプセル化膵島が、２．８９正規化インスリン含有量最小１（Ｘ１０－２）を生成したことを示し、一方で、静的条件下での裸の膵島及び拡散下のＳＮＭカプセル化膵島は、０．２２及び０．７３の正規化されたインスリン含有量最小１（Ｘ１０－２）を産生したことを示した（表２）。対流下のＳＮＭカプセル化膵島の高から低グルコース中止のインスリン産生の変化率は、１．７６正規化インスリン含有量最小であり（Ｘ１０－２）、一方、静的培養物下の裸の膵島及び拡散下のＳＮＭカプセル化膵島は、－０．０９２及び－０．３２の正規化されたインスリン含有量最小１（Ｘ１０－２）であった。対流下のＳＮＭカプセル化膵島は、それぞれ、サイトカインにより条件が、低グルコース曝露から高グルコース曝露に変化したときに、それぞれ拡散下の裸の膵島及びＳＮＭカプセル化と比較して、インスリン産生速度の１３．１～３．９６倍の増加を呈した。対流下のＳＮＭカプセル化膵島は、拡散において裸の膵島及びＳＮＭカプセル化と比較して、高から低グルコース条件下でインスリン分泌を停止する速度で１９．１～５．５倍の増加を実証した。要約すると、対流下のＳＮＭ－カプセル化膵島は、高レベルのグルコース及びインスリンが生成され、グルコース濃度の変化により停止した速度で刺激されたときに生成されたインスリンの大きさの観点から（図１５Ｂ～Ｃ）、拡散下での裸の膵島及びＳＮＭカプセル化の両方を超過した（図１９）。
高グルコース負荷の１０分以内に分泌されるインスリン分泌の最大レベルで、対流下のＳＮＭカプセル化膵島とは異なり、対流下のＳμＭカプセル化は、インスリン分泌の持続的上昇を示し、高グルコース曝露の３０分以内に最高ピークに達した（図１６Ａ）。更に、対流下のＳＮＭ－カプセル化インスリンは、６．２２±０．６９のＳＩ値を有するグルコース刺激インスリン分泌の最大の大きさを示し、それは４．６６±０．０７（即時刺激）のＳＩ値を有するＳμＭカプセル化の場合よりも有意に高かった（図１６Ｂ）。高グルコース相における最高量のインスリン分泌物を使用してＳＩ（最大刺激）を計算した場合（最大刺激）、対流下（６．５０±０．４２及び６．３７±０．１１）でのＳＮＭ及びＳμＭカプセル化は、静的条件下（３．８５±１．５１）の裸の膵島と比較してＳＩの増加を示した（図１６Ｂ）。しかしながら、対流下のＳＮＭ及びＳμＭカプセル化膵島の即時停止のためのＳＤＩは同じであり、ＳＤＩが、それぞれ０．４２±０．１９及び０．４０±０．０４であった。同じ傾向が、対流（０．２６±０．０２及び０．２８±０．０４）及び裸の膵島（０．７０±０．１２）でのＳＮＭ及びＳμＭカプセル化のＳＤＩを調べると観察され、ＳＤＩは、刺激後及び刺激（最大停止）からの最も低いインスリン分泌の比に基づいて計算された（図１６Ｃ）。インスリン産生の変化率のさらなる分析を、対流下のＳμＭ－カプセル化膵島について計算し、低から高グルコース刺激へ、及び高から低グルコース停止へ移行において対流下でのＳＮＭカプセル化膵島と比較して１．４６倍の減少及び１．６１倍の増加を示した（図１９）。顕著に、ＳＮＭ及びＳμＭカプセル化を伴う全ての拡散条件は、すべての対流シナリオと比較して、生成されたインスリンの大きさの低減、ならびにインスリン産生速度の低下を示した（図２６Ａ～Ｃ及び図２７Ａ～図２９）。要約すると、ＳＮＭカプセル化による対流輸送は、サイトカイン曝露下でのＳＩ及びＳＤＩ因子によって示されるように（図１５Ａ～Ｃ及び図１６Ａ～Ｃ）、高及び低グルコース相の間に生成及び停止したインスリンの大きさに関してＳμＭカプセル化より優れた性能を実証し、一方、インスリン分泌の変化率は両者で同様であった（図１９）。
サイトカインに供されなかった前の条件を比較すると、サイトカイン曝露の条件がＳＩ値においてわずかな減少を有したことが観察された（図２６Ａ～Ｃ及び図２７Ａ～Ｃを含む）。対流下でのＳＮＭカプセル化のためのサイトカイン曝露の前後に分泌されるインスリンの大きさに有意差はない（ＳＩ（即時刺激）：６．３８±０．４４及び６．２３±０．６９、それぞれ）ことが観察され（図１３Ｂ及び図１５Ｂ）、一方、対流下のＳμＭカプセル化及び静的培養物下の裸の膵島のすべてが、それらのＳＩ値においてわずかに低下した（即時刺激）：対流下でのＳμＭカプセル化は６．４４±１．４１から４．６６±０．０７減少し（図１４Ｂ、図１６Ｂ）、及び裸の膵島は、３．９２±１．０６から２．９８±０．０６に減少した（図１３Ｂ、図１５Ｂ）。静的培養物下の裸の膵島は、サイトカインなしの状態（１．１±０．３６）（図１５Ｃ）よりもサイトカイン曝露（０．５９±０．１７）（図１３Ｃ）でより高いＳＤＩ値を示し、一方、対流下のＳＮＭ及びＳμＭカプセル化は、サイトカインの添加前後に一貫したＳＤＩ値を示した（図１３Ｃ、図１４Ｃ、図１５Ｃ、図１６Ｃ）。高から低グルコース条件に切り替えるとき、裸の膵島は、ＳＤＩ値において大きな変動を示し（即時停止）、インスリン制御機能の部分的な損失を示した。対照的に、膜カプセル化条件は、それらが低グルコース環境に切り替えられた後に、インスリン産生の急激な低下を示した（図１５Ａ～Ｃ、図１６Ａ～Ｃ）。サイトカイン、すなわちＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ及びＩＬ－１βは、一酸化窒素及びケモカインの産生、及び膵島生存能と機能の喪失を引き起こす小胞体ストレスの誘発などの炎症事象のカスケードを介して相乗的に細胞傷害性であることが知られている。上述のＳＩ及びＳＤＩ値におけるそれらの変化によって示されるように、サイトカインは、裸の膵島を損傷し、一方、ＳＮＭ及びＳμＭ膜の選択性は、サイトカイン浸潤を妨害し及び膵島機能を保存したことが推測された。
２．３ 膵島生存率
上述のＳＮＭ－及びＳμＭ－カプセル化のグルコース－インスリン動態に加えて、膵島生存率を調査して、サイトカインが過剰な膵島機能障害を生じるかどうかを理解した（図６）。サイトカイン曝露を有する裸の膵島は、対流下でＳＮＭ－及びＳμＭ－カプセル化を備える全ての他の基と比較して著しく多くの細胞死を示した（図６、ａ）。全ての膜関連拡散条件は、静的培養物下で未処理の裸の膵島に匹敵する正常な健全性を示した（図Ｓ６）。あるレベルのサイトカイン誘導死損傷は、大きな膜孔径に起因する可能性の高いサイトカインを完全に除外することができない結果として、対流下のＳμＭカプセル化において観察された（図１７Ａ）。しかしながら、対流におけるＳμＭ－カプセル化における膵島死は、裸の膵島による対照シナリオにおいて有意ではなかった。サイトカイン曝露で対流下のＳＮＭカプセル化膵島は、サイトカインを含まないＳＮＭカプセル化及び健常な対照条件と比較して同様の生存率を示した。これらの観察は、ＳＮＭによって提供される膜保護が、カプセル化膵島の生存率及び機能的性能を支持するために十分な免疫単離を提供することを確認する。
上述のＳＮＭ－及びＳμＭ－カプセル化のグルコース－インスリン動態に加えて、膵島生存率を調査して、サイトカインが過剰な膵島機能障害を生じるかどうかを理解した（図６）。サイトカイン曝露を有する裸の膵島は、対流下でＳＮＭ－及びＳμＭ－カプセル化を備える全ての他の基と比較して著しく多くの細胞死を示した（図６、ａ）。全ての膜関連拡散条件は、静的培養物下で未処理の裸の膵島に匹敵する正常な健全性を示した（図Ｓ６）。あるレベルのサイトカイン誘導死損傷は、大きな膜孔径に起因する可能性の高いサイトカインを完全に除外することができない結果として、対流下のＳμＭカプセル化において観察された（図１７Ａ）。しかしながら、対流におけるＳμＭ－カプセル化における膵島死は、裸の膵島による対照シナリオにおいて有意ではなかった。サイトカイン曝露で対流下のＳＮＭカプセル化膵島は、サイトカインを含まないＳＮＭカプセル化及び健常な対照条件と比較して同様の生存率を示した。これらの観察は、ＳＮＭによって提供される膜保護が、カプセル化膵島の生存率及び機能的性能を支持するために十分な免疫単離を提供することを確認する。
結論
この研究において、改善されたケイ素ナノ孔膜のグルコースインスリン動態は、対流フローのための膵島のカプセル化のためのＳＮＭを特徴とした。膜カプセル化膵島のグルコース－インスリン応答性を、一連の低、高、及び低グルコース負荷下で以下により分析した：（１）低から高グルコース条件または逆に遷移するときに分泌されたインスリン分泌の大きさを示すＳＩ及びＳＤＩ値、（２）システムが低から高のグルコース条件またはその逆にどのように応答するかを示す、インスリン分泌の変化率。これらのパラメータに基づいて、対流モードは、ＳＮＭ及びＳμＭ両方のカプセル化において、拡散モードよりも良好に機能することが見出された。加えて、サイトカインでは、ＳＮＭカプセル化による対流輸送は、健常な膵島生存率での高及び低グルコース相の間に生成及び停止したインスリンの大きさに関してＳμＭカプセル化上で優れた性能を実証し、一方、インスリン分泌の変化率は、ＳμＭカプセル化の場合と同じスケールであった。要約すると、対流輸送下のＳＮＭカプセル化は、サイトカイン曝露下でも健康な膵島生存率を保持しながら、周囲のグルコース濃度に基づいてインスリン産生を活性化及び停止させる迅速なグルコースインスリン感知を可能にする。我々のデータは、より迅速なインスリン活性化及び停止を得るために、対流輸送を使用することの重要性を示し、それは、グルコース－インスリン応答における望ましくない遅延を伴う多くの膵島カプセル化装置５、３５で対処するのに重要な問題である。対流輸送下の選択的なＳＮＭによって成功した膵島カプセル化は、免疫抑制薬、現在の療法から生じるそれらの副作用を潜在的に減少させる可能性があり、ドナーの不足を克服するために異種または幹細胞由来の細胞源を使用する可能性を導き、将来のＴ１Ｄ患者のための危険な低血糖のエピソードを減少させる。
この研究において、改善されたケイ素ナノ孔膜のグルコースインスリン動態は、対流フローのための膵島のカプセル化のためのＳＮＭを特徴とした。膜カプセル化膵島のグルコース－インスリン応答性を、一連の低、高、及び低グルコース負荷下で以下により分析した：（１）低から高グルコース条件または逆に遷移するときに分泌されたインスリン分泌の大きさを示すＳＩ及びＳＤＩ値、（２）システムが低から高のグルコース条件またはその逆にどのように応答するかを示す、インスリン分泌の変化率。これらのパラメータに基づいて、対流モードは、ＳＮＭ及びＳμＭ両方のカプセル化において、拡散モードよりも良好に機能することが見出された。加えて、サイトカインでは、ＳＮＭカプセル化による対流輸送は、健常な膵島生存率での高及び低グルコース相の間に生成及び停止したインスリンの大きさに関してＳμＭカプセル化上で優れた性能を実証し、一方、インスリン分泌の変化率は、ＳμＭカプセル化の場合と同じスケールであった。要約すると、対流輸送下のＳＮＭカプセル化は、サイトカイン曝露下でも健康な膵島生存率を保持しながら、周囲のグルコース濃度に基づいてインスリン産生を活性化及び停止させる迅速なグルコースインスリン感知を可能にする。我々のデータは、より迅速なインスリン活性化及び停止を得るために、対流輸送を使用することの重要性を示し、それは、グルコース－インスリン応答における望ましくない遅延を伴う多くの膵島カプセル化装置５、３５で対処するのに重要な問題である。対流輸送下の選択的なＳＮＭによって成功した膵島カプセル化は、免疫抑制薬、現在の療法から生じるそれらの副作用を潜在的に減少させる可能性があり、ドナーの不足を克服するために異種または幹細胞由来の細胞源を使用する可能性を導き、将来のＴ１Ｄ患者のための危険な低血糖のエピソードを減少させる。
図１Ａ～Ｂは、ケイ素ナノ多孔性膜（ＳＮＭ）を示す。図１Ａは、ＳＮＭ切粉の光学画像を示す。図１Ｂは、２ｕｍの長さを有するナノ孔を例示する膜の表面のＳＥＭ画像を示す。図１Ｃは、７ｎｍの幅及び３００ｎｍの深さで１つのナノ孔を例示する膜の断面のＳＥＭ画像を示す。
図２Ａ～Ｇは、ケイ素ナノ孔膜の製造のための概略図を示す。図２Ａは、両側研磨Ｓｉウエハのピラニャー洗浄を示す。図２Ｂは、ＳｉＯ２の熱酸化成長及びポリシリコンの低圧力化学蒸着（ＬＰＣＶＤ）を示す。図２Ｃは、ポリシリコンの乾燥－エッチングパターンを示す。図２Ｄは、ナノ孔を画定する犠牲層として使用するためのＳｉＯ２の熱酸化成長を示す。図２Ｅは、湿ったエッチングによるアンカ層のパターン化を示す。図２Ｆは、ポリシリコンのＬＰＣＶＤを示す。図２Ｇは、垂直ＳｉＯ２ナノ孔が曝露するまでポリシリコンのブランケットエッチを示す。図２Ｈは、膜保護のための低温酸化物（ＬＴＯ）の堆積、及び深い反応性イオンエッチングを用いた膜の裏面エッチングを示す。図２Ｉは、ＬＴＯの乾燥エッチング除去及びＳｉＯ２の湿潤エッチング放出を示す。
図３Ａ～Ｄは、サイトカイン曝露下のマウス膵島のインビトロ生存率を示す。図３Ａは、６時間の実験に続いてＳＮＭカプセル化マウス膵島の生存率が測定され、膵島を２ｐｓｉの圧力差で５ｍｌ／分で模擬ループ回路を循環させる培養液に供した。図３Ｂは、生存可能（緑色）及び死（赤色）細胞を、対照静的培養物（図３Ａ～Ｂ）及びＳＮＭカプセル化マウス膵島（図３Ｃ～Ｄ）について染色した。サイトカイン曝露（＋Ｃｋで示す）の実験は、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、及びＩＬ－１βを含有する媒体から構成された。膵島の生存率を、膵島領域にわたって死細胞（赤色）の比に基づいて計算した。静的培養物の膵島の生存率を比較のための対照として評価した。ＳＮＭは、炎症誘発性サイトカイン（ＳＮＭ、＋Ｃｋ）由来のカプセル化されたマウス膵島を保護し、サイトカイン曝露（ＳＮＭ、－Ｃｋ）なしのＳＮＭカプセル化マウス膵島及びサイトカイン曝露なしの対照静的培養物（対照、－Ｃｋ）と同様の生存率を示した。サイトカイン曝露（対照、＋Ｃｋ）での対照静的培養物は、他の基と比較して著しく多くの細胞死を示した。（ｎ＞３、＊ｐ＜０．０５）。
図４は、ＳＮＭ－カプセル化チャンバ内及び静的培養物下のマウス膵島のグルコース刺激インスリン放出を示す。膵島を低グルコース、高グルコース、及び低グルコース含有する培地に、それぞれ１５分間さらした。サイトカイン曝露（＋Ｃｋにより示される）での実験は、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、及びＩＬ－１βを含有する培養溶液から構成された。サイトカインを含まない静的培養物（Ｃｏｎｔｒｏｌ、－Ｃｋ）、サイトカインを含まない模擬ループ装置（ＳＮＭ、－Ｃｋ）及びサイトカイン（ＳＮＭ、＋Ｃｋ）で曝露された模擬ループフローセル装置は、それぞれ、低グルコース相の間に分泌されるものよりも高グルコース負荷の間に分泌されるインスリンの量が３．０倍、２．６倍、及び４．１倍増加した。しかし、サイトカイン曝露による対照静的培養物（Ｃｏｎｔｒｏｌ、＋Ｃｋ）は、サイトカイン浸潤によって死滅した死細胞のために、高グルコース負荷時に限られた量のインスリンを分泌した。（ｎ＞３、＊ｐ＜０．０５）。
図５は、約２ｐｓｉの圧力差下でＳＮＭのスリット孔を通じた様々な分子の輸送を示す。ふるい係数（Ｓ）は、供給物の濃度に亘りの濾液の濃度の比として発現された（±ＳＥ）。ネガティブ対照として、ＢＳＡを使用した。結果は、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、及びＩＬ－１βのふるい係数が、６時間後にそれぞれ、０．１６、０．２７、及び０．２７であったことを示した。グルコース及びインスリンのふるい係数は迅速に１に達した。これらのデータは、グルコース及びインスリンなどの小分子がＳＮＭを完全に通過し、一方、サイトカインのエントリは、対流輸送下で大幅に妨げられたことを示した。
図６は、Ｔ１Ｄ患者の腕部における埋め込み可能な血管内バイオ人工膵装置の概念図を示す。移植された膵島は、動脈－静脈（ＡＶ）移植片として取り付けられた２つのＳＮＭシートの間にカプセル化される。動脈－静脈圧力差動は、膵島を連続的に支持する限外濾過液を生成するであろうが、次いで、順番に、グルコースレベルを感知し、静脈血液に掃引されるインスリンを生成する。ＳＮＭの小孔径は、移植された膵島とホストとの間の適切な免疫単離を保証する。
図７は、対流条件下でＳＮＭカプセル化膵島のインビトロ評価の模擬ループ回路の概略図を示す。蠕動ポンプは、液をフローセルの上部区画、圧力トランスデューサ、３方向バルブ、フローセルの底部区画を通って、最終的に元のリザーバに戻るように循環する。フローセルは、フローセルを３つの区画に分割する２つの膜で構成し、膵島を中央チャンバの内部に配置した。限外濾過液の流れは、上部膜が高圧「動脈」血液チャネルに隣接し、第２の膜が高圧「静脈」血液チャネルに隣接している間、２つの半透性膜の間の中央チャンバ内で生じた。３方向バルブを使用して、上部と底部の区画との間の約２ｐｓｉの圧力差を生成し、生理学的状態を模倣した。
図８は、圧力駆動サイトカイン濾過試験システムの概略図を示す。蠕動ポンプは、膜間圧力を確立するために３方向バルブに接続されたフローセルを通して液を循環した。膜による透過性限外濾過液を、最大６時間、様々な時間で収集した。
図９は、透水率試験システムの概略図を示す。空気は、圧力調整器を通り液体リザーバへと加えられる。蠕動ポンプは、囲まれた膜を介してフローセルを通してこの液体を循環させた。膜間圧力を調整するデータ取得用ノートパソコンによって自動的に制御された差圧トランスデューサに接続されたフローセル。透過した限外濾過液を精度質量バランスの上部で液体容器に回収した。差圧トランスデューサ及び質量バランスからのデータを自動的に収集し、データ取得用ノートパソコンに格納した。
図１０は、相対溶質サイズ（λ）のａ．比較を示す。実験の相対溶質サイズ（平均、ＳＥ）は、６時間のサイトカインのふるい係数に基づいて計算される。理論値は、Ｓｔｏｋｅｓ－Ｅｉｎｓｔｅｉｎの等式１４を使用して決定した。
図１１は、模擬ループ系における溶質分布の評価を示す。模擬ループ回路は、フローセルを上部、中央、及び底部区画に分割する２つの膜から成った。各チャンバからの溶質の濃度を６時間の実験の終了時に評価し、供給溶液のものに対する割合（平均、ＳＥ）として発現した。ケイ素微孔膜（ＳＨＭ）は、直径１０００ｎｍで構成され、スリット孔を対照として使用した。このデータは、中間チャンバではＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１βの量が３０％、３５％、３４％に有意に減少したが、小分子のインスリン及びグルコースは、対流フロー下のＳＮＭを通して完全に（約１００％）通過した。しかしながら、サイトカインを含有する全ての分子は、ＳＨＭ間に挟まれた中央チャンバ内に通された。（ｎ＞３、＊ｐ＜０．０５）。
図１２Ａは、２μｍの長さを有するナノ孔を示す傾斜した膜表面のＳＥＭ画像を示す。図１２Ｂは、７ｎｍの幅及び３００ｎｍの深さでナノ孔を描写する、膜の断面のＳＥＭ画像を示す。図１２Ｃは、４μｍの長さを有する微細孔を示す膜表面のＳＥＭ画像を示す。図１２Ｄは、１μｍの幅を有する微細孔を示す膜の断面のＳＥＭ画像を示す。
図１３Ａ～Ｃは、サイトカイン曝露なしの対流及び拡散下のグルコース－ＳＮＭカプセル化膵島のグルコース－インスリン動態を示す。図１３Ａは、サイトカインにさらされないで対流（２ｐｓｉ）（Ｃｏｎｖ）及び拡散輸送（Ｄｉｆｆ）下で９０分間の低－高－低（１．６ｍＭ、１６．６ｍＭ、１．６ｍＭ）グルコース刺激中のＳＮＭカプセル化マウス膵島のインスリン放出動態を示す。静的条件下で培養された裸の膵島は対照（対照）として機能した。対流輸送下のＳＮＭカプセル化膵島（ＳＮＭ、Ｃｏｎｖ）は、高いグルコース濃度での刺激後のより高いインスリン分泌及び拡散輸送下のもの（ＳＮＭ、Ｄｉｆｆ）と比較した応答で、より迅速なインスリン放出動態を呈した。（平均±ＳＥＭ、ｎは３以上）。図１３Ｂは、刺激指数（ＳＩ）が、（１）４０分の高グルコース相における最初のインスリン採取から３０分の前の低グルコース相の最後のインスリン採取点まで（即時刺激）、及び（２）高グルコース相における最高のインスリン分泌から３０分の前の低グルコース相の最後のインスリン採取点（最大刺激）の比率として計算されたことを示す。ＳＩは、より高い濃度のグルコースによって刺激されたインスリンの大きさを示す。サイトカイン曝露がない場合、静的条件（対照）下で培養された裸の膵島に加えて、対流（ＳＮＭ、Ｃｏｎｖ）及び拡散（ＳＮＭ、Ｄｉｆｆ）下のＳＮＭカプセル化膵島はすべて、低グルコースから高グルコースへの移行時（即時刺激）に同様の大きさのグルコース誘発インスリン分泌を示した。しかしながら、対流下のＳＮＭカプセル化膵島（ＳＮＭ、Ｃｏｎｖ）のＳＩは、高いグルコース相における最高インスリン分泌が使用されるときに（最大刺激）、拡散下でのもの（ＳＮＭ、Ｄｉｆｆ）及び静的条件下で培養された裸の膵島と比較して最高であった。（平均±ＳＥＭ、ｎは３以上）。図１３Ｃは、停止指数（ＳＤＩ）が、（１）７０分のその後の低グルコース相における最初のインスリン採取点からで６０分間の低グルコース相の最後のインスリン採取点（即時停止）、及び（２）その後の低グルコース相における最も低いインスリン分泌から６０分での高グルコース相における最後のインスリン採取点（最大遮断）までの比率であったことを示した。ＳＤＩは、一旦、グルコース濃度が正常に戻ると、インスリン産生の中止の大きさを反映する。サイトカイン曝露なしで、対流下のＳＮＭカプセル化膵島（ＳＮＭ、Ｃｏｎｖ）は、グルコース低下（即時停止＆最大停止）の際に、拡散状態（ＳＮＭ、Ｄｉｆｆ）及び裸の膵島培養物（対照）と比較してインスリン減少の最大の大きさを示した。（平均±ＳＥＭ、３以上、＊ｐ＜０．０５）。
図１４Ａ～Ｃは、サイトカイン曝露なしの対流下のＳＮＭ及びＳμｍカプセル化膵島のグルコース－インスリン動態を示す。図１４Ａは、対流（２ｐｓｉ）（Ｃｏｎｖ）下での９０分間の低－高－低（１．６ｍＭ、１６．６ｍＭ、１．６ｍＭ）グルコース刺激の間に、サイトカインに曝されないＳＮＭ及びＳμＭカプセル化マウス膵島のインスリン放出動態を示す。静的条件下で培養された裸の膵島は対照（対照）として機能した。サイトカイン曝露なしでは、対流輸送下でのＳμＭカプセル化膵島（ＳμＭ、Ｃｏｎｖ）は、高グルコース濃度での刺激後により高いインスリン分泌及び対流輸送下でのＳＮＭカプセル化膵島（ＳＮＭ、Ｃｏｎｖ）と比較した応答で、より速いインスリン放出動態を示した。（平均±ＳＥＭ、ｎは３以上）。図１４Ｂは、刺激指数（ＳＩ）が、（１）４０分の高グルコース相における最初のインスリン採取から３０分の前の低グルコース相の最後のインスリン採取点まで（即時刺激）、及び（２）高グルコース相における最高のインスリン分泌から３０分の前の低グルコース相の最後のインスリン採取点（最大刺激）の比率として計算されたことを示す。ＳＩは、より高い濃度のグルコースによって刺激されたインスリンの大きさを示す。サイトカイン曝露なしで、対流下のＳＮＭ及びＳμＭカプセル化膵島（ＳＮＭ、Ｃｏｎｖ＆ＳμＭ、Ｃｏｎｖ）は、すべて静的条件下で培養された裸の膵島（対照）と比較して分泌されたインスリンのより大きい大きさを示した。更に、高グルコース相における最も高いインスリン分泌が使用された場合（最大刺激）、対流下のＳμＭカプセル化膵島（ＳμＭ、Ｃｏｎｖ）のＳＩは、ＳＮＭ（ＳＮＭ、Ｃｏｎｖ）及び静的条件下で培養された裸の膵島（対照）と比較して最大である。（平均±ＳＥＭ、ｎは３以上）。図１４Ｃは、停止指数（ＳＤＩ）が、（１）７０分のその後の低グルコース相の最初のインスリン採取点から６０分の高グルコース相の最後のインスリン採取点まで、及び（２）その後の低グルコース相における最も低いインスリン分泌から６０分での高グルコース相における最後のインスリン採取点（最大遮断）までの比率であったことを示す。ＳＤＩは、一旦、グルコース濃度が正常に戻ると、インスリン産生の中止の大きさを反映する。サイトカイン曝露なしでは、対流下のＳＮＭ及びＳμＭカプセル化膵島の両方（ＳＮＭ、Ｃｏｎｖ＆ＳμＭ、Ｃｏｎｖ）は、静脈条件下で培養された膵島（対照）と比較して、グルコースが低く戻ると（即時停止及び最大停止）、有意なインスリン減少を示した。（平均±ＳＥＭ、３以上、＊ｐ＜０．０５）。
図１５Ａ～Ｃは、サイトカイン曝露で対流及び拡散下でＳＮＭカプセル化膵島のグルコース－インスリン動態を示す。図１５Ａは、サイトカインにさらされる対流（２ｐｓｉ）（Ｃｏｎｖ）及び拡散輸送（Ｄｉｆｆ）下の９０分間の低高低（１．６ｍＭ、１６．６ｍＭ、１．６ｍＭ）グルコース刺激のＳＮＭカプセル化マウスのインスリン放出動態を示す。サイトカイン曝露（＋Ｃｋ）を有する実験は、ＴＮＦ－α（２，０００Ｕ／ｍＬ）、ＩＦＮ－γ（１，０００Ｕ／ｍＬ）、及びＩＬ－１β（１０，０００Ｕ／ｍＬ）を含有する媒体から成った。静的条件下で培養された裸膵島は、対照（Ｃｏｎｔｒｏｌ、＋Ｃｋ）として機能した。対流輸送下のＳＮＭカプセル化膵島（ＳＮＭ、Ｃｏｎｖ、＋Ｃｋ）は、高グルコース濃度での刺激に続くより高いインスリン分泌、拡散輸送下のもの（ＳＮＭ、Ｄｉｆｆ、＋Ｃｋ）及び静的条件下で培養された裸の膵島（Ｃｏｎｔｒｏｌ、＋Ｃｋ）と比較した応答で、より速いインスリン放出動態を呈した。（平均±ＳＥＭ、ｎは３以上）図１５Ｂは、刺激指数（ＳＩ）が、（１）４０分の高グルコース相における最初のインスリン採取から３０分の前の低グルコース相の最後のインスリン採取点まで（即時刺激）、（２）高グルコース相における最高のインスリン分泌から３０分の前の低グルコース相の最後のインスリン採取点（最大刺激）までの比率として計算されたことを示す。ＳＩは、より高い濃度のグルコースによって刺激され、放出されたインスリンの大きさを示す。サイトカイン曝露（＋Ｃｋ）によって、対流下（ＳＮＭ、変換）、及び拡散（ＳＮＭ、Ｄｉｆｆ）下のＳＮＭカプセル化膵島を備えるすべての条件及び、静的条件（対照）下で培養された裸の膵島は、グルコース誘発インスリン分泌において様々なレベルの大きさを示した（即時刺激）。しかしながら、高グルコース相（最大刺激）における最高インスリン分泌を使用する場合、計算されたＳＩは、拡散下（ＳＮＭ、Ｄｉｆｆ）下のもの及び静的条件下（Ｃｏｎｔｒｏｌ）で培養された裸の膵島と比較して、対流下のＳＮＭカプセル化膵島（ＳＮＭ、Ｄｉｆｆ）に対して最高であった。（平均±ＳＥＭ、３以上、＊ｐ＜０．０５）。図１５Ｃは、刺激指数（ＳＩ）が、（１）７０分の後の低グルコース相の最初のインスリン採取点から６０分の高グルコース相の最後のインスリン採取点の最初のインスリン採取点（即時停止）、及び（２）その後の低グルコース相の最低のインスリン分泌から６０分の高グルコース相における最後のインスリン採取点（最大遮断）における最も低いインスリン分泌の比率として計算されたことを示す。ＳＤＩは、一旦、グルコース濃度が正常に戻ると、インスリン産生の中止の大きさを反映する。サイトカイン曝露（＋Ｃｋ）によって、対流下のＳＮＭカプセル化膵島（ＳＮＭ、変換）は、グルコースが低下（即時停止及び最大停止）する場合、拡散状態（ＳＮＭ、Ｄｉｆｆ）及び裸の膵島培養物（対照）と比較して、インスリン減少の最高の大きさを呈した。（平均±ＳＥＭ、３以上、＊ｐ＜０．０５）。
図１６Ａ～Ｃは、サイトカイン曝露で対流下のＳＮＭ及びＳμＭカプセル化膵島下のグルコース－インスリン動態を示す。図１６Ａは、サイトカイン（＋Ｃｋ）にさらされる対流（２ｐｓｉ）（Ｃｏｎｖ）下での９０分間の低－高－低（１．６ｍＭ、１６．６ｍＭ、１．６ｍＭ）グルコース刺激中のＳＮＭ及びＳμＭカプセル化マウス膵島のインスリン放出動態を示す。静的条件下で培養された裸膵島は、対照（Ｃｏｎｔｒｏｌ、＋Ｃｋ）として機能した。サイトカイン曝露（＋Ｃｋ）を有する実験は、ＴＮＦ－α（２，０００Ｕ／ｍＬ）、ＩＦＮ－γ（１，０００Ｕ／ｍＬ）、及びＩＬ－１β（１０，０００Ｕ／ｍＬ）を含有する媒体からなった。サイトカイン曝露（＋Ｃｋ）では、対流輸送下のＳμＭカプセル化膵島（ＳμＭ、Ｃｏｎｖ）は、高グルコース濃度での４０分から６０分の刺激後に連続的なインスリン分泌を示したが、対流下のＳＮＭカプセル化膵島（ＳＮＭ、Ｃｏｎｖ）は、この負荷期間中にインスリン産生の血小板を示した。（平均±ＳＥＭ、ｎは３以上）。図１６Ｂは、刺激指数（ＳＩ）は、（１）４０分の高グルコース相における最初のインスリン採取から３０分の前の低グルコース相の最後のインスリン採取点まで（即時刺激）、及び（２）高グルコース相の最高のインスリン分泌から３０分の前の低グルコース相の最後のインスリン採取点（最大刺激）までの比率として計算されたことを示す。ＳＩは、より高い濃度のグルコースによって刺激され、放出されたインスリンの大きさを示す。サイトカイン曝露（＋Ｃｋ）によって、対流下のＳＮＭ及びＳμＭカプセル化膵島（ＳＮＭ、Ｃｏｎｖ＆ＳμＭ、Ｃｏｎｖ）及び静的条件下での裸膵島培養物（対照）はすべて、高グルコース負荷（即時刺激）で分泌されるインスリンの大きさに有意差を示した（即時刺激）。しかしながら、対流下のＳＮＭ及びＳμＭカプセル化膵島（ＳＮＭ、Ｃｏｎｖ＆ＳμＭ、Ｃｏｎｖ）は、最も高いインスリン分泌が使用されたときの高グルコース負荷時に分泌されるインスリンの大きさに大きな差を示した（最大刺激）。（平均±ＳＥＭ、３以上、＊ｐ＜０．０５）。図１６Ｃは、停止指数（ＳＤＩ）が、（１）７０分の続く低グルコース相の最初のインスリン採取点から６０分の高グルコース相の最後のインスリン採取点まで（即時遮断）、及び（２）その後の低グルコース相から６０分での高グルコース相における最後のインスリン採取点までおける最も低いインスリン分泌（最大遮断）の比率として計算されたことを示す。ＳＤＩは、一旦、グルコース濃度が正常に戻ると、インスリン産生の中止の大きさを反映する。サイトカイン曝露（＋Ｃｋ）によって、対流下のＳＮＭ及びＳμＭカプセル化膵島（ＳＮＭ、Ｃｏｎｖ＆ＳμＭ、Ｃｏｎｖ）は、グルコースが低下する場合（即時停止＆最大停止）裸の膵島培養物（対照）に比べて最大のインスリン減少を示した。（平均±ＳＥＭ、３以上、＊ｐ＜０．０５）。
図１７Ａ～Ｂは、マウス膵島のインビトロ生存率を示す。図１７Ａは、９０分低－高－低（１．６ｍＭ、１６．６ｍＭ、１．６ｍＭ）のグルコース刺激後にマウス膵島の生存率を測定し、対流下のＳＮＭ及びＳμＭカプセル化（ＳＮＭ、Ｃ＆ＳμＭ、Ｃ）のためにサイトカイン曝露（＋Ｃｋ）あり、または無しの模擬ループ回路に供した。サイトカイン曝露で静的培養物下の裸の膵島培養物（対照、＋Ｃｋ）は、全ての他の条件と比較して著しく低い生存率を示した。（平均±ＳＥＭ、３以上、＊ｐ＜０．０５）。図１７Ｂは、サイトカインを含まない対照静的培養物（Ａ：対照）、サイトカインを用いた静的培養物（Ｂ：対照、＋Ｃｋ）、サイトカインなしで対流下のＳＮＭカプセル化マウス膵島（Ｃ：ＳＮＭ、Ｃ）、サイトカインを用いた対流下のＳＮＭカプセル化マウス膵島（Ｄ：ＳＮＭ、Ｃ、＋Ｃｋ）、サイトカインを含まない対流下のＳμＭカプセル化マウス膵島ＳμＭ、Ｃ）、及びサイトカインを用いた対流下のＳμＭ－カプセル化マウス膵島（Ｆ：ＳμＭ、Ｃ、＋Ｃｋ）のために生存可能な（緑色）細胞及び死んだ（赤色）細胞が染色されたことを示す。サイトカイン曝露（＋Ｃｋで示す）の実験は、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、及びＩＬ－１βを含有する媒体から構成された。サイトカインを備える両方の対照静的培養物、（Ｂ：対照、＋Ｃｋ）、サイトカインによる対流下のＳμＭカプセル化マウス膵島（Ｆ：ＳμＭ、Ｃ、＋Ｃｋ）は、他の基と比較してより高いレベルの膵島損傷を示したが、サイトカインによる対流下でのＳμＭカプセル化マウス膵島の生存率（Ｆ：ＳμＭ、Ｃ、＋Ｃｋ）は統計的に有意でない（ｎ．ｓ．）（図１７Ａ）。
図１８は、表１におけるサイトカイン曝露なしのインスリン分泌の変化率を示す。インスリン産生の変化率は、グルコース濃度変化として分泌されるインスリンの迅速性を説明するためにグルコースインスリン動態グラフ上に適合された曲線の傾斜に基づいて計算した。サイトカインにさらされないで、対流下のＳμＭカプセル化マウス膵島（ＳμＭ、Ｃｏｎｖ）は、高グルコース曝露後に最も速い応答を示し、一方で、対流下のＳＮＭ及びＳμＭカプセル化マウス膵島（ＳＮＭ、Ｃｏｎｖ＆ＳμＭ、Ｃｏｎｖ）は、グルコース濃度が正常に戻ったときに同様のインスリン停止率を示した。
図１９は、表２におけるサイトカイン曝露によるインスリン分泌の変化率を示す。インスリン産生の変化率は、グルコース濃度変化として分泌されるインスリンの病態を説明するためにグルコースインスリン動態グラフ上に適合された曲線の傾斜に基づいて計算した。サイトカイン（＋Ｃｋ）にさらされないで、対流下のＳＮＭカプセル化マウス膵島（ＳＮＭ、Ｃｏｎｖ）は、高グルコース曝露後に最も速い応答を示し、一方で、対流下のＳＮＭ及びＳμＭカプセル化マウス膵島（ＳＮＭ、Ｃｏｎｖ＆ＳμＭ、Ｃｏｎｖ）は、グルコース濃度が正常に戻ったときに同様のインスリン停止率を示した。
図２０Ａ～Ｄは、細胞骨格構造のためのプロセス及び固定具の説明を示す。図２０Ａは、ケイ素ワイヤホルダーの上部にレーザー切断アクリルシートを提示する。図２０Ｂは、限外濾過チャネルを作製するための適所のレッドワイヤを示す。図２０Ｃは、アクリルシートのレーザー切断空隙に注入される紫色の膵島アガロースゲルを提示する。図２０Ｄは、赤色ワイヤ及びケイ素ワイヤホルダーの除去後の完成した細胞骨格を示す。
図２１は、バイオ人工装置の構成要素の拡大図を示す。
図２２は、バイオ人工装置の入口及び出口構成要素を示す。組み立てられたｉＢＡＰは、インビトロ及びインビボ実験の両方で使用される。
図２３Ａ～Ｂは、動脈静脈移植片にインライン接続されたバイオ人工装置、及びインスリン豊富な限外濾過液を静脈内に送達する限外濾過カテーテルの例示の説明を示す。図２３Ｂは、両側のＳＮＭ（緑）カプセル化ＩＣ（青色）で囲まれた単一の血液チャネルを示す洪水流の軸方向及び垂直方向に沿った断面図を示す。限外濾過液は、ＳＮＭカプセル化入化入口チャンバを超え限外濾過液チャンバに、次いで、限外濾過流路に沿って、限外濾過液出口に流れる。
図２４Ａ～Ｃは、サイトカイン曝露を伴わない対流及び拡散下でのＳμＭカプセル化膵島のグルコース－インスリン動態を示す。図２４Ａは、サイトカインへさらされることなく、対流（２ｐｓｉ）（Ｃｏｎｖ）及び拡散輸送（Ｄｉｆｆ）の下で、９０分間低高低（１．６ｍＭ、１６．６ｍＭ、１．６ｍＭ）グルコース刺激の間のＳμＭカプセル化マウスのインスリン放出動態を示す。静的条件下で培養された裸の膵島は、対照（Ｃｏｎｔｒｏｌ）として機能した。対流輸送下のＳμＭカプセル化膵島（ＳμＭ、Ｃｏｎｖ）は、高グルコース濃度での刺激後のインスリン分泌がより高く、拡散輸送下でのもの（ＳμＭ、Ｄｉｆｆ）と比較した反応でより速いインスリン放出動態を呈した。（平均±ＳＥＭ、ｎは３以上）。図２４Ｂは、刺激指数（ＳＩ）が、（１）４０分の高グルコース相における最初のインスリン採取から３０分の前の低グルコース相の最後のインスリン採取点まで（即時刺激）、及び（２）高グルコース相における最高のインスリン分泌から３０分の前の低グルコース相の最後のインスリン採取点（最大刺激）までの比率として計算されたことを示す。ＳＩは、より高い濃度のグルコースによって刺激され、放出されたインスリンの大きさを示す。サイトカイン曝露なしで、静的条件下で培養された裸の膵島に加えて対流（ＳμＭ、Ｃｏｎｖ）及び拡散（ＳμＭ、Ｄｉｆｆ）下のＳμＭカプセル化膵島はすべて、同様の大きさのグルコース誘発インスリン分泌（即時刺激）を示した。しかしながら、対流下（ＳμＭ、Ｃｏｎｖ）下のＳμＭ－カプセル化膵島は、高グルコース相における最高のインスリン分泌が使用されるときに（最大刺激）、インスリン分泌の最も高い大きさを示した。（平均±ＳＥＭ、ｎは３以上）。図２４Ｃは、停止指数（ＳＤＩ）が（１）７０分の後の低グルコース相の最初のインスリン採取点から６０分で高グルコース相の最後のインスリン採取点まで（即時停止）、及び（２）その後の低グルコース相における最も低いインスリン分泌から６０分での高グルコース相における最後のインスリン採取点（最大遮断）までの比率であったことを示す。ＳＤＩは、一旦、グルコース濃度が正常に戻ると、インスリン産生の中止の大きさを反映する。サイトカイン曝露なしで、対流下のＳμＭカプセル化膵島（ＳμＭ、Ｃｏｎｖ）は、グルコースが低くなった（即時停止）場合の拡散状態（ＳμＭ、Ｄｉｆｆ）及び裸の膵島培養物（Ｃｏｎｔｒｏｌ）と比較して最高のインスリン減少量を示した。低グルコース相における最低インスリン分泌が使用された場合、対流下（ＳμＭ、Ｃｏｎｖ）の下にＳμＭカプセル化膵島は、インスリン減少の最大の大きさ（最大停止）も示した。（平均±ＳＥＭ、３以上、＊ｐ＜０．０５）。
図２５Ａ～Ｃは、サイトカイン曝露なしの拡散下でＳＮＭ及びＳμＭカプセル化のグルコース－インスリン動態を示す。図２５Ａは、サイトカインにさらされないで拡散（２ｐｓｉ）（Ｄｉｆｆ）下での９０分間の低－高－低（１．６ｍＭ、１６．６ｍＭ、１．６ｍＭ）グルコース刺激中のＳＮＭ及びＳμＭカプセル化マウス膵島のインスリン放出動態を示す。静的条件下で培養された裸の膵島は、対照（Ｃｏｎｔｒｏｌ）として機能した。サイトカイン曝露なしで、拡散輸送下のＳμＭカプセル化膵島（ＳμＭ、Ｄｉｆｆ）は、拡散輸送下のＳＮＭカプセル化膵島（ＳＮＭ、Ｄｉｆｆ）と比較して、高グルコース濃度での刺激後にゆっくりと安定化したより高いインスリン分泌を示した。（平均±ＳＥＭ、ｎは３以上）。図２５Ｂは、刺激指数（ＳＩ）が（１）４０分の高グルコース相における最初のインスリン採取から３０分の前の低グルコース相の最後のインスリン採取点まで（即時刺激）、（２）高グルコース相における最高のインスリン分泌から３０分の前の低グルコース相の最後のインスリン採取点（最大刺激）までの比率として計算されたことを示す。ＳＩは、より高い濃度のグルコースによって刺激され、放出されたインスリンの大きさを示す。サイトカイン曝露なしで、拡散下のＳＮＭ及びＳμＭカプセル化膵島（ＳＮＭ、Ｄｉｆｆ及びＳμＭ、Ｄｉｆｆ）は全て静的条件下で培養された裸の膵島（対照）（即時刺激）と比較して同様のインスリン分泌量を示した。更に、拡散下のＳＮＭカプセル化膵島（ＳＮＭ、Ｄｉｆｆ）及び静的条件下で培養された裸の膵島は、高グルコース相における最も高いインスリン分泌が使用される場合（最大刺激）、拡散下のＳμＭカプセル化膵島（ＳμＭ、Ｄｉｆｆ）と比較してＳＩの増加を示した。（平均±ＳＥＭ、ｎは３以上）。図２５Ｃは、停止指数（ＳＤＩ）が、（１）７０分の続く低グルコース相の最初のインスリン採取点から６０分高グルコース相の最後のインスリン採取点まで（即時停止）、及び（２）その後の低グルコース相における最も低いインスリン分泌から６０分での高グルコース相における最後のインスリン採取点（最大遮断）までの比率であったことを示す。ＳＤＩは、一旦、グルコース濃度が正常に戻ると、インスリン産生の中止の大きさを反映する。サイトカイン曝露なしで、拡散下のＳＮＭ及びＳμＭカプセル化膵島（ＳＮＭ、Ｄｉｆｆ及びＳμＭ、Ｄｉｆｆ）は、グルコースが低く戻ると（即時停止）、静脈条件下で培養された膵島（対照）と比較してインスリン低下の類似の大きさを示した。しかしながら、停止されたレベルは、最低インスリン分泌が使用されたときに（最大停止）、他の２つの条件（ＳＮＭ、Ｄｉｆｆ＆Ｃｏｎｔｒｏｌ）よりも拡散下のＳμＭ－カプセル化膵島（ＳμＭ、Ｄｉｆｆ）において、有意であった。（平均±ＳＥＭ、３以上、＊ｐ＜０．０５）。
図２６Ａ～Ｃは、サイトカイン曝露による対流及び拡散下のＳμＭカプセル化膵島のグルコース－インスリン動態を示す。図２６Ａは、サイトカイン（＋Ｃｋ）にさらされないで、対流（２ｐｓｉ）（Ｃｏｎｖ）及び拡散輸送（Ｄｉｆｆ）下での９０分間の低－高－低（１．６ｍＭ、１６．６ｍＭ、１．６ｍＭ）グルコース刺激中のＳμＭカプセル化マウス膵島のインスリン放出動態を示す。サイトカイン曝露（＋Ｃｋ）を有する実験は、ＴＮＦ－α（２，０００Ｕ／ｍＬ）、ＩＦＮ－γ（１，０００Ｕ／ｍＬ）、及びＩＬ－１β（１０，０００Ｕ／ｍＬ）を含有する媒体からなった。静的条件下で培養された裸膵島は、対照（Ｃｏｎｔｒｏｌ、＋Ｃｋ）として機能した。対流輸送下のＳμＭカプセル化膵島（ＳμＭ、Ｃｏｎｖ、＋Ｃｋ）は、拡散輸送下のもの（ＳμＭ、Ｄｉｆｆ、＋Ｃｋ）及び静的条件下で培養した裸の膵島（対照、＋Ｃｋ）と比較して高グルコース濃度での刺激に応答して、より高いインスリン分泌及びより速いインスリン放出動態を示した。（平均±ＳＥＭ、ｎは３以上）。図２６Ｂは、刺激指数（ＳＩ）が、（１）４０分の高グルコース相における最初のインスリン採取から３０分の前の低グルコース相の最後のインスリン採取点まで（即時刺激）、及び（２）高グルコース相における最高のインスリン分泌から３０分の前の低グルコース相の最後のインスリン採取点（最大刺激）までの比率として計算されたことを示す。ＳＩは、より高い濃度のグルコースによって刺激され、放出されたインスリンの大きさを示す。サイトカイン曝露（＋Ｃｋ）によって、対流（ＳμＭ、Ｃｏｎｖ）及び拡散（ＳμＭ、Ｄｉｆｆ）下のＳμＭカプセル化膵島及び静的条件（Ｃｏｎｔｒｏｌ）下で培養された裸の膵島を備えるすべての条件が、グルコース誘導インスリン分泌（即時刺激）において様々なレベルの大きさを示した。対流下のＳμＭカプセル化膵島（ＳμＭ、Ｃｏｎｖ）及び静的条件下で培養された裸の膵島（Ｃｏｎｔｒｏｌ）は、高グルコース相における最も高いインスリン分泌が使用された場合（最大刺激）、インスリン分泌の大きさの増加を示した。（平均±ＳＥＭ、３以上、＊ｐ＜０．０５）。図２６Ｃは、停止指数（ＳＤＩ）が、（１）７０分の続く低グルコース相の最初のインスリン採取点から６０分の高グルコース相の最後のインスリン採取点（即時停止）まで、及び（２）その後の低グルコース相における最も低いインスリン分泌から６０分での高グルコース相における最後のインスリン採取点（最大遮断）までの比率であったことを示す。ＳＤＩは、一旦、グルコース濃度が正常に戻ると、インスリン産生の中止の大きさを反映する。サイトカイン曝露（＋Ｃｋ）によって、対流（ＳμＭ、Ｃｏｎｖ）下及び拡散下（ＳμＭ、Ｄｉｆｆ）のＳμＭカプセル化膵島は両方とも、グルコースが低くなった（即時停止及び最大停止）場合、裸の膵島培養物（コントロール）と比較してインスリン低下の最大の大きさを示した。（平均±ＳＥＭ、３以上、＊ｐ＜０．０５）。
図２７Ａ～Ｃは、サイトカイン曝露による拡散下のＳＮＭ及びＳμＭカプセル化膵島のグルコース－インスリン動態を示す。図２７Ａは、サイトカイン（＋Ｃｋ）にさらされる拡散（Ｄｉｆｆ）下の９０分間低－高－低（１．６ｍＭ、１６．６ｍＭ、１．６ｍＭ）グルコース刺激中のＳＮＭ及びＳμＭカプセル化マウス膵島のインスリン放出動態を示す。静的条件下で培養された裸膵島は、対照（Ｃｏｎｔｒｏｌ、＋Ｃｋ）として機能した。サイトカイン曝露（＋Ｃｋ）を有する実験は、ＴＮＦ－α（２，０００Ｕ／ｍＬ）、ＩＦＮ－γ（１，０００Ｕ／ｍＬ）、及びＩＬ－１β（１０，０００Ｕ／ｍＬ）を含有する媒体から成った。サイトカイン曝露（＋Ｃｋ）により、拡散輸送下のＳμＭカプセル化膵島（ＳμＭ、Ｄｉｆｆ）は、４０分から６０分までの高グルコース濃度で最も速いインスリン分泌を示し、続いて拡散下のＳＮＭカプセル化膵島（ＳＮＭ、Ｄｉｆｆ）が続いた。静的条件（Ｃｏｎｔｒｏｌ）下で培養された裸の膵島からのグルコース誘導インスリン分泌レベルは、他の２つの基のように有意ではなかった。（平均±ＳＥＭ、ｎは３以上）。図２７Ｂは、刺激指数（ＳＩ）が、（１）４０分の高グルコース相における最初のインスリン採取から３０分の前の低グルコース相の最後のインスリン採取点まで（即時刺激）、（２）高グルコース相における最高のインスリン分泌から３０分の前の低グルコース相の最後のインスリン採取点（最大刺激）までの比率として計算されたことを示す。ＳＩは、より高い濃度のグルコースによって刺激され、放出されたインスリンの大きさを示す。サイトカイン曝露（＋Ｃｋ）によって、拡散下のＳＮＭ及びＳμＭカプセル化膵島（ＳＮＭ、Ｄｉｆｆ及びＳμＭ、Ｄｉｆｆ）及び静的条件下での裸の膵島培養物（対照）はすべて、高グルコース負荷（即時刺激）で分泌されたインスリンの大きさに有意差を示した。拡散下のＳＮＭカプセル化膵島（ＳＮＭ、Ｄｉｆｆ）及び静的条件下で培養した裸の膵島（Ｃｏｎｔｒｏｌ）は、高グルコース相における最も高いインスリン分泌を使用した場合（最大刺激）、インスリン分泌の大きさの増加を示した。（平均±ＳＥＭ、３以上、＊ｐ＜０．０５）。図２７Ｃは、停止指数（ＳＤＩ）が、（１）７０分の（即時停止）後の低グルコース相の最初のインスリン採取点から６０分の高グルコース相の最後のインスリン採取点、及び（２）その後の低グルコース相における最も低いインスリン分泌から６０分での高グルコース相における最後のインスリン採取点（最大遮断）の比率であったことを示す。ＳＤＩは、一旦、グルコース濃度が正常に戻ると、インスリン産生の中止の大きさを反映する。サイトカイン曝露（＋Ｃｋ）によって、グルコースが低下された場合、拡散下のＳμＭカプセル化膵島（ＳμＭ、Ｄｉｆｆ）は、拡散下のＳＮＭカプセル化膵島（ＳＮＭ、Ｄｉｆｆ）及び裸の膵島培養物（対照）と比較して、最も大きなインスリン減少を呈した（即時停止と最大停止）。（平均±ＳＥＭ、３以上、＊ｐ＜０．０５）。
図２８Ａ～Ｂは、マウス膵島のインビトロ生存率を示す。図２８Ａは、９０分間低－高－低（１．６ｍＭ、１６．６ｍＭ、１．６ｍＭ）グルコース刺激後にマウス膵島の生存率を測定し、拡散下でのＳＮＭ及びＳμＭカプセル化（ＳＮＭ、Ｄ＆ＳμＭ、Ｄ）のための（＋Ｃｋ）あり、またはサイトカイン曝露なしの模擬ループ回路に膵島を供したことを示す。サイトカイン曝露で静的培養物下の裸の膵島培養物（対照、＋Ｃｋ）は、全ての他の条件と比較して著しく低い生存率を示した。（平均±ＳＥＭ、３以上、＊ｐ＜０．０５）。図２８Ｂは、サイトカインを含まない対照静的培養物（Ａ：対照）、サイトカインを用いた静的培養物（Ｂ：対照、＋Ｃｋ）、サイトカインなしのＳＮＭカプセル化マウス膵島（Ｃ：ＳＮＭ、Ｄ）、サイトカインによる拡散下のＳＮＭカプセル化マウス膵島（Ｄ：ＳＮＭ、Ｄ、＋Ｃｋ）、サイトカインなしのＳμＭカプセル化マウス膵島（Ｅ：ＳμＭ、Ｄ）、及びサイトカインによる拡散下のＳμＭカプセル化マウス膵島（Ｆ：ＳμＭ、Ｄ、＋Ｃｋ）のために生存可能な（緑色）細胞及び死んだ（赤色）細胞が染色されたことを示す。サイトカイン曝露（＋Ｃｋで示す）の実験は、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、及びＩＬ－１βを含有する媒体から構成された。サイトカインによる対照静的培養物（Ｂ：対照、＋Ｃｋ）は、全ての他の条件と比較して、有意なレベルの損傷を示した。
図２９は、表に示されるように、インスリン分泌の変化率を示す。インスリン産生の変化率は、グルコース濃度変化として分泌されるインスリンの迅速性を説明するためにグルコースインスリン動態グラフ上に適合された曲線の傾斜に基づいて計算した。サイトカイン曝露を伴わない拡散下のＳμＭカプセル化マウス膵島（ＳμＭ、Ｄｉｆｆ）は、サイトカイン曝露による拡散下のＳμＭカプセル化マウス膵島（ＳμＭ、Ｄｉｆｆ、＋Ｃｋ）と比較して、グルコース誘発刺激におけるインスリン分泌の同様の速度及びわずかに速いインスリン停止を示した。
図３０Ａ～Ｂは、固体ケイ素領域で囲まれた孔含有領域のＳＥＭ画像を示す。図３０Ａは、機械的支持を提供する固体ケイ素領域によって囲まれた長方形の孔含有領域を説明する上面ＳＥＭ画像を示す。図３０Ｂは、個々の１０ｎｍ幅の孔を示す孔領域のさらなる拡大上面ＳＥＭ画像を示す。
実施例３：
拡散系バイオ人工膵島（ＢＡＰ）装置は、不十分な質量移動に起因する不良な膵島生存率及び機能性によって制限され、膵島低酸素症及び遅延されたグルコース速度をもたらす。血管内限外濾過系ＢＡＰ装置は、改良されたグルコースインスリン動態を有するが、これらの装置で使用されるポリマー膜は、不十分な限外濾過流速及び過剰な血栓症をもたらす。ここで、ケイ素ナノ孔膜（ＳＮＭ）は、ＢＡＰ用途で使用するためのポリマー膜と比較してより高い透水率及び優れた孔径選択性を呈する。具体的には、約１０及び約４０ｎｍの孔径の膜を有するＳＮＭ系血管内ＢＡＰは、対流インビトロ下の臨床関連膵島密度（５，７００及び１１，４００ＩＥ／ｃｍ２）で高い膵島生存率（＞６０％）及び機能性（グルコース刺激に対する１５分未満のインスリン応答）を支える。ブタモデルで約１０ｎｍの孔径のＳＮＭを用いたインビボ研究は、臨床的に関連する膵島密度（５，７００ＩＥ／ｃｍ２）での高い膵島生存率（＞８５％）、流出限外濾過液中の１４４ｐＭのｃ－ペプチド濃度、及び対流下の血液適合性を示した。
拡散系バイオ人工膵島（ＢＡＰ）装置は、不十分な質量移動に起因する不良な膵島生存率及び機能性によって制限され、膵島低酸素症及び遅延されたグルコース速度をもたらす。血管内限外濾過系ＢＡＰ装置は、改良されたグルコースインスリン動態を有するが、これらの装置で使用されるポリマー膜は、不十分な限外濾過流速及び過剰な血栓症をもたらす。ここで、ケイ素ナノ孔膜（ＳＮＭ）は、ＢＡＰ用途で使用するためのポリマー膜と比較してより高い透水率及び優れた孔径選択性を呈する。具体的には、約１０及び約４０ｎｍの孔径の膜を有するＳＮＭ系血管内ＢＡＰは、対流インビトロ下の臨床関連膵島密度（５，７００及び１１，４００ＩＥ／ｃｍ２）で高い膵島生存率（＞６０％）及び機能性（グルコース刺激に対する１５分未満のインスリン応答）を支える。ブタモデルで約１０ｎｍの孔径のＳＮＭを用いたインビボ研究は、臨床的に関連する膵島密度（５，７００ＩＥ／ｃｍ２）での高い膵島生存率（＞８５％）、流出限外濾過液中の１４４ｐＭのｃ－ペプチド濃度、及び対流下の血液適合性を示した。
材料及び方法
ケイ素ナノ孔膜（ＳＮＭ）のアーキテクチャ及び製作
ケイ素ナノ孔膜（ＳＮＭ）は、以前に報告されたように２６、ＭＥＭＳ技術によってケイ素基質から試作された。簡潔に言うと、プロセスは、４００μｍの厚さの二重側面研磨（ＤＳＰ）ケイ素ウエハ上に薄いＳｉＯ２（酸化物）の成長を使用し、ポリシリコン（約５００ｎｍ）の低圧化学蒸着（ＬＰＣＶＤ）が続く。次いで、ウエハは、第２のポリシリコン層で具体的にパターン化され、乾燥酸化され、ウェットエッチングされ、最後に、ポリシリコンが４００ｎｍ残存し、その下にある垂直酸化物層が曝露するまでブランケットエッチングされる。垂直犠牲酸化物層は、膜の臨界ナノスケール孔径を定義した。低温酸化物（ＬＴＯ）（約１μｍ）を、膜保護のための硬質マスクとして機能するために、ウエハのポリシリコン上に堆積した。深度反応イオンエッチング（ＤＲＩＥ）は、膜が開示されるまで各ウィンドウの背面を除去した。最終的に、犠牲酸化物は、製作プロセスの最終工程中に４９％のフッ化水素酸（ＨＦ）中でエッチングされて、開口ナノスケールスリット孔を残す。その後、ウエハを１５００ウィンドウでそれぞれ含有する１×１ｃｍチップに有効領域６×６ｍｍ２で切断し、膜当たり合計１０６孔を備える。各長方形の孔は、３００ｎｍの深さ及び２μｍの長さであった。約１０ｎｍ及び約４０ｎｍの平均孔径を備えるＳＮＭをこの研究に使用した。全ての膜を、従来の「ピラニア」洗浄手順を使用して洗浄し、３：１の硫酸（Ｈ２ＳＯ４）／過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）混合物に２０分間浸漬した後、脱イオン（ＤＩ）水中で十分にすすいだ。走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）（Ｌｅｏ１５５０）を使用してＳＮＭの画像を得た（図１Ａ、３０Ａ、及び３０Ｂ）。
ケイ素ナノ孔膜（ＳＮＭ）のアーキテクチャ及び製作
ケイ素ナノ孔膜（ＳＮＭ）は、以前に報告されたように２６、ＭＥＭＳ技術によってケイ素基質から試作された。簡潔に言うと、プロセスは、４００μｍの厚さの二重側面研磨（ＤＳＰ）ケイ素ウエハ上に薄いＳｉＯ２（酸化物）の成長を使用し、ポリシリコン（約５００ｎｍ）の低圧化学蒸着（ＬＰＣＶＤ）が続く。次いで、ウエハは、第２のポリシリコン層で具体的にパターン化され、乾燥酸化され、ウェットエッチングされ、最後に、ポリシリコンが４００ｎｍ残存し、その下にある垂直酸化物層が曝露するまでブランケットエッチングされる。垂直犠牲酸化物層は、膜の臨界ナノスケール孔径を定義した。低温酸化物（ＬＴＯ）（約１μｍ）を、膜保護のための硬質マスクとして機能するために、ウエハのポリシリコン上に堆積した。深度反応イオンエッチング（ＤＲＩＥ）は、膜が開示されるまで各ウィンドウの背面を除去した。最終的に、犠牲酸化物は、製作プロセスの最終工程中に４９％のフッ化水素酸（ＨＦ）中でエッチングされて、開口ナノスケールスリット孔を残す。その後、ウエハを１５００ウィンドウでそれぞれ含有する１×１ｃｍチップに有効領域６×６ｍｍ２で切断し、膜当たり合計１０６孔を備える。各長方形の孔は、３００ｎｍの深さ及び２μｍの長さであった。約１０ｎｍ及び約４０ｎｍの平均孔径を備えるＳＮＭをこの研究に使用した。全ての膜を、従来の「ピラニア」洗浄手順を使用して洗浄し、３：１の硫酸（Ｈ２ＳＯ４）／過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）混合物に２０分間浸漬した後、脱イオン（ＤＩ）水中で十分にすすいだ。走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）（Ｌｅｏ１５５０）を使用してＳＮＭの画像を得た（図１Ａ、３０Ａ、及び３０Ｂ）。
ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）によるＳＮＭの表面変性
ＳＮＭは、以前に報告されたプロトコルを使用してＰＥＧで共有的に変性し、膜表面２６上のタンパク質汚染を防止した。ＰＥＧ付与に使用される技法は、ケイ素表面シラノール基（Ｓｉ－ＯＨ）をＳｉ－Ｏ－Ｓｉ－ＰＥＧ配列を形成する三重メトキシシラン基を介してＰＥＧポリマーの鎖に共有結合させる単一の反応工程を伴う。簡潔に言うと、ＳＮＭを３ｍＭ２－［メトキシ（ポリエチレンオキシ）プロピル］トリメトキシシラン（ＰＥＧ－シラン）（Ｇｅｌｅｓｔ：ＳＩＭ６４９２．７）トルエンで２時間にわたって７０℃で浸した。トルエン、エタノール、及びＤＩ水を備える一連の広範な洗浄工程を使用して、未結合のＰＥＧ残基を除去した。
ＳＮＭは、以前に報告されたプロトコルを使用してＰＥＧで共有的に変性し、膜表面２６上のタンパク質汚染を防止した。ＰＥＧ付与に使用される技法は、ケイ素表面シラノール基（Ｓｉ－ＯＨ）をＳｉ－Ｏ－Ｓｉ－ＰＥＧ配列を形成する三重メトキシシラン基を介してＰＥＧポリマーの鎖に共有結合させる単一の反応工程を伴う。簡潔に言うと、ＳＮＭを３ｍＭ２－［メトキシ（ポリエチレンオキシ）プロピル］トリメトキシシラン（ＰＥＧ－シラン）（Ｇｅｌｅｓｔ：ＳＩＭ６４９２．７）トルエンで２時間にわたって７０℃で浸した。トルエン、エタノール、及びＤＩ水を備える一連の広範な洗浄工程を使用して、未結合のＰＥＧ残基を除去した。
ＳＮＭ孔径特性の透水率
自動化された質量及び圧力測定システムが、接線流濾過操作下で、ＳＮＭを介して液体流量を特徴付けるために利用された。ＳＮＭの孔径は、
（式１）を使用した濾過フローパラメータに関連付けることができ、式中、ｈは孔幅であり、μは粘度ｌであり、ｌは膜厚であり、Ｑは容積流量であり、ｎは膜当たりの孔数であり、ΔＰは膜貫通圧力である。ＳＮＭ孔径の特徴付け用にシステム全体を組み立てるために、空気をシリンジポンプＺ６７５７０９）を通って貯水槽へ加える。水を蠕動ポンプ（マスターフレックス：０７５５１－００）により差圧トランスデューサ（Ｏｍｅｇａ：ＰＸ４２９ ０１５ＧＩ）を通って、カプセル化膜を有するフローセルによって循環され、元の貯水槽に戻される。フローセルを水下で水没したＳＮＭで組み立てて、全ての区画から気泡を除去した。具体的には、膜の上部に位置付けられたカスタマイズされたケイ素ガスケットと対向するポリシリコンインターフェースを用いて膜が配置され、ガスケットの頂部に濾液チャンバの最終配置が続く。ガスケットが視覚的に圧縮されるまで、全てのセクションを一緒に固定し、手で締め付けられた六角ボルトに固定した。限外濾過液は膜を透過し、精度質量バランスで再停止する液体収集容器に送られた。（Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ；ＸＳ２０５）。差圧トランスデューサ及び質量バランスからの測定値は、データ取得用ノートパソコンで自動的に収集された。典型的な膜透水率試験は、５ｍｌ／分の流量及び４圧力サイクル（５、１、５、及び１ｐｓｉ）から成り、それぞれ１５０秒の期間かかった。個々のウエハ設計に基づいて提供される孔長、膜厚、及び孔の総数の仕様を用いて、式１を使用してＳＮＭの平均孔径を計算した。この研究における全てのＳＮＭ膜は、ＰＥＧで表面変性され、約１０ｎｍ及び約４０ｎｍの平均孔径を呈した。
自動化された質量及び圧力測定システムが、接線流濾過操作下で、ＳＮＭを介して液体流量を特徴付けるために利用された。ＳＮＭの孔径は、
膵島チャンバの開発（ＩＣ）
この研究において、ＩＣは、１０００μｍの厚さを保有し、１０％（５，７００ＩＥ／ｃｍ２）及び２０％（１１，４００ＩＥ／ｃｍ２）の高膵島密度を有していた。百分率による膵島密度は、膵島等価物で表された総膵島容積とＩＣ容積との比として計算した。表面積による膵島密度は、膵島等価物の総数（ＩＥ）を装置膜表面積によって除算することによって計算された。生体適合性アクリルシート（ＭｃＭａｓｔｅｒ：８５８９Ｋ１１）を最初にレーザー切断して、約２．４ｍｍ×約２．４ｍｍ×約１ｍｍの厚さの空隙領域を作成し、８つの直径１００μｍのポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）被覆ワイヤで挿入された（ＭｃＭａｓｔｅｒ：１７４９Ｔ１１）。次いで、２％アガロース－膵島混合物を、アクリルシートのこの空隙領域に注いだ。アガロース－膵島混合物が治癒され、全てのワイヤを除去した（図２０Ｄ）。このプロセスを使用して、中央の１００μｍ円筒形チャネル（塗りつぶしの赤い丸）を有する８つの８００μｍ円筒形アガロース－膵島領域（点線の赤丸）の六角形配列がＩＣについて得られた（図３１）。この構成は、膵島と限外濾過との間の拡散距離≦４００μｍを作った。ＩＣ構成後、図２１～２２Ａに記載されるように、ｉＢＡＰで組み立てられ、様々なｉＢＡＰ構成成分間のガスケットを有する。
この研究において、ＩＣは、１０００μｍの厚さを保有し、１０％（５，７００ＩＥ／ｃｍ２）及び２０％（１１，４００ＩＥ／ｃｍ２）の高膵島密度を有していた。百分率による膵島密度は、膵島等価物で表された総膵島容積とＩＣ容積との比として計算した。表面積による膵島密度は、膵島等価物の総数（ＩＥ）を装置膜表面積によって除算することによって計算された。生体適合性アクリルシート（ＭｃＭａｓｔｅｒ：８５８９Ｋ１１）を最初にレーザー切断して、約２．４ｍｍ×約２．４ｍｍ×約１ｍｍの厚さの空隙領域を作成し、８つの直径１００μｍのポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）被覆ワイヤで挿入された（ＭｃＭａｓｔｅｒ：１７４９Ｔ１１）。次いで、２％アガロース－膵島混合物を、アクリルシートのこの空隙領域に注いだ。アガロース－膵島混合物が治癒され、全てのワイヤを除去した（図２０Ｄ）。このプロセスを使用して、中央の１００μｍ円筒形チャネル（塗りつぶしの赤い丸）を有する８つの８００μｍ円筒形アガロース－膵島領域（点線の赤丸）の六角形配列がＩＣについて得られた（図３１）。この構成は、膵島と限外濾過との間の拡散距離≦４００μｍを作った。ＩＣ構成後、図２１～２２Ａに記載されるように、ｉＢＡＰで組み立てられ、様々なｉＢＡＰ構成成分間のガスケットを有する。
膵島カプセル化用の血管内バイオ人工膵島装置（ｉＢＡＰ）のアセンブリ
血管内バイオ人工膵島装置（ｉＢＡＰ）は、図２１－２２Ａの分解図で示されていて、血流路を備えるポリカーボネート流路構成要素、アガロース（Ｓｉｇｍａ：Ａ２５７６）を接種したマウス膵島を備える膵島チャンバ（ＩＣ）を挟む２つのＳＮＭ、ポリカーボネート裏面（ＰＣ裏面）、及び限外濾過ポート（限外濾過液出口）である。平行な血液流路は、ＳｏｌｉｄＷｏｒｋｓ及び計算流体力学（ＣＦＤ）でモデル化され理想的な流れ特性を創出し、血栓症を最小化する。ｉＢＡＰは両側で対称であり、各側面の１つのＩＣで組み立てられ得る。ｉＢＡＰは、ＳＮＭ領域の最大０．７２ｃｍ２まで有し得る。動作中、流体は、血流路と限外濾過液出口との間に約８０ｍｍＨｇの膜貫通圧（ＴＭＰ）を生じる上昇した圧力で流路構成要素を通って流れ、ＳＮＭ、ＩＣ、ＰＣ裏面及び限外濾過出口を流れる限外濾過液をもたらし、インビトロで管内に収集されたか、またはインビボで間質組織空間に排出された。拡散条件下で、ＰＣ裏面をキャップオフにしたものであって、システムを通じた限外濾過液の流れはない。インビトロ及びインビボの両方の実験のために、すべての装置構成要素をオートクレーブまたはＮｏｌｖａｓａｎのいずれかによって個々に滅菌された。
血管内バイオ人工膵島装置（ｉＢＡＰ）は、図２１－２２Ａの分解図で示されていて、血流路を備えるポリカーボネート流路構成要素、アガロース（Ｓｉｇｍａ：Ａ２５７６）を接種したマウス膵島を備える膵島チャンバ（ＩＣ）を挟む２つのＳＮＭ、ポリカーボネート裏面（ＰＣ裏面）、及び限外濾過ポート（限外濾過液出口）である。平行な血液流路は、ＳｏｌｉｄＷｏｒｋｓ及び計算流体力学（ＣＦＤ）でモデル化され理想的な流れ特性を創出し、血栓症を最小化する。ｉＢＡＰは両側で対称であり、各側面の１つのＩＣで組み立てられ得る。ｉＢＡＰは、ＳＮＭ領域の最大０．７２ｃｍ２まで有し得る。動作中、流体は、血流路と限外濾過液出口との間に約８０ｍｍＨｇの膜貫通圧（ＴＭＰ）を生じる上昇した圧力で流路構成要素を通って流れ、ＳＮＭ、ＩＣ、ＰＣ裏面及び限外濾過出口を流れる限外濾過液をもたらし、インビトロで管内に収集されたか、またはインビボで間質組織空間に排出された。拡散条件下で、ＰＣ裏面をキャップオフにしたものであって、システムを通じた限外濾過液の流れはない。インビトロ及びインビボの両方の実験のために、すべての装置構成要素をオートクレーブまたはＮｏｌｖａｓａｎのいずれかによって個々に滅菌された。
血管内バイオ人工膵島装置（ｉＢＡＰ）インビトロの試験
マウス膵島の単離を伴う全ての手順は、カリフォルニア大学サンフランシスコ校（ＵＣＳＦ）の施設内動物管理及び使用委員会（ＩＡＣＵＣ）によって承認されたプロトコルに従って行われた。マウス膵島を以前に記載されたプロトコルに基づいて、８～１０週齢の雄のＢ６マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から単離した。回収された膵島を、Ｌ－グルタミン及び１１．１ｍＭのグルコース（Ｇｉｂｃｏ：１１８７５－０９３）、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ：１６０００）、及び１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）（ＵＣＳＦ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ：ＣＣＦＧＫ００３）を含むＰＲＭＩ１６４０での懸濁培養に維持した。適切な量のマウス膵島と混合された２％アガロースゲルを、以前に説明されたＩＣに分配して、それぞれ容積により１０％または２０％の高膵島密度を生成した。約１０ｎｍ及び約４０ｎｍの孔径を有するＳＮＭを選択し、１０％及び２０％の膵島密度を備えるＩＣをカプセル化した。インビトロ生存率試験については、模擬ループ回路を、約８０ｍｍＨｇのＴＭＰにおいて、ｉＢＡＰを介して培養培地を流出する蠕動ポンプで設定して、対流状態のための限外濾過液を生成し（図２２ａ）、一方、限外濾過液は拡散状態のために生成されなかった。生存率実験は、１０％か２０％の両方をカプセル化する約１０ｎｍと約４０ｎｍのＳＮＭカプセル化の両方を研究した。培養の３日後、装置を分解し、膵島を生存率について評価した。この同じ模擬ループ回路を使用して、グルコース－インスリン動態を、１０％または２０％の膵島密度及び約１０ｎｍまたは約４０ｎｍの孔径のＳＮＭのいずれかを含有するｉＢＡＰにおいて調査した。ｉＢＡＰにおけるＳＮＭカプセル化マウス膵島を、低、高、及び低グルコース（Ｇｉｂｃｏ：１１８７９号）負荷に０日曝露した。対流下でＩＣから直接生成された限外濾過液をインスリン測定のために収集した。インスリン含有量を、マウスインスリン酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）キットを用いて（Ｍｅｒｃｏｄｉａ：１０～１２４７－０１）説明された希釈で分析した。
マウス膵島の単離を伴う全ての手順は、カリフォルニア大学サンフランシスコ校（ＵＣＳＦ）の施設内動物管理及び使用委員会（ＩＡＣＵＣ）によって承認されたプロトコルに従って行われた。マウス膵島を以前に記載されたプロトコルに基づいて、８～１０週齢の雄のＢ６マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から単離した。回収された膵島を、Ｌ－グルタミン及び１１．１ｍＭのグルコース（Ｇｉｂｃｏ：１１８７５－０９３）、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ：１６０００）、及び１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）（ＵＣＳＦ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ：ＣＣＦＧＫ００３）を含むＰＲＭＩ１６４０での懸濁培養に維持した。適切な量のマウス膵島と混合された２％アガロースゲルを、以前に説明されたＩＣに分配して、それぞれ容積により１０％または２０％の高膵島密度を生成した。約１０ｎｍ及び約４０ｎｍの孔径を有するＳＮＭを選択し、１０％及び２０％の膵島密度を備えるＩＣをカプセル化した。インビトロ生存率試験については、模擬ループ回路を、約８０ｍｍＨｇのＴＭＰにおいて、ｉＢＡＰを介して培養培地を流出する蠕動ポンプで設定して、対流状態のための限外濾過液を生成し（図２２ａ）、一方、限外濾過液は拡散状態のために生成されなかった。生存率実験は、１０％か２０％の両方をカプセル化する約１０ｎｍと約４０ｎｍのＳＮＭカプセル化の両方を研究した。培養の３日後、装置を分解し、膵島を生存率について評価した。この同じ模擬ループ回路を使用して、グルコース－インスリン動態を、１０％または２０％の膵島密度及び約１０ｎｍまたは約４０ｎｍの孔径のＳＮＭのいずれかを含有するｉＢＡＰにおいて調査した。ｉＢＡＰにおけるＳＮＭカプセル化マウス膵島を、低、高、及び低グルコース（Ｇｉｂｃｏ：１１８７９号）負荷に０日曝露した。対流下でＩＣから直接生成された限外濾過液をインスリン測定のために収集した。インスリン含有量を、マウスインスリン酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）キットを用いて（Ｍｅｒｃｏｄｉａ：１０～１２４７－０１）説明された希釈で分析した。
ブタにおける血管内バイオ人工膵島装置（ｉＢＡＰ）の移植
予備的な概念研究は、比較可能なサイズの血管系及びヒトによる血液的類似性のため、ブタモデルで設計された。研究は、ＰＭＩ前臨床ＣＲＯ、Ｓａｎ Ｃａｒｌｏｓ、ＣＡにおいてＩＡＣＵＣ審査委員会によって承認された。
予備的な概念研究は、比較可能なサイズの血管系及びヒトによる血液的類似性のため、ブタモデルで設計された。研究は、ＰＭＩ前臨床ＣＲＯ、Ｓａｎ Ｃａｒｌｏｓ、ＣＡにおいてＩＡＣＵＣ審査委員会によって承認された。
ブタ＃１について、アガロースゲルに懸濁したマウスイメージの容積によって５％膵島等価物（ＩＥ）密度を含有する各チャンバで前述したように、装置を組み立てた。経口吸引（８１ｍｇ）及びクロピドレル（７５ｍｇ）を、７５ｋｇの雌のＹｏｒｋｓｈｉｒｅブタに３日間、次いでその後毎日与えた。一般麻酔が誘導された後、左の外側頸部静脈を曝露させるために中央の左側に垂直切開を行った。１５Ｆｒ二重管腔トンネル化カテーテル（次工程（登録商標）、Ｔｅｌｅｆｌｅｘ、Ｍｏｒｒｉｓｖｉｌｌｅ、ＮＣ）を、血液サンプリングのために左外側頸部静脈内に配置した。その後、首の右側の同様の垂直切開を介して右側頚動脈及び右外頸部静脈を曝露した。血管が曝露したら、最終的な装置配置のために皮下ポケットを尾側に作成した。ヘパリンは、２００秒を超える活性化凝固時間（ＡＣＴ）を標的とした手術中に与えられた。次いで、６ｍｍの外部支持ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）移植片を流入のために内頸動脈に吻合させ、流出のために外頸静脈に吻合した。次いで、装置を皮下ポケットに配置し、周囲の軟質組織に固定した。次いで、流入及び流出移植片を装置に接続し、クランプを取り外して、装置を通る血流を可能にし、視覚的に確認した（図３４Ａ～Ｄ）。次いで、重複した軟質組織及び皮膚を層で閉鎖し、次いで動物を抜管し、回復させた。メロキシカム及びブプレノルフィンは、術後疼痛のために必要に応じて投与された。
ブタ＃２について、各チャンバについて１０％密度で前述したように装置を組み立てた。１つのチャンバは、大気にオープンした膵島と通信するチャネルを有し、チャンバを通る限外濾過液の流れを可能にする（図２２Ａ）。その後、限外濾過液をチャネルに通し、周囲の組織及び皮下ポケットに自由に堆積させた（図３５Ａ）。その他チャンバ限外濾過出口をキャップして、拡散チャンバをもたらした。インプラント手順の技術的態様は、ブタ＃１と同一であった。装置を通る血流及び周囲の組織への限外濾過液の堆積は、切開の閉鎖の前に視覚的に確認された。
膵島機能インビボの評価
膵島機能は、トンネル型静脈カテーテルを介してグルコース（４０％溶液中０．５ｇ／ｋｇ）の投与を伴う標準静脈内グルコース耐性試験（ＩＶＧＴＴ）を用いて評価した。血液を引き込み、標準的なグルコメーターを用いて血清グルコースを（Ａｃｃｕ－Ｃｈｅｋ Ｃｏｍｐａｃｔ Ｐｌｕｓ：１００２－５０２１）０、５、１０、１５、３０、６０及び９０分測定した。ＩＶＧＴＴは、動物が朝の食事を摂食する前に、術後（ＰＯＤ）１及び２に投与された。ＰＯＤ ３では、装置の計画外植片及び膵島抽出の前に、術中に試験を行った。ブタ＃１については、術中ＩＶＧＴＴの採血は、吻合部のすぐ遠位の外部頸静脈流出路の直接カニューレ挿入によって行われた。系統的循環からの試料及び限外濾過ポートから直接採取した全ての試料を、マウスインスリン酵素結合免疫吸着アッセイを試験する前に氷上に（ＥＬＩＳＡ（Ｍｅｒｃｏｄｉａ：１０－１２４７－０１）及びｃ－ペプチドＥＬＩＳＡキット（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ：ＥＺＲＭＣＰ２－２１Ｋ）。
膵島機能は、トンネル型静脈カテーテルを介してグルコース（４０％溶液中０．５ｇ／ｋｇ）の投与を伴う標準静脈内グルコース耐性試験（ＩＶＧＴＴ）を用いて評価した。血液を引き込み、標準的なグルコメーターを用いて血清グルコースを（Ａｃｃｕ－Ｃｈｅｋ Ｃｏｍｐａｃｔ Ｐｌｕｓ：１００２－５０２１）０、５、１０、１５、３０、６０及び９０分測定した。ＩＶＧＴＴは、動物が朝の食事を摂食する前に、術後（ＰＯＤ）１及び２に投与された。ＰＯＤ ３では、装置の計画外植片及び膵島抽出の前に、術中に試験を行った。ブタ＃１については、術中ＩＶＧＴＴの採血は、吻合部のすぐ遠位の外部頸静脈流出路の直接カニューレ挿入によって行われた。系統的循環からの試料及び限外濾過ポートから直接採取した全ての試料を、マウスインスリン酵素結合免疫吸着アッセイを試験する前に氷上に（ＥＬＩＳＡ（Ｍｅｒｃｏｄｉａ：１０－１２４７－０１）及びｃ－ペプチドＥＬＩＳＡキット（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ：ＥＺＲＭＣＰ２－２１Ｋ）。
膵島検索による開存性評価と装置外植
ＰＯＤ ３では、両方の動物を開存率及び装置回収の評価のために手術室に戻した。動物を挿管し鎮静させた後、切開を再開し、目視評価及び維持された開存率の確認のために、装置を表在性組織に送達した。最終ＩＶＧＴＴを投与した。上記のように、ブタ＃１では、吻合の遠位の頸静脈の直接カニューレ挿入を介して流出静脈から血液を直接採取した。ブタ＃２について、血液をトンネルカテーテルからサンプリングした。一旦ＩＶＧＴＴが完了した後、カルチドは、５Ｆｒカテーテルを有する吻合の近位にカニューレ化された。次いで、放射線不透過性造影剤を、装置を通る流れを透視的に確認するために（Ｖｉｓｉｐａｑｕｅ（商標）、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）注入した（図３４Ａ及び３５Ａ）。その後、流入口及び流出口移植片をクランプし、装置を次いで外植し、その後、チャンバからの分解及び回収の前に培養培地で洗浄した。
ＰＯＤ ３では、両方の動物を開存率及び装置回収の評価のために手術室に戻した。動物を挿管し鎮静させた後、切開を再開し、目視評価及び維持された開存率の確認のために、装置を表在性組織に送達した。最終ＩＶＧＴＴを投与した。上記のように、ブタ＃１では、吻合の遠位の頸静脈の直接カニューレ挿入を介して流出静脈から血液を直接採取した。ブタ＃２について、血液をトンネルカテーテルからサンプリングした。一旦ＩＶＧＴＴが完了した後、カルチドは、５Ｆｒカテーテルを有する吻合の近位にカニューレ化された。次いで、放射線不透過性造影剤を、装置を通る流れを透視的に確認するために（Ｖｉｓｉｐａｑｕｅ（商標）、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）注入した（図３４Ａ及び３５Ａ）。その後、流入口及び流出口移植片をクランプし、装置を次いで外植し、その後、チャンバからの分解及び回収の前に培養培地で洗浄した。
膵島生存率
膵島生存率を、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｋｉｔ（４８８／５７０）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｒ３７６０１）で二重染色によって評価された。生細胞は、生細胞内によく保持されている強い蛍光カルセイン（緑色）の存在によって区別されるが、死細胞は赤で染色される。簡潔に言うと、アガロースカプセル化マウス膵島を生存（緑色）及び死（赤色）キット構成成分の混合物で１５分間インキュベートし、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で広範に洗浄し、過剰染色を除去した。マウス膵島の画像を、レーザー走査ＮｉｋｏｎスペクトルＣ１ｓｉ共焦点顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して取得した。生存率の割合を、その膵島全体にわたる非死亡または緑色領域の比に基づいて計算した。
膵島生存率を、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｋｉｔ（４８８／５７０）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｒ３７６０１）で二重染色によって評価された。生細胞は、生細胞内によく保持されている強い蛍光カルセイン（緑色）の存在によって区別されるが、死細胞は赤で染色される。簡潔に言うと、アガロースカプセル化マウス膵島を生存（緑色）及び死（赤色）キット構成成分の混合物で１５分間インキュベートし、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で広範に洗浄し、過剰染色を除去した。マウス膵島の画像を、レーザー走査ＮｉｋｏｎスペクトルＣ１ｓｉ共焦点顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して取得した。生存率の割合を、その膵島全体にわたる非死亡または緑色領域の比に基づいて計算した。
外植された膜分析
観察に関して、ＳＮＭは３％のグルタルアルデヒド（Ｓｉｇｍａ：Ｇ７６５１）、１Ｍカドウ酸ナトリウム（ポリサイエンス）及び０．１Ｍのスクロース（Ｓｉｇｍａ）を含有する溶液中に固定した。２日後、基質を蒸留水で洗浄した。脱水は、これらの骨格をエタノールの増加濃度（５０～１００％）に置くことによって達成された。次いで、乾燥試料をアルミニウムスタブ上に載置し、金－パラジウムでスパッタコーティングし、走査電子顕微鏡法（ＳＥＭ）で検査した（Ｕｌｔｒａ５５、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）（Ｕｌｔｒａ５５、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）。
観察に関して、ＳＮＭは３％のグルタルアルデヒド（Ｓｉｇｍａ：Ｇ７６５１）、１Ｍカドウ酸ナトリウム（ポリサイエンス）及び０．１Ｍのスクロース（Ｓｉｇｍａ）を含有する溶液中に固定した。２日後、基質を蒸留水で洗浄した。脱水は、これらの骨格をエタノールの増加濃度（５０～１００％）に置くことによって達成された。次いで、乾燥試料をアルミニウムスタブ上に載置し、金－パラジウムでスパッタコーティングし、走査電子顕微鏡法（ＳＥＭ）で検査した（Ｕｌｔｒａ５５、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）（Ｕｌｔｒａ５５、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）。
血小板の接着及び活性化
ＳＮＭを４％パラホルムアルデヒドで固定し、続いてＰＢＳ洗浄し、ブロッキング溶液（ＰＢＳ、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））中で３０分間インキュベートした。次いで試料を１：３００の希釈率で４時間、血小板接着（緑色）ＣＤ４１抗体（Ｂｉｏｒｂｙｔ：ｏｒｂ１８１７９３）及び血小板活性化（赤色）のためのＣＤ６２ｐ抗体（Ｂｉｏｓｓ：ｂｓ－０５６１Ｒ－Ｃｙ３）でインキュベートし、ＰＢＳで繰り返し洗浄し、残留物を除去した。画像は、６Ｄハイスループットパーフェクトフォーカスシステム（Ｎｉｋｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて得た。
ＳＮＭを４％パラホルムアルデヒドで固定し、続いてＰＢＳ洗浄し、ブロッキング溶液（ＰＢＳ、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））中で３０分間インキュベートした。次いで試料を１：３００の希釈率で４時間、血小板接着（緑色）ＣＤ４１抗体（Ｂｉｏｒｂｙｔ：ｏｒｂ１８１７９３）及び血小板活性化（赤色）のためのＣＤ６２ｐ抗体（Ｂｉｏｓｓ：ｂｓ－０５６１Ｒ－Ｃｙ３）でインキュベートし、ＰＢＳで繰り返し洗浄し、残留物を除去した。画像は、６Ｄハイスループットパーフェクトフォーカスシステム（Ｎｉｋｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて得た。
統計分析
試料対はスチューデントのｔ検定を用いて分析した。複数の試料を、１方向または２方向分散分析で（ＡＮＯＶＡ）、続いてＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用してＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ及び複数の比較を用いて、評価した。Ａのｐ値＜０．０５は、すべての分析において統計的に有意であると認められた。
試料対はスチューデントのｔ検定を用いて分析した。複数の試料を、１方向または２方向分散分析で（ＡＮＯＶＡ）、続いてＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用してＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ及び複数の比較を用いて、評価した。Ａのｐ値＜０．０５は、すべての分析において統計的に有意であると認められた。
結果
ｉＢＡＰ試験インビトロ
１０％（５，７００ＩＥ／ｃｍ２）または２０％（１１，４００ＩＥ／ｃｍ２）マウス膵島密度でサイズ決定された約１０ｎｍのの孔径のＳＮＭを備えるｉＢＡＰは、３日後のグルコース刺激インスリン応答及びカプセル化膵島の生存率を調査した。対流下で、１０％マウス膵島密度及び約１０ｎｍ孔径のＳＮＭを有するｉＢＡＰは、高グルコース曝露の１０分以内にインスリン分泌の増加を示し（図３２Ａ（ｉ））、これは、二相性インスリン放出の正常膵島機能と一致し（すなわち、第１のインスリン相は５～１０分以内に現れ、その後、第２の持続相は時間が長くなるにつれてよりゆっくり遅延する）。更に、グルコース濃度が減少する６３～７８分の期間中、対応する刺激インスリン分泌も低下する。しかし、対流下で約１０ｎｍの孔径のＳＮＭを有するｉＢＡＰにおいて細胞密度が１０％から２０％に増加した場合、高グルコース曝露の最初の数分間では、グルコース刺激インスリンレベルの有意な変化は観察されなかった（図３２Ａ（ｉｉ））。刺激指数（ＳＩ）、インスリン含有量によって正規化された基底インスリン分泌の比が、１０％及び２０％のマウス膵島密度で約１０ｎｍの孔径のＳＮＭのｉＢＡＰの４．４±０．６及び１．１±０．１として計算された。グルコース（＞１５分）に応答したインスリン分泌の遅延は、早期の血管中空繊維系において遭遇した共通の問題であることが十分に認識されている。対流下で約１０ｎｍの孔径を有するｉＢＡＰは、グルコース刺激インスリン応答の有意な遅延を伴わずに、１０％膵島密度で正常なインスリン機能を支持した。しかし、約１０ｎｍの孔径のＳＮＭでの対流下の２０％膵島密度でのグルコース刺激－インスリン応答は、異常なインスリン機能挙動を示し、包まれた細胞がその環境において最適な健康状態にない可能性が高いことを示した。
ｉＢＡＰ試験インビトロ
１０％（５，７００ＩＥ／ｃｍ２）または２０％（１１，４００ＩＥ／ｃｍ２）マウス膵島密度でサイズ決定された約１０ｎｍのの孔径のＳＮＭを備えるｉＢＡＰは、３日後のグルコース刺激インスリン応答及びカプセル化膵島の生存率を調査した。対流下で、１０％マウス膵島密度及び約１０ｎｍ孔径のＳＮＭを有するｉＢＡＰは、高グルコース曝露の１０分以内にインスリン分泌の増加を示し（図３２Ａ（ｉ））、これは、二相性インスリン放出の正常膵島機能と一致し（すなわち、第１のインスリン相は５～１０分以内に現れ、その後、第２の持続相は時間が長くなるにつれてよりゆっくり遅延する）。更に、グルコース濃度が減少する６３～７８分の期間中、対応する刺激インスリン分泌も低下する。しかし、対流下で約１０ｎｍの孔径のＳＮＭを有するｉＢＡＰにおいて細胞密度が１０％から２０％に増加した場合、高グルコース曝露の最初の数分間では、グルコース刺激インスリンレベルの有意な変化は観察されなかった（図３２Ａ（ｉｉ））。刺激指数（ＳＩ）、インスリン含有量によって正規化された基底インスリン分泌の比が、１０％及び２０％のマウス膵島密度で約１０ｎｍの孔径のＳＮＭのｉＢＡＰの４．４±０．６及び１．１±０．１として計算された。グルコース（＞１５分）に応答したインスリン分泌の遅延は、早期の血管中空繊維系において遭遇した共通の問題であることが十分に認識されている。対流下で約１０ｎｍの孔径を有するｉＢＡＰは、グルコース刺激インスリン応答の有意な遅延を伴わずに、１０％膵島密度で正常なインスリン機能を支持した。しかし、約１０ｎｍの孔径のＳＮＭでの対流下の２０％膵島密度でのグルコース刺激－インスリン応答は、異常なインスリン機能挙動を示し、包まれた細胞がその環境において最適な健康状態にない可能性が高いことを示した。
約１０ｎｍの孔径のＳＮＭのｉＢＡＰにおける生存率の研究は、対流下の１０％マウス膵島密度（４０±１１％）が拡散下（４．０±１．３％）と比較して高い生存率を示したことを示した（図３２Ｂ～Ｃ）。更に、膵島密度が膵島チャンバ内の２０％に増加すると、生存率は、拡散（１１±５．８％）及び対流（１７±１１％）で著しく減少した（図３２Ｂ～Ｃ）。要約すると、対流下の約１０ｎｍの孔径のＳＮＭは、１０％（ただし２０％ではなく）マウス膵島密度の生存率及びグルコース－インスリン応答を支持するのに十分である。
孔径がより高い密度で細胞死を引き起こす限定因子であるかどうかを検証するために、１０％または２０％のマウス膵島密度で約４０ｎｍの孔径のＳＮＭが、拡散及び対流下でｉＢＡＰにおいて研究された。グルコース刺激インスリン研究は、両方の１０％（図３３Ａ（ｉ））及び２０％（図３３Ａ（ｉｉ））の特性インスリン二相放出曲線を実証したことを示した。約４０ｎｍの孔径のＳＮＭで１０％及び２０％のマウス膵島密度でのｉＢＡＰは、グルコース刺激インスリン産生における最初のスパイクは高グルコース曝露の１０分以内に起こったことを示した。両方の条件は、グルコースの濃度減少としてインスリン停止を示した。約４０ｎｍの孔径のＳＮＭを有する１０％及び２０％のマウス膵島密度でＳＩは、それぞれ３．２±１．３であり、９．１±１．２であった。インスリン分泌の絶対量は、細胞密度が１０％～２０％増加したときに二重ではなかったが、後者がＳＩ因子の１．９倍増加したことを示し、基準からほぼ二倍の高いグルコースレベルに刺激されるインスリンの大きさを示した。生存率研究は、対流下の１０％マウス膵島密度（６６±４．８％）が、拡散下（２４±６．８％）のものと比較してより高い生存率を示した（図３３Ｂ～Ｃ）。更に、膵島密度が膵島チャンバ内の２０％に増加したとき、対流下での膵島の生存率（６１±３．０％）が、拡散下のもの（５．２±１．３％）と比較して、生存率の著しい増加を呈した（図３３Ｂ～Ｃ）。全体として、対流下の約４０ｎｍの孔径のＳＮＭを使用したｉＢＡＰは、１０％及び２０％のマウス膵島密度での生存率及びグルコース反応を支持した。
約１０ｎｍの孔径ＳＮＭを使用した前のインビトロ実験と比較して、約４０ｎｍの孔径のＳＮＭは、対流下の約１０ｎｍの孔径のＳＮＭについて、４０±１１％及び１７±１１％と比較して、１０％及び２０％マウス膵島密度で６６±４．８％及び６１±３．０％に生存率を高めた（図３２Ｄ及び３３Ｂ）。膵島生存率は、対流下の孔径の増加と正確に相関する。対流下の約４０ｎｍの孔径によって生成された限外濾過液は、カプセル化膵島の生存率及び機能性を増強した。対照的に、拡散は、より大きな膵島密度を支持するために不十分な質量移動を提供する。孔径の増加は、約１０ｎｍ（４．０±１．３％）から約４０ｎｍの孔径（２４±６．８％）への拡散下でのより低い細胞密度（１０％）での膵島生存率を改善したが、より高い細胞密度（２０％）での膵島生存率は、拡散下で有意差を示さなかった（（１１±５．８％）対（５．２±１．３％））。これらのデータは、栄養素及び酸素が、孔径が約４０ｎｍに上昇してもよい場合であっても、拡散下で栄養素及び酸素が重度に枯渇したままであったことを示す。拡散質量輸送は、ナノメートルサイズの孔を有する多孔性材料で広く報告されており、この研究は、４５ｎｍのナノ粒子の拡散が、ヒドロダイナミック摩擦により３００ｎｍの円柱状孔の２の因子によって減速されたことを示した。したがって、より大きな細胞密度、大規模な拡散距離、及び拡散下でナノスケール孔の制限は、栄養素及び酸素の不十分な移動が細胞壊死及び低酸素をもたらす可能性が高い。要約すると、インビトロｉＢＡＰの試験は、対流が１０％または２０％のマウス膵島密度を約１０ｎｍまたは約４０ｎｍの孔径のＳＮＭいずれかでより高い隋臓生存率で支持し、適切なグルコース刺激インスリン応答を提供することが重要であることを実証した。
ブタにおけるｉＢＡＰ埋め込み
装置及び膜開存を研究するための第１の工程として、約１０ｎｍの孔径のＳＮＭ及び５％マウス膵島密度（２，８５０ＩＥ／ｃｍ２）を有する拡散系ｉＢＡＰは、３日間のブタモデルにおいて血管内移植片化された。血管造影は、外植中の装置の血液流路の血栓形成及び閉塞を示した（図３４Ａ（ｉ））。このデータは、ｉＢＡＰ装置をクラスＡ犬に血管内に移植した以前の研究と一致し、この装置は実験を通して特許済みであり、血栓形成を有しておらず、外植後８日目に５．６ｎｍのＳＮＭ孔径に基づく２７．５ｍｌの限外濾過液を生成した。サイトカインパネルは、手術直後のブタからの炎症誘発性促進応答の予想される増加を示した（図３７）。血液接触ＳＮＭのＳＥＭ画像は、細胞及び接着タンパク質のいくつかの非致死的な取り付け及び凝集を表示した（図３４Ａ（ｉｉ））。特に、赤血球、白血球、及び血小板を膜表面上に堆積させた。その後の免疫組織化学分析は、グリーンＣＤ４１マーカーによって示されるように、ＳＮＭの多孔性領域内（ナノ孔を含む）でほとんどの血小板接着が示されるが、赤色ＣＤ６２ｐマーカーによって観察される最小血小板活性化が観察されたことを示した（図３４Ｂ）。生存率研究は、ブタにおける拡散系ｉＢＡＰが、約１０ｎｍの孔径（８８±４．９％）で５％マウス膵島密度での生存率を支持し、これは、インビトロ条件（８９±２．１％）と比較可能であったことを実証した（図３４Ｃ）。拡散系装置の中心に位置する細胞の低酸素及び壊死を回避するために、マクロカプセルの膵島密度は、膵島の栄養素及び廃棄物の適切な交換を確実にするために容積分率の５～１０％であることが示唆されている。約１０ｎｍの孔径のＳＮＭを有するｉＢＡＰは、拡散下の５％膵島密度の生存率を支持するための十分な質量移動を実証した（図３４Ｄ）。残念ながら、ブタ全身循環中のマウスインスリン及びｃ－ペプチドの濃度は検出限界未満であった。
装置及び膜開存を研究するための第１の工程として、約１０ｎｍの孔径のＳＮＭ及び５％マウス膵島密度（２，８５０ＩＥ／ｃｍ２）を有する拡散系ｉＢＡＰは、３日間のブタモデルにおいて血管内移植片化された。血管造影は、外植中の装置の血液流路の血栓形成及び閉塞を示した（図３４Ａ（ｉ））。このデータは、ｉＢＡＰ装置をクラスＡ犬に血管内に移植した以前の研究と一致し、この装置は実験を通して特許済みであり、血栓形成を有しておらず、外植後８日目に５．６ｎｍのＳＮＭ孔径に基づく２７．５ｍｌの限外濾過液を生成した。サイトカインパネルは、手術直後のブタからの炎症誘発性促進応答の予想される増加を示した（図３７）。血液接触ＳＮＭのＳＥＭ画像は、細胞及び接着タンパク質のいくつかの非致死的な取り付け及び凝集を表示した（図３４Ａ（ｉｉ））。特に、赤血球、白血球、及び血小板を膜表面上に堆積させた。その後の免疫組織化学分析は、グリーンＣＤ４１マーカーによって示されるように、ＳＮＭの多孔性領域内（ナノ孔を含む）でほとんどの血小板接着が示されるが、赤色ＣＤ６２ｐマーカーによって観察される最小血小板活性化が観察されたことを示した（図３４Ｂ）。生存率研究は、ブタにおける拡散系ｉＢＡＰが、約１０ｎｍの孔径（８８±４．９％）で５％マウス膵島密度での生存率を支持し、これは、インビトロ条件（８９±２．１％）と比較可能であったことを実証した（図３４Ｃ）。拡散系装置の中心に位置する細胞の低酸素及び壊死を回避するために、マクロカプセルの膵島密度は、膵島の栄養素及び廃棄物の適切な交換を確実にするために容積分率の５～１０％であることが示唆されている。約１０ｎｍの孔径のＳＮＭを有するｉＢＡＰは、拡散下の５％膵島密度の生存率を支持するための十分な質量移動を実証した（図３４Ｄ）。残念ながら、ブタ全身循環中のマウスインスリン及びｃ－ペプチドの濃度は検出限界未満であった。
次に、より高い膵島密度で拡散及び対流下のＳＮＭカプセル化マウス膵島を備えるｉＢＡＰの性能を評価して、膵島生存率及び機能性を支持するための対流質量の移動の有効性を実証した。具体的には、対流及び拡散機構を有する約１０ｎｍの孔径のＳＮＭ及び１０％マウス膵島密度（５，７００ＩＥ／ｃｍ２）を備えるｉＢＡＰを、３日間ブタの頚動脈及び静脈に移植した。炎症誘発性反応は、手術直後のこのブタのためにも観察された（図３８）。拡散側のために限外濾過液は生成されなかったが、限外濾過液産生は、対流側面上で観察された。限外濾過液を動物の間質空間に直接排水した。３日後、装置血液流量の有意な変化はなく、限外濾過は明白であり、膜はインビボ実験中に無傷であったことを示した（図３５Ａ（ｉ））。血管造影はまた、外植中の装置の血液流路の血栓形成及び閉塞を示さなかった。血液接触膜表面のグロス検査は、拡散及び対流条件の両方に対して最小の細胞接着性を示したが、対流下のＳＮＭの背面は、タンパク質性材料の白い層を呈した（図３５Ｂ（ｉｉｉ））。当該前の研究は、約７ｎｍのＳＮＭの孔径が、ウシ血清アルブミン（６６．５ｋＤａ）等の大きな分子の通過を防止し得ることを示した。血液接触ＳＮＭのＳＥＭ画像は、拡散ケースの最小の細胞付着を呈したが、対流条件のためにより細胞堆積が存在したと明らかになった（図３５Ａ（ｉｉ））。後続の免疫組織化学分析は、対流が、拡散と比較して、血液曝露ＳＮＭ表面上でより多くの血小板接着及び活性化をもたらしたことを示した（図３５Ｂ）。より重要なことに、約１０ｎｍの孔径を有する１０％のマウス膵島密度の生存率は、拡散シナリオ（７３±４．１％）と比較された対流条件で（８５±４．４％）より高い。興味深いことに、約１０ｎｍの孔径を有する１０％のマウス膵島密度でインビボ生存率（７３±４．１％）は、拡散（２．０±１．３％）及び対流（４０±１１％）下のインビボ生存率より大きい。対流側の膵島チャンバから直接生成された限外濾過液は、カプセル化膵島の機能性を呈する、１４４ｐＭのマウスｃ－ペプチド濃度（または１２ｐｇ／分／ＩＥ（膵島等価）インスリン産生速度）を示す。これらのデータは、対流下のＳＮＭカプセル化が、マクロカプセル化のための細胞密度でカプセル化細胞の膵島生存能力及び機能性を保存したことを実証する。要するに、ｉＢＡＰのインビトロ試験は、約１０ｎｍの孔径のＳＮＭが対流下の１０％マウス膵島密度（５，７００ＩＥ／ｃｍ２）で改善された生存率を示したことを実証し、約４０ｎｍの孔径を有するＳＮＭは、拡散下で試験したものと比較して、１０％（５，７００ＩＥ／ｃｍ２）及び２０％（１１，４００ＩＥ／ｃｍ２）で生存率の増加を実証した。更に、グルコース－インスリン動態実験は、生理学的なグルコース－インスリン応答及び臨床的に関連する絶対インスリン産生速度を示した。更に、ブタ研究は、対流下と拡散の下で装置及び膜開存の両方が、対流を用いた１０％マウス膵島密度でより高い膵島生存率、及びＩＥ当たりの臨床的に関連するマウスインスリン産生速度を実証した。全体的に、これらの研究は、長期血液流量開存性を達成するためのフルスケールのＳＮＭ系ｉＢＡＰの設計の実行性を示し、臨床的に関連する密度での拡散との比較において、膵島生存率を改善し、ＩＥ当たりの臨床的に関連性のあるインスリン分泌を持続させた。
実施例４：
ケイ素ナノ孔膜は超高透過率を保有する。様々な異なる孔径のＳＮＭ（５～５００ｎｍ）の領域が試験されており、適切な限外濾過速度を生成して、依然として免疫単離を維持しながら、必要な栄養素とインスリンの対流質量移動を送達する。図３９は、様々な孔径ＳＮＭの透水率データを示し、図３０Ａ～Ｂは１０ｎｍ幅のＳＮＭの走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像を示す。
ケイ素ナノ孔膜は超高透過率を保有する。様々な異なる孔径のＳＮＭ（５～５００ｎｍ）の領域が試験されており、適切な限外濾過速度を生成して、依然として免疫単離を維持しながら、必要な栄養素とインスリンの対流質量移動を送達する。図３９は、様々な孔径ＳＮＭの透水率データを示し、図３０Ａ～Ｂは１０ｎｍ幅のＳＮＭの走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像を示す。
ケイ素ナノ孔膜は、免疫単離を達成するための超選択的精密スリット形状ナノ孔を有する。
非常に正確な孔を有するＳＮＭは、革新的なプロセスを使用して製造され、優れた透水率を実証した。ミクロン電気機械系（ＭＥＭＳ）製造技術はＳＮＭを作成した。薄犠牲ＳｉＯ２層が膜のサブミクロン孔径を定義して成長する。ケイ素基質の熱酸化は、１％未満のばらつきで３ｎｍまでの厚さの酸化物を提供する。酸化物は、開口平行プレートのナノチャネル孔の後方にエッチングされる。４００μｍの厚さの支持構造によって支持された５～５００ｎｍの孔径を有する０．２５～１．００μｍの厚さの多結晶性ポリマー結晶性膜が製造された。ＳＮＭ透水率を、クロスフロー及び膜貫通（ＴＭＰ）圧力でカスタムフローセル内で試験した。透水率実験は従来のポリマー膜の透過率より大きい透水率を実証した。
ポリマー被覆ＳＮＭは、タンパク質吸着を低減し、溶血性表面を提供した。ポリマーコーティングは、タンパク質の汚れを遅らせるためにケイ素基質上で評価された。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリスルホベタインメチルアクリレート（ｐＳＢＭＡ）、及びポリ（Ｎ－ビニルデキストランアルドナミド－コＮ－ビニルヘキサンアミド）（ＰＶＡｍ－Ｄｅｘ／Ｈｅｘ）を選択して、非特異的タンパク質吸着を低減させた。迅速インビボ血管内評価（ＲＩＶｉｖｅ）プロトコルは、Ｗｉｓｔａｒラットの大腿静脈にＰＥＧコーティング及びコーティングされない（裸）ケイ素ダーツを挿入した。埋め込みの３０日後、ダーツ及び血管を、肉眼検査、組織学、及び走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）（図４０）によって外植、評価された。全て未コーティングのケイ素ダーツは、血小板－フィブリン凝固を有したが、ＰＥＧコーティングされたダーツは、粘着性凝固を示さなかった。
ＳＮＭは、成功した免疫単離を実証した。サイトカイン（ＩＬ－１β、ＴＮＦ－α、及びＩＦＮ－γ）が有るまたは無い細胞培養培地を使用して、膵島免疫単離もインビトロ研究した。膵島を２つの７ｎｍの孔ＳＮＭの間にカプセル化した。６時間後、生存率のために膵島を除去し、染色した。対照静的培養実験を行い、ＳＮＭの効果を決定した。図４１は、７ｎｍの孔のＳＮＭが膵島免疫単離を達成する能力を示す。補体タンパク質（Ｃ４、２１０ｋＤａ、及びＣ１ｑ、４１０ｋＤａ等の）の大きなサイズは、ＳＮＭによる制限された輸送を示唆する。ＳＮＭによる補体透過率を、抗ヒツジ赤血球抗体でコーティングされたヒツジ赤血球を溶解する血清容量として全補体活性を測定する機能性溶血アッセイによって評価された。全補体活性の１００％が、市販の膜（１００～４００ｎｍの孔）を２つのチャンバに分離したときに受容チャンバにおいて検出された。対照的に、合計補体活性の１％未満がＳＮＭ及びトラックエッチング膜で検出された。これらの結果は、ＳＮＭブロック大型補体分子を実証する
小規模の細胞骨格が開発され、対流下の濃縮インスリン産生細胞の試験を可能にした。対流質量輸送下で限外濾過液形成を試験するために、小規模な細胞骨格が開発され、膵島で試験されている。細胞骨格は、８つの１００μｍ直径のＰＴＦＥ被覆ワイヤによって２％アガロースゲルに成形された８つの１００μｍ直径円筒形限外濾過液チャネル（図３１の塗りつぶしの丸）の六角形配列からなり、細胞と限外濾過液との間の拡散距離を最小にする。生体適合性アクリルシートは、レーザー切断され、細胞、アガロース、及び限外濾過チャネルをＳＮＭ間に保持する約２．４ｍｍ×約２．４ｍｍ×約１ｍｍの厚さを作製した。図２０Ａ～Ｄは、細胞骨格を作製するためのプロセス及び固定具を示し、図３１は、組み立てられた細胞骨格を示す。細胞骨格のアクリル酸シートは、膵島（白色球体）、アガロース、及び円筒形限外濾過チャネル（固体赤色）を備える。円筒形チャネルの六角形配列は、中央の１００μｍ円筒形チャネルを有する８つの８００μｍ円筒状細胞アガロース組織領域（点線の赤丸）を作製する。この構成は、拡散細胞と外膜濾過との間の４００μｍ以下の拡散距離を作製する。
低規模のｉＢＡＰプロトタイプが、ビトロ及びインビボ細胞骨格試験並びにインビボ血相適合性試験のために開発された。図２１及び２２Ａは、最大２ｃｍ２のＳＮＭ領域を有する小規模のｉＢＡＰを説明する。図２１は、ｉＢＡＰ構成成分の分解図である。血流流路を備えるポリカーボネート流路成分、２つのＳＮＭ、アガロース播種細胞を備える細胞骨格、ポリカーボネート裏面（ＰＣ裏面）、及び限外濾過液出口、細胞培養培地または血液は約８０ｍｍＨｇで流路構成要素を流れ、血液または細胞培養培地と限外濾過液出口との間にＴＭＰ圧を生じ、ＳＮＭ、細胞骨格、ＰＣ背面、及び限外濾過液出口を通した限外濾過液の流れをもたらし、これは、臨床設定の静脈またはインビトロの採取管に集められる。図２２Ａは、インビトロ及びインビボ試験のために使用される組み立てられた小規模のｉＢＡＰの写真である。
インビトロ小規模細胞骨格試験は、対流対拡散及び有望なグルコースインスリン動態によって増加した膵島生存率を示した。小規模な細胞骨格内の（またはそれぞれ５，７００ＩＥＱ／ｃｍ２または１１，４００ＩＥＱ／ｃｍ２）容積により１０％または２０％の膵島密度で新しく単離したマウス膵島は、４０ｎｍのＳＮＭを備えるｉＢＡＰに充填された。ｉＢＡＰ装置は、インキュベータ内の模擬回路ループ（図４２）に接続された。各膵島密度について３つの細胞骨格を拡散または対流において試験した。３日後、膵島をＦＤＡ＋ＰＩによって染色されて、細胞生存率を決定し、図３３Ｃ（ｉｖ及びｖ）は、２０％膵島密度実験からの代表的な画像である。両方の膵島密度について、対流に曝された細胞骨格は、拡散に曝された細胞骨格よりも大きな膵島生存率を有していた（図４８）。４０ｎｍのＳＮＭは、臨床的に膵島密度に関連する膵島生存率を支えた。
ヒト膵島機能を９０分間グルコース－インスリン動態研究で評価した。小規模細胞骨格の１０％膵島密度の新しく単離したヒト膵島を、４０ｎｍのＳＮＭを有するｉＢＡＰに装填し、次いで模擬回路ループにあることを低グルコース細胞培養培地中で１時間安定化させた。ゼロでは、グルコース濃度を７０分間増加させ、限外濾過液試料を限外濾過出口から収集した。図４３は、約８分の最初のインスリンピーク、続いて７０分でグルコース濃度が低下するまでインスリン分泌が持続的に高められ、インスリン産生の減少が観察されたことを示している。臨床的に機能するｉＢＡＰは、効果的な血糖コントロールを達成するために、＜１５分でインスリン応答を有していなければならない。
プロトタイプの本格的なｉＢＡＰが設計され、ＣＦＤがモデル化され、インビボでの７日間の血液適合性試験で血流の開存性が実証された。フルスケールのｉＢＡＰ血流設計がＳｏｌｉｄＷｏｒｋｓで生成され、ＡＮＳＹＳ Ｆｌｕｅｎｔで分析され、小規模のｉＢＡＰプロトタイプからの血流経路を拡張する実行可能性が決定された。この第１世代のフルスケールｉＢＡＰは、医療グレードのポリカーボネートから製造され、ＳＮＭで装填された。フルスケールｉＢＡＰを健康なブタに血管内に移植し（図４４）、ヘパリンを手術に際して１００単位／ｋｇで、次に１．５ｍｇ／ｋｇアセチルサリチル酸（アスピリン）を１日２回投与した。装置は、７日で外植され、実験全体を通して特許出願された。
実施例５：
ｉＢＡＰは動静脈移植片に接続され、動脈と静脈との間の圧力降下により、インスリン産生細胞で播種されたＳＮＭカプセル化細胞骨格を介して限外濾過液流を生成し、細胞に栄養素を運び、限外濾過静脈にインスリンを運ぶ（図３６Ａ－Ｂ）。ＳＮＭは生体適合性があり、高水圧の透水性膜であり、高レベルの限外濾過液を生成し、細胞骨格への生理学的栄養素の送達、及び細胞骨格からのインスリン分泌を可能にする一方で、細胞は、インビトロ及びインビボの両方でグルコース刺激インスリン分泌を有する直径約１００μｍの球体に配置されたヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）由来の成熟β細胞である。
ｉＢＡＰは動静脈移植片に接続され、動脈と静脈との間の圧力降下により、インスリン産生細胞で播種されたＳＮＭカプセル化細胞骨格を介して限外濾過液流を生成し、細胞に栄養素を運び、限外濾過静脈にインスリンを運ぶ（図３６Ａ－Ｂ）。ＳＮＭは生体適合性があり、高水圧の透水性膜であり、高レベルの限外濾過液を生成し、細胞骨格への生理学的栄養素の送達、及び細胞骨格からのインスリン分泌を可能にする一方で、細胞は、インビトロ及びインビボの両方でグルコース刺激インスリン分泌を有する直径約１００μｍの球体に配置されたヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）由来の成熟β細胞である。
図３１は、各限外濾過チャネルを囲む最大直径が８００μｍである、ＩＣ内の膵島及びアガロース混合物の総画像を示す。図は、アガロースゲル、膵島、及び円柱外濾過チャネルを含有する細胞骨格の顕微鏡画像を示す。
図３２Ａ～Ｃは、１０ｎｍの孔径のＳＮＭでカプセル化された１０％または２０％の膵島密度を有する血管内バイオ人工膵島装置（ｉＢＡＰ）のインビトロ試験を示す。図３２Ａは、対流下の１０％（ｉ）または２０％（ｉｉ）の膵島密度のＳＮＭカプセル化ｉＢＡＰのグルコース－インスリン動態を、それらを一連の低、高及び低グルコース条件に曝露することから測定したことを示す図である。図３２Ｂは、３日後に、拡散（１０％拡散）下の膵島密度１０％のもの、ならびに拡散（２０％拡散）下及び対流（２０％対流）下の両方での２０％膵島密度のものと比較して、対流（１０％対流）下で１０％膵島密度を有するＳＮＭカプセル化ｉＢＡＰが顕著に高い生存率を示したことを示す。（陰極＞３、＊ｐ＜０．０５）。アガロース中に直ちにカプセル化され、さらなる試験をせずに膵島チャンバ（ＩＣ）に分注された膵島の生存率をインビトロ陽性対照として評価した。図３２Ｃは、インビトロでの陽性対照（ｉ）、拡散下の１０％膵島密度（ｉｉ）、対流下での１０％膵島密度（ｉｉｉ）、拡散下の２０％膵島密度（ｉｖ）、対流下の２０％膵島密度（ｖ）（スケールバー＝５０μｍ）で生存可能な（緑色）細胞および死んだ（赤色）細胞が染色されたことを示す。対流下で１０％膵島密度を有するＳＮＭカプセル化ｉＢＡＰ（ｉｉｉ）は、拡散（ｉｉ）下の１０％膵島密度、及び拡散（ｉｖ）及び対流（ｖ）の両方での２０％膵島密度より高い生存率を示した。拡散（ｉｉ）下の１０％膵島密度、及び拡散（ｉｖ）及び対流（ｖ）両方の下の２０％膵島密度は、有意な量の細胞死を伴う同様の生存率を示した。
図３３Ａ～Ｃは、４０ｎｍの孔径のＳＮＭでカプセル化された１０％または２０％の膵島密度を有する血管内バイオ人工膵島装置（ｉＢＡＰ）のインビトロ試験を示す。図３３Ａは、対流下の膵島密度１０％（ｉ）または２０％（ｉｉ）を有するＳＮＭカプセル化ｉＢＡＰのグルコース－インスリン動態を、一連の低、高及び低グルコース条件に曝露することから測定したことを示す。図３３Ｂは、対流（１０％及び２０％対流）下での膵島密度１０％及び２０％を有するＳＮＭカプセル化ｉＢＡＰが、三日後の拡散（１０％及び２０％拡散）下の膵島密度１０％及び２０％を示した（ｎ＞３、＊ｐ＜０．０５）。アガロース中に直ちにカプセル化され、さらなる試験をせずに膵島チャンバ（ＩＣ）に分注された膵島の生存率をインビトロ陽性対照として評価した。図３３Ｃは、インビトロ陽性対照（ｉ）、拡散下の１０％の膵島密度（ｉｉ）、対流下で１０％の膵島密度（ｉｉｉ）、拡散下での２０％膵島密度（ｉｖ）及び対流下での２０％膵島密度（ｖ）（スケールバー＝５０μｍ）で生存可能な（緑色）細胞及び死んだ（赤色）細胞が染色されたことを示す。対流下で１０％及び２０％膵島密度を有するＳＮＭカプセル化ｉＢＡＰ（ｉｉｉ及びｖ）は、拡散下（ｉｉ及びｉｖ）のものより高い生存率を示した。特に、拡散下の２０％膵島密度（ｉｖ）は、有意な量の細胞死を示した。
図３４Ａ～Ｄは、１０ｎｍの孔径のＳＮＭで３日間カプセル化した５％膵島密度を有する血管内バイオ人工膵島装置（ｉＢＡＰ）のインビボ試験を示す。図３４Ａは、外科用拡散系ｉＢＡＰ（ｉ）の画像を示す。赤血球細胞及び血小板の付与を示す埋め込み膜のＳＥＭ画像（スケールバー＝１０μｍ）。図３４Ｂは、血小板接着ＣＤ４１マーカー（緑色）及び血小板活性化ＣＤ６２ｐマーカー（赤色）の免疫蛍光染色を示す。固体ケイ素領域によって囲まれた長方形の孔含有領域を、光沢場画像（ｉ）に示した。血小板接着（緑色）は、孔が存在するウィンドウ領域においてほとんど生じ、一方で最小の血小板活性化（赤色）は検出された（スケールバー＝２０μｍ）。図３４Ｃは、インビトロ（インビトロ５％拡散）及びインビボ（インビボ５％拡散）の両方の拡散下の５％膵島密度を有するＳＮＭカプセル化ｉＢＡＰが、インビトロ陰性対照と比較して有意に高い生存率を示した（ｎ＞３、＊ｐ＜０．０５）。インビトロ陰性対照は、３日間培地循環しないで組み立てられた膵島であった。アガロース中に直ちにカプセル化され、さらなる試験をせずに膵島チャンバ（ＩＣ）に分注された膵島の生存率をインビトロ陽性対照として評価した。図３４Ｄはインビトロ陽性対照（ｉ）、インビトロ陰性対照（ｉｉ）、拡散下のインビトロ５％膵島密度（ｉｉｉ）、拡散下のインビボ５％膵島密度（ｉｖ）（スケールバー＝５０μｍ）で生存可能な（緑色）細胞及び死んだ（赤色）細胞が染色されたことを示す。対流下で５％膵島密度を有するＳＮＭカプセル化ｉＢＡＰ（ｉｉｉ＆ｖ）は、インビトロ陽性対照と同様の生存率を示した。
図３５Ａ～Ｄは、３日間、拡散または対流のいずれかで１０ｎｍの孔径のＳＮＭでカプセル化された１０％膵島密度を有する血管内バイオ人工膵島装置（ｉＢＡＰ）のインビトロ試験を示している。図３５Ａは、装置（ｉ）の拡散（後）及び対流（正面）を有する外植型ｉＢＡＰの画像を示す。拡散側埋め込み膜のＳＥＭ画像は、特許面（ｉｉ、上部）（スケールバー＝１００μｍ）を示し、対流側膜のＳＥＭ画像は、表面上のタンパク質及び細胞の被覆率（ｉｉ）を示した（スケールバー＝１０μｍ）。図３５Ｂは、血小板接着ＣＤ４１マーカー（緑色）及び血小板活性化ＣＤ６２ｐマーカー（赤色）の免疫蛍光染色を示す。拡散側膜（ｉ）及び対流側膜（ｉｉｉ）の明視野画像には、固体ケイ素領域によって囲まれた長方形の孔含有領域が示されている。血小板接着（緑色）は、拡散側膜（ｉｉ）で最小である一方で、より小さい血小板接着（緑色）及び活性化（赤色）は、対流側膜（ｉｖ）（スケールバー＝２０μｍ）で検出された。図３５Ｃは、インビトロ（インビトロ１０％対流）及びインビボ（インビボ１０％対流）両方の対流下の１０％膵島密度を有するＳＮＭカプセル化ｉＢＡＰが、インビトロ（インビトロ１０％の拡散）及びインビボ（インビボで１０％の拡散）での拡散下のものと比較してより高い細胞生存率を示した。（陰極＞３、＊ｐ＜０．０５）。インビトロ陰性対照は、３日間培地循環しないで組み立てられた膵島であった。アガロース中に直ちにカプセル化され、さらなる試験をせずに膵島チャンバ（ＩＣ）に分注された膵島の生存率をインビトロ陽性対照として評価した。図３５Ｄは、インビトロ陽性対照（ｉ）、インビトロ陰性対照（ｉｉ）、拡散下のインビトロ１０％膵島密度（ｉｉｉ）、対流下でのインビトロ１０％膵島密度（ｉｖ）、拡散下のインビボ１０％膵島密度（ｖ）、対流下でのインビボ膵島密度（ｖｉ）（スケールバー＝５０μｍ）で生存可能な（緑色）細胞及び死んだ（赤色）細胞が染色されたことを示す。インビボ対流下で１０％膵島密度を有するＳＮＭカプセル化ｉＢＡＰ（ｖｉ）は、インビボ陽性対照と同様の生存率を示した。
図３６Ａ～Ｂは、ｉＢＡＰの血流を示す。図３６Ａは、インスリン豊富な限外濾過液を限外濾過静脈に送達する、動脈静脈移植片及び限外濾液過出口カテーテルに接続されたフルスケールのｉＢＡＰの説明を示す。血液がｉＢＡＰに流れ、ループ状の血液チャネルが血液を静脈に輸送する。ＳＮＭカプセル化ＩＣは、血液チャネルの上方及び下方に直接配置される。図３６Ｂは、ＳＮＭ（緑色）カプセル化ＩＣ（青色）によって包囲された血液チャネルを示す血流に対して垂直な断面図を示す。限外濾過液（黒色の矢印）は、ＳＮＭカプセル化ＩＣを限外濾過液チャネル（横）に横断し、限外濾過液静脈内に限外濾過液出口カテーテルを出る。
図３７は、ブタにおける系統的サイトカイン濃度の日常測定値を示す。１０ｎｍの孔径のＳＮＭでカプセル化された５％膵島密度を有する血管内バイオ人工膵島（ｉＢＡＰ）。サイトカイン、すなわち顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（Ｇｍ～ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦ－α）、インターロイキン１α（ＩＬ－１α）、インターロイキン１β（ＩＬ－１β）、インターロイキン８（ＩＬ－８）、インターロイキン１２（ＩＬ－１２）、インターロイキン１８（ＩＬ－１８）、インターロイキン－１受容体アンタゴニスト（ＩＬ－１Ｒａ）、インターロイキン４（ＩＬ－４）、及びインターロイキン１０（ＩＬ－１０）を分析した。インターフェロンガンマー（ＩＦＮ－Ｙ）を検出しなかった。約３５．８９ｐｇ／ｍｌのインターロイキン２（ＩＬ－２）を、０日目にのみ移植後に検出した。
図３８は、ブタにおける系統的サイトカイン濃度の日常測定値を示す。１０ｎｍの孔径のＳＮＭでカプセル化された１０％膵島密度を有する血管内バイオ人工膵臓（ｉＢＡＰ）。サイトカイン、すなわちインターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）、腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦ－α）、インターロイキン１α（ＩＬ－１α）、インターロイキン１β（ＩＬ－１β）、インターロイキン２（ＩＬ－２）、インターロイキン６（ＩＬ－６）、インターロイキン１２（ＩＬ－１２）、インターロイキン１８（ＩＬ－１８）、インターロイキン－１受容体アンタゴニスト（ＩＬ－１Ｒａ）、インターロイキン４（ＩＬ－４）及びインターロイキン１０（ＩＬ－１０）を分析した。顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（Ｇｍ－ＣＳＦ）を検出しなかった。約２５．４４ｐｇ／ｍｌのインターロイキン８（ＩＬ－８）を２日目にのみ検出した．
図３９は、孔径の関数としてのケイ素ナノ孔膜（ＳＮＭ）透水率を示す。
図４０は、抗凝固剤無し齧歯類の大腿血管におけるインビボでの３０日間の血液曝露後の低（上）及び高（下）倍率での未コーティング（左）及びＰＥＧコーティング（右）ケイ素表面のＳＥＭ画像を示す。コーティングされていない試料は、接着血小板－フィブリン凝固を呈し、一方で、コーティングされた表面は、血栓を一般に含まなかった。
Claims (68)
- バイオ人工限外濾過装置であって、
細胞集団及び前記細胞集団に隣接している複数のチャネルを備えるマトリックスを備える平面骨格であって、前記複数のチャネルが、前記平面骨格の第１の表面から第２の表面まで前記マトリックスを通して延在し、前記平面骨格の第１及び第２の表面に実質的に垂直である、平面骨格と、
前記平面骨格の前記第１の表面上に配設された第１の限外濾過半透膜と、
前記平面骨格の前記第１の表面に隣接し、前記第１の限外濾過半透膜を介して前記平面骨格と流体連通し、入口及び出口を備える第１の区画と、
前記平面骨格の前記第２の表面に隣接しており、出口を備える第２の区画と、を備え、
前記第１の限外濾過半透膜が、５ｎｍ～５ミクロンの範囲の幅を有する複数の孔を備え、
前記第１の限外濾過半透膜が、前記第１の区画から前記複数のチャネルへの限外濾過液の輸送を可能にし、前記限外濾過液が、前記複数のチャネルから前記第２の区画へと横断する、バイオ人工限外濾過装置。 - 前記装置が、前記平面骨格の前記第２の表面上に配設された第２の限外濾過半透膜を更に備え、前記限外濾過液が前記第２の限外濾過半透膜を通して前記複数のチャネルから前記第２の区画へと横断する、請求項１に記載の装置。
- 前記第２の限外濾過半透膜が、５ｎｍ～５ミクロンの範囲の幅を有する複数の孔を備える、請求項２に記載の装置。
- 前記第１及び第２の限外濾過半透膜が、０．１ミクロン～２ミクロンの範囲の範囲の幅を有する複数の孔を備える、請求項２または３のいずれか一項に記載の装置。
- 前記第２の限外濾過半透膜が、前記第１の限外濾過半透膜中の前記複数の孔の幅よりも大きい幅を有する複数の孔を備える、請求項２から４のいずれか一項に記載の装置。
- 前記第１の区画の前記入口が、対象の血管への接続のための管に取り付け可能である、請求項１から５のいずれか一項に記載の装置。
- 前記血管が、対象の動脈である、請求項６に記載の装置。
- 前記第１の区画の前記出口が、対象の血管への接続のための管に取り付け可能である、請求項１から７のいずれか一項に記載の装置。
- 前記第１の区画の前記出口が、前記対象の静脈への接続のための管に取り付け可能である、請求項８に記載の装置。
- 前記第１の区画の前記出口が、前記対象の動脈への接続のための管に取り付け可能である、請求項８に記載の装置。
- 前記出口に接続された前記動脈が、前記入口に接続された動脈と同じである、請求項１０に記載の装置。
- 前記第１の区画が、（ｉ）対象の複数の異なる血管または（ｉｉ）単一の血管上の複数の接続部位への接続のための管に各々取り付け可能な複数の出口を備える、請求項１から１１のいずれか一項に記載の装置。
- 前記第２の区画の前記出口が、対象の血管への接続のための管に取り付け可能である、請求項１から１２のいずれか一項に記載の装置。
- 前記第２の区画の前記出口が、前記対象の複数の血管に前記限外濾過液を提供する、請求項１３に記載の装置。
- 前記第２の区画の前記出口が、前記対象の複数の静脈への接続のための管に取り付け可能である、請求項１４に記載の装置。
- 前記第２の区画の前記出口が、前記対象の複数の動脈への接続のための管に取り付け可能である、請求項１４に記載の装置。
- 前記第２の区画の前記出口が、分析物分析装置に取り付け可能である、請求項１４に記載の装置。
- 前記第２の区画が、前記限外濾過液を少なくとも前記対象の１つの血管に提供するための複数の出口を備える、請求項１３に記載の装置。
- 前記第２の区画が、前記限外濾過液を分析物分析装置に提供するための複数の出口を備える、請求項１４に記載の装置。
- バイオ人工限外濾過装置であって、
細胞集団及び前記細胞集団に隣接した複数のチャネルを備えるマトリックスを各々備える第１の平面骨格及び第２の平面骨格であって、前記複数のチャネルが、前記平面骨格の各々の第１の表面から第２の表面まで前記マトリックスを通して延在し、前記平面骨格の各々の第１及び第２の表面に実質的に垂直である、第１の平面骨格及び第２の平面骨格と、
前記第１及び第２の平面骨格の前記第１の表面上に配設された第１の限外濾過半透膜と、
前記第１及び第２の平面骨格の前記第１の表面間に隣接して挟まれており、入口及び出口を備える第１の区画であって、前記第１の限外濾過半透膜が、前記第１の区画から前記骨格への限外濾過液の輸送を可能にする、第１の区画と、
前記第１の平面骨格の前記第２の表面に隣接しており、出口を備える第２の区画と、
前記第２の平面骨格の前記第２の表面に隣接しており、出口を備える第３の区画とを備え、
前記第１の限外濾過半透膜が、５ｎｍ～５ミクロンの範囲の幅を有する複数の孔を備え、
前記限外濾過液が、前記骨格中の前記複数のチャネルから前記第２の区画及び前記第３の区画へと横断する、バイオ人工限外濾過装置。 - ５ｎｍ～５ミクロンの範囲の幅を有する複数の孔を備える第２の限外濾過半透膜を更に備え、前記第２の限外濾過半透膜が、前記第１及び第２の平面骨格の前記第２の表面上に配設され、前記限外濾過液が、前記骨格の前記複数のチャネルから前記第２の限外濾過半透膜を介して前記第２の区画及び前記第３の区画へと横断する、請求項２０に記載の装置。
- 前記第１の限外濾過半透膜が、０．１ミクロン～２ミクロンの範囲の範囲の幅を有する複数の孔を備える、請求項２１に記載の装置。
- 前記第２の限外濾過半透膜が、０．１ミクロン～２ミクロンの範囲の範囲の幅を有する複数の孔を備える、請求項２２に記載の装置。
- 前記第２の限外濾過半透膜が、前記第１の限外濾過半透膜中の前記複数の孔の幅よりも大きい幅を有する複数の孔を備える、請求項２１に記載の装置。
- 前記第１の区画の前記入口が、対象の動脈への接続のための管に接続可能である、請求項２０から２４のいずれか一項に記載の装置。
- 前記第１の区画の前記出口が、対象の動脈への接続のための管に接続可能である、請求項２０から２５のいずれか一項に記載の装置。
- 前記第１の区画の前記出口が、対象の静脈への接続のための管に接続可能である、請求項２０から２５のいずれか一項に記載の装置。
- 前記第２の区画の前記出口が、対象の少なくとも１つの血管及び／または分析物分析装置への接続のための管に接続可能である、請求項２０から２７のいずれか一項に記載の装置。
- 前記第３の区画の前記出口が、少なくとも対象の血管及び／または分析物分析装置への接続のための管に接続可能である、請求項２０から２７のいずれか一項に記載の装置。
- 前記第３の区画の前記出口が、少なくとも対象の静脈及び／または分析物分析装置への接続のための管に接続可能である、請求項２０から２７のいずれか一項に記載の装置。
- 前記第２の区画の前記出口及び前記第３の区画の前記出口が、少なくとも対象の血管及び／または分析物分析装置への接続のための単一の管に接続される、請求項２０から２７のいずれか一項に記載の装置。
- 前記第１の限外濾過半透膜内の前記複数の孔が、０．２μｍ～０．５μｍの範囲の幅を有する、請求項１から３１のいずれか一項に記載の装置。
- 前記第２の限外濾過半透膜内の前記複数の孔が、０．２μｍ～０．５μｍの範囲の幅を有する、請求項２から１９及び２１から３２のいずれか一項に記載の装置。
- 前記第１の限外濾過半透膜の厚さが、０．１ミクロン～１０００ミクロンの範囲内である、請求項１から３３のいずれか一項に記載の装置。
- 前記第２の限外濾過半透膜の厚さが、０．１ミクロン～１０００ミクロンの範囲内である、請求項２から１９及び２１から３４のいずれか一項に記載の装置。
- 前記第１の限外濾過半透膜の厚さが、２００μｍ～１０００μｍの範囲内である、請求項１から３５のいずれか一項に記載の装置。
- 前記第２の限外濾過半透膜の厚さが、２００μｍ～１０００μｍの範囲内である、請求項２から１９及び２１から３６のいずれか一項に記載の装置。
- 前記第１の限外濾過半透膜の表面積が、１ｃｍ２～１００ｃｍ２の範囲内である、請求項１から３７のいずれか一項に記載の装置。
- 前記第１の限外濾過半透膜の表面積が、１５ｃｍ２～３０ｃｍ２の範囲内である、請求項１から３８のいずれか一項に記載の装置。
- 前記第２の限外濾過半透膜の表面積が、１ｃｍ２～１００ｃｍ２の範囲内である、請求項２から１９及び２１から３９のいずれか一項に記載の装置。
- 前記第２の限外濾過半透膜の表面積が、１５ｃｍ２～３０ｃｍ２の範囲内である、請求項２から１９及び２１から４０のいずれか一項に記載の装置。
- 前記複数の孔が、円形状であり、前記幅が前記孔の直径を指す、請求項１から４１のいずれか一項に記載の装置。
- 前記複数の孔が、スリット形状である、請求項１から４１のいずれか一項に記載の装置。
- 前記複数の孔が、スリット形状であり、前記孔の幅が５ｎｍ～１００ｎｍである、請求項１から４３のいずれか一項に記載の装置。
- 前記複数の孔が、スリット形状であり、前記孔の長さが、０．１ミクロン～５ミクロンの範囲内である、請求項１から４４のいずれか一項に記載の装置。
- 前記複数の孔が、スリット形状であり、前記孔の長さが１μｍ～３μｍの範囲内である、請求項１から４５のいずれか一項に記載の装置。
- 前記細胞が、インスリン産生細胞である、請求項１から４６のいずれか一項に記載の装置。
- 前記インスリン産生細胞が幹細胞の分化に由来する、請求項４７に記載の装置。
- 前記インスリン産生細胞が、膵島から単離された膵臓細胞である、請求項４７に記載の装置。
- 前記細胞が、前記装置を備える対象に対して自家性である、請求項１から４９のいずれか一項に記載の装置。
- 前記細胞が、前記装置を備える対象に対して異種性である、請求項１から４９のいずれか一項に記載の装置。
- 前記細胞が、前記装置を備える対象に対して同種性である、請求項１から４９のいずれか一項に記載の装置。
- バイオ人工限外濾過装置であって、
細胞集団及び前記細胞集団に隣接している複数のチャネルを備えるマトリックスを備える平面骨格であって、前記複数のチャネルが、前記平面骨格の第１の表面から第２の表面まで前記マトリックスを通して延在し、前記平面骨格の第１及び第２の表面に実質的に垂直である、平面骨格と、
前記第１の表面上に配設された第１の限外濾過半透膜及び前記平面骨格の前記第２の表面上に配設された第２の限外濾過半透膜と、
第１の入口及び第１の出口を備える第１の区画であって、前記第１の区画が前記平面骨格の前記第１の表面に隣接している、第１の区画と、
第２の入口及び第２の出口を備える第２の区画であって、前記第２の区画が前記平面骨格の前記第２の表面に隣接している、第２の区画とを備え、
前記第１の入口が、対象の動脈への接続のために構成され、前記第１の出口が前記第２の区画の前記第２の入口に接続され、
前記第２の区画の前記第２の出口が、前記対象の静脈への接続のために構成され、
前記限外濾過半透膜が、５ｎｍ～５ミクロンの範囲の幅を有する複数の孔を備え、
前記第１の限外濾過半透膜が、前記第１の区画から前記骨格への限外濾過液の輸送を可能にし、前記第２の限外濾過半透膜が、前記骨格中の前記複数のチャネルから前記第２の区画への前記限外濾過液の輸送を可能にする、バイオ人工限外濾過装置。 - 前記細胞が、インスリン産生細胞である、請求項５３に記載の装置。
- 前記インスリン産生細胞が幹細胞の分化に由来する、請求項５４に記載の装置。
- 前記インスリン産生細胞が、膵島から単離された膵臓細胞である、請求項５４に記載の装置。
- 前記細胞が、前記対象に対して自家性である、請求項５３から５６のいずれか一項に記載の装置。
- 前記細胞が、前記対象に対して異種性である、請求項５３から５６のいずれか一項に記載の装置。
- 前記細胞が、前記対象に対して同種性である、請求項５３から５６のいずれか一項に記載の装置。
- 前記複数の孔が、０．２μｍ～０．５μｍの範囲の幅を有する、請求項５３から５９のいずれか一項に記載の装置。
- 前記第２の限外濾過半透膜中の前記複数の孔が、前記第１の限外濾過半透膜中の前記複数の孔の幅よりも大きい幅を有するか、または前記第２の限外濾過半透膜中の前記複数の孔が、前記第１の限外濾過半透膜中の前記複数の孔の幅よりも小さい幅を有する、請求項５３から６０のいずれか一項に記載の装置。
- 前記限外濾過半透膜の厚さが、０．１ミクロン～１０００ミクロンの範囲内である、請求項５３から６１のいずれか一項に記載の装置。
- 前記限外濾過半透膜の厚さが、２００μｍ～１０００μｍの範囲内である、請求項５３から６１のいずれか一項に記載の装置。
- 前記限外濾過半透膜の表面積が、１ｃｍ２～１００ｃｍ２の範囲内である、請求項５３から６３のいずれか一項に記載の装置。
- 前記限外濾過半透膜の表面積が、１５ｃｍ２～３０ｃｍ２の範囲である、請求項５３から６３のいずれか一項に記載の装置。
- 前記複数の孔が、円形状であり、前記幅が前記孔の直径を指す、請求項５３から６５のいずれか一項に記載の装置。
- 前記複数の孔が、スリット形状であり、前記孔の長さが１ミクロン～５ミクロンの範囲内である、請求項５３から６５のいずれか一項に記載の装置。
- 前記複数の孔が、スリット形状であり、前記孔の長さが１μｍ～３μｍの範囲内である、請求項５３から６５のいずれか一項に記載の装置。
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