CN107709539A - 细胞培养器 - Google Patents

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Nat Cerebral &amp
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Abstract

本发明的目的是提供一种能够大量且简便地制备微小尺寸的细胞结构体的细胞培养器。该细胞培养器的特征在于，在细胞培养器的培养面具有多个用温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物包覆的第一包覆区域，第一包覆区域的表面Zeta电位是0～50mV。

Description

细胞培养器
技术领域
本发明特别涉及能够大量地简便地制备微小尺寸的细胞结构体的细胞培养器。
背景技术
1900年前后开发的细胞培养技术是生物学领域重要的实验技术。开发初期，停留在致力于使培养基成分最优化等驯化细胞方面，并逐渐以单层培养、悬浮培养的技术为中心进行了研究。
近年来，已经阐明了单层培养体系的细胞与生物体内的组织的细胞之间在各种性质、刺激响应性、细胞功能等方面都不同，相比于使单层结构形成的单层培养而言，使与生物体内的组织结构相近的3D结构形成的3D培养、特别是球形培养的需求正在扩大。
已经积极地开发的经典技术有：使细胞包埋于3D凝胶中的技术，所述3D凝胶是通过使细胞悬浮在蛋白质系的溶胶中并使用任意引发因素(热、光、化学交联剂等)使该细胞悬浮液凝胶化从而形成的；使细胞植入多孔质的支持物中的技术；使用固定有NIPAM的培养皿来制备细胞片层叠体的技术等。
近年来正在开发的方法有：住友电木株式会社的Prime Surface(商品名)等的、使细胞沉降至非粘附性的圆形底面的方法；JSR公司的Nano Culture Plate(商品名)、日立制作所的Nano Pillar Plate(商品名)等的、利用激光加工将平滑面制成规则分布的凹凸面从而提高粘附于培养面的细胞的迁移性，并由此在培养面诱导细胞的自组装化的方法；可乐丽株式会社(クラレ社)的Elplasia(商品名)、岩城株式会社(イワキ社)EZSPHERE(商品名)等的、使用配设有无限个直径100～500μm、深度500μm左右的孔的培养皿，并使种植于各孔内的细胞沉降至各孔的底面的方法等。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Nature,Vol 424,P870-872,21August,2003。
发明内容
本发明要解决的课题
然而，在大量地制备具有3D结构的球形等的细胞结构体的情况下，对于上述现有的细胞培养器，必须将细胞种植在许多微小尺寸(例如，100μm×200μm)的孔(well)中，培养操作很不方便。
鉴于此，本发明的目的是提供一种能够大量且简便地制备微小尺寸(例如，几百微米(μm)以下的尺寸)的细胞结构体(例如，球形)的细胞培养器。
解决课题的方案
本发明的主要内容如下。
本发明的细胞培养器，其特征在于，在细胞培养器的培养面具有多个用温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物包覆的第一包覆区域，所述第一包覆区域的表面Zeta电位(ζ电位)是0～50mV。
在此，水对本发明的细胞培养器的所述第一包覆区域的接触角优选是50～90°。
另外，在本发明的细胞培养器中，优选所述细胞培养器的培养面是细胞非粘附性的。
进一步，在本发明的细胞培养器中，优选所述第一包覆区域的俯视形状是从由圆形、椭圆形、外轮廓线的内侧具有曲率中心的形状所组成的组中选出的至少一种。
进一步，在本发明的细胞培养器中，优选所述温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物是选自由以下物质组成的组中的至少一种的温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物，所述物质是：包含甲基丙烯酸-2-N,N-二甲氨基乙酯(DMAEMA)单元和阴离子型单体单元的温度响应性聚合物；包含N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)单元和阳离子型单体单元和阴离子型单体单元的温度响应性聚合物；包含甲基丙烯酸-2-N,N-二甲氨基乙酯(DMAEMA)和/或其衍生物的聚合物、2-氨基-2-羟甲基-1,3-丙二醇(Tris)、以及从由核酸、肝素、透明质酸、硫酸葡聚糖、聚苯乙烯磺酸、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚磷酸、硫酸多糖类、凝胶多糖及聚海藻酸以及它们的碱金属盐所组成的组中选出的一种以上的阴离子型物质的温度响应性聚合物组合物。
进一步，在本发明的细胞培养器中，优选的是，所述阴离子型单体是选自由丙烯酸、甲基丙烯酸、以及乙烯衍生物所组成的组中的至少一种，所述乙烯衍生物在侧链中具有选自由羧基、磺酸基、磷酸基所组成组中的至少一种基团。
进一步，在本发明的细胞培养器中，优选所述阳离子型单体是从由3-(N,N-二甲氨基丙基)-(甲基)丙烯酰胺、3-(N,N-二甲氨基丙基)-(甲基)丙烯酸酯、氨基苯乙烯、2-(N,N-二甲氨基乙基)-(甲基)丙烯酰胺、2-(N,N-二甲氨基乙基)-(甲基)丙烯酸酯所组成的组中选出的至少一种。
进一步，对于本发明的细胞培养器，所述第一包覆区域可以具有由细胞粘附性物质进一步地包覆的第二包覆区域，该第二包覆区域可以位于所述第一包覆区域的内侧。
进一步，对于本发明的细胞培养器，优选所述细胞粘附性物质是从由层粘附蛋白、胶原蛋白、纤连蛋白所组成的组中选出的至少一种。
发明效果
根据本发明，能够提供一种能大量且简便地制备微小尺寸(例如，几百微米以下的尺寸)的细胞结构体(例如球形)的细胞培养器。
附图说明
图1是将本发明的实施方式的细胞培养器的一个例子的概略与本发明的实施方式的细胞培养器的制造方法的一个例子的概略以及采用了本发明的实施方式的细胞培养器的细胞培养方法的一个例子的概略一同示出的图。
图2是从培养面一侧观察到的在试验4中制备的本发明的实施例的细胞培养器的图。
图3是表示用相差显微镜观察时，在本发明的实施例的细胞培养器的第一包覆区域培养源自大鼠皮下脂肪的脂肪干细胞时的状态的照片的图。图(a)～图(d)表示从更换培养基后开始起0小时后(刚更换培养基后)、2小时后、3小时后、4小时后的状态。
图4是表示用相差显微镜观察时，在本发明的实施例的细胞培养器的第一包覆区域培养源自大鼠皮下脂肪的脂肪干细胞时的状态的照片的图。图(a)～图(d)表示从更换培养基后开始起5小时后、6小时后、8小时后、12小时后的状态。
图5是表示用荧光显微镜观察时，在本发明的实施例的细胞培养器的第一包覆区域培养源自大鼠皮下脂肪的脂肪干细胞时的状态的照片的图。图(a)～图(d)表示块状的细胞结构体自发地从第一包覆区域脱落、悬浮之后，通过使细胞培养器适当翻转并混合而人为地使悬浮物集中在细胞培养器的中央部并使细胞结构体彼此接触，自此开始起0小时后、5小时后、8小时后、12小时后的状态。
图6是表示用荧光显微镜观察时，在本发明的实施例的细胞培养器的第一包覆区域培养源自大鼠皮下脂肪的脂肪干细胞时的状态的照片的图。图(a)～图(d)表示块状的细胞结构体自发地从第一包覆区域脱落、悬浮之后，通过使细胞培养器适当翻转并混合而人为地使悬浮物集中在细胞培养器的中央部并使细胞结构体彼此接触，自此开始起17小时后、22小时后、25小时后、34小时后的状态。
图7(a)表示用实体显微镜观察时，在本发明的实施例的细胞培养器的第一包覆区域培养源自大鼠皮下脂肪的脂肪干细胞时的、从更换培养基后开始起0小时后(刚更换培养基后)的状态的照片，图(b)表示用实体显微镜观察时，在本发明的实施例的细胞培养器的第一包覆区域培养源自大鼠皮下脂肪的脂肪干细胞时的、从更换培养基后开始起21小时后的状态的照片。
图8是将本发明的实施方式的细胞培养器的另一个例子的概略与本发明的实施方式的细胞培养器的制造方法的另一个例子的概略、以及采用了本发明的实施方式的细胞培养器的细胞培养方法的另一个例子的概略一同示出的图。
图9是用实体显微镜观察时，在本发明的实施例的细胞培养器的第一和第二包覆区域培养源自大鼠皮下脂肪的脂肪干细胞时的、从更换培养基后开始起0小时后(刚更换培养基后)的状态的照片。
图10表示用相差显微镜观察时，以手动方式将图9所示的细胞结构体朝水平方向的四个方向以10cm/秒左右的速度摇动时的状态的照片。图(a)～图(d)表示自摇动开始起0秒后、0.5秒后、1.0秒后、1.5秒后的状态。
图11表示用相差显微镜观察时，以手动方式将图9所示的细胞结构体朝水平方向的四个方向以10cm/秒左右的速度摇动时的状态的照片。图(a)～图(d)表示自摇动开始起2.0秒后、2.5秒后、3.0秒后、3.5秒后的状态。
图12是表示采用了本发明的实施方式的细胞培养器的其他例子的本发明的实施方式的细胞结构体培养槽的概略图。图(a)是表示细胞结构体培养槽的立体图，图(b)表示细胞结构体培养槽的剖面图。
具体实施方式
以下参照附图对本发明的细胞培养器的实施方式进行详细的示例性说明。
在图1中，与本发明的实施方式的细胞培养器的概略一起示出了本发明的实施方式的细胞培养器的制造方法的一个例子的概略以及采用了本发明的实施方式的细胞培养器的细胞培养方法的一个例子的概略。
本发明的实施方式的细胞培养器(以下，也称作“本实施方式的细胞培养器”。)在细胞培养器的培养面具有多个用温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物包覆的第一包覆区域。
作为细胞培养器，可举出市售的板、盘、瓶、玻璃板、硅片等。
在此，在本实施方式的细胞培养器中，用温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物包覆的第一包覆区域的表面Zeta电位是0～50mV。如果表面Zeta电位为0mV以上，就能够使带负电的细胞与其粘附，另外，如果表面Zeta电位为50mV以下，就能够减轻细胞毒性。
基于与上述相同的理由，表面Zeta电位优选为0～35mV，更优选为10～25mV。
基于该细胞培养器，在通常的37℃的培养箱中培养细胞、使组织形成后，就能够回收例如具有细胞片状结构的细胞，而不用进行利用胰蛋白酶处理等的细胞脱落操作。
进一步，基于具有上述特定范围的表面Zeta电位的本发明的实施方式的细胞培养器，仅在适宜的培养条件下培养细胞，就能够简便地形成具有块状(颗粒状)结构的细胞结构体(球形)。
可以推测的是，通过设定为上述特定范围的表面Zeta电位，从而能够对细胞培养器的培养面赋予不会诱发细胞毒性的微弱的正电荷，并且能够确保种植的细胞快速粘附，促进细胞活性的提高以及细胞外基质的分泌，进一步还能够适度地抑制细胞迁移而使细胞间的结合增强。
上述形成细胞结构体的现象的再现性极高，基于细胞培养器，能够大量制备均质的细胞结构体。
对于采用现有的细胞培养器制备的细胞块，因为其仅是由不能粘附于细胞非粘附性的培养面的细胞聚集而成的，所以存在构成细胞块的细胞活力较低的问题。
而对于用本发明的实施方式的细胞培养器制备的细胞结构体(球形)而言，因为其是在经过了迅速粘附于培养面并一边增殖一边扩展的过程而形成的，所以存在丰富的细胞间产生的细胞外基质。因此，细胞结构体自身的活力(活性)极高。
而且，基于该细胞培养器，实验者能够根据目的来适当确定细胞结构体的尺寸，能够设成使尺寸具有分布，也能够设成均一的尺寸。
细胞结构体的尺寸能够设成微小尺寸(例如几百微米以下的尺寸)，可以是50～1500μm的直径，优选为50～200μm的直径。
另外，对于该细胞培养器，因为能够在平板状的培养面制备细胞结构体，所以在对采用细胞培养器制备成的细胞结构体进行分析时，还能够用显微镜直接观察该培养器。
进一步，基于该细胞培养器，能够使细胞不粘附在细胞培养器的培养面与培养壁之间的分界处即培养面的外缘，能够长时间维持尺寸的均匀性。
另外，从提高本发明效果的观点出发，对于本发明的实施方式的细胞培养器，优选水对第一包覆区域的接触角是50～90°，更优选是60～80°，特别优选是62～78°。
需要说明的是，水对第一包覆区域的接触角是指在第一包覆区域内的任意几个点上按照JIS R3257的标准测定的接触角的平均值。
如上所述，从提高与细胞表面之间的相互作用从而提高细胞对第一包覆区域的粘附性的观点出发，第一包覆区域优选是具有规定程度以上的疏水性的区域。
而且，对于细胞培养器而言，优选在包覆温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物之前的细胞培养器的培养面是细胞非粘附性的。
需要说明的是，“细胞非粘附性”是指附着的细胞(例如，成纤维细胞、肝细胞、血管内皮细胞等)在通常的培养条件下不会粘附或难以粘附的性质。
基于上述构成，能够抑制种植的细胞粘附在培养面中的除第一包覆区域以外的非包覆区域。对于未粘附的细胞，能够通过更换培养基等简单的操作而将其从细胞培养器中去除，从而能够抑制因这些细胞的凋亡、热休克蛋白的产生等对已粘附的细胞的生长造成不良影响。另外，如果细胞培养器的培养面设成细胞非粘附性，种植于各第一包覆区域的细胞不会接触，从而能够分别各自制备细胞结构体。
作为细胞培养器的材质，可举出聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚丙烯、聚丁烯、聚乙烯、聚碳酸酯等，从容易地进行精密的成型加工、能够应用各种灭菌法、因具有透明性以适合进行显微镜观察的观点出发，优选聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)。
详细而言，对上述聚苯乙烯等材质的细胞培养器而言，在未被处理的情况下，表面Zeta电位是绝对值较大的负值，带负电荷的细胞表面和培养面之间静电相斥。因此，此情况下，不利于细胞的粘附。需要说明的是，即使使用含有能与聚苯乙烯表面粘附并能使Zeta电位朝正侧变化的蛋白质的培养基，多数情况下，表面Zeta电位仍会停留在负值或零附近。
此时，当在上述聚苯乙烯等材质的细胞培养器上包覆温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物时，聚苯乙烯等材质的表面Zeta电位衰减了与聚合物或聚合物组合物的厚度(即距包覆前的培养面的距离)的平方的量相当(相应)的量，就会使，从而使包覆后的培养面的表面Zeta电位更偏向正侧。因此，在包覆处理的情况下，有利于细胞的粘附。
需要说明的是，通常用于细胞培养的板虽然用聚苯乙烯等塑料制成，但是已实施过表面处理(例如，等离子体处理)，细胞很容易粘附于培养面。
对于细胞培养器，优选各第一包覆区域的面积是0.1～30mm2。如果设为上述范围，就容易得到目标微小尺寸的球形。
对于细胞培养器，优选第一包覆区域之间的距离是0.1～10mm。
需要说明的是，“第一包覆区域之间的距离”是指第一包覆区域之间在培养面上的最短距离。
如果设为0.1mm以上，就能够防止在相邻的第一包覆区域之间、种植在各个区域的细胞彼此相互粘附。如果设为10mm以下，就能够高效制备大量的细胞结构体(球形等)。
对于本发明的实施方式的细胞培养器，该细胞培养器的培养面的第一包覆区域的每单位面积具有的温度响应性聚合物的量优选是5.0～50ng/mm2，更优选是15～40ng/mm2。如果设为上述范围，就能够容易地得到使细胞结构体的形成更容易的效果。
本实施方式的细胞培养器具有的第一包覆区域的数量，可根据实验者的目的适宜确定，可以是2以上，也可以是10以上，还可以是1000以上。
对于细胞培养器，优选第一包覆区域的俯视形状是圆形、椭圆形、外轮廓线的内侧具有曲率中心的形状。作为曲率半径，优选是0.1～50mm，更优选是1～10mm。
作为圆形的第一包覆区域的直径，优选是10μm～10mm，更优选是30μm～1500μm。
这些形状可以单独地使用一种，也可以组合两种以上使用。
对于细胞培养器，温度响应性聚合物可以通过以下方法包覆在细胞培养器的培养面：从水溶液状态产生沉淀；溶液的涂布及溶剂的干燥；使用放射线照射、低温等离子体照射、电晕放电、辉光放电、紫外线、自由基引发剂的接枝聚合等。
关于将细胞培养器的培养面用温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物包覆的方法，以及在作为第一包覆区域的培养面上的多个位置配置温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物的方法，将在后面说明。
本实施方式的细胞培养器可以仅具有前述的第一包覆区域而不具有后述的第二包覆区域，此情况下，可以以细胞培养用板(例如，35mm培养盘等)为基础来制备细胞培养器，例如，能够适合用于再生医疗领域。
另一方面，本实施方式的细胞培养器在前述的第一包覆区域的内侧可以具有后述的第二包覆区域，此情况下，可以以微孔板(例如，96孔板等)为基础来制备细胞培养器，例如，能够适合用于药物开发领域(特别是药剂筛选)。
另外，本实施方式的细胞培养器具有进一步用细胞粘附性物质包覆的第二包覆区域，该第二包覆区域可以位于第一包覆区域的内侧。
作为细胞粘附性物质，可举出层粘附蛋白、胶原蛋白、纤连蛋白、肽、阳离子型聚合物、聚苯乙烯等。
作为肽，可举出：分子内含有至少1组的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列的肽、含有由8个分子以上的精氨酸相连而成的序列的肽、含有由10个分子以上的赖氨酸相连而成的序列的肽等。作为阳离子型聚合物，可举出N,N-二甲氨基丙基丙烯酰胺、N,N-二甲氨基乙基甲基丙烯酰胺、氨基苯乙烯等。
在它们当中，优选细胞粘附性高的层粘附蛋白、胶原蛋白、纤连蛋白。
另外，也能适宜使用含有上述列举的细胞粘附性物质的试剂，作为所述试剂，可举出本领域技术人员公知的人、牛、狗、猪、鱼类的血清、无血清培养基等。
基于具有第二包覆区域的细胞培养器，形成的细胞结构体的一部分保持粘附于第二包覆区域的状态，从而能够将细胞结构体固定在细胞培养器的各第一包覆区域的位置。
另外，本发明中的第一包覆区域和第二包覆区域都是无色透明且厚度极薄、平滑的区域，所以透过该两个区域的光几乎不会被折射、反射、吸收，细胞培养器能够直接应用于测定(光学测定等)。
由于种植的细胞具有一旦其个数相对于细胞培养器的培养面的面积过小(细胞种植密度过小)就会凋亡的特性，所以存在为了得到活细胞而要满足的最小限度的细胞种植密度。
在用以往公知的具有多个孔的细胞培养器进行细胞培养的情况下，根据孔的尺寸相应地确定要种植的细胞的数量。
而且，伴随要种植的细胞数量并考虑到一个个细胞所必要的营养量、能物理浸渍细胞整体的体积等，就确定了培养细胞结构体所需的培养规模，也确定了培养所需的培养基的量，进而也确定了试验所用的药剂的量。
在本技术领域中，越来越希望以小规模来进行最近的iPS细胞实验等的有效实验，目前，即使在使用作为国际规格产品中最小尺寸的384孔的细胞培养器的情况下，有时也不能充分降低实验成本。
在此，基于本实施方式的具有第二包覆区域的细胞培养器，能够使许多细胞结构体(球形)共存于同一空间，而不用通过隔离壁等将它们各自隔离于独立的空间。因此，仅将用于使细胞结构体分化的分化诱导因子、受筛选的药剂等加入培养基并将该培养基一次性添加至许多细胞结构体共存的体系(根据需要适当搅拌)，就能够将所有的细胞结构体置于相同的条件下。另外，还能够使细胞结构体分泌的生理活性物质在体系中均匀地扩散。
对于细胞培养器，优选各第二包覆区域的面积是0.001～10mm2。如果设为上述范围，就能够以良好平衡的方式取得如前所述的由第一包覆区域带来的形成目标微小尺寸的球形的效果和前述的由第二包覆区域带来的将细胞结构体固定于细胞培养器的效果。
对于细胞培养器，优选第二包覆区域的每单位面积具有的细胞粘附性物质的量是1.0～1000ng/mm2，更优选是10～100ng/mm2。如果设为上述范围，就能有效进行细胞结构体的形成和细胞结构体的固定。
第一包覆区域的内侧所设置的第二包覆区域的数量，可以根据实验者的目的适当确定，在各第一包覆区域可设一个，也可设两个以上的多个。
对于细胞培养器而言，优选第二包覆区域的俯视形状是圆形、椭圆形、外轮廓线的内侧具有曲率中心的形状。作为曲率半径，优选是0.1～50mm，更优选是1～10mm。
作为圆形的第二包覆区域的直径，优选是0.01mm～10mm，更优选是10～1000μm。
这些形状，可以单独地使用一种，也可以组合两种以上使用。
以下，对本发明的实施方式的细胞培养器的第一包覆区域中使用的温度响应性聚合物以及温度响应性聚合物组合物进行详细说明。
作为本发明的实施方式的细胞培养器中使用的温度响应性聚合物以及温度响应性聚合物组合物，可举出(A)包含甲基丙烯酸-2-N,N-二甲氨基乙酯(DMAEMA)单元和阴离子型单体单元的温度响应性聚合物；(B)包含N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)单元和阳离子型单体单元和阴离子型单体单元的温度响应性聚合物；(C)包含甲基丙烯酸-2-N,N-二甲氨基乙酯(DMAEMA)和/或其衍生物的聚合物、2-氨基-2-羟甲基-1,3-丙二醇(Tris)以及选自由核酸、肝素、透明质酸、硫酸葡聚糖、聚苯乙烯磺酸、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚磷酸、硫酸多糖类、凝胶多糖及聚海藻酸以及它们的碱金属盐所组成的组中的一种以上的阴离子型物质的温度响应性聚合物组合物等。
在此，作为上述(A)，可举出例如(A-1)通过在水的存在下使DMAEMA聚合的方法而得到的温度响应性聚合物、(A-2)包含以含有DMAEMA为主的聚合物段(聚合链α末端)、并主要含有DMAEMA和阴离子型单体(聚合链ω末端)的温度响应性聚合物等。
在本发明的实施方式中，它们可以单独地使用一种，也可以组合两种以上使用。
以下，针对上述(A-1)温度响应性聚合物以及其制造方法进行说明。
(温度响应性聚合物的制造方法)
在(A-1)温度响应性聚合物的制造方法中，首先，制备含甲基丙烯酸-2-N,N-二甲氨基乙酯(DMAEMA)的混合物(制备工序)。在此，混合物还含有阻聚剂及水。
作为甲基丙烯酸-2-N,N-二甲氨基乙酯(DMAEMA)，能够使用市售品。作为阻聚剂，可举出甲基对苯二酚(MEHQ)、对苯二酚、对苯并喹啉、N,N-二乙基羟胺、N-亚硝基-N-苯基羟胺铵盐(铜铁试剂)、叔丁基对苯二酚等。另外，也可以直接使用市售的DMAEMA所含的MEHQ等。作为水，可举出超纯水。
阻聚剂相对混合物的重量比例优选是0.01％～1.5％，更优选是0.1％～0.5％。如果设为上述范围，就能够抑制自由基聚合反应的失控从而减少不能控制的交联，能够确保制造的温度响应性聚合物相对于溶剂的溶解性。
水相对混合物的重量比例，优选是1.0％～50％，更优选是9.0％～33％。如果设为上述范围，就能够良好地协调侧链的水解反应的反应速度与进行聚合的聚合物链的增长反应的反应速度之间的平衡。由此，能够得到侧链未被水解的DMAEMA相对于侧链已被水解的DMAEMA的比例(共聚比例)是1.0～20左右的温度响应性聚合物。
然后，在(A-1)温度响应性聚合物的制造方法中，对混合物照射紫外线(照射工序)。在此，在非活性环境下照射紫外线。DMAEMA在紫外线照射作用下发生自由基聚合而成为聚合物。
在该工序中，例如，在透明的密封小瓶中加入上述混合物，通过用非活性气体进行鼓泡而使小瓶内成为非活性环境之后，从小瓶的外部用紫外线照射装置照射紫外线。
作为紫外线的波长，优选是210nm～600nm，更优选是360nm～380nm。如果设为上述范围，就能够高效地进行聚合反应，并能够稳定地得到具有所期望的共聚比例的高分子材料。另外，还能够防止制造的聚合物材料着色。
作为非活性气体，可举出氮、氩、氦、氖等。
关于反应条件，作为温度条件，优选是15℃～50℃，更优选是20℃～30℃。如果设为上述范围，就能够抑制由热而引起的引发反应，使由光照射而引起的引发反应优先进行。另外，还能够使水解反应的反应速度相对于聚合物链的增长反应的反应速度有良好的平衡。
作为反应时间，优选是7小时～24小时，更优选是17小时～21小时。如果设为上述范围，就能够以高收率获得(A-1)温度响应性聚合物，另外，还能够在抑制光分解反应、不必要的交联反应的同时，进行自由基聚合。
需要说明的是，从在制备工序中混合物的制备结束起截至在照射工序中开始紫外线照射为止的时间，优选是10分钟～1小时。
对加入了混合物的小瓶内部的气体进行置换而使小瓶内成为非活性环境的过程，需要10分钟左右的时间。因此，当上述时间不足10分钟时，有可能得不到自由基聚合所需的非活性环境。另外，会导致在混合物中DMAEMA的水解反应在紫外线的照射开始之前开始。当上述时间超过1小时，将导致在自由基聚合反应中，混合物中大量生成非活性的甲基丙烯酸。
在(A-1)温度响应性聚合物的制造方法，因为混合物中含有水，所以能够使DMAEMA的自由基聚合反应与聚甲基丙烯酸-2-N,N-二甲氨基乙酯(PDMAEMA)的侧链的酯键的水解反应相抗衡。
基于该抗衡而得到的生成物是含有由下述式(I)表示的重复单元(A)以及由下述式(II)表示的重复单元(B)的聚合物。
因此，能够以良好平衡的方式具有聚合物所具备的阳离子型官能团即二甲氨基、以及聚合物所具备的阴离子型官能团即由侧链的酯键水解而来的羧基。而且，基于(A-1)温度响应性聚合物的制造方法，能够以较少的工序简便地制造具有阳离子型官能团和阴离子型官能团的源自聚(甲基丙烯酸-2-N,N-二甲氨基乙酯)的聚合物。
需要说明的是，即使是与(A-1)温度响应性聚合物的制造方法不同的制造方法，只要在紫外线照射时DMAEMA、阻聚剂及水在反应体系中共存，就能够得到与本发明的温度响应性聚合物的制造方法的上述效果相同的效果。
下述温度响应性聚合物的制造方法也属于(A-1)温度响应性聚合物的制造方法，例如，分别准备混合物和水，所述混合物含有DMAEMA和阻聚剂，然后，在混合物和水中进行非活性气体的鼓泡，然后，将混合物和水在非活性环境下混合，与此同时进行紫外线照射。
(温度响应性聚合物)
(A-1)温度响应性聚合物是通过上述(A-1)的制造方法制造的。
在此，作为(A-1)温度响应性聚合物，优选数均分子量(Mn)为10kDa～500kDa的分子。另外，优选重均分子量(Mw)和数均分子量(Mn)之比(Mw/Mn)是1.1～10.0的分子。
(A-1)温度响应性聚合物的分子量能够通过紫外线的照射时间以及照射强度的条件适当调节。
基于(A-1)温度响应性聚合物，能使浊点下降至例如室温(25℃)以下。
对于上述(A-1)温度响应性聚合物，在浊点以上的温度形成的温度响应性聚合物的不溶物在室温(约25℃)条件下截至再溶解为止的时间被显著延迟。该现象被推测是因为得到的(A-1)温度响应性聚合物在分子内存在阳离子型官能团和阴离子型官能团所以具有高自凝集性的缘故。
另外，能够采用该(A-1)温度响应性聚合物如后所述地制备在培养面包覆该温度响应性聚合物而成细胞培养器。
进一步，基于(A-1)温度响应性聚合物，通过如后所述地在适宜的培养条件下培养细胞，从而能够形成具有管腔状(管状)及块状(颗粒状)的结构的细胞结构体。
(A-1)温度响应性聚合物具有的阳离子型官能团(2-N,N-二甲氨基)的官能团数量与阴离子型官能团(羧基)的官能团数量之比(C/A比值)优选是0.5～32，更优选是4～16。
如果将C/A比值设为上述范围，就能够很容易得到使浊点降低的上述效果。推测原因是，对于有上述C/A比值的温度响应性聚合物，在上述温度响应性聚合物中阳离子型官能团和阴离子型官能团以离子键方式对分子间和/或分子内的凝集产生作用，从而增强了温度响应性聚合物的凝集力。
另外，如果将C/A比值设为上述范围，推测能使上述温度响应性聚合物中的正电荷和负电荷之间的平衡特别合适，从而能抑制因正电荷造成的细胞伤害，另外，还能使上述温度响应性聚合物的亲水性和疏水性之间的平衡特别合适，从而能够使细胞的迁移、取向易于发生。
以下，说明上述(A-2)温度响应性聚合物及其制造方法。
(温度响应性聚合物的制造方法)
在(A-2)温度响应性聚合物的制造方法中，首先，对含有甲基丙烯酸-2-N,N-二甲氨基乙酯(DMAEMA)的第一混合物照射紫外线(第一聚合工序)。
在此，第一混合物在含有DMAEMA之外，还可以任选地含有例如其他的单体、溶剂等。
另外，可以在非活性环境下照射紫外线。
作为DMAEMA，可以是市售品。
作为能包含在第一混合物中的其他单体，可举出例如，N,N-二甲基丙烯酰胺、具有聚乙二醇侧链的丙烯酸或甲基丙烯酸的酯、N-异丙基丙烯酰胺、3-N,N-二甲氨基丙基丙烯酰胺、2-N,N-二甲氨基乙基甲基丙烯酰胺等，从能够稳定地调节离子平衡的观点出发，特别优选N,N-二甲基丙烯酰胺、具有聚乙二醇侧链的丙烯酸或甲基丙烯酸的酯、N-异丙基丙烯酰胺。它们可以单独地使用一种，也可以组合两种以上使用。在此，其他单体的使用量相对DMAEMA的使用量的比例(摩尔数)优选是0.001～1，更优选是0.01～0.5。
作为溶剂，可举出例如甲苯、苯、氯仿、甲醇、乙醇等，因为甲苯、苯相对于DMAEMA的酯键是非活性的，所以特别优选。它们可以单独地使用一种，也可以组合两种以上使用。
在该工序中，例如，在透明的密封小瓶内加入上述第一混合物，通过用非活性气体进行鼓泡而使小瓶内成为非活性环境之后，从小瓶的外部用紫外线照射装置照射紫外线。
作为紫外线的波长，优选是210～600nm，更优选是360～380nm。如果设为上述范围，就能够高效地进行聚合反应，并能够稳定地得到具有所期望的共聚比例的高分子材料。另外，还能够防止制造的聚合物材料着色。
作为紫外线的照射强度，优选是0.01～50mW/cm2，更优选是0.1～5mW/cm2。如果设为上述范围，就能够抑制因不必要的化学键的断裂等造成的分解，并且使聚合反应以合适的速度(时间)稳定地进行。
作为非活性气体，可举出氮、氩、氦、氖等。
作为温度条件，优选是10～40℃，更优选是20～30℃。如果设为上述范围，就能够在通常的实验室的室温条件下进行反应，另外，还能够通过除了光以外的其他方式(加热等)来抑制反应。
作为反应时间，优选是10分钟～48小时，更优选是60分钟～24小时。
在该工序中，DMAEMA在紫外线照射作用下发生自由基聚合而成为聚合物(聚(甲基丙烯酸-2-N,N-二甲氨基乙酯)(PDMAEMA))，形成含有甲基丙烯酸-2-N,N-二甲氨基乙酯的均聚物段(homopolymer block)。在还使用了其他单体的情况下，形成含有DMAEMA和其他单体的聚合物段。
然后，在(A-2)温度响应性聚合物的制造方法中，在第一聚合工序中的聚合物(具体是聚合而成的甲基丙烯酸-2-N,N-二甲氨基乙酯)的数均分子量成为规定值以上的时间点，在第一混合物中添加阴离子型单体来制备第二混合物(添加工序)。
在此，第二混合物除了包含第一聚合工序后的第一混合物以及阴离子型单体之外，还可以包含例如其他单体、前述的能包含在第一混合物中的溶剂(甲苯、苯、甲醇等)等。
另外，可以在非活性环境下添加阴离子型单体。
作为阴离子型单体，可举出例如丙烯酸、甲基丙烯酸、以及侧链中具有选自由羧基、磺酸基、磷酸基所组成的组中的至少一种基团的乙烯衍生物等，从化学稳定性的观点出发，特别优选丙烯酸、甲基丙烯酸。
它们可以单独地使用一种，也可以组合两种以上使用。
作为能包含于第二混合物的其他单体，可举出例如N,N-二甲基丙烯酰胺、具有聚乙二醇侧链的丙烯酸或甲基丙烯酸的酯、N-异丙基丙烯酰胺、3-N,N-二甲氨基丙基丙烯酰胺、2-N,N-二甲氨基乙基甲基丙烯酰胺等，特别优选为电中性且为亲水性的N,N-二甲基丙烯酰胺。它们可以单独地使用一种，也可以组合两种以上使用。在此，其他单体的使用量相对DMAEMA的使用量的比例(摩尔)优选是0.01～10，更优选是0.1～5。
在该工序中，例如，一边通过使非活性气体流入小瓶而保持小瓶内为非活性环境，一边添加上述第二混合物。
从得到充分的浊点降低的效果的观点出发，数均分子量的规定值优选为5000，更优选为20000，特别优选为100000。
需要说明的是，第一聚合工序后的第一混合物中的聚合而成的PDMAEMA的数均分子量，能够通过在规定的时间点从聚合体系采集少量的反应混合物并利用凝胶渗透色谱(GPC)、光散射法(SLS)等本领域技术人员公知的方法进行测定。
在该工序中，除了均聚物以外，阴离子型单体也包含在聚合体系内，从而使小瓶内的聚合体系从DMAEMA的单独聚合体系转变为DMAEMA与阴离子型单体的共聚体系，所述均聚物含有正在聚合中的DMAEMA。
然后，在(A-2)温度响应性聚合物的制造方法中，对第二混合物照射紫外线(第二聚合工序)。
在此，可以在非活性环境下照射紫外线。
在该工序中，例如，从已添加第二混合物后的小瓶的外部用紫外线照射装置照射紫外线。
第二聚合工序中的紫外线的波长、紫外线的照射强度、所用的非活性气体、反应温度、反应时间等各种条件，可以与第一聚合工序中的条件相同。
在该工序中，DMAEMA和阴离子型单体在紫外线照射作用下发生自由基聚合，并以连接于第一聚合工序中形成的含DMAEMA的均聚物段的聚合链α末端的方式，形成含有DMAEMA和阴离子型单体的共聚物段。在还使用了其他单体的情况下，形成含有DMAEMA、阴离子型单体以及其他单体的共聚物段。
如上所述，得到了包含均聚物段及共聚物段的温度响应性聚合物，所述均聚物段含有DMAEMA，所述共聚物段是DMAEMA与阴离子型单体的共聚物段。
需要说明的是，对于(A-2)的制造方法，正如本领域技术人员所理解的那样，在要生成具有多种分子量及分子结构的聚合物的混合物的情况下，从取得作为主要成分的、包含均聚物段及共聚物段的温度响应性聚合物的观点出发，优选在第一聚合工序、添加工序以及第二聚合工序中一直在相同的条件下进行聚合，所述均聚物段含有DMAEMA，所述共聚物段是DMAEMA与阴离子型单体的共聚物段。
(温度响应性聚合物)
(A-2)温度响应性聚合物是通过上述(A-2)的制造方法而制造的。
(A-2)温度响应性聚合物包含聚合物段(聚合链α末端)和共聚物段，该聚合物段以含有甲基丙烯酸-2-N,N-二甲氨基乙酯为主，并任选地含有二甲基丙烯酰胺、具有聚乙二醇侧链的丙烯酸或甲基丙烯酸等亲水性单体等的其他单体单元，该共聚物段以含有甲基丙烯酸-2-N,N-二甲氨基乙酯和阴离子型单体(聚合链ω末端)为主，并任选地含有其他单体单元。
优选(A-2)温度响应性聚合物包含DMAEMA的均聚物段、以及DMAEMA与阴离子型单体形成的共聚物段，更优选由这些段所构成。
在此，作为(A-2)温度响应性聚合物，聚合链α末端的聚合物段(例如，DMAEMA的均聚物段)的数均分子量优选是5000Da以上，更优选是20000Da以上。
作为(A-2)温度响应性聚合物，优选是数均分子量(Mn)为10～500kDa的分子。另外，优选的是，重均分子量(Mw)与数均分子量(Mn)之比(Mw/Mn)为1.1～10.0的分子。
温度响应性聚合物的分子量能够通过紫外线的照射时间以及照射强度的条件适宜调节。
基于(A-2)温度响应性聚合物，能够使浊点下降至例如室温(25℃)以下。
对于上述(A-2)温度响应性聚合物，在浊点以上的温度形成的温度响应性聚合物的不溶物在室温(约25℃)条件下截至再溶解为止的时间被延迟。该现象被推测是因为得到的温度响应性聚合物在分子内存在阳离子型官能团和阴离子型官能团所以具有高自凝集性的缘故。
特别是对于(A-2)温度响应性聚合物，因为其在聚合链α末端具备具有高分子量(例如，5000Da以上)的DMAEMA的均聚物段，所以容易发生DMAEMA侧链的温度依赖性的珠球转变(globule transition)，而能够有效地降低浊点。
另外，能够采用该温度响应性聚合物如后所述地制备在培养面包覆该温度响应性聚合物而成的细胞培养器。
进一步，基于(A-2)温度响应性聚合物，通过如后所述地在适宜的培养条件下培养细胞，能够形成具有块状(颗粒状)结构的细胞结构体。
(A-2)温度响应性聚合物具有的阳离子型官能团(2-N,N-二甲氨基)的官能团数量和阴离子型官能团(羧基)的官能团数量之比(C/A比值)优选是0.5～32，更优选是4～16。
如果将C/A比值设为上述范围，能易于得到使浊点降低的上述效果。推测原因是，对于具有上述C/A比值的温度响应性聚合物，在上述温度响应性聚合物中阳离子型官能团和阴离子型官能团以离子键方式对分子间和/或分子内的凝集产生作用，从而增强了温度响应性聚合物的凝集力。
另外，如果将C/A比值设为上述范围，推测能使上述温度响应性聚合物中的正电荷和负电荷之间的平衡特别合适，从而能抑制因正电荷造成的细胞伤害，另外，还能使上述温度响应性聚合物的亲水性和疏水性之间的平衡特别合适，从而能够使细胞的迁移、取向易于发生。
以下，针对上述(B)温度响应性聚合物及其制造方法进行说明。
(温度响应性聚合物的制造方法)
(B)温度响应性聚合物的制造方法是使N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)(以下也称为“单体(A)”)、阳离子型单体(以下也称为“单体(B)”。)、阴离子型单体(以下也称为“单体(C)”。)聚合的方法。还可以任选地在上述三类单体中加入除此以外的其他单体而使之聚合。
作为N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)，可以是市售品。
作为阳离子型单体，可举出具有阳离子型官能团的单体，作为阳离子型官能团，可举出一级～四级胺基等的胺基、胍基等，特别从化学稳定性、低细胞伤害性、灭菌稳定性、强正电荷性的观点出发，优选三级胺基。
更具体而言，作为阳离子型单体，优选即使负载生理活性物质、或置于碱性条件下也具有高稳定性的单体，可举出例如3-(N,N-二甲氨基丙基)-(甲基)丙烯酰胺、3-(N,N-二甲氨基丙基)-(甲基)丙烯酸酯、氨基苯乙烯、2-(N,N-二甲氨基乙基)-(甲基)丙烯酰胺、2-(N,N-二甲氨基乙基)-(甲基)丙烯酸酯等。
这些当中，特别优选3-(N,N-二甲氨基丙基)丙烯酰胺，因为其具有高的正电荷强度而易于负载阴离子型物质。
另外，优选氨基苯乙烯，因为其具有高的正电荷强度所以容易负载阴离子型物质，并且因为分子内的芳香环在水溶液中会与其他物质的疏水性结构相互作用所以能负载的阴离子型物质的变化被加以扩展。
进一步，优选2-(N,N-二甲氨基乙基)-甲基丙烯酰胺，因为其在中性区域的pH条件下具有微弱的正电荷而且在水中的溶解性不受温度影响，所以容易一次性释放所负载的阴离子型物质。
它们可以单独地使用一种，也可以组合两种以上使用。
作为阴离子型单体，可举出具有阴离子型官能团的单体，作为阴离子型官能团，可举出羧酸基、磺酸基、硫酸基、磷酸基、硼酸基等，从化学稳定性、细胞亲和性、高纯化度的观点出发，特别优选羧酸基、磺酸基、磷酸基。
更具体而言，可举出丙烯酸、甲基丙烯酸、乙烯基苯甲酸等，从化学稳定性、细胞亲和性的观点出发，特别优选甲基丙烯酸、乙烯基苯甲酸。
它们可以单独地使用一种，也可以组合两种以上使用。
作为其他单体，可举出例如二甲基丙烯酰胺、具有聚乙二醇侧链的丙烯酸或甲基丙烯酸等中性的亲水性单体等。
它们可以单独地使用一种，也可以组合两种以上使用。
其他单体可以用于调节除电荷以外的亲水性-疏水性的平衡，能够扩展变化。
在此，对于(B)温度响应性聚合物的制造方法中的NIPAM的使用量、阳离子型单体的使用量、其他单体的使用量分别相对单体(A)～(C)的总使用量的比例(摩尔)，本领域技术人员能够考虑单体在聚合反应中的反应性并以能得到所希望的单体成分的比例的方式进行适当调节。
在此，作为聚合方法，可举出自由基聚合、离子聚合等。
作为自由基聚合，优选是活性自由基聚合，作为活性自由基聚合，可举出可逆加成-断裂链转移聚合(RAFT)、原子转移自由基聚合(ATRP)、引发转移终止剂聚合等，优选引发转移终止剂聚合。
作为离子聚合，优选活性阴离子聚合。
(B)温度响应性聚合物的制造方法的一个例子是使用自由基聚合的方法。
在该制造方法的一个例子中，首先，对含N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)的第一混合物照射紫外线(第一聚合工序)。
在此，第一混合物除了含有DMAEMA以外，还可以任选地含有例如其他单体、溶剂、链转移剂、稳定剂、表面活性剂等。
另外，可以在非活性环境下照射紫外线。
在该工序中，例如，在透明的密封小瓶内加入上述第一混合物，通过用非活性气体进行鼓泡而使小瓶内成为非活性环境之后，从小瓶的外部用紫外线照射装置照射紫外线。
作为溶剂，可举出例如苯、甲苯、氯仿、甲醇、水、等，从溶解能力的点以及对聚合是非活性的点出发，特别优选苯、甲苯。它们可以单独地使用一种，也可以组合两种以上使用。
在该工序中，例如，在透明的密封小瓶内加入上述第一混合物，通过用非活性气体进行鼓泡而使小瓶内成为非活性环境之后，从小瓶的外部用紫外线照射装置照射紫外线。
作为紫外线的波长，优选是210～600nm，更优选是360～380nm。如果设为上述范围，就能够高效地进行聚合反应，并能够稳定地得到具有所期望的共聚比例的高分子材料。另外，还能够防止制造的聚合物材料着色。
作为紫外线的照射强度，优选是0.01～50mW/cm2，更优选是0.1～5mW/cm2。
作为非活性气体，可举出氮、氩、氦、氖等。
作为温度条件，优选是10～40℃，更优选是20～30℃。如果设为上述范围，就能够在通常的实验室的室温条件下进行聚合反应，另外，还能够通过与光照射的方式不同的加热的方式进行反应控制。
作为反应时间，作为反应时间，优选是10分钟～48小时，更优选是60分钟～24小时。
在该工序中，NIPAM在紫外线的照射作用下发生自由基聚合而成为聚合物(聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAM))，形成含有N-异丙基丙烯酰胺的均聚物段。在还使用了其他单体的情况下，形成含有NIPAM和其他单体的聚合物段。
然后，在(B)温度响应性聚合物的制造方法中，在第一聚合工序后的第一混合物中添加阳离子型单体和阴离子型单体来制备第二混合物(添加工序)。
在此，第二混合物除了含有第一聚合工序后的第一混合物、阳离子型单体以及阴离子型单体以外，还可以含有例如其他单体、溶剂、链转移剂、稳定剂、表面活性剂等。
另外，可以在非活性环境下添加阳离子型单体和阴离子型单体。
在该工序中，例如，一边通过使非活性气体流入小瓶而保持小瓶内为非活性环境，一边添加上述阳离子型单体和阴离子型单体。
在该工序中，除了均聚物以外，阳离子型单体及阴离子型单体也被包含在聚合体系中，从而使小瓶内的聚合体系从NIPAM的单独聚合体系转换为NIPAM、阳离子型单体及阴离子型单体的共聚体系，所述均聚物含有正在聚合中的NIPAM。
然后，在(B)温度响应性聚合物的制造方法中，对第二混合物照射紫外线(第二聚合工序)。
在此，可以在非活性环境下照射紫外线。
在该工序中，例如，用紫外线照射装置从已添加了阳离子型单体和阴离子型单体之后的小瓶的外部照射紫外线。
作为紫外线的波长，优选是210～600nm，更优选是360～380nm。如果设为上述范围，就能够高效地进行聚合反应，并能够稳定地得到具有所期望的共聚比例的高分子材料。另外，还能够防止制造的聚合物材料着色。
作为紫外线的照射强度，优选是0.01～50mW/cm2，更优选是0.1～5mW/cm2。
作为非活性气体，可举出氮、氩、氦、氖等。
作为温度条件，优选是10～40℃，更优选是20～30℃。如果设为上述范围，就能够在通常的实验室的室温条件下进行聚合反应，另外，还能够通过与光照射的方式不同的加热的方式进行反应控制。
作为反应时间，作为反应时间，优选是10分钟～48小时，更优选是60分钟～24小时。
在该工序中，NIPAM、阳离子型单体和阴离子型单体在紫外线的照射作用下发生自由基聚合，以连接于第一聚合工序中形成的含有NIPAM的均聚物段的聚合链α末端的方式，形成含有NIPAM、阳离子型单体和阴离子型单体的共聚物段。在还使用了其他单体的情况下，会形成聚合物段和/或共聚物段，该聚合物段含有NIPAM和其他单体，该共聚物段含有NIPAM、阳离子型单体、阴离子型单体和其他单体。
如上所述，可得到包含均聚物段和共聚物段的温度响应性聚合物，所述均聚物段含有NIPAM，所述共聚物段是NIPAM与阳离子型单体与阴离子型单体的共聚物段。
需要说明的是，在该一个例子的制造方法中，从实现高效反应的观点出发，优选在第一聚合工序、添加工序以及第二聚合工序中一直照射紫外线。
(B)温度响应性聚合物的制造方法的另一个例子是采用了自由基聚合的方法，对含有N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)、阳离子型单体、阴离子型单体、可任选的其他单体的混合物照射紫外线。
在此，上述混合物还可以含有例如溶剂、链转移剂、稳定剂、表面活性剂等。
另外，可以在非活性环境下照射紫外线。
关于其他的条件，可以与前述一个例子的制造方法相同。
进一步，在采用引发转移终止剂聚合的情况下，作为引发转移终止剂，可以使用苄基-(N,N-二乙基)二硫代氨基甲酸酯，作为溶剂，可以使用甲苯等，也可以通过近紫外线的照射进行活性聚合。在此，通过在第一单体的聚合之后经过分离操作再进行第二单体的聚合，从而能够得到嵌段共聚物。
进一步，在采用离子聚合的情况下，作为催化剂，可以使用NaOH粉末，作为溶剂，可以将用于纯化的再沉淀用溶剂与非质子系溶剂一起使用。第一单体的聚合后，经过再沉淀操作(该操作后在ω末端残留离子种类(ionspecies))，进行第二单体的聚合，以此能够得到嵌段共聚体。
(温度响应性聚合物)
(B)温度响应性聚合物是通过上述(B)的制造方法制造的。
(B)温度响应性聚合物包含N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)单元、阳离子型单体单元、阴离子型单体单元，并任选地包含其他单体单元。本聚合物能够通过前述一个例子、另一个例子的制造方法来制造。
优选(B)温度响应性聚合物包含聚合物段(聚合链α末端)以及共聚物段，所述聚合物段主要包含N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)单元并任选地含有其他单体单元，所述共聚物段主要包含阳离子型单体单元和阴离子型单体单元并任选地含有其他单体单元。更优选(B)温度响应性聚合物包含NIPAM的均聚物段以及共聚物段，该共聚物段是NIPAM与阳离子型单体与阴离子型单体的共聚物段，特别优选由这些段所构成。本聚合物能够通过前述的一个例子的制造方法来制造而得。
例如，对于专利文献1所记载的温度响应性聚合物，赋予聚合物温度响应性的DMAEMA同时也作为(与阴离子型单体共同地)形成细胞结构体所必须的阳离子型单体，另外，与温度响应性相关的DMAEMA作为聚合物段包含于聚合链α末端。
在所述温度响应性聚合物中，因为聚合链α末端必须存在阳离子型单体，所以聚合链中的阳离子型位点位置的调节自由度不高，另外，因为阳离子型单体主要限于DMAEMA，所以阳离子型位点的正电荷强度的调节、温度响应性聚合物水溶液的pH的调节也不一定容易。
例如，在将温度响应性聚合物用于药物传递(DDS)的情况下，能负载的药剂的种类、量可能受限。作为DDS的方式，可举出例如通过将负载有药剂的温度响应性聚合物涂布于细胞培养器，并使用涂布后的细胞培养器进行细胞、组织的培养，从而从包覆物向细胞、组织缓慢释放药剂的方法等。在此，因为上述专利文献1的温度响应性聚合物中包含正电荷强度较小的DMAEMA，所以阴离子型物质的药剂的负载并不一定容易，而且能负载的药剂的种类、量还可能受限。
另一方面，对于(B)温度响应性聚合物，赋予聚合物温度响应性的NIPAM是中性的单体，并且(与阴离子型单体共同地)形成细胞结构体所必须的阳离子型单体是与NIPAM不同的单体。
对于(B)温度响应性聚合物，在聚合链α末端不一定必须存在阳离子型单体，能够自由调节聚合链中的阳离子型位点的位置，另外，因为能够广泛使用阳离子型单体，所以能够容易地调节阳离子型位点的正电荷强度、温度响应性聚合物水溶液的pH。
基于(B)温度响应性聚合物，例如在将温度响应性聚合物用于药物传递(DDS)的情况下，能够拓展能负载的药剂的种类并使负载量增加，进而能够拓展温度响应性聚合物的应用范围。
在(B)温度响应性聚合物中，NIPAM单元相对于NIPAM单元、阳离子型单体单元及阴离子型单体单元的合计的比例(摩尔)优选是0.6～0.9，更优选是0.7～0.9，特别优选是0.9。
在还使用了其他单体的情况下，其他单体单元相对于NIPAM单元、阳离子型单体单元及阴离子型单体单元的合计的比例(摩尔)优选是0.001～0.2，更优选是0.01～0.1。
作为(B)温度响应性聚合物，聚合链α末端的聚合物段(例如，NIPAM的均聚物段)的数均分子量优选是5000Da以上，更优选是20000Da以上。
作为(B)温度响应性聚合物，优选是数均分子量(Mn)为10～500kDa的分子。另外，优选是重均分子量(Mw)与数均分子量(Mn)之比(Mw/Mn)为1.1～10.0的分子。
温度响应性聚合物的分子量能够根据聚合条件进行适当调节。
基于(B)温度响应性聚合物，能够使浊点下降至例如室温(25℃)以下。
对于上述温度响应性聚合物而言，在浊点以上的温度形成的温度响应性聚合物的不溶物在室温(约25℃)条件下截至再溶解为止的时间被延迟。该现象被推测是因为得到的温度响应性聚合物在分子内存在阳离子型官能团和阴离子型官能团所以具有高自凝集性的缘故。
认为特别是因为前述的(B)温度响应性聚合物在聚合链α末端具备具有高分子量的NIPAM的均聚物段，所以NIPAM的侧链的温度依赖性的珠球转变容易发生，从而能够有效地降低浊点。
另外，能够采用该温度响应性聚合物如后所述地制备在培养面包覆该温度响应性聚合物而成的细胞培养器。
进一步，基于(B)温度响应性聚合物，通过如后所述地在适宜的培养条件下培养细胞，能够形成具有管腔状(管状)、块状(颗粒状)结构的细胞结构体。
(B)温度响应性聚合物具有的阳离子型官能团的官能团数量与阴离子型官能团的官能团数量之比(C/A比值)优选是0.5～32，更优选是4～16。
如果将C/A比值设为上述范围，能易于得到使浊点降低的上述效果。推测原因是，对于具有上述C/A比值的温度响应性聚合物，在上述温度响应性聚合物中阳离子型官能团和阴离子型官能团以离子键方式对分子间和/或分子内的凝集产生作用，从而增强了温度响应性聚合物的凝集力。
另外，如果将C/A比值设为上述范围，推测能使上述温度响应性聚合物中的正电荷和负电荷之间的平衡特别合适，从而能抑制因正电荷造成的细胞伤害，另外，还能使上述温度响应性聚合物的亲水性和疏水性之间的平衡特别合适，从而能够使细胞的迁移、取向易于发生。
以下，针对上述(C)温度响应性聚合物及其制造方法进行说明。
(温度响应性聚合物组合物的制造方法)
对于(C)温度响应性聚合物组合物的制造方法，首先，制备混合型温度响应性聚合物组合物(混合物制备工序)。具体而言，将(1)甲基丙烯酸-2-N,N-二甲氨基乙酯(DMAEMA)和/或其衍生物的聚合物、(2)2-氨基-2-羟甲基-1,3-丙二醇(Tris)、以及，(3)选自由核酸、肝素、透明质酸、硫酸葡聚糖、聚苯乙烯磺酸、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚磷酸、硫酸多糖类、凝胶多糖和聚海藻酸及它们的碱金属盐所组成的组中的一种以上的阴离子型物质混合(可任选地含有(2)Tris。)。
(1)DMAEMA和/或其衍生物的聚合物是温度响应性聚合物，其浊点是32℃。(2)推测Tris发挥以下作用：使在比浊点低一些的温度和/或比浊点高的高温条件下形成的聚合物在被冷却至浊点以下时再溶解的速度降低，另外，即使在疎水化的聚合物层中也在维持亲水性的同时通过来自氨基的正电荷来给予细胞刺激。(3)推测阴离子型物质起到能使培养的细胞迁移、取向的作用、抑制细胞伤害性的作用。
基于该混合型温度响应性聚合物组合物，能够使浊点降低至室温(25℃)以下。
推测在上述组合物中，DMAEMA和/或其衍生物的聚合物的侧链与Tris彼此相互作用(例如，交联作用)而使上述聚合物变得易于凝集。
在此，关于上述(1)，作为DMAEMA和/或其衍生物的聚合物，优选数均分子量(Mn)是10kDa～500kDa的分子。另外，优选重均分子量(Mw)与数均分子量(Mn)之比(Mw/Mn)是1.1～6.0的分子。
另外，作为(1)DMAEMA的衍生物，可举出例如，甲基丙烯酸酯的甲基的氢原子被卤素取代而成的衍生物、甲基丙烯酸酯的甲基被低级烷基取代而成的衍生物、二甲氨基的甲基的氢原子被卤素取代而成的衍生物、二甲氨基的甲基被低级烷基取代而成的衍生物。
关于上述(2)，Tris优选是纯度99.9％以上的纯物质，或在使用时通过添加碱性物质等将Tris水溶液制成中性或碱性。在使用以盐酸盐的状态销售的Tris的情况下，由于Tris水溶液的pH下降，造成组合物的浊点上升至70℃左右。因此，不优选Tris盐酸盐。
在上述(3)中列举的阴离子型物质中，对于核酸而言，可举出DNA、RNA、其他的单链、双链、寡核酸、发夹结构(hairbin)等的人工核酸等。
特别地，作为DNA，优选能够将iPS细胞、ES细胞、间叶系干细胞等干细胞诱导分化成分化的细胞、特别是诱导分化成心肌细胞、肝细胞、神经细胞、血管内皮细胞的DNA。
另外，在上述(3)中列举的阴离子型物质优选具有一定程度的尺寸，例如1kDa～5000kDa的分子量(M)。
如果分子量设为上述范围，阴离子型物质就能够起到与阳离子型物质发生离子键合而长期捕捉阳离子型物质的作用，从而形成稳定的离子复合体微粒子。另外，能够缓和阳离子型物质通常具有的因对细胞的细胞膜表面的静电相互作用而造成的细胞伤害性。
除了在上述(3)中列举的阴离子型物质之外，还能使用实质上作为阴离子型物质起作用的聚合物衍生物，该聚合物衍生物是例如通过使作为阳离子型聚合物的聚(4-氨基苯乙烯)的4-位的氨基与草酸等二羧酸进行脱水缩合从而导入了阴离子型官能团而成的。
需要说明的是，也可以含有两种以上的在上述(3)中列举的阴离子型物质。
在此，优选使用(2)2-氨基-2-羟甲基-1,3-丙二醇(Tris)相对于(1)甲基丙烯酸-2-N,N-二甲氨基乙酯(DMAEMA)和/或其衍生物的聚合物的比例((2)/(1))为1.0以下的混合型温度响应性聚合物组合物。
需要说明的是，比例((2)/(1))是重量比例。
在使用上述比例的混合型温度响应性聚合物组合物的情况下，能够在后述的培养工序中使细胞结构体更易形成。
基于该组合物，能够使上述组合物的亲水性与疏水性之间的平衡更合适。因此，推测该合适的平衡将细胞与培养面的粘附性调节得较为合适从而使细胞的迁移、取向处于活性化状态。
另外，优选上述比例((2)/(1))为0.1以上。
通过将上述比例设为0.1以上，能易于得到使浊点降低的上述效果。另外，能易于得到使细胞结构体更易形成的上述效果。
基于与上述相同的理由，更优选上述比例((2)/(1))为0.1～0.5。
在此，优选混合型温度响应性聚合物组合物中的C/A比值(正电荷/负电荷)为0.5～16。
需要说明的是，在本申请的说明书中，C/A比值是指组合物中所含的物质具有的正电荷相对于组合物中所含的物质具有的负电荷的比例。具体而言，将(1)DMAEMA和/或其衍生物的聚合物的摩尔数设为N1、将(3)阴离子型物质的摩尔数设为N3时，C/A比值用{(每1分子的聚合物的正电荷)×N1}/{(每1分子的阴离子型物质的负电荷)×N3}表示。
另外需要说明的是，在本申请的说明书中，当阴离子型物质设为DNA时，每1分子的阴离子型物质的负电荷数用DNA的碱基对的数目(bp数目)×2来计算，分子量(Da)用bp数目×660(AT对以及CG对的平均分子量)来计算。
通过将C/A比值设为0.5～16，更易于得到使管状细胞结构体更易形成的上述效果。
据推测，合适地设定上述组合物中的正电荷与负电荷之间的平衡，能够抑制因正电荷造成的细胞伤害性。另外，据推测，进一步合适地设定上述组合物的亲水性与疏水性之间的平衡，能使细胞的迁移、取向更易发生。
基于与上述相同的理由，上述C/A比值更优选是2～10，特别地，C/A比值最优选是8附近。
上述温度响应性聚合物或上述温度响应性聚合物组合物可以通过加热干燥、冷冻干燥、减压蒸馏等去除水分，并溶解于甲醇、乙醇等醇、酮、酯等有机溶剂。在它们当中，从表面张力、沸点较低且能够迅速干燥并能够更均匀地包覆温度响应性聚合物的观点出发，优选使其溶解于甲醇。另外，在溶解于有机溶剂的情况下，还可以加入聚乙二醇(PEG)、二甲基丙烯酰胺(DMAA)、甘油、TritonX、聚丙二醇等的非离子型且亲水性的亲水性分子。
(细胞培养器的制造方法)
在图1中，将本发明的实施方式的细胞培养器的制造方法的一个例子的概略与本发明的实施方式的细胞培养器的一个例子的概略及采用了本发明的实施方式的细胞培养器的细胞培养方法的一个例子的概略一同示出。
本发明的实施方式的细胞培养器的制造方法的一个例子仅具有第一包覆区域而不具有第二包覆区域。
在本发明的实施方式的细胞培养器的制造方法的一个例子中，首先，准备细胞培养器(参见图1(i))。
需要说明的是，在图1所示的例子中，将细胞培养器的培养面设为细胞非粘附性。
然后，在细胞培养器的培养面上的多个位置，配置温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物(点样)(参见图1(ii))。
在此，作为温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物的配置(点样)方式，可举出例如利用8道微移液器的手段、定量喷出溶液的点样印刷法、旋转筛辊筒(Screendrum)印刷法等。
另外，使用水溶液状态下的温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物的情况下，可以将其冷却至浊点以下的温度使用。
在图1所示的例子中，在4个位置涂布了温度响应性聚合物的水溶液。
如前所述，作为包覆方式，可举出以下方式：从水溶液的状态产生沉淀的方式；从涂布的水溶液或有机溶剂溶液中去除溶剂(干燥)的方式；使用了放射线照射、低温等离子体照射、电晕放电、辉光放电、紫外线、自由基产生剂的接枝聚合等的方式。
在该制造方法的一个例子中，使温度响应性聚合物结合于细胞培养器的培养面(通过相互作用、非共价键、共价键等)(参见图1(iii))。
在图1所示的例子中，使已涂布的温度响应性聚合物的水溶液进行干燥。
在此，作为涂布量，可以设为0.005～200μL，优选设为1～50μL。
在图1中，将采用了本发明的实施方式的细胞培养器的细胞培养方法的一个例子的概略与本发明的实施方式的细胞培养器的概略及本发明的实施方式的细胞培养器的制造方法的一个例子的概略一起示出。
在采用了本发明的实施方式的细胞培养器的细胞培养方法的一个例子中，种植细胞(参见图1(iv))。在此，可以在细胞培养器中加入培养基，然后加入使细胞悬浮的培养基。
种植的细胞的密度优选是1500个/mm2以下(通过在培养面的面积为200mm2的24孔细胞培养板中加入1.0mL的细胞悬浮液来种植时，密度优选是3.0×105个/mL以下)。需要说明的是，种植的细胞是活细胞。
如果设为上述细胞密度，粘附于第一包覆区域的细胞易于形成具有块状(颗粒状)结构的细胞结构体。
该细胞培养方法的一个例子能够特别合适地用于血管内皮细胞、脂肪细胞、脂肪干细胞、成纤维细胞等间叶系细胞。原代细胞的情况下，只要选择形成群落的粘附性细胞即可，能够由本领域技术人员适当选择。
接着，在该细胞培养方法的一个例子中，对已种植的细胞进行培养(参见图1(v))。培养条件可根据使用的细胞适当决定，例如，可以设为37℃、5％CO2环境等。
此时，如图1(v)所示，在已种植的细胞中，位于培养面中的第一包覆区域的细胞粘附于第一包覆区域，另一方面，在已种植的细胞中，位于培养面中的细胞非粘附性的非包覆区域的细胞则没有粘附于培养面。
在此，在该细胞培养方法的一个例子中，进行培养基更换(参见图1(vi))。
此时，如图1(vi)所示，未粘附于培养面的细胞从细胞培养器去除。
在该细胞培养方法的一个例子中，对粘附于第一包覆区域的细胞(参见图1(vii))进一步培养。培养条件可根据使用的细胞适当决定，例如，可设为37℃、5％CO2环境等。
此时，在具有特定范围的表面Zeta电位的第一包覆区域，能够简便地形成具有块状(颗粒状)结构的细胞结构体。
然后，如上所述形成的细胞结构体从第一包覆区域自发脱落，并在细胞培养器的培养面上移动(参见图1(viii))。
进一步，在培养面上移动的多个细胞结构体通过互相接触而相互粘附从而形成更大的细胞结构体(参见图1(ix))。在此，可以通过适当翻转/混合细胞培养器从而促进多个细胞结构体的接触。
在图8中，将本发明的实施方式的细胞培养器的制造方法的另一个例子的概略与本发明的实施方式的细胞培养器的另一个例子的概略及采用了本发明的实施方式的细胞培养器的细胞培养方法的另一个例子的概略一起示出。
对于本发明的实施方式的细胞培养器的另一个例子而言，在第一包覆区域的内侧具有第二包覆区域。
关于本发明的实施方式的细胞培养器的制造方法的另一个例子中的细胞培养器的准备(参见图8(i))、对细胞培养器的培养面配置温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物(参见图8(ii))、温度响应性聚合物与细胞培养器的培养面的结合(参见图8(iii))，可以与前述本发明的实施方式的细胞培养器的制造方法的一个例子的情况相同。
然后，在该制造方法的另一个例子中，在第一包覆区域上配置(点样)细胞粘附性物质(参见图8(iv))。
在此，作为温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物的配置(点样)方式，可举出例如，利用8道微型移液器的手段、定量喷出溶液的点样印刷法、旋转筛辊筒印刷法等。
在图8所示的例子中，在4个第一包覆区域的位置，分别在每一个位置涂布细胞粘附性物质的水溶液。
在此，作为涂布量，可以是0.01～100μL，优选是0.1～10μL。
接着，在该制造方法的另一个例子中，如图1所示的例子那样，对已涂布的细胞粘附性物质的水溶液进行干燥。
在图8中，将采用了本发明的实施方式的细胞培养器的细胞培养方法的另一个例子的概略与本发明的实施方式的细胞培养器的另一个例子的概略及本发明的实施方式的细胞培养器的制造方法的另一个例子的概略一起示出。
关于本发明的实施方式的细胞培养器的制造方法的另一个例子中的细胞的种植(参见图8(vi))、已种植的细胞的培养(参见图8(vii))、培养基更换(参见图8(viii))、粘附于第一以及第二包覆区域的细胞的进一步培养(参见图8(ix))，可以与前述本发明的实施方式的细胞培养器的制造方法的一个例子的情况相同。
如前所述，形成的细胞结构体通过位于第二包覆区域的部分细胞结构体而锚定于细胞培养器。
通过本发明的实施方式的细胞培养器的制造方法的一个例子制造的仅具有第一包覆区域而不具有第二包覆区域的细胞培养器，能够适宜用于再生医疗、药物传递(DDS)领域。
具体而言，可考虑的用途是，在再生医疗中用于想要再生的部位的细胞源、在DDS中用于细胞因子的分泌体。
通过本发明的实施方式的细胞培养器的制造方法的另一个例子制造的在第一包覆区域的内侧有第二包覆区域的细胞培养器，能够适合用于药物开发领域。
具体而言，可考虑的用途是采用价格昂贵的iPS细胞进行的小规模的药剂筛选。
在图12中示出采用了本发明的实施方式的细胞培养器的另一个例子的本发明的实施方式的细胞结构体培养槽的概略。在图12(a)中示出了细胞结构体培养槽的立体图，在图12(b)中示出了细胞结构体培养槽的剖面图。
如图12所示，本发明的实施方式的细胞结构体培养槽是在容器内由培养片多层地层叠而成的，该培养片具有多个在第一包覆区域的内侧具有第二包覆区域的位置。
本发明的实施方式的细胞结构体培养槽，适合用于在高活性状态下培养细胞结构体并使细胞结构体生成所希望的物质、生物材料(例如，生长因子、肽、糖、蛋白质、细胞因子、其他的生理活性物质、外泌体、小分子RNA(microRNA)等)以此得到所述物质、生物材料。
在采用了以往的培养槽的方法中，在容器内一边搅拌包含细胞块的培养基一边使其悬浮分散，得到细胞块产生的抗凝固剂(t-PA等)等。但是，即使在粘附性细胞的情况下，也使细胞悬浮而不会使其粘附，因此，细胞的活性较低、所希望的物质的生成效率变低。作为解决该问题的改良方法，正在探讨使细胞粘附于珠子(beads)，并一边搅拌含珠子的培养基一边分散的方法。然而，该方法存在培养规模变得较大以及细胞受细菌感染的风险增高的问题，并且，使细胞均匀且高效地粘附于珠子，这本身也很困难。
基于本发明的实施方式的细胞结构体培养槽，在粘附性细胞的情况下能够在使细胞粘附于培养面的状态下培养该细胞，并且，因为不需要搅拌培养基，所以能够有效利用容器内的空间，并降低细胞受细菌感染的风险。
关于细胞结构体培养槽中的培养板的详情，可以如在前述的本发明的实施方式的细胞培养器的另一个例子中所记载的那样。
在此，从使培养环境均匀的观点出发，优选的是，在培养片中，使细胞结构体锚定的上述位置，在片的纵向和横向形成阵列。
另外，在细胞结构体培养槽中，培养片彼此间设有能够使培养基通过的程度的间隔。所述间隔可通过以下方式设置，例如，在培养片的表面和/或背面适当设置高度大于细胞结构体的直径的突起部，用突起部的前端支撑与该培养片相邻的培养片。
如图12所示，在细胞结构体培养槽中，容器的侧壁设有用于投入培养基的投入部和用于排出培养基的排出部。
如图12所示，在采用了本发明的实施方式的细胞结构体培养槽的细胞结构体的培养的一个例子中，在制备了被锚定于培养片的细胞结构体后，从投入部投入培养基，并从排出部排出培养基。
在此，可以通过水分蒸发浓缩、冷冻干燥、乙醇沉淀、酚处理、抗体固定磁珠处理、抗体固定荧光珠处理、凝胶过滤、离心分离、密度梯度离心介质(density gradients)、透析、过滤、电泳、酶处理、液液萃取等本领域技术人员公知的方法，从排出的培养基中提取所希望的物质、生物材料。
需要说明的是，排出的培养基可以被灌注，另外还可任选地将其在进行透析而去除氨等代谢物、或用氧进行鼓泡而提高溶解氧的浓度的基础上进行再利用。需要说明的是，投入的培养基也可以是新的培养基。
本发明的实施方式的细胞结构体培养槽能够适合用于来源于生物体类的生理活性物质的制造等的用途。
实施例
以下，通过实施例更详细地说明本发明，但本发明不受下述实施例的任何限定。
在下述试验中，除非有特别说明否则均使用未进一步纯化的市售的试药。
(实施例1)
(试验1-1)聚合物的制造-1
分子内离子复合体型温度响应性聚合物的制造(实施例制法1-1)
在容量50mL的软质玻璃制的透明小瓶中加入甲基丙烯酸-2-N,N-二甲氨基乙酯(DMAEMA)10.0g，用磁力搅拌器进行了搅拌。
然后，对该混合物(液体)进行10分钟的G1级高纯度(纯度：99.99995％)的氮气清洗(流速：2.0L/分钟)，以此使该混合物脱氧。
其后，用圆型黑色(ブラック)荧光灯(NEC公司制，型号：FCL20BL，18W)对混合物进行5个小时的紫外线照射，从而使上述反应物聚合。
在此，采集一部分的反应物，测定了聚合物化后的DMAEMA的数均分子量(Mn)，结果是970000(分散度＝4.1)。
确认数均分子量为5000以上后，立即通过使非活性气体流入小瓶而保持小瓶内为非活性环境，同时添加甲基丙烯酸1.4g，再次用磁力搅拌器进行搅拌。需要说明的是，预先用非活性气体对在此加入的甲基丙烯酸进行了鼓泡。
用圆型黑色荧光灯(NEC公司制，型号：FCL20BL，18W)对所述混合物进行16个小时的紫外线照射，从而使上述反应物聚合。反应物在刚刚混合后带有粘性，1小时后固化，作为反应生成物，得到了聚合物。使该反应生成物溶解于2-丙醇并将溶液转移至透析管。然后，进行了72小时的透析，纯化了反应生成物。
将包含反应生成物的溶液用纤维素混合酯制的0.2μm过滤器(东洋滤纸公司制，型号：25AS020)过滤，通过对得到的滤液进行冻结干燥，得到了由DMAEMA的均聚物段、以及共聚物段构成的温度响应性聚合物(产量：6.8g、转化率60％)，所述共聚物段是DMAEMA与甲基丙烯酸的共聚物段。
用GPC(岛津公司制，型号：LC-10vp系列)以聚乙二醇(昭和电工科学仪器公司(Shodex社)制，TSK系列)为标准物质测定了该聚合物的数均分子量(Mn)，确定为Mn＝4500000(Mw/Mn＝2.2)(实施例聚合物1-1)。
用核磁共振装置(瓦里安公司(Varian)制，型号：Gemini300)以重水(D2O)为标准物质测定实施例聚合物1-1的核磁共振光谱(NMR)。下述结果表示实施例聚合物1中共同的代表性的峰。
1H-NMR(在D2O中)δ0.8-1.2(br,3H,-CH2-C(CH3)-),1.6-2.0(br,2H,-CH2-C(CH3)-),2.2-2.4(br,6H,-N(CH3)2),2.5-2.7(br,1.9H,-CH2-N(CH3)2),4.0-4.2(br,1.9H,-O-CH2-).
在此，根据在α位键合的甲基(δ0.8-1.2)的质子数(在DMAEMA单元的情况下和在甲基丙烯酸单元的情况下均是3个)A和与侧链的酯键的氧键合的乙基(δ4.0-4.2)的甲基质子数(DMAEMA单元的情况下是2个，甲在基丙烯酸单元的情况下是0个)B，算出DMAEMA的侧链具有的氨基的官能团数量与甲基丙烯酸的侧链的羧基的官能团数量之比。
其结果，在实施例聚合物1-1的情况下是94：6。将其换算成对包含阳离子型聚合物和阴离子型聚合物的两成分混合体系中的离子复合体而言的C/A比值的话，C/A比值＝15.6。
(试验2)聚合物的浊点的测定
制备实施例聚合物1-1的3％的水溶液，在20℃～40℃的区间测定该水溶液在660nm的吸光度。
其结果，在20℃～30℃，水溶液是透明的且吸光度几乎是0，但是从31℃附近开始可在水溶液中观察到白色浑浊，在32℃吸光度急剧上升。由此，确认了上述聚合物具有约为32℃的浊点。
此外，使实施例聚合物升温至37℃时，聚合物水溶液有良好的响应性，悬浮，然后，水溶液整体固化。将该固化物保持在室温(25℃)，结果在几十小时期间一直保持固化的状态。然后，固化物缓慢溶解，转化成均匀的水溶液。将固化后的聚合物冷却至4℃时，其迅速溶解。而且，即使反复进行上述升温及降温的操作，响应性也没有产生变化，因此确认了聚合物发生了可逆的相转移。
(试验3)聚合物的凝集体的粒径测定
将实施例聚合物1-1制成20℃的液体，用静态光散射装置(希森美康(シスメックス)公司制，型号：Zatasizer Nano)通过光散射测定了聚合物分子的凝集体的粒径，结果是250nm。意味着在小于浊点的温度20℃形成了粒径相对较大的凝集体即形成了易于沉淀且沉淀后难以扩散的凝集体。意味着实施例聚合物1可能能够很容易地包覆在细胞培养器上。
(试验4)细胞培养器(仅具有第一包覆区域的细胞培养器)的制造
作为细胞培养器，使用聚苯乙烯制的35mm细胞培养板(岩城株式会社(イワキ社)制，型号：3000-035-MYP，每一个孔的底面积：9cm2)。
用非离子型表面活性剂(旭电化公司制，Pluronic F-68)涂布培养面，使其成为细胞非粘附性的培养面。
然后，在培养面上的28个位置，用微型移液器将冷却至浊点以下的温度响应性聚合物的水溶液(浓度：15μg/mL)分别以各4μL的量涂布成圆形。
每个位置的圆形的第一包覆区域的直径是约2000μm，另外，第一包覆区域之间的距离约为1000μm。
然后，通过在净化台内放置而使已涂布的温度响应性聚合物的水溶液干燥。
如此地在细胞培养板的培养面设置了用温度响应性聚合物包覆的第一包覆区域。
在图2中示出了从培养面一侧观察的在试验4中制备的本发明的实施例的细胞培养器的图。
(试验5)Zeta电位的测定
按照与(试验4)的步骤相同的步骤在细胞培养板的小片设置第一包覆区域，用Zeta电位仪(大塚电子公司制，型号：ELSZ)和平板试样用样品池单元测定该第一包覆区域的表面Zeta电位。
具体而言，将小片的试样密接于石英样品池的下表面，并向样品池内部注入探测粒子的悬浮液。在此，作为标准探测粒子，使用的是用羟丙基纤维素(Mw＝30000)包覆聚苯乙烯胶乳(粒径：约500nm)而成的粒子(Zeta电位：-5mV～+5mV)。另外，作为溶剂，在pH＝7、37℃的条件下使用了10mM的氯化钠水溶液。然后，用Smoluchowski公式算出了Zeta电位。
非包覆的细胞培养板的小片的表面Zeta电位是-68mV，是本领域技术人员所公知的通常的热可塑性树脂的固体表面Zeta电位的值。
另一方面，用温度响应性聚合物包覆过的细胞培养板的小片的表面Zeta电位是+20mV。
需要说明的是，如本领域技术人员所公知的那样，在以往的技术中，固体表面Zeta电位的测定值具有±10％左右的偏差，另外，在试料的制备工序中涂布操作本身也存在偏差，因此，上述Zeta电位的测定值具有一定程度的误差。
(试验6)接触角的测定
按照JIS R3257的标准，用接触角测量仪(商品名：DMs-400，协和界面科学公司制)测定了水对细胞培养板的第一包覆区域的接触角，结果是70°±10°。
(试验7)细胞培养
在此，使标记了GFP的源自大鼠皮下脂肪的间叶系脂肪干细胞2.5×106个悬浮在完全培养基(达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco's Modified EagleMedium，DMEM)+10％胎牛血清(FBS)溶液；DMEM：Gibco公司制，型号：11995-065；FCS：美国英杰生命技术公司(Invitrogen Corporation)制，批号：928696)中，以细胞密度成为2.5×106个/板的方式种植。
将该种植的源自大鼠皮下脂肪的脂肪干细胞在37℃、5％CO2环境的细胞培养箱中培养3小时。
此时，在所种植的细胞中，位于培养面中的第一包覆区域的细胞粘附于第一包覆区域，另一方面，在所种植的细胞中，位于培养面中的细胞非粘附性的非包覆区域的细胞则没有粘附于培养面。
培养3小时后，使用新的DMEM+10％FCS溶液进行培养基更换。
在图3及图4中示出了用相差显微镜观察时的在本发明的实施例的细胞培养器的第一包覆区域中培养源自大鼠皮下脂肪的脂肪干细胞时的状态的照片。
在图3(a)～(d)、图4(a)～(d)中分别示出了从更换培养基后开始起0小时后(刚更换培养基后)、2小时后、3小时后、4小时后、5小时后、6小时后、8小时后、12小时后的状态。
从更换培养基后开始起0小时后(刚更换培养基后)，脂肪干细胞粘附于第一包覆区域的整个面(参见图3(a))。
从更换培养基后开始起2小时后，已粘附的细胞中的特别是位于第一包覆区域外缘的细胞开始自发性脱落(参见图3(b))。
从更换培养基后开始起3小时后～6小时后，细胞的自发性脱落从第一包覆区域的外缘侧朝第一包覆区域的中心侧逐渐推进(参见图3(c)、图3(d)、图4(a)、图4(b))。
从更换培养基后开始起8小时后，最终根据每个第一包覆区域中的培养，形成了与第一包覆区域的数量相当的、具有块状(颗粒状)结构的细胞结构体(参见图4(c))。
从更换培养基后开始起12小时后，块状的细胞结构体从第一包覆区域自发脱落，开始在细胞培养器的培养面上移动。若干个细胞结构体开始互相粘附(参见图4(d))。
此外，在图7(a)中示出了用实体显微镜观察时的在本发明的实施例的细胞培养器的第一包覆区域培养源自大鼠皮下脂肪的脂肪干细胞的时的、从
更换培养基后开始起0小时后(刚更换培养基后)的状态的照片。
在本实施例中，在37℃、5％CO2环境的细胞培养箱中进一步培养块状的细胞结构体。
在图5及图6中示出了用相差显微镜观察时的在本发明的实施例的细胞培养器的第一包覆区域培养源自大鼠皮下脂肪的脂肪干细胞时的状态。
在图5(a)～(d)、图6(a)～(d)中，分别示出了从块状的细胞结构体从第一包覆区域自发脱落并悬浮后，通过使细胞培养器适当翻转并混合从而人为地将悬浮物集中到细胞培养器的中央部，使细胞结构体彼此间接触开始起0小时后、5小时后、8小时后、12小时后、17小时后、22小时后、25小时后、34小时后的状态。
大量的块状的细胞结构体在培养面上移动，当相互接触时即相互粘附而形成更大的细胞结构体，这样的现象反复发生，最终变成多个块状的细胞结构体(参见图5(a)～(d)、图6(a)～(d))。
需要说明的是，在图7(b)中示出了，用实体显微镜观察时，在本发明的实施例的细胞培养器的第一包覆区域培养源自大鼠皮下脂肪的脂肪干细胞时的、从更换培养基后开始起21小时后的状态的照片。
(试验8)细胞培养器(在第一包覆区域上具有第二包覆区域的细胞培养器)的制造
与前述的(试验4)同样地在细胞培养板的培养面设置了用温度响应性聚合物包覆的第一包覆区域。
然后，在第一包覆区域，使用超微量计量移液管(立洋(NICHIRYO)公司制，数码式(デジフィット))，在设置于培养面上的28个位置的圆形的第一包覆区域，将源自人血浆的纤连蛋白水溶液(BD Falcon公司制，浓度：1mg/mL，批号：3353663)分别以各0.2μL的量涂布成圆形。在此，使第一包覆区域的圆形与第二包覆区域的圆形成为同心圆状。
每一个位置的圆形的第二包覆区域的直径是约250μm。
然后，通过在净化台内放置而使涂布的细胞粘附性物质的水溶液干燥。
如此地，在细胞培养板的培养面，在用温度响应性聚合物包覆的第一包覆区域的内侧设置了第二包覆区域。
(试验9)细胞培养
在此，与前述的(试验4)同样地，使标记了GFP的源自大鼠皮下脂肪的脂肪干细胞2.5×106个悬浮在完全培养基(达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)+10％胎牛血清(FBS)溶液；DMEM：Gibco公司制，型号：11995-065；FCS：美国英杰生命技术公司(Invitrogen)制，批号：928696)中，以细胞密度成为2.5×106个/板的方式进行了种植。
在37℃、5％CO2环境的细胞培养恒温箱中培养该种植的源自大鼠皮下脂肪的脂肪干细胞3小时。
此时，在所种植的细胞中，位于培养面中的第一包覆区域的细胞粘附于第一包覆区域，另一方面，在所种植的细胞中，位于培养面中的细胞非粘附性的非包覆区域的细胞则没有粘附于培养面。
培养3小时后，用新的DMEM+10％FCS溶液进行培养基的更换。
用相差显微镜观察时，在本发明的实施例的细胞培养器的第一和第二包覆区域培养源自大鼠皮下脂肪的脂肪干细胞时的状态的照片与图3及图4大致相同(图中未示出)。
从更换培养基后开始起0小时后(刚更换培养基后)、2小时后、3小时后、4小时后、5小时后、6小时后、8小时后、12小时后的状态分别与图3及图4大致相同(图中未示出)。
从更换培养基后开始起0小时后(刚更换培养基后)，脂肪干细胞粘附于第一包覆区域的整个面(参见图3(a))。
从更换培养基后开始起2小时后，已粘附的细胞中的特别是位于第一包覆区域外缘的细胞开始自发脱落(参见图3(b))。
从更换培养基后开始起3小时后～6小时后，细胞的自发性脱落从第一包覆区域的外缘侧朝第一包覆区域的中心侧逐渐推进(参见图3(c)、图3(d)、图4(a)、图4(b))。
从更换培养基开始起8小时后，最终根据每个第一包覆区域中的培养，形成了与第一包覆区域的数量相当的、有块状(颗粒状)结构的细胞结构体(参见图4(c))。
从更换培养基后开始起12小时后，块状的细胞结构体中的大部分从第一包覆区域自发脱落，但是位于细胞结构体中的第二包覆区域上的部分被锚定在第二包覆区域而残留在第一和第二包覆区域上(参见图9)。
需要说明的是，在图9中，示出了用实体显微镜观察时，在本发明的实施例的细胞培养器的第一和第二包覆区域培养源自大鼠皮下脂肪的脂肪干细胞时的、从更换培养基后开始起0小时后(刚更换培养基后)的状态的照片。
在本实施例中，在37℃、5％CO2环境的细胞培养箱中以规定时间培养了块状的细胞结构体。
即使使细胞培养器适当翻转并混合，形成的细胞结构体也不会从细胞培养皿脱落，在相邻的第一包覆区域间和相邻的第二包覆区域间分别形成的细胞结构体没有粘附。
在图10中，示出了用相差显微镜观察时，以手动方式将图9所示的细胞结构体朝水平方向的四个方向以10cm/秒左右的速度摇晃时的状态的照片。(a)～(d)表示自摇动开始起0秒后、0.5秒后、1.0秒后、1.5秒后的状态。
在图11中，示出了用相差显微镜观察时，以手动方式将图9所示的细胞结构体朝水平方向的四个方向以10cm/秒左右的速度摇晃时的状态的照片。(a)～(d)表示自摇动开始起2.0秒后、2.5秒后、3.0秒后、3.5秒后的状态。
如图10及图11观察的那样，可知在揺动中细胞培养皿上的6个块状的细胞结构体(参见图中培养面的上方)相对细胞培养皿没有位移，而细胞培养皿上的细胞结构体以外的细胞(参见图中培养面的右下方)相对细胞培养皿有位移。
(实施例2～实施例11)
进一步，改变下述表1所记载的条件，与实施例1同样地进行与试验1～试验9所记载的操作相同的操作。
实施例2～实施例11中使用的实验材料的详情如下所述。
细胞培养器
·低粘附性板(35mm)：Prime Surface(注册商标)(住友电木株式会社)
·玻璃培养皿(50mm)：BROSIL(亚速旺(アズワン)公司制)
·通用灭菌(大肠杆菌用)培养皿(90mm)：GD90-15(亚速旺公司)
温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物
·实施例聚合物1-2：通过下述(试验1-2)制备。
(试验1-2)聚合物的制造-2
在容量50mL的软质玻璃制的透明小瓶中加入甲基丙烯酸-2-N,N-二甲氨基乙酯(DMAEMA)10.0g及水5000μL，用磁力搅拌器搅拌。然后，对该混合物(液体)进行10分钟的G1级高纯度(纯度：99.99995％)的氮气清洗(流速：2.0L/分钟)，以此使该混合物脱氧。需要说明的是，使用的DMAEMA中含有0.5重量％的作为阻聚剂的甲基对苯二酚(MEHQ)。
然后，通过用圆形黑色荧光灯(NEC公司制，型号：FCL20BL，18W)对该反应物进行22小时的紫外线照射，使上述反应物发生聚合。反应物在5小时后带有粘性，15小时后固化，得到作为反应生成物的聚合物。使该反应生成物溶解于2-丙醇，并将溶液转移至透析管。然后，进行了72小时的透析，纯化了反应生成物。
通过用纤维素混合酯制的0.2μm过滤器(东洋滤纸公司制，型号：25AS020)过滤该含有反应生成物的溶液并对得到的滤液进行冻结干燥，从而得到分子内离子复合体型的温度响应性聚合物(产量：6.8g、转化率：68％)。用GPC(岛津公司制，型号：LC-10vp系列)以聚乙二醇(昭和电工科学仪器公司(Shodex社)制，TSK系列)为标准物质测定该聚合物的数均分子量(Mn)，确定为Mn＝100000(Mw/Mn＝10.0)。
需要说明的是，聚合物的浊点以及粒径与实施例聚合物1-1的情况相同。
·实施例聚合物1-3：(试验1-2)中，将氮气的清洗时间从10分钟改变为20分钟。相对于聚合而言更多地进行水解，从而增加了阴离子成分。
·实施例聚合物1-4：(试验1-2)中，将氮气的清洗时间从10分钟改变为5分钟。相对于水解而言更多地进行聚合，从而增加了阳离子成分。
·实施例聚合物1-5：(试验1-2)中，作为DMAEMA的替代，使用了配合有DMAEMA的3质量％的亲水性非离子型单体的N,N-二甲基丙烯酰胺(DMAA)而成的物质。
·实施例聚合物1-6：(试验1-2)中，作为DMAEMA的替代，使用了配合有DMAEMA的5％的非离子型单体的N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)而成的物质。
细胞
·源自人癌的细胞株(HepG2)：CET公司制，HEPG2-500
·心肌细胞：源自小猎犬(beagle)的原代细胞
·软骨细胞：源自小猎犬的原代细胞
细胞粘附性物
·层粘附蛋白：日皮(ニッピ)公司制
·胶原蛋白：新田明胶公司制。
工业实用性
根据本发明，能够提供一种能大量且简便地制备微小尺寸(例如几百微米以下的尺寸)的细胞结构体(例如球形)的细胞培养器。

Claims (9)

1.一种细胞培养器，其特征在于，
在细胞培养器的培养面具有多个用温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物包覆的第一包覆区域，
所述第一包覆区域的表面Zeta电位是0～50mV。
2.如权利要求1所述的细胞培养器，其中，水对所述第一包覆区域的接触角是50～90°。
3.如权利要求1或2所述的细胞培养器，其中，
所述细胞培养器的培养面是细胞非粘附性的。
4.如权利要求1至3中任一项所述的细胞培养器，其中，
所述第一包覆区域的俯视形状是从由圆形、椭圆形、外轮廓线的内侧具有曲率中心的形状所组成的组中选出的至少一种。
5.如权利要求1至4中任一项所述的细胞培养器，其中，
所述温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物选自由以下物质组成的组中的至少一种，所述物质是：包含DMAEMA单元和阴离子型单体单元的温度响应性聚合物；包含NIPAM单元和阳离子型单体单元和阴离子型单体单元的温度响应性聚合物；包含DMAEMA和/或其衍生物的聚合物、Tris以及阴离子型物质的温度响应性聚合物组合物，所述阴离子型物质是从由核酸、肝素、透明质酸、硫酸葡聚糖、聚苯乙烯磺酸、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚磷酸、硫酸多糖类、凝胶多糖及聚海藻酸以及它们的碱金属盐所组成的组中选出的一种以上的阴离子型物质，
所述DMAEMA是甲基丙烯酸-2-N,N-二甲氨基乙酯，所述NIPAM是N-异丙基丙烯酰胺，所述Tris是2-氨基-2-羟甲基-1,3-丙二醇。
6.如权利要求5所述的细胞培养器，其中，
所述阴离子型单体是选自由丙烯酸、甲基丙烯酸以及乙烯衍生物所组成的组中的至少一种，所述乙烯衍生物在侧链中具有选自由羧基、磺酸基、磷酸基所组成组中的至少一种基团。
7.如权利要求5或6所述的细胞培养器，其中，
所述阳离子型单体是从由3-(N,N-二甲氨基丙基)-(甲基)丙烯酰胺、3-(N,N-二甲氨基丙基)-(甲基)丙烯酸酯、氨基苯乙烯、2-(N,N-二甲氨基乙基)-(甲基)丙烯酰胺、2-(N,N-二甲氨基乙基)-(甲基)丙烯酸酯所组成的组中选出的至少一种。
8.如权利要求1至7中任一项所述的细胞培养器，其中，
在所述第一包覆区域具有由细胞粘附性物质进一步地包覆的第二包覆区域，该第二包覆区域位于所述第一包覆区域的内侧。
9.如权利要求8所述的细胞培养器，其中，
所述细胞粘附性物质是从由层粘附蛋白、胶原蛋白、纤连蛋白所组成的组中选出的至少一种。
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