KR20240056514A - 개방형의 이식 가능한 세포 전달 장치 - Google Patents

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KR20240056514A
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아트 알렉산더 반 아펠도른
릭 데 브리에스
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위니베르시테이트 마스트리흐트
아카데미스 지켄하위스 마스트리흐트
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Abstract

대상체에 세포를 이식하기 위한 개방형의 이식 가능한 세포 전달 장치로서, 복수의 기공을 갖는 표면 영역을 갖는 하부 필름; 복수의 기공을 갖는 표면 영역을 가지며, 내부 공간을 생성하기 위해 상부 필름이 하부 필름을 실질적으로 덮도록 하부 필름의 상부에 위치하는 상부 필름을 포함하고, 여기서 하부 필름과 상부 필름은 생체적합성 생체재료로부터 형성되고, 하부 필름은 상기 마이크로웰의 개방 측면과 함께 상부 필름의 표면 영역을 향하도록 위치된 복수의 마이크로웰을 포함하고, 하부 필름 및 선택적으로 상부 필름의 기공 크기는 기공을 통해 장치 내에서 혈관 형성 또는 혈관 내성장을 허용하는 정도이다.

Description

개방형의 이식 가능한 세포 전달 장치
본 발명은 이식 가능한 세포 전달 장치, 구체적으로 이식된 세포와 숙주 조직의 상호연결을 가능하게 하는 개방형의 이식 가능한 이식 가능한 세포 전달 장치 분야에 관한 것이다. 이러한 장치는 대상체에 췌장 섬 세포와 같은 세포를 이식하는 데 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 장치를 구성하는 방법 및 장치에 세포를 로딩하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 세포를 함유하는 개방형의 이식 가능한 세포 전달 장치를 대상체에 이식하여 질환 또는 장애의 치료시 이의 용도에 관한 것이다.
환자에게 기증자 세포를 이식하는 것은 다양한 질환의 치료를 위한 유망한 도구이다. 예를 들어, 섬 세포는 당뇨병 환자에게 이식될 수 있다. 현재, 임상 섬 이식은 외인성 인슐린 투여가 더 이상 혈당 수치를 조절하는 데 사용할 수 없는 제1형 당뇨병의 가장 심각한 사례를 치료하기 위한 가장 유망한 최소 침습 요법이다. 이 절차 동안, 사망한 기증자의 췌장을 채취하고 췌장 섬을 단리하고 그 후 제1형 당뇨병 환자에게 이식한다. 췌장 자체는 소화 효소의 누출 가능성과 췌장염의 높은 위험으로 인해 췌장 섬에 적합한 이식 부위로 간주되지 않는다. 따라서, 문맥(portal vein)을 통한 섬의 간 전달은 임상 섬 이식의 절대적 표준(golden standard)이었다. 지난 20년 동안 단리 및 이식 프로토콜의 큰 진전에도 불구하고, 40% 미만의 환자가 섬 이식 5년 후에 인슐린 독립성을 보이며, 이는 10년 후에는 30%까지 더 감소한다. 더욱이, 췌장 섬 이식은 이식 후 몇 시간 이내에 이식된 섬의 60%가 손실되는 것과 관련이 있으며, 이는 제1형 당뇨병 환자 한 명을 치료하기 위해 평균 2 내지 3명의 기증자가 필요하다는 것을 설명한다. 시간이 경과함에 따라 섬 질량의 감소는 무엇보다도 기계적 스트레스, 혈관 형성 장애로 인해 섬으로의 산소 흐름 부족 및 간 내 즉각적인 혈액-매개된 면역 반응의 존재에 의해 야기된다. 췌장 내 섬의 산소 장력은 30 내지 40 mm Hg로 보고되며, 췌장의 섬에는 조밀한 모세혈관 네트워크가 포함되어 있기 때문에 동맥혈의 산소 장력(80 내지 100 mm Hg)에 가깝게 증가할 수 있다. 이식된 섬은 대략 14일 내에 혈관재생되는 것으로 알려져 있지만, 심지어 3개월 후 간내 이식된 섬은 상대적으로 낮은 산소 장력(< 10 mm Hg)을 나타낸다. 또한, 통상적으로 사용되는 면역억제제는 경구로 복용되며, 이는 간에서 발견될 약물 수치가 가장 높은 첫 번째 간 통과를 거친다. 이것은 면역억제제가 섬에 독성이 있는 것으로 나타났기 때문에 섬 손상에 기여할 수 있다. 매크로-캡슐화 임플란트(이식 가능한 세포 전달 장치)의 도움을 통해 췌장 섬에 간외 이식 부위를 제공하는 것은 이식 성공을 개선하는 것으로 추정된다.
매크로-캡슐화 이식 가능한 세포 전달 장치에는 두 유형이 있는데: 하나는 매크로분자가 장치에 들어오고 나갈 수 있지만 세포는 그럴 수 없는 '폐쇄형' 면역보호 장치이다. 예를 들어, 장치의 기공 크기를 0.45 미크론 미만으로 제어한다. 기능적 폐쇄형(면역보호) 이식 가능한 세포 전달 장치의 제작은 면역 세포를 차단하는 데 필요한 작은 기공 크기가 또한 영양분, 예를 들어, 인슐린의 확산을 제한하기 때문에 여전히 어려운 과제이다. 다른 그룹은 세포가 장치에 들어가고 나갈 수 있도록 하는 '개방형' 장치로 구성되며, 특히 섬 혈관재생을 자극하는 것을 목표로 한다.
ViaCyte의 VC-02 또는 PEC-Direct 장치와 같이 현재 시판 중이거나 테스트 중인 개방형의 이식 가능한 세포 전달 장치[제1형 당뇨병 및 저혈당증에 대한 인식이 없는 대상체에서 VC-02 복합 제품의 안전성, 내약성 및 효능 연구. https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03163511] 장치의 개방형 특성은 이식 시 세포의 신속한 혈관재생을 자극한다. 이러한 개방형 임플란트를 이식한 후에도 면역억제제를 여전히 사용할 수 있지만, 세포는 덜 적대적인 환경에서 이식될 수 있다. 더욱이, 면역 반응을 회피하도록 세포를 조작하는 경우 면역억제제가 필요하지 않을 수도 있으며, 이는 현재 이 분야에서 개발되고 있다. 이는 잠재적으로 이식에 필요한 기증자 기관의 양을 감소시킬 수 있으며, 섬 세포 이식의 경우 혈당을 더 잘 유지하고, 외인성 인슐린 주사의 필요성을 감소시키거나 없애고, 장기적인 합병증의 위험을 더 낮출 수 있다.
기존 개방형 장치의 단점은 세포가 응집되는 경향이 있다는 것이다. 세포의 응집은 영양분 및 산소의 결핍으로 인해 세포 덩어리의 중심에 있는 세포 괴사를 야기하는 경향이 있다. 응집을 방지하는 방식은 세포(또는 세포 클러스터)를 하이드로겔에 삽입하는 것이다. 그러나, 이 해결책의 단점은 하이드로겔에 삽입하는 것이 영양분 및 단백질의 확산을 다시 방해하여 개방형 장치의 이점을 부분적으로 원상태로 돌린다는 것이다. 따라서, 개선된 개방형 장치가 필요하다.
본 발명자들은 이전에 마우스에서 화학적으로 유발된 당뇨병을 역전시키는 데 성공적으로 사용되었던 개방형 마이크로웰-어레이 섬 전달 전략을 보고하였다(Buitinga, M., et al., Microwell scaffolds for the extrahepatic transplantation of islets of Langerhans. PLoS One, 2013. 8(5): p. e64772; Buitinga, M., et al., Micro-fabricated scaffolds lead to efficient remission of diabetes in mice. Biomaterials, 2017. 135: p. 10-22; 두 참고문헌 모두 그 전체가 본원에 참고로 포함됨). 본원에 기재된 장치는 상기 문제 중 일부를 해결한다. 상기 장치는 2개의 얇은 다공성 중합체 필름으로 구성된다. 하나의 필름에는 이러한 섬 전달 장치의 고유한 특징인 조밀한 배열의 마이크로웰이 각인되어 있다. 다른 필름은 뚜껑 역할을 하여 마이크로웰 내에 시딩된 섬을 가둔다. 전반적으로, 상기 장치는 섬에 물리적 보호를 제공하는 동시에 시트의 기공은 혈관재생을 가능하게 한다. 마이크로웰 구조는 각 마이크로웰에서 개별 섬을 포획할 수 있도록 보장하여 장치 전체에 걸쳐 섬을 균일하게 분포하도록 하고 섬 응집을 방지하여 섬 세포 생존율의 손실을 감소시킨다.
그러나, 마이크로웰-어레이 이식 가능한 세포 전달 장치에는 몇 가지 단점이 있다. 상기 장치는 임상용으로 승인되지 않은 특정 PolyActive™ 조성으로 구성된다. 최근, 이 물질이 세포 내 괴사를 유발할 수 있다는 우려가 제기되어 세포 전달 장치로는 바람직하지 않다. 추가적인 단점은 마이크로웰 패턴의 필름이 상단에 있는 뚜껑을 봉합하여 닫힌다는 것인데, 이는 번거롭고 상대적으로 깨지기 쉬운 장치를 초래한다는 것이다. 더욱이, 상기 장치는 2개의 얇은 멤브레인으로 구성되어 있어 기계적 안정성이 부족하여 장치를 접을 수 있었다. 마지막으로, 인간 환자에게 임상적으로 관련된 치수로 장치를 확대하면 외과적으로 이식하기 어려운 장치 치수를 초래할 것이다.
본 발명은 무엇보다도 첨부된 청구범위에 정의된 바와 같은 개방형 장치에 의해 상기 문제를 해결한다.
제1 양태에서, 본 발명은
- 복수의 기공을 갖는 표면 영역을 갖는 하부 필름;
- 복수의 기공을 갖는 표면을 가지며, 내부 공간을 생성하기 위해 상부 필름이 하부 필름을 실질적으로 덮도록 하부 필름의 상부에 위치하는 상부 필름
을 포함하는, 대상체에 세포를 이식하기 위한 개방형의 이식 가능한 세포 전달 장치에 관한 것이며:
여기서 하부 필름과 상부 필름은 생체적합성 생체재료로부터 형성되고,
하부 필름은 상기 마이크로웰의 개방 측면과 함께 상부 필름의 표면 영역을 향하도록 위치된 복수의 마이크로웰을 포함하고,
하부 필름 및 선택적으로 상부 필름의 기공 크기는 기공을 통해 장치 내에서 혈관 형성 또는 혈관 내성장을 허용하는 정도이다.
제2 양태에서, 본 발명은 질환의 치료, 예방 또는 개선에 사용하기 위한 본 발명의 제1 양태에 따른 개방형의 이식 가능한 세포 전달 장치에 관한 것이다.
제3 양태에서, 본 발명은 개방형의 이식 가능한 세포 전달 장치를 구성하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은: 복수의 기공을 갖는 표면 영역을 가지며 복수의 마이크로웰을 추가로 포함하는 하부 필름을 제공하는 단계; 마이크로웰의 개구부가 상부 필름을 향하도록, 복수의 기공을 갖는 표면 영역을 갖는 상부 필름을 하부 필름에 위치시켜, 마이크로웰과 개방 접촉되는 하부 필름과 상부 필름 사이에 내부 공간을 생성하는 단계; 및 선택적으로, 지지 구조물이 하부 필름과 상부 필름의 가장자리와 적어도 부분적으로 중첩되도록 필름과 동일한 평면에서 하부 필름과 상부 필름의 조립체 주위에 지지 구조물을 실질적으로 위치시키는 단계; 내부 공간에 접근할 수 있는 여러 개의 개구부를 남기도록 하는 등 하부 필름과 상부 필름을 두 곳 이상에서 스폿 용접(spot welding)하여 하부 필름과 상부 필름을 서로 및/또는 지지 구조물에 부착하는 단계를 포함하고, 여기서 하부 필름 및 선택적으로 상부 필름의 기공 크기는 기공을 통해 장치 내에서 혈관 형성 또는 혈관 내성장을 허용하는 정도이다.
제4 양태에서, 본 발명은 본 발명의 제1 양태에 정의되거나 본 발명의 제3 양태에 따른 방법에 의해 수득되거나 수득 가능한 개방형의 이식 가능한 세포 전달 장치에 세포를 시딩하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 세포용 용기를 튜브의 제1 말단과 연결하고, 튜브의 제2 말단을 개방형의 이식 가능한 세포 전달 장치의 개구부를 통해 내부 공간이 용기와 개방되게 연결되도록 내부 공간에 삽입하는 단계; 나머지 개구부가 모두 밀봉되도록 개방형의 이식 가능한 세포 전달 장치의 외부를 클램핑하는 단계; 적합한 배지에 현탁된 세포를 용기에 로딩하는 단계; 세포가 튜브를 통해 용기로부터 개방형의 이식 가능한 세포 전달 장치의 내부 공간으로 유입되도록 하면서 과잉 배지가 기공을 통해 배출되도록 하는 단계를 포함한다.
정의
본 발명의 목적을 위해, 하기 용어들이 이하에 정의된다.
본원에 사용된 바와 같이, 단수형 용어 "A", "an" 및 "the"는 내용에 달리 명백하게 지시하지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "세포"에 대한 언급은 둘 이상의 세포의 조합 등을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "및/또는"은 명시된 경우 중 하나 이상이 단독으로 또는 명시된 경우 중 적어도 하나와 조합하여 최대 모든 명시된 경우와 함께 발생할 수 있는 상황을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "적어도" 특정 값이라는 용어는 그 특정 값 이상을 의미한다. 예를 들어, "적어도 2"는 "2 이상", 즉 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, ..., 등과 동일한 것으로 이해된다. 본원에 사용된 바와 같이, "최대" 특정 값이라는 용어는 특정 값 이하를 의미한다. 예를 들어, "최대 5"는 "5 이하", 즉 5, 4, 3, ....-10, -11 등과 동일한 것으로 이해된다.
본원에 사용된 바와 같이, "포함하다(comprises)" 또는 "포함하는(comprising)"과 같은 단어 "포함하다" 또는 이의 변형은 명시된 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소, 정수 또는 단계의 그룹을 포함하는 것으로 이해될 것이지만, 임의의 다른 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소, 정수 또는 단계의 그룹을 배제하는 것은 아니다. "포함하는"이라는 동사에는 "본질적으로 구성되는" 및 "구성되는"이라는 동사를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "통상적인 기술"은 본 발명의 방법에 사용된 통상적인 기술을 수행하는 방법이 숙련가에게 명백할 상황을 지칭한다. 분자생물학, 생화학, 계산 화학, 세포 배양, 조직 공학, 재생 의학, 재조합 DNA, 생물정보학, 유전체학, 시퀀싱 및 관련 분야에서의 통상적인 기술의 실행은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 다음의 참고문헌에서 논의되어 있다: Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1987 and periodic updates; and the series Methods in Enzymology, Academic Press, San Dieg.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "시험관내"는 자연 조건으로부터 단리된 유기체의 구성요소를 사용하여 수행된 실험 또는 측정을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "대상체" 또는 "개체" 또는 "동물" 또는 "환자" 또는 "포유동물"은 상호 교환적으로 사용되며, 진단, 예후 또는 치료가 필요한 임의의 대상체, 특히 포유류 대상체를 지칭한다. 포유류 대상체에는 인간, 가축, 농장 동물 및 동물원, 스포츠 또는 애완 동물, 예컨대 개, 고양이, 기니피그, 토끼, 래트, 마우스, 말, 소(cattle), 소(cow), 곰 등이 포함된다. 본원에 정의된 바와 같이, 대상체는 살아 있거나 죽었을 수 있다. 샘플은 사후, 즉 사망 후 대상체로부터 채취할 수 있고/있거나, 샘플은 살아 있는 대상체로부터 채취할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 상호 교환적으로 사용되는 "치료", "치료하는", "일시적으로 완화시키는(palliating)", "완화하는" 또는 "개선하는"이라는 용어는 치료적 이익을 포함하지만 이에 제한되지 않는 유익하거나 원하는 결과를 얻기 위한 접근법을 지칭한다. 치료적 이익이란 치료되는 기저 질환의 근절 또는 개선 또는 진행의 감소(또는 지연)를 의미한다. 또한, 환자가 여전히 기저 질환을 앓고 있을 수 있음에도 불구하고, 환자에게서 개선, 둔화 또는 쇠퇴의 감소가 관찰되도록, 기저 질환과 관련된 하나 이상의 생리적 증상의 근절 또는 개선 또는 진행의 감소(또는 지연)를 통해 치료 효과가 달성된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "이식 가능한 세포 전달 장치"는 "이식 장치", "세포 전달 장치", "이식 가능한 장치", "매크로-캡슐화 임플란트" 또는 간단히 "장치" 또는 "임플란트"와 상호 교환적으로 사용되며, 세포를 유지하는 데 적합하고 대상체에게 이식하기 위한 인클로저를 지칭한다. 따라서, 장치는 대상체에게 세포를 이식하는 비히클 역할을 한다. 따라서, 장치는 대상체에게 이식하기에 적합한 재료로 만들어졌으며, 살아 있는 세포를 담기에 적합하도록 장치가 구성된다고 가정할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "개방형"이라는 용어는 이식 가능한 세포 전달 장치를 지칭할 때, 장치가 장치 내에서 혈관 형성 또는 혈관 내성장을 허용하는 하나 이상의 개구부를 갖는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 개구부는 기공을 지칭한다. 따라서, "개방형"이라는 용어는 영양분 확산을 허용하기 위해 존재하는 기공을 지칭한다. 따라서 개방형 장치의 기공 크기는 장치 내에서 혈관 내성장을 허용하는 정도이고 추가로 세포가 장치에 들어가도록 허용한다. 따라서, 개방형 장치는 혈관 내성장과 세포가 장치에 들어가도록 허용하기에 충분히 큰 기공 크기를 갖는 기공을 갖는다. 유사하게, 이식 가능한 세포 전달 장치를 지칭할 때 "폐쇄형"이라는 용어는 장치가 영양분 및 산소의 확산을 허용하지만, 장치 내부의 혈관 형성 또는 세포가 장치 내부로 들어가는 것을 허용하지 않으므로 혈관 형성을 허용하기에는 너무 작은 기공 또는 개구부만을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "혈관 내성장" 및 "혈관 형성"이라는 용어는 상호 교환적으로 사용되며, 새로 발달된 혈관이 적어도 부분적으로 장치의 내부 공간으로 들어가 무엇보다도 영양분 및 산소의 교환을 허용하도록 장치의 개구부를 통한 혈관구조의 혈관신생을 지칭한다.
본원에서 사용될 때, 섬 세포라는 용어는 인슐린을 생산하는 다른 베타 세포 중에서 포함되는, 랑게르한스(Langerhans) 섬으로도 알려진 췌장 섬 세포를 지칭한다.
본원에서 사용될 때, 임플란트 장치에 사용되도록 의도된 세포를 지칭할 때 "세포"라는 용어는 세포 클러스터 또는 오가노이드(organoid)를 지칭한다. 또한, "세포 클러스터"를 언급할 때, 상기 용어는 "오가노이드"를 포함하는 것으로 이해된다. 따라서, 세포를 언급할 때 "클러스터"라는 용어는 "오가노이드" 종의 속으로 간주된다. 따라서, 본원에서 세포 클러스터를 언급할 때 오가노이드도 포함된다.
본원에서 사용될 때, "생체적합성"이라는 용어는 해당 요법의 이식대상자 또는 수혜자에게 어떠한 바람직하지 않은 국소적 또는 전신적 효과도 유발하지 않으면서 의료 요법과 관련하여 원하는 기능을 수행하는 생체재료의 능력을 지칭한다. 바람직하지 않은 국소적 또는 전신적 영향의 비제한적인 예는 생물학적 시스템에 대한 독성 또는 유해한 영향이다.
본원에서 사용될 때, "생체재료"라는 용어는 의학적 목적을 위해 생물학적 시스템과 상호작용하도록 조작된 물질을 지칭한다. 구체적으로, 본원에서 사용될 때, 생체재료는 이식 가능한 세포 전달 장치 또는 이의 개별 구성요소를 지칭한다.
발명의 상세한 설명
본원에 사용된 섹션 제목은 조직적인 목적만을 위한 것이며 설명된 주제를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
본 발명의 일부에는 저작권 보호 대상인 자료(다이어그램, 장치 사진 또는 모든 관할권에서 저작권 보호를 받거나 받을 수 있는 본 제출물의 임의의 기타 양태와 같은 그러나 이에 제한되지 않음)가 포함되어 있다. 저작권 소유자는 특허청 특허 파일 또는 기록에 나타나는 특허 문서 또는 특허 발명을 어느 누군가가 팩스로 복제하는 것에 대하여 이의를 제기하지 않지만, 그렇지 않은 경우에는 모든 저작권을 무엇이든지 보유한다.
본 발명의 방법, 조성물, 용도 및 기타 양태와 관련된 다양한 용어가 명세서 및 청구범위 전체에 걸쳐 사용된다. 이러한 용어는 달리 지시되지 않는 한, 본 발명이 관련된 기술분야에서 통상적인 의미로 부여되어야 한다. 구체적으로 정의된 다른 용어는 본원에 제공된 바와 같은 정의와 일치하는 방식으로 해석되어야 한다. 바람직한 재료 및 방법이 본원에 기재되어 있지만, 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 테스트를 위한 실시에 사용될 수 있다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본 발명은, 예를 들어, 질환을 치료하는 수단으로서 대상체에 세포를 이식하기 위한 개방형의 이식 가능한 세포 전달 장치에 관한 것이다. 이식 요법에 사용될 수 있었던 예시적인 세포는 당뇨병 치료에 사용되는 췌장 섬 세포이지만, 이식에 의한 치료 방법에 사용될 수 있었던 다른 세포도 당업자에게 알려져 있다.
모든 중합체 장치를 이식하면 이물질을 단리하고 그 확산을 방지하기 위해 인체의 마지막 시도로서 섬유층의 형성을 초래할 것이다. 세포 전달 장치 주변의 섬유 조직층을 최소화하는 것은 임플란트를 향한 산소 및 영양분의 확산 거리를 증가시키고 세포를 향한 혈관구조의 내성장을 손상시켜 둘 모두 세포 기능을 감소시킬 것이 때문에 매우 중요하다. 췌장 베타 세포에 대한 생체적합성 생체재료 스크리닝은 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF)가 유망한 후보 중 하나임을 나타내었다. PVDF는 현재 클리닉에서 봉합 재료, 작은 각막 구멍 인레이 및 탈장 복구용 메쉬로서 사용된다. PVDF는 고도로 생체적합성이며 폴리프로필렌과 같은 기존 중합체에 비해 섬유 조직 형성이 적다. 폴리카보네이트(PC), 폴리프로필렌(PP), 폴리(에틸렌 테레프탈레이트(PET), 폴리(염화비닐)(PVC), 폴리아미드(PA), 폴리에틸렌(PE), 폴리이미드(PI), 폴리아크릴레이트, 폴리올레핀, 폴리설폰(PSF), 테트라플루오로에틸렌/폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE), ePTFE(확장 폴리테트라플루오로에틸렌), 폴리에테르설폰(PES), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리(메틸 메타크릴레이트)(PMMA), 폴리(락트산)(PLA) 또는 이들의 조합과 같은 기타 생체적합성 생체재료가 해당 기술분야의 숙련자에게 알려져 있지만 이에 제한되지 않는다.
본원에서 본 발명자들은 임상적으로 관련된 크기의 임플란트로 업스케일링될 수 있는 임상적으로 승인된 PVDF로부터 개방형 마이크로웰-어레이 이식 가능한 세포 전달 장치의 제작을 설명한다. 개념 증명으로, 마우스 크기의 임플란트를 제작하고, 1차 래트 섬에 시딩하고, 7일의 시험관내 배양 동안 섬 생존율 및 베타 세포 기능을 평가하였다. 마우스 크기의 장치의 설계를 래트 크기의 개방형 섬 임플란트로 업스케일링한 다음, 7일의 시험관내 배양 동안 래트 섬 또는 인간 섬 생존율 및 기능에 대해 제작 및 평가하였다.
따라서, 제1 양태에서, 본 발명은 대상체에 세포를 이식하기 위한 개방형의 이식 가능한 세포 전달 장치에 관한 것으로서, - 복수의 기공을 갖는 표면 영역을 갖는 하부 필름; - 복수의 기공을 갖는 표면 영역을 가지며, 내부 공간을 생성하기 위해 상부 필름이 하부 필름을 실질적으로 덮도록 하부 필름의 상부에 위치하는 상부 필름을 포함하며, 여기서 하부 필름과 상부 필름은 생체적합성 생체재료로부터 형성되고, 하부 필름은 상기 마이크로웰의 개방 측면과 함께 상부 필름의 표면 영역을 향하도록 위치된 복수의 마이크로웰을 포함한다. 바람직하게는, 하부 필름 및 선택적으로 상부 필름의 기공 크기는 기공을 통해 장치 내에서 혈관 형성 또는 혈관 내성장을 허용하는 정도이고, 세포가 장치에 들어가도록 허용한다.
일 실시양태에서, 개방형의 이식 가능한 세포 전달 장치는 지지 구조물이 상부 필름과 하부 필름의 표면 영역의 평면에 위치하도록 하부 필름의 표면 영역과 상부 필름의 표면 영역 주위에 실질적으로 위치하는 지지 구조물을 추가로 포함하고, 여기서 하부 필름과 상부 필름은 상부 필름, 하부 필름 및 내부 공간과 주변 사이의 접촉을 허용하는 지지 구조물 사이에 하나 이상의 개구부를 남기도록 하는 등 하나 이상의 위치에서 지지 구조물에 부착된다. 바람직하게는, 지지 구조물은 또한 생체적합성 생체재료로부터 형성된다.
일 실시양태에서, 생체적합성 생체재료는 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF), 폴리카보네이트(PC), 폴리프로필렌(PP), 폴리(에틸렌 테레프탈레이트(PET), 폴리(염화비닐)(PVC), 폴리아미드(PA), 폴리에틸렌(PE), 폴리이미드(PI), 폴리아크릴레이트, 폴리올레핀, 폴리설폰(PSF), 테트라플루오로에틸렌/폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE), ePTFE(확장 폴리테트라플루오로에틸렌), 폴리에테르설폰(PES), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리(메틸 메타크릴레이트)(PMMA), 폴리(락트산)(PLA) 또는 이들의 조합으로부터 선택된다.
많은 이식 부위 또는 이식에서 우려되는 바와 같이, 적절한 (재)혈관 형성이 이식편의 최적의 생존 및 기능을 보장하는 데 필수적이다. 예를 들어, 췌장 섬은 높은 신진대사 활동을 나타내므로 생존을 위해 산소 및 영양분에 빠르게 접근할 필요가 있다. 따라서, 임플란트로의 확산 거리 및 혈관구조 내성장 거리를 둘 모두 감소시키기 위해 전달 장치가 가능한 한 얇고 다공성인 것이 중요하다. 따라서, 본 발명의 목적은 무엇보다도 세포 전달을 실현하기 위해 개방형 매크로-캡슐화 세포 전달 장치를 제작하고, 임플란트 설계를 임상적으로 관련된 장치 치수로 업스케일링하는 것이다.
본원에 기재된 이식 가능한 세포 전달 장치의 독특한 마이크로웰 특징은 장치 내의 섬과 같은 세포 클러스터의 공간적 분포에 대한 제어를 허용하며, 이에 따라 다중 세포 클러스터가 대형 세포 응집체로 추가로 응집되고 응집된 세포 클러스터에서 저산소 코어가 형성되는 것을 효과적으로 방지한다. 여기서는 장치 내의 섬 패킹 밀도를 증가시키기 위해 이상적인 클러스터 대 클러스터(예를 들어, 섬-섬) 거리, 마이크로웰의 과충전 정도 및 다중 마이크로웰 층을 서로 위에 적층할 수 있는 가능성을 평가하였다. 전략은 시험관내 실험과 섬 주변의 국소 산소 수준에 대한 인실리코 모델링의 조합을 통해 조사되었다. 개방형 장치의 업스케일링된 버전의 예측된 장치 치수는 복막 전 부위에서 이식에 적합한 장치 치수와 임상적으로 관련된 섬 번호를 수용할 수 있는 것으로 나타났다. 모델은 섬 기반 매개변수를 기반으로 했지만 원리를 임의의 다른 세포 또는 오가노이드 유형에 적용하여 최적의 장치 치수를 예측할 수 있다.
본 발명에 따른 이식 가능한 세포 전달 장치는 대상체에 세포를 이식하기 위한 것이다. 실시예는 섬 세포를 이식하기 위한 장치에 대한 데이터를 제공하지만, 다른 세포 유형, 세포 유형의 혼합물, 오가노이드 또는 조직 또는 기관(의 일부)이 이식 가능한 세포 전달 장치에 포함될 수 있는 것으로 이해된다. 장치는 대상체에게 이식하기 위한 것이므로 예를 들어, 장치의 치수뿐만 아니라 생체적합성이 있어야 하는 사용되는 재료에 특정 제한이 있다. 치수는 장치를 이식하려는 대상체에 따라 달라질 수 있음을 이해한다. 본원에서 사용될 때, 대상체라는 용어는 설치류, 포유동물 또는 인간과 같은 동물을 지칭할 수 있다. 따라서, 이식 가능한 세포 전달 장치에 대한 크기 제한은, 예를 들어, 인간과 비교할 때 마우스에 대해 상이하지만, 동일한 종 내에서도, 예를 들어, 신체 크기의 차이가 이식 가능한 세포 전달 장치의 크기에 영향을 미칠 수 있다. 장치의 크기는 이식 가능한 세포 전달 장치에 포함되도록 의도된 세포 유형에 의해 추가로 영향을 받는다. 당업자는 무엇보다도 이식될 대상 및 세포 유형을 기반으로 임플란트의 대략적인 원하는 크기를 추정할 수 있다.
본 발명에 따른 이식 가능한 세포 전달 장치는 복수의 기공을 갖는 표면 영역을 갖는 하부 필름 및 복수의 기공을 갖는 표면 영역을 가지며, 내부 공간을 생성하기 위해 상부 필름이 하부 필름을 실질적으로 덮도록 하부 필름의 상부에 위치하는 상부 필름을 포함한다. 하부 필름은 복수의 마이크로웰을 포함하고, 이들 웰의 개구부는 내부 공간을 향한다. 웰은 세포를 보유하기 위한 것이다. 따라서, 내부 공간은 바람직하게는 세포가 장치 내부에서 자유롭게 이동하지 않도록 세포(예를 들어, 세포 클러스터 또는 오가노이드)가 상부 필름에 의해 웰에 어느 정도 제 위치에 고정되어 있다. 상부 필름과 하부 필름 둘 모두는 복수의 구멍(기공)을 가지고 있어 세포를 향하여 영양분 및 산소가 확산되도록 하고, 선택적으로, 세포로부터 분비된 인자를 장치 밖으로 방출한다. 분비된 인자의 비제한적인 예는 인슐린이다. 또한, 기공 크기는 혈관 내성장 및 세포가 장치에 들어가는 것을 허용하기에 충분히 크다.
본원에서 사용될 때, 필름은 얇고 평평한 재료를 지칭한다. 본원에서 사용될 때, 필름의 표면 영역은 그 측면(face side)을 지칭한다. 본원에서 사용될 때, 기공은 필름을 완전히 관통하여, 예를 들어, 필름의 한 면에서 다른 면으로 분자의 통과를 허용하는 필름의 개구부 또는 공동을 지칭한다. 본원에서 사용될 때, 기공은 혈관 내성장 및 세포가 장치에 들어가는 것을 허용하기에 충분히 크다.
본 발명에 따른 이식 가능한 세포 전달 장치는 선택적으로 지지 구조물이 상부 필름과 하부 필름의 표면 영역의 평면에 위치하도록 하부 필름의 표면 영역과 상부 필름의 표면 영역 주위에 실질적으로 위치하는 지지 구조물을 추가로 포함한다. 지지 구조물은, 예를 들어, 타원형 또는 원형일 수 있지만, 임의의 종류의 형상을 가질 수 있는 것으로 이해된다. 이상적으로는, 지지 구조물의 형상이 상부 필름과 하부 필름의 윤곽을 따른다. 예를 들어, 하부 필름과 상부 필름이 타원 형상인 경우, 지지 구조물은 하부 필름과 상부 필름의 가장자리를 따르는 타원 형상 링인 것이 바람직하다. 지지 구조물은 개구부를 가질 수 있고, 예를 들어, 지지 구조물은 U자형일 수도 있는 것으로 이해된다.
장치는 추가 지지 구조물을 포함할 수 있는 것으로 이해된다. 예를 들어, 본 발명에 따른 개방형의 이식 가능한 세포 전달 장치는 하나 이상의 추가 지지 구조물을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 상기 하나 이상의 추가 지지 구조물은 하부 필름과 상부 필름에 대해 더 중앙에 위치한다.
지지 구조물의 기능은 장치에 약간의 강성을 제공하는 것이다. 이식 가능한 세포 전달 장치에서는 어느 정도의 유연성이 바람직하지만, 구조적 무결성이 보장되어야 한다. 하부 필름과 상부 필름은 영양분 및 산소의 확산, 혈관 내성장을 허용해야 하기 때문에 일반적으로 매우 얇고 따라서 취약한 필름의 두께에는 제한이 있다. 지지 구조물(들)은 필름이 찢어지거나 파열되는 것을 방지하는 데 도움이 된다. 또한, 지지 구조물이 포함하면 장치가 접히거나 구부러지는 것을 방지하며, 그렇지 않으면 내부 공간이 증가하여 세포가 웰 밖으로 이동할 수 있다. 따라서, 지지 구조물은 일반적으로 하부 필름과 상부 필름의 두께보다 실질적으로 더 큰 두께를 갖는다. 예를 들어, 상부 필름과 하부 필름의 두께는 각각 개별적으로 5 내지 50 μm 두께, 바람직하게는 10 내지 30 μm, 보다 바람직하게는 약 15 μm일 수 있고, 지지 구조물은 약 75 내지 500 μm 두께, 바람직하게는 100 내지 400 μm, 보다 바람직하게는 약 200 μm 두께일 수 있다.
지지 구조물은 또한 하부 필름과 상부 필름을 부착하기 위한 스캐폴드 역할을 할 수 있다. 필름은 지지 구조물이 필름의 가장자리 사이에 끼워지도록 지지 구조물에 부착될 수 있고, 대안적으로 필름은 지지 구조물의 일면, 예를 들어, 상부 또는 하부 면에 함께 부착될 수 있다. 필름은, 예를 들어, 초음파 용접에 의해 부착될 수 있다. 장치에 지지 구조물이 사용되지 않는 경우 하부 필름과 상부 필름을 서로 직접 부착될 수 있는 것으로 이해된다.
본 발명에 따른 이식 가능한 세포 전달 장치는 하나 이상의 위치에서 지지 구조물에 부착된 하부 필름과 상부 필름을 추가로 갖는다. 하부 필름과 상부 필름은 상부 필름 및/또는 하부 필름과 지지 구조물 사이에 하나 이상의 개구부를 남겨두도록 지지 구조물에 부착될 수 있다. 이러한 개구부의 목적은 이식 가능한 세포 전달 장치의 혈관 형성이 발생할 수 있는 하나 이상의 공간 또는 개구부를 허용하기 위한 것이다. 개방형의 이식 가능한 세포 전달 장치의 이점은 장치 내에서 혈관 형성을 허용하여 영양분 및 산소를 더 잘 교환하고 이식 가능한 세포 전달 장치에서 세포에 의해 분비되는 인자(예를 들어, 인슐린)를 더 잘 흡수할 수 있는 옵션이 있다는 것이다. 따라서, 이식 가능한 세포 전달 장치의 내부 공간은 적어도 복수의 기공 및 필름과 지지 구조물 사이의 하나 이상의 개구부를 통해 외부와 개방적으로 연결된다. 추가적으로 또는 대안적으로, 하부 필름과 상부 필름은 지지 구조물에 완전히 밀봉될 수 있지만(개구부가 남지 않음을 의미함) 기공 크기는 기공이 혈관 형성(및 세포가 장치에 들어갈 수 있음)을 허용하도록 선택된다. 대안적으로, 기공 크기 둘 모두는 혈관 내성장을 허용하기에 충분히 크고, 개구부는 하부 필름과 상부 필름과 지지 구조물 사이에 제공된다.
상부 필름과 하부 필름은 그 자체로 접히는 동일한 필름인 것이 추가로 구상된다. 본원에서 사용될 때, 하부 필름은 마이크로웰을 포함하는 필름으로 정의되며, 결과적으로 커버 필름은 그들의 실제 위치(예를 들어, 상부 또는 하부)에 관계없이 상부 필름으로 간주된다. 두 필름 모두 마이크로웰을 포함하는 경우, 필름 중 어느 하나는 하부 필름으로 간주될 수 있다.
장치는 바람직하게는 생체적합성 생체재료로부터 구성되는 것으로 밝혀졌다. 특히 바람직한 재료는 PVDF인데, 이는 기계적 강도를 유지하면서 다른 적합한 재료에 비해 다공성이 개선되었기 때문이다. 추가의 이점은 PVDF가 생체적합성이 있어 면역 반응을 촉발하거나 장치의 세포에 부정적인 방식으로 영향을 미치지 않는다는 것이다. PVDF는 적합한 재료와 혼합될 수 있으며, 비제한적인 예는 PVP인 것으로 이해된다. 그러나, 장치는 다른 생체 적합성 생체재료로부터 구성될 수도 있는데, 이는 다양한 재료가 특정 용도(예를 들어, 이식 위치, 장치의 크기, 장치 내 세포 유형 등)에 따라 이점을 가질 수 있기 때문이다. 생체적합성 생체재료의 다른 비제한적인 예로는 폴리카보네이트(PC), 폴리프로필렌(PP), 폴리(에틸렌 테레프탈레이트(PET), 폴리(염화비닐)(PVC), 폴리아미드(PA), 폴리에틸렌(PE), 폴리이미드(PI), 폴리아크릴레이트, 폴리올레핀, 폴리설폰(PSF), 테트라플루오로에틸렌/폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE), ePTFE(확장 폴리테트라플루오로에틸렌), 폴리에테르설폰(PES), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리(메틸 메타크릴레이트)(PMMA), 폴리(락트산)(PLA) 또는 이들의 조합이 있다.
마이크로웰은 세포 클러스터 및/또는 오가노이드를 보유하기 위한 것이다. 따라서, 일 실시양태에서, 마이크로웰은 200 내지 1000 μm, 바람직하게는 250 내지 950 μm, 보다 바람직하게는 300 내지 900 μm의 직경을 갖는다. 이상적으로, 웰은 응집체의 중앙에 위치한 세포가 영양분 또는 산소 결핍으로 괴사하기 시작할 정도로 다중 세포 클러스터의 응집을 방지한다. 당업자는 세포 유형, 세포 크기, 세포 클러스터 또는 오가노이드에 따라 웰 크기를 변경할 필요가 있다는 것을 이해할 것이다. "세포 클러스터 및/또는 오가노이드"라는 용어는 배양된 세포 또는 기증자 유기체의 조직 또는 기관으로부터 절제된 세포를 지칭할 수 있는 것으로 이해된다.
특히 매력적인 실시양태에서, 웰 크기는 세포 클러스터가 웰에서 단리되도록 하기 때문에 직경이 대략 300 내지 500 μm, 바람직하게는 350 내지 450 μm, 보다 바람직하게는 약 400 μm이다. 대안적인 매력적인 실시양태에서, 웰은 하이드로겔(하이드로겔 캡슐로도 알려져 있음)에 캡슐화된 세포를 포함할 수 있기 때문에 직경이 600 내지 1000 μm, 바람직하게는 700 내지 900 μm, 보다 바람직하게는 직경이 대략 800 μm이다. 하이드로겔 캡슐화된 세포를 사용하는 것의 이점은 세포를 웰에 고정하여 세포가 떨어지거나 웰에서 멀리 이동하는 것을 방지한다는 것이다. 추가 이점은 면역 체계가 캡슐화된 세포에 도달하는 것을 방지한다는 것이다. 그러나, 하이드로겔 내에서 세포를 벌크 캡슐화하면 혈관구조가 하이드로겔로 성장할 수 없기 때문에 확산 거리가 너무 길어질 가능성이 높을 것이다. 따라서, 하이드로겔 캡슐을 사용하는 것은 면역 체계가 캡슐화된 세포에 도달하는 것을 여전히 방지하면서 짧은 확산 거리를 보장하는 매력적인 대안이다. 그러나, 하이드로겔 캡슐의 주요 단점은 수술 후 위치를 파악하고 회복하기 어렵다는 것이다. 따라서, 하이드로겔 캡슐화(면역 체계에 접근하지 않음)의 이점은 개방형 장치의 이점, 즉 세포 클러스터를 캡슐화하는 작은 하이드로겔 캡슐로 인해 영양분 및 산소의 확산이 증가된 회복 가능한 구조체와 결합될 수 있다. 대부분의 응용 분야의 경우 장치 내 세포에 대한 대상체의 면역 반응은 면역 체계에 의해 세포의 표적화된 파괴를 초래하므로 바람직하지 않다고 가정한다. 그러나, 면역 체계와 장치 내 세포의 상호작용이 바람직한 경우, 하이드로겔을 사용하여 세포를 삽입해서는 안 된다.
하이드로겔 캡슐화된 세포를 사용하는 경우, 하이드로겔은 세포가 장치에서 빠져나가는 것을 방지할 것이기 때문에 기공 크기가 훨씬 더 커질 수 있는 것으로 이해된다. 따라서, 일 실시양태에서, 세포는 하이드로겔에 캡슐화되고, 장치의 하부 필름 및 선택적으로 상부 필름의 기공 크기는 5 내지 200 μm, 예를 들어, 25 내지 200 μm, 50 내지 190 μm, 75 내지 180 μm, 100 내지 170 μm 또는 125 내지 160 μm이다.
일 실시양태에서, 웰은 웰 내부의 세포 클러스터가 대략 300 μm 이격, 예를 들어, 200 내지 400 μm 이격, 바람직하게는 250 내지 350 μm 이격되도록 간격을 두고 있다. 그러나, 세포 클러스터의 간격은 크기에 따라 달라지는 데, 이는 세포 클러스터가 클수록 국소 산소 고갈을 방지하기 위해 더 큰 간격이 필요하다는 것을 의미하는 것으로 이해된다. 예를 들어, 직경이 50 μm인 세포 클러스터의 경우 사실상 간격이 필요하지 않은 반면, 100 μm의 세포 클러스터의 경우 대략 100 μm의 거리로 충분하고, 150 μm의 세포 클러스터의 경우 대략 300 μm의 거리로 충분하다는 것이 밝혀졌다. 직경이 200 μm 이상인 세포 클러스터는 섬-섬 거리에 관계없이 인슐린 고갈을 보여주었다.
상부 필름과 하부 필름의 기공은 혈관 내성장의 결과로서 영양분 및 산소의 확산에 추가하여, 장치 내 세포에 영양분 및 산소의 확산을 허용한다. 또한, 기공은 장치의 내부 공간으로의 혈관 내성장 및 세포가 장치에 들어가는 것을 허용한다. 이상적으로, 기공 크기 및 피치는 구조적 무결성을 유지하고 세포 클러스터가 장치를 빠져나가는 것을 방지하면서 최대 확산 및 혈관 내성장을 허용하도록 선택된다. 따라서, 일 실시양태에서, 하부 필름 및 선택적으로 상부 필름의 기공 크기는 5 내지 100 μm, 바람직하게는 10 내지 80 μm, 보다 바람직하게는 15 내지 60 μm, 가장 바람직하게는 20 내지 55 μm이다. 선택적으로 기공은 다음을 갖는다:
- 10 내지 1000 μm, 예를 들어, 50 또는 100 μm의 평균 피치, 단, 피치는 기공 크기보다 크거나;
- mm2당 25 내지 500개 기공, 바람직하게는 mm2당 40 내지 250개 기공의 평균 기공 밀도.
기공 크기는 장치에 포함된 세포 클러스터 및/또는 오가노이드의 크기에 의해 제한되므로, 바람직하게는 기공 크기는 장치에 포함되도록 의도된 세포 클러스터 또는 오가노이드의 크기를 초과하지 않는 것으로 이해된다. 또한, 세포 클러스터가 하이드로겔 내에 삽입되는 경우, 장치는 세포 클러스터의 크기를 초과하는 더 큰 기공 크기를 허용할 수 있는 것으로 이해된다. 상부 필름과 하부 필름의 기공 크기는 동일하거나 상이할 수 있다. 예를 들어, 장치가 세포가 웰에서 빠져나가는 것을 방지하는 상부 필름과 하부 필름 사이에 메쉬를 포함하는 경우, 상부 필름은 하부 필름의 기공 크기보다 큰 기공 크기를 가질 수 있고, 상부 필름의 기공 크기는 세포(세포 클러스터 또는 오가노이드) 크기를 초과할 수 있다. 후자의 경우, 상부 필름의 기공 크기는 필름의 구조적 무결성에 의해서만 제한된다. 본원에 사용될 대, 기공 크기라는 용어는 그 직경을 지칭한다.
영양분 및 산소의 확산은 장치로의 혈관 내성장에 따라 달라질 뿐만 아니라 기공의 총 표면적에 의해 결정되며, 이는 상부 필름 또는 하부 필름의 기공 크기 및 기공 수의 함수를 의미하는 것으로 이해된다. 따라서, 기공의 피치는, 기공 크기에 따라, 10 내지 1000 μm, 바람직하게는 20 내지 900 μm, 보다 바람직하게는 40 내지 800 μm, 가장 바람직하게는 50 내지 750 μm인 것으로 이해된다. 피치는 기공 크기보다 커야 한다는 것도 추가로 이해된다. 본원에서 사용될 때, 피치는 반복되는 요소의 중심 사이의 거리, 이 경우에는 필름의 기공을 설명하는 데 사용된다. 기공이 다소 고르게 분포되어 있다고 가정된다. 기공이 고르게 분포되어 있지 않은 경우, 피치라는 용어는 인접한 기공 사이의 평균 거리를 지칭한다.
대안적으로, 기공의 수는 평방 mm당 기공의 수(기공 밀도)로 표현될 수 있다. 기공 크기에 따라, 기공 밀도는 mm2당 25 내지 600개, 보다 바람직하게는 25 내지 500개, 보다 바람직하게는 40 내지 550개, 보다 바람직하게는 40 내지 400개, 더욱 바람직하게는 50 내지 500개, 더욱 더 바람직하게는 50 내지 300개, 더욱 더 바람직하게는 75 내지 450개 또는 75 내지 300개의 기공이다.
일 실시양태에서, 마이크로웰은 세포 클러스터 및/또는 오가노이드를 포함하고, 바람직하게는 세포 클러스터는 내분비 세포 또는 사이토카인 생산 세포 또는 이의 클러스터이고, 바람직하게는 세포 클러스터는 섬 세포, 신장 세포, 갑상선 세포, 흉선 세포, 고환 세포, 췌장 세포로부터 선택되거나, 바람직하게는 오가노이드는 장 오가노이드, 위 오가노이드, 갑상선 오가노이드, 흉선 오가노이드, 고환 오가노이드, 간 오가노이드, 췌장 오가노이드, 상피 오가노이드, 폐 오가노이드, 신장 오가노이드, 위배체(배아 오가노이드), 배반포 유사체(blastoid)(배반포-유사 오가노이드), 심장 오가노이드, 망막 오가노이드 또는 교모세포종 오가노이드로부터 선택된다. 세포 클러스터는 또한, 예를 들어, 기증자 유기체로부터 얻은 조직 또는 기관의 절제된 조각을 지칭할 수 있다. 대안적으로, 세포 클러스터 또는 오가노이드는 유도만능 줄기 세포와 같은 세포주 또는 줄기 세포로부터 수득할 수 있지만 이에 제한되지 않는다.
장치는 호르몬 또는 사이토카인 또는 임의의 치료 단백질과 같은 물질을 분비하는 세포를 대상체에게 이식하는 데 특히 적합한 것으로 구상된다. 따라서, 세포 클러스터 및/또는 오가노이드는 바람직하게는 내분비 또는 사이토카인 생산 세포를 포함하거나 이로 구성된다.
일 실시양태에서, 마이크로웰 내에 함유된 세포 클러스터 또는 오가노이드는 40 내지 300 μm, 바람직하게는 50 내지 250 μm의 직경을 갖는다. 이상적으로 마이크로웰은 각각 하나의 세포 클러스터 또는 오가노이드를 포함하므로 실질적으로 모든 마이크로웰이 적어도 단일 세포 클러스터 또는 오가노이드를 포함할 때, 장치 내의 공간을 효율적으로 사용하기 위해 세포 클러스터 또는 오가노이드는 바람직하게는 직경이 150 내지 300 μm, 바람직하게는 200 및 250 μm인 것으로 이해된다. 대안적으로, 마이크로웰은 다중 세포 클러스터 또는 오가노이드로 채워질 수 있지만, 국소 산소 고갈을 방지하기 위해 세포 클러스터 또는 오가노이드 크기는 더 작게 유지되는 것이 바람직하다는 것이 이해된다. 예를 들어, 마이크로웰이 2개의 세포 클러스터 또는 오가노이드를 포함하는 경우, 직경은 바람직하게는 40 내지 150 μm, 보다 바람직하고, 50 내지 100 μm 크기이다. 마이크로웰당 3개 또는 4개의 세포 클러스터 또는 오가노이드를 함유하는 경우, 직경은 바람직하게는 40 내지 120 μm, 바람직하게는 50 내지 100 μm 크기이다.
대안적인 바람직한 실시양태에서, 마이크로웰은 600 내지 1000 μm, 바람직하게는 700 내지 900 μm, 보다 바람직하게는 750 내지 850 μm의 직경을 갖는다. 이러한 큰 웰 직경은 세포 클러스터 및/또는 오가노이드가 하이드로겔에 의해 캡슐화되거나 세포 클러스터 또는 오가노이드의 크기가 커서 큰 웰이 필요한 상황에 유용하다.
장치를 제조하기 위한 재료로서 PVDF를 사용하는 추가적인 이점은 스폿 용접이 가능하다는 것이다. 따라서, 일 실시양태에서, 상부 필름과 하부 필름은 스폿 용접에 의해 지지 구조물에 부착된다. 스폿 용접은 면역 체계를 유발하거나 생체적합성이 없거나 심지어 독성이 있을 수 있거나 시간이 경과함에 따라 용해되어 장치의 구조적 고장을 초래할 수 있는 접착제와 같은 추가 재료를 사용할 필요가 없다는 이점이 있다.
이미징을 위한 마커가 장치 내에 또는 장치 상에 포함되는 것이 추가로 구상된다. 이는 수술 절차의 필요 없이 대상체에게 장치를 위치시킬 수 있어 유리할 수 있다. 따라서, 일 실시양태에서, 장치는 이미징을 위한 하나 이상의 마커를 포함하고, 바람직하게는 상기 하나 이상의 마커는 상부 필름, 하부 필름 및/또는 지지 구조물의 PVDF에 주입되거나 그 위에 코팅되는 방사선 불투과제(radiopacifier)를 포함하고, 보다 바람직하게는 상기 방사선 불투과제는 황산바륨과 같은 바륨계, 삼산화비스무트, 아탄산비스무트 또는 옥시염화비스무트와 같은 비스무트계이거나, 방사선 불투과제는 텅스텐 또는 산화그래핀이다.
본원에서 사용될 때, 방사선 조영 물질로도 지칭되는 방사선 불투과제는 전자기 스펙트럼의 방사선 및 x선 파 부분에 대해 불투명한 물질이며, 이는 이러한 종류의 전자기 방사선이 특정 물질을 통과할 수 있는 상대적인 능력이 없음을 의미한다. 방사선 조영 물질의 비제한적인 예로는 티타늄, 텅스텐, 황산바륨, 산화비스무트 및 산화지르코늄이 포함된다. 일부 해결책은 중원소(heavy element), 예를 들어, 요오드를 중합체 사슬에 직접 결합하는 것을 포함한다.
장치에 약물을 포함하는 것이 유리할 수 있다는 것이 추가로 구상된다. 따라서, 일 실시양태에서, 장치는 상부 필름, 하부 필름 및/또는 지지 구조물의 PVDF에 주입되거나 그 위 코팅되는(예를 들어, 장치를 약물의 용액에 침지시킴으로써) 약물을 포함한다. 예를 들어, 장치는 면역 체계에 의한 장치 내 세포의 분해를 방지하기 위해 면역 억제제 또는 섬유증 반응을 감소시키는 약물로 코팅될 수 있다. 대안적으로, 대상체에게 치료 옵션으로 장치를 이식하는 경우 치료 약물이 공동 치료로서 포함될 수 있다. 비제한적인 예로는 암 치료를 위한 화학요법제, 면역관문 억제제, 수술 후 초기에 세포 클러스터 및/또는 오가노이드 생존을 돕는 세포 스트레스 억제제, 또는 수술 후 임플란트를 추적하기 위한 이미징 마커가 있다. 장치에 혈관 내성장을 촉진하기 위해 혈관생성 인자를 포함하는 것이 추가로 구상된다.
장치의 크기는 의도된 응용 분야(예를 들어, 치료 방법 또는 장치에 포함된 세포의 유형)에 따라 그리고 대상체에 기반하여 확장될 수 있는 것으로 이해된다. 인간 대상체에게 이식하기 위한 장치가 설치류에 이식되도록 의도된 장치보다 커야 한다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 장치는 본질적으로 2차원이기 때문에 웰이 있는 단일 평면으로 존재한다는 것을 의미하므로 일부 응용 분야의 경우 인간과 같은 더 큰 포유동물에서 장치를 비실용적인 크기로 확장해야 할 것으로 예상된다. 이론적으로는 여러 개의 작은 버전의 장치를 사용할 수 있지만 실제로는 동일하거나 상이한 위치에 여러 개의 장치를 이식하는 것은 바람직하지 않다. 따라서, 여러 개의 작은 버전의 장치를 함께 적층할 수 있는 것이 추가로 구상된다. 따라서, 일 실시양태에서, 장치는 서로의 상부에 적층되고 스페이서에 의해 분리된 본원에 정의된 바와 같은 개방형의 이식 가능한 세포 전달 장치의 2개 이상의 적층형 버전을 포함한다. 스페이서는 본질적으로 개별 장치 사이의 거리를 만드는 기능을 한다. 따라서, 일 실시양태에서, 스페이서는 상이한 적층형 장치 사이에 200 내지 800 μm, 바람직하게는 250 내지 700 μm, 더욱 바람직하게는 250 내지 650 μm의 간격을 허용한다. 두 장치의 스택을 사용할 때 장치 사이에 250 내지 350 μm의 간격으로 충분하다는 것이 밝혀졌다. 그러나, 더 많은, 예를 들어, 3개 이상의 적층된 장치를 사용하는 경우, 간격을 늘리는 것이 유리할 수 있으므로, 장치가 장치의 3개 이상의 적층형 버전을 포함하는 경우, 간격은 바람직하게는 250 내지 750 μm, 보다 바람직하게는 300 내지 700 μm, 400 내지 650 μm 또는 심지어 450 내지 600 μm이다. 보다 바람직한 실시양태에서, 장치는 본원에 정의된 바와 같은 개방형의 이식 가능한 세포 전달 장치의 2개의 적층형 버전을 포함하는 데, 이는 2개의 적층체를 사용하는 것이 장치에서 세포 밀도를 증가시키면서 세포의 최적 산소화를 허용하는 것으로 밝혀졌기 때문이다.
세포에 대한 영양분 및 산소의 적절한 확산이 보장되는 한, 원칙적으로 2개 이상의 장치를 적층하여 세포에 보다 컴팩트한 디자인을 얻을 수 있다. 이것은 특히 중간층에 대해 3개 이상의 층이 적층될 때 관련이 있다. 따라서, 적층된 층은 스페이서에 의해 분리되어야 한다는 것이 본 발명자들에 의해 발견된다. 바람직하게는, 스페이서는 층 사이의 공간이 스페이서에 의해 완전히 둘러싸이지 않도록 구성된다. 따라서, 여러 개의 작은 스페이서를 사용하거나 스페이서에 개구부가 있을 수 있다. 스페이서는 추가적인 지지 구조물로서 간주될 수 있으므로, 본원에서 사용될 때 스페이서는 또한 "추가 지지 구조물"로 지칭될 수 있다. 바람직하게는, 스페이서는 또한 생체적합성을 보장하기 위해 PVDF로부터 구성된다. 지지 구조물과 스페이서(들)(추가 지지 구조물)는 하나의 연속 구조인 것으로 추가로 구상된다.
장치는 의학적 방법 또는 치료 방법으로 사용될 수 있다는 것이 구상된다. 따라서, 제2 양태에서, 본 발명은 질환의 치료, 예방 또는 개선에 사용하기 위한 본 발명에 따른 개방형의 이식 가능한 세포 전달 장치에 관한 것이다. 장치는 바람직하게는 세포, 보다 바람직하게는 세포 클러스터 또는 오가노이드를 포함하므로, 일 실시양태에서, 본 발명은 질환의 치료, 예방 또는 개선에 사용하기 위해 본 발명에 따른 세포, 바람직하게는 세포 클러스터 및/또는 오가노이드를 포함하는 개방형의 이식 가능한 세포 전달 장치에 관한 것이다. 대안적으로, 본 발명은 대상체의 질환 또는 병태를 치료, 예방 또는 개선하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 세포, 바람직하게는 세포 클러스터 또는 오가노이드를 포함하는 장치를 대상체에 이식하는 단계를 포함한다.
장치에 대한 몇 가지 치료 옵션이 구상된다. 예를 들어, 장치는 당뇨병 치료에 사용될 수 있다. 따라서, 일 실시양태에서, 치료는 당뇨병, 바람직하게는 제1형 당뇨병의 치료이다. 바람직하게는, 치료가 당뇨병의 치료인 경우, 장치는 인슐린 분비 세포, 예컨대 섬 세포 또는 인슐린을 분비하도록 조작된 세포를 포함한다.
그러나, 장치가 모든 유형의 세포, 세포 클러스터 또는 오가노이드를 통합을 허용하기 때문에 장치의 사용이 당뇨병 치료에만 제한되지 않는다는 것이 당업자에게 분명할 것이다. 개방형 장치는 혈관구조의 내성장을 허용하기 때문에 외인성 인자의 투여가 바람직한 치료 옵션에 특히 적합하다. 외인성 인자의 비제한적인 예로는 펩티드 및 단백질, 예컨대 인슐린, 글루카곤, 사이토카인, 성장 인자, 호르몬, 탄수화물, 및 응고 인자가 포함된다.
따라서, 장치는 면역 관련 장애, 예컨대 다발성 골수종, 흑색종, 류마티스 관절염, 염증성 장 질환, 루푸스, 경피증, 용혈성 빈혈, 혈관염, 제1형 당뇨병, 그레이브스병(Graves' disease), 다발성 경화증, 굿파스처 증후군(Goodpasture syndrome), 악성 빈혈, 근육병증, 라임병(Lyme disease), 중증 복합 면역결핍증(SCID: Severe combined immunodeficiency), 디조지 증후군(DiGeorge syndrome), 고면역글로불린 E 증후군(잡 증후군(Job's Syndrome)으로도 알려져 있음), 공통 가변성 면역 결핍증(CVID: Common variable immunodeficiency), 만성 육아종성 질환(CGD: Chronic granulomatous disease), 위스콧-알드리치 증후군(WAS: Wiskott-Aldrich syndrome), 자가면역 림프증식 증후군(ALPS: Autoimmune lymphoproliferative syndrome), 고 IgM 증후군, 백혈구 부착 결핍증(LAD: Leukocyte adhesion deficiency), NF-κB 필수 변형자(NEMO: NF-κB Essential Modifier) 돌연변이, 선택적 면역글로불린 A 결핍증, X-연관 무감마글로불린혈증(X-linked agammaglobulinemia)(XLA; 브루톤형 무감마글로불린혈증으로도 알려져 있음), X-연관 림프증식성 질환(XLP: X-linked lymphoproliferative disease), 운동실조증-모세혈관확장증 또는 후천성 면역결핍증후군(AIDS: Acquired immunodeficiency syndrome)의 치료에 사용될 수 있다. 또한, 장치는 암과 같은 성장 인자 관련 질환의 치료에 사용될 수 있다. 또한, 장치는 호르몬 또는 내분비 관련 장애, 예컨대 부신 기능 부전, 애디슨병(Addison's disease), 쿠싱병(Cushing's disease), 쿠싱 증후군, 거대증(말단비대증), 갑상선 기능 항진증, 그레이브스병, 갑상선 기능 저하증, 뇌하수체 기능 저하증, 다발성 내분비 종양 I 및 II(MEN I 및 MEN II), 다낭성 난소 증후군(PCOS: Polycystic ovary syndrome) 또는 성조숙증에 사용될 수 있다. 또한, 장치는 응고 장애, 예컨대 인자 V 라이덴, 프로트롬빈 유전자 돌연변이, 응고를 방지하는 천연 단백질의 결핍(예컨대 항트롬빈, 단백질 C 및 단백질 S), 호모시스테인 수치 상승, 피브리노겐 또는 기능 장애 피브리노겐의 상승된 수치(이상섬유소원혈증(dysfibrinogenemia)), 인자 VIII 및 인자 IX 및 XI를 포함하는 기타 인자의 상승된 수치, 저플라스미노겐혈증, 이상플라스미노겐혈증(dysplasminogenemia) 및 플라스미노겐 활성제 억제제(PAI-1) 수준 상승을 포함한 비정상적인 섬유소용해 체계, 암, 비만, 임신, 경구 피임약(contraceptive pill)(피임약(birth control pill))을 포함한 에스트로겐 보충 사용, 호르몬 대체 요법, 장기간 침상 안정 또는 부동 상태, 심장마비, 울혈성 심부전, 뇌졸중 및 활동 감소를 초래하는 기타 질병, 헤파린 유발 혈소판 감소증, 항인지질 항체 증후군, 심부정맥 혈전증 또는 폐색전증의 과거 병력, 골수증식성 장애, 예컨대 진성적혈구증가증 또는 본태성 혈소판증가증, 발작성 야간 혈색소뇨증, 염증성 장 증후군, HIV/AIDS 또는 신증후군의 치료에 사용될 수 있다.
제3 양태에서, 본 발명은 개방형의 이식 가능한 세포 전달 장치를 구성하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 복수의 기공을 갖는 표면 영역을 가지며 복수의 마이크로웰을 추가로 포함하는 하부 필름을 제공하는 단계; 마이크로웰의 개구부가 상부 필름을 향하도록, 복수의 기공을 갖는 표면 영역을 갖는 상부 필름을 하부 필름에 위치시켜, 마이크로웰과 개방 접촉되는 하부 필름과 상부 필름 사이에 내부 공간을 생성하는 단계; 지지 구조물이 하부 필름과 상부 필름의 가장자리와 적어도 부분적으로 중첩되도록 필름과 동일한 평면에서 하부 필름과 상부 필름의 조립체 주위에 지지 구조물을 실질적으로 위치시키는 단계; 내부 공간에 접근할 수 있는 여러 개의 개구부를 남기도록 하는 등 하부 필름과 상부 필름을 두 곳 이상에서 스폿 용접하여 하부 필름과 상부 필름을 지지 구조물에 부착하는 단계를 포함한다. 하부 필름 및 선택적으로 상부 필름의 기공 크기는 기공을 통해 장치 내에서 혈관 형성 또는 혈관 내성장을 허용하는 정도이다. 기공 크기는 또한 세포가 장치에 들어갈 수 있도록 한다.
본원에서 사용될 때 용어 "스폿 용접"은 바람직하게는 초음파 스폿 용접을 지칭한다. 초음파 스폿 용접은 고주파 초음파 음향 진동이 압력 하에서 함께 유지되는 공작물에 국부적으로 적용되어 고체 상태 용접을 만드는 산업 공정이다. 일반적으로 플라스틱에 사용된다.
일 실시양태에서, 하부 필름과 상부 필름은 2개 이상, 바람직하게는 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상, 예컨대 3 내지 50개, 4 내지 40개, 5 내지 30개, 6 내지 25개, 7 내지 20개 또는 8 내지 15개의 스폿 용접부로 지지 구조물에 부착된다. 용접부의 양은 장치의 크기에 의해 정의되며, 개구부가 혈관 내성장(웰의 간격으로 인해)을 위해 충분히 크게 유지되지만 구조적 무결성을 보장할 수 있을 만큼 충분히 작도록 선택되어야 한다는 것이 이해된다.
하부층의 마이크로웰은 PVDF가 열성형 공정에 특히 적합하기 때문에 (마이크로-) 열성형에 의해 형성될 수 있다.
본 발명자들은 웰을 포함하는 임의의 다른 개방형의 이식 가능한 세포 전달 장치를 알지 못한다. 그 이유는 셀을 장치에 로딩할 수 있는 방법이 간단하지 않은 것과 같이 그러한 장치의 구성에 몇 가지 장애물이 있을 수 있기 때문이다. 한 가지 방법은 장치를 조립하기 전에 하부층에 세포를 시딩하는 것이지만, 장치가 최종 사용자에게 조립된 형태로 배송되는 것이 바람직하기 때문에 몇 가지 비실용적인 점이 있다. 더욱이, 세포 근처의 중합체 층을 용접하면 세포 생존율이 심각하게 손실될 것이다. 이러한 문제점을 극복하기 위해, 본 발명자들은 시딩 후 장치의 조립을 필요로 하지 않는 장치의 시딩 방법을 개발하였는데, 이는 장치가 완전히 조립되었을 때 시딩되는 것을 의미한다. 따라서, 제4 양태에서, 본 발명은 제1 양태에 정의된 바와 같거나 제3 양태에 따른 방법에 의해 수득되거나 수득될 수 있는 개방형의 이식 가능한 세포 전달 장치에 세포를 시딩하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 세포용 용기를 튜브의 제1 말단과 연결하고, 튜브의 제2 말단을 개방형의 이식 가능한 세포 전달 장치의 개구부를 통해 내부 공간이 상기 용기와 개방되게 연결되도록 내부 공간에 삽입하는 단계; 나머지 개구부가 모두 밀봉되도록 개방형의 이식 가능한 세포 전달 장치의 외부를 클램핑하는 단계; 적합한 배지에 현탁된 세포 또는 세포 클러스터를 용기에 로딩하는 단계; 세포가 튜브를 통해 용기로부터 개방형의 이식 가능한 세포 전달 장치의 내부 공간으로 유입되도록 하면서 과잉 배지가 기공을 통해 배출되도록 하는 단계를 포함한다.
단일 개구부를 제외하고 상부층과 하부층 사이의 개구부를 클램핑함으로써 세포 현탁액이 장치 내 중력 흐름에 의해 배출될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 이를 가능하게 하기 위해, 세포 현탁액은 용기에 담아 튜브를 통해 천천히 배출되고, 여기서 튜브의 다른 말단은 장치 내부(상부 필름과 하부 필름 사이)의 단일 개구부를 통해 삽입된다. 액체가 장치의 기공을 통해 배출될 수 있기 때문에 세포 현탁액은 중력을 통해 간단히 흘러 액체가 배출되는 동안 세포가 장치의 마이크로웰에 침착될 수 있다. 상기 방법은 시딩 동안 세포가 손실되는 것을 효과적으로 방지한다. 중력 대신에 펌프 또는 주사기를 사용하여 장치에 세포 현탁액을 삽입할 수도 있는 것으로 이해된다.
따라서, 일 실시양태에서, 세포는 중력에 의해 튜브를 통해 개방형의 이식 가능한 세포 전달 장치의 내부 공간 내로 흘러들어가도록 한다.
마이크로웰 크기, 기공 크기, 세포 클러스터 또는 오가노이드 직경, 스페이서 크기 또는 웰 거리에 대해 본원에 제공된 바람직한 수는 섬 세포 클러스터로 얻은 데이터를 기반으로 하는 것으로 이해된다. 이 데이터는 다양한 세포 유형의 클러스터 또는 오가노이드 외삽될 수 있지만 이상적인 값이 상이할 수 있다. 특정 세포 또는 오가노이드 유형에 대한 마이크로웰 크기, 기공 크기, 세포 클러스터 또는 오가노이드 직경, 스페이서 크기 또는 웰 거리에 대한 이상적인 매개변수를 얻기 위해 본원, 특히 하기 실시예 2에 기재된 방법을 다양한 세포 유형에 맞게 적용할 수 있다는 것을 당업자는 알고 있다.
도 1: 섬 캡슐화를 위한 다공성의 열성형 마이크로웰-어레이 하부 필름을 생성하기 위한 중합체 필름의 단계별 미세제작 처리 단계. (상단 줄) 용매-주조된 PVDF에 이어 (하단 줄) PVDF 필름의 레이저-드릴링 및 열성형(E, F)의 주사 전자 현미경(SEM) 이미지. 뷰는 유리면(A), 공기면(B), 상단(D, E) 및 단면(C, F)이다. (G, H) 미세-열성형 전(G)과 후(H)의 PVDF 및 PolyActive 둘 모두의 평균 기공 크기뿐만 아니라 미세-열성형 필름(I)의 웰 깊이의 정량화. 데이터는 평균 ± SD로 표시되고, * p < 0.05이다.
도 2: 개방형 PVDF 마이크로웰-어레이 임플란트 조립. A) 다공성 뚜껑(왼쪽 상단, 평면도), 마이크로웰-어레이 열성형 필름(오른쪽 상단, 단면), 지지 링 표면(왼쪽 하단, 평면도) 및 초음파 용접 포인트 시일(오른쪽 하단, 평면도)에 자세히 설명된 세부 사항이 있는 임플란트 디자인의 단면(중앙)의 주사 전자 현미경(SEM) 현미경 사진에 세부 묘사가 있는 임플란트 설계(중앙)의 단면. B) 직경 8 mm의 영역에 300개의 마이크로웰이 포함된 마우스 크기의 임플란트(4개 지점에서 밀봉됨). 삽입물은 이 마우스 크기의 임플란트 내에 시딩된 래트 섬의 분포를 도시한다. (C) 파손 응력 (D) 피크 응력 (E) 파손 변형률 및 (F) 중합체 박막(N = 10)의 영률(Young's modulus) 및 필름과 지지 링(N=6) 사이의 초음파(US) 용접 시일. 데이터는 평균 ± SD로 표시된다.
도 3: 래트 섬은 마우스 크기의 임플란트에서 7일에 걸쳐 배양하여 생존 가능하고 기능적으로 유지된다. (A-I) 1일차(상단 줄)와 7일차(중간 줄)에 자유-부유 대조군으로 배양된 섬 및 7일차에 임플란트(하단 줄)에서 배양된 섬의 살아있는/죽은 염색. 형광 현미경 이미지(왼쪽 열 2개)는 살아있는(녹색; A, D, G) 및 죽은(빨간색; B, E, H) 섬을 나타낸다. 명시야 현미경(C, F, I)은 배양 환경에서 섬을 나타낸다. (J) 섬의 살아있는/죽은 염색(A-I)의 정량화는 7일차에 자유-부유 대조군과 비교하여 임플란트에 시딩된 것들에 대해 유사한 생존율을 나타낸다. (K) 섬이 1.67 mM, 16.7 mM 및 1.67 mM 글루코스에서 교대로 배양되는 글루코스-자극 인슐린 분비(GSIS: glucose-stimulated insulin secretion) 테스트 동안 래트 섬의 분비된 인슐린. (L) 시간 경과에 따른 래트 섬의 자극 지수(stimulation index). 자극 지수 > 2(빨간색 선)를 표시하는 섬은 기능적인 것으로 간주된다. 데이터(생존율에 대해 > 10개, 인슐린 분비에 대해 n = 3)는 평균 ± SD로 표시되고, * p < 0.05이다.
도 4: 개방형의 이식 가능한 세포 전달 장치의 대형 동물 및 인간 크기의 임플란트로 업스케일링. 임플란트 치수는 래트-(3000 IEQ 보유), 미니 돼지-(13,000 IEQ 보유) 및 인간 크기 임플란트(200,000, 450,000 또는 700,000 IEQ 보유)로 확대되었다. 임플란트 치수는 단경(minor diameter)× 장경(major diameter)으로 주어진다. 기본 격자 패턴의 각 사각형은 1 cm2를 나타낸다. 섬이 1 IEQ/웰(검은색)을 갖는 하나의 임플란트, 2 IEQ/웰(회색)을 갖는 하나의 임플란트 또는 2 IEQ/웰(흰색)을 갖는 2개의 임플란트를 통해 분포되어 있는 여러 임플란트 치수를 나타낸다.
도 5: 래트 섬은 래트 크기의 임플란트에서 7일에 걸쳐 배양하여 생존 가능하고 기능적으로 유지된다. (A-F) 대조군 배양 7일차의 살아있는/죽은 염색(자유-부유 섬, 상단 줄) 및 임플란트에서 500 IEQ/cm2(300 IEQ/mL)의 밀도로 배양된 섬(두 번째 줄). 형광 현미경 이미지(왼쪽 열 2개)는 살아있는(녹색; A, D) 및 죽은(빨간색; B, E) 섬을 나타낸다. 명시야 현미경(C, F)은 배양 환경에서 섬을 나타낸다. G) 섬의 살아있는/죽은 염색(A-F)의 정량화는 7일차에 자유-부유 대조군과 비교하여 임플란트에 시딩된 것들에 대해 유사한 생존율을 나타낸다. H) 섬이 1.67 mM, 16.7 mM 및 1.67 mM 글루코스에서 교대로 배양되는 글루코스-자극 인슐린 분비(GSIS) 테스트 동안 래트 섬의 분비된 인슐린. I) 시간 경과에 따른 래트 섬의 자극 지수. 자극 지수 > 2(빨간색 선)를 표시하는 섬은 기능적인 것으로 간주된다. 데이터(생존율에 대해 > 10개, 인슐린 분비에 대해 n = 3)는 평균 ± SD로 표시되고, * p < 0.05이다.
도 6: 인간 섬은 래트 크기의 임플란트에서 7일 걸쳐 배양하여 생존 가능하고 기능적으로 유지된다. (A-I) 150 IEQ/cm2(상단 줄)의 대조군(자유-부유 섬), 600 IEQ/cm2의 대조군(두 번째 줄) 및 임플란트(세 번째 줄)에서 600 IEQ/cm2의 밀도로 배양된 섬의 배양 7일차에 살아 있는/죽은 염색. 형광 현미경 이미지(왼쪽 열 2개)는 살아있는(녹색; A, D, G) 및 죽은(빨간색; B, E, H) 섬 세포를 나타낸다. 명시야 현미경(C, F, I)은 배양 환경에서 섬을 나타낸다. J) 섬의 살아있는/죽은 염색(A-I)의 정량화는 1일차와 7일차에 자유-부유 대조군과 비교하여 임플란트에 시딩된 것들에 대해 유사한 생존율을 나타낸다. K) 섬이 1.67 mM, 16.7 mM 및 1.67 mM 글루코스에서 교대로 배양되는 글루코스-자극 인슐린 분비(GSIS) 테스트 동안 인간 섬의 분비된 인슐린. L) 시간 경과에 따른 래트 섬의 자극 지수. 자극 지수 > 2(빨간색 선)를 표시하는 섬은 기능적인 것으로 간주된다. 데이터(생존율에 대해 > 10개의 섬, 인슐린 분비에 대해 n = 3개의 샘플)는 평균 ± SD로 표시되고, * p < 0.05이다.
도 7: 초음파 용접을 통한 임플란트 조립 공정. A) Branson LPX 수동 초음파 용접 시스템. B) 열성형 PVDF 필름과 다공성 PVDF 뚜껑으로 덮은 지지 링이 있는 개방형 임플란트(1)의 조립을 묘사하는 초음파(미국) 용접 절차. 수동 용접기 끝에 있는 소노트로드(sonotrode)는 40 kHz에서 고주파 초음파 음향 진동을 발생시켜 중합체 필름으로 변환되어 국부적 용융(2)을 유도하고 이에 따라 PVDF 필름(3)의 어닐링을 유도한다. (C, D) 스테인레스강 바닥 및 테프론 상단으로 구성된 마우스 크기(C) 및 래트 크기(D) 임플란트용 US 용접 가이드. 빨간색 원통은 US 용접기의 끝을 나타낸다. E, F) 이러한 금형을 사용하여 생산된 실제 US-용접 임플란트: E) 4-포인트 밀봉된 마우스 크기 임플란트 및 F) 7-포인트 밀봉된 래트 크기의 임플란트.
도 8: 개방형 세포 전달 장치에 대한 시딩 절차. (A) 레토르트 스탠드 및 뷰렛 클램프, 셀 용기(주사기), 스톱 콕(stop cock), 공급 카테터 및 세포 시딩 클램프를 포함한 중력 기반 세포 시딩을 위한 세포 시딩 설정. (B) (상단) 시딩 주입구를 통해 삽입된 공급 카테터, (중간) 유체가 포인트 시일 사이의 큰 개구부에서 저항이 가장 적은 경로를 따르기 때문에 세포 손실을 초래하는 외부 경계를 클램핑하지 않고 세포를 시딩, (하단) 장치 외부에서 세포 손실을 방지하는 시딩 클램프를 사용한 세포 시딩이 있는 장치의 평면도. (C) 클램프를 조이기 위한 나사와 윙너트를 포함한 시딩 도구의 구성요소. 클램프는 실리콘 링용 컷아웃(cutout)을 고정하여 개방형 세포 전달 장치를 단단하지만 부드럽게 클램핑하는 것을 보장한다. 너트를 시드 유입구에 가까운 나사에 배치하여 기울기를 만들어 시드 유입구를 통한 유체 손실을 방지한다. (D) 마우스 크기 또는 (E) 래트 크기의 개방형 세포 전달 장치용 시딩 클램프의 예.
도 9: PVDF의 레이저-미세가공은 PVDF 필름의 화학 조성을 태우지 않는다. (A) EDX가 수행된 위치의 후방 산란 이미지. PVDF 필름의 탄소 및 불소 함량은 원자%(B) 또는 중량%(C)로 표시된다. 탄소 함량이 증가하지 않는다는 것은 재료가 연소되지 않음을 나타낸다.
도 10: PolyActive를 단계별 변경하면 PVDF 필름과 유사한 마이크로웰 치수가 생성된다. (상단 줄) 용매-주조된 PolyActive에 이어 (하부 줄) PolyActive 필름의 레이저-드릴링 및 열성형(E, F)의 주사 전자 현미경(SEM) 현미경 사진. 뷰는 유리면(A), 공기면(B), 상단(E) 및 단면(C, F)이다. 레이저-드릴링 PolyActive 필름은 15 μm의 기공 직경을 나타낸다(D, 입체현미경 이미지). PVDF 및 PolyActive 박막의 기계적 특성: (G) 영률, (H) 피크 응력, (I) 파손 응력 및 (J) 파손 변형률.
도 11: 임상 섬 이식 개선을 위한 매크로-캡슐화, 개방형 섬 전달 전략의 최적화. A) 간외 마이크로웰-어레이 섬 전달 장치의 작동 원리. 췌장 섬은 마이크로웰 위에 분포되어 있어 섬이 응집되어 괴사성 코어가 있는 더 큰 구조체를 형성하는 것을 방지한다. 장치의 다공성 특성으로 인해 췌장 섬의 신속한 혈관재생이 가능하여 섬의 생존율 및 기능을 유지할 수 있다. 따라서, 혈당 수치의 상승은 이식된 췌장 섬에 의한 인슐린 분비로 보상될 수 있다. B) 장치의 현재 평면 구성은 이식하기에 외과적으로 어려운 상당한 장치 치수를 초래한다. C) 더 큰 장치에 대한 증가된 섬 패킹 밀도를 가진 잠재적인 업스케일링 가능성은 층의 적층, 마이크로웰의 촘촘한 패킹 및 마이크로웰의 과충전이다. D) 섬 주변의 국소 산소 수준을 시뮬레이션하는 데 사용되는 계산 모델의 도메인 및 산소 공급 경계 조건. E) 산소 값은 메쉬에 걸쳐 시뮬레이션되어 마이크로웰 전반에 걸쳐 산소 구배를 시뮬레이션할 수 있다. 메쉬는 섬 계면에서 더 정교해졌다.
도 12: 저산소 염색 강도(hypoxia staining intensity)는 INS1E 의사섬 직경이 증가함에 따라 증가한다. 200 um 직경 아가로스 칩 A) 50개 세포, B) 100개 세포, C) 250개 세포에서 또는 400 um 직경의 아가로스 칩 D) 500개 세포, E) 750개 세포, F) 1000개 세포에서 3일의 인큐베이션 기간에 걸쳐 단일 INS1E 세포의 시딩 및 응집. 스케일 바는 400 μm를 나타낸다. G) 의사섬 직경의 정량화. 의사섬은 저산소(5% O2, H) 또는 정상산소(21% O2, J) 배양 후 저산소(녹색) 및 Hoechst(파란색)에 대해 염색되었다. 이어서, 염색 강도를 정량화하고 신호 대 잡음비(저산소의 경우 I, 정상산소의 경우 K)로 표시하였다. 빨간색 바는 저산소 임계값을 나타낸다. 데이터는 평균 ± SD로 표시되고, * p < 0.05이다.
도 13: 인간 섬의 시험관내 저산소 염색과 인실리코 계산 O 2 소비 모델을 통해 결정된 국소 산소 수준에 대한 섬 직경의 중요성. 인간 섬은 저산소(5% O2, A) 또는 정상산소(21% O2, B) 배양 후 저산소(녹색) 및 Hoechst(파란색)에 대해 염색되었다. 스케일 바는 150 μm를 나타낸다. C) 저산소 염색 강도를 정량화하여 신호 대 잡음비로 표시하였다. 데이터는 평균 ± SD로 표시되고, * p < 0.05이다. 직경이 D) 50 μm, E) 100 μm, F) 150 μm, G) 200 μm, H) 250 μm인 섬에 대한 계산 산소 소비 모델링 결과. I) 산소 수준은 도 D-H에 표시된 두 섬의 중심을 통해 그려진 선에 걸쳐 시각화되었다.
도 14: 두 섬 사이의 최적 거리는 직경에 따라 다르다. 서로 0 내지 500 μm(X축) 사이의 거리에 있는 다양한 크기의 섬(직경 50 내지 250 μm, Y축)을 둘러싼 국소 산소 수준. 저산소 임계값은 5% O2(밝은 파란색)였다.
도 15: 마이크로웰은 심각한 O 2 경쟁을 일으키지 않으면서 작은 의사섬으로 과충전될 수 있다. A) 마이크로웰(너비 400 μm, 높이 250 μm)과 유사한 영역 내에 유지되는 다양한 크기의 섬에 대한 시뮬레이션. 섬 직경은 50 μm(왼쪽 열), 100 μm(중간 열) 및 150 μm(오른쪽 열) 사이의 범위였다. 섬 밀도는 마이크로웰당 2개의 섬(첫 번째 줄), 3개의 섬(두 번째 줄) 또는 4개의 섬(세 번째 줄) 사이의 범위였다. 정상산소 조건 하에서 배양된 INS1E 의사섬의 일부 대표적인 이미지는 B) 50 μm, C) 100 μm 및 D) 150 μm 초과의 섬 직경 주변에서 함께 응집되었다. 저산소 상태는 INS1E 세포에 대한 저산소 임계값(SNR = 3.0)이 교차된 경우 가장 큰 섬 직경 그룹에서만 관찰되었다.
도 16: 여러 장치 층을 적층하면 3층 장치에서 저산소 상태가 초래된다. 특정 장치 조립체(왼쪽)에 이어 직경 150 μm 섬의 국소 O2 수준 시뮬레이션(중간) 및 구조체의 중간에 있는 섬(들)을 통해 그려진 점선 수직선에 걸쳐 국소 산소 수준의 정량화(오른쪽)에 대한 도면. 첫 번째 줄: 단층 장치, 두 번째 줄: 층 사이의 거리가 300 μm인 이중층 장치, 세 번째 줄: 층 사이가 600 μm인 이중층 장치, 네 번째 줄: 300 μm 거리층을 갖는 3층 장치, 다섯 번째 줄: 층 사이가 600 μm인 3층 장치.
도 17: 마이크로웰-어레이 섬 전달 장치를 위한 최적의 패킹 밀도. A) 이중층 마이크로웰-어레이 섬 전달 장치에서 섬의 최적 설계 및 시딩 분포. B) 층 사이의 거리가 300 μm인 센티넬(sentinel) 이중층 마이크로웰 장치의 평면도, 스케일 바는 1 cm(왼쪽)를 나타낸다. 2개의 공급 카테터가 삽입된 장치의 정면도는 이중층 구조체의 각 개별 층에 대한 로딩 가능성을 도시한다(중간). 포인트 용접을 통해 층을 초음파로 연결하여 장치의 가장자리를 개방하여 산소 확산과 조직 내성장을 허용한다(오른쪽).
실시예
실시예 1
재료 및 방법
중합체 필름 제작
문헌[Li, M., et al., Controlling the microstructure of poly(vinylidene-fluoride) (PVDF) thin films for microelectronics. Journal of Materials Chemistry C, 2013. 1(46): p. 7695-7702]에 설명된 바와 같이, PVDF(의료용 등급 Kynar 720, Solvay)의 박막을 용매 주조하였다. 15%(w/w) 중합체 용액을 디메틸 포름아미드(DMF, Sigma-Aldrich)에서 제조하였다. 가습 조절된 상자 내에 위치한 자동 필름 캐스터(Elcometer K4340M12)에는 유리판이 장착되어 있으며 100℃ 온도 및 10% 습도에서 사전 컨디셔닝되었다. 이어서, PVDF-DMF 용액을 유리판 위에 주조하였다. 갭 거리가 250 μm인 범용 어플리케이터(Elcometer K0003530M005)를 5 mm/s의 일정한 속도로 중합체 용액 위에 실행하여 중합체 용액을 유리판 표면에 퍼뜨렸다. 이어서, 중합체 필름을 질소 가스 흐름 하에서 밤새 건조시켜 15 μm 두께의 필름을 생성하였다. 중합체 필름을 밤새 탈염수에서 인큐베이션하여 용매 잔류물을 제거하고 공기 건조시켰다. PVDF 필름은 25 kHz의 주파수에서 UV 단펄스 레이저를 사용한 레이저 미세 가공에 의해 다공성으로 만들어졌다. 마이크로웰 하부 필름은 25 μm의 기공 크기 및 50 μm의 피치를 갖는 기공으로 패턴화되었으며, 뚜껑으로 사용된 중합체 필름은 40 μm의 기공 크기 및 100 μm의 피치로 패턴화되었다. 또한, Polyvation BV에서 생산한 PolyActive로부터 박막을 만들었다. 정확한 조성은 4000PEOT30PBT70으로, 분자량이 4000이고 30 중량%의 폴리(에틸렌옥사이드 테레프탈레이트)(PEOT) 및 70 중량%의 폴리(부틸렌테레프탈레이트)(PBT)의 중량%(wt%)를 갖는 폴리(에틸렌옥사이드)로 구성되었다. PolyActive를 클로로포름과 1,1,1,3,3,3-헥사플루오로-2-이소프로판올의 65:35(w/w) 혼합물에 15 중량%의 농도로 용해시키고, 캐스팅 동안 실온을 사용하고 에탄올 중에서 용매 침출하는 것을 제외하고는 PVDF와 유사하게 필름 캐스터에 주조하였다. 중합체 필름은 15 μm의 기공 크기 및 50 μm의 피치를 갖는 기공으로 패턴화하였다.
마이크로웰 필름 제작
마이크로웰을 보유하는 박막은 미세-열성형에 의해 제작되었다. PVDF 필름은 금속 주형(Veld laser Innovations BV)과 지지재(backing material)로 기능하는 560 μm 두께의 폴리에틸렌 필름 사이에 압착되었다. 구조체를 유압 프레스(Atlas manual 유압 프레스, Specac)에 넣고, 85℃에서 2분 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 마우스 또는 래트 크기의 임플란트에 대해 각각 30 또는 35 kN으로 압력을 증가시켰다. 10분 동안 인큐베이션한 후, 샘플을 유압 프레스에서 꺼내어 탈형을 용이하게 하기 위해 5분 동안 에탄올에 담갔다.
PolyActive 필름에 대해서도 유사한 구조체를 만들어 유압 프레스에 넣고, 85℃에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 이후 마우스 또는 래트 크기의 임플란트에 대해 각각 25 또는 30 kN으로 압력을 증가시키고, 샘플을 프레스에서 37℃로 냉각시켰다. 샘플을 유압 프레스에서 꺼내어 탈형을 용이하게 하기 위해 5분 동안 에탄올에 담갔다.
지지 링
총 2 g의 PVDF 펠렛을 스테인레스강 주형(200 μm 두께, 네거티브 Ø9 cm 디스크가 있는 10×10 cm 플레이트)에 로딩하고 유압 프레스에 로딩하였다. 샘플을 180℃에서 1분 동안 예열하였다. 압력을 증가시키고 20 kN으로 1분 동안 유지하였다. 이어서, 샘플을 유압 프레스에서 꺼내어 실온에서 5분 동안 냉각시킨 후 탈형하여 두께가 200 μm인 Ø9 cm 디스크를 만들었다. 다음으로, 지지 링을 절단 플로터(cutting plotter)(Silhouette Cameo 4)를 사용하여 원하는 형상으로 절단하였다.
초음파(US) 용접으로 조립
맞춤형 US 용접 가이드를 사용하여 개방형 임플란트의 조립을 제어하였다(도 7). 먼저, 지지 링을 스테인레스강 홀더에 놓고, 다공성 미세-열성형 하부 필름과 다공성 뚜껑으로 덮었다. 구름 모양의 패턴을 테프론 커버 플레이트에서 밀링하여 US 용접 가이드에 배치하여 마우스 및 래트 크기의 임플란트에 대해 각각 4-포인트 또는 7-포인트 밀봉을 초래하였다. PVDF 층은 40 kHz 수동 Branson LPX US 용접 스테이션에서 1초 동안 75% 진폭으로 어닐링하였다.
래트 섬 단리
동물 실험은 마스트리히트 대학의 동물 관리 및 실험에 관한 기관 윤리 위원회와 네덜란드 중앙 동물 작업 위원회에서 신청 번호 AVD1070020186965로 승인하였다. 래트 섬은 10주령 수컷 루이스 래트로부터 단리되었다. 래트의 췌장에 0.25 mg/mL의 리버라제(Roche)를 관류하고 37℃에서 16분 동안 소화될 때까지 얼음 위에 보관하였다. 10 mM 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산(HEPES), 1% 페니실린/스트렙토마이신(P/S, 1000 U/mL), 2.5 mM CaCl2ㆍ2H2O, 4.2 mM NaHCO3, 1 mM MgCl2ㆍ6H2O 및 10% 소 태아 혈청(FBS)이 보충된 급냉 용액(행크스의 균형염 용액(HBSS))으로 소화를 중단하였다. 조직을 균질화하고, 여과하고, 급냉 용액으로 세척하였다. 섬은 피콜(ficoll) 구배(Ficoll-Paque Plus, GE Healthcare)로 정제하고 브레이크 없이 10℃에서 원심분리하였다. 섬을 급냉 및 배지(10% FBS, 1% P/S, 10 mM HEPES 및 1 mM 피루브산나트륨이 보충된 RPMI 1640 배지(11 mM 글루코스))로 세척하였다. 섬은 단리 직후와 그 다음날 직접 선택하였다. 섬의 순도 및 양은 디티존 염색(Sigma-Aldrich)으로 단리한 후 24시간 후에 결정하였다. 섬의 양은 종래의 Ricordi 방법을 기반으로 섬 등가물(IEQ, 직경 150 μm의 섬에 대한 섬 부피)로 보고되었다.
인간 섬
순도 80%의 총 20,500개의 인간 랑게르한스 섬은 네덜란드 정부로부터 임상 목적으로 인간 섬을 단리할 수 있는 허가를 받은 라이덴 대학 의료 센터(LUMC, Leiden, the Netherlands)의 인간 섬 단리 실험실에서 얻었다. 임상 섬 이식에 적합하지 않은 것으로 간주되었던 인간 섬을 네덜란드 법에 따라 이 실험에 사용하였다.
섬 시딩
자유-부유 대조군 섬(래트 섬 150 IEQ/cm2 또는 500 IEQ/cm2, 인간 섬 150 IEQ/cm2 또는 600 IEQ/cm2)을 500 uL 배지 내 24웰 플레이트의 12 mm Millicell 세포 배양 삽입물(MERCK, 12 μm 기공 크기) 내부에 시딩하였다. 임플란트를 조립하는 데 사용되는 포인트 시일 사이의 공간은 향후 생체내 연구 동안 혈관 내성장을 용이하게 하기 위한 것이었지만 세포 시딩 동안 임플란트가 섬이 손실되기 쉽도록 만들 수 있다. 시딩 도구는 임플란트의 외부 경계를 단단히 클랭핑하여 섬 손실을 방지하도록 설계되어 섬이 로딩된 배지가 마이크로웰 구조의 기공을 통해서만 배출될 수 있도록 한다(도 8). Luer lock 주사기에 섬(200 IEQ/mL)을 로딩하고 3.5 Fr 무딘-팁 공급 튜브(Argyle™ PVC 공급 튜브, Cardinal Health, Dublin, Ireland)에 연결하고 개방된 임플란트에서 비웠다. 마우스 크기의 개방형 세포 전달 장치를 300 IEQ로 시딩하고 5 mL 배지의 비부착성 6-웰 플레이트에 넣었다. 래트 크기의 임플란트에 3000 IEQ를 로딩하고 10 mL 배지에 비부착성 55 mm 페트리 접시에 넣었다.
살아있는/죽은 생존율 검정
포유류 세포를 위한 살아있는/죽은 생존율/세포독성 키트(ThermoFisher Scientific)를 제조업체의 지침에 따라 사용하여 배양 1일차와 7일차에 자유-부유 대조군 래트 섬과 개방형 임플란트 내에 시딩된 섬의 생존율을 검사하였다. 이미지는 Nikon Eclipse Ti 도립 현미경(inverted microscope)을 사용하여 촬영하고 FIJI 소프트웨어(https://fiji.sc/)를 사용하여 분석하였다. 살아있는/죽은 이미지는 Spaepen 등의 작업을 기반으로 정량화되었으며, 살아있는 염색 또는 죽은 염색을 위해 염색된 영역의 크기를 기반으로 세포 생존율을 결정하였다. 마지막으로, 세포 생존율은 하기 식 1에 따라 계산되었다:
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글루코스-자극 인슐린 분비(GSIS) 테스트
크렙의 완충액 스톡 용액(25 mM HEPES, 115 mM NaCl, 24 mM NaHCO3, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2ㆍ6H2O, 2.5 mM CaClㆍ2H2O, 멸균수 중의 0.2% 소 혈청 알부민)에 글루코스를 보충하여 고(16.7 mM) 또는 저(1.67 mM) 글루코스 용액을 형성하였다. 배지는 1일차와 7일차에 모든 샘플에서 제거하였다. 샘플을 세척하고, 37℃의 저글루코스 용액에서 1시간 동안 인큐베이션하여 남아 있는 모든 인슐린을 씻어냈다. 그 후, 모든 샘플을 새로운 저글루코스 용액에서 1시간 더 인큐베이션한 후 고글루코스 용액에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 샘플을 저글루코스 용액으로 3회 세척하고, 저글루코스 용액에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 각 인큐베이션 단계 후, 글루코스 용액의 분취량을 인슐린 ELISA 검정이 수행될 때까지 -30℃에서 보관하였다. 다음으로, 모든 샘플의 크렙 완충액 용액을 산성 에탄올(70% 에탄올 중 1.5% HCl)로 교체하고 5분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 샘플을 Eppendorf 튜브로 옮기고 ELISA 검정이 수행될 때까지 -30℃에서 보관하였다. 래트 인슐린에 대한 ELISA 키트(Mercodia, Uppsala, Sweden)를 사용하여 제조업체 지침에 따라 GSIS 후 인슐린 농도를 결정하였다. 샘플의 광학 밀도는 분광 광도계 플레이트 판독기(CLARIOStar Plus, BMG Labtech)를 사용하여 450 nm에서 판독하였다. 샘플은 필요한 경우 크렙 완충액으로 희석하였다. 마지막으로, 췌장 섬의 자극 지수(SI)는 고글루코스 인큐베이션 단계 동안의 인슐린 분비를 제1 저글루코스 인큐베이션 단계 동안의 인슐린 분비로 나누어 계산하였다. SI ≥ 2를 나타내는 췌장 섬은 기능적인 것으로 간주되었다.
업스케일링
동물 임플란트의 치수는 각각 마우스, 래트 및 미니 돼지 크기의 개방형 임플란트에 대해 300, 3000 및 13000개의 마이크로웰을 사용하여 계산되었다. 마우스 크기의 임플란트(원형 임플란트)에는 종횡비 1이 사용되었고, 다른 모든 임플란트(타원형 임플란트)에는 1.5가 사용되었다. 모든 인간 크기의 임플란트는 1.5의 단리 지수(IIN: isolation index number)를 사용하여 계산되었다. 유럽 전역의 여러 임상 센터에서 70 kg 환자에 대한 인간 섬의 평균 최소 이식 IEQ 용량을 기반으로 200,000 IEQ, 450,000 IEQ 또는 700,000 IEQ를 보유하는 인간 크기의 임플란트에 대한 세 가지 특정 사례가 평가되었다.
통계
모든 결과는 평균 ± 표준 편차(SD)로 제시되었다. 통계 분석은 Graphpad PRISM 8을 사용하여 수행되었다. p-값 < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다. 그룹 비교는 등분산(equality in variance)(Brown-Forsythe 테스트)과 정규성(Shapiro-Wilk 테스트)의 가정을 평가한 후 Tuckey의 사후 테스트(Tuckey's post hoc test)와 함께 일원 분산 분석(ANOVA: one-way analysis of variance)을 사용하여 수행되었다. 정규성 가정이 검증되지 않은 경우 Dunn 테스트와 함께 Kruskal-Wallis 테스트가 사용되었다. 두 그룹 간의 직접 비교는 등분산과 정규성 가정을 평가한 후 쌍을 이루지 않은 t-테스트에 의해 수행되었다. Welch의 수정은 등분산 가정이 위반되는 경우, t-테스트에 사용되었다. 만-휘트니 테스트(Mann-Whitney test)는 등분산과 정규성 가정이 둘 모두 위반하는 경우 수행되었다.
결과
마이크로웰 박막
PVDF 필름은 자동 필름 캐스터로 주조하여 15 내지 20 μm 두께의 중합체 필름을 만들었다(도 1A 내지 1C). 다음으로, 레이저 미세 가공에 의해 동일한 크기의 기공의 미리 결정된 패턴을 생성하였다(도 1D). 마이크로웰 하부 필름에 사용되는 중합체 필름은 24 ± 1 μm의 기공 크기 및 50 μm의 피치를 갖는 기공으로 패턴화되었으며, 뚜껑으로 사용된 중합체 필름은 40 ± 1 μm의 기공 크기 및 100 μm의 피치를 가졌다(도 1G). 레이저 미세 가공 후 중합체 필름이 어두워졌지만 에너지 분산 X선 분석에서는 중합체의 소각(incineration)을 나타내는 탄소 수준 증가가 나타나지 않았다(도 9). 레이저로 미세 가공된 기공은 미세-열성형 동안 이방성으로 늘어났다. 웰의 하단과 상단에 위치한 기공은 각각 48 ± 2 μm 및 27 ± 2 μm의 기공 크기를 가진 둥근 형상을 표시하였다(도 1H). 웰의 측면에 위치한 기공은 웰의 깊이를 따라 타원형이었으며, 평균 단경은 42 ± 6 μm, 장경은 89 ± 14 μm를 나타내었다. 미세-열성형을 적용하여 390 ± 12 μm의 평균 웰 직경 및 260 ± 6 μm의 웰 깊이를 나타내는 마이크로웰 구조를 생성하였다(도 1I). 마이크로웰 단면 분석을 기반으로, 모든 PVDF 마이크로웰에는 55개의 기공이 있는 것으로 추정되었다. 일반적으로 기공 크기는 PolyActive 필름에 비해 미세-열성형 후 PVDF 필름에서 더 컸다(도 1G, 1H). PolyActive 필름의 마이크로웰 상단에 위치한 기공은 포아송 효과(Poisson effect)(로딩 방향에 수직 방향으로 재료가 수축됨)를 나타내어 3:1 비율로 늘어난 기공이 형성되는 반면(도 10E) PVDF 필름의 기공은 둥글게 유지되었다(도 1E).
임플란트 조립
모든 PVDF 임플란트는 초음파 용접에 의해 특정 지점에서 200 μm 두께의 지지 링, 마이크로웰 형상의 필름 및 다공성 뚜껑을 어닐링하여 조립되었다(도 2A, 도 7). 각 용접은 150 μm의 빈 코어를 포함하여 직경 0.5 mm의 원형 시일을 생성하였다. 마우스 크기의 임플란트는 각 용접 스폿 사이에 14 mm의 고정 거리를 두고 4개 스폿에서 함께 밀봉되었다. 마우스 크기의 임플란트는 24 mm의 외경, 300개의 마이크로웰을 보유하는 직경 8 mm의 마이크로웰이 각인된 영역 및 4 mm 너비의 지지 링을 보유하고 있다(도 2B). 용접된 스폿의 강도는 기계적 인장 테스트를 통해 평가되었으며 중합체 박막과 비교되었다(도 2C 내지 2F). US 용접된 시일과 박막 사이에는 파손 응력, 피크 응력, 영률 또는 파손 변형률에는 통계적 차이가 없었다.
마우스 크기의 개방형 세포 전달 장치의 래트 섬 생존율 및 기능
마우스 크기의 개방형 세포 전달 장치에 래트 섬을 로딩한 후 세포 생존율을 평가하였다. 마우스와 래트의 췌장 섬은 유사하지만, 래트의 경우 단리 수율이 상당히 높다(마우스의 경우 100 내지 150개 섬, 래트의 경우 300 내지 800개 섬). 평균적으로 각 래트에 대해 757개의 췌장 섬이 단리되었으며, 이는 1534 IEQ 및 2.02의 섬 단리 수(IIN, IEQ/섬의 평균 수)로 환산된다. 단리된 섬은 순도 > 85%를 나타내었다. 다음으로, 세포 시딩 도구와 카테터를 사용하여 마우스 크기의 개방형 세포 전달 장치 내에 300개의 IEQ를 시딩하였다(도 8). 마우스 크기의 임플란트 내에 시딩된 래트 섬은 마이크로웰 위에 고르게 분포되었다. 일부 웰은 비어 있었고 이중으로 채워진 웰은 거의 관찰되지 않았다. 세포 생존율은 1일차와 7일차에 결정되었다(도 3A 내지 3I). 특히, 개별 자유-부유 대조군은 7일의 기간에 걸쳐 응집된 반면, 임플란트에 시딩된 섬은 분리된 상태로 유지되었다. 응집된 섬은 섬의 중심과 응집체의 경계 사이의 거리로 결정된 최대 확산 거리가 93 ± 19 μm인 것으로 나타났다. 자유-부유 대조군 내의 래트 섬은 7일차 대조군(85 ± 6%)에 비해 1일차(92 ± 10%)에 상당히 더 높은 생존율을 나타내었다(도 3J). 임플란트에 시딩된 섬의 생존율(86± 10%)은 7일차에 대조군 샘플과 유사하였다.
다음으로, 래트 섬은 GSIS 테스트를 실시하여 마이크로웰 임플란트에 삽입하는 것이 섬 기능에 영향을 미치는지 여부를 평가하였다. 대조군 샘플과 임플란트 샘플 둘 모두 정상적인 섬 기능을 나타내는 특징적인 낮음-높음-낮음 패턴을 나타내었다(도 3K). 대조군 섬은 1일차에 임플란트에서 배양된 섬(0.31 ± 0.14 ng 인슐린/IEQ)에 비해 1일차에 고글루코스 인큐베이션 단계(0.78 ± 0.18 ng 인슐린/IEQ) 동안 더 높은 인슐린 분비를 나타내었다. 이 효과는 배양 7일 후 대조군 섬(0.52 ± 0.15 ng 인슐린/IEQ)이 임플란트의 섬(0.28 ± 0.14 ng 인슐린/IEQ)과 비교하여 유사한 인슐린 분비 수준을 나타냈을 때 사라졌다. 또한, SI는 자유-부유 대조군 섬(4.0 ± 2.3)과 7일의 배양 후 개방형 세포 전달 장치에 시딩된 섬(5.3 ± 0.6)에 대해 유사하였다(도 3L). 그룹과 시점 둘 모두에서 췌장 섬은 SI≥ 2 임계값을 초과했기 때문에 기능적인 것으로 간주되었다.
업스케일링
가상의 기증자 및 이식대상자 데이터(실제 임상 섬 이식을 기반으로 함)를 사용하여 필요한 웰의 수를 계산하였다. 이 수는 이후 형상 및 종횡비와 같은 임플란트 특성에 따라 임플란트 표면에 분포되어 최종적으로 단경× 장경으로 주어지는 임플란트 치수를 계산하게 된다. 모든 임플란트 치수는 마이크로웰 영역만 포함하며 지지 링은 제외하다. 마우스, 래트 및 미니 돼지 크기의 임플란트는 300 IEQ를 수용하는 직경 0.8 cm의 원형 마이크로웰 영역 또는 각각 3000 IEQ를 수용하는 1.8 × 3.5 cm 및 13,000 IEQ를 수용하는 3.7 × 7.4 cm의 타원형 마이크로웰 영역을 필요로 하는 설계(IIN=1, 웰 거리 = 35 μm, 임플란트 양 = 1 및 IEQ/웰 = 1)였다. 인간 크기의 임플란트는 70 kg 환자에 대해 유럽 전역의 임상 센터에서 활용하는 평균 최소 이식 IEQ 용량을 기반으로 설계되었다(도 4). 임플란트 치수는 최저(200,000 IEQ), 평균(450,000 IEQ) 및 최고 용량(700,000 IEQ)을 유지하는 임플란트에 대해 계산되었으며(IIN = 1.5, 종횡비= 0.5 및 웰 거리 = 35 μm), 각 경우에 대해 임플란트의 양 및 IEQ/웰을 다르게 했다. 단일 인간 크기의 단일 임플란트 크기(검은색 형상)는 11.8 × 23.6 cm 내지 22.1 × 44.1 cm 범위였다. 이 모델에서는 모든 섬을 2개의 임플란트(회색 형상)에 분산시켜 임플란트 치수를 작게 유지하여 임플란트 치수를 8.3 × 16.7 cm 내지 11.0 × 22.1 cm로 만들었고, 2개의 IEQ/웰(흰색 형상)을 시딩하여 더 작게 만들어 임플란트 크기가 5.9 × 11.8 cm 내지 11.0 × 22.1 cm로 다양해졌다.
래트 크기의 장치의 래트 섬 생존율 및 기능
래트 크기의 개방형 세포 전달 장치는 2.6 × 4.4 cm의 최종 임플란트 치수로 제조되었다(도 7F). 임플란트는 용접 가이드의 업스케일링된 버전에 따라 US 용접되고(도 7D), 멸균되고, 확장된 시딩 도구로 클램핑된 후 래트 섬으로 시딩되었다(도 8C 내지 8E). 자유 부유 대조군은 500 IEQ/cm2에서 300 IEQ로 시딩되었고, 임플란트는 600 IEQ/cm2에서 3000 IEQ로 시딩되었다. 대조군 샘플은 큰 응집체(직경 1200 ± 300 μm)의 형성을 나타내어 7일의 시험관내 배양에 걸쳐 괴사 코어를 생성하였다(도 5A 내지 5C). 임플란트 내에 시딩된 섬은 서로 분리되어 유지되었으며, 직경이 100 μm 미만인 섬의 웰의 경우 여러 개의 섬만 나타내었다(도 5D 내지 5F). 장치 그룹은 대조군에 비해 상당히 더 높은 생존율을 나타내었다(각각 87 ± 7% 대 63 ± 9%)(도 5G). 대조군 섬은 7일차에 장치에서 배양된 섬(0.40 ± 0.12 ng 인슐린/IEQ)에 비해 7일차에 고글루코스 인큐베이션 단계(1.40 ± 0.52 ng 인슐린/IEQ) 동안 더 높은 인슐린 분비를 나타내었다. 또한, 대조군은 첫 번째 저글루코스 인큐베이션 동안 더 높은 인슐린 분비를 나타내었다(0.56 ± 0.20 ng 인슐린/IEQ 대 0.19 ± 0.04 ng 인슐린/IEQ). SI는 자유-부유 대조군(2.6 ± 0.9)과 7일의 배양 후 개방형 세포 전달 장치에 시딩된 섬(2.1 ± 0.7)에 대해 유사하였다(도 3L). 그룹과 시점 둘 모두에서 췌장 섬은 SI ≥ 2 임계값을 초과했기 때문에 기능적인 것으로 간주되었다.
래트 크기의 장치의 인간 섬 생존율 및 기능
인간 섬을 래트 섬에 대해 수행된 것과 유사한 방식으로 래트 크기의 개방형 세포 전달 장치에 시딩하였다. 대조군은 90 IEQ(150 IEQ/cm2) 또는 360 IEQ(600 IEQ/cm2)로 시딩되었고, 장치는 3000 IEQ(600 IEQ/cm2)로 시딩되었다. 대조군 샘플은 응집체를 나타내지 않았지만 7일의 배양 기간에 걸쳐 배양 삽입물에 부착되었다(도 6A 내지 6F). 장치 내에 시딩된 인간 섬은 표면에 부착된 것처럼 보였고, 마이크로웰은 때때로 1개 초과의 섬을 보유한다(도 6G 내지 6I). 1일차(91.1 ± 4.7% VS 90.7 ± 3.9% 대 90.0 ± 4.2%) 또는 7일차(93.6 ± 2.1% 대 91.6 ± 3.1% 대 91.7 ± 4.4%)에 저세포 밀도 대조군, 고세포 밀도 대조군 및 장치 사이의 생존율에는 통계적 차이가 없었다(도 6J). 인슐린 분비 수준은 1일차에 대조군과 장치에서 유사했지만, 고글루코스 인큐베이션 단계 동안 분비된 인슐린은 배양 7일 후 대조군(16.3 ±± 1.8 ng 인슐린/IEQ 및 13.0 ± 2.2 ng 인슐린/IEQ)에 비해 장치(24.4 ± 3.7 ng 인슐린/IEQ)에서 더 높았다(도 6K). 모든 그룹의 췌장 섬은 기능적(SI ≥ 2)인 것으로 간주되었다. 그러나, 장치에서 배양된 섬은 1일차에 대조군에 비해 더 높은 자극 지수를 나타내었다(SI 1.7± 0.4 대 1.7± 0.4 대 4.2 ± 1.1)(도 6L). 이 효과는 7일차에 더욱 명확해졌다(SI 3.0± 1.1 대 2.8 ± 0.3 대 13.7 ± 3.4).
논의
실시예에 설명한 바와 같이, 제1 단계는 임상적으로 승인된 PVDF로부터 마우스 크기의 장치를 제조하는 것이었다. PVDF의 주조된 박막은 다른 문헌에 따라 상 분리의 결과로 매끄럽고 거친 면을 나타내었다(도 1A, 1B). 이후 필름을 레이저로 미세 가공하고 미세 열성형하여 마이크로웰 구조로 성형하여 필름과 그 내부의 기공을 효과적으로 늘렸다. 본질적으로. 섬은 직경이 50 내지 400 μm 범위인 구형 모폴로지를 유지한다. 웰의 측면에 위치한 기공은 수평 기공 직경이 50 μm 임계값을 초과하지 않는 이방성 방식으로 늘어나 상대적으로 큰 수직 기공 직경으로 인한 섬의 손실을 방지하였다. 전체적으로, 대부분의 기공 크기는 약 30 내지 50 μm였으며 이는 혈관재생을 자극하다. PolyActive 필름의 미세-열성형은 PVDF 임플란트와 유사한 마이크로웰 구조를 만들었다. PolyActive 필름은 두 재료의 기계적 특성 차이로 인해 PVDF 필름에 비해 더 작은 기공 크기로 레이저 드릴링되었다(도 1G). 특히 주목할 만한 것은 PolyActive의 파손 변형률이 PVDF의 파손 변형율보다 60배 높다는 점이다. 일반적으로. PVDF 임플란트의 기공 크기는 PolyActive 임플란트에 비해 더 컸다. 열성형 PVDF 필름 상단의 기공은 둥글게 유지되는 반면, PolyActive 필름의 기공은 이전 연구와 유사하게 장경:내경 비율이 3:1인 타원형이었다.
제2 단계는 초음파 용접에 의한 미세 열성형 하부 필름, 다공성 상부 필름 및 지지 링의 접합을 통해 개방형 섬 전달 장치를 조립하는 것이었다(도 2A, 2B). 지지 링은 마이크로웰 구조물을 기계적으로 보호하고, 임플란트의 접힘을 방지하고, 취급을 개선하였다. 인장 테스트에서는 중합체 박막의 기계적 특성과 박막과 지지 링 사이의 초음파 용접 결합에 차이가 없는 것으로 나타났다(도 2C 내지 2F).
총 300 IEQ 및 3000 IEQ를 시딩 도구를 사용하여 마우스 크기 및 래트 크기의 개방형 세포 전달 장치 각각에 시딩하였다. 저밀도 배양이 섬에 유익할 수 있지만 많은 관련된 많은 노력과 비용, 그리고 낮은 실용성이 주요한 한계이다. 결과적으로, 인간 섬은 종종 상대적으로 높은 밀도(500 내지 1000 IEQ/mL)로 배양된다. 또한 최종 임플란트 크기를 감소시키기 위해 임플란트에 높은 세포 밀도가 필요하다. 세포 밀도의 효과를 연구하기 위해, 래트 섬 대조군은 마우스 크기의 임플란트의 경우 총 100 IEQ(150 IEQ/cm2), 래트 크기의 임플란트의 경우 300 IEQ(500 IEQ/cm2)의 자유-부유 섬으로 구성되었다. 자유-부유 인간 섬 대조군은 100 IEQ(150 IEQ/cm2) 또는 360 IEQ(600 IEQ/cm2)의 다양한 시딩 밀도를 갖는 2개 그룹에 걸쳐 분포되었다. 마우스 크기의 임플란트에는 300 IEQ가 시딩되었고, 마우스 크기의 임플란트에는 3000 IEQ가 시딩되었다.
섬 단리 과정은 섬 혈관구조의 붕괴를 초래하여 섬이 영양분 및 산소를 얻기 위해 주변으로부터의 확산에 의존하게 만든다. 가장 중요한 것은 가장 가까운 모세혈관으로부터 세포의 최대 거리가 200 μm를 초과하는 경우는 거의 없으며 일반적으로 100 μm 미만이라는 것이다. 단리된 섬은 저산소 상태, 섬 기질의 파괴, 사이토카인 및 내독소에 대한 노출의 결과로 아폽토시스를 겪는 것으로 이전에 설명되었다. 또한, 중심 괴사는 배양 동안 세포 사멸에 기여하며 섬 밀도, 응집량, 섬의 크기 및 배양 동안 아폽토시스 정도에 따라 달라진다.
150 IEQ/cm2로 시딩된 설치류 대조군 섬은 배양 기간 동안 응집을 나타냈고, 이는 100 um 미만의 최대 확산 거리를 갖는 불규칙한 형상의 응집체를 형성하고 세포 생존율을 유지하도록 하였다(도 3A 내지 3F 및 3J). 그러나, 500 IEQ/cm2로 시딩된 설치류 대조군 섬은 500 um 이상의 최대 확산 거리를 갖는 큰 응집체의 형성을 나타내었다(도 5A 내지 5C). 산소가 부족하면 괴사 코어가 형성되고 궁극적으로 세포가 사멸될 것이며, 이는 500 IEQ/cm2 실험에서 대조군에서 관찰된 세포 생존율 감소를 설명한다(도 5A 내지 5G). 유사한 결과가 문헌에 보고되었으며, 600 IEQ/cm2에서 배양된 설치류 섬은 150 IEQ/cm2에서 배양된 섬에 비해 배양 24시간 후 세포 생존율이 감소한 것으로 이미 나타났다. 죽은 세포의 잔존물은 면역 체계를 촉발하여 더 심각한 면역 반응을 초래하고 임플란트 실패의 위험을 증가시킨다. 3000 IEQ를 보유한 대조군 샘플은 섬의 응집으로 인해 세포 기능과 생존율이 너무 많이 저하되어 섬 단리를 위한 불필요한 동물 고통을 초래할 것으로 예상되었기 때문에 채취하지 않았다. 섬의 응집과 그에 따른 괴사성 코어의 형성을 방지하기 위해, 개방형 세포 전달 장치에서 마이크로웰을 사용하여 섬에 별도의 미세환경을 제공하였다. 마이크로웰은 섬을 서로 효과적으로 분리하여 7일의 배양 후 각각의 대조군과 동일하거나(마우스-임플란트) 더 높은 세포 생존율(래트-임플란트)을 초래하였다(도 3D 내지 3J, 도 5D 내지 5G). 인간 섬은 7일의 배양 기간에 걸쳐 응집되지 않았지만 세포 배양 삽입물의 표면에 부착되는 것처럼 보였다(도 6A 내지 6F). 마이크로웰 임플란트에 시딩된 인간 섬(도 6G 내지 6I)은 대조군과 유사한 세포 생존율(> 90%)을 나타냈다(도 6J). 인간 섬이 대조군의 세포 배양 삽입물에 부착됨에 따라, 섬의 응집 또는 융합이 없어서 세포 생존율이 유지되는 것을 잘 설명했지만(도 6A 내지 6J) 설치류 섬에서 섬의 생존율이 손실되었다. 더욱이, 설치류 섬의 평균 직경(100 내지 150 μm)은 인간 섬(50 내지 100 um)보다 상당히 커서 중심 괴사가 발생하기 쉽다.
설치류 섬은 배양 시 적어도 일주일 동안 글루코스 민감성을 유지하는 것으로 보고되었지만, 설치류 섬 기능의 변화는 며칠 후에도 발생하는 것으로 알려져 있다. 설치류 섬의 인슐린 방출 데이터는 대조군 및 마우스 크기 임플란트에 대해 7일의 배양 후 유사한 낮음-높음-낮음 인슐린 분비 프로파일 및 자극 지수(SI ≥ 2)를 나타내며, 이는 적절한 섬 기능을 나타낸다(도 3K 및 3L). 살아있는 죽은 염색으로 표시된 저산소증-관련 괴사가 없다는 점을 감안할 때 대조군 및 장치 그룹의 섬이 유사하게 행동하는 것은 놀라운 일이 아니다. 그러나, 500 IEQ/cm2로 시딩된 대조군 래트 섬은 저산소증-관련 괴사를 보였으며 장치에서 배양된 섬에 비해 상당히 높은 인슐린-방출 프로파일을 나타냈다(도 5H 및 5I). 마우스 크기의 장치에서 섬으로부터 상대적으로 낮은 인슐린 방출 수준은 베타 세포의 인슐린 방출에 대한 자가분비 피드백 루프로 설명할 수 있는데, 이는 장치 샘플이 대조군 샘플에 비해 10배 더 많은 IEQ를 보유하기 때문이다. 따라서, 높은 인슐린 수치에 노출된 섬은 인슐린을 덜 분비하는 것으로 여겨진다. 반면에, 대조군의 상대적으로 높은 인슐린 분비 수치는 섬의 괴사로 인해 야기되어, 그 결과 세포내 인슐린이 방출되어 GSIS 테스트 동안 방출된 인슐린 수준이 증가할 수 있다(도 5H). 인간 섬은 대조군과 임플란트 둘 모두에 대해 유사한 낮음-높음-낮음 인슐린 방출 프로파일을 나타냈다. 장치에서 배양된 섬은 고글루코스 조건 동안 더 많은 인슐린을 분비하여 더 높은 자극 지수를 초래함에 따라 7일의 배양 후 대조군보다 기능이 개선된 것으로 나타났다(도 6K 및 6L).
췌장은 섬의 본래 환경이기 때문에 자연적으로 가장 최적의 이식 부위로 간주된다. 그러나, 효소 누출로 인한 조직 염증(췌장염)의 위험이 높고 베타 세포에 대한 자가면역 공격에 대한 국소 림프절의 프라이밍 가능성으로 인해 임상 실습에서 사용되는 것으로 거의 고려되지 않는다. 임플란트의 매크로캡슐화 설계는 크기 수축으로 인해 이식 부위의 선택을 제한하여 복막강과 피하 공간을 잠재적인 이식 부위로 남겨둔다. 복강간 공간은 접근성이 용이하고 수많은 섬을 수용할 수 있어서 흥미로운 이식 부위를 제공하다. 그럼에도 불구하고, 제한된 혈관재생, 지연된 글루코스 반응성 및 만성 저산소 스트레스 용량과도 관련이 있어 매력적이지 않은 부위가 된다. 피하 공간은 최소 침습성, 재현성 및 시간이 경과함에 따라 장치를 용이하게 모니터링하거나 필요한 경우 장치를 복구할 수 있는 기회로 인해 종종 고려된다. 그러나, 저산소증 및 부적절한 혈관재생은 피하 장치와 관련된 일반적인 문제이므로 산소 발생기, 성장 인자 또는 중간엽 줄기 세포의 공동 이식과 같은 사전 혈관재생 또는 기타 혈관신생 유도 조치가 필요하다.
따라서, 본 발명자들은 새로운 이식 부위를 제안하다: 광배근의 근육 근막 아래에 포켓을 만들어 섬 전달 임플란트의 근육위(supramuscular) 이식. 이러한 새로운 이식 부위는 이식을 위한 넓은 표면적, 이식된 섬에 대한 높은 혈액 공급 및 상대적인 비침습적 수술을 제공해야 한다. 특히 광배근은 머리, 목 및 유방 수술을 포함한 재건 수술에 일반적으로 사용된다. 광배근은 넓은 표면적(경우에 따라 심지어 최대 25 × 40 cm)을 가진 비교적 일정한 해부학적 구조를 가지고 있으며 100 cm2 초과의 조직 이식에 사용된다. 더욱이, 근육은 상대적으로 쉬운 해부로 제거할 수 있으며 문제가 발생할 수 있으며 기증자 부위 이환율이 최소화되는 것으로 알려져 있다. 근육을 제거하면 어깨 관절의 안정성, 운동 범위 및 근력이 감소와 관련되지만 이러한 단점은 향후 6 내지 12개월 이내에 해결된다.
마우스 크기의 장치(300 IEQ 보유)의 설계는 래트 크기(3000 IEQ 보유), 미니 돼지 크기(13,000 IEQ 보유) 및 여러 인간 크기의 장치에 맞춰 외삽되었다(도 4). 이식하기 용이하도록 타원형 형상을 선택하였다. 타원형 래트 크기의 장치는 마이크로웰로 채워진 타원형 1.8 × 3.5 cm 영역을 포함하여 2.7 × 4.4 cm의 외부 치수로 제작되었다(도 7F). 유럽 센터 전역의 임상 섬 이식을 위한 섬의 방출 기준에 근거하여, 200,000, 450,000 또는 700,000 IEQ를 보유한 세 가지 상이한 크기의 인간 임플란트를 시뮬레이션하였다. 현재, 평면 임플란트는 한 층으로만 만들어지기 때문에 인간 크기의 장치 치수가 최대 22 cm × 44 cm에 달해 임상용으로 사용하기에는 너무 클 수 있다. 따라서, 본 발명자들은 2개의 장치(또는 양면 마이크로웰 장치)에 대한 섬의 분포 및/또는 2 IEQ/마이크로웰의 시딩을 시뮬레이션하여 장치 치수를 감소시키는 것을 목표로 하였다. 그럼에도 불구하고, 다층 장치의 타당성과 더 높은 세포 밀도의 시딩은 또한 산소와 영양분에 대한 국소적 경쟁을 증가시킬 수 있으므로 향후 연구에서 철저히 조사되어야 하다.
마이크로웰 시스템은 췌장 섬 이외의 다른 세포 유형에도 용이하게 로딩될 수 있다. 기증자 조직의 부족은 섬 이식 기술의 가장 큰 제한 요소는 아니더라도 제한 요소이다. 최근, 여러 연구에서 유도만능 줄기세포(IPSC)와 배아 줄기세포로부터 췌장 세포를 시험관내에서 개발함으로써 섬 이식을 더 많은 사람들에게 제공하려고 시도하였다. 동종 기증자 유래 섬의 이식 다음으로, 이 임플란트는 섬과 지지 세포와 함께 공동 이식하는 데에도 용이하게 사용될 수 있다. 가능한 세포 유형에는 중간엽 기질 세포 또는 내피 세포가 포함되며, 이는 이전에 섬 이식을 개선하는 것으로 나타났다.
췌장 섬 전달 장치는 임상 섬 이식을 개선하는 것을 목표로 간외 섬 전달을 용이하게 하기 위해 제조하였다. 임상적으로 승인된 PVDF로 만든 임플란트는 이전에 사용했던 PolyActive 임플란트와 비교하여 유사한 마이크로웰 구조를 보였지만 다공성은 개선되었다. 초음파 용접을 사용하여 임플란트를 조립했으며, 그 결과 PVDF 필름과 유사한 기계적 특성을 가진 시일이 생성되었다. 마이크로웰-어레이 섬 전달 장치에서 배양된 래트 및 인간 섬은 시험관내 7일의 시험관내 배양 후 생존 가능하고 기능적인 것으로 나타났다. 마우스 크기의 장치 설계는 임상적으로 관련된 치수를 가진 래트, 미니 돼지 및 인간 크기의 임플란트에 맞춰 외삽 및 업스케일링되었다.
실시예 2
췌장은 자연적으로 섬 이식을 위한 가장 최적의 이식 부위로 간주된다. 그러나, 췌장은 β-세포에 대한 자가면역 공격에 대한 국소 림프절의 프라이밍 가능성과 췌장의 선포(acinar) 부분에서 효소 누출로 인한 조직 염증(췌장염)의 위험이 높기 때문에 임상 실습에서 거의 고려되지 않는다. 따라서, 섬 이식 분야에서는 섬의 생존과 기능을 자극하는 대체 간외 이식 전략을 찾고 있다.
성공적인 이식 전략을 개발하기 위해서는 췌장 섬의 요구 사항을 이해하는 것이 중요하다. 췌장 섬은 자연적으로 췌장 전체에 걸쳐 퍼져 있으며 췌장 조직의 1 내지 2%를 차지하다. 섬은 대사 활동이 높기 때문에 산소 요구량이 상대적으로 높아 췌장 혈류량의 15 내지 20%를 필요로 하다. 섬은 췌장 내에서 40 내지 60 mmHg(약 5% O2)의 부분 산소압(pO2)에 노출되며, 이는 혈당 수치를 모니터링하기 위해 췌장의 섬에는 조밀한 모세혈관 네트워크가 포함되어 있기 때문에 동맥혈의 산소 분압(oxygen tension)(80 내지 100 mmHg)에 가깝게 증가할 수 있다. 임상 섬 이식 동안, 췌장은 효소적으로 소화되어 세포외 기질을 분해함으로써 선포 조직으로부터 섬을 해방시킨다. 그러나, 이러한 효소 칵테일은 또한 섬 내의 조밀한 모세혈관 네트워크를 방해하다. 따라서, 단리된 섬은 이식 후 7 내지 14일 동안 산소와 영양분의 확산에만 의존하다. 그럼에도 불구하고, 3개월 후에도 간내 이식된 섬은 10 mmHg 미만의 상대적으로 낮은 산소 분압을 보여 간외 이식 전략의 필요성을 다시 한 번 강조하다. 더욱이, 저산소 상태에서는 β-세포의 글루코스 반응성과 인슐린 분비가 모두 감소하여 임상 효과가 감소하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 섬 이식 시 산소 분압을 회복하는 것은 원하는 임상 결과를 실현하는 데 중요하다.
본원에 기재된 장치의 다공성 특성은 이식 시 췌장 섬의 신속한 혈관재생을 가능하게 한다. 췌장 섬은 마이크로웰 위에 분포되어 섬 응집을 방지하는데, 이는 노출된 세포를 이식할 때 피할 수 없는 특징이다. 생리학적으로, 가장 가까운 모세혈관으로부터 어떤 세포의 최대 거리도 산소의 확산 제한으로 인해 100 내지 200 μm를 초과하는 경우는 거의 없다. 그러나, 단리된 섬은 저산소 코어를 형성하는 큰 세포 구조체로 응집되는 경향이 있다. 이것은 저산소증이 유지되면 괴사성 코어로 더 발전하여 결국 세포 사멸과 기능 저하를 초래한다. 게다가, 이러한 죽은 세포의 잔존물은 면역 체계를 촉발하여 더 심각한 면역 반응을 초래하고 이식 실패의 위험을 증가시킬 것이다. 마이크로웰 형상의 개별 하위 공간을 제공함으로써 섬을 분리하는 것은 일단 부고환 지방 패드에 이식되면 시험관내 및 생체내에서 섬 생존율 및 기능을 개선하는 것으로 본원에 나타났다. 그러나, 임상적으로 관련된 양의 섬을 전달할 수 있는 마이크로웰 장치에 대한 예상 장치 치수는 이식하기가 외과적으로 어렵다. 200,000 IEQ의 경우 8 × 16 cm이고 700,000 IEQ의 경우 최대 16 × 32 cm의 단축 × 장축을 갖는 장치 치수를 둘 모두 유지하는 2개의 타원형 장치를 이식해야 한다. 따라서, 장치 치수를 감소시키기 위해 마이크로웰 장치에서 섬 패킹 밀도를 증가시켜야 하다. 그러나, 섬 패킹 밀도가 너무 높으면 유리한 장치 치수를 실현할 수 있지만 또한 산소 및 영양분 경쟁의 심각한 위험을 초래할 것이고 이식 직후 이식편 기능을 상실할 가능성이 있다. 본 발명자들은 마이크로웰 임플란트에서 세포 패킹 밀도를 최적화하기 위해 세 가지 전략을 평가하였다: 1) 섬 사이의 거리를 최적화하여 마이크로웰을 촘촘히 패킹하는 것, 2) 여러 섬으로 마이크로웰을 과충전하는 것, 3) 마이크로웰 장치의 다양한 층을 적층하는 것(도 11C). 이 세 가지 전략에 대한 완전한 시험관내 평가는 비용과 시간이 많이 들기 때문에, 본 발명자들은 세 가지 전략을 인실리코에서 평가하기 위한 계산 모델을 만들었다.
방법
마이크로웰 장치 제작
마이크로웰-어레이 섬 전달 장치의 구성요소는 이전에 보고된 바와 같이 제조되었다(실시예 1 참조). 마이크로웰 장치는 세 가지 상이한 구성요소로 구성되었다: (1) 마이크로웰 각인된 다공성 필름, (2) 뚜껑 역할을 하는 평면 다공성 필름 및 (3) 지지 링. 간단히 말해서, 15 μm 두께의 폴리비닐리덴 플루오라이드 필름(PVDF 또는 Kynar 720, Solvay)을 자동 필름 캐스터(Elcometer)를 사용하여 용매 주조하였다. 필름은 25 kHz의 주파수에서 UV 단펄스 레이저를 사용하여 레이저 미세-가공에 의해 다공성으로 만들어졌다. 마이크로웰 필름에 사용된 중합체 필름은 25 μm의 기공 크기 및 50 μm의 피치를 보유한 기공으로 패턴화되었으며, 뚜껑으로 사용된 중합체 필름은 40 μm의 기공 크기 및 100 μm의 피치로 패턴화되었다. 마이크로웰을 보유하는 다공성 필름은 유압 프레스(Specac)에서 85℃ 및 30 kN에서 미세-열성형을 통해 제작되어 평면 필름을 마이크로웰-함유 필름으로 효과적으로 재형성하였다. 지지 링은 동일한 유압 프레스에 의해 180℃ 및 20 kN에서 200 μm 두께의 디스크로 2 g의 PVDF 펠렛을 압축하여 제작하였다. 그 후, 절단 플로터(Silhouette Cameo 4)를 사용하여 200 μm 두께의 디스크에서 지지 링을 절단하였다. 마지막으로, 장치는 1초 동안 75% 진폭으로 초음파 포인트 용접 시스템(수동 LPX 용접 스테이션, Branson)에 의해 조립되었다. 단층 장치를 (1) 지지 링, (2) 마이크로웰 필름, (3) 뚜껑으로 (아래에서 위로) 구성되고 맞춤형 용접 가이드에 따라 용접되어 11개의 용접 스폿의 재현 가능한 패턴을 얻었다. 이중층 장치는 (1) 지지 링 하부층, (2) 마이크로웰 필름 하부층, (3) 뚜껑 하부층, (4) 스페이서 역할을 하는 지지 링, (5) 지지 링 상부층, (6) 마이크로웰 필름 상부층, (7) 뚜껑 상부층의 적층 순서를 제외하고는 유사한 방식으로 조립되었다.
세포 배양
INS1E 래트 인슐린종(insulinoma) β-세포(계대 36-40, Addexbio Technology)를 10%(v/v) 소 태아 혈청(FBS, Sigma), 10 mM HEPES(4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산), 1 mM 피루브산나트륨, 5 mM 글루코스, 23.8 mM 중탄산나트륨 및 50 mM 베타-머캅토에탄올(모두 Thermo Fisher Scientific)이 보충된 L-글루타민(Sigma Aldrich)과 함께 Roswell Park Memorial Institute(RPMI) 1640 배지에서 배양하였다. INS1E 세포는 Rivron 등에 기재된 방법을 통해 의사섬으로 응집되었다[42]. 간단히 말해서, 200 μm 또는 400 μm 너비의 마이크로필러가 있는 폴리디메틸실록산(PDMS) 스탬프를 6웰 플레이트의 바닥에 배치하였다. 가열된 3% UltraPureTM 아가로스(Thermo Fisher Scientific) 용액을 PDMS 스탬프 위에 붓고 냉각 및 응고되도록 하였다. 이어서, 아가로스 디스크를 6웰 플레이트에서 꺼내고, PDMS 스탬프를 제거하였다. 이어서, 아가로스 디스크를 형상에 맞게 절단하고 12웰 플레이트에 넣었다. 각 아가로스 디스크는 직경이 400 μm인 800개의 미세공동 또는 직경이 200 μm인 3200개의 미세공동을 보유하였다. 400 μm 미세공동에 1000, 750 또는 500개 세포를 시딩하거나 200 μm 너비의 미세공동에 250, 100 또는 50개 세포를 시딩하여 3일의 기간에 걸쳐 다양한 크기의 INS1E 의사섬을 응집하였다(도 12A 내지 12G).
인간 섬은 네덜란드 정부로부터 임상 목적으로 인간 섬을 단리할 수 있는 허가를 받은 라이덴 대학 의료 센터(LUMC, Leiden, the Netherlands)의 인간 섬 단리 실험실에 의해 제공되었다. 임상 섬 이식에 적합하지 않은 것으로 간주되었던 인간 섬을 네덜란드 법에 따라 이 실험에 사용하였다. 총 40.000개의 IEQ 인간 섬이 95%의 순도로 얻어졌다. 섬을 10% FBS(Sigma), 10 mM HEPES(Thermo Fisher Scientific), 1% 페니실린-스트렙토마이신(Thermo Fisher Scientific) 및 10 μg/mL 시프로플록사신(Sigma)이 보충된 CMRL-1066 배지(Pan Biotech)에서 배양하였다. INS1E 세포, 의사섬 및 인간 섬을 실험이 시작될 때까지 37℃, 21% O2 또는 5% CO2에서 배양하였다. 명시야 이미지는 PLN2X 대물렌즈가 장착된 Olympus CKX53 현미경을 사용하여 배양 동안 촬영하였다. (의사)섬은 이전에 기재된 바와 같이 섬 전달 장치에 시딩되었다(실시예 1 참조). 간단히 말해서, 시딩 도구를 사용하여 장치의 외부 경계를 고정하여 시딩 중 세포 손실을 방지하였다. Luer lock 주사기에는 무딘-팁 공급 튜브에 연결된 (의사)섬이 로딩되어 섬 전달 장치에서 비워졌다. 장치를 10 mL 배지가 있는 비부착성 55 mm 페트리 접시에 넣었다.
저산소 염색 및 이미징
아가로스 디스크에서 의사섬을 채취하고 0.5 mL 배지에서 150개의 의사섬/구획 밀도로 CELLview 비부착 배양 접시(유리 바닥, 4개 구획, Greiner Bio-One)에 시딩하였다. 샘플을 정상산소(21% O2) 또는 저산소(5% O2)에서 밤새 배양했지만 항상 5% CO2로 배양하였다. 자유 부유 인간 섬을 세 가지 상이한 그룹으로 직접 선택하고 1 mL 배지의 비부착성 24웰 플레이트에서 수집하였다: 소형(< 75 μm), 중형(75 내지 150 μm), 대형(> 150 μm) 및 혼합 직경의 섬. 그 후, 섬을 정상산소 또는 저산소 하에서 2일 동안 배양하였다. 이미징 당일, (의사)섬을 5 μM InvitrogenTM Image-iTTM 녹색 저산소 염료(Fisher Scientific)로 1시간 동안 염색한 후 배지를 8 nM Hoechst 33342(세포핵에 대한 카운터 염색, Thermo Fisher Scientific)로 교체하고 정상산소 또는 저산소에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 저산소 염료는 대기 중 O2 수준이 5% O2 미만으로 떨어지면 형광을 발하기 시작하고 환경에서 O2 수준이 더 감소함에 따라 형광 신호 강도가 증가한다. 저산소 이미징은 Lumencor Spectra X 광원, Photometrics Prime 95B sCMOS 카메라 및 MCL NANO Z500-N TI z-stage가 장착된 자동 도립 Nikon Ti-E 현미경에서 수행되었다. 시스템에는 핀홀 크기가 70 μm인 CrestOptics X-Light V2 회전 디스크 장치가 장착되어 있다. 이미지는 DAPI 및 FITC 방출 필터, CFI Plan Fluor DL 10X 대물렌즈 및 2 x 2 카메라 비닝(binning)과 함께 390 nm 및 480 nm의 여기 파장으로 촬영하였다. 이미지는 FIJI 소프트웨어(https://fiji.sc/)를 사용하여 분석하였다. 저산소 염색 강도는 섬과 배경을 둘 모두 포함하여 (의사)섬을 가로지르는 라인 프로파일에 대해 정량화되었다. 이어서, (의사)섬 내 염료의 형광 강도를 평균화하고, 배경의 평균 형광 강도로 나누어 저산소 염색의 신호 대 잡음비(SNR)를 계산하였다. 저산소 임계값은 저산소에서 배양된 가장 작은 (의사)섬 그룹(< 75 μm)의 평균 SNR로 결정되었다.
산소 이미징
산소 감지 센서 호일(SF-RPSu4, Presens)을 유리 바닥 페트리 접시(12 mm 직경의 유리 바닥, 35 mm 페트리 접시, VWR)의 내부에 접착하고, 70% 에탄올로 세척하고, 세포 배양 배지로 3회 세척하였다. INS1E 의사섬을 1 mL의 배지에 페트리 접시 내에 시딩하였다. 그 후. 저산소(5% O2) 배양 동안 VisiSens 산소 이미징 시스템(Presens)을 사용하여 섬 주변의 국소 산소 농도를 이미지화하였다. 시스템에는 현미경 구성(Presens)이 장착되어 있어 시야각이 2.5 × 1.8 mm에 달한다. 연구에 앞서, 산소 이미징 시스템은 (1) 공기 포화(주변 공기) 및 (2) 1 mg/mL의 아황산나트륨(Na2SO3), 0.5 mol/L 질산 중 50 μL의 질산코발트(Co(NO3)2, 및 100 mL의 수돗물을 혼합하여 실현된 무산소 환경에서 2 포인트 보정 동안 보정되었다. 전용 소프트웨어(VisiSens ScientifiCal 버전 1.10)를 사용하여 4시간에 걸쳐 5분마다 이미지를 촬영하는 시계열(time series)을 얻었다. 그 후, 소프트웨어를 사용하여 의사섬을 가로지르는 라인 프로파일에 대한 산소 농도를 추출하였다. 추출된 데이터는 30개의 데이터 포인트 간격으로 두고 이동 평균으로 평균을 냈다.
계산 모델
본 연구에서 계산 모델은 산소의 이동 및 소비를 설명하는 반응-확산-이류 편미분 식(reaction-diffusion-advection partial differential equation)을 기반으로 개발되었다:
Figure pct00002
상기 식에서, c = c(x,y,t)는 스칼라 수량(scalar quantity)이고, D는 확산 계수이고, u는 외부 속도장(external velocity field)이다. 식 1의 항은 각각 c의 시간적 진화, 관심 도메인에서의 확산, 이류되는 동안의 거동, 및 반응 및 소비 패턴에 해당하다. 이 작업에서는 유체 흐름의 존재 및 영향이 고려되지 않았기 때문에 c를 산소 농도로 간주하는 식 1의 단순화된 형태는 다음과 같이 작성할 수 있다:
Figure pct00003
상기 식에서, C O2 는 mol.m -3 단위의 산소 농도이다. 식의 최종 형태를 얻기 위해, 반응 항은 산소 소비에 대한 Michaelis-Menten과 유사한 식으로 작성되었다[43].
상기 식에서, R max,O2 는 최대 소비율이고, C MM,O2 는 산소 농도에 대한 Michaelis-Menten 상수이고, C cr 은 임계 농도이고, δ는 산소 농도가 임계 농도 미만으로 떨어지는 곳에서 소비를 줄이는 헤비사이드(Heaviside) 함수이다. 식 3은 국부적 글루코스 농도를 고려하여 인슐린 생산의 대사 요구량의 효과를 포함하도록 다시 작성될 수 있다:
Figure pct00005
상기 식에서, φ는 글루코스의 효과를 조정하기 위한 상수이고 C MM,gluc 는 글루코스 농도에 대한 Michaelis-Menten 상수이다. 식 4를 식 2에 추가하면 현재 연구에 사용되는 수송 식의 최종 형태가 된다.
계산 모델은 유한 요소법(finite element method) 및 편미분 식(partial differential equation)을 풀기 위한 도메인별 언어인 FreeFEM 소프트웨어[44]를 사용하여 도출된 식을 풀어 구현되었다. Picard 반복 방법은 수치 구현에서 식의 비선형성을 처리하는 데 사용되었다. 웰의 기하형상은 장치의 웰 형상을 모방하기 위해 반원으로 모델링되었으며 고정된 산소 공급 경계 조건이 웰 경계에 적용되었다(도 11D, 11E). 표 1은 이전 연구에서 보고된 바와 같이 식 2 및 4의 각 매개변수 및 계수의 선택된 값을 요약한 것이다. 웰 내 주변 환경과 섬(조직)을 구별하기 위해 가변 확산 계수를 사용했으며, 소비율은 섬에만 적용되었다. 시뮬레이션의 수치 정확도를 높이기 위해 섬/중간 계면에서 계산 메쉬를 개선하여 단일 섬의 경우 약 7,000개의 요소가 생성되었고 스태킹 시뮬레이션의 경우 약 230,000개의 요소가 생성되었다. 시뮬레이션은 단일 섬 시뮬레이션의 경우 정상 상태에 도달하기에 충분히 긴 시간을 두고 수행되었다. 데이터 비교를 용이하게 하기 위해 스태킹 시뮬레이션에도 동일한 시간 프레임이 사용되었다. 모델은 정상산소 세포 배양(18.5% O2) 또는 저산소 배양(5% O2 또는 이식 직후 섬을 시뮬레이션하는 40 mmHg의 pO2) 동안 마이크로웰의 섬을 나타낸다. 따라서, 모델에는 혈관 내성장이 포함되지 않으며 섬은 산소의 확산에만 의존하다. 또한, 저산소(산소 요구량 감소를 초래함)로 인한 세포 사멸은 포함되지 않았다.
표 1: 단위, 값 및 참조(들)를 포함한 계산 모델의 매개변수 개요
통계
모든 결과는 평균 ± 표준 편차(SD)로 제시되었다. 통계 분석은 Graphpad PRISM 8을 사용하여 수행되었다. p-값 < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다. 그룹 비교는 등분산(Brown-Forsythe 테스트)과 정규성(Shapiro-Wilk 테스트)의 가정을 평가한 후 Tuckey의 사후 테스트와 함께 일원 분산 분석(ANOVA)을 사용하여 수행되었다. 정규성 가정이 검증되지 않은 경우, Dunn 테스트와 함께 Kruskal-Wallis 테스트가 사용되었다. 등분산의 가정이 검증되지 않은 경우, Dunnett의 사후 테스트와 함께 Brown-Forsythe 및 Welch ANOVA 테스트가 수행되었다.
결과
INS1E 의사섬의 저산소 이미징
상이한 세포 수의 INS1E β-세포를 3일의 기간에 걸쳐 응집하여 50개 세포의 경우 53 ± 9.3 μm, 100개 세포의 경우 81 ± 9.1 μm, 250개 세포의 경우 95 ± 6.5 μm, 500개 세포의 경우 168.3 ± 4.4 μm, 750개 세포의 경우 163 ± 5.5 μm, 1000개 세포의 경우 170 ± 7.8 μm의 응집체 직경을 얻었다(도 12A 내지 12G). 동일한 아가로스 칩에서 배양된 세포 클러스터(200 μm 직경의 칩에서 50, 100 및 250개 세포, 400 μm 직경의 칩에서 500, 750 및 1000개 세포)의 응집체 직경에는 유의한 차이가 없었다. 저산소증의 정도는 저산소증(5% O2, 도 12H 및 12I) 또는 정상 산소증(21% O2, 도 12J 및 12K)에서 24시간 배양 후 저산소증 염색으로 평가되었습니다. 저산소증의 강도는 의사섬 직경에 따라 달라졌으며, 평균 SNR은 75 μm 직경 미만의 경우 3.0 ± 1.0, 75-100 μm 직경의 경우 4.4 ± 1.1, 100-125 μm 직경의 경우 8.0 ± 3.7, 125-150 μm 직경의 경우 11.0 ± 3.0, 저산소증에서 배양된 150 μm 직경의 의사섬의 경우 12.6 ± 1.3 이었습니다. 100 내지 125 μm 대 125 내지 150 μm 그룹 및 125 내지 150 μm 대 > 150 μm 그룹을 제외하고는 모든 그룹은 서로 유의하게 달랐다. 저산소 하에서 배양된 가장 작은 의사섬으로부터 얻어진 SNR을 저산소 임계값으로 활용하였는데, 이는 이 임계값 미만의 SNR(SNR = 3.0)이 배경으로 간주되었음을 의미한다. 정상산소 하에서 배양된 의사섬은 또한 75 μm 미만 직경 의사섬의 경우 1.6 ± 0.3, 75 내지 100 μm 직경 의사섬의 경우 1.8 ± 0.1, 100 내지 125 μm 직경 의사섬의 경우 2.0 ± 0.6, 125 내지 150 μm의 경우 2.4 ± 1.3, 그리고 150 μm 초과 직경 의사섬의 경우 3.9 ± 1.1의 평균 SNR을 갖는 크기 의존적 저산소 강도를 나타냈다. 75 μm 미만 및 75 내지 100 μm 그룹은 150 μm 초과 그룹과 유의하게 달랐다. 직경이 150 μm를 초과하는 그룹만이 저산소 임계값을 초과했으며, 이는 150 μm 미만의 INS1E 의사섬이 정상산소증 세포 배양 동안 저산소 상태가 되지 않음을 나타낸다.
인간 섬의 저산소 이미징
저산소의 정도는 저산소(5% O2, 도 13A) 또는 정상산소(21% O2, 도 13B) 하에서 48시간의 배양 후 유사한 저산소 염색을 가진 인간 섬에 대해 평가하고 정량화하였다(도 13C). 저산소 강도는 의사섬 직경에 따라 달라졌으며, 평균 SNR은 저산소에서 배양된 75 μm 미만 직경 섬의 경우 1.6 ± 0.6, 75 내지 100 μm 직경 섬의 경우 1.6 ± 0.3, 100 내지 125 μm 직경 섬의 경우 2.6 ± 1.6, 125 내지 150 μm의 경우 3.2 ± 1.5 그리고 150 μm 초과 직경 섬의 경우 3.9 ± 1.2이다. 2개의 가장 작은 섬 그룹(75 μm 미만 및 75 내지 100 μm)은 2개의 가장 큰 섬 그룹(125 내지 150 μm 및 150 μm 초과)과 유의하게 달랐다. 가장 작은 섬으로부터 얻은 SNR을 다시 저산소 임계값으로 활용하였다. 정상산소 하에서 배양된 인간 섬은 또한 크기 의존적 저산소 강도를 보였으며 이때 평균 SNR은 75 μm 미만 직경 섬의 경우 1.2 ± 0.1, 75 내지 100 μm 직경 섬의 경우 1.2 ± 0.1, 100 내지 125 μm 직경 섬의 경우 1.2 ± 0.1, 125 내지 150 μm의 경우 1.3 ± 0.1, 150 μm 초과 직경 섬의 경우 1.6 ± 0.6이다. 75 μm 미만, 75 내지 100 μm 및 100 내지 125 μm 그룹은 150 μm 초과 그룹과 유의하게 달랐다. 150 μm 초과 직경의 그룹만이 저산소 임계값에 도달했으며, 이는 150 μm 미만의 인간 섬이 정상산소 세포 배양 동안 저산소 상태가 되지 않았음을 나타낸다. 계산 산소 소비 모델은 정상 산소 배양 조건 하에서 50 μm 내지 250 μm의 직경을 갖는 섬 주변의 국소적 산소 수준을 평가하는 데 사용되었다(도 13D 내지 13I). 직경이 150 μm 초과인 섬만 코어(직경 50 μm, 100 μm, 150 μm, 200 μm 및 250 μm 섬의 경우 각각 16% O2, 12% O2, 7% O2, 3% O2, 2% O2)에서 저산소 상태가 되었으며, 이는 5% O2 미만의 산소 수준으로 표시된다.
저산소 배양 동안 INS1E 의사섬의 국소 산소 이미징
산소 이미징 시스템은 저산소 배양 동안 INS1E 의사섬 주변의 국소 산소 수준을 이미지화하는 데 활용되었다. 시계열은 4시간 동안 수집되었으며, 그 동안 5분마다 이미지를 촬영하였다. 처음에는, 인큐베이터 도어를 열어 의사섬을 배양물에 배치했기 때문에 O2 수준이 높았다. 이어서, 배경 O2 수준은 10분 이내에 5% O2에 가깝게 감소하였다. 섬은 O2를 소비할 때 검출되어 국소 O2 수준을 감소시켰다. 4시간의 배양 후, 상이한 크기의 의사섬을 이미지화하고 의사섬의 중심을 가로지르는 라인을 통해 국소 O2 수준을 정량화하였다. 비교적 작은 의사섬(직경 75 μm)의 코어는 2.9% O2에 도달한 반면, 평균 크기의 의사섬(직경 125 μm)의 코어는 0.9% O2에 도달했으며 상대적으로 큰 의사섬(직경 175 μm)의 코어는 0.0% O2에 도달하였다. 계산 산소 소비 모델은 저산소 조건 하에서 다양한 크기의 섬 주변의 국소 O2 수준을 평가하는 데 사용되었다. 시험관내 실험과 유사하게, 시뮬레이션된 섬의 중심을 가로지르는 선을 통해 국소 O2 수준을 정량화하였다. 섬 코어 내의 산소 수준은 각각 50 μm, 100 μm, 150 μm, 200 μm 및 250 μm의 섬 직경의 경우 2.7%, 0.2%, 0.1%, 0.1% 및 0.1% O2에 도달할 것으로 예측되었다.
섬 사이의 최적 거리
계산 산소 소비 모델은 2개의 섬을 시뮬레이션하도록 조정되었다. 시뮬레이션은 정상산소 배양 동안 다양한 섬 직경(50 μm, 100 μm, 150 μm, 200 μm 및 250 μm)과 섬 사이의 거리(0 μm, 100 μm, 200 μm, 300 μm, 400 μm 및 500 μm)를 사용하여 실행되었다(도 14). 직경 200 μm 및 250 μm 섬의 코어는 섬 사이의 거리에 관계없이 무산소 상태가 되었다(접촉할 때와 500 μm 떨어져 있을 때 < 1% O2). 다른 모든 경우에서, 500 μm의 섬-섬 거리는 O2 소비 영역 사이에 중첩되지 않는 것으로 나타났으며, 따라서 이들 섬은 서로 영향을 미치지 않는 2개의 별개의 섬으로 간주되었다. 50 μm의 국소 O2 환경은 섬이 서로 가깝게 배양되었을 때 거의 영향을 받지 않았다(코어에서 O2 수준은 접촉할 때 14% O2로 예측되고 500 μm 떨어져 있을 때 16% O2로 예측됨). 직경 100 μm 섬의 경우, 500 μm(12% O2) 간격에 비해 섬이 0 μm(6% O2), 100 μm(10% O2) 및 200 um(11% O2) 간격일 때 섬 코어 O2 수준이 영향을 받았지만 어떠한 섬-섬 거리에서도 저산소 상태가 예측되지 않았다. 반면, 0 μm(2% O2), 100 μm(4% O2) 또는 200 μm(5% O2) 간격으로 이격되었을 때 직경 150 μm 섬의 코어에서 저산소에 도달했지만, 섬이 300 μm(6% O2), 400 μm(6% O2) 또는 500 μm(6% O2) 간격으로 이격되었을 때는 그렇지 않았다.
임플란트 과충전
계산 산소 소비 모델은 마이크로웰과 유사한 영역(너비 400 μm × 높이 250 μm의 영역) 내에 패킹된 2개, 3개 또는 4개의 섬을 시뮬레이션하도록 조정되었다(도 15A). 상대적으로 작은 섬(직경 50 μm)의 산소 수준은 패킹 밀도 증가에 거의 영향을 받지 않았다(2개 섬의 경우 16% O2, 3개 섬의 경우 15% O2 및 4개 섬/마이크로웰의 경우 14% O2). 직경 100 μm 섬의 산소 수준은 더 작은 섬보다 더 큰 영향을 받았으며, 코어 산소 수준은 2개 섬의 경우 12% O2, 3개 섬의 경우 11% O2 및 4개의 섬/마이크로웰의 경우 10% O2로 예측되었다. 직경 150 μm 섬의 코어는 세 가지 패킹 밀도 모두에서 저산소가 되었으며 패킹 밀도가 증가함에 따라 코어 O2 수준이 더욱 감소한다(2개 섬의 경우 4% O2, 3개 섬의 경우 2% O2 및 4개 섬/마이크로웰의 경우 < 1% O2). 또한, 섬 주변의 저산소 영역은 패킹 밀도가 증가함에 따라 증가하였다. 작은 의사섬(직경 60 내지 80 μm), 평균 크기의 의사섬(직경 90 μm 및 120 μm) 및 큰 의사섬(직경 200 μm 및 275 μm)의 저산소 염색의 대표적인 이미지는 각각 1.8, 2.2 및 5.0의 SNR 값을 보여준다. 저산소 상태는 가장 큰 섬 직경 그룹에서만 검출되었다(SNR = 3.0의 저산소 임계값을 초과함).
장치 층의 적층
인간 섬을 시딩할 수 있었던 단일층 마이크로웰 장치가 제작되었다. 그러나, 계산 모델은 여러 적층된 마이크로웰 층으로 구성된 장치를 시뮬레이션하도록 조정되었다. 마이크로웰 층은 각각 개별 마이크로웰이 있는 일련의 15개의 150 μm 직경의 섬으로 시뮬레이션되었다. 장치 층은 200 μm 또는 500 μm의 두께를 갖는 추가 지지층을 사용하여 서로 거리를 두어 섬 사이의 거리가 300 μm 또는 600 μm가 되도록 했다. 국소 산소 수준은 구조체의 중심을 통해 그려진 수직선 프로파일에 대해 정량화되었다. 단층 장치(250 μm 구조체 두께) 내에 시딩된 섬은 6%의 코어 O2 수준에 도달하였다(도 16, 첫 번째 줄). 마이크로웰 층 사이에 300 μm 간격(650 μm 두께 구조체 생성) 또는 600 μm 간격(950 μm 두께 구조체 생성)을 갖는 이중층 장치 내에 시딩된 섬은 5%의 코어 O2 수준을 얻었다(도 16, 두 번째 및 세 번째 줄). 마이크로웰 층 사이에 300 μm 간격(1150 μm 두께 구조체 생성) 또는 600 μm 간격(1650 μm 두께 구조물체 생성)을 갖는 삼중층 장치는 외부 마이크로웰 층에서 5%의 코어 O2 수준을 얻었지만, 3층 구조체의 중앙층에 로딩된 섬의 경우 4%의 코어 O2 수준이 감소한 것으로 나타났다(도 16, 네 번째 및 다섯 번째 줄).
이중층 장치의 제조
이중층 마이크로웰 구조체는 2개의 단층 장치의 구성요소를 추가 지지 링으로 분리하여 서로의 상부에 적층하여 제조하였다. 타원형 형상의 장치는 직경이 26 × 44 mm였으며 총량은 6000개 마이크로웰이었다. 이러한 이중-마이크로웰 층상 장치의 7개의 상이한 층은 11개의 개별 위치에서 수동으로 포인트 용접되어 각각 세포 시딩에 적합한 3000개의 마이크로웰을 보유하는 2개의 개별 포켓이 있는 세포 전달 장치를 효과적으로 생성하였다(도 17B 왼쪽 및 가운데). 모든 층은 수동 포인트 용접 시스템으로 하나씩 연결되어 구조체의 7개 층을 모두 연결하였다(도 17B, 오른쪽).
논의
적절한 혈관형성은 이식된 이식편의 최적의 생존과 기능을 보장하는 데 필수적이다. 이식된 섬은 대략 14일 내에 혈관이 재형성되는 것으로 알려져 있기 때문에 이식 후 첫 2주 동안 섬은 산소와 영양분의 확산에 크게 의존한다[24]. 더욱이, 산소 경쟁은 인슐린 방출 및 글루코스 반응성을 감소시킨다[26-28, 50]. 따라서, 섬 전달 장치의 설계는 산소에 대한 너무 심각한 경쟁을 일으키지 않으면서 섬의 높은 패킹 밀도를 허용하는 것이 중요하다. 일반적으로, 섬 밀도는 매크로-캡슐화 장치의 부피 분율의 5 내지 10% 범위로 권장되었다[51]. 그러나, 이것은 섬들이 여전히 함께 뭉쳐서 괴사 코어를 형성할 수 있는 대형 장치를 생성한다. 따라서, 다른 사람들은 국소 산소 공급을 강화하여 다양한 전략을 통해 매크로-캡슐화 섬 전달 장치의 섬 패킹 밀도를 높이려고 시도하였다. βair 장치에는 면역장벽으로 덮인 평평한 알지네이트 슬래브 내에 캡슐화된 섬이 포함되어 있다. 슬래브에는 산소-투과성 멤브레인을 통해 산소가 공급되어 가스 혼합물이 캡슐화된 섬에 도달할 수 있도록 하였다[52, 53]. 다른 사람들은 용매 주조 및 입자 침출을 통해 유도된 외부 산소 공급 장치가 있는 PDMS 임플란트를 설명하였다[54]. 불행하게도, 이러한 접근법은 외부 포트를 통해 가스 혼합물을 매일 보충해야 한다. OxySite 장치는 가수분해 반응성 산소-생성 생체재료를 PDMS 디스크에 통합한 또 다른 접근법을 취한다[55]. 이러한 접근법은 하이드로겔 담체 내에 헤모글로블린을 통합하여 하이드로겔을 통한 산소 확산성을 개선하고 산소-생성 생체재료에 의해 생성되는 유해한 부산물인 활성 산소 종을 중화함으로써 더욱 향상되었다[56]. 그럼에도 불구하고, 산소 생성 생체재료의 장기 내구성은 여전히 연구 중이다. 따라서, 본 발명자들은 섬들 사이의 산소 및 영양분에 대한 경쟁을 방지하는 마이크로웰-어레이 장치를 통해 다른 섬과 거리를 두어 상이한 전략을 선택하였다. 현재 연구의 목적은 개방형 마이크로웰 임플란트 내에서 섬 패킹 밀도를 미세 조정하여 장치 치수를 최적화하는 것이었다. 처음에는, 섬 직경이 국소 산소 수준에 미치는 영향을 평가한 다음, 섬-섬 거리, 여러 섬이 있는 마이크로웰의 과충전 및 국소 섬 산소 수준에 마이크로웰 층의 적층과 같은 마이크로웰 설계 매개변수의 영향을 평가하였다.
(의사)섬의 시험관내 배양에 의한 모델 검증
제1 단계는 세포 배양 동안 다양한 크기의 INS1E 의사섬과 인간 섬의 저산소 수준을 평가하는 것이었다. 따라서, INS1E 세포를 아가로스 칩에서 3일의 기간에 걸쳐 의사섬으로 응집하고 수확한 후 정상산소 또는 저산소 하에서 배양하였다. 저산소의 정도는 (의사)섬 직경에 따라 달라지며, 더 큰 응집체에서 저산소 정도가 더 높았으며(도 12I), 이는 섬과 회전타원체 배양에 대한 다른 연구와 중복된다[21, 37, 57]. 아가로스 칩에서 마이크로웰 공동의 영향을 생략하기 위해 응집 칩으로부터 의사섬을 채취하고, 페트리 접시에 평면 베이스를 각 (의사)섬에 제공하였다. 그러나, 이것은 (의사)섬 사이의 상호작용을 허용하여 국소 산소 수준에 영향을 미쳤을 수 있다. 따라서, 그룹 간 저산소 SNR에서 표준 편차의 차이는 배양 동안 섬 사이의 산소 경쟁의 결과일 수 있다. 가장 작은 (의사)섬 그룹(< 75 μm)의 SNR은 각 세포 유형에 대한 저산소 임계값으로 설정되었다. 흥미롭게도, INS1E 의사섬과 인간 섬 둘 모두의 큰 응집체(> 150 μm)는 정상산소 조건에서 배양할 때 저산소 임계값을 초과했다. 의사섬과 인간섬 사이의 이러한 중첩은 응집체 조성으로 설명될 수 있다. 췌장 섬은 다양한 세포 유형으로 구성된다: α-세포(30%), β-세포(60%), γ-, δ- 및 ε-세포(총칭 10%)[16]. 그러나. α-세포와 β-세포의 산소 소비율은 유사하므로 β-세포에만 초점을 맞추어 전체 섬의 산소 소비를 시뮬레이션할 수 있다[21]. 의사섬은 3일 동안 응집체 크기를 제어하기 위해 다양한 세포 밀도로 형성되었다. 그러나, 이전에 INS1E 세포에 대해서도 설명한 바와 같이 집합체 크기는 상대적으로 낮은 시딩 밀도의 경우 유의하게 다르지 않았다[58]. 의사섬 직경은 500 내지 1000개의 세포 응집체에 대해 유사했으며, 이러한 세포 밀도의 차이는 더 큰 의사섬에서 SNR의 증가된 표준 편차를 설명할 수 있다.
계산 O2 소비 모델은 직경이 50 내지 250 μm 범위인 췌장 섬의 국소 O2 조건을 시뮬레이션하는 데 사용되었다(도 13D 내지 13I). 마이크로웰 장치의 얇은(두께 5 내지 10 μm) 다공성 구조로 인해 장치가 인간 섬으로의 산소 확산에 영향을 미치지 않을 것으로 가정되었다. 이는 낮은 산소-투과성 PDMS로 만든 고체의 10 μm 두께 마이크로웰이 단 몇 초의 O2 침투 시간을 보였으며 이는 얇은 중합체 필름이 산소 투과성에 거의 영향을 미치지 않는다는 것을 나타내는 Lee 등의 연구에 의해 뒷받침된다[59]. 국소 O2 수준의 인실리코 조절을 위한 경계 조건은 18.6% O2로 설정되었는데, 이는 5% CO2 하에서 세포를 시험관내 배양하면 해수면에서 배양될 때 최대 산소 농도가 18.6%가 될 것이기 때문이다[60]. 이 모델은 다른 계산 모델에서 관찰된 바와 같이 섬의 직경이 증가함에 따라 저산소가 증가할 것으로 예측하였다[26, 37, 38, 41, 57]. 저산소 염색 결과에 따라, 섬 직경이 150 μm를 초과하면 저산소에 도달하였다.
모델은 또한 저산소 조건 하에서 배양된 의사섬의 국소 산소 수준을 예측하는 데 사용되어 의사섬을 생체내에 막 이식하였을 때의 상황을 시뮬레이션하였다. 국소 O2 이미징을 사용하여 의사섬의 저산소 염색에서 얻은 결과를 확인하였다. 직경이 75 μm, 125 μm 또는 175 μm인 세포 응집체를 산소에 민감한 센서 호일 위에 저산소 조건 하에서 배양하고 시간이 경과함에 따라 추적하였다. 다양한 크기의 의사섬 주변의 국소 O2 수준을 응집체의 중심을 통과하는 라인 프로파일에 걸쳐 정량화하고 모델에 의해 예측된 국소 O2 수준과 비교하였다. 다시 말하지만, 의사섬 직경은 (> 100 μm)보다 큰 응집체에 대해 무산소 조건(< 1% O2)과 함께 국소 O2 수준에 영향을 미쳤다. 국소 산소 수준은 사용된 배지의 양(따라서 확산 거리)에 따라 크게 달라지므로 인실리코와 시험관내 결과 사이의 정확한 O2 수준을 비교하는 데 주의해야 한다[37, 60, 61]. 그러나, 국소 O2 수준에 대한 의사섬 직경의 영향은 모델과 O2 이미징 데이터 둘 모두에서 관찰되었다.
섬 사이의 최적 거리
계산 모델과 시험관내 데이터 사이의 높은 중첩으로 인해 모델은 검증된 것으로 간주되어 섬 사이의 거리부터 시작하여 섬 사이의 다양한 패킹 밀도를 시뮬레이션하는 데 사용되었다. 국소 O2 수준은 정상 산소 배양 동안 크기(직경 50 내지 250 μm)와 섬-섬 거리(0 내지 500 μm) 범위의 섬에 대해 예측되었다(도 14). 본 발명자들이 아는 한, 이것은 섬 사이의 공간 분포가 국소 산소 수준에 미치는 영향을 예측하는 계산 모델을 설명하는 첫 번째 논문이다. 500 μm의 섬-섬 거리는 어떤 섬 크기에서도 O2 환경 사이에 중첩되지 않는 것으로 나타났으며, 따라서 이들 섬은 서로 영향을 미치지 않는 2개의 개별 섬으로 간주되었다. 직경이 200 μm 이상인 섬은 섬-섬 거리에 관계없이 무산소화된 코어를 나타냈다. 직경 50 μm 섬의 국소 O2 환경은 섬-섬 거리의 영향을 거의 받지 않았는데, 이는 상대적으로 작은 응집체의 제한된 산소 소비로 인한 것일 가능성이 크다. 섬이 200 μm 미만으로 이격되어 있을 때 직경 100 μm 섬의 코어 O2 수준은 영향을 받았지만 임의의 섬-섬 거리에 대해서는 저산소 상태가 예측되지 않았다. 반면에, 300 μm 미만의 간격으로 이격되었을 때 직경 150 μm 섬의 코어에서 저산소에 도달하였다. 따라서. 300 μm의 섬-섬 거리는 일반 크기의 섬에 최적인 것으로 간주되었다.
마이크로웰 과충전
증가된 마이크로웰 패킹 밀도는 단일 마이크로웰 내에서 여러 섬을 시뮬레이션하여 평가되었다. 50 μm 섬의 국소 O2 수준은 최대 4개의 섬을 마이크로웰에 로딩했을 때에도 거의 영향을 받지 않은 반면, 100 μm 섬은 국소 산소 수준에서 적당한 감소를 보였다(도 15A). 근접하게 배양된 직경 50 μm 및 100 μm의 의사섬의 저산소 염색은 저산소 임계값에 도달하지 않았다(도 15B, 15C). 반면에, 직경 150 μm 섬의 코어 O2 수준은 2개의 섬/마이크로웰의 시딩 밀도로 저산소 조건에 도달하도록 시뮬레이션되었다. 이것은 두 섬 사이의 거리가 300 μm 미만이었기 때문에 최적의 섬-섬 거리와 관련이 있을 수 있다. 저산소 염색은 근접하게 배양된 더 큰 의사섬에서 저산소의 존재를 확인하였다(도 15D). 전체적으로, 섬-섬 거리와 유사하게, 마이크로웰의 과충전 정도는 섬 크기에 따라 달랐다. Cao 등은 유사한 결과를 얻었고, 500 μm 두께의 알지네이트 캡슐 내에 캡슐화된 300 μm 직경의 섬이 유사한 알지네이트 캡슐에 있는 4개의 100 μm 섬에 비해 더 심각한 저산소증을 보였다고 보고하였다[38].
적층
장치 치수에 가장 영향력 있는 업스케일링 전략은 여러 마이크로웰 층을 적층하는 것이다. 계산 모델을 변경하여 15개의 섬이 각각 단일, 이중 또는 삼중 층 장치와 유사한 1개, 2개 또는 3개 층을 시뮬레이션하였다. 이전에 논의한 최적의 섬-섬 거리를 고려하여, 섬은 층 내에서 서로 300 μm 분리되었다. 층 사이의 거리는 300 μm 내지 600 μm로 다양했는데, 이는 본 발명자들이 여러 층의 증가된 섬 패킹 밀도가 섬 사이의 심각한 O2 경쟁을 방지하기 위해 층 사이의 더 큰 거리가 필요할 수 있다는 가설을 세웠기 때문이다. 흥미롭게도, 층 사이의 거리가 아닌 층의 양이 섬 코어 O2 수준에 영향을 미쳤다. 삼중층 장치의 중간층에서 시뮬레이션된 섬은 외부층에 비해 더 낮은 O2 수준을 경험하는 것으로 나타났으며, 이는 삼중층 장치에 비해 이중층 장치의 우수성을 나타낸다. Johnson 등은 다층 알지네이트 슬래브의 중간 층으로 시뮬레이션된 섬에 대해서도 유사한 결과를 얻었다[62]. 또한, 알지네이트 슬래브로 캡슐화된 섬과 그 환경 사이의 확산 거리는 국소 산소 수준에 중요한 역할을 하는 것으로 이전에 보고되었다[38]. 이중층 알지네이트 슬래브는 이 원고에서 논의된 이중층 장치와 유사하게 두 층 모두에 대해 확산 거리가 상대적으로 짧기 때문에 다층 슬래브보다 더 나은 성능을 보였다.
층 거리가 600 μm인 삼중층 장치의 중간층 내에 있는 섬은 더 넓은 확산 거리, 특히 산소의 최대 확산 거리가 200 μm라는 점을 고려할 때 층 거리가 300 μm인 삼중층 장치보다 더 심각한 저산소에 도달할 것으로 예상되었다[31, 32]. 그러나, 계산 모델 구현 방법론에서 언급한 바와 같이, 모든 시뮬레이션에 사용된 시간은 단일 섬이 정상 상태에 도달하는 데 필요한 시간과 동일하도록 선택되었다. 이를 통해 다양한 시뮬레이션 결과를 서로 비교할 수 있다. 그러나, 적층 모델은 현재 웰 사이의 산소 수송을 정확하게 설명할 수 없는데, 이는 모델이 원래 주변 경계에 적절한 산소 공급 경계 조건이 적용된 단일 웰 내부의 상황만을 모방하도록 개발되었기 때문이다. 정상 상태에 도달하기 위해 시뮬레이션을 계속 적층하면 공급 부족으로 인해 확산된 모든 O2가 중간층에서 소비될 것이다. 그러나, 시뮬레이션 시간을 단일 웰 시뮬레이션의 정상 상태 시간과 동일하게 유지하면 웰이 장치 내부에 적층된 상태를 모방하였다. 이러한 가정을 통해, 시뮬레이션 결과는 삼중층 장치의 중간층과 같이 O2 공급 경계에서 멀리 떨어진 층이 더 낮은 O2 수준을 경험했음을 확인하였다. 웰간(inter-well) 공간에 대한 모델 설명을 개선하고 시뮬레이션 시간을 늘리면 이중층 구성과 삼중층 구성 간의 국소 O2 수준에서의 더 뚜렷한 차이가 드러날 수 있다.
임상적으로 관련된 장치 치수
본 발명자들은 원하는 섬 용량 및 장치 설계를 기반으로 마이크로웰-어레이 세포 전달 장치의 장치 치수를 계산할 수 있는 장치 크기 계산기에 대해 이전에 발표하였다[개방형 장치 논문 참조]. 매크로-캡슐화 섬 전달 장치에 대한 최적의 섬-섬 거리, 과충전 정도 및 층의 양을 알면 임상적으로 관련된 장치 치수에 대한 예측을 개선할 수 있다. 장치 크기 계산기의 중요한 매개변수는 150 μm 직경의 섬을 기준으로 이식된 섬의 평균 섬 직경을 나타내는 IEQ/섬 수로 계산된 섬 단리 지수(또는 섬 크기 지수)이다. CIT에 사용된 인간 섬 제제의 섬 단리 지수는 0.5 내지 2 범위로 보고되었다[33, 63-67]. 따라서, 섬 단리 수 1과 1.25 IEQ/웰의 약간의 과충전을 고려하면 직경 8 × 16 cm의 2개의 이중층 장치에 분포된 300,000 IEQ를 이식할 수 있다. 최근에는, 600명이 넘는 환자에 대해 후복직근초(posterior rectus sheath) 평면의 치수를 정량화하여 이 부위에서 매크로-캡슐화 세포 전달 장치의 가능한 크기를 계산하는 데 사용하였다. 타원형 형상의 세포 전달 장치는 복막 전 공간에 이식하기 위해 직사각형 및 원형 형상의 장치보다 우수한 것으로 나타났으며 8.3 × 16.6 cm 크기의 타원형 장치와 동일한 108 cm2의 평균 면적을 가진 장치를 보유할 수 있었다[68]. 따라서 8 × 16 cm의 장치 치수는 복막 전 부위에 이식하는 데 합리적인 것으로 보이다. 중요한 것은 다른 전략을 통해 섬 사이의 O2 경쟁을 더욱 감소시키면 장치 내의 섬 패킹 밀도를 증가시켜 더 많은 섬을 로딩하거나 장치 치수를 감소시킬 수 있다는 것이다. 삼중층 구조체의 중심층 내의 섬에서 경험하는 저산소는 OxySite 장치 내에서 사용되는 것과 같은 산소 방출 마이크로비드에 의해 감소될 수 있다[69]. 예를 들어, 삼중층 장치(300,000 IEQ의 경우 직경이 6.5 × 13 cm인 2개의 장치)를 만들어 장치 치수를 감소시키거나, 8 × 16 cm의 2개의 삼중층 장치 위에 300,000 IEQ 대신 450,000 IEQ를 로딩할 수 있다.
결론
저산소 염색 및 INS1E 응집체 및 인간 섬의 O2 이미징과 중첩된 계산 모델로 시뮬레이션된 췌장 섬 주변의 예측된 국소 산소 수준. 췌장 섬 주변의 국소 O2 수준은 섬의 직경에 의해 크게 좌우되었다. O2를 얻기 위해 확산에만 의존하는 고립된 췌장 섬은 섬의 직경이 > 150 μm인 경우 정상산소 배양(18.6% O2) 동안 저산소(< 5% O2)가 된다. 결과적으로, O2에 대한 광범위한 경쟁을 방지하기 위해 일정한 크기의 섬(직경 150 μm)은 300 μm 간격으로 떨어져 있어야 하다. 반면에, 섬이 마이크로웰 위에 분포될 수 있는 매크로-캡슐화 전략에서는 상대적으로 작은 섬(직경 100 μm 이하)의 경우 마이크로웰의 과충전이 가능하다. 이중층 장치는 여전히 섬을 향한 O2가 충분히 확산되도록 하여 층 간의 O2 경쟁을 방지한다. 반면, 삼중층 장치는 O2에 대한 경쟁이 증가한 것으로 나타났다. 이러한 업스케일링 전략을 고려할 때, 마이크로웰 장치 설계의 업스케일링 버전은 복막 전 부위에서 이식하기에 적합한 장치 치수와 함께 임상적으로 관련된 섬 번호를 수용할 수 있는 것으로 나타났다.

Claims (15)

  1. 대상체에 세포를 이식하기 위한 개방형의 이식 가능한 세포 전달 장치로서,
    - 복수의 기공을 갖는 표면 영역을 갖는 하부 필름;
    - 복수의 기공을 갖는 표면 영역을 가지며, 내부 공간을 생성하기 위해 상부 필름이 하부 필름을 실질적으로 덮도록 하부 필름의 상부에 위치하는 상부 필름
    을 포함하고,
    여기서 하부 필름과 상부 필름은 생체적합성 생체재료로부터 형성되고,
    하부 필름은 상기 마이크로웰의 개방 측면과 함께 상부 필름의 표면 영역을 향하도록 위치된 복수의 마이크로웰을 포함하고,
    하부 필름 및 선택적으로 상부 필름의 기공 크기는 기공을 통해 장치 내에서 혈관 형성 또는 혈관 내성장을 허용하는 정도인, 개방형의 이식 가능한 세포 전달 장치.
  2. 제1항에 있어서,
    - 지지 구조물이 상부 필름과 하부 필름의 표면 영역의 평면에 위치하도록 하부 필름의 표면 영역과 상부 필름의 표면 영역 주위에 실질적으로 위치하는 지지 구조물을 추가로 포함하고, 여기서 하부 필름과 상부 필름은 상부 필름, 하부 필름 및 내부 공간과 주변 사이의 접촉을 허용하는 지지 구조물 사이에 하나 이상의 개구부를 남기도록 하는 등 하나 이상의 위치에서 지지 구조물에 부착되고, 바람직하게는 지지 구조물은 또한 생체적합성 생체재료로부터 형성되는 것인, 개방형의 이식 가능한 세포 전달 장치.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 생체적합성 생체재료는 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF), 폴리카보네이트(PC), 폴리프로필렌(PP), 폴리(에틸렌 테레프탈레이트(PET), 폴리(염화비닐)(PVC), 폴리아미드(PA), 폴리에틸렌(PE), 폴리이미드(PI), 폴리아크릴레이트, 폴리올레핀, 폴리설폰(PSF), 테트라플루오로에틸렌/폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE), ePTFE(확장 폴리테트라플루오로에틸렌), 폴리에테르설폰(PES), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리(메틸 메타크릴레이트)(PMMA), 폴리(락트산)(PLA) 또는 이들의 조합으로부터 선택되는, 개방형의 이식 가능한 세포 전달 장치.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 마이크로웰은 200 내지 1000 μm, 바람직하게는 250 내지 950 μm, 보다 바람직하게는 300 내지 900 μm의 직경을 갖는, 개방형의 이식 가능한 세포 전달 장치.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 하부 필름 및 선택적으로 상부 필름의 기공 크기는 5 내지 100 μm, 바람직하게는 10 내지 80 μm, 보다 바람직하게는 15 내지 60 μm, 가장 바람직하게는 20 내지 55 μm인, 개방형의 이식 가능한 세포 전달 장치.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 마이크로웰은 세포를 포함하고, 바람직하게는 세포는 오가노이드(organoid) 또는 세포 클러스터이고, 보다 바람직하게는 세포 또는 세포 클러스터는 내분비 세포 또는 사이토카인 생산 세포 또는 이의 클러스터이거나 이를 포함하고,
    보다 바람직하게는 세포 또는 세포 클러스터는 섬 세포, 신장 세포, 갑상선 세포, 흉선 세포, 고환 세포, 췌장 세포 또는 이의 클러스터로부터 선택되거나, 보다 바람직하게는 오가노이드는 장 오가노이드, 위 오가노이드, 갑상선 오가노이드, 흉선 오가노이드, 고환 오가노이드, 간 오가노이드, 췌장 오가노이드, 상피 오가노이드, 폐 오가노이드, 신장 오가노이드, 위배체(배아 오가노이드), 배반포 유사체(blastoid)(배반포-유사 오가노이드), 심장 오가노이드, 망막 오가노이드 또는 교모세포종 오가노이드로부터 선택되는, 개방형의 이식 가능한 세포 전달 장치.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 마이크로웰은 600 내지 1000 μm, 바람직하게는 700 내지 900 μm, 보다 바람직하게는 750 내지 850 μm의 직경을 가지며, 선택적으로 웰은 하이드로겔로 캡슐화된 오가노이드 또는 세포 클러스터를 포함하는, 개방형의 이식 가능한 세포 전달 장치.
  8. 제7항에 있어서, 하부 필름 및 선택적으로 상부 필름의 기공 크기는 5 내지 200 μm인, 개방형의 이식 가능한 세포 전달 장치.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 장치는 상부 필름, 하부 필름 및/또는 지지 구조물의 PVDF에 주입되거나 그 위에 코팅된 약물을 포함하는, 개방형의 이식 가능한 세포 전달 장치.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 장치는 서로의 상부에 적층되고 선택적으로 스페이서에 의해 분리된 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 정의된 개방형의 이식 가능한 세포 전달 장치의 2개 이상의 적층형 버전을 포함하는, 개방형의 이식 가능한 세포 전달 장치.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 질환의 치료, 예방 또는 개선에 사용하기 위한, 개방형의 이식 가능한 세포 전달 장치.
  12. 제11항에 있어서, 치료는 당뇨병, 바람직하게는 제1형 당뇨병의 치료인, 개방형의 이식 가능한 세포 전달 장치.
  13. 개방형의 이식 가능한 세포 전달 장치를 구성하는 방법으로서, 상기 방법은:
    복수의 기공을 갖는 표면 영역을 가지며 복수의 마이크로웰을 추가로 포함하는 하부 필름을 제공하는 단계;
    마이크로웰의 개구부가 상부 필름을 향하도록, 선택적으로 복수의 기공을 갖는 표면 영역을 갖는 상부 필름을 하부 필름에 위치시켜, 마이크로웰과 개방 접촉되는 하부 필름과 상부 필름 사이에 내부 공간을 생성하는 단계; 및
    선택적으로, 지지 구조물이 하부 필름과 상부 필름의 가장자리와 적어도 부분적으로 중첩되도록 필름과 동일한 평면에서 하부 필름과 상부 필름의 조립체 주위에 지지 구조물을 실질적으로 위치시키는 단계;
    내부 공간에 접근할 수 있는 여러 개의 개구부를 남기도록 하는 등 하부 필름과 상부 필름을 두 곳 이상에서 스폿 용접하여 하부 필름과 상부 필름을 서로 및/또는 선택적으로 지지 구조물에 부착하는 단계
    를 포함하고,
    여기서 하부 필름 및 선택적으로 상부 필름의 기공 크기는 기공을 통해 장치 내에서 혈관 형성 또는 혈관 내성장을 허용하는 정도인, 방법.
  14. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 정의되거나, 제12항에 따른 방법에 의해 수득되거나 수득 가능한 개방형의 이식 가능한 세포 전달 장치에 세포를 시딩하는 방법으로서, 상기 방법은:
    세포용 용기를 튜브의 제1 말단과 연결하고, 튜브의 제2 말단을 개방형의 이식 가능한 세포 전달 장치의 개구부를 통해 내부 공간이 용기와 개방되게 연결되도록 내부 공간에 삽입하는 단계;
    나머지 개구부가 모두 밀봉되도록 개방형의 이식 가능한 세포 전달 장치의 외부를 클램핑하는 단계;
    적합한 배지에 현탁된 세포 또는 세포 클러스터를 용기에 로딩하는 단계;
    세포가 튜브를 통해 용기로부터 개방형의 이식 가능한 세포 전달 장치의 내부 공간으로 흘러들어가도록 하면서 과잉 배지가 기공을 통해 배출되도록 하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  15. 제14항에 있어서, 세포는 중력에 의해 튜브를 통해 개방형의 이식 가능한 세포 전달 장치의 내부 공간으로 흘러 들어가도록 하는, 방법.
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