KR20180021003A - 세포배양기 - Google Patents
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Abstract
본 발명은, 미소 사이즈의 세포 구조체를 대량으로 간편하게 제작하는 것이 가능한 세포배양기를 제공하는 것을 목적으로 한다. 세포배양기의 배양면에, 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물로 피복된 제1피복영역을 복수 갖고, 제1피복영역의 표면 제타 전위가, 0 ~ 50 mV인 것을 특징으로 하는, 세포배양기.
Description
본 발명은, 특히, 미소 사이즈의 세포 구조체를 대량으로 간편하게 제작하는 것이 가능한 세포배양기에 관한 것이다.
생물학 분야에서의 중요한 실험 기술로서 1900년경에 개발된 세포 배양 기술이 있다. 개발 당초는, 배지 성분의 최적화 등 세포를 순화(馴化)하는 것에 주력하는데 머물러 있고, 단층 배양이나 부유 배양의 기술을 중심으로 검토되어 왔다.
최근, 단층 배양계의 세포와 생체 내 조직의 세포의 사이에, 여러 가지의 성질, 자극 응답성, 세포 기능 등이 다른 것이 밝혀져, 단층 구조를 형성시키는 단층 배양보다, 생체 내의 조직 구조에 가까운 3D 구조를 형성시키는 3D 배양, 특히, 스페로이드(spheroid) 배양의 수요가 확대되고 있다.
고전적으로는, 단백질계의 졸 중에 세포를 부유시켜, 이 세포 부유액을 어떠한 트리거(열, 광, 화학가교제 등)로 겔화시킴으로써 형성시킨 3D 겔 중에 세포를 포매(包埋)시키는 기술, 다공질의 스캐폴드 중에 세포를 생착하는 기술, NIPAM을 고정화한 배양 접시를 이용하여 세포시트의 적층체를 조제하는 기술 등이 활발히 개발되어 왔다.
최근에는, Sumitomo Bakelite Co., Ltd.의 PrimeSurface 등의, 비접착성의 환저면에 세포를 침강시키는 수법；JSR사의 Nano Culture Plate, Hitachi, Ltd. 의 Nano Pillar Plate 등의, 레이저 가공처리에 의해 평활면을 규칙적인 요철면으로 함으로써 배양면에 접착한 세포의 유주성(遊走性)을 높이고, 이것에 의하여, 배양면에서 세포의 자기 조직화를 유도하는 수법；Kuraray Co.Ltd.의 Elplasia, IWAKI&CO.,LTD.의 EZSPHERE 등의, 직경 100 ~ 500㎛, 깊이 500㎛ 정도의 무수한 구멍이 배설된 배양 접시를 이용하고, 각 구멍의 저면에 각 구멍에 파종한 세포를 침강시키는 수법 등이 개발되고 있다.
Nature, Vol 424, P870－872, 21 August, 2003.
그렇지만, 3D구조를 갖는 스페로이드 등의 세포 구조체를 다수 조제하는 경우, 상기 종래의 세포배양기는, 다수의 미소 사이즈(예를 들면, 100㎛×200㎛)의 웰에 세포를 파종하지 않으면 안되고, 배양 조작이 간편하지 않았다.
여기서, 본 발명은, 미소 사이즈(예를 들면, 수백 ㎛ 이하의 사이즈)의 세포 구조체(예를 들면, 스페로이드)를 대량으로 간편하게 제작하는 것이 가능한 세포배양기를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 요지는 이하와 같다.
본 발명의 세포배양기는, 세포배양기의 배양면에, 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물로 피복된 제1피복영역을 복수 갖고, 상기 제1피복영역의 표면 제타 전위가, 0 ~ 50 mV인, 것을 특징으로 한다.
여기서, 본 발명의 세포배양기는, 상기 제1피복영역에 대한 물의 접촉각이, 50 ~ 90°인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 세포배양기에서는, 상기 세포배양기의 배양면은, 세포 비접착성인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 세포배양기에서는, 상기 제1피복영역의 평면시 형상이, 원형, 타원형, 외윤곽선의 내측에 곡률 중심을 갖는 형상으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 세포배양기에서는, 상기 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물이, 2－N, N－디메틸아미노에틸 메타크릴레이트(DMAEMA) 단위와 음이온성 모노머 단위를 포함하는 온도 응답성 폴리머；N－이소프로필 아크릴아미드(NIPAM) 단위와 양이온성 모노머 단위와 음이온성 모노머 단위를 포함하는 온도 응답성 폴리머；2－N, N－디메틸아미노에틸 메타크릴레이트(DMAEMA) 및/또는 그 유도체의 중합체와, 2－아미노-2－히드록시메틸-1, 3－프로판디올(트리스)와, 핵산, 헤파린, 히알론산, 덱스트란황산, 폴리스티렌 설폰산, 폴리아크릴산, 폴리메타크릴산, 폴리인산, 황산화 다당류, 커드란 및 폴리알긴산 및 이들의 알칼리금속염으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 음이온성 물질을 포함하는 온도 응답성 폴리머 조성물；로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 세포배양기에서는, 상기 음이온성 모노머는, 아크릴산, 메타크릴산, 측쇄에 카르복시기, 설폰산기, 인산기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 기를 갖는 비닐 유도체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 세포배양기에서는, 상기 양이온성 모노머는, 3－(N, N－디메틸아미노프로필)－(메타)아크릴아미드, 3－(N, N－디메틸아미노프로필)－(메타)아크릴레이트, 아미노스티렌, 2－(N, N－디메틸아미노에틸)－(메타)아크릴아미드, 2－(N, N－디메틸아미노에틸)－(메타)아크릴레이트로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 세포배양기는, 상기 제1피복영역에, 세포접착성 물질로 더욱 피복된 제2피복영역을 갖고, 상기 제2피복영역은 상기 제1피복영역의 내측에 있는 것으로 해도 좋다.
또한, 본 발명의 세포배양기는, 상기 세포접착성 물질은, 라미닌, 콜라겐, 피브로넥틴으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종인 것이 바람직하다.
본 발명에 의하면, 미소 사이즈(예를 들면, 수백 ㎛ 이하의 사이즈)의 세포 구조체(예를 들면, 스페로이드)를 대량으로 간편하게 제작하는 것이 가능한 세포배양기를 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시 형태의 세포배양기의 일례의 개략을, 본 발명의 실시 형태의 세포배양기의 제조 방법의 일례의 개략, 및 본 발명의 실시 형태의 세포배양기를 이용한 세포 배양 방법의 일례의 개략과 함께 나타내는 도면이다.
도 2는 시험 4에서 제작한 본 발명의 실시예의 세포배양기를 배양면측으로부터 본 도면이다.
도 3은 본 발명의 실시예의 세포배양기의 제1피복영역에서 래트 피하지방 유래의 지방 간세포를 배양했을 때의 모습을, 위상차현미경을 이용해 관찰했을 때의 사진을 나타내는 도면이다. (a) ~ (d)는, 배지 교환으로부터, 0시간 후(배지 교환 직후) 2시간 후, 3시간 후, 4시간 후의 모습을 나타내는 도면이다.
도 4는 본 발명의 실시예의 세포배양기의 제1피복영역에서 래트 피하지방 유래의 지방 간세포를 배양했을 때의 모습을, 위상차현미경을 이용해 관찰했을 때의 사진을 나타내는 도면이다. (a) ~ (d)는, 배지 교환으로부터 5시간 후, 6시간 후, 8시간 후, 12시간 후의 모습을 나타내는 도면이다.
도 5는 본 발명의 실시예의 세포배양기의 제1피복영역에서 래트 피하지방 유래의 지방 간세포를 배양했을 때의 모습을, 형광현미경을 이용해 관찰했을 때의 사진을 나타내는 도면이다. (a) ~ (d)는, 괴상(塊狀)의 세포 구조체가 자발적으로 제1피복영역으로부터 박리되고, 부유된 후, 세포배양기를 적당하게 전도·혼화 시킴으로써 부유물을 인위적으로 세포배양기의 중앙부에 모으고, 세포 구조체끼리를 접촉 시키고 나서, 0시간 후, 5시간 후, 8시간 후, 12시간 후의 모습을 나타내는 도면이다.
도 6은 본 발명의 실시예의 세포배양기의 제1피복영역에서 래트 피하지방 유래의 지방 간세포를 배양했을 때의 모습을, 형광현미경을 이용해 관찰했을 때의 사진을 나타내는 도면이다. (a) ~ (d)는, 괴상의 세포 구조체가 자발적으로 제1피복영역으로부터 박리되고, 부유된 후, 세포배양기를 적당하게 전도·혼화 시킴으로써 부유물을 인위적으로 세포배양기의 중앙부에 모으고, 세포 구조체끼리를 접촉 시키고 나서, 17시간 후, 22시간 후, 25시간 후, 34시간 후의 모습을 나타내는 도면이다.
도 7은 (a)는, 본 발명의 실시예의 세포배양기의 제1피복영역에서 래트 피하지방 유래의 지방 간세포를 배양했을 때의, 배지 교환으로부터 0시간 후(배지 교환 직후)의 모습을, 실체현미경을 이용해 관찰했을 때의 사진을 나타내는 도면이고, (b)는, 본 발명의 실시예의 세포배양기의 제1피복영역에서 래트 피하지방 유래의 지방 간세포를 배양했을 때의, 배지 교환으로부터 21시간 후의 모습을, 실체현미경을 이용해 관찰했을 때의 사진을 나타내는 도면이다.
도 8은 본 발명의 실시 형태의 세포배양기의 다른 예의 개략을, 본 발명의 실시 형태의 세포배양기의 제조 방법의 다른 예의 개략, 및 본 발명의 실시 형태의 세포배양기를 이용한 세포 배양 방법의 다른 예의 개략과 함께 나타내는 도면이다.
도 9는 본 발명의 실시예의 세포배양기의 제1 및 제2 피복영역에서 래트 피하지방 유래의 지방 간세포를 배양했을 때의, 배지 교환으로부터 0시간 후(배지 교환 직후)의 모습을, 실체현미경을 이용해 관찰했을 때의 사진이다.
도 10은 도 9에 나타내는 세포 구조체를, 수동으로 수평방향 사방으로 10 cm/초 정도의 속도로 흔들었을 때의 모습을, 위상차현미경을 이용해 관찰했을 때의 사진을 나타낸다. (a) ~ (d)는, 요동 개시부터, 0초 후, 0.5초 후, 1.0초 후, 1.5초 후의 모습을 나타내는 도면이다.
도 11은 도 9에 나타내는 세포 구조체를, 수동으로 수평방향 사방으로 10 cm/초 정도의 속도로 흔들었을 때의 모습을, 위상차현미경을 이용해 관찰했을 때의 사진을 나타낸다. (a) ~ (d)는, 요동 개시부터, 2.0초 후, 2.5초 후, 3.0초 후, 3.5초 후의 모습을 나타내는 도면이다.
도 12는 본 발명의 실시 형태의 세포배양기의 다른 예를 이용한 본 발명의 실시 형태의 세포 구조체 배양조의 개요를 나타내는 도면이다. (a)는, 세포 구조체 배양조의 사시도를 나타내는 도면이고, (b)는, 세포 구조체 배양조의 단면도를 나타내는 도면이다.
도 2는 시험 4에서 제작한 본 발명의 실시예의 세포배양기를 배양면측으로부터 본 도면이다.
도 3은 본 발명의 실시예의 세포배양기의 제1피복영역에서 래트 피하지방 유래의 지방 간세포를 배양했을 때의 모습을, 위상차현미경을 이용해 관찰했을 때의 사진을 나타내는 도면이다. (a) ~ (d)는, 배지 교환으로부터, 0시간 후(배지 교환 직후) 2시간 후, 3시간 후, 4시간 후의 모습을 나타내는 도면이다.
도 4는 본 발명의 실시예의 세포배양기의 제1피복영역에서 래트 피하지방 유래의 지방 간세포를 배양했을 때의 모습을, 위상차현미경을 이용해 관찰했을 때의 사진을 나타내는 도면이다. (a) ~ (d)는, 배지 교환으로부터 5시간 후, 6시간 후, 8시간 후, 12시간 후의 모습을 나타내는 도면이다.
도 5는 본 발명의 실시예의 세포배양기의 제1피복영역에서 래트 피하지방 유래의 지방 간세포를 배양했을 때의 모습을, 형광현미경을 이용해 관찰했을 때의 사진을 나타내는 도면이다. (a) ~ (d)는, 괴상(塊狀)의 세포 구조체가 자발적으로 제1피복영역으로부터 박리되고, 부유된 후, 세포배양기를 적당하게 전도·혼화 시킴으로써 부유물을 인위적으로 세포배양기의 중앙부에 모으고, 세포 구조체끼리를 접촉 시키고 나서, 0시간 후, 5시간 후, 8시간 후, 12시간 후의 모습을 나타내는 도면이다.
도 6은 본 발명의 실시예의 세포배양기의 제1피복영역에서 래트 피하지방 유래의 지방 간세포를 배양했을 때의 모습을, 형광현미경을 이용해 관찰했을 때의 사진을 나타내는 도면이다. (a) ~ (d)는, 괴상의 세포 구조체가 자발적으로 제1피복영역으로부터 박리되고, 부유된 후, 세포배양기를 적당하게 전도·혼화 시킴으로써 부유물을 인위적으로 세포배양기의 중앙부에 모으고, 세포 구조체끼리를 접촉 시키고 나서, 17시간 후, 22시간 후, 25시간 후, 34시간 후의 모습을 나타내는 도면이다.
도 7은 (a)는, 본 발명의 실시예의 세포배양기의 제1피복영역에서 래트 피하지방 유래의 지방 간세포를 배양했을 때의, 배지 교환으로부터 0시간 후(배지 교환 직후)의 모습을, 실체현미경을 이용해 관찰했을 때의 사진을 나타내는 도면이고, (b)는, 본 발명의 실시예의 세포배양기의 제1피복영역에서 래트 피하지방 유래의 지방 간세포를 배양했을 때의, 배지 교환으로부터 21시간 후의 모습을, 실체현미경을 이용해 관찰했을 때의 사진을 나타내는 도면이다.
도 8은 본 발명의 실시 형태의 세포배양기의 다른 예의 개략을, 본 발명의 실시 형태의 세포배양기의 제조 방법의 다른 예의 개략, 및 본 발명의 실시 형태의 세포배양기를 이용한 세포 배양 방법의 다른 예의 개략과 함께 나타내는 도면이다.
도 9는 본 발명의 실시예의 세포배양기의 제1 및 제2 피복영역에서 래트 피하지방 유래의 지방 간세포를 배양했을 때의, 배지 교환으로부터 0시간 후(배지 교환 직후)의 모습을, 실체현미경을 이용해 관찰했을 때의 사진이다.
도 10은 도 9에 나타내는 세포 구조체를, 수동으로 수평방향 사방으로 10 cm/초 정도의 속도로 흔들었을 때의 모습을, 위상차현미경을 이용해 관찰했을 때의 사진을 나타낸다. (a) ~ (d)는, 요동 개시부터, 0초 후, 0.5초 후, 1.0초 후, 1.5초 후의 모습을 나타내는 도면이다.
도 11은 도 9에 나타내는 세포 구조체를, 수동으로 수평방향 사방으로 10 cm/초 정도의 속도로 흔들었을 때의 모습을, 위상차현미경을 이용해 관찰했을 때의 사진을 나타낸다. (a) ~ (d)는, 요동 개시부터, 2.0초 후, 2.5초 후, 3.0초 후, 3.5초 후의 모습을 나타내는 도면이다.
도 12는 본 발명의 실시 형태의 세포배양기의 다른 예를 이용한 본 발명의 실시 형태의 세포 구조체 배양조의 개요를 나타내는 도면이다. (a)는, 세포 구조체 배양조의 사시도를 나타내는 도면이고, (b)는, 세포 구조체 배양조의 단면도를 나타내는 도면이다.
이하, 도면을 참조하여, 본 발명의 세포배양기의 실시 형태에 대해 상세하게 예시 설명한다.
도 1에, 본 발명의 실시 형태의 세포배양기의 개략을, 본 발명의 실시 형태의 세포배양기의 제조 방법의 일례의 개략, 및 본 발명의 실시 형태의 세포배양기를 이용한 세포 배양 방법의 일례의 개략과 함께 나타낸다.
본 발명의 실시 형태의 세포배양기 (이하, 「본 실시 형태의 세포배양기」라고도 말한다.)는, 세포배양기의 배양면에, 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물로 피복된 제1피복영역을 복수 갖는 것이다.
세포배양기로서는, 시판의 플레이트, 디쉬, 플라스크, 유리 판, 실리콘 시트 등을 들 수 있다.
여기서, 본 실시 형태의 세포배양기에서는, 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물로 피복된 제1피복영역의 표면 제타 전위가, 0 ~ 50 mV이다. 표면 제타 전위를 0 mV 이상으로 하면, 부(負)로 대전된 세포를 접착시킬 수 있고, 또한, 50 mV 이하로 하면, 세포 독성을 경감할 수 있다.
상기와 마찬가지의 이유로부터, 표면 제타 전위는, 호적하게는 0 ~ 35 mV이고, 더욱 호적하게는 10 ~ 25 mV이다.
이 세포배양기에 의하면, 일반적인 37℃의 인큐베이터 중에 세포를 배양하고, 조직을 형성시킨 후, 트립신처리 등의 세포 박리 조작을 실시하지 않고, 예를 들면, 세포시트상의 구조를 갖는 세포를 회수할 수 있다.
또한, 상기 특정의 범위의 표면 제타 전위를 갖는, 본 발명의 실시 형태의 세포배양기에 의하면, 세포를 적절한 배양 조건에서 배양하는 것만으로, 괴상(펠릿상)의 구조를 갖는 세포 구조체(스페로이드)를 간편하게 형성시킬 수 있다.
이것은, 상기 특정의 범위의 표면 제타 전위로 함으로써, 세포배양기의 배양면에 세포 독성을 야기하지 않는 미약한 양전하를 제공할 수 있고, 또한, 파종한 세포의 신속한 접착을 확보하고, 세포의 활성의 향상 및 세포외 매트릭스의 분비를 촉진하고, 또한, 세포 유주를 적당히 억제하고, 세포간의 결합을 강하게 할 수 있는 것으로 추측된다.
상기의 세포 구조체를 형성하는 현상의 재현성은 매우 높고, 세포배양기에 의하면, 균질인 세포 구조체를 다수 제작하는 것이 가능해진다.
종래의 세포배양기를 이용해 제작된 세포의 괴(塊)는, 세포 비접착성의 배양면에 접착할 수 없는 세포가 모여 있는 것에 지나지 않기 때문에, 세포의 괴를 구성하는 세포의 바이어빌리티(viability)가 낮다는 문제가 있었다.
한편, 본 발명의 실시 형태의 세포배양기로 제작된 세포 구조체(스페로이드)는, 배양면 상에 신속하게 접착하고, 증식하면서 신장한다는 경과를 거쳐 형성되는 것이기 때문에, 세포 사이에 산생된 세포외 매트릭스가 풍부하게 존재한다. 그 때문에, 세포 구조체 자체의 바이어빌리티(활성)가 매우 높다.
그리고, 이 세포배양기에 의하면, 세포 구조체의 사이즈는, 실험자가 목적에 따라 적절히 정할 수 있고 사이즈에 분포를 갖게 하는 것도, 사이즈를 균일하게 하는 것도 가능해진다.
세포 구조체의 사이즈는, 미소 사이즈(예를 들면, 수백 ㎛ 이하의 사이즈)로 할 수 있고 50 ~ 1,500㎛ 경(徑)으로 해도 좋고, 50 ~ 200㎛ 경(徑)인 것이 바람직하다.
또한, 이 세포배양기에서는, 평판 배양면에서 세포 구조체를 제작하는 것이 가능하기 때문에, 세포배양기를 이용해 제작한 세포 구조체에 대해서 어세이를 실시하는 경우에, 이 배양기를 직접적으로 현미경에 의해 관찰하는 것도 가능해진다.
또한, 이 세포배양기에 의하면, 세포가 세포배양기의 배양면과 벽의 경계인 배양면의 외연에 접착시키지 않는 것도 가능해지고, 사이즈의 균질성을 장시간 유지할 수 있다.
또한, 본 발명의 실시 형태의 세포배양기에서는, 본 발명의 효과를 높이는 관점으로부터, 제1피복영역에 대한 물의 접촉각이, 50 ~ 90°인 것이 바람직하고, 60 ~ 80°인 것이 더욱 바람직하고, 62 ~ 78°인 것이 특히 바람직하다.
또한, 제1피복영역에 대한 물의 접촉각이란, 제1피복영역 내의 임의의 몇 점에서, JIS R3257에 준거하여, 측정되는 접촉각의 평균치를 가리킨다.
상기와 같이, 제1피복영역은, 세포 표면과의 사이의 상호작용을 높이고, 세포의 제1피복영역에 대한 접착성을 높이는 관점으로부터, 소정 정도 이상의 소수성을 갖는 영역인 것이 바람직하다.
그리고, 세포배양기에서는, 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물을 피복하기 전의 세포배양기의 배양면이, 세포 비접착성인 것이 바람직하다.
또한, 「세포 비접착성」이란, 부착세포(예를 들면, 섬유아세포, 간세포, 혈관 내피세포 등)가, 통상의 배양 조건하에서, 접착하지 않는 또는 접착하기 어려운 성질을 말한다.
이러한 구성에 의하면, 배양면 중 제1피복영역 이외의 비피복영역에, 파종된 세포가 접착하는 것을 억제할 수 있다. 접착하지 않았던 세포는, 배지 교환 등의 간편한 조작에 의하여, 세포배양기로부터 제거할 수 있고 이러한 세포에 의한 아포토시스(apoptosis)나 열 충격 단백질(heat shock protein)의 산생 등의, 접착한 세포의 생육에 대한 나쁜 영향을 억제하는 것이 가능해진다. 또한, 세포배양기의 배양면을 세포 비접착성으로 하면, 각 제1피복영역에 파종된 세포가, 접촉하지 않고, 따로 따로 세포 구조체를 제작하는 것이 가능하게 된다.
세포배양기의 재질로서는, 폴리스티렌, 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET), 폴리프로필렌, 폴리부텐, 폴리에틸렌, 폴리카보네이트 등을 들 수 있고, 정밀한 성형 가공이 용이하고, 여러 가지의 멸균법을 적용하는 것이 가능하고, 투명성이 있기 때문에 현미경 관찰에 적합하다는 관점으로부터, 폴리스티렌, 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET)가 바람직하다.
상세하게는, 상기 폴리스티렌 등의 재질의 세포배양기는, 미처리의 경우, 표면의 제타 전위가 마이너스의 비교적 큰 값으로 되고, 부(負)전하를 띠는 세포 표면과 배양면이 정전기적으로 반발한다. 그 때문에, 이 경우, 세포의 접착에는 불리하게 된다. 또한, 폴리스티렌 표면에 접착하고 제타 전위를 플러스 측으로 변화시킬 수 있는 단백질을 포함하는 배지를 이용했다고 해도, 표면의 제타 전위는 마이너스 그대로이거나 제로 부근에 머무르는 것이 많다.
여기서, 상기 폴리스티렌 등의 재질의 세포배양기에, 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물을 피복하면, 폴리머 또는 폴리머 조성물의 두께(즉, 피복 전의 배양면으로부터의 거리)의 제곱의 분만큼 폴리스티렌 등의 재질의 표면의 제타 전위가 감쇠되어 피복 후의 배양면의 표면의 제타 전위가 보다 플러스 측으로 흔들리게 된다. 그 때문에, 피복 처리의 경우, 세포의 접착에 유리하게 된다.
또한, 일반적인 세포 배양용 플레이트는, 폴리스티렌 등의 플라스틱으로 되어 있지만, 표면 처리(예를 들면, 플라즈마처리)가 실시되어 있고 배양면에 세포가 접착하기 쉽게 되어 있다.
세포배양기에서는, 각 제1피복영역의 면적이, 0.1 ~ 30 ㎟인 것이 바람직하다. 상기 범위로 하면, 목적의 미소 사이즈의 스페로이드가 얻어지기 쉽다.
세포배양기에서는, 제1피복영역간의 거리가, 0.1 ~ 10 mm인 것이 바람직하다.
또한, 「제1피복영역간의 거리」란, 제1피복영역간의 배양면 상의 최단 거리를 말한다.
0.1 mm 이상으로 하면, 인접하는 제1피복영역 간에서, 각각의 영역에 파종된 세포끼리 접착해 버리는 것을 억제할 수 있다. 10 mm 이하로 하면, 대량의 세포 구조체(스페로이드 등)를 효율적으로 제작할 수 있다.
본 발명의 실시 형태의 세포배양기에서는, 상기 세포배양기의 배양면의 제1피복영역이, 단위면적당 갖는 온도 응답성 폴리머의 양이, 5.0 ~ 50 ng/㎟인 것이 바람직하고, 15 ~ 40 ng/㎟인 것이 더욱 바람직하다. 상기 범위로 하면, 세포 구조체를 형성시키기 쉽게 하는 효과가 얻어지기 쉽다.
본 실시 형태의 세포배양기가 갖는 제1피복영역의 수는, 실험자의 목적에 따라 적절히 정해져도 좋고, 2 이상으로 해도 좋고, 10 이상으로 해도 좋고, 1,000 이상으로 해도 좋다.
세포배양기에서는, 제1피복영역의 평면시 형상이, 원형, 타원형, 외윤곽선의 내측에 곡률 중심을 갖는 형상인 것이 바람직하다. 곡률 반경으로서는, 0.1 ~ 50 mm인 것이 바람직하고, 1 ~ 10 mm인 것이 더욱 바람직하다.
원형의 제1피복영역의 직경으로서는, 10㎛ ~ 10 mm인 것이 바람직하고, 30㎛ ~ 1500㎛인 것이 더욱 바람직하다.
이러한 형상은, 1종 단독으로 이용해도 좋고, 2종 이상을 조합하여 이용해도 좋다.
세포배양기에서는, 온도 응답성 폴리머는, 수용액 상태로부터의 침전, 용액의 도포 및 용매의 건조, 방사선 조사, 저온 플라즈마 조사, 코로나 방전, 글로우방전, 자외선, 라디칼 발생제를 사용한 그래프트중합 등의 수법에 의해 세포배양기의 배양면에 피복되어 있어도 좋다.
세포배양기의 배양면을 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물로 피복하는 방법, 및 제1피복영역이 되는 복수의 배양면 상의 위치에 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물을 배치하는 방법에 대해서는 후술한다.
본 실시 형태의 세포배양기는, 전술의 제1피복영역만을 갖고, 후술의 제2피복영역을 가지지 않는 것으로 해도 좋고, 이 경우, 세포배양기는, 세포 배양용 플레이트(예를 들면, 35 mm 디쉬 등)를 베이스로서 제작해도 좋고, 예를 들면, 재생 의료의 분야에서 호적하게 이용할 수 있다.
한편, 본 실시 형태의 세포배양기는, 전술의 제1피복영역의 내측에 후술의 제2피복영역을 갖는 것으로 해도 좋고, 이 경우, 세포배양기는, 마이크로플레이트(예를 들면, 96 구멍 플레이트 등)를 베이스로서 제작해도 좋고, 예를 들면, 창약(創藥)의 분야(특히, 약제 스크리닝)에서 호적하게 이용할 수 있다.
또한, 본 실시 형태의 세포배양기는, 세포접착성 물질로 더욱 피복된 제2피복영역을 갖고, 상기 제2피복영역은 제1피복영역의 내측에 있는 것으로 해도 좋다.
세포접착성 물질로서는, 라미닌, 콜라겐, 피브로넥틴, 펩티드, 양이온성 폴리머, 폴리스티렌 등을 들 수 있다.
펩티드로서는, 분자 내에 알기닌-글리신-아스파라긴산의 배열을 적어도 1쌍 포함하는 것, 알기닌을 8분자 이상 연속한 배열을 포함하는 것, 리신이 10분자 이상 연속한 배열을 포함하는 것 등을 들 수 있다. 양이온성 폴리머로서는, N, N－디메틸아미노프로필 아크릴아미드, N, N－디메틸아미노에틸 메타크릴아미드, 아미노스티렌 등을 들 수 있다.
이들 중에서도, 세포접착성이 높은, 라미닌, 콜라겐, 피브로넥틴이 바람직하다.
또한, 상기 열거의 세포접착성 물질을 포함하는 시약도 호적하게 이용할 수 있고, 이러한 시약으로서는, 당업자에게 주지의, 사람, 소, 개, 돼지, 어류의 혈청, 무혈청 배지 등을 들 수 있다.
제2피복영역을 갖는 세포배양기에 의하면, 형성된 세포 구조체의 일부가 제2피복영역에 접착한 채로 되어, 세포 구조체를 세포배양기의 각 제1피복영역의 위치에 고정하는 것이 가능해진다.
또한, 본 발명의 제1피복영역도 제2피복영역도, 무색 투명으로, 두께는 매우 얇고, 평활하기 때문에, 상기 양 영역을 투과하는 광은, 굴절, 반사, 흡수되는 것이 거의 없고, 세포배양기를 그대로 측정(광학 측정 등)에 적용하는 것이 가능해 진다.
파종되는 세포는, 세포배양기의 배양면의 면적에 대한 개수가 너무 적으면(세포 파종 밀도가 너무 작으면), 아포토시스(apoptosis) 해 버린다는 성질이 있고, 살아있는 세포를 얻기 위해서 만족시켜야 할 최소한의 세포 파종 밀도가 존재한다.
종래 공지의 복수의 웰을 구비하는 세포배양기를 이용해 세포 배양을 실시하는 경우, 웰의 사이즈에 따라 파종해야 할 세포의 수가 정해져 버린다.
그리고, 파종해야 할 세포수에 따라, 1개 1개의 세포에 대한 필요 영양량이나 세포 전체를 물리적으로 침지하는 것이 가능한 부피 등을 고려하여, 세포 구조체를 배양하기 위해서 필요한 배양 스케일이 정해지고, 배양에 필요한 배지의 양, 또한, 시험에 이용하는 약제의 양도 정해지게 된다.
요즈음 iPS 세포 실험 등의 효과실험을 소(小)스케일로 실시하고 싶다는 욕구가 해당 기술 분야에서 높아지고 있고 현재로서는 국제 규격품 중에서 최소 사이즈인 384 웰의 세포배양기를 이용한 경우에도, 실험 코스트가 충분히 저감되지 않는 것도 있다.
여기서, 본 실시 형태의 제2피복영역을 갖는 세포배양기에 의하면, 다수의 세포 구조체(스페로이드)를, 각각을 격벽 등에 의해 독립적인 공간으로 격리하지 않고, 같은 공간에 공존시키는 것이 가능해진다. 이 때문에, 세포 구조체를 분화시키는데 이용되는 분화유도인자나, 스크리닝 되는 약제 등을 배지에 포함하고 이 배지를 다수의 세포 구조체가 공존하는 계에 한 번에 가하는(필요에 따라서, 적절히 교반한다) 것만으로, 모든 세포 구조체를 같은 조건하에 둘 수 있다. 또한, 세포 구조체가 분비하는 생리활성물질도, 계 중에 균일하게 확산시킬 수 있다.
세포배양기에서는, 각 제2피복영역의 면적이, 0.001 ~ 10 ㎟인 것이 바람직하다. 상기 범위로 하면, 전술한 바와 같이 제1피복영역에 의한, 목적의 미소 사이즈의 스페로이드를 형성하는 효과와, 전술의 제2피복영역에 의한, 세포 구조체를 세포배양기에 고정하는 효과를, 균형적으로 얻을 수 있다.
세포배양기에서는, 제2피복영역이, 단위면적당 갖는 세포접착성 물질의 양이, 1.0 ~ 1,000 ng/㎟인 것이 바람직하고, 10 ~ 100 ng/㎟인 것이 더욱 바람직하다. 상기 범위로 하면, 세포 구조체의 형성과 세포 구조체의 고정을, 효율적으로 실시할 수 있다.
제1피복영역의 내측에 마련하는 제2피복영역의 수는, 실험자의 목적에 따라 적절히 정해도 좋고, 각 제1피복영역에, 1개로 해도 좋고, 2 이상의 복수로 해도 좋다.
세포배양기에서는, 제2피복영역의 평면시 형상이, 원형, 타원형, 외윤곽선의 내측에 곡률 중심을 갖는 형상인 것이 바람직하다. 곡률 반경으로서는, 0.1 ~ 50 mm인 것이 바람직하고, 1 ~ 10 mm인 것이 더욱 바람직하다.
원형의 제2피복영역의 직경으로서는, 0.01 mm ~ 10 mm인 것이 바람직하고,
10 ~ 1,000㎛인 것이 더욱 바람직하다.
이러한 형상은, 1종 단독으로 이용해도 좋고, 2종 이상을 조합해 이용해도 좋다.
이하, 본 발명의 실시 형태의 세포배양기의 제1피복영역에 이용되는 온도 응답성 폴리머 및 온도 응답성 폴리머 조성물에 대해 상술한다.
본 발명의 실시 형태의 세포배양기에 이용되는 온도 응답성 폴리머 및 온도 응답성 폴리머 조성물로서는, (A) 2－N, N－디메틸아미노에틸 메타크릴레이트(DMAEMA) 단위와 음이온성 모노머 단위를 포함하는 온도 응답성 폴리머, (B) N－이소프로필 아크릴아미드(NIPAM) 단위와 양이온성 모노머 단위와 음이온성 모노머 단위를 포함하는 온도 응답성 폴리머, (C) 2－N, N－디메틸아미노에틸 메타크릴레이트(DMAEMA) 및/또는 그 유도체의 중합체와, 2－아미노-2－히드록시메틸-1, 3－프로판디올(트리스)와, 핵산, 헤파린, 히알론산, 덱스트란황산, 폴리스티렌 설폰산, 폴리아크릴산, 폴리메타크릴산, 폴리인산, 황산화 다당류, 커드란 및 폴리알긴산 및 이들의 알칼리금속염으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 음이온성 물질을 포함하는 온도 응답성 폴리머 조성물 등을 들 수 있다.
여기서, 상기 (A)로서는, 예를 들면, (A－1) DMAEMA를 물 존재 하에서 중합하는 방법에 의해 얻어지는 온도 응답성 폴리머, (A－2) 주로 DMAEMA를 포함하는 폴리머 블록(중합쇄 α말단)과 주로 DMAEMA와 음이온성 모노머(중합쇄 ω말단)를 포함하는 온도 응답성 폴리머 등을 들 수 있다.
본 발명의 실시 형태에서, 이들은, 1종 단독으로 이용해도 좋고, 2종 이상을 조합해 이용해도 좋다.
이하, 상기 (A－1)의 온도 응답성 폴리머 및 그 제조 방법에 대해 기재한다.
(온도 응답성 폴리머의 제조 방법)
(A－1)의 온도 응답성 폴리머의 제조 방법에서는, 우선, 2－N, N－디메틸아미노에틸 메타크릴레이트(DMAEMA)를 포함하는 혼합물을 조제한다(조제 공정). 여기서, 혼합물은, 중합 금지제 및 물을 더 포함한다.
2－N, N－디메틸아미노에틸 메타크릴레이트(DMAEMA)로서는, 시판품을 이용할 수 있다. 중합 금지제로서는, 메틸 히드로퀴논(MEHQ), 히드로퀴논, p－벤조퀴놀린, N, N－디에틸히드록실아민, N－니트로소－N－페닐히드록실아민 (Cupferron), t－부틸하이드로퀴논, 등을 들 수 있다. 또한, 시판의 DMAEMA에 포함되는 MEHQ 등을 그대로 이용해도 좋다. 물로서는, 초순수를 들 수 있다.
중합 금지제의 혼합물에 대한 중량 비율은, 0.01% ~ 1.5%인 것이 바람직하고, 0.1% ~ 0.5%인 것이 더욱 바람직하다. 상기 범위로 하면, 라디칼 중합반응의 폭주를 억제하고, 제어할 수 없는 가교를 저감할 수 있고 제조되는 온도 응답성 폴리머의 용매에 대한 용해도를 확보할 수 있다.
물의 혼합물에 대한 중량 비율은, 1.0% ~ 50%인 것이 바람직하고, 9.0% ~ 33%인 것이 더욱 바람직하다. 상기 범위로 하면, 측쇄의 가수분해반응의 반응속도와 중합하는 폴리머쇄의 성장반응의 반응속도를, 균형적으로 조화시킬 수 있다. 이것에 의하여, 측쇄가 가수분해된 DMAEMA에 대한, 측쇄가 가수분해되어 있지 않은 DMAEMA의 비율(공중합 비율)이 1.0 ~ 20 정도의 온도 응답성 폴리머를 얻을 수 있다.
그 다음에, (A－1)의 온도 응답성 폴리머의 제조 방법에서는, 혼합물에 자외선을 조사한다(조사 공정). 여기서, 자외선은, 불활성 분위기 하에서, 조사된다. DMAEMA는, 자외선의 조사에 의하여, 라디칼 중합하고, 폴리머로 된다.
이 공정에서는, 예를 들면, 투명 밀봉 바이알에, 상기 혼합물을 가하고 불활성 가스를 버블링 함으로써 바이알 내를 불활성 분위기로 한 후에, 바이알의 외부로부터 자외선 조사장치를 이용해 자외선을 조사한다.
자외선의 파장으로서는, 210 nm ~ 600 nm인 것이 바람직하고, 360 nm ~ 380 nm인 것이 더욱 바람직하다. 상기 범위로 하면, 효율적으로 중합반응을 진행시킬 수 있고 소기의 공중합 비율을 갖는 고분자 재료를 안정적으로 얻을 수 있다. 또한, 제조한 폴리머 재료가 착색하는 것을 막을 수도 있다.
불활성 가스로서는, 질소, 아르곤, 헬륨, 네온 등을 들 수 있다.
반응 조건에 관해서, 온도 조건으로서는, 15℃ ~ 50℃인 것이 바람직하고, 20℃ ~ 30℃인 것이 더욱 바람직하다. 상기 범위로 하면, 열에 의한 개시반응을 억제하고, 광조사에 의한 개시반응을 우선적으로 진행시킬 수 있다. 또한, 가수분해반응의 반응속도를 폴리머쇄의 성장반응의 반응속도에 대해서 균형적인 것으로 할 수 있다.
반응 시간으로서는, 7시간 ~ 24시간인 것이 바람직하고, 17시간 ~ 21시간인 것이 더욱 바람직하다. 상기 범위로 하면, (A－1)의 온도 응답성 폴리머를 고수율로 얻을 수 있고, 또한, 광분해 반응이나 불필요한 가교반응을 억제하면서 라디칼 중합을 실시할 수 있다.
또한, 조제 공정에서 혼합물이 조제되고 끝낸 후, 조사 공정에서 자외선의 조사가 개시될 때까지의 시간은, 10분 ~ 1시간인 것이 바람직하다.
혼합물을 가한 바이알의 내부의 기체를 치환하고, 바이알 내를 불활성 분위기로 할 때, 10분 정도의 시간을 필요로 한다. 그 때문에, 상기 시간을 10분 미만으로 하면, 라디칼 중합에 필요한 불활성 분위기가 얻어지지 않을 우려가 있다. 또한, 혼합물 중에서는, DMAEMA의 가수분해반응이, 자외선의 조사가 개시되기 전에 개시된다. 그 때문에, 상기 시간을 1시간 초과로 하면, 라디칼 중합반응에 불활성인 메타크릴산이 혼합물 중에 다수 생겨 버린다.
(A－1)의 온도 응답성 폴리머의 제조 방법에서는, 혼합물에 물이 포함되기 때문에, DMAEMA의 라디칼 중합반응과 폴리 2－N, N－디메틸아미노에틸 메타크릴레이트(PDMAEMA)의 측쇄의 에스테르 결합의 가수분해반응을, 길항(拮抗)시킬 수 있다.
이 길항에 의하여, 얻어지는 생성물은, 식(I)으로 나타내는 반복 단위(A)
[화 1]
, 및 식(II)으로 나타내는 반복 단위(B)
[화 2]
를 포함하는 폴리머가 된다.
그 때문에, 폴리머가 갖는 양이온성 관능기, 즉, 디메틸아미노기와 폴리머가 갖는 음이온성 관능기, 즉, 측쇄의 에스테르 결합이 가수분해되어 생긴 카르복시기의 양방을, 균형적으로 구비할 수 있다. 그리고, (A－1)의 온도 응답성 폴리머의 제조 방법에 의하면, 양이온성 관능기 및 음이온성 관능기를 갖는, 폴리(2－N, N－디메틸아미노에틸 메타크릴레이트) 유래의 폴리머를, 적은 공정으로 간편하게 제조할 수 있다.
또한, (A－1)의 온도 응답성 폴리머의 제조 방법과 동일한 제조 방법은 아니어도, DMAEMA, 중합 금지제, 및 물이, 자외선 조사 시에 반응계 중에 공존하고 있으면, 본 발명의 온도 응답성 폴리머의 제조 방법의 상기 효과와 마찬가지의 효과를 얻을 수 있다.
예를 들면, DMAEMA 및 중합 금지제를 포함하는 혼합물과 물을 따로 따로 준비하고, 그 다음에, 혼합물과 물에 불활성 가스를 버블링 하고, 그 후, 혼합물과 물을 불활성 분위기 하에서 혼합하는 것과 동시에 자외선을 조사한다는, 온도 응답성 폴리머의 제조 방법도, (A－1)의 온도 응답성 폴리머에 포함할 수 있다.
(온도 응답성 폴리머)
(A－1)의 온도 응답성 폴리머는, 상기 (A－1)의 제조 방법에 의해 제조된다.
여기서, (A－1)의 온도 응답성 폴리머로서는, 수평균분자량(Mn)이, 10 kDa ~ 500 kDa인 분자가 바람직하다. 또한, 중량평균분자량(Mw)과 수평균분자량(Mn)의 비(Mw/Mn)는, 1.1 ~ 10.0인 분자가 바람직하다.
(A－1)의 온도 응답성 폴리머의 분자량은, 자외선의 조사 시간 및 조사 강도의 조건에 의하여, 적절히 조정할 수 있다.
(A－1)의 온도 응답성 폴리머에 의하면, 담점(曇点)을, 예를 들면 실온(25℃) 이하로 저하시킬 수 있다.
상기 (A－1)의 온도 응답성 폴리머에서는, 담점 이상의 온도로 형성된 온도 응답성 폴리머의 부용화물이, 실온(약 25℃) 조건하에서 재용해 할 때까지의 시간이 현저하게 지연된다. 이것은, 얻어진 (A－1)의 온도 응답성 폴리머는, 분자 내에 양이온성 관능기와 음이온성 관능기가 존재하기 때문에, 높은 자기 응집성을 갖기 때문인 것으로 추정된다.
또한, 이 (A－1)의 온도 응답성 폴리머를 이용하여, 후술한 바와 같이, 배양면에 이 온도 응답성 폴리머를 피복해서 이루어지는 세포배양기를 조제할 수 있다.
또한, (A－1)의 온도 응답성 폴리머에 의하면, 후술한 바와 같이, 세포를 적절한 배양 조건으로 배양함으로써, 관강상(管腔狀)(튜브상) 및 괴상(펠릿상)의 구조를 갖는 세포 구조체를 형성시킬 수 있다.
(A－1)의 온도 응답성 폴리머가 갖는, 양이온성 관능기 (2－N, N－디메틸아미노기)의 관능기 수와 음이온성 관능기 (카르복시기)의 관능기 수의 비(C/A비)는, 0.5 ~ 32인 것이 바람직하고, 4 ~ 16인 것이 더욱 바람직하다.
C/A비를 상기 범위로 하면, 담점을 저감시킨다는 상기 효과가 얻어지기 쉽다. 상기 C/A비를 갖는 온도 응답성 폴리머에서는, 상기 온도 응답성 폴리머중에서 양이온성 관능기와 음이온성 관능기가, 이온결합적으로 분자 간 및/또는 분자 내의 응집에 작용하고, 온도 응답성 폴리머의 응집력이 강해진 결과가 있다고 추측된다.
또한, C/A비를 상기 범위로 하면, 상기 온도 응답성 폴리머 중의 정(正)전하와 부전하의 균형을 특히 호적하게 하고, 정전하에 의한 세포 상해성을 억제할 수 있고, 또한, 상기 온도 응답성 폴리머의 친수성과 소수성의 균형을 특히 호적하게 하고, 세포의 유주나 배향을 일으키기 쉽게 할 수 있는 것으로 추정된다.
이하, 상기 (A－2)의 온도 응답성 폴리머 및 그 제조 방법에 대해 기재한다.
(온도 응답성 폴리머의 제조 방법)
(A－2)의 온도 응답성 폴리머의 제조 방법에서는, 우선, 2－N, N－디메틸아미노에틸 메타크릴레이트(DMAEMA)를 포함하는 제1 혼합물에 자외선을 조사한다(제1 중합 공정).
여기서, 제1 혼합물은, DMAEMA 이외에, 임의 선택적으로, 예를 들면, 다른 모노머, 용매 등을 포함해도 좋다.
또한, 자외선은, 불활성 분위기 하에서, 조사되어도 좋다.
DMAEMA로서는, 시판품으로 해도 좋다.
제1 혼합물에 포함될 수 있는 다른 모노머로서는, 예를 들면, N, N－디메틸아크릴아미드, 폴리에틸렌글리콜 측쇄를 갖는 아크릴산이나 메타크릴산의 에스테르, N－이소프로필 아크릴아미드, 3－N, N－디메틸아미노프로필 아크릴아미드, 2－N, N－디메틸아미노에틸 메타크릴아미드 등을 들 수 있고, 특히, 이온 균형의 조정을 안정적으로 실시하는 것을 가능하게 하는 관점으로부터, N, N－디메틸아크릴아미드, 폴리에틸렌글리콜 측쇄를 갖는 아크릴산이나 메타크릴산의 에스테르, N－이소프로필 아크릴아미드가 바람직하다. 이들은, 1종 단독으로 이용해도 좋고, 2종 이상을 조합해 이용해도 좋다. 여기서, 다른 모노머의 사용량의 DMAEMA의 사용량에 대한 비율(몰 수)은, 0.001 ~ 1으로 하는 것이 바람직하고, 0.01 ~ 0.5로 하는 것이 더욱 바람직하다.
용매로서는, 예를 들면, 톨루엔, 벤젠, 클로로포름, 메탄올, 에탄올 등을 들 수 있고, 특히, DMAEMA의 에스테르 결합에 대해서 불활성이기 때문에, 톨루엔, 벤젠이 바람직하다. 이들은, 1종 단독으로 이용해도 좋고, 2종 이상을 조합해 이용해도 좋다.
이 공정에서는, 예를 들면, 투명 밀봉 바이알에, 상기 제1 혼합물을 가하고 불활성 가스를 버블링 함으로써 바이알 내를 불활성 분위기로 한 후에, 바이알의 외부로부터 자외선 조사장치를 이용해 자외선을 조사한다.
자외선의 파장으로서는, 210 ~ 600 nm인 것이 바람직하고, 360 ~ 380 nm인 것이 더욱 바람직하다. 상기 범위로 하면, 효율적으로 중합반응을 진행시킬 수 있고 소기의 공중합 비율을 갖는 고분자 재료를 안정적으로 얻을 수 있다. 또한, 제조한 폴리머 재료가 착색하는 것을 막을 수도 있다.
자외선의 조사 강도로서는, 0.01 ~ 50 mW/㎠인 것이 바람직하고, 0.1 ~ 5 mW/㎠인 것이 더욱 바람직하다. 상기 범위로 하면, 불필요한 화학 결합의 절단 등에 의한 분해를 억제하면서, 안정적으로, 적절한 속도(시간)로 중합반응을 진행시킬 수 있다.
불활성 가스로서는, 질소, 아르곤, 헬륨, 네온 등을 들 수 있다.
온도 조건으로서는, 10 ~ 40℃인 것이 바람직하고, 20 ~ 30℃인 것이 더욱 바람직하다. 상기 범위로 하면, 통상의 실험실의 실온에서 반응을 실시할 수 있고, 또한, 광과는 다른 수단(가열 등)에 의해 반응을 억제하는 것이 가능해진다.
반응 시간으로서는, 10분 ~ 48시간인 것이 바람직하고, 60분 ~ 24시간인 것이 더욱 바람직하다.
이 공정에서, DMAEMA는, 자외선의 조사에 의하여, 라디칼 중합하고, 폴리머(폴리(2－N, N－디메틸아미노에틸 메타크릴레이트)(PDMAEMA))로 되어, 2－N, N－디메틸아미노에틸 메타크릴레이트를 포함하는 호모폴리머 블록이 형성된다. 다른 모노머도 이용한 경우에는, DMAEMA와 다른 모노머를 포함하는 폴리머 블록이 형성된다.
그 다음에, (A－2)의 온도 응답성 폴리머의 제조 방법에서는, 제1 중합 공정에서의 중합물(구체적으로는, 폴리머화한 2－N, N－디메틸아미노에틸 메타크릴레이트)의 수평균분자량이 소정치 이상으로 된 시점에서, 제1 혼합물에 음이온성 모노머를 첨가하고 제2 혼합물을 조제한다(첨가 공정).
여기서, 제2 혼합물은, 제1 중합 공정 후의 제1 혼합물, 및 음이온성 모노머 이외로, 예를 들면, 다른 모노머, 전술의 제1 혼합물에 포함될 수 있는 용매(톨루엔, 벤젠, 메탄올 등) 등을 포함해도 좋다.
또한, 음이온성 모노머는, 불활성 분위기 하에서, 첨가되어도 좋다.
음이온성 모노머로서는, 예를 들면, 아크릴산, 메타크릴산, 측쇄에 카르복시기, 설폰산기, 인산기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 기를 갖는 비닐 유도체 등을 들 수 있고, 특히, 화학적 안정성의 관점으로부터, 아크릴산, 메타크릴산이 바람직하다.
이들은, 1종 단독으로 이용해도 좋고, 2종 이상을 조합해 이용해도 좋다.
제2 혼합물에 포함될 수 있는 다른 모노머로서는, 예를 들면, N, N－디메틸아크릴아미드, 폴리에틸렌글리콜 측쇄를 갖는 아크릴산이나 메타크릴산의 에스테르, N－이소프로필 아크릴아미드, 3－N, N－디메틸아미노프로필 아크릴아미드, 2－N, N－디메틸아미노에틸 메타크릴아미드 등을 들 수 있고, 특히, 전기적으로 중성이고, 친수성인, N, N－디메틸아크릴아미드가 바람직하다. 이들은, 1종 단독으로 이용해도 좋고, 2종 이상을 조합해 이용해도 좋다. 여기서, 다른 모노머의 사용량의 DMAEMA의 사용량에 대한 비율(몰)은, 0.01 ~ 10으로 하는 것이 바람직하고, 0.1 ~ 5로 하는 것이 더욱 바람직하다.
이 공정에서는, 예를 들면, 바이알에 불활성 가스를 플로우 시킴으로써 바이알 내를 불활성 분위기로 유지하면서, 상기 제2 혼합물을 첨가한다.
수평균분자량의 소정치는, 담점 저감의 효과를 충분히 얻는 관점으로부터, 호적하게는 5,000이며, 더욱 호적하게는 20,000이며, 특히 호적하게는 100,000이다.
또한, 제1 중합 공정 후의 제1 혼합물 중에서의 폴리머화한 PDMAEMA의 수평균분자량은, 소정의 시점에서 중합계로부터 소량의 반응 혼합물을 채취하고, 겔침투 크로마토그래피(GPC)나 광산란법(SLS) 등의 당업자에게 주지의 방법에 의하여, 측정할 수 있다.
이 공정에서, 중합 중의 DMAEMA를 포함하는 호모폴리머에다가, 음이온성 모노머도 중합계에 포함되게 되고, 바이알 내의 중합계가, DMAEMA의 단독중합계로부터, DMAEMA와 음이온성 모노머의 공중합계로 변하게 된다.
그리고, (A－2)의 온도 응답성 폴리머의 제조 방법에서는, 제2 혼합물에 자외선을 조사한다(제2 중합 공정).
여기서, 자외선은, 불활성 분위기 하에서, 조사되어도 좋다.
이 공정에서는, 예를 들면, 제2 혼합물을 첨가한 후의 바이알의 외부로부터 자외선 조사장치를 이용해 자외선을 조사한다.
제2 중합 공정에서의, 자외선의 파장, 자외선의 조사 강도, 이용하는 불활성 가스, 반응 온도, 반응 시간 등의 모든 조건은, 제1 중합 공정에서의 조건과 마찬가지로 해도 좋다.
이 공정에서, DMAEMA와 음이온성 모노머가, 자외선의 조사에 의하여, 라디칼 중합하고, 제1 중합 공정에서 형성한 DMAEMA를 포함하는 호모폴리머 블록의 중합쇄 α말단에 연속하는 형태로, DMAEMA와 음이온성 모노머를 포함하는 코폴리머 블록이 형성된다. 다른 모노머도 이용한 경우에는, DMAEMA와 음이온성 모노머와 다른 모노머를 포함하는 코폴리머 블록이 형성된다.
상기와 같이, DMAEMA를 포함하는 호모폴리머 블록과 DMAEMA와 음이온성 모노머의 코폴리머 블록을 포함하는 온도 응답성 폴리머가 얻어진다.
또한, (A－2)의 제조 방법에서는, 당업자에게 이해되는 바와 같이, 여러 가지의 분자량 및 분자구조를 갖는 폴리머의 혼합물이 생성하는데, DMAEMA를 포함하는 호모폴리머 블록과, DMAEMA와 음이온성 모노머의 코폴리머 블록을 포함하는 온도 응답성 폴리머를 주성분으로서 얻는 관점으로부터, 제1 중합 공정, 첨가 공정, 및 제2 중합 공정에 걸쳐, 동일한 조건하에서 중합을 실시하는 것이 바람직하다.
(온도 응답성 폴리머)
(A－2)의 온도 응답성 폴리머는, 상기 (A－2)의 제조 방법에 의해 제조된다.
(A－2)의 온도 응답성 폴리머는, 주로 2－N, N－디메틸아미노에틸 메타크릴레이트를 포함하고, 임의 선택적으로 디메틸아크릴아미드, 폴리에틸렌글리콜 측쇄를 갖는 아크릴산이나 메타크릴산 등의 친수성 모노머 등의 다른 모노머 단위를 포함하는 폴리머 블록(중합쇄 α말단)과, 주로 2－N, N－디메틸아미노에틸 메타크릴레이트와 음이온성 모노머(중합쇄 ω말단)를 포함하고, 임의 선택적으로 다른 모노머 단위를 포함하는 코폴리머 블록을 포함한다.
호적하게는, (A－2)의 온도 응답성 폴리머는, DMAEMA의 호모폴리머 블록과, DMAEMA와 음이온성 모노머의 코폴리머 블록을 포함하고, 더욱 호적하게는, 이들 블록으로 이루어진다.
여기서, (A－2)의 온도 응답성 폴리머로서는, 중합쇄 α말단의 폴리머 블록(예를 들면, DMAEMA의 호모폴리머 블록)의 수평균분자량이 5000 Da 이상인 것이 바람직하고, 20000 Da 이상인 것이 더욱 바람직하다.
(A－2)의 온도 응답성 폴리머로서는, 수평균분자량(Mn)이, 10 ~ 500 kDa인 분자가 바람직하다. 또한, 중량평균분자량(Mw)과 수평균분자량(Mn)의 비(Mw/Mn)는, 1.1 ~ 10.0인 분자가 바람직하다.
온도 응답성 폴리머의 분자량은, 자외선의 조사 시간 및 조사 강도의 조건에 의하여, 적절히 조정할 수 있다.
(A－2)의 온도 응답성 폴리머에 의하면, 담점을, 예를 들면 실온(25℃) 이하로 저하시킬 수 있다.
상기 (A－2)의 온도 응답성 폴리머에서는, 담점 이상의 온도로 형성된 온도 응답성 폴리머의 부용화물이, 실온(약 25℃) 조건하에서 재용해할 때까지의 시간이 현저하게 지연된다. 이것은, 얻어진 온도 응답성 폴리머는, 분자 내에 양이온성 관능기와 음이온성 관능기가 존재하기 때문에, 높은 자기 응집성을 갖기 때문인 것으로 추정된다.
특히, (A－2)의 온도 응답성 폴리머는, 중합쇄 α말단에, 고분자량(예를 들면, 5000 Da 이상)을 갖는 DMAEMA의 호모폴리머 블록을 구비하기 때문에, DMAEMA의 측쇄의 온도 의존적인 글로블(globule)로의 전이가 생기기 쉽고, 담점을 효과적으로 저감하는 것이 가능해진다고 고려된다.
또한, 이 온도 응답성 폴리머를 이용하여, 후술한 바와 같이, 배양면에 이 온도 응답성 폴리머를 피복해서 이루어지는 세포배양기를 조제할 수 있다.
또한, (A－2)의 온도 응답성 폴리머에 의하면, 후술한 바와 같이, 세포를 적절한 배양 조건에서 배양함으로써, 괴상(펠릿상)의 구조를 갖는 세포 구조체를 형성시킬 수 있다.
(A－2)의 온도 응답성 폴리머가 갖는, 양이온성 관능기 (2－N, N－디메틸아미노기)의 관능기 수와 음이온성 관능기 (카르복시기)의 관능기 수의 비(C/A비)는, 0.5 ~ 32인 것이 바람직하고, 4 ~ 16인 것이 더욱 바람직하다.
C/A비를 상기 범위로 하면, 담점을 저감시킨다는 상기 효과가 얻어지기 쉽다. 상기 C/A비를 갖는 온도 응답성 폴리머에서는, 상기 온도 응답성 폴리머중에서 양이온성 관능기와 음이온성 관능기가, 이온결합적으로 분자 간 및/또는 분자 내의 응집에 작용하고, 온도 응답성 폴리머의 응집력이 강해진 결과가 있다고 추측된다.
또한, C/A비를 상기 범위로 하면, 상기 온도 응답성 폴리머 중의 정전하와 부전하의 균형을 특히 호적하게 하고, 정전하에 의한 세포 상해성을 억제할 수 있고, 또한, 상기 온도 응답성 폴리머의 친수성과 소수성의 균형을 특히 호적하게 하고, 세포의 유주나 배향을 일으키기 쉽게 할 수 있는 것으로 추정된다.
이하, 상기 (B)의 온도 응답성 폴리머 및 그 제조 방법에 대해 기재한다.
(온도 응답성 폴리머의 제조 방법)
(B)의 온도 응답성 폴리머의 제조 방법은, N－이소프로필 아크릴아미드(NIPAM)(이하, 「모노머(A)」라고도 말한다.)와 양이온성 모노머(이하, 「모노머(B)」라고도 말한다.)와 음이온성 모노머(이하, 「모노머(C)」라고도 말한다.)를 중합시키는 것이다. 임의 선택적으로, 상기 3 종류의 모노머에 이들 이외의 다른 모노머를 가하고 중합시켜도 좋다.
N－이소프로필 아크릴아미드(NIPAM)로서는, 시판품으로 해도 좋다.
양이온성 모노머로서는, 양이온성 관능기를 갖는 모노머를 들 수 있고 양이온성 관능기로서는, 제1급 ~ 제4급 아미노기 등의 아미노기, 구아니딘기 등을 들 수 있고, 특히, 화학적 안정성, 저세포 상해성, 멸균 안정성, 강양전하성의 관점으로부터, 제3급 아미노기가 바람직하다.
보다 구체적으로는, 양이온성 모노머로서는, 생리활성물질을 담지하거나 알칼리성 조건하에 두거나 해도, 안정성이 높은 것이 바람직하고, 예를 들면, 3－(N, N－디메틸아미노프로필)－(메타)아크릴아미드, 3－(N, N－디메틸아미노프로필)－(메타)아크릴레이트, 아미노스티렌, 2－(N, N－디메틸아미노에틸)－(메타)아크릴아미드, 2－(N, N－디메틸아미노에틸)－(메타)아크릴레이트 등을 들 수 있다.
이들 중에서, 특히, 3－(N, N－디메틸아미노프로필) 아크릴아미드는, 높은 양전하 강도를 갖는 것에 의해, 음이온성 물질의 담지를 용이하게 하기 때문에, 바람직하다.
또한, 아미노스티렌은, 높은 양전하 강도를 갖는 것에 의해 음이온성 물질의 담지를 용이하게 하는 것과 함께, 분자 내의 방향환이 수용액 중에서 다른 물질의 소수성 구조와 상호작용하는 것에 의해 담지 가능한 음이온성 물질의 베리에이션을 넓히기 때문에 바람직하다.
또한, 2－(N, N－디메틸아미노에틸)－메타크릴아미드는, 중성 역의 pH에서 미약한 양전하를 가지고 물에의 용해도가 온도에 영향을 받지 않는 것에 의해, 한 번 담지한 음이온성 물질의 방출을 용이하게 하기 때문에, 바람직하다.
이들은, 1종 단독으로 이용해도 좋고, 2종 이상을 조합해 이용해도 좋다.
음이온성 모노머로서는, 음이온성 관능기를 갖는 모노머를 들 수 있고 음이온성 관능기로서는, 카르복실산기, 설폰산기, 황산기, 인산기, 보론산기 등을 들 수 있고, 특히, 화학적 안정성, 세포 친화성, 높은 정제도의 관점으로부터, 카르복실산기, 설폰산기, 인산기가 바람직하다.
보다 구체적으로는, 아크릴산, 메타크릴산, 비닐 안식향산, 등을 들 수 있고, 특히, 화학적 안정성, 세포 친화성의 관점으로부터, 메타크릴산, 비닐 안식향산이 바람직하다.
이들은, 1종 단독으로 이용해도 좋고, 2종 이상을 조합해 이용해도 좋다.
다른 모노머로서는, 예를 들면, 디메틸아크릴아미드, 폴리에틸렌글리콜 측쇄를 갖는 아크릴산이나 메타크릴산 등의 중성의 친수성 모노머 등을 들 수 있다.
이들은, 1종 단독으로 이용해도 좋고, 2종 이상을 조합해 이용해도 좋다.
다른 모노머는, 전하 이외의 친수성·소수성의 균형의 조정에 사용 가능하고, 베리에이션을 넓히는 것이 가능해진다.
여기서, (B)의 온도 응답성 폴리머의 제조 방법에서의 NIPAM의 사용량, 양이온성 모노머의 사용량, 다른 모노머의 사용량 각각의, 모노머(A) ~ (C)의 합계의 사용량에 대한 비율(몰)은, 모노머의 중합반응에서의 반응성을 고려하여, 소망한 모노머 성분의 비율을 얻을 수 있도록, 당업자가 적절히 조정할 수 있다.
여기서, 중합 방법으로서는, 라디칼 중합, 이온중합 등을 들 수 있다.
라디칼 중합으로서는, 리빙라디컬중합이 바람직하고, 리빙라디컬중합으로서는, 가역적 부가 개열(開裂) 연쇄이동(RAFT) 중합, 원자이동 라디칼 중합(ATRP), 이니퍼터(iniferter) 중합 등을 들 수 있고 이니퍼터 중합이 바람직하다.
이온중합으로서는, 리빙 음이온중합이 바람직하다.
(B)의 온도 응답성 폴리머의 제조 방법의 일례는, 라디칼 중합을 이용하는 방법이다.
이 제조 방법의 일례에서는, 우선, N－이소프로필 아크릴아미드(NIPAM)를 포함하는 제1 혼합물에 자외선을 조사한다(제1 중합 공정).
여기서, 제1 혼합물은, DMAEMA 이외에, 임의 선택적으로, 예를 들면, 다른 모노머, 용매, 연쇄이동제, 안정제, 계면활성제 등을 포함해도 좋다.
또한, 자외선은, 불활성 분위기 하에서, 조사되어도 좋다.
이 공정에서는, 예를 들면, 투명한 밀봉 바이알에, 상기 제1 혼합물을 가해 불활성 가스를 버블링 함으로써 바이알 내를 불활성 분위기로 한 후에, 바이알의 외부로부터 자외선 조사장치를 이용해 자외선을 조사한다.
용매로서는, 예를 들면, 벤젠, 톨루엔, 클로로포름, 메탄올, 물, 등을 들 수 있고, 특히, 용해력의 점, 및 중합에 불활성인 점에서, 벤젠, 톨루엔이 바람직하다. 이들은, 1종 단독으로 이용해도 좋고, 2종 이상을 조합해 이용해도 좋다.
이 공정에서는, 예를 들면, 투명한 밀봉 바이알에, 상기 제1 혼합물을 가해 불활성 가스를 버블링 함으로써 바이알 내를 불활성 분위기로 한 후에, 바이알의 외부로부터 자외선 조사장치를 이용해 자외선을 조사한다.
자외선의 파장으로서는, 210 ~ 600 nm인 것이 바람직하고, 360 ~ 380 nm인 것이 더욱 바람직하다. 상기 범위로 하면, 효율적으로 중합반응을 진행시킬 수 있고 소기의 공중합 비율을 갖는 고분자 재료를 안정적으로 얻을 수 있다. 또한, 제조한 폴리머 재료가 착색하는 것을 막을 수도 있다.
자외선의 조사 강도로서는, 0.01 ~ 50 mW/㎠인 것이 바람직하고, 0.1 ~ 5 mW/㎠인 것이 더욱 바람직하다.
불활성 가스로서는, 질소, 아르곤, 헬륨, 네온 등을 들 수 있다.
온도 조건으로서는, 10 ~ 40℃인 것이 바람직하고, 20 ~ 30℃인 것이 더욱 바람직하다. 상기 범위로 하면, 통상의 실험실의 실온에서 중합반응을 실시하는 것을 가능하게 할 수 있고, 또한, 광조사의 수단과는 다른 가열의 수단으로의 반응 제어를 가능하게 할 수도 있다.
반응 시간으로서는, 반응 시간으로서는, 10분 ~ 48시간인 것이 바람직하고, 60분 ~ 24시간인 것이 더욱 바람직하다.
이 공정에서, NIPAM은, 자외선의 조사에 의하여, 라디칼 중합하고, 폴리머(폴리(N－이소프로필 아크릴아미드)(PNIPAM))로 되어, N－이소프로필 아크릴아미드를 포함하는 호모폴리머 블록이 형성된다. 다른 모노머도 이용한 경우에는, NIPAM과 다른 모노머를 포함하는 폴리머 블록이 형성된다.
그 다음에, (B)의 온도 응답성 폴리머의 제조 방법에서는, 제1 중합 공정 후의 제1 혼합물에 양이온성 모노머와 음이온성 모노머를 첨가하고 제2 혼합물을 조제한다(첨가 공정).
여기서, 제2 혼합물은, 제1 중합 공정 후의 제1 혼합물, 양이온성 모노머, 및 음이온성 모노머 이외에, 예를 들면, 다른 모노머, 용매, 연쇄이동제, 안정제, 계면활성제 등을 포함해도 좋다.
또한, 양이온성 모노머와 음이온성 모노머는, 불활성 분위기 하에서, 첨가되어도 좋다.
이 공정에서는, 예를 들면, 바이알에 불활성 가스를 플로우 시킴으로써 바이알 내를 불활성 분위기로 유지하면서, 상기 양이온성 모노머와 음이온성 모노머를 첨가한다.
이 공정에서, 중합 중의 NIPAM을 포함하는 호모폴리머에다가, 양이온성 모노머 및 음이온성 모노머도 중합계에 포함되게 되어, 바이알 내의 중합계가, NIPAM의 단독중합계로부터, NIPAM과 양이온성 모노머와 음이온성 모노머의 공중합계로, 변하게 된다.
그리고, (B)의 온도 응답성 폴리머의 제조 방법에서는, 제2 혼합물에 자외선을 조사한다(제2 중합 공정).
여기서, 자외선은, 불활성 분위기 하에서, 조사되어도 좋다.
이 공정에서는, 예를 들면, 양이온성 모노머와 음이온성 모노머를 첨가한 후의 바이알의 외부로부터 자외선 조사장치를 이용해 자외선을 조사한다.
자외선의 파장으로서는, 210 ~ 600 nm인 것이 바람직하고, 360 ~ 380 nm인 것이 더욱 바람직하다. 상기 범위로 하면, 효율적으로 중합반응을 진행시킬 수 있고 소기의 공중합 비율을 갖는 고분자 재료를 안정적으로 얻을 수 있다. 또한, 제조한 폴리머 재료가 착색하는 것을 막을 수도 있다.
자외선의 조사 강도로서는, 0.01 ~ 50 mW/㎠인 것이 바람직하고, 0.1 ~ 5 mW/㎠인 것이 더욱 바람직하다.
불활성 가스로서는, 질소, 아르곤, 헬륨, 네온 등을 들 수 있다.
온도 조건으로서는, 10 ~ 40℃인 것이 바람직하고, 20 ~ 30℃인 것이 더욱 바람직하다. 상기 범위로 하면, 통상의 실험실의 실온에서 중합반응을 실시하는 것을 가능하게 할 수 있고, 또한, 광조사의 수단과는 다른 가열의 수단으로의 반응 제어를 가능하게 할 수도 있다.
반응 시간으로서는, 반응 시간으로서는, 10분 ~ 48시간인 것이 바람직하고, 60분 ~ 24시간인 것이 더욱 바람직하다.
이 공정에서, NIPAM과 양이온성 모노머와 음이온성 모노머가, 자외선의 조사에 의하여, 라디칼 중합하고, 제1 중합 공정에서 형성한 NIPAM을 포함하는 호모폴리머 블록의 중합쇄 α말단에 연속하는 형태로, NIPAM과 양이온성 모노머와 음이온성 모노머를 포함하는 코폴리머 블록이 형성된다. 다른 모노머도 이용한 경우에는, NIPAM과 다른 모노머를 포함하는 폴리머 블록, 및/또는, NIPAM과 양이온성 모노머와 음이온성 모노머와 다른 모노머를 포함하는 코폴리머 블록이 형성된다.
상기와 같이, NIPAM을 포함하는 호모폴리머 블록과, NIPAM과 양이온성 모노머와 음이온성 모노머의 코폴리머 블록을 포함하는 온도 응답성 폴리머가 얻어진다.
또한, 이 일례의 제조 방법에서는, 효율적인 반응을 실현하는 관점으로부터, 제1 중합 공정, 첨가 공정, 및 제2 중합 공정에 걸쳐 자외선을 조사하는 것이 바람직하다.
(B)의 온도 응답성 폴리머의 제조 방법의 다른 예는, 라디칼 중합을 이용하는 방법이고, N－이소프로필 아크릴아미드(NIPAM)와 양이온성 모노머와 음이온성 모노머와 임의 선택적으로 다른 모노머를 포함하는 혼합물에 자외선을 조사한다.
여기서, 상기 혼합물은, 예를 들면, 용매, 연쇄이동제, 안정제, 계면활성제 등을 포함해도 좋다.
또한, 자외선은, 불활성 분위기 하에서, 조사되어도 좋다.
다른 조건에 대해서는, 전술의 일례의 제조 방법과 마찬가지로 해도 좋다.
또한, 이니퍼터 중합을 이용하는 경우, 이니퍼터로서 벤질-(N, N－디에틸) 디티오카르바메이트를, 용매로서 톨루엔 등을 이용해도 좋고, 근자외선의 조사에 의해 리빙중합을 실시해도 좋다. 여기서, 1번째의 모노머에 의한 중합 후, 단리조작을 거치고, 2번째의 모노머에 의한 중합을 실시함으로써, 블록공중합체를 얻을 수 있다.
또한, 이온중합을 이용하는 경우, 촉매로서 NaOH 분말을, 용매로서 정제에 이용되는 재침전용 용매와 함께 비프로톤계 용매를 이용해도 좋다. 1번째의 모노머에 의한 중합 후, 재침전 조작(이 조작 후에도 ω 말단에 이온종이 남는다)을 거치고, 2번째의 모노머에 의한 중합을 실시함으로써, 블록공중합체를 얻을 수 있다.
(온도 응답성 폴리머)
(B)의 온도 응답성 폴리머는, 상기 (B)의 제조 방법에 의해 제조된다.
(B)의 온도 응답성 폴리머는, N－이소프로필 아크릴아미드(NIPAM) 단위와 양이온성 모노머 단위와 음이온성 모노머 단위를 포함하고, 임의 선택적으로, 다른 모노머 단위를 포함한다. 본 폴리머는, 전술의 일례, 다른 예의 제조 방법에 의해 제조할 수 있다.
호적하게는, (B)의 온도 응답성 폴리머는, 주로 N－이소프로필 아크릴아미드(NIPAM) 단위를 포함하고, 임의 선택적으로 다른 모노머 단위를 포함하는 폴리머 블록(중합쇄 α말단)과 주로 양이온성 모노머 단위와 음이온성 모노머 단위를 포함하고, 임의 선택적으로 다른 모노머 단위를 포함하는 코폴리머 블록을 포함한다. 더욱 호적하게는, (B)의 온도 응답성 폴리머는, NIPAM의 호모폴리머 블록과, NIPAM과 양이온성 모노머와 음이온성 모노머의 코폴리머 블록을 포함하고, 특히 호적하게는, 이들의 블록으로 이루어진다. 본 폴리머는, 전술의 일례의 제조 방법에 의해 제조할 수 있다.
예를 들면, 특허문헌 1에 기재된 온도 응답성 폴리머에서는, 폴리머에 온도 응답성을 제공하는 DMAEMA가, 동시에, (음이온성 모노머와 함께) 세포 구조체의 형성에 필요한 양이온성 모노머이고, 또한, 온도 응답성에 관련되는 DMAEMA는 폴리머 블록으로서 중합쇄 α말단에 포함되어 있다.
이러한 온도 응답성 폴리머에서는, 중합쇄 α말단에 반드시 양이온성 모노머가 존재하기 때문에, 중합쇄 중에서의 양이온성 사이트의 위치의 조정의 자유도가 높지는 않고, 또한, 양이온성 모노머가 주로 DMAEMA에 한정되기 때문에, 양이온성 사이트의 양전하 강도의 조정이나, 온도 응답성 폴리머 수용액의 pH의 조정도 반드시 용이하다고는 할 수 없었다.
예를 들면, 온도 응답성 폴리머를 약물 송달(DDS)에 이용한 경우, 담지 가능한 약제의 종류나 양이 한정될 가능성이 있었다. DDS의 수법으로서는, 예를 들면, 세포배양기에 약제를 담지시킨 온도 응답성 폴리머를 도포하고, 도포 후의 세포배양기로 세포나 조직을 배양함으로써, 피복물로부터 세포·조직에 대해서 약제를 서방(徐放) 한다는 수법 등을 들 수 있다. 여기서, 상기 특허문헌 1의 온도 응답성 폴리머에서는, 양전하 강도가 작은 DMAEMA를 포함하기 때문에, 음이온성 물질의 약제의 담지는 반드시 용이하다고 할 수 없지만, 담지 가능한 약제의 종류나 양이 한정될 가능성이 있었다.
한편, (B)의 온도 응답성 폴리머에서는, 폴리머에 온도 응답성을 제공하는 NIPAM은 중성의 모노머어고, (음이온성 모노머와 함께) 세포 구조체의 형성에 필요한 양이온성 모노머는 NIPAM과는 다른 모노머이다.
(B)의 온도 응답성 폴리머에서는, 중합쇄 α말단에 반드시 양이온성 모노머가 존재할 필요는 없고, 중합쇄 중에서의 양이온성 사이트의 위치를 자유롭게 조정하는 것이 가능하고, 또한, 광범위한 양이온성 모노머를 이용할 수 있기 때문에, 양이온성 사이트의 양전하 강도나 온도 응답성 폴리머 수용액의 pH를 용이하게 조정하는 것이 가능하다.
(B)의 온도 응답성 폴리머에 의하면, 예를 들면, 온도 응답성 폴리머를 약물 송달(DDS)에 이용한 경우, 담지 가능한 약제의 종류를 확대하면서, 그 양을 증가시키는 것이 가능해지고, 나아가서는, 온도 응답성 폴리머의 응용범위를 확대할 수 있다.
(B)의 온도 응답성 폴리머에서는, NIPAM 단위의, NIPAM 단위, 양이온성 모노머 단위, 음이온성 모노머 단위의 합계에 대한 비율(몰)이, 0.6 ~ 0.9인 것이 바람직하고, 0.7 ~ 0.9인 것이 더욱 바람직하고, 0.9인 것이 특히 바람직하다.
다른 모노머도 이용한 경우에는, 다른 모노머 단위의, NIPAM 단위, 양이온성 모노머 단위, 음이온성 모노머 단위의 합계에 대한 비율(몰)이, 0.001 ~ 0.2인 것이 바람직하고, 0.01 ~ 0.1인 것이 더욱 바람직하다.
(B)의 온도 응답성 폴리머로서는, 중합쇄 α말단의 폴리머 블록(예를 들면, NIPAM의 호모폴리머 블록)의 수평균분자량이 5000 Da 이상인 것이 바람직하고, 20000 Da 이상인 것이 더욱 바람직하다.
(B)의 온도 응답성 폴리머로서는, 수평균분자량(Mn)이, 10 ~ 500kDa인 분자가 바람직하다. 또한, 중량평균분자량(Mw)과 수평균분자량(Mn)의 비(Mw/Mn)는, 1.1 ~ 10.0인 분자가 바람직하다.
온도 응답성 폴리머의 분자량은, 중합조건에 의하여, 적절히 조정할 수 있다.
(B)의 온도 응답성 폴리머에 의하면, 담점을, 예를 들면 실온(25℃) 이하로 저하시킬 수 있다.
상기 온도 응답성 폴리머에서는, 담점 이상의 온도로 형성된 온도 응답성 폴리머의 부용화물이, 실온(약 25℃) 조건하에서 재용해할 때까지의 시간이 현저하게 지연된다. 이것은, 얻어진 온도 응답성 폴리머는, 분자 내에 양이온성 관능기와 음이온성 관능기가 존재하기 때문에, 높은 자기 응집성을 갖기 때문인 것으로 추정된다.
특히, 전술의 (B)의 온도 응답성 폴리머는, 중합쇄 α말단에, 고분자량을 갖는 NIPAM의 호모폴리머 블록을 구비하기 때문에, NIPAM의 측쇄의 온도 의존적인 글로블 전이가 생기기 쉽고, 담점을 효과적으로 저감하는 것을 가능해진다고 고려된다.
또한, 이 온도 응답성 폴리머를 이용하여, 후술한 바와 같이, 배양면에 이 온도 응답성 폴리머를 피복해서 이루어지는 세포배양기를 조제할 수 있다.
또한, (B)의 온도 응답성 폴리머에 의하면, 후술한 바와 같이, 세포를 적절한 배양 조건으로 배양함으로써, 관강상(튜브상)이나 괴상(펠릿상)의 구조를 갖는 세포 구조체를 형성시킬 수 있다.
(B)의 온도 응답성 폴리머가 갖는, 양이온성 관능기의 관능기 수와 음이온성 관능기의 관능기 수의 비(C/A비)는, 0.5 ~ 32인 것이 바람직하고, 4 ~ 16인 것이 더욱 바람직하다.
C/A비를 상기 범위로 하면, 담점을 저감시킨다는 상기 효과가 얻어지기 쉽다. 상기 C/A비를 갖는 온도 응답성 폴리머에서는, 상기 온도 응답성 폴리머중에서 양이온성 관능기와 음이온성 관능기가, 이온결합적으로 분자 간 및/또는 분자 내의 응집에 작용하고, 온도 응답성 폴리머의 응집력이 강해진 결과가 있다고 추측된다.
또한, C/A비를 상기 범위로 하면, 상기 온도 응답성 폴리머 중의 정전하와 부전하의 균형을 특히 호적하게 하고, 정전하에 의한 세포 상해성을 억제할 수 있고, 또한, 상기 온도 응답성 폴리머의 친수성과 소수성의 균형을 특히 호적하게 하고, 세포의 유주나 배향을 일으키기 쉽게 할 수 있는 것으로 추정된다.
이하, 상기 (C)의 온도 응답성 폴리머 및 그 제조 방법에 대해 기재한다.
(온도 응답성 폴리머 조성물의 제조 방법)
(C)의 온도 응답성 폴리머 조성물의 제조 방법은, 우선, 혼합형 온도 응답성 폴리머 조성물을 조제한다(혼합물 조제 공정). 구체적으로는, (1) 2－N, N－디메틸아미노에틸 메타크릴레이트(DMAEMA) 및/또는 그 유도체의 중합체와, (2) 2－아미노-2－히드록시메틸-1, 3－프로판디올(트리스)와, (3) 핵산, 헤파린, 히알론산, 덱스트란황산, 폴리스티렌 설폰산, 폴리아크릴산, 폴리메타크릴산, 폴리인산, 황산화 다당류, 커드란 및 폴리알긴산 및 이들의 알칼리금속염으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 일종 이상의 음이온성 물질을 혼합한다((2) 트리스는 임의 선택적으로 포함한다.).
(1)의 DMAEMA 및/또는 그 유도체의 중합체는, 온도 응답성 폴리머이고, 그 담점은 32℃이다. (2)의 트리스는, 담점의 약간의 저하, 및/또는 담점보다 고온으로 형성된 폴리머가, 담점 이하로 냉각되었을 때에 재용해하는 속도를 저감시키는 역할을 하고, 또한, 소수화된 폴리머층 중에서도 친수성을 유지하면서, 아미노기에 유래하는 양전하에 의해 세포에 자극을 주는 역할을 한다고 추정된다. (3)의 음이온성 물질은, 배양하는 세포의 유주나 배향을 가능하게 하는 역할이나 세포 상해성을 억제하는 역할을 한다고 추정된다.
이 혼합형 온도 응답성 폴리머 조성물에 의하면, 담점을 실온(25℃) 이하로 저감시킬 수 있다.
상기 조성물에서는, DMAEMA 및/또는 그 유도체의 중합체의 측쇄와 트리스가, 서로 상호작용(예를 들면, 가교하는 작용) 하고, 상기 중합체가 응집하기 쉬워지게 된다고 추정된다.
여기서, 상기 (1)에 대해서, DMAEMA 및/또는 그 유도체의 중합체로서는, 수평균분자량(Mn)이, 10kDa ~ 500kDa인 분자가 바람직하다. 또한, 중량평균분자량(Mw)과 수평균분자량(Mn)의 비(Mw/Mn)는, 1.1 ~ 6.0인 분자가 바람직하다.
또한, (1)의 DMAEMA의 유도체로서는, 예를 들면, 메타크릴레이트의 메틸기의 수소원자를 할로겐 치환한 유도체, 메타크릴레이트의 메틸기를 저급 알킬기로 치환한 유도체, 디메틸아미노기의 메틸기의 수소원자를 할로겐 치환한 유도체, 디메틸아미노기의 메틸기를 저급 알킬기로 치환한 유도체를 들 수 있다.
상기 (2)에 대해서, 트리스는, 순도 99.9% 이상의 순수물질이거나, 또는, 트리스 수용액을, 알칼리성 물질의 첨가 등에 의하여, 사용시에 중성 또는 염기성으로 하는 것이 바람직하다. 트리스는, 염산염 상태로 시판되고 있는데, 이를 이용한 경우에는, 트리스 수용액의 pH가 감소하기 때문에, 조성물의 담점이 70℃ 정도까지 상승해 버린다. 그 때문에, 트리스 염산염은 바람직하지 않다.
상기 (3)에 열거한 음이온성 물질 중, 핵산은, DNA, RNA, 그 외 1개 쇄, 2개 쇄, 올리고체, 머리핀 등의 인공 핵산 등을 들 수 있다.
특히, DNA로서는, iPS 세포, ES 세포, 간엽계 간세포 등의 간세포를 분화 세포, 특히, 심근 세포, 간세포, 신경 세포, 혈관 내피 세포로 분화 유도할 수 있는 DNA가 바람직하다.
또한, 상기 (3)에 열거한 음이온성 물질은, 어느 정도의 크기, 예를 들면 1kDa ~ 5,000kDa의 분자량(M)을 가지고 있는 것이 바람직하다.
분자량을 상기 범위로 하면, 음이온성 물질은, 양이온성 물질과 이온결합하고, 양이온성 물질을, 장시간 포착(捕捉)하는 역할을 할 수 있고 안정한 이온 복합체 미립자를 형성시키는 것이다. 또한, 일반적으로 양이온성 물질이 갖는, 세포의 세포막 표면에 대한 정전적 상호작용에 기인하는 세포 상해성을 완화할 수도 있다.
(3)에 열거한 음이온성 물질 외에도, 예를 들면, 양이온성 폴리머인 폴리(4－아미노스티렌)의 4-위(位)의 아미노기에 대해서 옥살산 등의 디카르복실산을 탈수 축합시킴으로써, 음이온성 관능기를 도입한, 실질적으로 음이온성 물질로서 기능하는 폴리머 유도체도, 이용할 수 있다.
또한, 상기 (3)에 열거한 음이온성 물질은, 2종 이상 포함되어 있어도 좋다.
여기서, (1) 2－N, N－디메틸아미노에틸 메타크릴레이트(DMAEMA) 및/또는 그 유도체의 중합체에 대한, (2) 2－아미노-2－히드록시메틸-1, 3－프로판디올(트리스)의 비율((2)/(1))이, 1.0 이하로 한 혼합형 온도 응답성 폴리머 조성물을 이용하는 것이 바람직하다.
또한, 비율((2)/(1))은, 중량 비율인 것으로 한다.
상기 비율의 혼합형 온도 응답성 폴리머 조성물을 이용한 경우, 후술의 배양 공정으로, 세포 구조체를 형성하기 쉽게 할 수 있다.
이 조성물에 의하면, 상기 조성물의 친수성과 소수성의 균형을 더욱 호적하게 할 수 있다. 그리고, 이 호적한 균형이, 배양면에의 세포의 접착성을 호적하게 조정하고, 세포의 유주나 배향을 활성화한다고 추정된다.
또한, 상기 비율((2)/(1))은, 0.1 이상인 것이 바람직하다.
상기 비율을 0.1 이상으로 함으로써, 담점을 저감시킨다는 상기 효과가 얻어지기 쉽다. 또한, 세포 구조체를 형성하기 쉽게 한다는 상기 효과가 얻어지기 쉽다.
상기와 마찬가지의 이유에 의하여, 상기 비율((2)/(1))은, 0.1 ~ 0.5인 것이 더욱 바람직하다.
여기서, 혼합형 온도 응답성 폴리머 조성물 중의 C/A비(정전하/부전하)가, 0.5 ~ 16인 것이 바람직하다.
또한, 본원 명세서에서는, C/A비란, 조성물 중에 포함되는 물질이 갖는 정전하의, 조성물 중에 포함되는 물질이 갖는 부전하에 대한 비율을 가리킨다. 구체적으로는, C/A비는, (1) DMAEMA 및/또는 그 유도체의 중합체의 몰 수를 N1, (3) 음이온성 물질의 몰 수를 N3로 했을 때에, ｛(중합체 1분자당의 정전하)×N1｝/｛(음이온성 물질 1분자당의 부전하)×N3｝의 식으로 나타낸다.
또한, 본원 명세서에서는, 음이온성 물질을 DNA로 한 경우, 음이온성 물질 1분자 당의 음 전하수는, DNA의 염기쌍의 수(bp수)×2로 계산하고, 분자량(Da)은, bp수×660(AT페어 및 CG페어의 평균분자량)으로 계산하는 것으로 한다.
C/A비를 0.5 ~ 16으로 함으로써, 관상 세포 구조체를 형성시키기 쉽게 한다는 상기 효과가 얻어지기 쉬워진다.
상기 조성물 중의 정전하와 부전하의 균형을 호적하게 하고, 정전하에 의한 세포 상해성을 억제할 수 있다고 추정된다. 또한, 상기 조성물의 친수성과 소수성의 균형을 더욱 호적하게 하고, 세포의 유주나 배향을 일으키기 쉽게 할 수 있다고 추정된다.
상기와 마찬가지의 이유에 의하여, 상기 C/A비는, 2 ~ 10으로 하는 것이 더욱 바람직하고, 특히 C/A비는 8 부근인 것이 가장 바람직하다.
상기 온도 응답성 폴리머 또는 상기 온도 응답성 폴리머 조성물은, 가열 건조, 동결건조, 감압 증류 등에 의해 수분을 제거하고, 메탄올, 에탄올 등의 알코올, 케톤, 에스테르 등의 유기 용매에 용해해도 좋다. 이들 중에서도, 표면장력과 비점이 낮고 신속한 건조가 가능하고, 온도 응답성 폴리머를 보다 균일하게 피복할 수 있는 관점으로부터, 메탄올에 용해시키는 것이 바람직하다. 또한, 유기 용매에 용해하는 경우에는, 더욱, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 디메틸아크릴아미드(DMAA), 글리세린, TritonX, 폴리프로필렌글리콜 등의 비이온이고 친수성인 친수성분자를 가해도 좋다.
(세포배양기의 제조 방법)
도 1에, 본 발명의 실시 형태의 세포배양기의 제조 방법의 일례의 개략을, 본 발명의 실시 형태의 세포배양기의 일례의 개략, 및 본 발명의 실시 형태의 세포배양기를 이용한 세포 배양 방법의 일례의 개략과 함께 나타낸다.
본 발명의 실시 형태의 세포배양기의 제조 방법의 일례는, 제1피복영역만을 갖고, 제2피복영역을 가지지 않는 것이다.
본 발명의 실시 형태의 세포배양기의 제조 방법의 일례에서는, 우선, 세포배양기를 준비한다(도 1(i) 참조).
또한, 도 1에 나타내는 예에서는, 세포배양기의 배양면을, 세포 비접착성으로 한다.
그 다음에, 세포배양기의 배양면 상의 복수의 개소에, 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물을 배치(스팟)한다(도 1(ii) 참조).
여기서, 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물의 배치(스팟) 수법으로서는, 예를 들면, 8개의 연속적인 마이크로 피펫에 의한 수기 (手技), 용액을 정량 토출하는 스퍼터 인쇄법, 회전 스크린 드럼 인쇄법 등을 들 수 있다.
또한, 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물을 수용액 상태로 사용하는 경우에는, 그 담점 이하의 온도까지 냉각해 이용해도 좋다.
도 1에 나타내는 예에서는, 4개소에, 온도 응답성 폴리머의 수용액을 도포한다.
전술한 바와 같이, 피복 수법으로서는, 수용액 상태로부터의 침전, 도포한 수용액 또는 유기 용매 용액으로부터의 용매의 제거(건조), 방사선 조사, 저온 플라즈마 조사, 코로나 방전, 글로우방전, 자외선, 라디칼 발생제를 사용한 그래프트중합 등의 수법을 들 수 있다.
이 제조 방법의 일례에서는, 온도 응답성 폴리머를 세포배양기의 배양면에(상호작용, 비공유결합, 공유결합 등을 통해서,) 결합시킨다(도 1(iii) 참조).
도 1에 나타내는 예에서는, 도포한 온도 응답성 폴리머의 수용액을 건조시킨다.
여기서, 도포량으로서는, 0.005 ~ 200μL로 해도 좋고, 호적하게는, 1 ~ 50μL이다.
도 1에, 본 발명의 실시 형태의 세포배양기를 이용한 세포 배양 방법의 일례의 개략을, 본 발명의 실시 형태의 세포배양기의 개략, 및 본 발명의 실시 형태의 세포배양기의 제조 방법의 일례의 개략과 함께 나타낸다.
본 발명의 실시 형태의 세포배양기를 이용한 세포 배양 방법의 일례에서는, 세포를 파종한다(도 1(iｖ) 참조). 여기에서는, 세포배양기에 배지를 가하고 그 후, 세포를 현탁시킨 배지를 가해도 좋다.
파종되는 세포의 밀도가, 1,500개/㎟ 이하(배양면의 면적이 200 ㎟인 24 웰 세포 배양 플레이트에 1.0 mL의 세포 부유액을 가함으로써 파종하는 경우, 3.0×105개/mL 이하)인 것이 바람직하다. 또한, 파종되는 세포는, 살아있는 세포로 한다.
상기 세포 밀도로 하면, 제1피복영역에 접착한 세포가, 괴상(펠릿상)의 구조를 갖는 세포 구조체를 형성하기 쉽다.
이 세포 배양 방법의 일례는, 혈관 내피세포, 지방세포, 지방 간세포, 섬유아세포 등 간엽계의 세포에 대해서, 특히 호적하게 적용할 수 있다. 초대 세포의 경우는, 콜로니를 형성하는 접착성 세포를 선택하면 좋고, 당업자에 의해서 적절히 선택 가능하다.
이어서, 이 세포 배양 방법의 일례에서는, 파종된 세포를 배양하는(도 1(ｖ) 참조). 배양 조건은, 사용하는 세포에 따라 적절히 정해도 좋고, 예를 들면, 37℃, 5% CO2 분위기 등으로 해도 좋다.
이 때, 도 1(ｖ)에 나타내는 바와 같이, 파종된 세포 중, 배양면 중 제1피복영역에 위치하는 세포는, 제1피복영역에 접착하고, 한편, 파종된 세포 중, 배양면 중 세포 비접착성인 비피복영역에 위치하는 세포는, 배양면에 접착하지 않는다.
여기서, 이 세포 배양 방법의 일례에서는, 배지 교환을 실시한다(도 1(ｖi) 참조).
이 때, 도 1(ｖi)에 나타내는 바와 같이, 배양면에 접착하지 않은 세포가 세포배양기로부터 제거된다.
이 세포 배양 방법의 일례에서는, 제1피복영역에 접착한 세포를 더욱 배양한다(도 1(ｖii) 참조). 배양 조건은, 사용하는 세포에 따라 적절히 정해도 좋고, 예를 들면, 37℃, 5% CO2 분위기 등으로 해도 좋다.
이 때, 특정의 범위의 표면 제타 전위를 갖는 제1피복영역에서, 괴상(펠릿상)의 구조를 갖는 세포 구조체를 간편하게 형성시킬 수 있다.
상기와 같이 형성한 세포 구조체는, 그 후, 자발적으로 제1피복영역으로부터 박리하고, 세포배양기의 배양면 상을 이동하게 된다(도 1(ｖiii) 참조).
또한, 배양면 상을 이동하는 복수의 세포 구조체는, 서로 접촉함으로써, 서로 접착하고, 보다 큰 세포 구조체를 형성한다(도 1(ix) 참조). 여기에서는, 세포배양기를 적절히 전도·혼화시킴으로써, 복수의 세포 구조체의 접촉을 촉진해도 좋다.
도 8에, 본 발명의 실시 형태의 세포배양기의 제조 방법의 다른 예의 개략을, 본 발명의 실시 형태의 세포배양기의 다른 예의 개략, 및 본 발명의 실시 형태의 세포배양기를 이용한 세포 배양 방법의 다른 예의 개략과 함께 나타낸다.
본 발명의 실시 형태의 세포배양기의 다른 예는, 제1피복영역의 내측에 제2피복영역을 구비하는 것이다.
본 발명의 실시 형태의 세포배양기의 제조 방법의 다른 예에서의, 세포배양기의 준비(도 8(i) 참조), 세포배양기의 배양면에의 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물의 배치(도 8(ii) 참조), 온도 응답성 폴리머의 세포배양기의 배양면에의 결합(도 8(iii) 참조)에 대해서는, 전술의 본 발명의 실시 형태의 세포배양기의 제조 방법의 일례의 경우와 마찬가지로 해도 좋다.
그 다음에, 이 제조 방법의 다른 예에서는, 제1피복영역 상에, 세포접착성 물질을 배치(스팟)한다(도 8(iｖ) 참조).
여기서, 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물의 배치(스팟) 수법으로서는, 예를 들면, 8련(連) 마이크로 피펫에 의한 수기, 용액을 정량 토출하는 스퍼터 인쇄법, 회전 스크린 드럼 인쇄법 등을 들 수 있다.
도 8에 나타내는 예에서는, 4개소의 제1피복영역에서, 각각 1개소에, 세포접착성 물질의 수용액을 도포한다.
여기서, 도포량으로서는, 0.01 ~ 100μL로 해도 좋고, 호적하게는, 0.1 ~ 10μL이다.
이어서, 이 제조 방법의 다른 예에서는, 도 1에 나타내는 예와 같이, 도포한 세포접착성 물질의 수용액을 건조시킨다.
도 8에, 본 발명의 실시 형태의 세포배양기를 이용한 세포 배양 방법의 다른 예의 개략을, 본 발명의 실시 형태의 세포배양기의 다른 예의 개략, 및 본 발명의 실시 형태의 세포배양기의 제조 방법의 다른 예의 개략과 함께 나타낸다.
본 발명의 실시 형태의 세포배양기의 제조 방법의 다른 예에서의, 세포의 파종(도 8(ｖi) 참조), 파종된 세포의 배양(도 8(ｖii) 참조), 배지 교환(도 8(ｖiii) 참조), 제1 및 제2 피복영역에 접착한 세포의 추가의 배양(도 8(ix) 참조)에 대해서는, 전술의 본 발명의 실시 형태의 세포배양기의 제조 방법의 일례의 경우와 마찬가지로 해도 좋다.
전술한 바와 같이, 형성한 세포 구조체는, 제2피복영역에 위치하는 세포 구조체의 일부로, 세포배양기에 앵커링 된다.
본 발명의 실시 형태의 세포배양기의 제조 방법의 일례에 의해 제조되는, 제1피복영역만을 갖고, 제2피복영역을 가지지 않는 세포배양기는, 재생 의료, 약물 송달(DDS)의 분야에서, 호적하게 이용할 수 있다.
구체적으로는, 재생 의료에서는 재생을 원하는 부위에서의 세포 소스, DDS에서는 사이토킨의 분비체의 용도가 고려된다.
본 발명의 실시 형태의 세포배양기의 제조 방법의 다른 예에 의해 제조되는, 제1피복영역의 내측에 제2피복영역을 갖는 세포배양기는, 창약의 분야에서, 호적하게 이용할 수 있다.
구체적으로는, 고가의 iPS 세포를 이용한 소(小) 스케일에서의 약제 스크리닝의 용도가 고려된다.
도 12에, 본 발명의 실시 형태의 세포배양기의 다른 예를 이용한 본 발명의 실시 형태의 세포 구조체 배양조의 개요를 나타낸다. 도 12(a)에, 세포 구조체 배양조의 사시도를 나타내고, 도 12(b)에, 세포 구조체 배양조의 단면도를 나타낸다.
본 발명의 실시 형태의 세포 구조체 배양조는, 도 12에 나타낸 바와 같이, 용기 내에, 제1피복영역의 내측에 제2피복영역을 구비하는 개소를 복수 갖는 배양 시트가 복수층 적층되어 있는 것이다.
본 발명의 실시 형태의 세포 구조체 배양조는, 세포 구조체를 활성이 높은 상태로 배양하고, 세포 구조체에 소망한 물질이나 생물 재료(예를 들면, 성장 인자, 펩티드, 당, 단백질, 사이토카인, 그 외 생리활성물질, 에크소솜, 마이크로 RNA 등)를 산생시켜, 이러한 물질이나 생물 재료를 얻기 위해서, 호적하게 이용된다.
종래의 배양조를 이용한 방법에서는, 세포괴를 포함하는 배지를 용기 내에서 교반하면서 부유 분산시키고, 세포괴가 산생하는 항응고제(t－PA 등) 등을 얻는다. 그러나, 접착성 세포의 경우에도, 세포를 접착시키지 않고 부유시키고 있기 때문에, 세포의 활성이 낮고, 소망한 물질의 산생 효율이 낮은 것으로 되었다. 이러한 문제를 해결하는 개량 방법으로서 세포를 비즈에 접착시키고, 비즈를 포함하는 배지를 교반하면서 분산하는 방법이 검토되어 있다. 그렇지만, 이 방법도, 배양 스케일이 비교적 커지고, 또한, 세포가 세균에 감염될 리스크가 높다는 문제가 있고, 비즈에 균질하게 효율적으로 세포를 접착시키는 것 자체도 곤란했다.
본 발명의 실시 형태의 세포 구조체 배양조에 의하면, 접착성 세포의 경우에도, 세포를 배양면에 접착시킨 상태로 배양하는 것이 가능해지고, 배지의 교반을 필요로 하지 않기 때문에 용기 내의 공간을 유효하게 이용하면서, 세포의 세균에의 감염 리스크도 저감하는 것이 가능해진다.
세포 구조체 배양조에서의 배양 시트의 상세한 것에 대하여는, 전술의 본 발명의 실시 형태의 세포배양기의 다른 예에서 기재한 대로 해도 좋다.
여기서, 배양 시트에는, 세포 구조체를 앵커링시키는 상기 개소가, 시트의 종방향 및 횡방향으로 행렬을 이루는 것이, 배양 환경을 균일하게 하는 관점으로부터, 바람직하다.
또한, 세포 구조체 배양조에서는, 배양 시트끼리의 사이에 배지를 통과할 수 있는 정도의 간격이 마련되어 있다. 이러한 간격은, 예를 들면, 배양 시트의 표면 및/또는 이면에, 세포 구조체의 경(徑)보다 큰 높이를 갖는 돌기부를 적절히 마련하고, 돌기부의 선단에서 상기 배양 시트에 인접하는 배양 시트를 지지함으로써, 마련해도 좋다.
세포 구조체 배양조에는, 도 12에 나타낸 바와 같이, 용기의 측벽에, 배지를 투입하기 위한 투입부와 배지를 배출하기 위한 배출부가 마련되어 있다.
본 발명의 실시 형태의 세포 구조체 배양조를 이용한 세포 구조체의 배양의 일례에서는, 도 12 에 나타낸 바와 같이, 배양 시트에 앵커링된 세포 구조체를 조제한 후, 투입부로부터 배지를 투입하고, 배출부로부터 배지를 배출한다.
여기서, 배출된 배지에, 수분 증발농축, 동결건조, 에탄올침전, 페놀 처리, 항체고정 자기 비즈 처리, 항체고정 형광 비즈 처리, 겔 여과, 원심분리, 경사 비중 약, 투석, 여과, 전기영동, 효소처리, 액액추출 등의 당업자에게 주지의 방법으로, 소망한 물질이나 생물 재료를 추출해도 좋다.
또한, 배출된 배지는, 관류해도 좋고, 또한, 임의 선택적으로, 투석해 암모니아 등 대사물을 제거하거나 산소 버블링을 해 용존산소 농도를 높이거나 한 후, 재이용해도 좋다. 또한, 투입하는 배지는 새로운 배지로서 해도 좋다.
본 발명의 실시 형태의 세포 구조체 배양조는, 생체 유래계 생리활성물질의 제조 등의 용도에 호적하게 이용할 수 있다.
실시예
이하, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 하기 실시예에 아무런 한정되는 것은 아니다.
하기 시험에서, 시판의 시약은, 특히 거절이 없는 한 더 정제하지 않고 이용했다.
(실시예 1)
(시험 1－1) 폴리머의 제조-1
분자 내 이온 복합체형 온도 응답성 폴리머의 제조(실시예 제법 1－1)
용량 50 mL의 연질글라스 제의 투명한 바이알병에, 2－N, N－디메틸아미노에틸 메타크릴레이트(DMAEMA) 10.0 g을 가하고, 자성 교반기를 이용해 교반했다.
그리고, 이 혼합물(액체)에 대해서 G1그레이드의 고순도(순도：99.99995%)의 질소 가스를 10분간 퍼지(유속：2.0L/분) 함으로써, 이 혼합물을 탈산소했다.
그 후, 이 혼합물에 대해서, 환형블랙 형광등(NEC 사 제, 형번(型番)：FCL20BL, 18 W)을 이용해 5시간 자외선 조사함으로써, 상기 반응물을 중합시켰다.
여기서, 반응물의 일부를 채취하고, 폴리머화한 DMAEMA의 수평균분자량(Mn)을 측정했는데, 97,0000(분산=4.1) 이었다.
수평균분자량이 5,000 이상인 것을 확인한 직후에, 바이알병에 불활성 가스를 플로우 시킴으로써 바이알 내를 불활성 분위기로 유지하면서, 메타크릴산 1.4 g을 가하고, 재차 자성 교반기를 이용해 교반했다. 또한, 여기서 가하는 메타크릴산에 대해서는 미리 불활성 가스로 버블링을 행했다.
이 혼합물에 대해서, 환형블랙 형광등(NEC 사 제, 형번：FCL20BL, 18 W)을 이용하고, 16시간 자외선 조사함으로써, 상기 반응물을 중합시켰다. 반응물은, 혼합 직후에 점성을 띠고 1시간 후에 고화하고, 중합체가 반응 생성물로서 얻어졌다. 이 반응 생성물을 2－프로판올에 용해시키고, 용액을 투석 튜브로 옮겼다. 그리고, 투석을 72시간 실시하고, 반응 생성물을 정제했다.
반응 생성물을 포함하는 용액을, 셀룰로오스 혼합에스테르 제의 0.2㎛ 필터(Toyo Roshi Kaisha, Ltd.제, 형번：25 AS020)로 여과하고, 얻어진 여액을 동결건조시킴으로써, DMAEMA의 호모폴리머 블록과, DMAEMA와 메타크릴산의 코폴리머 블록로 이루어지는 온도 응답성 폴리머가 얻어졌다(수량：6.8 g, 전화율 60%).
이 폴리머의 수평균분자량(Mn)을, GPC(Shimadzu Corporation제, 형번：LC－10ｖp시리즈)를 이용하고, 폴리에틸렌글리콜(Shodex 사 제, TSK 시리즈)을 표준 물질로서 측정하고, Mn=450,0000(Mw/Mn=2.2)로 결정했다(실시예 폴리머 1－1).
실시예 폴리머 1－1의 핵자기공명 스펙트럼(NMR)을, 핵자기공명 장치(Varian 사 제, 형번：Gemini300)를 이용하고, 중수(D2O)를 표준 물질로서 측정했다. 하기에는, 실시예 폴리머 1에 공통되는 대표적인 피크를 나타낸다.
1H-NMR (in D2O) δ 0.8-1.2 (br, 3H, -CH2-C(CH3)-), 1.6-2.0 (br, 2H, -CH2-C(CH3)-), 2.2-2.4 (br, 6H, -N(CH3)2), 2.5-2.7 (br, 1.9H,-CH2-N(CH3)2), 4.0-4.2 (br, 1.9H, -O-CH2-).
여기서, α 위에 결합한 메틸기 (δ 0.8-1.2)의 프로톤 수(DMAEMA 유닛의 경우도 메타크릴산 유닛의 경우도 3개) A와 측쇄의 에스테르 결합의 산소에 결합되어 있는 에틸기 (δ 4.0-4.2)의 메틸플로톤 수(DMAEMA 유닛의 경우는 2개이고, 메타크릴산 유닛의 경우는 0개) B로부터, DMAEMA의 측쇄가 갖는 아미노기의 관능기 수와 메타 아크릴산의 측쇄의 카르복시기의 관능기 수의 비를 산출했다.
그 결과, 실시예 폴리머 1－1의 경우 94：6이 되었다. 이것은, 양이온성 폴리머와 음이온성 폴리머를 포함하는 2성분 혼합계에서의 이온 복합체에서 말하는 C/A비로 환산하면, C/A비=15.6이 된다.
(시험 2) 폴리머의 담점의 측정
실시예 폴리머 1－1의 3% 수용액을 조제하고, 이 수용액의 660 nm에서의 흡광도를, 20℃ ~ 40℃의 사이에서 측정했다.
그 결과, 20℃ ~ 30℃에서는, 수용액은 투명이고, 흡광도가 거의 0이었지만, 31℃ 부근으로부터 수용액 중에 백탁이 보여지게 되고, 32℃에서 흡광도가 급격하게 상승했다. 이것에 의하여, 상기 폴리머는, 약 32℃의 담점을 갖는 것을 확인했다.
또한, 실시예 폴리머를 37℃까지 승온시키면, 폴리머 수용액은, 양호한 응답성으로, 현탁하고, 그 후, 수용액 전체가 고화했다. 이 고화물을 실온(25℃)으로 유지했는데, 수십 시간의 동안, 고화한 상태인 채였다. 그 후, 고화물이 서서히 용해하고, 균질인 수용액으로 변화했다. 고화한 폴리머는 4℃까지 냉각하면, 빠르게 용해했다. 그리고, 상기 승온 및 강온의 조작을 반복해서 행해도, 응답성으로의 변화가 생기지 않았기 때문에, 폴리머가 가역적으로 상전이(相轉移)를 일으키는 것이 확인되었다.
(시험 3) 폴리머의 응집체의 입자경 측정
실시예 폴리머 1－1을 20℃의 액체로 하고, 정적 광산란 장치(Sysmex Corporation제, 형번：Zetasizer Nano)를 이용하고, 광산란에 의해, 폴리머분자의 응집체의 입자경을 측정했는데, 250 nm였다. 담점 미만의 온도인 20℃에서도, 비교적 입자경이 큰 응집체, 즉, 침전하기 쉽고, 침전 후에 확산하기 어려운 응집체를 형성하는 것이 시사되었다. 실시예 폴리머 1은, 세포배양기에 용이하게 피복할 수 있을 가능성이 시사되었다.
(시험 4) 세포배양기 (제1피복영역만을 갖는 세포배양기)의 제조
세포배양기로서 폴리스티렌 제의 35 mm 세포 배양 플레이트(IWAKI&CO.,LTD.제, 형번：3000－035－MYP, 1 웰 당의 저면적：9 ㎠)를 이용했다.
배양면을, 비이온성 계면활성제(Asahidenka Co.,Ltd. 제, Pluronic F－68)로 코팅하고, 세포 비접착성으로 했다.
그 다음에, 마이크로 피펫을 이용하고, 배양면 상의 28개소에, 담점 이하로 냉각한 온도 응답성 폴리머의 수용액(농도：15μg/mL) 4μL씩을, 각각 원형상으로 도포했다.
1개소 당의 원형의 제1피복영역의 직경은, 약 2,000㎛이고, 또한, 제1피복영역간의 거리는, 약 1,000㎛였다.
그리고, 크린벤치 내에서 방치함으로써, 도포한 온도 응답성 폴리머의 수용액을 건조시켰다.
이렇게 하여, 세포 배양 플레이트의 배양면에 온도 응답성 폴리머로 피복한 제1피복영역을 마련했다.
도 2에, 시험 4에서 제작한 본 발명의 실시예의 세포배양기를 배양면 측으로부터 본 도면을 나타낸다.
(시험 5) 제타 전위의 측정
세포 배양 플레이트의 소편(小片)에(시험 4)의 순서와 마찬가지의 순서에 따라서 마련한 제1피복영역의 표면 제타 전위를, 제타 전위계(Otsuka Electronics Co.,Ltd.제, 형번：ELSZ) 및 평판 시료용 셀 유닛을 이용해 측정했다.
구체적으로는, 석영 셀의 하면에 소편의 시료를 밀착시키고, 셀 내부에 모니터 입자 현탁액을 주입했다. 여기서, 표준의 모니터 입자로서 폴리스티렌 라텍스(입자경：약 500 nm)를 히드록시프로필셀룰로오스(Mw=30,000)로 피복한 입자(제타 전위：－5 mV ~ ＋5 mV)를 이용했다. 또한, 용매로서 10 mM의 염화나트륨 수용액을 pH=7, 37℃의 조건하에서 이용했다. 그리고, 제타 전위는, Smoluchowski식을 이용해 산출했다.
비피복의 세포 배양 플레이트의 소편의 표면의 제타 전위는 -68 mV이고, 일반적인 열가소성 수지의 고체 표면의 제타 전위로서 당업자에게 주지의 값이었다.
한편, 온도 응답성 폴리머에 의해 피복된 세포 배양 플레이트의 소편의 표면의 제타 전위는, ＋20 mV였다.
또한, 당업자에게 주지한 바와 같이, 현재의 기술에서는, 고체 표면의 제타 전위의 측정치는, ±10%정도의 불균형을 갖는 것이고, 또한, 시료의 조제 공정에서도, 코팅 조작 자체에 불균형이 존재하는 것이기 때문에, 상기 제타 전위의 측정치는 어느 정도의 오차를 가질 수 있다.
(시험 6) 접촉각의 측정
세포 배양 플레이트의 제1피복영역에 대한 물의 접촉각을, JIS R3257에 준거하고, 접촉각 계(상품명：DMs－400, Kyowa Interface Science Co., Ltd.제)를 이용해 측정했는데, 70°±10°였다.
(시험 7) 세포 배양
여기서, GFP로 태그 붙인 래트 피하지방 유래의 간엽계 지방 간세포 2.5×106개를, 완전 배지(둘베코 개변 이글 배지(DMEM)＋10% 소 태아 혈청(FBS) 용액, DMEM：Gibco 사 제, 형번：11995－065, FCS：invitrogen 사 제, 로트번호：928696) 중에 부유시키고, 세포 밀도가 2.5×106개/플레이트로 되도록 파종했다.
이 파종한 래트 피하지방 유래의 지방 간세포를, 37℃, 5% CO2 분위기의 세포 배양 인큐베이터 중에서 3시간 배양했다.
이 때, 파종된 세포 중, 배양면 중 제1피복영역에 위치하는 세포는, 제1피복영역에 접착하고, 한편, 파종된 세포 중, 배양면 중 세포 비접착성인 비피복영역에 위치하는 세포는, 배양면에 접착하지 않았다.
3시간 배양 후, 새로운 DMEM＋10%FCS 용액을 이용해 배지 교환을 실시했다.
도 3 및 도 4에, 본 발명의 실시예의 세포배양기의 제1피복영역에서 래트 피하지방 유래의 지방 간세포를 배양했을 때의 모습을, 위상차현미경을 이용해 관찰했을 때의 사진을 나타낸다.
도 3(a) ~ (d), 도 4(a) ~ (d)에, 각각, 배지 교환으로부터, 0시간 후(배지 교환 직후), 2시간 후, 3시간 후, 4시간 후, 5시간 후, 6시간 후, 8시간 후, 12시간 후의 모습을 나타낸다.
배지 교환으로부터 0시간 후(배지 교환 직후)에는, 지방 간세포가 제1피복영역의 전면에 접착되었다(도 3(a) 참조).
배지 교환으로부터 2시간 후에, 접착되어 있는 세포 중, 특히, 제1피복영역의 외연에 위치하는 세포가, 자발적으로 박리하기 시작했다(도 3(b) 참조).
배지 교환으로부터 3시간 후 ~ 6시간 후에 걸쳐, 세포의 자발적인 박리는, 제1피복영역의 외연 측으로부터 제1피복영역의 중심 측으로 향하고, 서서히 진행했다(도 3(c), 도 3(d), 도 4(a), 도 4(b) 참조).
배지 교환으로부터 8시간 후에, 마침내는, 각 제1피복영역에서의 배양으로부터, 제1피복영역의 수만큼, 괴상(펠릿상)의 구조를 갖는 세포 구조체가 형성되었다(도 4(c) 참조).
배지 교환으로부터 12시간 후, 괴상의 세포 구조체는, 자발적으로 제1피복영역으로부터 박리하고, 세포배양기의 배양면 상을 이동하기 시작했다. 몇 개의 세포 구조체는, 서로 접착을 시작했다(도 4(d) 참조).
또한, 도 7(a)에, 본 발명의 실시예의 세포배양기의 제1피복영역에서 래트 피하지방 유래의 지방 간세포를 배양했을 때의, 배지 교환으로부터 0시간 후(배지 교환 직후)의 모습을, 실체현미경을 이용해 관찰했을 때의 사진을 나타낸다.
본 실시예에서는, 괴상의 세포 구조체를, 37℃, 5% CO2 분위기의 세포 배양 인큐베이터 중에서 더욱 배양했다.
도 5 및 도 6에, 본 발명의 실시예의 세포배양기의 제1피복영역에서 래트 피하지방 유래의 지방 간세포를 배양했을 때의 모습을, 위상차현미경을 이용해 관찰했을 때의 사진을 나타낸다.
도 5(a) ~ (d), 도 6(a) ~ (d)에, 각각, 괴상의 세포 구조체가 자발적으로 제1피복영역으로부터 박리하고, 부유한 후, 세포배양기를 적당하게 전도·혼화시킴으로써 부유물을 인위적으로 세포배양기의 중앙부에 모으고, 세포 구조체끼리를 접촉시키고 나서, 0시간 후, 5시간 후, 8시간 후, 12시간 후, 17시간 후, 22시간 후, 25시간 후, 34시간 후의 모습을 나타낸다.
다수의 괴상의 세포 구조체는, 배양면 상을 이동하고, 서로 접촉하도록 서로 접착하고, 보다 큰 세포 구조체를 형성한다, 라는 현상을 반복하고, 마침내는, 몇 개의 괴상의 세포 구조체로 된다(도 5(a) ~ (d), 도 6(a) ~ (d) 참조).
또한, 도 7(b)에, 본 발명의 실시예의 세포배양기의 제1피복영역에서 래트 피하지방 유래의 지방 간세포를 배양했을 때의, 배지 교환으로부터 21시간 후의 모습을, 실체현미경을 이용해 관찰했을 때의 사진을 나타낸다.
(시험 8) 세포배양기 (제1피복영역 상에 제2피복영역을 갖는 세포배양기)의 제조
전술한 (시험 4)와 마찬가지로, 세포 배양 플레이트의 배양면에 온도 응답성 폴리머로 피복한 제1피복영역을 마련했다.
그 다음에, 제1피복영역에, 초미량 계량 피펫(NICHIRYO 사 제, Digifit)를 이용하고, 배양면 상의 28개소에 마련된 원형의 제1피복영역에, 사람 혈장 유래 피브로넥틴 수용액(BD Falcon 사 제, 농도：1mg/mL, 로트번호：3353663) 0.2μL씩을, 각각 원형상으로 도포했다. 여기서, 제1피복영역의 원형과 제2피복영역의 원형은, 동심원상으로 되도록 했다.
1개소 당의 원형의 제2피복영역의 직경은, 약 250㎛였다.
그리고, 크린벤치 내에서 방치함으로써, 도포한 세포접착성 물질의 수용액을 건조시켰다.
이렇게 하여, 세포 배양 플레이트의 배양면에 온도 응답성 폴리머로 피복한 제1피복영역의 내측에 제2피복영역을 마련했다.
(시험 9) 세포 배양
여기서, 전술한 (시험 4)와 마찬가지로, GFP로 태그 붙인 래트 피하지방 유래의 지방 간세포 2.5×106개를, 완전 배지(둘베코 개변 이글 배지(DMEM)＋10% 소 태아 혈청(FBS) 용액, DMEM：Gibco 사 제, 형번：11995－065, FCS：Invitrogen 사 제, 로트번호：928696) 중에 부유시키고, 세포 밀도가 2.5×106개/플레이트로 되도록 파종했다.
이 파종한 래트 피하지방 유래의 지방 간세포를, 37℃, 5% CO2 분위기의 세포 배양 인큐베이터 중에서 3시간 배양했다.
이 때, 파종된 세포 중, 배양면 중 제1피복영역에 위치하는 세포는, 제1피복영역에 접착하고, 한편, 파종된 세포 중, 배양면 중 세포 비접착성인 비피복영역에 위치하는 세포는, 배양면에 접착하지 않았다.
3시간 배양 후, 새로운 DMEM＋10%FCS 용액을 이용해 배지 교환을 실시했다.
본 발명의 실시예의 세포배양기의 제1 및 제2 피복영역에서 래트 피하지방 유래의 지방 간세포를 배양했을 때의 모습을, 위상차현미경을 이용해 관찰했을 때의 사진은, 도 3 및 도 4와 거의 마찬가지로 되었다(도시하지 않음).
각각, 배지 교환으로부터, 0시간 후(배지 교환 직후), 2시간 후, 3시간 후, 4시간 후, 5시간 후, 6시간 후, 8시간 후, 12시간 후의 모습은, 도 3 및 도 4와 거의 마찬가지로 되었다(도시하지 않음).
배지 교환으로부터 0시간 후(배지 교환 직후)에는, 지방 간세포가 제1피복영역의 전면에 접착되었다(도 3(a) 참조).
배지 교환으로부터 2시간 후에, 접착되어 있는 세포 중, 특히, 제1피복영역의 외연에 위치하는 세포가, 자발적으로 박리하기 시작했다(도 3(b) 참조).
배지 교환으로부터 3시간 후 ~ 6시간 후에 걸친 세포의 자발적인 박리는, 제1피복영역의 외연 측으로부터 제1피복영역의 중심 측으로 향하고, 서서히 진행한다(도 3(c), 도 3(d), 도 4(a), 도 4(b) 참조).
배지 교환으로부터 8시간 후에, 마침내는, 각 제1피복영역에서의 배양으로부터, 제1피복영역의 수만큼, 괴상(펠릿상)의 구조를 갖는 세포 구조체가 형성되었다(도 4(c) 참조).
배지 교환으로부터 12시간 후, 괴상의 세포 구조체 중 대부분은, 자발적으로 제1피복영역으로부터 박리했지만, 세포 구조체 중 제2피복영역 상에 위치하는 부분이, 제2피복영역에 앵커링 되어 제1 및 제2 피복영역 상에 머물렀다(도 9 참조).
또한, 도 9에, 본 발명의 실시예의 세포배양기의 제1 및 제2 피복영역에서 래트 피하지방 유래의 지방 간세포를 배양했을 때의, 배지 교환으로부터 0시간 후(배지 교환 직후)의 모습을, 실체현미경을 이용해 관찰했을 때의 사진을 나타낸다.
본 실시예에서는, 괴상의 세포 구조체를, 37℃, 5% CO2 분위기의 세포 배양 인큐베이터 중에서 소정 시간 배양했다.
세포배양기를 적당하게 전도·혼화시켜도, 형성한 세포 구조체가 세포 배양 접시로부터 박리하지 않고, 인접하는 제1 및 제2 피복영역 간의 각각에서 형성한 세포 구조체는 접착하지 않았다.
도 10에, 도 9에 나타내는 세포 구조체를, 수동으로 수평방향 사방으로 10 cm/초 정도의 속도로 흔들었을 때의 모습을, 위상차현미경을 이용해 관찰했을 때의 사진을 나타낸다. (a) ~ (d)는, 요동 개시부터, 0초 후, 0.5초 후, 1.0초 후, 1.5초 후의 모습을 나타낸다.
도 11에, 도 9에 나타내는 세포 구조체를, 수동으로 수평방향 사방으로 10 cm/초 정도의 속도로 흔들었을 때의 모습을, 위상차현미경을 이용해 관찰했을 때의 사진을 나타낸다. (a) ~ (d)는, 요동 개시부터, 2.0초 후, 2.5초 후, 3.0초 후, 3.5초 후의 모습을 나타낸다.
도 10 및 도 11에 보여지는 바와 같이, 요동 중, 세포 배양 접시 상의 6개의 괴상의 세포 구조체(도면 중, 배양면 상 참조)는, 세포 배양 접시에 관해서 변위하지 않은 것에 대해, 세포 배양 접시 상의 세포 구조체 이외의 세포(도면 중, 배양면의 우하(右下) 참조)는, 세포 배양 접시에 관해서 변위하는 것을 알 수 있다.
(실시예 2 ~ 실시예 11)
또한, 하기 표 1에 기재된 바와 같이 조건을 변경하고, 실시예 1과 마찬가지로, 시험 1 ~ 시험 9에 기재된 조작과 마찬가지의 조작을 실시했다.
실시예 2 ~ 실시예 11에 대해 이용한 실험 재료의 상세를 이하에 기재한다.
－세포배양기-
·저접착성 플레이트(35 mm)：Prime Surface(등록상표)(Sumitomo Bakelite Co., Ltd.)
·유리 샬레(50 mm)：BROSIL(AS ONE Corporation제)
·범용 멸균(대장균 용) 샬레(90 mm)：GD90－15(AS ONE Corporation)
－온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물-
·실시예 폴리머 1－2：하기 (시험 1－2)에 의해 조제.
(시험 1－2) 폴리머의 제조-2
용량 50 mL의 연질글라스 제의 투명한 바이알병에, 2－N, N－디메틸아미노에틸 메타크릴레이트(DMAEMA) 10.0 g, 및 물 5,000μL를 가하고, 자성 교반기를 이용해 교반했다. 그리고, 이 혼합물(액체)에 대해서 G1그레이드의 고순도(순도：99.99995%)의 질소 가스를 10분간 퍼지(유속：2.0L/분) 함으로써, 이 혼합물을 탈산소했다. 또한, 이용한 DMAEMA에는, 중합 금지제인 메틸 히드로퀴논(MEHQ)이 0.5 중량% 포함되어 있었다.
그 후, 이 반응물에 대해서, 환형블랙 형광등(NEC 사 제, 형번：FCL20BL, 18 W)을 이용하고, 22시간 자외선 조사함으로써, 상기 반응물을 중합시켰다. 반응물은, 5시간 후에 점성을 띠고 15시간 후에 고화하고, 중합체가 반응 생성물로서 얻어졌다. 이 반응 생성물을 2－프로판올에 용해시키고, 용액을 투석 튜브로 옮겼다. 그리고, 투석을 72시간 실시하고, 반응 생성물을 정제했다.
반응 생성물을 포함하는 용액을, 셀룰로오스 혼합에스테르 제의 0.2㎛ 필터(Toyo Roshi Kaisha, Ltd.제, 형번：25 AS020)로 여과하고, 얻어진 여액을 동결건조시킴으로써, 분자 내 이온 복합체형의 온도 응답성 폴리머가 얻어졌다(수량(收量)：6.8 g, 전화율：68%). 이 폴리머의 수평균분자량(Mn)을, GPC(Shimadzu Corporation제, 형번：LC－10ｖp시리즈)를 이용하고, 폴리에틸렌글리콜(Shodex 사 제, TSK 시리즈)을 표준 물질로서 측정하고, Mn=100,000(Mw/Mn=10.0)로 결정했다.
또한, 폴리머의 담점 및 입자경은, 실시예 폴리머 1－1의 경우와 마찬가지였다.
·실시예 폴리머 1－3：(시험 1－2)에서, 질소 가스의 퍼지 시간을 10분간으로부터 20분간으로 변경했다. 중합보다 가수분해가 더 진행해 음이온 성분이 증가했다.
·실시예 폴리머 1－4：(시험 1－2)에서, 질소 가스의 퍼지 시간을 10분간으로부터 5분간으로 변경했다. 가수분해보다 중합이 더 진행해 양이온 성분이 증가했다
·실시예 폴리머 1－5：(시험 1－2)에서, DMAEMA 대신에, 친수성 비이온성 모노머의 N, N－디메틸아크릴아미드(DMAA)를 DMAEMA의 3질량% 배합한 것을 이용했다.
·실시예 폴리머 1－6：(시험 1－2)에서, DMAEMA 대신에, 비이온성 모노머의 N－이소프로필 아크릴아미드(NIPAM)를 DMAEMA의 5% 배합한 것을 이용했다.
－세포-
·사람 암 유래 세포주(HepG2)：CET 사 제, HEPG2－500
·심근 세포：비글개 유래 초대 세포
·연골 세포：비글개 유래 초대 세포
－세포접착성 물질-
·라미닌：Nippi. Inc.제
·콜라겐：Nitta Gelatin Inc.제
[표 1-1]
[표 1-2]
[산업상의 이용 가능성]
본 발명에 의하면, 미소 사이즈(예를 들면, 수백 ㎛ 이하의 사이즈)의 세포 구조체(예를 들면, 스페로이드)를 대량으로 간편하게 제작하는 것이 가능한 세포배양기를 제공할 수 있다.
Claims (9)
- 세포배양기의 배양면에, 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물로 피복된 제1피복영역을 복수 갖고,
상기 제1피복영역의 표면 제타 전위가, 0 ~ 50 mV인,
것을 특징으로 하는, 세포배양기. - 제1항에 있어서,
상기 제1피복영역에 대한 물의 접촉각이, 50 ~ 90°인, 세포배양기. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 세포배양기의 배양면은, 세포 비접착성인, 세포배양기. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제1피복영역의 평면시(平面視) 형상이, 원형, 타원형, 외윤곽선의 내측에 곡률 중심을 갖는 형상으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종인, 세포배양기. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물이, 2－N, N－디메틸아미노에틸 메타크릴레이트(DMAEMA) 단위와 음이온성 모노머 단위를 포함하는 온도 응답성 폴리머；N－이소프로필 아크릴아미드(NIPAM) 단위와 양이온성 모노머 단위와 음이온성 모노머 단위를 포함하는 온도 응답성 폴리머；2－N, N－디메틸아미노에틸 메타크릴레이트(DMAEMA) 및/또는 그 유도체의 중합체와, 2－아미노-2－히드록시메틸-1, 3－프로판디올(트리스)와, 핵산, 헤파린, 히알론산, 덱스트란황산, 폴리스티렌 설폰산, 폴리아크릴산, 폴리메타크릴산, 폴리인산, 황산화 다당류, 커드란 및 폴리알긴산 및 이들의 알칼리금속염으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 음이온성 물질을 포함하는 온도 응답성 폴리머 조성물；로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물인, 세포배양기. - 제5항에 있어서,
상기 음이온성 모노머는, 아크릴산, 메타크릴산, 측쇄에 카르복시기, 설폰산기, 인산기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 기를 갖는 비닐 유도체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종인, 세포배양기. - 제5항 또는 제6항에 있어서,
상기 양이온성 모노머는, 3－(N, N－디메틸아미노프로필)－(메타)아크릴아미드, 3－(N, N－디메틸아미노프로필)－(메타)아크릴레이트, 아미노스티렌, 2－(N, N－디메틸아미노에틸)－(메타)아크릴아미드, 2－(N, N－디메틸아미노에틸)－(메타)아크릴레이트로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종인, 세포배양기. - 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제1피복영역에, 세포접착성 물질로 더 피복된 제2피복영역을 갖고, 상기 제2피복영역은 상기 제1피복영역의 내측에 있는, 세포배양기. - 제8항에 있어서,
상기 세포접착성 물질은, 라미닌, 콜라겐, 피브로넥틴으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종인, 세포배양기.
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