JP5717253B2 - 膵島細胞シート、製造方法及びその利用方法 - Google Patents

Description

本発明は、医学、生物、創薬、薬学等の分野において有用な膵島細胞シート、製造方法及びその利用方法に関するものである。

膵臓はアミラーゼ等の消化酵素を十二指腸内へ分泌する外分泌腺と膵島からなる生体内の重要な臓器の一つである。膵臓の９０％以上は外分泌線が占め、その中に、内分泌細胞の塊である膵島が島のように浮かんだように存在している。膵島は、動物の臓器の一つである膵臓の中でグルカゴンを分泌するα細胞(Ａ細胞)、血糖量を低下させるホルモンであるインスリンを分泌するβ細胞(Ｂ細胞)、ソマトスタチンを分泌するδ細胞および膵ポリペプチドを分泌するＰＰ細胞の４種の内分泌細胞からなる。その中でβ細胞とは、多くの脊椎動物の膵臓内に散在する球形の内分泌腺組織で、主にインスリンを分泌し血糖の調節を行う。膵島の直径は１００〜３００μｍであり、ヒトの場合、膵臓１ｍｇにつき１０〜２０個あり、膵臓全体で１００万個以上存在すると言われている。齧歯類では、膵島の中心部にβ細胞が位置し、α、δ、ＰＰ細胞が周辺部に位置するが、ヒトにおいては、この分布は齧歯類ほどは明確ではない。

この膵島の機能に障害がおこると深刻な疾患を引き起こす。例えば、β細胞によるインスリン分泌が廃絶すると重症糖尿病となる。この重症糖尿病症例においては、血糖コントロールが非常に困難であることが多く、糖尿病関連の合併症に加え、インスリン投与後の低血糖発作を生じることも多く、生活の質（ＱＯＬ）はきわめて不良となる。

このような重症糖尿病患者に対し、これまでにさまざまな治療がなされてきた。その中で、膵島移植は安定したインスリンの供給を目的とした治療法であり、膵臓という臓器そのものを移植したときと比べ低侵襲であることから、最近、注目を浴びるようになってきた。今では組織工学的な技術が加わり、例えば、特許文献１ではその膵島を生体外のハニカム状多孔質体上で製造する方法、特許文献２では三次元培養装置で膵島を製造する方法等が開発されるようになってきた。膵島移植関連技術は多くの開発者らによって検討されているが、ここで利用される細胞は膵島、もしくは膵島様の塊であり、それらを移植するとなると、その塊の内部の細胞まで栄養分や酸素を供給するために、門脈等の血管の中や肝臓組織等の血流の豊富な部位へ行わざるを得ないのが現状である。近年、移植方法に関するプロトコールが確立され治療成績が向上してきたが、それでも糖尿病患者の１年後のインスリン投与離脱率は４５％程度に過ぎないと言われている（非特許文献１参照）。この手技の問題点として、即時型血液媒介性炎症反応（ＩＢＭＩＲ）と、膵島による塞栓門脈域の虚血に伴う炎症反応が挙げられる。その結果、移植された膵島の半数以上が失われることとなる（非特許文献２、３、４参照）。これらの問題を解決すべく、膵島にさらなる組織工学的加工を施されることが望まれている。

このような背景のもと、特許文献３には、水に対する上限若しくは下限臨界溶解温度が０〜８０℃であるポリマーで基材表面を被覆した細胞培養支持体上にて、細胞を上限臨界溶解温度以下または下限臨界溶解温度以上で培養し、その後上限臨界溶解温度以上または下限臨界溶解温度以下にすることにより酵素処理なくして培養細胞を剥離させる新規な細胞培養法が記載されている。また、特許文献４には、この温度応答性細胞培養基材を利用して皮膚細胞を上限臨界溶解温度以下或いは下限臨界溶解温度以上で培養し、その後上限臨界溶解温度以上或いは下限臨界溶解温度以下にすることにより培養皮膚細胞を低損傷で剥離させることが記載されている。温度応答性細胞培養基材を利用することにより、従来の培養技術に対しさまざまな新規な展開をはかれるようになってきた。特許文献５では、その技術をさらに発展させ、肝組織内に存在する実質細胞を細胞シートとすることで、従来技術では困難であった肝組織細胞機能を長期にわたり維持させられることが分かってきた。しかしながら、特殊な形態を有する膵島についてはこれまで何ら検討されていなかった。

特開２００８−２７８７６９号公報 特開２００６−３０４７９１号公報 特開平０２−２１１８６５号公報 特開平０５−１９２１３８号公報 再表２００７−０８０９９０号公報

Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３５５，１３１８−１３３０（２００６） Ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，１４（４），２８８−２９７（２００７） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ，７７（５），５８７−５９７（２００５） Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ，５８，１９４−２４３（２００６）

本発明は、上述したような膵島移植技術に関する問題点を解決することを意図してなされたものである。すなわち、本発明は、従来技術と全く異なった発想からの新規な膵島細胞シート、製造方法及びその利用方法を提供するものである。

本発明者らは、上記課題を解決するために、種々の角度から検討を加えて研究開発を行ってきた。その結果、膵島に対しその形態を壊し、シート状に再構築することで、血管内へ移植する必要がなくなり、血流の乏しい組織においても生着することを見出した。本発明はかかる知見に基づいて完成されたものである。

すなわち、本発明は、血管内以外の部位へ移植可能なインスリン産生機能を有する膵島細胞シートを提供するものである。また、本発明は、この膵島細胞シートを温度応答性ポリマーが被覆された基材表面で作製する方法を提供するものである。さらに、本発明は得られた膵島細胞シートを利用する方法を提供するものである。本発明は、細胞シートという世界に類のない新規な発想による細胞構造物を使ってはじめて実現する極めて重要な発明と考えている。

本発明に示される膵島細胞シートであれば、膵島細胞を血管内のような血流の中へ移植する必要がなく、例えば皮下組織のような血流の乏しい組織への移植でも膵島細胞自身が持つ機能を十分に発現させられるようになる。

図１は、実施例１の概要を示す図である。 図２は、実施例１の細胞シートの剥離の概要を示す図である。 図３は、実施例１の温度応答性培養皿上で培養された膵島細胞を示す図である。倍率は１００倍である。 図４は、実施例１の温度応答性培養皿上で培養された膵島細胞内に存在するインスリンを染色した図である。倍率は４００倍である。 図５は、実施例１の培地中の糖濃度に応じたインスリン分泌能を検討した結果を示す図である。 図６は、実施例１の温度応答性培養皿上で培養された膵島細胞シートを剥離するときのようすを示す図である。 図７は、実施例１で得られた膵島細胞シートをＨＥ染色した結果を示す図である。倍率は４００倍である。 図８は、実施例１で得られた膵島細胞シート内のインスリンを染色した結果を示す図である。倍率は４００倍である。 図９は、実施例１で得られた膵島細胞シートをラットの背部の皮下に移植するときのようすを示す図である。 図１０は、実施例１で移植部位から摘出された膵島細胞シート内のインスリンを染色した結果を示す図である。 図１１は、実施例４で糖尿病化SCIDマウスへの膵島細胞シート移植後の血中グルコース量（濃度）の変化の結果を示す図である（表題：ストレプトゾトシン誘発糖尿病化ＳＣＩＤマウスにおけるラット膵島細胞シート移植後の血中グルコース量の変化）。

なお、図１１に記載のグラフは次の条件に基づくデータを示したものである。
Non fasting blood glucose levels of the streptozotocin-induced diabetic SCID mice after transplantation. At day 0, 2 islet cell sheets (triangle: n=5) or single islet cells (circular: n=3) were transplanted into the subcutaneous space on the dorsal site of diabetic SCID mice. Sham-operation (square: n=4). Data are showed as mean ± SEM. *P < 0.05 (Student’s t test)
即ち、図１１は、ストレプトゾトシン誘発糖尿病化ＳＣＩＤマウスにおけるラット膵島細胞シート移植後の非絶食状態における血中グルコース量の変化を表している。０日及び２日後に膵島細胞シート（三角：ｎ＝５）または個別の膵島細胞（黒丸：ｎ＝３）が糖尿病化ＳＣＩＤマウスの背面の皮下に移植された。擬似手術されたマウス（四角：ｎ＝４）を対照とした。データはmean ± SEMとして示した。Ｐ＜０．０５（チューデントのt検定）。
図１２は、実施例５で糖尿病化SCIDマウスへ膵島細胞シート移植を行った後のグルコース負荷試験を行ったときの血中グルコース量（濃度）の変化の結果を示す図である（表題：グルコース負荷試験）。

なお、図１２に記載のグラフは次の条件に基づくデータを示したものである。
Intraperitoneal glucose tolerant test (IPGTT, 2g of glucose/kg body wt) of the streptozotocin-induced diabetic or non-diabetic SCID mice that received 2 islet cell sheets. IPGTT was performed 60 days after islet cell sheet transplantation. IPGTT results showing glucose concentrations before (time 0) and 15, 30, 60, 90, 120, 150 min after glucose administration. Diabetic SCID mice with 2 islet cell sheets (n=7, triangle), diabetic SCID mice with sham-operation (n=5, square), non-diabetic SCID mice without islet cell sheet transplantation (n=11, circle). Data were represented as the mean ± SEM.
即ち、図１２は、２枚の膵島細胞シート移植を受けた、ストレプトゾトシン誘発糖尿病化または非糖尿病化ＳＣＩＤマウスの腹腔内グルコース負荷試験（ＩＰＧＴＴ，体重１ｋｇ当たり２ｇのグルコース）の結果を示す。ＩＰＧＴＴは、膵島細胞シート移植後６０日目に実施した。ＩＰＧＴＴの結果は、グルコース投与前（０分）及びグルコース投与後１５分、３０分、６０分、９０分、１２０分、１５０分におけるグルコース濃度を示す。この試験において使用したマウスは、２枚の膵島細胞シートを有する糖尿病化ＳＣＩＤマウス（ｎ＝７，三角）、擬似手術された糖尿病化ＳＣＩＤマウス（ｎ＝５，四角）、及び膵島細胞シート移植を受けた非糖尿病化ＳＣＩＤマウス（ｎ＝１１，黒丸）である。データはmean ± SEMとして示した。
図１３は、実施例６で糖尿病化SCIDマウスへ膵島細胞シートを移植した後の膵島細胞シートのようすを示す図である（表題：膵島細胞シート移植後の組織学的解析（インシュリン免疫染色））。

本発明の膵島細胞シートに使用される膵島細胞は膵臓より回収した細胞である。本発明では、その中にインスリン産生機能を発現するβ細胞が含まれていれば良く、そのβ細胞の含有比率は何ら制約されるものではないが、本発明の膵島細胞シートの本来の目的がインスリンの産生であることを考えると、好ましくはβ細胞の含有比率は４０％以上、さらに好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上である方が好都合である。β細胞以外の細胞の種類、比率についても何ら制約されるものではなく、膵島に含まれるα細胞、δ細胞、ＰＰ細胞が含まれていても良い。本発明の膵島細胞シート内にα細胞が含まれればグルカゴンも産生する膵島細胞シートとなり、ＰＰ細胞が含まれれば膵ポリペプチドを分泌する膵島細胞シートとなり、より膵島様の機能を発現するという意味で好ましい。本発明の膵島細胞シートであれば、膵島細胞シート周囲の糖濃度を感知し、その濃度に応じてインスリン、及び／または膵島が産生するその他の生理活性物質を産生することとなる。本発明では、さらに、本来、膵島に含まれている細胞以外のものが含まれていても良く、その種類については何ら制約されるものではないが、例えば、セルトリ細胞、膵管細胞、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、肝実質細胞、骨髄由来細胞、脂肪由来細胞のいずれか１種、もしくは２種以上の細胞が混合したものが挙げられる。また、それらの細胞のそれぞれの含有比率についても特に限定されるものではない。

本発明で用いられる細胞は、生体組織から直接採取した細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性幹細胞（胚性幹細胞）等の生体組織から直接採取しその後培養系等で分化させた細胞、或いは細胞株が挙げられるがその種類は、何ら制約されるものではない。これらの細胞の由来は特に制約されるものではないが、例えば、ヒト、或いはラット、マウス、モルモット、マーモセット、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、チンパンジーあるいはそれらの免疫不全動物等が挙げられるが、本発明の膵島細胞をヒトの治療に用いる場合はヒト、ブタ、チンパンジー由来の細胞を用いる方が望ましい。本発明における細胞培養のための培地はＲＰＭＩ１６４０等の培養される細胞に対し通常用いられるものを用いれば特に制約されるものではない。

本発明では、膵島内の細胞を酵素処理することで個々の状態とする必要がある。膵島は安定した細胞塊であるが、それを生体に移植する際は、移植されるものが細胞塊であるがために血流の豊富な血管内へ移植せざるを得なかった。本発明ではその安定な膵島をさらに個々の細胞へ分散させるものであり、その分散操作によりβ細胞等の有用細胞が若干損傷を受けるものの、得られた膵島細胞シートは細胞塊のように厚みのあるものでなく、従って細胞塊のように血流の豊富な血管内へ移植する必要がなくなる。その際の処理方法については常法に従えば良く、何ら制約されるものではない。また、培養時に播種する細胞数は使用細胞の動物種によって異なるが、一般的に０．４×１０^６〜２．５×１０^６個／ｃｍ^２が良く、好ましくは０．５×１０^６〜２．１×１０^６個／ｃｍ^２が良く、さらに好ましくは０．６×１０^６〜１．７×１０^６個／ｃｍ^２が良い。播種濃度が０．４×１０^６個／ｃｍ^２より低い場合、膵島細胞の増殖が悪く、得られる膵島細胞シートの機能の発現程度が悪化し、本発明を実施する点において好ましくない。また、播種濃度が２．５×１０^６個／ｃｍ^２より高い場合においても、膵島細胞の増殖が悪く、得られる膵島細胞シートの機能の発現程度が悪化し、本発明を実施する点において好ましくない。

本発明においては、上記細胞を０〜８０℃の温度範囲で水和力が変化するポリマーを表面に被覆した細胞培養支持体上で、ポリマーの水和力の弱い温度域で培養される。その温度とは通常、細胞を培養する温度である３７℃が好ましい。本発明に用いる温度応答性高分子はホモポリマー、コポリマーのいずれであってもよい。このような高分子としては、例えば、特開平２−２１１８６５号公報に記載されているポリマーが挙げられる。具体的には、例えば、以下のモノマーの単独重合または共重合によって得られる。使用し得るモノマーとしては、例えば、（メタ）アクリルアミド化合物、Ｎ−（若しくはＮ，Ｎ−ジ）アルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体、またはビニルエーテル誘導体が挙げられ、コポリマーの場合は、これらの中で任意の２種以上を使用することができる。更には、上記モノマー以外のモノマー類との共重合、ポリマー同士のグラフトまたは共重合、あるいはポリマー、コポリマーの混合物を用いてもよい。また、ポリマー本来の性質を損なわない範囲で架橋することも可能である。その際、培養、剥離されるものが細胞であることから、分離が５℃〜５０℃の範囲で行われるため、温度応答性ポリマーとしては、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド（単独重合体の下限臨界溶解温度２１℃）、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド（同２７℃）、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（同３２℃）、ポリ−Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド（同４３℃）、ポリ−Ｎ−シクロプロピルアクリルアミド（同４５℃）、ポリ−Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド（同約３５℃）、ポリ−Ｎ−エトキシエチルメタクリルアミド（同約４５℃）、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド（同約２８℃）、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド（同約３５℃）、ポリ−Ｎ，Ｎ−エチルメチルアクリルアミド（同５６℃）、ポリ−Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド（同３２℃）などが挙げられる。本発明に用いられる共重合のためのモノマーとしては、ポリアクリルアミド、ポリ−Ｎ、Ｎ−ジエチルアクリルアミド、ポリ−Ｎ、Ｎ−ジメチルアクリルアミド、ポリエチレンオキシド、ポリアクリル酸及びその塩、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリヒドロキシエチルアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、セルロース、カルボキシメチルセルロースなどの含水ポリマーなどが挙げられるが、特に制約されるものではない。

本発明で用いられる、上述の各ポリマーの基材表面への被覆方法は、特に制限されないが、例えば、基材と上記モノマーまたはポリマーを、電子線照射（ＥＢ）、γ線照射、紫外線照射、プラズマ処理、コロナ処理、有機重合反応のいずれかにより、または塗布、混練等の物理的吸着等により行うことができる。培養基材表面への温度応答性ポリマーの被覆量は、１．１〜２．３μｇ／ｃｍ^２の範囲が良く、好ましくは１．４〜１．９μｇ／ｃｍ^２であり、さらに好ましくは１．５〜１．８μｇ／ｃｍ^２である。１．１μｇ／ｃｍ^２より少ない被覆量のとき、刺激を与えても当該ポリマー上の細胞は剥離し難く、作業効率が著しく悪くなり好ましくない。逆に２．３μｇ／ｃｍ^２以上であると、その領域に細胞が付着し難く、細胞を十分に付着させることが困難となる。このような場合、温度応答性ポリマー被覆層の上にさらに細胞接着性タンパク質を被覆すれば、基材表面の温度応答性ポリマー被覆量は２．３μｇ／ｃｍ^２以上であっても良く、その際の温度応答性ポリマーの被覆量は９．０μｇ／ｃｍ^２以下が良く、好ましくは８．０μｇ／ｃｍ^２以下が良く、７．０μｇ／ｃｍ^２以下が好都合である。温度応答性ポリマーの被覆量が９．０μｇ／ｃｍ^２以上であると温度応答性ポリマー被覆層の上にさらに細胞接着性タンパク質を被覆しても細胞が付着し難くなり好ましくない。そのような細胞接着性タンパク質の種類は何ら限定されるものではないが、例えば、コラーゲン、ラミニン、ラミニン５、フィブロネクチン、マトリゲル等の単独、もしくは２種以上の混合物が挙げられる。また、これらの細胞接着性タンパク質の被覆方法は常法に従えば良く、通常、細胞接着性タンパク質の水溶液を基材表面に塗布し、その後その水溶液を除去しリンスする方法がとられている。本発明は、温度応答性培養皿を利用したなるべく細胞シートそのものを利用しようとする技術である。従って、温度応答性ポリマー層上の細胞接着性タンパク質の被覆量が極度に多くなっては好ましくない。温度応答性ポリマーの被覆量、並びに細胞接着性タンパク質の被覆量の測定は常法に従えば良く、例えばＦＴ−ＩＲ−ＡＴＲを用いて細胞付着部を直接測る方法、あらかじめラベル化したポリマーを同様な方法で固定化し細胞付着部に固定化されたラベル化ポリマー量より推測する方法などが挙げられるがいずれの方法を用いても良い。

本発明の方法において、培養した細胞シートを温度応答性基材から剥離回収するには、培養された細胞の付着した培養基材の温度を培養基材上の被覆ポリマーの上限臨界溶解温度以上若しくは下限臨界溶解温度以下にすることによって剥離させることができる。その際、培養液中において行うことも、その他の等張液中において行うことも可能であり、目的に合わせて選択することができる。細胞をより早く、より高効率に剥離、回収する目的で、基材を軽くたたいたり、ゆらしたりする方法、更にはピペットを用いて培地を撹拌する方法等を単独で、あるいは併用して用いてもよい。温度以外の培養条件は、常法に従えばよく、特に制限されるものではない。例えば、使用する培地については、公知のウシ胎児血清（ＦＣＳ）等の血清が添加されている培地でもよく、また、このような血清が添加されていない無血清培地でもよい。

以上のことを温度応答性ポリマーとしてポリ（N−イソプロピルアクリルアミド）を例にとり説明する。ポリ（N−イソプロピルアクリルアミド）は３１℃に下限臨界溶解温度を有するポリマーとして知られ、遊離状態であれば、水中で３１℃以上の温度で脱水和を起こしポリマー鎖が凝集し、白濁する。逆に３１℃以下の温度ではポリマー鎖は水和し、水に溶解した状態となる。本発明では、このポリマーがシャーレなどの基材表面に被覆、固定されたものである。したがって、３１℃以上の温度であれば、基材表面のポリマーも同じように脱水和するが、ポリマー鎖が基材表面に被覆、固定されているため、基材表面が疎水性を示すようになる。逆に、３１℃以下の温度では、基材表面のポリマーは水和するが、ポリマー鎖が基材表面に被覆、固定されているため、基材表面が親水性を示すようになる。このときの疎水的な表面は細胞が付着、増殖できる適度な表面であり、また、親水的な表面は細胞が付着できないほどの表面となり、培養中の細胞、もしくは細胞シートも冷却するだけで剥離させられることになる。

被覆を施される基材としては、通常細胞培養に用いられるガラス、改質ガラス、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等の化合物を初めとして、一般に形態付与が可能である物質、例えば、上記以外のポリマー化合物、セラミックス類など全て用いることができる。

本発明における培養基材の形状は特に制約されるものではないが、例えばディッシュ、マルチプレート、フラスコ、セルインサートのような形態のもの、或いは平膜状のものなどが挙げられる。

本発明における膵島細胞シートは温度応答性基材上で作製され、その培養時にディスパーゼ、トリプシン等で代表される蛋白質分解酵素による損傷を受けていないものである。そのため、基材から剥離された膵島細胞シートは接着性蛋白質を有し、膵島細胞をシート状に剥離させた際には細胞−細胞間のデスモソーム構造がある程度保持されたものとなる。このことにより、移植時において患部組織と良好に接着することができ、効率良い移植を実施することができるようになる。一般に蛋白質分解酵素であるディスパーゼに関しては、細胞−細胞間のデスモソーム構造については１０〜４０％保持した状態で剥離させることができることで知られているが、細胞−基材間の基底膜様蛋白質等を殆ど破壊してしまうため、得られる細胞シートは強度の弱いものとなる。これに対して、本発明の膵島細胞シートは、デスモソーム構造、基底膜様蛋白質共に６０％以上残存された状態のものであり、上述したような種々の効果を得ることができるものである。

かくして、本発明における膵島細胞シートが得られる。本発明では、それが複数枚が積層化されたものであっても良い。その積層化枚数は特に限定されるのものではないが、積層回数は１０回以下が良く、好ましくは８回以下、さらに好ましくは４回以下が良い。膵島織細胞シートを積層化するとシート単面積当たりの細胞密度が向上し、膵島細胞シートとしての機能も向上し好ましい。

本発明に用いる細胞シート積層体とは、細胞シート内へ血管を導入させるための血管内皮細胞や血管内皮前駆細胞等の細胞シート、或いは膵島細胞シートの免疫隔離するための軟骨細胞シート等の別の細胞からなるシートと組み合わされた状態で積層化されたものでも良い。その際、２種以上の異なる細胞を利用すると異なる細胞間で相互作用し合い、より高い活性の細胞シートが得られ好ましい。その際に利用される細胞は特に限定されるものでないが、例えば、セルトリ細胞、軟骨細胞、膵管細胞、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、肝実質細胞、骨髄由来細胞、脂肪由来細胞のいずれか１種、もしくは２種以上の細胞が混合した細胞シートまた、その積層する位置、順番、積層回数は特に制約されるものではないが、被覆又は補填される組織に応じ、接着性の強い滑膜由来細胞シートを使用すること等で適宜変えられる。また、積層回数は１０回以下が良く、好ましくは８回以下、さらに好ましくは４回以下が良い。その際、血管内皮細胞を選択したとき、細胞シート積層体内に血管網を構築させる方法で防ぐことができる。その血管網を構築する方法は特に限定されるものではないが、例えば積層体内にあらかじめ血管内皮細胞を混在させる方法、積層体を製造する際に血管内皮細胞シートを積層させる方法、あるいは細胞シート積層体を生体内に埋入して血管網を構築させる方法等が挙げられる。

本発明における細胞シート積層体を作製する方法についても特に限定されるものではないが、例えば、培養細胞をシート状で剥離させ、必要に応じ培養細胞移動治具を用いて培養細胞シート同士を積層化させることで得られる。その際、培地の温度は、培養基材表面に被覆された前記ポリマーが上限臨界溶解温度を有する場合はその温度以下、また前記ポリマーが下限臨界溶解温度を有する場合はその温度以上であれば特に制限されない。しかし、培養細胞が増殖しないような低温域、あるいは培養細胞が死滅するような高温域における培養が不適切であることは言うまでもない。温度以外の培養条件は、常法に従えばよく、特に制限されるものではない。例えば、使用する培地については、公知のウシ胎児血清（ＦＣＳ）等の血清が添加されている培地でもよく、また、このような血清が添加されていない無血清培地でもよい。また、使用される培養細胞移動治具は剥離した細胞シートを捕捉できるものであれば特に限定されるわけではなく、例えば多孔膜や紙、ゴム等の膜類や板類、スポンジ類等が挙げられ、積層化作業を行い易くするために柄の付いた治具に多孔膜や紙、ゴム等の膜類や板類、スポンジ類等を取り付けたものを利用しても良い。

本発明では、膵島細胞シートの機能を安定化させる意味で、膵島細胞シートに対し合成ポリマー、或いは天然ポリマーを被覆させたり、常法に従ってマイクロカプセル化することもできる。その際のポリマーの被覆法、マイクロカプセル化方法、並びに使用される材料は何ら限定されるものではないが、通常、ポリビニルアルコール、ウレタン、セルロース及びその誘導体、キチン、キトサン、コラーゲン、ポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）、シリコン等の材料を膜状、多孔膜状、不織布状、織布状として膵島細胞シートに接触させて使用される。

以上より、本発明における細胞シート積層体とは、温度応答性ポリマーが被覆された細胞培養基材上から剥離され、必要に応じて培養細胞移動治具を用いることで得られた培養細胞シートは、培養時にディスパーゼ、トリプシン等で代表される蛋白質分解酵素による損傷を受けておらず、培養時に形成される細胞−基材間の基底膜様蛋白質も酵素による破壊を受けておらず、また、細胞−細胞間のデスモソーム構造が保持され、構造的欠陥が少なく強度の高いものである。

膵島細胞シートを密着させる際に使用するキャリアは、本発明の細胞を保持するための構造物であり、例えば高分子膜または高分子膜から成型された構造物、金属性治具などを使用することができる。例えば、キャリアの材質として高分子を使用する場合、その具体的な材質としてはポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）、ポリプロピレン、ポリエチレン、セルロース及びその誘導体、紙類、キチン、キトサン、コラーゲン、ウレタン、ゼラチン等を挙げることができる。キャリアの形状は、特に限定されるものではない。

本発明で得られた膵島細胞シートを生体内の所定部位に移植することができる。その移植部位は生体内のいずれの場所でも良く特に限定されないが、例えば、皮下組織、大網、腹腔内組織、腹膜下組織、肝臓、筋肉、筋膜下組織等が挙げられる。その中で、特に大網は血管が豊富に存在し、かつ移植行為が容易な点で好ましい。その移植部位はあらかじめ血管誘導を施されていても、施されていなくても良く、特に限定されるものではない。ここで、血管誘導を施す方法も特に限定されるものではないが、例えば、血管増殖因子であるＦＧＦをミクロスフィアに包埋し、このミクロスフィアの組成、大きさ、注入範囲を変えながら生体に８〜１０日間作用させる方法、ポリエチレンテレフタレートメッシュを任意の大きさに切り、袋状のものを作製し、そのバッグの内側に、高濃度アガロース溶液に溶解させたＦＧＦを入れ、８〜１０日間後、そのバッグを除去することにより、血管誘導された空間を作製する方法などが挙げられる。いずれにせよ、本発明で得られる膵島細胞シートは、従来の膵島移植のように血管内のような血流下に移植する必要がない。このことは、従来のような膵島の場合、それらを移植するとなると、その塊の内部の細胞まで栄養分や酸素を供給するために、門脈等の血管の中や肝臓組織等の血流の豊富な部位へ行わざるを得ないのに対し、本発明である膵島細胞シートは構成される膵島細胞が１層に並べられているだけなので、細胞シートを構成する細胞へ容易に栄養分や酸素を供給でき、従って、本発明の膵島細胞シートは血管内という血流の豊富な部位へ移植する必要がなくなり、血管内以外の通常の組織への移植ができるようになる。本発明の膵島細胞シートは、簡便な移植だけで生命の維持に欠かせない膵機能を発現できるものである。

本発明において移植される膵島細胞シートは、基底膜様蛋白質を保持しており、生着性が極めて良好である。移植する際には目的に応じて細胞数を変えれば良く、移植する細胞がシート状の時には、その大きさや形状を変えることで膵島機能の総活性度を変えることができる。

ヒトに対し、本発明で示すところの膵島細胞シートを利用すれば、移植された膵島細胞シートはヒトの生体内で膵島機能を長期間発現することとなり、そのまま人工膵臓となる。剥離された膵島細胞シートの大きさや形状、もしくは両者で機能の発現量を制御できる。このような人工膵臓は、例えばI型糖尿病、II型糖尿病、慢性膵炎等のような各疾患の本質的な治療、或いは膵臓全摘出後の治療、もしくは膵機能補佐を目的に使用されるが、特に限定されるものではない。

動物に対し、本発明で示すところの膵島細胞シートを移植されれば、膵島細胞移植動物となる。剥離された膵島細胞シートの大きさや形状で機能の発現量を制御できる。ここで使用される動物はラット、マウス、モルモット、マーモセット、ウサギ、イヌ、ブタ、チンパンジーあるいはそれらの免疫不全動物等が挙げられるが特に限定されるものではない。このような膵島移植動物は、例えば、被検物質をこの膵島移植動物に投与し、当該被検物質の膵機能への影響を判定する膵機能評価システム等を目的に使用されるが、特に限定されるものではない。

以下に、本発明を実施例に基づいて更に詳しく説明するが、これらは本発明を何ら限定するものではない。

各臓器から得られた細胞を温度応答性培養皿上で培養し、コンフルエントの状態となった後、低温処理を施すことで、細胞をシート状に回収することが可能となる。この技術はすでに、心筋、角膜上皮、食道粘膜上皮、肝細胞などで応用されているが、膵島を用いた研究はこれまでなかった（図１）。

（膵島細胞の分離）
生後８週のラット（Ｌｅｗｉｎｓ ｒａｔ、雄、体重約２５０ｇ）に対し、イソフルレン麻酔下に開腹し、膵島の摘出を行った。摘出した膵島はコラゲナーゼ溶液で３２分間反応させ、その後Ｆｉｃｏｌｌ液を用いた濃度勾配法により膵島を分離した。そして、得られた膵島に対し、０．１２５％トリプシン−ＥＤＴＡで５分間反応させることで膵島を個々の細胞にした。その際、細胞は１０％ウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）中に保管した。得られた膵島細胞の活性（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）は９０％以上であった。

（膵島細胞の培養）
細胞培養基材として、ポリスチレン製の35 mm 細胞培養皿（コーニング社製）に対し温度応答性ポリマーであるポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドを被覆したものを用いた。温度応答性ポリマーの被覆は特開平０２−２１１８６５号公報に示された方法に従って行い、最終的に温度応答性ポリマーの被覆量が４．９μｇ／ｃｍ^２である温度応答性細胞培養基材を得た。本実験では、その温度応答性細胞培養基材表面へさらにラミニン−５（ＣＨＥＭＩＣＯＮ社）を０．２μｇ／ｃｍ^２となるようにコーティングし、その表面へ上述の膵島細胞を５．７×１０^５個／ｃｍ^２となるよう播種し、そのまま２日間培養した。その際、培地としては１０％ウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を利用した。ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドが被覆された基材表面は、３２℃以上では疎水性となり、３２℃以下では親水性となる。これにより、３７℃の培養条件下では接着培養が可能で、３７℃以下になると、トリプシン処理することなくシート状に剥離される（図２）。

（膵島細胞シート評価）
培養２日目、培養皿上で膵島細胞は、ほぼ１００％に近い密度となった（図３）。この培養皿上でコンフルエントとなった膵島細胞をインスリン染色にて観察したところ、７〜８割の細胞でインスリン陽性が認められた（図４）。次に、別に用意した温度応答性培養基材上の膵島細胞に対し、グルコース濃度が３ｍＭ、２０ｍＭ、３ｍＭとなるように作製した培地を用いて、それぞれ１時間間隔で培地交換し、培地中のインスリン濃度を測定した。その結果、糖濃度に応じたインスリン分泌能が証明された（図５）。さらに、膵島細胞シートをＰＫＨ２６（ＳＩＧＭＡ）を用いて蛍光染色を行った。その結果、得られた細胞は膵島細胞であることが分かった。

次に、得られた膵島細胞シートを２０℃の培養室にて３０分間静置し、次いで支持膜（セルシフター、セルシード社製）を用いることで温度応答性培養基材表面より剥離した。採取後、培養皿上には細胞の残存は認められなかった（図６）。さらに、膵島細胞シートを支持膜上に付着させた状態でコンパウンドへ封入し、凍結切片を作成した。切片はＨＥ染色、インスリン染色、そして蛍光顕微鏡、さらには細胞内の構造を電子顕微鏡を用いて観察した。その結果、膵島細胞シートは一層のシート状であることが観察された（図７）。また、その膵島細胞シートは、インスリン陽性細胞と陰性細胞から形成されていることも確認された（図８）。さらに、電子顕微鏡観察により、得られた膵島細胞シートにはデスモソーム構造、基底膜様蛋白質共に損傷なく存在していることが分かった。

（膵島細胞シートの移植、移植評価）
最後に、得られた膵島細胞シートを、ドナーと同じ種類のラット（Ｌｅｗｉｓ ｒａｔ、生後８週、雄、体重約２５０ｇ）へ移植した。背部にL字状皮膚切開し、皮下を剥離し、同部位の筋膜を露出させた。そこへ上述の支持膜を用いて採取した膵島細胞シートを静置し、細胞シートと筋膜面が付着したところで、支持膜に生理食塩水を添加し、支持膜をゆっくり除去させた。支持膜に水分を添加することで、膵島細胞シート間との吸着力が低下することから、膵島細胞シートが筋膜上にとどまり、シートを乱すことなく移植できた（図９）。移植４日後、失血死させた後、背部の移植した組織を採取した。採取した組織は凍結切片として、インスリン染色での評価と、蛍光顕微鏡下での評価を行った。その結果、膵島細胞にあらかじめ蛍光染色を施すことにより、移植４日後に摘出した組織中から膵島細胞シートの状態で存在することが確認された。また、インスリン染色により、シートを形成する細胞にはインスリン陽性細胞の存在が確認された（図１０）。

実施例１で得られた膵島細胞シートを、ドナーと同じ種類のラット（Ｌｅｗｉｓ ｒａｔ、生後８週、雄、体重約２５０ｇ）の大網へ移植すること以外、全て実施例１と同様に実験を行った。移植１４日後、失血死させた後、大網の移植した組織を採取した。採取した組織は凍結切片として、インスリン染色での評価と、蛍光顕微鏡下での評価を行った。その結果、膵島細胞にあらかじめ蛍光染色を施すことにより、移植１４日後に摘出した組織中から膵島細胞シートの状態で存在することが確認された。また、インスリン染色により、シートを形成する細胞にはインスリン陽性細胞の存在が確認された。

実施例１で得られた膵島細胞シートに、実施例１と同じ温度応答性培養基材上で別に作製した血管内皮細胞シートを積層させ、膵島細胞シート、血管内皮細胞シート、膵島細胞シートの順に積み重ねた積層化細胞シートを作製した。その積層化細胞シートをドナーと同じ種類のラット（Ｌｅｗｉｓ ｒａｔ、生後８週、雄、体重約２４０ｇ）の皮下へ移植すること以外、全て実施例１と同様に実験を行った。移植１４日後、失血死させた後、皮下の移植した組織を採取した。採取した組織は凍結切片として、インスリン染色での評価と、蛍光顕微鏡下での評価を行った。その結果、膵島細胞にあらかじめ蛍光染色を施すことにより、移植１４日後に摘出した組織中から膵島細胞シートの状態で存在することが確認された。また、インスリン染色により、膵島細胞シートを形成する細胞にはインスリン陽性細胞の存在が確認された。さらに、積層化膵島細胞シートへは血管が侵入しており厚みのある膵島細胞シートが生着していることが分かった。

常法に従って、糖尿病化SCIDマウスを作製した。具体的には、SCIDマウスの体重を測定した後、ストレプトゾトシン(シグマ社製)を220 mg／kg体重の投与量で腹腔内投与することで作製した。また、ストレプトゾトシン投与後、尾静脈より全血を採取し、小型血糖値測定器グルコカード(日本ヘキストマリオンルセル社製)を用いて血糖値を測定し、血糖値が350 mg/dL以上のマウスを糖尿病発症とみなした。この糖尿病化SCIDマウスの背部皮下へ、実施例１と同様な操作で、実施例１の膵島細胞シートを移植した。移植後の血中グルコース量の変化を図１１に示す。糖尿病化SCIDマウスでは血中グルコース量が下がらないが、膵島細胞シートを移植したものは移植後から速やかに血中グルコース量が下がっていること、その効果が少なくとも６０日持続していること、さらに、６０日後においても血中グルコース量が再び上昇する傾向が認められなかった。一方、膵島細胞をシート化せず個々の状態で同様な実験を行ったが、この方法では血中グルコース量を低減させられず、またその効果を持続させることができなかった。以上より、本発明の膵島細胞シートは糖尿病治療に有効なものであると考えられる。

実施例４を終えた後の糖尿病化SCIDマウス、膵島細胞シート移植糖尿病化SCIDマウス、さらに健常なSCIDマウスを使い、それぞれのマウスへさらにグルコース負荷試験を行った。その際のグルコース負荷量は、２ｇ／kg体重とした。得られた結果を図１２に示す。その結果、糖尿病化SCIDマウスでは血中グルコース量が下がらないが、膵島細胞シートを移植したものは、健常なマウスと同様にグツコース負荷３０分後から速やかに血中グルコース量が下がっていること、その効果が持続していること、さらに、１５０分後においても血中グルコース量が再び上昇する傾向が認められなかった。以上より、本発明の膵島細胞シートは糖尿病治療に有効なものであると考えられる。

実施例４において膵島細胞シート移植１８日後、並びに８９日後に、失血死させ、背部の移植した膵島細胞シート部分を採取した。採取した組織はホルマリン固定、パラフィン処理切片としてインスリン染色での評価を行った。その結果、膵島細胞シートを移植した皮下組織内で膵島細胞がシート状に組織化し、インスリン陽性細胞の存在が確認された（図１３）。移植８９日後の組織からは、インスリン陽性細胞が移植部で再配置され、インスリン陽性細胞同士が集まっているようすを確認することもできた。本発明で移植された膵島細胞シートが移植先でより好ましい状態へ再構成される可能性が示唆された。

温度応答性培養基材上で作製された膵島細胞シートは、膵島細胞を血管内に移植する必要がなく、例えば皮下組織のような血流の乏しい組織への移植でも膵島細胞自身が持つ機能を十分に発現させられるようになる。

Claims (27)

1. 血管内以外の部位へ移植可能なインスリン産生機能を有する膵島細胞シートであって、以下の工程：
   （ａ）酵素処理により膵島を個々の膵島細胞に分離する；
   （ｂ）０℃〜８０℃の温度範囲で水和力が変化するポリマーを表面に被覆した細胞培養支持体上で、ポリマーの水和力が弱い温度域で膵島細胞を培養する；および
   （ｃ）その後、培養液をポリマーの水和力が強い状態となる温度に変化させることで、培養した膵島細胞をシート状で剥離させる；
   を含む方法により製造される、前記膵島細胞シート。
2. β細胞含有率が４０％以上である、請求項１記載の膵島細胞シート。
3. グルカゴン産生機能、及びグルコース濃度感知機能を有する、請求項１または２記載の膵島細胞シート。
4. セルトリ細胞、膵管細胞、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、肝実質細胞、骨髄由来細胞、脂肪由来細胞のいずれか１種、もしくは２種以上の細胞が混合した、請求項１〜３のいずれか１項記載の膵島細胞シート。
5. ２以上の膵島細胞シートが積層化されたものである、請求項１〜４のいずれか１項記載の膵島細胞シート。
6. 膵島細胞シートにセルトリ細胞、軟骨細胞、膵管細胞、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、肝実質細胞、骨髄由来細胞、脂肪由来細胞のいずれか１種、もしくは２種以上の細胞が混合した細胞シートが積層化された、請求項１〜５のいずれか１項記載の膵島細胞シート。
7. 合成ポリマー及び／または天然ポリマーに被覆された、請求項１〜６のいずれか１項記載の膵島細胞シート。
8. マイクロカプセル化された、請求項１〜７のいずれか１項記載の膵島細胞シート。
9. ０〜８０℃の温度範囲で水和力が変化するポリマーを表面に被覆した細胞培養支持体上で、ポリマーの水和力が弱い温度域で膵島細胞を培養し、その後、培養液をポリマーの水和力が強い状態となる温度に変化させることで培養した膵島細胞をシート状で剥離させることを特徴とする膵島細胞シートの製造方法。
10. 細胞培養支持体表面にラミニン−５が被覆されたものである、請求項９記載の膵島細胞シートの製造方法。
11. 剥離した膵島細胞シートをさらに別の膵島細胞シート上に積層化し、或いはその操作を繰り返すことで膵島細胞シートを積層化する、請求項９または１０記載の膵島細胞シートの製造方法。
12. 剥離方法が蛋白質分解酵素による処理を施されることなく細胞培養支持体から剥離されたものである、請求項９〜１１のいずれか１項記載の膵島細胞シートの製造方法。
13. 剥離方法が培養終了時に培養細胞上にキャリアを密着させ、キャリアと共に剥離する方法である、請求項９〜１２のいずれか１項記載の膵島細胞シートの製造方法。
14. 膵島が生体組織から採取されたものである、請求項９〜１３の膵島細胞シートの製造方法。
15. 培養時に播種する細胞数が０．４×１０^６〜２．５×１０^６個／ｃｍ^２である、請求項９〜１４のいずれか１項記載の膵島細胞シートの製造方法。
16. ０〜８０℃の温度範囲で水和力が変化するポリマーがポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）である、請求項９〜１５のいずれか１項記載の膵島細胞シートの製造方法。
17. 生体内の所定部位に移植するための、請求項１〜８のいずれか１項記載の膵島細胞シート。
18. 移植部位が生体内の皮下組織、大網、腹腔内組織、腹膜下組織、肝臓、筋肉、筋膜下組織である、請求項１７記載の膵島細胞シート。
19. 移植部位があらかじめ血管誘導を施した部位である、請求項１７または１８記載の膵島細胞シート。
20. 血管誘導法が、長期間にわたるＦＧＦ処理によるものである、請求項１９記載の膵島細胞シート。
21. 請求項１〜８のいずれか１項記載の膵島細胞シートを利用した人工膵臓。
22. 剥離された膵島がシート状のものであり、かつそのシートの大きさ、及び／または形状で機能の発現量を制御できる、請求項２１記載の人工膵臓。
23. Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、慢性膵炎、膵臓全摘出後の治療、もしくは膵機能補佐を目的とすることを特徴とする、請求項２１または２２記載の人工膵臓。
24. 遺伝子導入技術により膵島細胞機能が強化された、請求項２１〜２３のいずれか１項記載の人工膵臓。
25. 請求項２１〜２４のいずれか１項記載の人工膵臓を移植した、ヒト以外の膵島細胞移植動物。
26. 動物がラット、マウス、モルモット、マーモセット、ウサギ、イヌ、ブタ、チンパンジーあるいはそれらの免疫不全動物であることを特徴とする、請求項２５記載の膵島細胞移植動物。
27. 請求項２５または２６記載の方法により得られたヒト以外の膵島細胞移植動物に対し被検物質を投与し、当該被検物質の肝機能への影響を判定することを特徴とする膵機能評価システム。