KR20180103075A - 세포괴, 세포구조체 및 입체조직체 - Google Patents

세포괴, 세포구조체 및 입체조직체 Download PDF

Info

Publication number
KR20180103075A
KR20180103075A KR1020187021598A KR20187021598A KR20180103075A KR 20180103075 A KR20180103075 A KR 20180103075A KR 1020187021598 A KR1020187021598 A KR 1020187021598A KR 20187021598 A KR20187021598 A KR 20187021598A KR 20180103075 A KR20180103075 A KR 20180103075A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cell
cells
responsive polymer
culture
temperature
Prior art date
Application number
KR1020187021598A
Other languages
English (en)
Inventor
야스히데 나카야마
료스케 이와이
야스시 네모토
Original Assignee
고쿠리츠켄큐카이하츠호진 고쿠리츠쥰칸키뵤 겐큐센터
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from JP2016016459A external-priority patent/JP2017131198A/ja
Priority claimed from JP2016026293A external-priority patent/JP6800436B2/ja
Priority claimed from JP2016053082A external-priority patent/JP2017163912A/ja
Priority claimed from JP2016053081A external-priority patent/JP2017163911A/ja
Priority claimed from JP2016124458A external-priority patent/JP2017169552A/ja
Priority claimed from JP2016148977A external-priority patent/JP6780816B2/ja
Priority claimed from JP2016162950A external-priority patent/JP6704197B2/ja
Application filed by 고쿠리츠켄큐카이하츠호진 고쿠리츠쥰칸키뵤 겐큐센터 filed Critical 고쿠리츠켄큐카이하츠호진 고쿠리츠쥰칸키뵤 겐큐센터
Priority claimed from PCT/JP2017/003879 external-priority patent/WO2017131241A1/ja
Publication of KR20180103075A publication Critical patent/KR20180103075A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0655—Chondrocytes; Cartilage
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3604—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix characterised by the human or animal origin of the biological material, e.g. hair, fascia, fish scales, silk, shellac, pericardium, pleura, renal tissue, amniotic membrane, parenchymal tissue, fetal tissue, muscle tissue, fat tissue, enamel
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3604—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix characterised by the human or animal origin of the biological material, e.g. hair, fascia, fish scales, silk, shellac, pericardium, pleura, renal tissue, amniotic membrane, parenchymal tissue, fetal tissue, muscle tissue, fat tissue, enamel
    • A61L27/3612—Cartilage, synovial fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3804—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
    • A61L27/3813—Epithelial cells, e.g. keratinocytes, urothelial cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3804—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
    • A61L27/3817—Cartilage-forming cells, e.g. pre-chondrocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M21/00—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses
    • C12M21/08—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses for producing artificial tissue or for ex-vivo cultivation of tissue
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/20—Material Coatings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/12—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0657—Cardiomyocytes; Heart cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/13—Coculture with; Conditioned medium produced by connective tissue cells; generic mesenchyme cells, e.g. so-called "embryonic fibroblasts"
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/30—Synthetic polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins
    • C12N2533/52—Fibronectin; Laminin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins
    • C12N2533/54—Collagen; Gelatin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2535/00—Supports or coatings for cell culture characterised by topography

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Thermal Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

본 발명은 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물로 피복된 배양면에 의해, 세포괴, 세포구조체, 또는 입체조직체를 효율 좋게 제조하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명의 세포괴, 세포구조체, 또는 입체조직체의 제조 방법은, 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물로 피복된 배양면에, 세포를 파종하고, 배양하는 것을 특징으로 한다.

Description

세포괴, 세포구조체 및 입체조직체
본 발명은, 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물로 피복된 배양면에 의해, 세포괴, 세포구조체, 또는 입체조직체를 효율적으로 제조하는 방법, 및 그 방법에 의해 수득하는 세포괴, 세포구조체, 또는 입체조직체에 관한 것이다.
특히, 본 발명(I)은, 연골 세포괴 및 이식 재료의 제조 방법, 연골 세포괴 및 이식 재료 및 복합재에 관한 것이다. 또한, 본 발명(II)은, 상피계 세포의 배양 방법, 세포구조체의 제조 방법, 및 상피계 세포용 세포배양기에 관한 것이다. 또한, 본 발명(III)은, 입체조직체의 제작 장치, 및 입체조직체의 제작 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명(IV)은, 세포구조체의 제조 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명(V)은, 세포구조체의 제조 방법, 세포구조체, 세포배양기에 관한 것이다. 또한, 본 발명(VI)은, 세포구조체의 제조 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명(VII)은, 세포구조체의 제조 방법에 관한 것이다.
발명(I)에 관해, 최근, 환자의 QOL의 향상을 목적으로 하고, 오더 메이드 의료의 실현이 요구되고 있다. 오더 메이드 의료에서는, 환자 자신의 세포를 이용해 기능 장애나 기능 결함에 빠진 조직이나 장기의 재생을 도모하는, 재생 의료가 주요한 역할을 담당한다.
여기서, 재생 의료는, 환자의 조직으로부터 채취한 세포를, 세포배양기 중에서 배양해, 조직을 형성시키고, 그 후, 그 조직을 환자에게 이식한다고 하는 오퍼레이션을 필요로 한다. 그 때문에, 세포를 배양하고, 조직 등의 세포구조체를 형성시키는 기술이나, 세포구조체를 그대로의 상태로 회수하는 기술이 소망되고 있다.
일반적으로, 생체 외에 꺼내진 세포는, 그 유전자 제어에 혼란을 일으키게 하는 다양한 스트레스를 받고, 탈분화해 버리는 경우가 많고, 또한, 세포를 증식시키기 위해서 탈분화시키는 것이 필요한 경우도 많다. 이것에 의해, 환자로부터 채취한 세포를, 단순배양 조건에서 배양해도, 세포는 원래의 유전자 발현 상태를 유지할 수 없는 경우가 많기 때문에, 세포구조체, 나아가서는 조직을 형성시킬 수 없고, 또한, 그 세포의 고도의 기능을 발휘할 수 없다고 하는 문제가 있다. 예를 들면, 일반적인 폴리스티렌 제의 세포 배양 접시로 세포 배양을 행했을 경우에는, 세포가 단층상의 구조를 형성한 채로 있고, 고도로 분화한 세포로 보여지는 구조, 예를 들면, 연골 세포가 생체 내에 존재하고 있는 경우의 형상인 펠릿상의 구조와 마찬가지의 구조를 가지는 세포구조체를 형성시키는 것은 곤란하고, 또한, 연골 세포에 특이적인 많은 기능이 소실되어 버린다.
상기 문제에 관해서, 예를 들면, 조직의 구조를 모방한 입체적 구조를 구축하는 세포 배양 방법, 예를 들면, 스페로이드(spheroid) 배양, 클러스터 배양, 펠렛 배양, 삼차원 담체 배양 등의 방법이 개발되고 있다. 입체적인 구조를 가지는 세포외 매트릭스를, 세포 배양의 발판(스캐폴드)으로서 이용함으로써, 입체적인 구조를 가지는 세포를 제작하는 세포 배양 방법이 알려져 있다.
또한, 최근에는, 생체 조직 재생의 분야에서, 무인 자동화의 세포배양법, 분화 제어를 위한 약제의 발견, 바이러스 감염 검사 방법 등의 관련 기술의 완성도가 높아지고 있는 데 따라, 생체 내의 구조를 모방하는 고차적 유형 구조체를 자재(自在)로 설계하는 연구가 활발해지고 있다(비특허 문헌 1, 2 참조).
특히, 배양 연골의 삼차원화에 관해서는, 탈분화한 연골 세포를 유형의 주형에 주입하고, 세포에 BMP2나 b-FGF 등을 이용한 화학 자극에 의해 분화 유도함으로써, 직경 10 mm, 두께 1 mm의 사이즈의 연골 디스크를 조제하는 것에 성공한 예가 알려져 있다.
또한, 발명(II)에 관해, 종래, 상피계 세포는, 세포배양기에의 접착성이 약하고, 통상의 세포배양기를 이용한 상피계 세포의 배양은 매우 곤란했다. 또한, 세포의 접착성을 향상시킨 세포배양기로서 콜라겐 코트 세포배양기(특허 문헌 1 참조), 피브로넥틴 코트 세포배양기(특허 문헌 2 참조), 라미닌 코트 세포배양기(특허 문헌 3 참조) 등의 세포접착 인자를 코팅한 세포배양기가 알려져 있다. 그러나, 천연물 유래의 세포접착 인자를 이용했을 경우, 미지 물질이나 병원성 물질이 포함될 가능성이 있고, 또한 동물 자원의 절감의 관점에서도, 화학합성 물질의 세포접착 인자를 이용한 방법이 요구되고 있다.
또한, 콜라겐, 피브로넥틴, 라미닌 등의 종래의 세포접착 인자를 이용한 방법에서는, 상피계 세포와 배양면의 접착성이 충분하다고는 말하지 못하고, 상피계 세포의 접착성이 우수한 세포배양기가 요구되고 있는 것이 현상(現狀)이다.
또한, 발명(III)에 관해, 종래, 입체 구조를 가지는 세포구조체, 인공 조직체의 제작 방법으로서 구상이나 시트상 등 단순세포구조체에서는, 행잉드롭법(hanging drop)(비특허 문헌 3 참조), 저접착성 U자 바닥 배양접시(특허 문헌 4 참조) 등이 알려져 있다.
또한, 복잡한 3차원 형상의 세포구조체로서는, 3D 프린터를 이용한 세포구조체가 알려져 있다.
또한, 발명(IV)에 관해, 생물학의 분야에서의 중요한 실험 기술로서 1900년경에 개발된 세포배양기술이 있다. 개발 당초는, 배지 성분의 최적화 등 세포를 순화하는 것에 주력하고 있고, 단층 배양이나 부유 배양의 기술 중심으로 검토되어 왔다.
최근, 단층 배양계의 세포와 생체 내 조직의 세포의 사이에, 다양한 성질, 자극 응답성, 세포기능 등이 다른 것이 밝혀져, 단층 구조를 형성시키는 단층 배양보다, 생체 내의 조직 구조에 가까운 3D 구조를 형성시키는 3D 배양, 특히, 스페로이드 배양의 수요가 확대하고 있다(비특허 문헌 4 참조).
고전적으로는, 단백질계의 졸 중에 세포를 부유시키고, 이 세포 부유액을 어떠한 트리거(열, 광, 화학가교제 등)로 겔화시킴으로써 형성시킨 3D 겔 중에 세포를 포매(包埋)시키는 기술, 다공질의 스캐폴드 중에 세포를 생착하는 기술, NIPAM를 고정화한 배양접시를 이용해 세포시트의 적층체를 조제하는 기술 등이 활발히 개발되어 왔다.
최근, Sumitomo Bakelite Co., Ltd.의 PrimeSurface 등의, 비접착성의 둥근바닥면에 세포를 침강시키는 수법； JSR사의 Nano　Culture　Plate, Hitachi, Ltd.의 Nano　Pillar　Plate 등의, 레이저 가공에 의해 평활면을 규칙적인 요철 면으로 함으로써 배양면에 접착한 세포의 유주성(遊走性)을 높이고, 이것에 의해, 배양면에서 세포의 자기 조직화를 유도하는 수법； Kuraray Co.Ltd.의 Elplasia, IWAKI&CO.,LTD.의 EZSPHERE 등의, 직경 100 ~ 500μm, 깊이 500μm 정도의 무수한 구멍이 배설된 배양접시를 이용하여, 각 구멍의 바닥면으로 각 구멍에 파종(播種)한 세포를 침강시키는 수법 등이 개발되고 있다.
또한, 최근에는, 관상 부재(部材)의 선단에 세포 현탁액의 액적을 조제하고, 액적의 표면장력을 이용해 액적의 형상을 구상으로 유지하면서 액적을 소정 기간(예를 들면, 2주간 정도) 유지함으로써, 액적 중에서 스페로이드상의 세포구조체를 제조하는, 행잉드롭법도 알려져 있다.
또한, 발명(V)에 관해, 최근, 환자의 QOL의 향상을 목적으로, 오더 메이드 의료의 실현이 요구되고 있다. 오더 메이드 의료에서는, 환자 자신의 세포를 이용해 기능 장애나 기능 결함에 빠진 조직이나 장기의 재생을 도모하는, 재생 의료가 주요한 역할을 담당한다.
여기서, 재생 의료는, 환자의 조직으로부터 채취한 세포를, 세포배양기 중에서 배양해, 조직을 형성시키고, 그 후, 그 조직을 환자에게 이식한다고 하는 오퍼레이션을 필요로 한다. 그 때문에, 세포를 배양하고, 조직 등의 세포구조체를 형성시키는 기술이나, 세포구조체를 그대로의 상태로 회수하는 기술이 소망되고 있다.
일반적으로, 생체 외에 꺼내진 세포는, 그 유전자 제어에 혼란을 일으키게 하는 다양한 스트레스를 받고, 탈분화해 버리는 경우가 많고, 또한, 세포를 증식시키기 위해서 탈분화시키는 것이 필요한 경우도 많다. 이것에 의해, 환자로부터 채취한 세포를, 단순배양 조건에서 배양해도, 세포는 원래의 유전자 발현 상태를 유지할 수 없는 경우가 많기 때문에, 세포구조체, 나아가서는 조직을 형성시킬 수 없고, 또한, 그 세포의 고도의 기능을 발휘할 수 없다고 하는 문제가 있다. 예를 들면, 일반적인 폴리스티렌 제의 세포 배양 접시로 세포 배양을 행했을 경우에는, 세포가 단층상의 구조를 형성한 채로 있고, 고도로 분화한 세포로 보여지는 구조, 예를 들면, 연골 세포가 생체 내에 존재하고 있는 경우의 형상인 펠릿상의 구조와 마찬가지의 구조를 가지는 세포구조체를 형성시키는 것은 곤란하고, 또한, 연골 세포에 특이적인 많은 기능이 소실되어 버린다.
상기 문제에 관해서, 예를 들면, 조직의 구조를 모방한 입체적 구조를 구축하는 세포 배양 방법, 예를 들면, 스페로이드 배양, 클러스터 배양, 펠렛 배양, 삼차원 담체 배양 등의 방법이 개발되고 있다. 입체적인 구조를 가지는 세포외 매트릭스를, 세포 배양의 발판(스캐폴드)으로서 이용함으로써, 입체적인 구조를 가지는 세포구조체를 제작하는 세포 배양 방법이 알려져 있다(특허 문헌 5 참조).
또한, 입체적인 구조를 가지는 세포구조체를 제작하는 수법으로서 U자 바닥의 저접착성 배양접시를 이용하는 수법이나, 행잉드롭법도 개발되고 있다.
최근, 특수한 온도 응답성 폴리머 및/또는 온도 응답성 폴리머 조성물로 피복한 배양면에서, 세포를 파종·배양함으로써, 삼차원 구조를 구비하는 세포구조체를 간편하게 제조하는 방법이 보고되고 있다(특허 문헌 6 참조).
또한, 발명(VI)에 관해, 심장의 기능 장애의 연구에서, 동물의 생체 심장을 심부전 등의 상태로 하는 심 질환 모델로서는, 관상 동맥의 폐색, 약제 투여, 심근 미오신의 하지에의 근주(筋注)에서 자기면역성에 심근염을 야기시키는 등의 방법으로 제작한 모델 동물이 공지이다.
심장은, 생명의 유지에 매우 중요한 장기인 것과 동시에, 다른 장기 상태도 좌우하기 때문에, 심기능을 저하시킨 심 질환 모델을 재현 좋게 제작하는 것은 곤란했다. 예를 들면, 관상 동맥 폐색이면, 폐색의 정도가 가벼우면 정상 상태와 거의 차이가 없고, 조금이라도 심하면 곧바로 동물을 잃게 되어, 그 정도의 차이가 작기 때문에 가감이 매우 곤란했다. 또한, 미오신 투여에 의한 자기면역반응에서의 심근염 모델 제작에서는, 면역반응의 정도에 의해서 심근 조직의 병상이 크게 바뀌고, 또한 심기능 자체가, 떨어진 다른 장기 상태에도 크게 영향을 주기 때문에, 안정한 실험, 재현성이 있는 실험계를 조직하는 것이 매우 곤란했다.
또한, 제작한 심 질환 모델 장기를 생체 내로부터 적출해도, 많은 산소를 요구하는 심근 세포를 유지하는 것이 곤란했다.
또한, 실험동물의 사용은, 동물 애호나 윤리상의 문제도 있었다.
일반적으로 심부전 등을 일으킨 조직은, 관상 동맥의 부분적 폐색, 바이러스·세균의 감염, 자기면역반응 등에 의해 심근 세포가 괴사하고, 괴사한 심근 세포로 치환되어 선유아세포가 과증식하고 있는 상태에 있는 것이 알려져 있다.
여기서, 심부전 등을 일으킨 심 질환의 조직을 시험관 내에서 재현하는 것이 시도되고 있다. 이것에는, 저산소에 약한 심근 세포를 보호하고, 증식이 빠른 선유아세포와 공배양하여 세포구조체로 할 필요가 있고, 세포구조체의 제작에 1 ~ 2주간을 필요로 하는 종래의 행잉드롭법이나 저접착성 배양접시에서는 곤란했다.
단시간에, 효율 좋게 세포괴를 제조하는 방법으로서 특정의 온도 응답성 폴리머를 도포한 세포배양기를 이용한 방법이 알려져 있다(특허 문헌 6 참조).
또한, 발명(VII)에 관해, Muse 세포(다능성 줄기세포)의 이식 등으로 대표되는 간장 재생 요법의 연구에서, 간부전 모델 동물이 사용되는 경우가 있다. 간부전 모델 동물의 제작 방법으로서는, 예를 들면, 간장의 부분 절제, 문맥이나 상류 혈관의 결쇄(結刷), 사염화탄소 등의 간상해성 약제의 반복 투여 등의 방법이 공지이다. 또한, 많은 경우, 병태 간장은 동물체 내로부터 적출하는 일 없이, in　ｖiｖo 계에서의 실험에 제공된다.
동물을 사용한 실험에는, 동물 애호나 윤리관의 문제를 수반해, 실험 목적, 성공율, 수득되는 식견의 가치와의 밸런스가 중요하게 된다.
또한, 장기의 부분 절제에 의한 방법에서는, 간부전의 정도나 동물 개체 상태가, 시술자의 손기술에 크게 의존한다. 또한, 간상해성 약제를 사용하는 방법에서는, 공지의 표준적 프로토콜이 존재하지만, 반복 투여가 필요한 케이스가 많아, 증상의 진행의 정도를 제어하는 것이 곤란했다. 이와 같이, 안정하고, 재현성이 있는 간부전 모델 동물을 이용한 실험계를 조직하는 것은 곤란했다.
간세포의 배양은 활발히 행해지고 있지만, 간부전 모델을 재현하기 위해서는, 선유아세포 등을 공배양할 필요가 있다. 그러나, 상피계 세포인 간세포와 간엽계 세포인 선유아세포는, 배양접시에의 접착성이나 배양 방법이 상이하기 때문에, 제작에 1 ~ 2주간을 필요로 하는 종래의 행잉드롭법이나 저접착성 배양접시에서는, 간세포 및 선유아세포를 포함하는 삼차원 구조의 세포구조체를 제작하는 것은 곤란했다.
단시간에, 효율적으로 세포괴를 제조하는 방법으로서 특정의 온도 응답성 폴리머를 도포한 세포배양기를 이용한 방법이 알려져 있다(특허 문헌 6 참조).
특허 문헌 1：　일본 특허공개 평 05-260950호 공보 특허 문헌 2：　일본 특허공개 평 06-014764호 공보 특허 문헌 3：　일본 특허공개 평 08-173144호 공보 특허 문헌 4：　일본 특허공개 2009-050194호 공보 특허 문헌 5：　일본 특허공개 2010-524458호 공보 특허 문헌 6：　일본 특허 제5746240호 공보
비특허 문헌 1：　M.　Matsusaki　et　al,　Adｖ.　Healthcare　Mater.,　2,　534　(2013) 비특허 문헌 2：　M. Matsusaki　et　al,　Biochem. Biophys.　Res.　Commun.,　457,　363　(2015) 비특허 문헌 3：　Keller　G. M.　et　al.,　Curr. Opin. Cell　Biol.,　7,　862-869　(1995) 비특허 문헌 4：　Nature, Vol　424, P870-872, 21　August, 2003.
본 발명은, 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물로 피복된 배양면에 의해, 세포괴, 세포구조체, 또는 입체조직체를 효율 좋게 제조하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명(I)에 관해, 상기 종래의 방법에 의해, 보다 큰 사이즈의 및/또는 보다 복잡한 구조의 배양 연골을 조제하려고 하면, 구조체 내부의 세포의 괴사를 일으키고, 세포가 네크로시스(necrosis)에 의해 사멸하는 것이 보고되고 있다.
여기서, 본 발명(I)은, 관절, 기관, 코 등의 치료에 유용한 연골 세포괴 및 이식 재료 및 복합재를 간편하게 제조하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명(II)의 목적은, 세포배양기에 접착하기 어려운 상피계 세포의 배양 방법, 세포배양기에 접착하기 어려운 상피계 세포를 포함하는 세포구조체의 제조 방법, 및 상피계 세포의 배양 및 그 세포구조체의 제조가 가능한 세포배양기를 제공하는 것에 있다.
또한, 본 발명(III)에 관해, 행잉드롭법이나 저접착성 U자 바닥 배양접시 등을 이용한 방법에서는, 세포구조체 내부에 존재하는 세포에의 산소, 영양 공급이, 농도 구배 확산에 의존하기 때문에, 사이즈에 한계가 있고, 일반적으로는 직경 0.1 mm 정도가 최대로 여겨져 형상도 구체로 한정되어 있다.
또한, 3D 프린터에 의한 세포구조체의 제작 방법에서는, 트립신 등의 효소를 사용해 세포를 개개로 분산시킨 세포 부유액을 사용하고, 세포를 노즐로부터 토출해서 세포구조체를 제작한다. 이 방법에서는, 토출한 세포끼리를 결합시키려면, 토출한 개개의 세포의 주변에 외부로부터 접착 인자 등을 동시에 토출할 필요가 있다. 그러나, 이 접착 인자는 세포가 분비한 것이 아니고, 수득되는 3차원 형상의 세포구조체는, 세포끼리의 결합의 강도나 세포의 활성의 점에서, 충분하다고는 말할 수 없었다.
또한, 최근, 기능 장애나 기능 결함에 빠진 조직이나 장기의 재생을 도모하는 재생 의료 등의 관점에서, 세포를 세포배양기 내에서 배양하고, 예를 들면 링상, 관강상 등의, 조직의 구조를 모방한 입체적 구조를 가지는 세포구조체를 형성시키는 기술의 중요성이 높아지고 있다. 또한, 조직의 구조를 모방한 입체적 구조를 가지는 세포구조체로서 세포를 주성분으로 하는 세포구조체 이외에도, 세포외 매트릭스를 주성분으로 하는 세포구조체를 제작하는 방법도 요구되고 있다.
그러나, 링상 또는 관강상 등의, 조직의 구조를 모방한 입체조직체를 용이하게 형성하는 방법은 알려지지 않은 것이 현상(現狀)이다.
따라서, 본 발명(III)의 목적은, 용이하게 링상 또는 관강상 등의 입체조직체를 수득할 수 있는 입체조직체의 제작 장치, 및 용이하게 링상 또는 관강상 등의 입체조직체를 수득할 수 있는 입체조직체의 제작 방법을 제공하는 것에 있다.
또한, 본 발명(IV)에 관해, 상기 종래의 방법을 이용해 스페로이드상의 세포구조체를 제조했을 경우, 세포구조체의 바이어빌리티(viability)가 낮은, 소망한 사이즈로 하는 것이 용이하지 않는, 형상을 갖추는 것이 곤란한 등의 문제가 있었다. 특히, 세포구조체의 사이즈나 형상이 고르게 되지 않는 경우에는, 제조한 세포구조체의 분급 작업이 필요하게 되어, 제조 공정이 번잡하게 되고 코스트도 증대하게 된다.
여기서, 본 발명(IV)은, 소망한 사이즈의 형상이 갖춰진 스페로이드상의 세포구조체를 간편하게 제조하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명(V)에 관해, 상기 스페로이드 배양법 등은, 직경 10μm 정도와 사이즈가 작고, 세포간 네트워크가 약한 스페로이드(다수의 세포의 응집체) 밖에 조제할 수 없다고 하는 문제를 가지고 있다.
또한, 상기 U자 바닥의 저접착성 배양접시를 이용하는 수법이나, 행잉드롭법에서는, 대략 진구상의 스페로이드 밖에 수득할 수 없고, 포석 형태나 방추 형태의 세포 고유의 형태를 구비한 스페로이드를 수득할 수 없다.
최근 개발된 상기 특수한 폴리머 및/또는 폴리머 조성물을 이용하는 방법은, 수득되는 세포구조체의 형태를 소망의 형태로 하는 것까지 반드시 도달하는 것은 아니며, 이 방법에 관한 여러 조건을 최적화·호적화하는 여지를 남기고 있다.
그래서, 본 발명(V)은, 세포의 응집 양식을 제어함으로써, 소망한 형태의 세포구조체를 제조하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명(VI)에 관해, 특허 문헌 6에 기재의 방법에서, 심부전 등의 심 질환의 조직의 재현은 검토되지 않고, 심 질환을 시험관 내에서 재현하는 방법이 요구되고 있는 것이 현상이다.
따라서, 본 발명(VI)의 목적은, 심 질환 모델로서 유용한, 심근 세포와 선유아세포를 포함하는 세포구조체를 용이하게 형성하는, 세포구조체의 제조 방법을 제공하는 것에 있다.
또한, 본 발명(VII)에 관해, 특허 문헌 6에 기재의 방법에서, 간부전의 조직의 재현은 검토되지 않고, 간부전을 시험관 내에서 재현하는 방법이 요구되고 있는 것이 현상이다.
따라서, 본 발명(VII)의 목적은, 간부전 모델로서 유용한, 간세포와 선유아세포를 포함하는 세포구조체를 용이하게 형성하는, 세포구조체의 제조 방법을 제공하는 것에 있다.
본 발명(I) ~ (VII)의 요지는 이하와 같다.
본 발명(I)의 연골 세포괴의 제조 방법은, 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물로 피복된 피복배양면에서, 세포괴의 존재하에서, 연골 세포로 분화할 수 있는 세포를 파종하고, 상기 세포괴 및 상기 연골 세포로 분화할 수 있는 세포를 배양함으로써, 연골 세포괴를 조제하는 파종 배양 공정을 포함하는 것을 특징으로 한다.
여기서, 본 발명(I)의 연골 세포괴의 제조 방법에서는, 상기 연골 세포로 분화할 수 있는 세포를 파종하고, 이것을 배양함으로써, 상기 세포괴를 조제하는 것이 바람직하다.
본 발명(I)의 연골 세포괴의 제조 방법에서는, 상기 파종 배양 공정을 복수회 행하는 것이 바람직하다.
본 발명(I)의 연골 세포괴의 제조 방법에서는, 상기 피복배양면은, 세포 비접착성의 벽으로 둘러싸여 있는 것이 바람직하다.
본 발명(I)의 연골 세포괴의 제조 방법에서는, 상기 피복배양면의 폭을 3 mm 이하로 하고, 상기 벽의 높이를 3 mm 이하로 하는 것이 바람직하다.
본 발명(I)의 연골 세포괴의 제조 방법에서는, 상기 피복배양면이 단위면적당 가지는 상기 온도 응답성 폴리머 및 온도 응답성 폴리머 조성물의 양을, 0.1 ~ 3.0μg/㎠로 하는 것이 바람직하다.
본 발명(I)의 연골 세포괴의 제조 방법에서는, 상기 파종 배양 공정에서, 상기 연골 세포로 분화할 수 있는 세포를, 0.3×104 ~ 10.0×105개/㎠의 세포 밀도로 파종하는 것이 바람직하다.
본 발명(I)의 연골 세포괴는, 상기 본 발명의 연골 세포괴의 제조 방법에 의해 제조된 것을 특징으로 한다.
여기서, 본 발명(I)의 연골 세포괴는, 도너츠형인 것이 바람직하다.
본 발명(I)의 이식 재료의 제조 방법은, 상기 본 발명의 연골 세포괴의 존재하에서, 간엽계 세포를 파종하고, 상기 연골 세포괴 및 상기 간엽계 세포를 배양함으로써, 이식 재료를 조제하는, 공정을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명(I)의 이식 재료는, 본 발명의 이식 재료의 제조 방법에 의해 제조된 것을 특징으로 한다.
본 발명(I)의 복합재는, 상기 본 발명의 연골 세포괴가 관상 구조체의 외표면에 설치되어 있는 것을 특징으로 한다.
여기서, 본 발명(I)의 복합재는, 관상 구조체의 내부에 심재가 설치되어 있는 것이 바람직하다.
본 발명(II)은, 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물을 조제하는 조제 공정과, 상기 온도 응답성 폴리머 또는 상기 온도 응답성 폴리머 조성물로 세포배양기의 배양면의 적어도 일부를 피복하여 피복 영역 A를 형성하고, 피복 영역 A를 가지는 피복 세포배양기를 준비하는 배양기 준비 공정과, 상피계 세포를 상기 피복 세포배양기에 파종하는 파종 공정과, 상기 피복 영역 A에 접착한 상기 상피계 세포를 배양하는 배양 공정을 포함하고, 상기 피복 영역 A에서의 상기 온도 응답성 폴리머 또는 상기 온도 응답성 폴리머 조성물의 농도가 0.3 pg/㎟ 이상인 것을 특징으로 하는, 상피계 세포의 배양 방법을 제공한다.
본 실시 형태(II)의 상피계 세포의 배양 방법은, 상기 세포배양기의 배양면의 적어도 일부에 오목부를 가지고 있고, 상기 피복 영역 A 내에 상기 오목부가 있는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명(II)은, 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물을 조제하는 조제 공정과, 상기 온도 응답성 폴리머 또는 상기 온도 응답성 폴리머 조성물로 세포배양기의 배양면의 적어도 일부를 피복하여 피복 영역 A를 형성하고, 피복 영역 A를 가지는 피복 세포배양기를 준비하는 배양기 준비 공정과, 상피계 세포를 상기 피복 세포배양기에 파종하는 파종 공정과, 상기 상피계 세포로부터 괴상의 세포구조체를 형성하고, 상기 피복 영역 A에 접착한 세포구조체를 수득하는 배양 공정을 포함하고, 상기 피복 영역 A에서의 상기 온도 응답성 폴리머 또는 상기 온도 응답성 폴리머 조성물의 농도가 0.3 pg/㎟ 이상인 것을 특징으로 하는, 세포구조체의 제조 방법을 제공한다.
본 실시 형태(II)의 세포구조체의 제조 방법은, 상기 배양기 준비 공정에서, 상기 온도 응답성 폴리머 또는 상기 온도 응답성 폴리머 조성물로, 세포배양기의 배양면의 적어도 일부로서, 상기 피복 영역 A와는 다른 위치에, 피복 영역 B를 형성하고, 상기 피복 영역 B에서의 상기 온도 응답성 폴리머 또는 상기 온도 응답성 폴리머 조성물의 농도가 200 pg/㎟ 미만인 것이 바람직하다.
본 실시 형태(II)의 세포구조체의 제조 방법은, 상기 세포배양기의 배양면의 적어도 일부에 오목부를 가지고 있고, 상기 피복 영역 A 내에 상기 오목부가 있는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명(II)은, 배양면의 적어도 일부에, 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물로 피복된 피복 영역 A를 갖고, 상기 피복 영역 A에서의 상기 온도 응답성 폴리머 또는 상기 온도 응답성 폴리머 조성물의 농도가 0.3 pg/㎟ 이상인 것을 특징으로 하는, 상피계 세포용 세포배양기를 제공한다.
본 실시 형태(II)의 상피계 세포용 세포배양기는, 배양면의 적어도 일부로서, 상기 피복 영역 A와 다른 위치에, 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물로 피복된 피복 영역 B를 갖고, 상기 피복 영역 B에서의 상기 온도 응답성 폴리머 또는 상기 온도 응답성 폴리머 조성물의 농도가 200 pg/㎟ 미만인 것이 바람직하다.
본 실시 형태(II)의 상피계 세포용 세포배양기는, 상기 세포배양기의 배양면의 적어도 일부에 오목부를 가지고 있고, 상기 피복 영역 A 내에 상기 오목부가 있는 것이 바람직하다.
본 발명(III)은, 적어도 1개의 관통공을 가지는 배양면과 상기 관통공을 삽통하는 심봉으로 이루어지는 입체조직체의 제작 장치로서, 상기 배양면에 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물로 피복된 피복배양면을 적어도 1개 포함하고, 1개의 상기 피복배양면의 내측에, 적어도 1개의 상기 관통공을 갖고, 상기 배양면이 상기 심봉의 연재(延在) 방향으로 가동하는 것을 특징으로 하는, 입체조직체의 제작 장치를 제공한다.
상기 입체조직체의 제작 장치는, 복수의 상기 배양면을 갖고, 1개의 상기 심봉이, 상기 복수의 상기 배양면의 상기 관통공을 삽통하고 있는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명(III)은, 상기 입체조직체의 제작 장치를 이용한 입체조직체의 제작 방법으로서, 상기 피복배양면 상에 적어도 1종의 세포를 파종하는 파종 공정과, 파종한 상기 세포를 배양하여 상기 심봉의 주위에 감긴 링상의 입체조직체를 수득하는 배양 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는, 입체조직체의 제작 방법을 제공한다.
상기 입체조직체의 제작 방법은, 심봉의 주위에 감긴 링상의 입체조직체가 수득된 후에, 상기 배양면을 상기 심봉의 연재 방향으로 이동시키는 배양면 이동 공정과, 이동 후의 상기 피복배양면 상에 적어도 1종의 세포를 파종하는 파종 공정과, 파종한 상기 세포를 배양하여 심봉의 주위에 감긴 링상의 상기 입체조직체에 인접하는, 심봉의 주위에 감긴 링상의 입체조직체를 수득하는 배양 공정의 반복을 더 포함하는 것이 바람직하다.
상기 입체조직체의 제작 방법은, 모든 상기 피복배양면에 상기 세포를 파종하고, 파종한 상기 세포를 배양하여 입체조직체를 수득하는 것이 바람직하다.
상기 입체조직체의 제작 방법은, 상기 파종 공정에서 파종한 상기 세포를 포함하는 입체조직체를 수득하는 것이 바람직하다.
상기 입체조직체의 제작 방법은, 상기 배양 공정 후에, 상기 세포를 제거하여 상기 세포로부터 분비된 물질을 포함하는 입체조직체를 수득하는 것이 바람직하다.
상기 입체조직체의 제작 방법은, 상기 물질이 단백질인 것이 바람직하다.
본 발명(IV)의 세포구조체의 제조 방법은, 배양면에 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물로 피복된 피복 영역을 조제하고, 상기 피복 영역에 세포 현탁액의 액적을 형성하고, 상기 액적 중에서 세포 배양을 실시해, 여기서, 상기 피복 영역의 표면 제타 전위를 0 ~ 50 mV로 하는 것을 특징으로 한다.
여기서, 본 발명(IV)의 세포구조체의 제조 방법에서는, 상기 피복 영역에 대한 물의 접촉각을 50 ~ 90°으로 하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명(IV)의 세포구조체의 제조 방법에서는, 상기 배양면에 복수의 상기 피복 영역을 조제하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명(IV)의 세포구조체의 제조 방법에서는, 상기 피복 영역에 복수의 상기 액적을 형성하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명(IV)의 세포구조체의 제조 방법에서는, 각 상기 피복 영역에서, 상기 액적의 바닥 면적을 상기 피복 영역의 면적보다도 작게 하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명(IV)의 세포구조체의 제조 방법에서는, 상기 액적에 포함되는 세포의 수를 3.0×105개/mL 이하로 하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명(IV)의 세포구조체의 제조 방법에서는, 상기 액적의 경(徑)을 1μm ~ 8 mm로 하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명(IV)의 세포구조체의 제조 방법에서는, 상기 액적의 양을 0.5 ~ 50μL로 하는 것이 바람직하다.
본 발명(V)의 요지는 이하와 같다.
본 발명(V)의 세포구조체의 제조 방법은, 세포배양기의 배양면에, 온도 응답성 폴리머 및/또는 온도 응답성 폴리머 조성물로 피복된 제1 피복 영역과 상기 제1 피복 영역의 단부에 설치된, 세포접착성 물질로 피복된 복수의 제2 피복 영역을 준비하는 준비 공정과,
세포를 상기 제1 피복 영역 및 상기 제2 피복 영역에 파종하고, 상기 세포를 배양함으로써, 세포구조체를 조제하는 파종 배양 공정
을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명(V)의 세포구조체의 제조 방법에서는, 상기 배양면을, 세포 비접착성으로 하는 것이 바람직하다.
본 발명(V)의 세포구조체의 제조 방법에서는, 상기 세포접착성 물질을, 라미닌, 콜라겐, 피브로넥틴으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종으로 하는 것이 바람직하다.
본 발명(V)의 세포구조체의 제조 방법에서는, 상기 제1 피복 영역 및 상기 제2 피복 영역이 차지하는 영역을, 세포 비접착성의 벽으로 둘러싸는 것이 바람직하다.
본 발명(V)의 세포구조체의 제조 방법에서는, 상기 제1 피복 영역을, 소정 방향으로 연장되는 형상으로 하고, 상기 제1 피복 영역의 상기 단부를, 상기 소정 방향에 대한 단부로 하는 것이 바람직하다.
본 발명(V)의 세포구조체는, 상기 어느 하나에 기재의 세포구조체의 제조 방법에 의해 제조된 것을 특징으로 한다.
본 발명(V)의 세포는, 배양기 배양면에, 온도 응답성 폴리머 및/또는 온도 응답성 폴리머 조성물로 피복된 제1 피복 영역과, 상기 제1 피복 영역의 단부에 설치된, 세포접착성 물질로 피복된 복수의 제2 피복 영역을 가지는 것을 특징으로 한다.
본 발명(VI)은, 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물을 조제하는 조제 공정과, 상기 온도 응답성 폴리머 또는 상기 온도 응답성 폴리머 조성물로 세포배양기의 배양면을 피복하여 피복 세포배양기를 준비하는 배양기 준비 공정과, 심근 세포와 상기 심근 세포 100개에 대해서 200 ~ 300개의 비율의 선유아세포를 상기 피복 세포배양기에 파종하는 파종 공정과, 파종한 세포를 배양하여 괴상의 세포구조체를 수득하는 배양 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는, 세포구조체의 제조 방법을 제공한다.
상기 파종 공정에서, 혈관 내피세포를 더 파종하는 것이 바람직하다.
상기 파종 공정 이후이고 상기 세포구조체가 수득되기 전에, 면역계 세포를 상기 피복 세포배양기에 더 첨가하는 것이 바람직하다.
상기 면역계 세포가, 마크로파지 및/또는 T세포인 것이 바람직하다.
상기 온도 응답성 폴리머 또는 상기 온도 응답성 폴리머 조성물로 피복된 부분의 면적이 200 ㎟ 이하인 것이 바람직하다.
본 발명(VII)은, 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물을 조제하는 조제 공정과, 상기 온도 응답성 폴리머 또는 상기 온도 응답성 폴리머 조성물로 세포배양기의 배양면을 피복하여 피복 세포배양기를 준비하는 배양기 준비 공정과, 간세포와 상기 간세포 100개에 대해서 10 ~ 50개의 비율의 선유아세포를 상기 피복 세포배양기에 파종하는 파종 공정과, 파종한 세포를 배양하여 괴상의 세포구조체를 수득하는 배양 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는, 세포구조체의 제조 방법을 제공한다.
상기 파종 공정에서, 혈관 내피세포를 더 파종하는 것이 바람직하다.
상기 파종 공정에서, 지방세포를 더 파종하는 것이 바람직하다.
상기 파종 공정에서, 상기 간세포 100개에 대해서 상기 지방세포를 50개의 비율로, 상기 선유아세포 100개에 대해서 상기 지방세포를 100 ~ 500개의 비율로 파종하는 것이 바람직하다.
상기 파종 공정 이후이고 상기 세포구조체가 수득되기 전에, 면역계 세포를 상기 피복 세포배양기에 더 첨가하는 것이 바람직하다.
상기 면역계 세포가, 단구, 과립구, 림프구, 및 마크로파지로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종인 것이 바람직하다.
본 발명에 의하면, 세포괴, 세포구조체, 또는 입체조직체를 효율 좋게 제조하는 방법을 제공할 수 있다.
특히 본 발명(I)에 의하면, 관절, 기관, 코 등의 치료에 유용한 연골 세포괴 및 이식 재료 및 복합재를 간편하게 제조할 수 있다.
또한, 본 발명(II)의 상피계 세포의 배양 방법은, 상기 구성을 가지기 때문에, 세포배양기에 접착하기 어려운 상피계 세포를 용이하게 배양할 수 있다. 또한, 본 발명(II)의 세포구조체의 제조 방법은, 상기 구성을 가지기 때문에, 세포배양기에 접착하기 어려운 상피계 세포를 포함하는 세포구조체를 용이하게 제조할 수 있다. 또한, 본 발명(II)의 상피계 세포용 세포배양기는, 상기 구성을 가지기 때문에, 상피계 세포의 배양 및 그 세포구조체의 제조가 가능하다.
또한, 본 발명(III)의 입체조직체의 제작 장치는, 상기 구성을 가지기 때문에, 용이하게 링상 또는 관강상 등의 입체조직체를 제작할 수 있다. 또한, 본 발명(III)의 입체조직체의 제작 방법에 의하면, 상기 구성을 가지기 때문에, 용이하게 링상 또는 관강상 등의 입체조직체를 제작할 수 있다.
또한, 본 발명(IV)에 의하면, 소망한 사이즈의 형상이 갖춰진 스페로이드상의 세포구조체를 간편하게 제조할 수 있다.
또한, 본 발명(V)에 의하면, 세포의 응집 양식을 제어하여, 소망한 형태의 세포구조체를 제조할 수 있다.
또한, 본 발명(VI)의 세포구조체의 제조 방법은, 상기 구성을 가지기 때문에, 심 질환 모델로서 유용한, 심근 세포와 선유아세포를 포함하는 세포구조체를 용이하게 형성할 수 있다.
또한, 본 발명(VII)의 세포구조체의 제조 방법은, 상기 구성을 가지기 때문에, 간부전 모델로서 유용한, 간세포와 선유아세포를 포함하는 세포구조체를 용이하게 형성할 수 있다.
도 1은, (i) ~ (ｖiii)는, 본 실시 형태(I)에서의 일례의 연골 세포괴의 제조 방법의 개요에 대해 나타내는 도면이다.
도 2는, (i) ~ (ｖi)는, 본 실시 형태(I)에서의 일례의 연골 세포괴의 제조 방법의 개요에 대해 나타내는 도면이다. (iｖ)에서의 괄호 내에는, 구조물의 단면도를 나타낸다.
도 3은, 본 실시 형태(I)에서의, 준비 공정의 변형예 및 이것에 계속해서 파종 배양 공정의 개략도이다. (a)는, 준비 공정의 제1 변형예를 나타내는 도면이고, (b)는, 준비 공정의 제2 변형예를 나타내는 도면이다.
도 4는, 본 실시 형태(I)의 이식 재료의 제조 방법의 개요에 대해 나타내는 도면이다.
도 5는, 본 실시 형태(I)에서의 다른 예의 연골 세포괴의 제조 방법의 개요에 대해 나타내는 도면이다.
도 6은, (i) ~ (ｖ)는, 본 실시 형태(I)에서의 일례의 복합재의 제조 방법의 개요에 대해 나타내는 도면이다.
도 7은, 본 실시 형태(I)의 시험 I-C-1(참고예 I)에서의, 배양 개시부터 24시간 후(1일 후), 2일 후, 6일 후, 10일 후의 세포구조체의 상태를 형광현미경을 이용해 관찰했을 때의 사진을 나타내는 도면이다. 특히, 하측 도면은, 10일 후의 세포구조체의 사진의 일부를 확대해 나타낸 것이다.
도 8은 본 실시 형태(I)의 시험 I-C-1(참고예 I)에서 수득된 세포구조체를 단축 방향 단면으로 절단했을 때의 사진을 나타내는 도면이다.
도 9는, 본 실시 형태(I)의 시험 I-C-2에서의, 배양 개시부터 27시간 후, 44시간 후, 70시간 후, 122시간 후의 세포구조체의 상태를 형광현미경을 이용해 관찰했을 때의 사진을 나타내는 도면이다. 상측 도면은, 폭 2 mm의 도너츠형의 속이 빈 깔개를 이용했을 경우의 세포구조체의 상태를 나타내는 도면이고, 하측 도면은, 폭 2.5 mm의 도너츠형의 속이 빈 깔개를 이용했을 경우의 세포구조체의 상태를 나타내는 도면이다.
도 10은, 본 실시 형태(I)의 시험 I-C-3에서의, 배양 개시부터 8시간 후, 20시간 후, 32시간 후, 42시간 후의 세포구조체의 상태를 형광현미경을 이용해 관찰했을 때의 사진을 나타내는 도면이다. 상측 도면은, 폭 2 mm의 도너츠형의 속이 빈 깔개를 이용했을 경우의 세포구조체의 상태를 나타내는 도면이고, 하측 도면은, 폭 2.5 mm의 도너츠형의 속이 빈 깔개를 이용했을 경우의 세포구조체의 상태를 나타내는 도면이다. 최하측 도면은, 42시간 후의 세포구조체의 상태를 실체현미경을 이용해 관찰했을 때의 사진을 나타내는 도면이다.
도 11의 (a)는, 본 실시 형태(I)의 시험 I-D에서의 배양 개시부터 6일 후의 복합재의 상태를 육안으로 관찰했을 때의 사진을 나타내는 도면이고, 도 11의 (b)는, 본 실시 형태(I)의 시험 I-D에서의 배양 개시부터 21일 후의 복합재의 상태를 육안으로 관찰했을 때의 사진을 나타내는 도면이다.
도 12는, 본 실시 형태(I)의 시험 I-D에서의 배양 개시부터 21일 후의 복합재의 일부의 상태를 육안으로 관찰했을 때의 사진을 확대해 나타내는 도면이다.
도 13은, 본 실시 형태(I)의 시험 I-D에서 조제된 복합재에 대해서 핀셋으로 조작했을 때의 상태를 육안으로 관찰했을 때의 사진을 나타내는 도면이다. (a)는, 무조작시의 외주면, (b)는, 무조작시 내강면, (c)는, 전체에의 압궤(壓潰)시, (d)는, 측면의 일부에의 인장 시의 상태를 나타내는 도면이다.
도 14는, 본 실시 형태(I)의 시험 I-D에서 조제된 복합재를 헤마톡실린·에오신 염색(HE염색)에 제공했을 때의 상태를 현미경을 이용해 관찰했을 때의 사진을 나타내는 도면이다. (a)는, 복합재의 외관 사진을 나타내고, (b)는, (a)의 선A-A에 따르는 면에 의해 절단했을 때의 단면도를 나타내는 도면이고, (c) 및 (d)은, (b)에 나타내는 사진을 부분 확대한 것을 나타내는 도면이다.
도 15는, 본 발명(II)의 일 실시 형태의 세포구조체의 제조 방법을 설명하기 위한 개략도이다.
도 16은, 본 발명(II)의 일 실시 형태의 세포구조체의 제조 방법을 설명하기 위한 개략도이다.
도 17은, 본 발명(II)에서 이용되는 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물 상에서 상피계 세포를 96시간 배양했을 때의 상태를 나타내는 사진이다. 도면 중, 파선으로 둘러싸인 부분은 피복 영역 A를 나타내고, 흑색 테두리 화살표는 피복 영역 A에서 접착·생육하고 있는 세포를 나타내고, 흑색 색칠된 화살표는 비피복 영역에서 접착·생육하고 있는 세포를 나타낸다.
도 18은, 본 발명(III)의 일 실시 형태의 입체조직체의 제작 장치를 설명하기 위한 개략도(사시도)이다.
도 19는, 본 발명(III)의 일 실시 형태의 입체조직체의 제작 장치를 설명하기 위한 개략도(사시도)이다.
도 20은, 본 발명(III)의 일 실시 형태의 입체조직체의 제작 장치를 설명하기 위한 개략도(사시도)이다.
도 21은, 본 발명(III)의 일 실시 형태의 입체조직체의 제작 장치의 사진이다.
도 22는, 본 발명(III)의 일 실시 형태의 입체조직체의 제작 방법을 설명하기 위한 개략도이다.
도 23은, 본 발명(III)의 일 실시 형태의 입체조직체의 제작 방법을 설명하기 위한 개략도이다.
도 24는, 본 발명(III)의 실시예 III-4에서 수득된 링상의 입체조직체의 사진이다.
도 25는, 본 발명(III)의 실시예 III-5에서 수득된 관강상의 입체조직체의 사진이다.
도 26은, 본 발명(III)의 일 실시 형태의 입체조직체의 제작 장치를 설명하기 위한 개략도(사시도)이다.
도 27은, 본 발명(III)의 일 실시 형태의 입체조직체의 제작 방법을 설명하기 위한 개략도이다.
도 28의 (A)는, 본 발명(III)의 실시예 III-8에서 수득된 관강상의 입체조직체의 사진이다. 도 28의 (B)는, 본 발명(III)의 실시예 III-8에서 수득된 관강상의 입체조직체의 HE 염색 절편상이다.
도 29는, 본 발명(III)의 실시예 III-9에서 수득된 인공혈관의 사진이다.
도 30은, 본 발명(III)의 실시예 III-10에서 수득된 인공 기관의 사진이다.
도 31은, 본 발명(III)의 실시예 III-11에서 수득된 단백질을 주성분으로 하는 입체조직체의 사진이다.
도 32는, 본 발명(IV)의 실시 형태의 세포배양체의 제조 방법의 일례의 개략도이다.
도 33의 (i) ~ (iii)는, 본 발명(IV)의 실시 형태의 세포배양체의 제조 방법의 변형예를 나타내는 도면이다.
도 34의 (A) ~ (C)는, 본 발명(IV)의 실시예에서 배양면에서의 액적의 양과 액적의 경(徑)의 상관을 조사한 결과를 나타내는 도면이다.
도 35　(i) ~ (ｖiii)는, 본 실시 형태(V)에서의 일례의 세포구조체의 제조 방법의 개요에 대해 나타내는 도면이다.
도 36　(a) ~ (c)는, 본 실시 형태(V)에서의 제1 피복 영역과 제1 피복 영역의 배치 양태에 대해 나타내는 도면이다.
도 37　본 실시 형태(V)에서의, 준비 공정의 변형예 및 이것에 계속해서 파종 배양 공정의 개략도이다.
도 38　(a)는, 본 실시 형태(V)에서의, 시험 V-C에서, 시험 V-B에서 준비한 제1 피복 영역 및 제2 피복 영역에서 GFP 재조합 루이스 래트의 ADSC를 2시간 배양한 후의 상태를, 현미경을 이용해 관찰했을 때의 사진을 나타내는 도면이다. (b)는, 시험 V-C에서, 시험 V-B에서 준비한 제1 피복 영역 및 제2 피복 영역에서 GFP 재조합 루이스 래트의 ADSC를 20시간 배양한 후의 상태를, 현미경을 이용해 관찰했을 때의 사진을 나타내는 도면이다. (c)는, (b)에 나타내는 세포구조체를 배율을 낮춰 관찰했을 때의 사진을 나타내는 도면이다. (d)는, (b)의 파선으로 나타내는 세포구조체의 상태를 형광현미경을 이용해 관찰했을 때의 사진을 나타내는 도면이다.
도 39는, 본 발명(VI)의 일 실시 형태의 세포구조체의 제조 방법을 설명하기 위한 개략도이다.
도 40은, 본 발명(VI)의 일 실시 형태의 세포구조체의 제조 방법을 설명하기 위한 개략도이다.
도 41은, 본 발명(VII)의 일 실시 형태의 세포구조체의 제조 방법을 설명하기 위한 개략도이다.
도 42는, 본 발명(VII)의 일 실시 형태의 세포구조체의 제조 방법을 설명하기 위한 개략도이다.
본 발명은, 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물로 피복된 배양면에, 세포를 파종하고, 배양하는 것을 특징으로 한다. 구체적으로는, 하기의 발명(I) ~ (VII)를 들 수 있다.
[[발명(I)]]
발명(I)에 관해, 발명자들은 지금까지, 특정의 물성을 구비하고 세포구조체의 제조에 매우 유용한, 온도 응답성 폴리머 및 온도 응답성 폴리머 조성물을 개발하고 있다. 이러한 폴리머 및/또는 폴리머 조성물로 세포배양기의 배양면을 피복하고, 여기에 약 100% 컨플루언트에 상당하는 수의 세포를 파종·배양하면, 세포는 피복물에 접착하고, 그 후, 피복배양면 상에서 한 번에 응집하여, 피복배양면의 중앙 부분에서 세포괴를 형성한다. 이 현상은, 세포간의 네트워크에 의한 수축이, 세포의 피복배양면에의 접착을 웃돌아, 세포가 피복배양면으로부터 박리하기 때문인 것으로 고찰되고 있다.
본 발명(I)의 연골 세포괴 및 이식 재료의 제조 방법은, 이 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물을 이용하는 것이다.
이하, 도면을 참조하여, 본 발명(I)의 연골 세포괴 및 이식 재료의 제조 방법, 및 본 발명(I)의 연골 세포괴 및 이식 재료의 실시 형태에 대해서, 상세하게 예시 설명한다.
(연골 세포괴의 제조 방법)
본 발명(I)의 실시 형태(이하, 「본 실시 형태(I)」라고도 말한다.)의 연골 세포괴의 제조 방법은, 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물로 피복된 피복배양면에서, 세포괴의 존재하에서, 연골 세포로 분화할 수 있는 세포를 파종하고, 세포괴 및 연골 세포로 분화할 수 있는 세포를 공배양함으로써, 연골 세포괴를 조제하는 파종 배양 공정을 포함한다.
호적하게는, 본 실시 형태(I)의 제조 방법은, 온도 응답성 폴리머 및/또는 온도 응답성 폴리머 조성물을 조제하는 조제 공정과, 상기 온도 응답성 폴리머 및/또는 상기 온도 응답성 폴리머 조성물로 배양면의 일부를 피복하여, 피복배양면을 준비하는 준비 공정과, 상기 피복배양면에서, 세포괴의 존재하에서, 연골 세포로 분화할 수 있는 세포를 파종하고, 세포괴 및 연골 세포로 분화할 수 있는 세포를 공배양함으로써, 연골 세포괴를 조제하는 파종 배양 공정을 포함한다.
도 1(i) ~ (ｖiii) 및 도 2(i) ~ (ｖi)에, 본 실시 형태(I)에서의 일례의 연골 세포괴의 제조 방법의 개요에 대해 나타낸다.
이하, 본 실시 형태(I)에서의 일례의 연골 세포괴의 제조 방법에서의 각 공정의 상세를 기재한다.
(조제 공정)
일례의 제조 방법에서는, 우선, 온도 응답성 폴리머 및/또는 온도 응답성 폴리머 조성물을 조제한다(조제 공정).
본 실시 형태(I)에서 이용되는 온도 응답성 폴리머 및 온도 응답성 폴리머 조성물로서는, (A) 2-N, N-디메틸아미노에틸 메타크릴레이트(DMAEMA) 단위와 음이온성 모노머 단위를 포함하는 온도 응답성 폴리머, (B) N-이소프로필 아크릴아미드(NIPAM) 단위와 양이온성 모노머 단위와 음이온성 모노머 단위를 포함하는 온도 응답성 폴리머, (C) 2-N, N-디메틸아미노에틸 메타크릴레이트(DMAEMA) 및/또는 그 유도체의 중합체와 2-아미노-2-히드록시메틸 1, 3-프로판디올(트리스)와, 핵산, 헤파린, 히알루론산, 덱스트란황산, 폴리스티렌 설폰산, 폴리아크릴산, 폴리메타크릴산, 폴리인산, 황산화 다당류, 커드란 및 폴리알긴산 및 이들의 알칼리금속염으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 음이온성 물질을 포함하는 온도 응답성 폴리머 조성물 등을 들 수 있다.
여기서, 상기 (A)로서는, 예를 들면, (A-1) DMAEMA를 물 존재하에서 중합하는 방법에 의해 수득되는 온도 응답성 폴리머, (A-2) 주로 DMAEMA를 포함하는 폴리머 블록(중합쇄 α말단)와, 주로 DMAEMA와 음이온성 모노머를 포함하는 코폴리머 블록(중합쇄 ω말단)을 포함하는, 온도 응답성 폴리머 등을 들 수 있다.
본 실시 형태(I)에서, 이들은, 1종 단독으로 이용해도 좋고, 2종 이상을 조합해 이용해도 좋다.
이하, 상기 (A-1)의 온도 응답성 폴리머 및 그 제조 방법에 대해 기재한다.
(온도 응답성 폴리머의 제조 방법)
(A-1)의 온도 응답성 폴리머의 제조 방법은, 2-N, N-디메틸아미노에틸 메타크릴레이트(DMAEMA)를 포함하는 혼합물을 조제하는 조제 공정과, 혼합물에 자외선을 조사하는 조사 공정을 포함하고, 여기서, 조제 공정에서, 혼합물은 중합금지제 및 물을 더 포함하고, 조사 공정에서, 자외선은 불활성 분위기 하에서 조사되는 것을 특징으로 한다.
(A-1)의 온도 응답성 폴리머의 제조 방법에서는, 우선, 2-N, N-디메틸아미노에틸 메타크릴레이트(DMAEMA)를 포함하는 혼합물을 조제한다(조제 공정). 여기서, 혼합물은, 중합금지제 및 물을 더 포함한다.
2-N, N-디메틸아미노에틸 메타크릴레이트(DMAEMA)로서는, 시판품을 이용할 수 있다. 중합금지제로서는, 메틸 히드로퀴논(MEHQ), 히드로퀴논, p 벤조키노린, N, N-디에틸하이드록실아민, N-니트로소-N-페닐히드록실아민(N-nitroso N-phenylhydroxylamine)(Cupferron), t 부틸히드로퀴논, 등을 들 수 있다. 또한, 시판의 DMAEMA에 포함되는 MEHQ 등을 그대로 이용해도 좋다. 물로서는, 초순수를 들 수 있다.
중합금지제의 상기 혼합물에 대한 질량 비율은, 0.01 ~ 1.5%인 것이 바람직하고, 0.1 ~ 0.5%인 것이 더욱 바람직하다. 상기 범위로 하면, 라디칼 중합반응의 폭주를 억제하여, 제어할 수 없는 가교를 저감할 수 있고, 제조되는 온도 응답성 폴리머의 용매에 대한 용해성을 확보할 수 있다.
물의 상기 혼합물에 대한 질량 비율은, 1.0 ~ 50%인 것이 바람직하고, 9.0 ~ 33%인 것이 더욱 바람직하다. 상기 범위로 하면, 측쇄의 가수분해반응의 반응속도와 중합하는 폴리머쇄의 성장반응의 반응속도를, 밸런스 좋게 조화시킬 수 있다. 이것에 의해, 측쇄가 가수분해된 DMAEMA에 대한, 측쇄가 가수분해되어 있지 않은 DMAEMA의 비율(공중합 비율)이 1.0 ~ 20 정도의 온도 응답성 폴리머를 수득할 수 있다.
그 다음에, (A-1)의 온도 응답성 폴리머의 제조 방법에서는, 혼합물에 자외선을 조사한다(조사 공정). 여기서, 자외선은, 불활성 분위기 하에서, 조사된다. DMAEMA는, 자외선의 조사에 의해, 라디칼 중합하여 폴리머가 된다.
이 공정에서는, 예를 들면, 투명한 밀봉 바이알에, 상기 혼합물을 가해 불활성 가스를 버블링함으로써 바이알 내를 불활성 분위기로 한 후에, 바이알의 외부로부터 자외선 조사장치를 이용해 자외선을 조사한다.
자외선의 파장으로서는, 210 ~ 600 nm인 것이 바람직하고, 360 ~ 380 nm인 것이 더욱 바람직하다. 상기 범위로 하면, 효율적으로 중합반응을 진행시킬 수 있고, 소기의 공중합 비율을 가지는 고분자 재료를 안정적으로 수득할 수 있다. 또한, 제조한 폴리머 재료가 착색하는 것을 막을 수도 있다.
불활성 가스로서는, 질소, 아르곤, 헬륨, 네온 등을 들 수 있다.
반응 조건에 관해서, 온도 조건으로서는, 15 ~ 50℃인 것이 바람직하고, 20 ~ 30℃인 것이 더욱 바람직하다. 상기 범위로 하면, 열에 의한 개시반응을 억제해, 광조사에 의한 개시반응을 우선적으로 진행시킬 수 있다. 또한, 가수분해반응의 반응속도를 폴리머쇄의 성장반응의 반응속도에 대해서 밸런스 좋은 것으로 할 수 있다.
반응 시간으로서는, 7 ~ 24시간인 것이 바람직하고, 17 ~ 21시간인 것이 더욱 바람직하다. 상기 범위로 하면, (A-1)의 온도 응답성 폴리머를 고수율로 수득하고, 또한, 광분해 반응이나 불필요한 가교반응을 억제하면서 라디칼 중합을 행할 수 있다.
또한 조제 공정에서 혼합물이 조제된 후부터 조사 공정에서 자외선의 조사가 개시될 때까지의 시간은, 10분 ~ 1시간인 것이 바람직하다.
혼합물을 첨가한 바이알 내부의 기체를 치환하고, 바이알 내를 불활성 분위기로 할 때, 10분 정도의 시간을 필요로 한다. 그 때문에, 상기 시간을 10분 미만으로 하면, 라디칼 중합에 필요한 불활성 분위기가 수득되지 않을 우려가 있다. 또한, 혼합물 중에서는, DMAEMA의 가수분해반응이, 자외선의 조사가 개시되기 전에 개시된다. 그 때문에, 상기 시간을 1시간 초과로 하면, 라디칼 중합반응에 불활성인 메타크릴산이 혼합물 중에 다수 생겨 버린다.
(A-1)의 온도 응답성 폴리머의 제조 방법에서는, 혼합물에 물이 포함되기 때문에, DMAEMA의 라디칼 중합반응과 폴리 2-N, N-디메틸아미노에틸 메타크릴레이트(PDMAEMA)의 측쇄의 에스테르 결합의 가수분해반응을, 길항(拮抗)시킬 수 있다.
이 길항에 의해, 수득되는 생성물은, 식(I)으로 나타내는 반복 단위(A)
[화 1]
Figure pct00001
, 및 식(II)으로 나타내는 반복 단위(B)
[화 2]
Figure pct00002
를 포함하는 폴리머가 된다.
그 때문에, 폴리머가 가지는 양이온성 관능기, 즉, 디메틸아미노기와 폴리머가 가지는 음이온성 관능기, 즉, 측쇄의 에스테르 결합이 가수분해되어서 생긴 카르복실기의 양방을, 밸런스 좋게 갖출 수 있다. 그리고, (A-1)의 온도 응답성 폴리머의 제조 방법에 의하면, 양이온성 관능기 및 음이온성 관능기를 가지는, 폴리(2-N, N-디메틸아미노에틸 메타크릴레이트) 유래의 폴리머를, 적은 공정으로 간편하게 제조할 수 있다.
또한 (A-1)의 온도 응답성 폴리머의 제조 방법과 동일한 제조 방법은 아니어도, DMAEMA, 중합금지제, 및 물이, 자외선 조사시에 반응계 중에 공존하고 있으면, 본 발명(I)의 온도 응답성 폴리머의 제조 방법의 상기 효과와 마찬가지의 효과를 수득할 수 있다.
예를 들면, DMAEMA 및 중합금지제를 포함하는 혼합물과 물을 따로 따로 준비해, 그 다음에, 혼합물과 물에 불활성 가스를 버블링하고, 그 후, 혼합물과 물을 불활성 분위기 하에서 혼합하는 것과 동시에 자외선을 조사한다고 하는, 온도 응답성 폴리머의 제조 방법도, (A-1)의 온도 응답성 폴리머에 포함할 수 있다.
(온도 응답성 폴리머)
(A-1)의 온도 응답성 폴리머는, 상기 (A-1)의 제조 방법에 의해 제조된다.
여기서, (A-1)의 온도 응답성 폴리머로서는, 수평균분자량(Mn)이, 10 ~ 500 kDa인 분자가 바람직하다. 또한, 중량평균분자량(Mw)과 수평균분자량(Mn)의 비(Mw/Mn)는, 1.1 ~ 10.0인 분자가 바람직하다.
(A-1)의 온도 응답성 폴리머의 분자량은, 자외선의 조사 시간 및 조사 강도의 조건에 따라, 적절히 조정할 수 있다.
(A-1)의 온도 응답성 폴리머에 의하면, 담점(曇点)을, 예를 들면 실온(25℃) 이하로, 저하시킬 수 있다.
상기 (A-1)의 온도 응답성 폴리머에서는, 담점 이상의 온도에서 형성된 온도 응답성 폴리머의 부용화물이, 실온(약 25℃) 조건하에서 재용해할 때까지의 시간이 현저하게 지연된다. 이것은, 수득된 (A-1) 온도 응답성 폴리머는, 분자 내에 양이온성 관능기와 음이온성 관능기가 존재하기 때문에, 높은 자기 응집성을 가지기 때문인 것으로 추정된다.
또한, 이 (A-1)의 온도 응답성 폴리머를 이용하여, 후술한 바와 같이, 배양면에 이 온도 응답성 폴리머가 피복되어 있는 세포배양기를 조제할 수 있다.
또한, (A-1)의 온도 응답성 폴리머에 의하면, 후술한 바와 같이, 세포를 적절한 배양 조건에서 배양함으로써, 관강상(튜브상), 괴상(펠릿상) 등의 구조를 가지는 세포구조체를 형성시킬 수 있다.
(A-1)의 온도 응답성 폴리머가 가지는, 양이온성 관능기(2-N, N-디메틸아미노기)의 관능기 수와 음이온성 관능기(카르복실기)의 관능기 수의 비(C/A비)는, 0.5 ~ 32인 것이 바람직하고, 4 ~ 16인 것이 더욱 바람직하다.
C/A비를 상기 범위로 하면, 담점을 저감시킨다고 하는 상기 효과가 수득되기 쉽다. 상기 C/A비를 가지는 온도 응답성 폴리머에서는, 상기 온도 응답성 폴리머 중에서 양이온성 관능기와 음이온성 관능기가, 이온결합적으로 분자 사이 및/또는 분자 내의 응집에 작용하여, 온도 응답성 폴리머의 응집력이 강해진 결과인 것으로 추측된다.
또한, C/A비를 상기 범위로 하면, 상기 온도 응답성 폴리머 중의 양전하와 음전하의 밸런스를 특히 호적하게 해서, 양전하에 의한 세포상해성을 억제할 수 있고, 또한, 상기 온도 응답성 폴리머의 친수성과 소수성의 밸런스를 특히 호적하게 하고, 세포의 유주나 배향을 일으키기 쉽게 할 수 있는 것으로 추정된다.
이하, 상기 (A-2)의 온도 응답성 폴리머 및 그 제조 방법에 대해 기재한다.
(온도 응답성 폴리머의 제조 방법)
(A-2)의 온도 응답성 폴리머의 제조 방법은, 2-N, N-디메틸아미노에틸 메타크릴레이트(DMAEMA)를 포함하는 제1 혼합물에 자외선을 조사하는 제1 중합 공정과, 제1 중합 공정에서의 중합물의 수평균분자량이 소정치 이상이 된 시점에서, 제1 혼합물에 음이온성 모노머를 첨가해 제2 혼합물을 조제하는 첨가 공정과, 제2 혼합물에 자외선을 조사하는 제2 중합 공정을 포함하는 것을 특징으로 한다.
(A-2)의 온도 응답성 폴리머의 제조 방법에서는, 우선, 2-N, N-디메틸아미노에틸 메타크릴레이트(DMAEMA)를 포함하는 제1 혼합물에 자외선을 조사한다(제1 중합 공정).
여기서, 제1 혼합물은, DMAEMA 이외에, 임의 선택적으로, 예를 들면, 다른 모노머, 용매 등을 포함해도 좋다.
또한, 자외선은, 불활성 분위기 하에서, 조사되어도 좋다.
DMAEMA로서는, 시판품으로 해도 좋다.
제1 혼합물에 포함될 수 있는 다른 모노머로서는, 예를 들면, N, N-디메틸아크릴아미드, 폴리에틸렌글리콜 측쇄를 가지는 아크릴산이나 메타크릴산의 에스테르, N-이소프로필 아크릴아미드, 3-N, N-디메틸아미노프로필 아크릴아미드, 2-N, N-디메틸아미노에틸 메타크릴아미드계 등을 들 수 있고, 특히, 이온 밸런스의 조정을 안정적으로 행하는 것을 가능하게 하는 관점에서, N, N-디메틸아크릴아미드, 폴리에틸렌글리콜 측쇄를 가지는 아크릴산이나 메타크릴산의 에스테르, N-이소프로필 아크릴아미드가 바람직하다. 이들은, 1종 단독으로 이용해도 좋고, 2종 이상을 조합해 이용해도 좋다. 여기서, 다른 모노머의 사용량의 DMAEMA의 사용량에 대한 비율(몰 비율)은, 0.001 ~ 1으로 하는 것이 바람직하고, 0.01 ~ 0.5로 하는 것이 더욱 바람직하다.
용매로서는, 예를 들면, 톨루엔, 벤젠, 클로로포름, 메탄올, 에탄올 등을 들 수 있고, 특히, DMAEMA의 에스테르 결합에 대해서 불활성이기 때문에, 톨루엔, 벤젠이 바람직하다. 이들은, 1종 단독으로 이용해도 좋고, 2종 이상을 조합해 이용해도 좋다.
이 공정에서는, 예를 들면, 투명한 밀봉 바이알에, 상기 제1 혼합물을 가하고, 불활성 가스를 버블링함으로써 바이알 내를 불활성 분위기로 한 후에, 바이알의 외부로부터 자외선 조사장치를 이용해 자외선을 조사한다.
자외선의 파장으로서는, 210 ~ 600 nm인 것이 바람직하고, 360 ~ 380 nm인 것이 더욱 바람직하다. 상기 범위로 하면, 효율 좋게 중합반응을 진행시킬 수 있고, 소기의 공중합 비율을 가지는 고분자 재료를 안정적으로 수득할 수 있다. 또한, 제조한 폴리머 재료가 착색하는 것을 막을 수도 있다.
자외선의 조사 강도로서는, 0.01 ~ 50 mW/㎠인 것이 바람직하고, 0.1 ~ 5 mW/㎠인 것이 더욱 바람직하다. 상기 범위로 하면, 불필요한 화학 결합의 절단 등에 의한 분해를 억제하면서, 안정적으로, 적절한 속도(시간)로 중합반응을 진행시킬 수 있다.
불활성 가스로서는, 질소, 아르곤, 헬륨, 네온 등을 들 수 있다.
온도 조건으로서는, 10 ~ 40℃인 것이 바람직하고, 20 ~ 30℃인 것이 더욱 바람직하다. 상기 범위로 하면, 통상의 실험실의 실온에서 반응을 행할 수 있고, 또한, 광과는 다른 수단(가열 등)에 의해 반응을 억제하는 것이 가능해진다.
반응 시간으로서는, 10분 ~ 48시간인 것이 바람직하고, 60분 ~ 24시간인 것이 더욱 바람직하다.
이 공정에서, DMAEMA는, 자외선의 조사에 의해, 라디칼 중합하고, 폴리머(폴리(2-N, N-디메틸아미노에틸 메타크릴레이트)(PDMAEMA))로 되어, 2-N, N-디메틸아미노에틸 메타크릴레이트를 포함하는 호모폴리머 블록이 형성된다. 다른 모노머도 이용했을 경우에는, DMAEMA와 다른 모노머를 포함하는 폴리머 블록이 형성된다.
그 다음에, (A-2)의 온도 응답성 폴리머의 제조 방법에서는, 제1 중합 공정에서의 중합물(구체적으로는, 폴리머화한 2-N, N-디메틸아미노에틸 메타크릴레이트)의 수평균분자량이 소정치 이상이 된 시점에서, 제1 혼합물에 음이온성 모노머를 첨가해 제2 혼합물을 조제한다(첨가 공정).
여기서, 제2 혼합물은, 제1 중합 공정 후의 제1 혼합물, 및 음이온성 모노머 이외로, 예를 들면, 다른 모노머, 전술의 제1 혼합물에 포함될 수 있는 용매(톨루엔, 벤젠, 메탄올 등) 등을 포함해도 좋다.
또한, 음이온성 모노머는, 불활성 분위기 하에서, 첨가되어도 좋다.
음이온성 모노머로서는, 예를 들면, 아크릴산, 메타크릴산, 측쇄에 카르복실기, 설폰산기 및 인산기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 기를 가지는 비닐 유도체 등을 들 수 있고, 특히, 화학적 안정성의 관점에서, 아크릴산, 메타크릴산이 바람직하다.
이들은, 1종 단독으로 이용해도 좋고, 2종 이상을 조합해 이용해도 좋다.
제2 혼합물에 포함될 수 있는 다른 모노머로서는, 예를 들면, N, N-디메틸아크릴아미드, 폴리에틸렌글리콜 측쇄를 가지는 아크릴산이나 메타크릴산의 에스테르, N-이소프로필 아크릴아미드, 3-N, N-디메틸아미노프로필 아크릴아미드, 2-N, N-디메틸아미노에틸 메타크릴아미드 등을 들 수 있고, 특히, 전기적으로 중성이고, 친수성인, N, N-디메틸아크릴아미드가 바람직하다. 이들은, 1종 단독으로 이용해도 좋고, 2종 이상을 조합해 이용해도 좋다. 여기서, 다른 모노머의 사용량의 DMAEMA의 사용량에 대한 비율(몰)은, 0.01 ~ 10으로 하는 것이 바람직하고, 0.1 ~ 5로 하는 것이 더욱 바람직하다.
이 공정에서는, 예를 들면, 바이알에 불활성 가스를 플로우시킴으로써 바이알 내를 불활성 분위기로 유지하면서, 상기 제2 혼합물을 첨가한다.
수평균분자량의 소정치는, 담점 저감의 효과를 충분히 수득하는 관점에서, 호적하게는 5,000이고, 더욱 호적하게는 20,000이고, 특히 호적하게는 100,000이다.
또한 제1 중합 공정 후의 제1 혼합물 중에서의 폴리머화한 PDMAEMA의 수평균분자량은, 소정의 시점에서 중합계로부터 소량의 반응 혼합물을 채취하고, 겔침투크로마토그래피(GPC)나 광산란법(SLS) 등의 당업자에게 주지의 방법에 의해 측정할 수 있다.
이 공정에서, 중합 중의 DMAEMA를 포함하는 호모폴리머 외에, 음이온성 모노머도 중합계에 포함할 수 있게 되고, 바이알 내의 중합계가, DMAEMA의 단독중합계로부터, DMAEMA와 음이온성 모노머의 공중합계로, 바뀌게 된다.
그리고, (A-2)의 온도 응답성 폴리머의 제조 방법에서는, 제2 혼합물에 자외선을 조사한다(제2 중합 공정).
여기서, 자외선은, 불활성 분위기 하에서, 조사되어도 좋다.
이 공정에서는, 예를 들면, 제2 혼합물을 첨가한 후의 바이알의 외부로부터 자외선 조사장치를 이용해 자외선을 조사한다.
제2 중합 공정에서의, 자외선의 파장, 자외선의 조사 강도, 이용하는 불활성 가스, 반응 온도, 반응 시간 등의 여러 조건은, 제1 중합 공정에서의 조건과 마찬가지로 해도 좋다.
이 공정에서, DMAEMA와 음이온성 모노머가, 자외선의 조사에 의해, 라디칼 중합하여, 제1 중합 공정에서 형성한 DMAEMA를 포함하는 호모폴리머 블록의 중합쇄 α말단에 연속하는 형태로, DMAEMA와 음이온성 모노머를 포함하는 코폴리머 블록이 형성된다. 다른 모노머도 이용했을 경우에는, DMAEMA와 음이온성 모노머와 다른 모노머를 포함하는 코폴리머 블록이 형성된다.
상기와 같이, DMAEMA를 포함하는 호모폴리머 블록, 및 DMAEMA와 음이온성 모노머의 코폴리머 블록을 포함하는 온도 응답성 폴리머가 수득될 수 있다.
또한 (A-2)의 제조 방법에서는, 당업자에게 이해되는 바와 같이, 다양한 분자량 및 분자구조를 가지는 폴리머의 혼합물이 생성할 때, DMAEMA를 포함하는 호모폴리머 블록, 및 DMAEMA와 음이온성 모노머의 코폴리머 블록을 포함하는 온도 응답성 폴리머를 주성분으로서 수득하는 관점에서, 제1 중합 공정, 첨가 공정, 및 제2 중합 공정에 걸쳐 동일한 조건하에서 중합을 행하는 것이 바람직하다.
(온도 응답성 폴리머)
(A-2)의 온도 응답성 폴리머는, 상기 (A-2)의 제조 방법에 의해 제조된다.
(A-2)의 온도 응답성 폴리머는, 주로 2-N, N-디메틸아미노에틸 메타크릴레이트를 포함하고, 임의 선택적으로 디메틸아크릴아미드, 폴리에틸렌글리콜 측쇄를 가지는 아크릴산이나 메타크릴산 등의 친수성 모노머 등의 다른 모노머 단위를 포함하는 폴리머 블록(중합쇄 α말단)과 주로 2-N, N-디메틸아미노에틸 메타크릴레이트와 음이온성 모노머(중합쇄 ω말단)를 포함하고, 임의 선택적으로 다른 모노머 단위를 포함하는 코폴리머 블록을 포함한다.
호적하게는, (A-2)의 온도 응답성 폴리머는, DMAEMA의 호모폴리머 블록, 및 DMAEMA와 음이온성 모노머의 코폴리머 블록을 포함하고, 더욱 호적하게는, 이러한 블록으로 이루어진다.
여기서, (A-2)의 온도 응답성 폴리머로서는, 중합쇄 α말단의 폴리머 블록(예를 들면, DMAEMA의 호모폴리머 블록)의 수평균분자량이 5000 Da 이상인 것이 바람직하고, 20000 Da 이상인 것이 더욱 바람직하다.
(A-2)의 온도 응답성 폴리머로서는, 수평균분자량(Mn)이, 10 ~ 500 kDa인 분자가 바람직하다. 또한, 중량평균분자량(Mw)과 수평균분자량(Mn)의 비(Mw/Mn)는, 1.1 ~ 10.0인 분자가 바람직하다.
온도 응답성 폴리머의 분자량은, 자외선의 조사 시간 및 조사 강도의 조건에 따라, 적절히 조정할 수 있다.
(A-2)의 온도 응답성 폴리머에 의하면, 담점을, 예를 들면 실온(25℃) 이하에, 저하시킬 수 있다.
상기 (A-2)의 온도 응답성 폴리머에서는, 담점 이상의 온도에서 형성된 온도 응답성 폴리머의 부용화물이, 실온(약 25℃) 조건하에서 재용해할 때까지의 시간이 현저하게 지연된다. 이것은, 수득된 온도 응답성 폴리머는, 분자 내에 양이온성 관능기와 음이온성 관능기가 존재하기 때문에, 높은 자기 응집성을 가지기 때문인 것으로 추정된다.
특히, (A-2)의 온도 응답성 폴리머는, 중합쇄 α말단에, 고분자량(예를 들면, 5000 Da 이상)을 가지는 DMAEMA의 호모폴리머 블록을 구비하기 때문에, DMAEMA의 측쇄의 온도 의존적인 글로뷸 전이가 생기기 쉽고, 담점을 효과적으로 저감하는 것이 가능해진다고 생각된다.
또한, 이 온도 응답성 폴리머를 이용하여, 후술한 바와 같이, 배양면에 이 온도 응답성 폴리머를 피복하여 이루어지는 세포배양기를 조제할 수 있다.
또한, (A-2)의 온도 응답성 폴리머에 의하면, 후술한 바와 같이, 세포를 적절한 배양 조건에서 배양함으로써, 관강상(튜브상)이나 괴상(펠릿상) 등의 구조를 가지는 세포구조체를 형성시킬 수 있다.
(A-2)의 온도 응답성 폴리머가 가지는, 양이온성 관능기(2-N, N-디메틸아미노기)의 관능기 수와 음이온성 관능기(카르복실기)의 관능기 수의 비(C/A비)는, 0.5 ~ 32인 것이 바람직하고, 4 ~ 16인 것이 더욱 바람직하다.
C/A비를 상기 범위로 하면, 담점을 저감시킨다고 하는 상기 효과가 수득되기 쉽다. 상기 C/A비를 가지는 온도 응답성 폴리머에서는, 상기 온도 응답성 폴리머 중에서 양이온성 관능기와 음이온성 관능기가, 이온결합적으로 분자 사이 및/또는 분자 내의 응집에 작용하여, 온도 응답성 폴리머의 응집력이 강해진 결과인 것으로 추측된다.
또한, C/A비를 상기 범위로 하면, 상기 온도 응답성 폴리머 중의 양전하와 음전하의 밸런스를 특히 호적하게 해서, 양전하에 의한 세포상해성을 억제할 수 있고, 또한, 상기 온도 응답성 폴리머의 친수성과 소수성의 밸런스를 특히 호적하게 해서, 세포의 유주나 배향을 일으키기 쉽게 할 수 있는 것으로 추정된다.
이하, 상기 (B)의 온도 응답성 폴리머 및 그 제조 방법에 대해 기재한다.
(온도 응답성 폴리머의 제조 방법)
(B)의 온도 응답성 폴리머의 제조 방법은, N-이소프로필 아크릴아미드(NIPAM)(이하, 「모노머(A)」라고도 말한다.)와 양이온성 모노머(이하, 「모노머(B)」라고도 말한다.)와 음이온성 모노머(이하, 「모노머(C)」라고도 말한다.)를 중합시키는 것이다. 임의 선택적으로, 상기 3 종류의 모노머에 이것들 이외의 다른 모노머를 가해 중합시켜도 좋다.
N-이소프로필 아크릴아미드(NIPAM)로서는, 시판품으로 해도 좋다.
양이온성 모노머로서는, 양이온성 관능기를 가지는 모노머를 들 수 있고, 양이온성 관능기로서는, 제1급 ~ 제4급 아미노기 등의 아미노기, 구아니딘 기 등을 들 수 있고, 특히, 화학적 안정성, 저세포상해성, 멸균 안정성, 강양전하성의 관점에서, 제3급 아미노기가 바람직하다.
보다 구체적으로는, 양이온성 모노머로서는, 생리활성물질을 담지하거나 알칼리성 조건하에 두거나 해도, 안정성이 높은 것이 바람직하고, 예를 들면, 3-(N, N-디메틸아미노프로필)-(메타) 아크릴아미드, 3-(N, N-디메틸아미노프로필)-(메타) 아크릴레이트, 아미노스티렌, 2-(N, N-디메틸아미노에틸)-(메타) 아크릴아미드, 2-(N, N-디메틸아미노에틸)-(메타) 아크릴레이트 등을 들 수 있다.
이들 중에서, 특히, 3-(N, N-디메틸아미노프로필) 아크릴아미드는, 높은 양전하 강도를 가지기 때문에, 음이온성 물질의 담지를 용이하게 하기 때문에, 바람직하다.
또한, 아미노스티렌은, 높은 양전하 강도를 가지기 때문에 음이온성 물질의 담지를 용이하게 함과 더불어, 분자 내의 방향환이 수용액 중에서 다른 물질의 소수성 구조와 상호작용하기 때문에 담지 가능한 음이온성 물질의 바리에이션을 넓히므로, 바람직하다.
또한, 2-(N, N-디메틸아미노에틸) 메타크릴아미드는, 중성 역의 pH로 미약한 양전하를 가지고, 물에의 용해성이 온도에 영향을 받지 않기 때문에, 한 번 담지한 음이온성 물질의 방출을 용이하게 하므로, 바람직하다.
이들은, 1종 단독으로 이용해도 좋고, 2종 이상을 조합해 이용해도 좋다.
음이온성 모노머로서는, 음이온성 관능기를 가지는 모노머를 들 수 있고, 음이온성 관능기로서는, 카르복실산기, 설폰산기, 황산기, 인산기, 보론산 기 등을 들 수 있고, 특히, 화학적 안정성, 세포 친화성, 높은 정제도의 관점에서, 카르복실산기, 설폰산기, 인산기가 바람직하다.
보다 구체적으로는, 아크릴산, 메타크릴산, 비닐 안식향산, 등을 들 수 있고, 특히, 화학적 안정성, 세포 친화성의 관점에서, 메타크릴산, 비닐 안식향산이 바람직하다.
이들은, 1종 단독으로 이용해도 좋고, 2종 이상을 조합해 이용해도 좋다.
다른 모노머로서는, 예를 들면, 디메틸아크릴아미드, 폴리에틸렌글리콜 측쇄를 가지는 아크릴산이나 메타크릴산 등의 중성의 친수성 모노머 등을 들 수 있다.
이들은, 1종 단독으로 이용해도 좋고, 2종 이상을 조합해 이용해도 좋다.
다른 모노머는, 전하 이외의 친수성·소수성의 밸런스의 조정에 사용 가능하고, 바리에이션을 넓히는 것이 가능해진다.
여기서, (B)의 온도 응답성 폴리머의 제조 방법에서의 NIPAM의 사용량, 양이온성 모노머의 사용량, 다른 모노머의 사용량 각각의, 모노머(A) ~ (C)의 합계의 사용량에 대한 비율(몰)은, 모노머의 중합반응에서의 반응성을 고려하여, 소망한 모노머 성분의 비율을 수득할 수 있도록, 당업자가 적절히 조정할 수 있다.
여기서, 중합 방법으로서는, 라디칼 중합, 이온중합 등을 들 수 있다.
라디칼 중합으로서는, 리빙라디컬중합이 바람직하고, 리빙라디컬중합으로서는, 가역적 부가개열 연쇄이동(RAFT) 중합, 원자이동 라디칼 중합(ATRP), 이니퍼터 중합 등을 들 수 있고, 이니퍼터 중합이 바람직하다.
이온중합으로서는, 리빙 음이온중합이 바람직하다.
(B)의 온도 응답성 폴리머의 제조 방법의 일례는, 라디칼 중합을 이용하는 방법이다.
이 제조 방법의 일례는, N-이소프로필 아크릴아미드(NIPAM)를 포함하는 제1 혼합물에 자외선을 조사하는 제1 중합 공정과, 제1 혼합물에, 양이온성 모노머와 음이온성 모노머를 첨가해 제2 혼합물을 조제하는 첨가 공정과, 제2 혼합물에 자외선을 조사하는 제2 중합 공정을 포함한다.
이 제조 방법의 일례에서는, 우선, N-이소프로필 아크릴아미드(NIPAM)를 포함하는 제1 혼합물에 자외선을 조사한다(제1 중합 공정).
여기서, 제1 혼합물은, NIPAM 이외에, 임의 선택적으로, 예를 들면, 다른 모노머, 용매, 연쇄이동제, 안정제, 계면활성제 등을 포함해도 좋다.
또한, 자외선은, 불활성 분위기 하에서, 조사되어도 좋다.
이 공정에서는, 예를 들면, 투명한 밀봉 바이알에, 상기 제1 혼합물을 가하고, 불활성 가스를 버블링함으로써 바이알 내를 불활성 분위기로 한 후에, 바이알의 외부로부터 자외선 조사장치를 이용해 자외선을 조사한다.
용매로서는, 예를 들면, 벤젠, 톨루엔, 클로로포름, 메탄올, 물 등을 들 수 있고, 특히, 용해력의 점, 및 중합에 불활성인 점에서, 벤젠, 톨루엔이 바람직하다. 이들은, 1종 단독으로 이용해도 좋고, 2종 이상을 조합해 이용해도 좋다.
이 공정에서는, 예를 들면, 투명한 밀봉 바이알에, 상기 제1 혼합물을 가해 불활성 가스를 버블링함으로써 바이알 내를 불활성 분위기로 한 후에, 바이알의 외부로부터 자외선 조사장치를 이용해 자외선을 조사한다.
자외선의 파장으로서는, 210 ~ 600 nm인 것이 바람직하고, 360 ~ 380 nm인 것이 더욱 바람직하다. 상기 범위로 하면, 효율 좋게 중합반응을 진행시킬 수 있고, 소기의 공중합 비율을 가지는 고분자 재료를 안정적으로 수득할 수 있다. 또한, 제조한 폴리머 재료가 착색하는 것을 막을 수도 있다.
자외선의 조사 강도로서는, 0.01 ~ 50 mW/㎠인 것이 바람직하고, 0.1 ~ 5 mW/㎠인 것이 더욱 바람직하다.
불활성 가스로서는, 질소, 아르곤, 헬륨, 네온 등을 들 수 있다.
온도 조건으로서는, 10 ~ 40℃인 것이 바람직하고, 20 ~ 30℃인 것이 더욱 바람직하다. 상기 범위로 하면, 통상의 실험실의 실온에서 중합반응을 행하는 것을 가능하게 할 수 있고, 또한, 광조사의 수단과는 다른 가열 수단으로의 반응 제어를 가능하게 할 수도 있다.
반응 시간으로서는, 반응 시간으로서는, 10분 ~ 48시간인 것이 바람직하고, 60분 ~ 24시간인 것이 더욱 바람직하다.
이 공정에서, NIPAM는, 자외선의 조사에 의해, 라디칼 중합하고, 폴리머(폴리(N-이소프로필 아크릴아미드)(PNIPAM))로 되어, N-이소프로필 아크릴아미드를 포함하는 호모폴리머 블록이 형성된다. 다른 모노머도 이용했을 경우에는, NIPAM와 다른 모노머를 포함하는 폴리머 블록이 형성된다.
그 다음에, (B)의 온도 응답성 폴리머의 제조 방법에서는, 제1 중합 공정 후의 제1 혼합물에 양이온성 모노머와 음이온성 모노머를 첨가해 제2 혼합물을 조제한다(첨가 공정).
여기서, 제2 혼합물은, 제1 중합 공정 후의 제1 혼합물, 양이온성 모노머, 및 음이온성 모노머 이외에, 예를 들면, 다른 모노머, 용매, 연쇄이동제, 안정제, 계면활성제 등을 포함해도 좋다.
또한, 양이온성 모노머와 음이온성 모노머는, 불활성 분위기 하에서, 첨가되어도 좋다.
이 공정에서는, 예를 들면, 바이알에 불활성 가스를 플로우시킴으로써 바이알 내를 불활성 분위기로 유지하면서, 상기 양이온성 모노머와 음이온성 모노머를 첨가한다.
이 공정에서, 중합 중의 NIPAM를 포함하는 호모폴리머 외에, 양이온성 모노머 및 음이온성 모노머도 중합계에 포함할 수 있게 되어, 바이알 내의 중합계가, NIPAM의 단독중합계로부터, NIPAM와 양이온성 모노머와 음이온성 모노머의 공중합계로, 바뀌게 된다.
그리고, (B)의 온도 응답성 폴리머의 제조 방법에서는, 제2 혼합물에 자외선을 조사한다(제2 중합 공정).
여기서, 자외선은, 불활성 분위기 하에서, 조사되어도 좋다.
이 공정에서는, 예를 들면, 양이온성 모노머와 음이온성 모노머를 첨가한 후의 바이알의 외부로부터 자외선 조사장치를 이용해 자외선을 조사한다.
자외선의 파장으로서는, 210 ~ 600 nm인 것이 바람직하고, 360 ~ 380 nm인 것이 더욱 바람직하다. 상기 범위로 하면, 효율 좋게 중합반응을 진행시킬 수 있고, 소기의 공중합 비율을 가지는 고분자 재료를 안정적으로 수득할 수 있다. 또한, 제조한 폴리머 재료가 착색하는 것을 막을 수도 있다.
자외선의 조사 강도로서는, 0.01 ~ 50 mW/㎠인 것이 바람직하고, 0.1 ~ 5 mW/㎠인 것이 더욱 바람직하다.
불활성 가스로서는, 질소, 아르곤, 헬륨, 네온 등을 들 수 있다.
온도 조건으로서는, 10 ~ 40℃인 것이 바람직하고, 20 ~ 30℃인 것이 더욱 바람직하다. 상기 범위로 하면, 통상의 실험실의 실온에서 중합반응을 행하는 것을 가능하게 할 수 있고, 또한, 광조사의 수단과는 다른 가열 수단으로의 반응 제어를 가능하게 할 수도 있다.
반응 시간으로서는, 반응 시간으로서는, 10분 ~ 48시간인 것이 바람직하고, 60분 ~ 24시간인 것이 더욱 바람직하다.
이 공정에서, NIPAM와 양이온성 모노머와 음이온성 모노머가, 자외선의 조사에 의해, 라디칼 중합하고, 제1 중합 공정에서 형성한 NIPAM를 포함하는 호모폴리머 블록의 중합쇄 α말단에 연속하는 형태로, NIPAM와 양이온성 모노머와 음이온성 모노머를 포함하는 코폴리머 블록이 형성된다. 다른 모노머도 이용했을 경우에는, NIPAM와 다른 모노머를 포함하는 폴리머 블록, 및/또는 NIPAM와 양이온성 모노머와 음이온성 모노머와 다른 모노머를 포함하는 코폴리머 블록이 형성된다.
상기와 같이, NIPAM를 포함하는 호모폴리머 블록, 및 NIPAM와 양이온성 모노머와 음이온성 모노머의 코폴리머 블록을 포함하는 온도 응답성 폴리머가 수득된다.
또한 이 일례의 제조 방법에서는, 효율적인 반응을 실현하는 관점에서, 제1 중합 공정, 첨가 공정, 및 제2 중합 공정에 걸쳐 자외선을 조사하는 것이 바람직하다.
(B)의 온도 응답성 폴리머의 제조 방법의 다른 예는, 라디칼 중합을 이용하는 방법으로, N-이소프로필 아크릴아미드(NIPAM), 양이온성 모노머, 음이온성 모노머, 및 임의 선택적으로 다른 모노머를 포함하는 혼합물에 자외선을 조사한다.
여기서, 상기 혼합물은, 예를 들면, 용매, 연쇄이동제, 안정제, 계면활성제 등을 포함해도 좋다.
또한, 자외선은, 불활성 분위기 하에서, 조사되어도 좋다.
다른 조건에 대해서는, 전술의 일례의 제조 방법과 마찬가지로 해도 좋다.
또한, 이니퍼터(iniferter) 중합을 이용하는 경우, 이니퍼터로서 벤질-(N, N-디에틸) 디티오카르바메이트를, 용매로서 톨루엔 등을 이용해 좋고, 근자외선의 조사에 의해 리빙중합을 행해도 좋다. 여기서, 1회째의 모노머에 의한 중합 후, 단리조작을 거치고, 2회째의 모노머에 의한 중합을 행함으로써, 블록공중합체를 수득할 수 있다.
또한, 이온중합을 이용하는 경우, 촉매로서 NaOH 분말을, 용매로서 정제에 이용되는 재침전용 용매와 함께 비프로톤계 용매를 이용해도 좋다. 1회째의 모노머에 의한 중합 후, 재침전 조작(이 조작 후에도 ω말단에 이온종이 남는다)을 거치고, 2회째의 모노머에 의한 중합을 행함으로써, 블록공중합체를 수득할 수 있다.
(온도 응답성 폴리머)
(B)의 온도 응답성 폴리머는, 상기 (B)의 제조 방법에 의해 제조된다.
(B)의 온도 응답성 폴리머는, N-이소프로필 아크릴아미드(NIPAM) 단위, 양이온성 모노머 단위, 및 음이온성 모노머 단위를 포함하고, 임의 선택적으로, 다른 모노머 단위를 포함한다. 본 폴리머는, 전술의 일례, 다른 예의 제조 방법에 의해 제조할 수 있다.
호적하게는, (B)의 온도 응답성 폴리머는, 주로 N-이소프로필 아크릴아미드(NIPAM) 단위를 포함하고, 임의 선택적으로 다른 모노머 단위를 포함하는 폴리머 블록(중합쇄 α말단), 주로 양이온성 모노머 단위, 및 음이온성 모노머 단위를 포함하고, 임의 선택적으로 다른 모노머 단위를 포함하는 코폴리머 블록을 포함한다. 더욱 호적하게는, (B)의 온도 응답성 폴리머는, NIPAM의 호모폴리머 블록, 및 NIPAM와 양이온성 모노머와 음이온성 모노머의 코폴리머 블록을 포함하고, 특히 호적하게는, 이러한 블록으로 이루어진다. 본 폴리머는, 전술의 일례의 제조 방법에 의해 제조할 수 있다.
종래의 온도 응답성 폴리머 중 하나(일본 특허공개 2014-162865호 공보 참조)에서는, 폴리머에 온도 응답성을 제공하는 DMAEMA가, 동시에, (음이온성 모노머와 함께) 세포구조체의 형성에 필요한 양이온성 모노머이고, 또한, 온도 응답성에 관련되는 DMAEMA는, 폴리머 블록으로서 중합쇄 α말단에 포함되어 있다.
이러한 온도 응답성 폴리머에서는, 중합쇄 α말단에 반드시 양이온성 모노머가 존재하기 때문에, 중합쇄 중에서의 양이온성 사이트의 위치의 조정의 자유도가 높지는 않고, 또한, 양이온성 모노머가 주로 DMAEMA에 한정되기 때문에, 양이온성 사이트의 양전하 강도의 조정이나, 온도 응답성 폴리머 수용액의 pH의 조정도 반드시 용이하다고는 말할 수 없었다.
그리고, 상기 온도 응답성 폴리머를, 예를 들면, 온도 응답성 폴리머를 약물 송달(DDS)에 이용했을 경우, 담지 가능한 약제의 종류나 양이 한정될 가능성이 있었다. DDS의 수법으로서는, 예를 들면, 세포배양기에 약제를 담지시킨 온도 응답성 폴리머를 도포하고, 도포 후의 세포배양기에서 세포나 조직을 배양함으로써, 피복물로부터 세포·조직에 대해서 약제를 서방한다고 하는 수법 등을 들 수 있다. 여기서, 상기 종래의 온도 응답성 폴리머에서는, 양전하 강도가 작은 DMAEMA를 포함하기 때문에, 음이온성 물질의 약제의 담지가 반드시 용이하다고 말할 수 없고, 담지 가능한 약제의 종류나 양이 한정될 가능성이 있었다.
한편, (B)의 온도 응답성 폴리머에서는, 폴리머에 온도 응답성을 제공하는 NIPAM는 중성의 모노머이고, (음이온성 모노머와 함께) 세포구조체의 형성에 필요한 양이온성 모노머는 NIPAM와는 다른 모노머이다.
(B)의 온도 응답성 폴리머에서는, 중합쇄 α말단에 반드시 양이온성 모노머가 존재할 필요는 없고, 중합쇄 중에서의 양이온성 사이트의 위치를 자유롭게 조정하는 것이 가능하고, 또한, 광범위한 양이온성 모노머를 이용할 수 있기 때문에, 양이온성 사이트의 양전하 강도나 온도 응답성 폴리머 수용액의 pH를 용이하게 조정하는 것이 가능하다.
(B)의 온도 응답성 폴리머에 의하면, 예를 들면, 온도 응답성 폴리머를 약물 송달(DDS)에 이용했을 경우, 담지 가능한 약제의 종류를 확대하면서, 그 양을 증가시키는 것이 가능해지고, 나아가서는, 온도 응답성 폴리머의 응용범위를 확대할 수 있다.
(B)의 온도 응답성 폴리머에서는, NIPAM 단위의, NIPAM 단위, 양이온성 모노머 단위, 음이온성 모노머 단위의 합계에 대한 비율(몰)이, 0.6 ~ 0.9인 것이 바람직하고, 0.7 ~ 0.9인 것이 더욱 바람직하고, 0.9인 것이 특히 바람직하다.
다른 모노머도 이용했을 경우에는, 다른 모노머 단위의, NIPAM 단위, 양이온성 모노머 단위, 음이온성 모노머 단위의 합계에 대한 비율(몰)이, 0.001 ~ 0.2인 것이 바람직하고, 0.01 ~ 0.1인 것이 더욱 바람직하다.
(B)의 온도 응답성 폴리머로서는, 중합쇄 α말단의 폴리머 블록(예를 들면, NIPAM의 호모폴리머 블록)의 수평균분자량이 5000 Da 이상인 것이 바람직하고, 20000 Da 이상인 것이 더욱 바람직하다.
(B)의 온도 응답성 폴리머로서는, 수평균분자량(Mn)이, 10 ~ 500 kDa인 분자가 바람직하다. 또한, 중량평균분자량(Mw)과 수평균분자량(Mn)의 비(Mw/Mn)는, 1.1 ~ 10.0인 분자가 바람직하다.
온도 응답성 폴리머의 분자량은, 중합조건에 따라, 적절히 조정할 수 있다.
(B)의 온도 응답성 폴리머에 의하면, 담점을, 예를 들면 실온(25℃) 이하로, 저하시킬 수 있다.
상기 온도 응답성 폴리머에서는, 담점 이상의 온도에서 형성된 온도 응답성 폴리머의 부용화물이, 실온(약 25℃) 조건하에서 재용해할 때까지의 시간이 현저하게 지연된다. 이것은, 수득된 온도 응답성 폴리머는, 분자 내에 양이온성 관능기와 음이온성 관능기가 존재하기 때문에, 높은 자기 응집성을 가지기 때문인 것으로 추정된다.
특히, 전술의 (B)의 온도 응답성 폴리머는, 중합쇄 α말단에, 고분자량을 가지는 NIPAM의 호모폴리머 블록을 구비하기 때문에, NIPAM의 측쇄의 온도 의존적인 글로뷸 전이가 생기기 쉽고, 담점을 효과적으로 저감하는 것이 가능해진다고 생각된다.
또한, 이 온도 응답성 폴리머를 이용하여, 후술한 바와 같이, 배양면에 이 온도 응답성 폴리머를 피복하여 이루어지는 세포배양기를 조제할 수 있다.
또한, (B)의 온도 응답성 폴리머에 의하면, 후술한 바와 같이, 세포를 적절한 배양 조건에서 배양함으로써, 관강상(튜브상)이나 괴상(펠릿상) 등의 구조를 가지는 세포구조체를 형성시킬 수 있다.
(B)의 온도 응답성 폴리머가 가지는, 양이온성 관능기의 관능기 수와 음이온성 관능기의 관능기 수의 비(C/A비)는, 0.5 ~ 32인 것이 바람직하고, 4 ~ 16인 것이 더욱 바람직하다.
C/A비를 상기 범위로 하면, 담점을 저감시킨다고 하는 상기 효과가 수득되기 쉽다. 상기 C/A비를 가지는 온도 응답성 폴리머에서는, 상기 온도 응답성 폴리머 중에서 양이온성 관능기와 음이온성 관능기가, 이온결합적으로 분자 사이 및/또는 분자 내의 응집에 작용하여, 온도 응답성 폴리머의 응집력이 강해진 결과인 것으로 추측된다.
또한, C/A비를 상기 범위로 하면, 상기 온도 응답성 폴리머 중의 양전하와 음전하의 밸런스를 특히 호적하게 해서, 양전하에 의한 세포상해성을 억제할 수 있고, 또한, 상기 온도 응답성 폴리머의 친수성과 소수성의 밸런스를 특히 호적하게 해서, 세포의 유주나 배향을 일으키기 쉽게 할 수 있는 것으로 추정된다.
이하, 상기 (C)의 온도 응답성 폴리머 및 그 제조 방법에 대해 기재한다.
(온도 응답성 폴리머 조성물의 제조 방법)
(C)의 온도 응답성 폴리머 조성물의 제조 방법은, 우선, 혼합형 온도 응답성 폴리머 조성물을 조제한다(혼합물 조제 공정). 구체적으로는, (C1) 2-N, N-디메틸아미노에틸 메타크릴레이트(DMAEMA) 및/또는 그 유도체의 중합체, (C2) 2-아미노-2-히드록시메틸-1, 3-프로판디올(트리스), 및 (C3) 핵산, 헤파린, 히알루론산, 덱스트란황산, 폴리스티렌 설폰산, 폴리아크릴산, 폴리메타크릴산, 폴리인산, 황산화 다당류, 커드란 및 폴리알긴산, 및 이들의 알칼리금속염으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 음이온성 물질을 혼합한다. 또한 (C2) 트리스는 임의 선택적인 성분이다.
(온도 응답성 폴리머 조성물)
(C)의 온도 응답성 폴리머 조성물은, 상기와 같이, 2-N, N-디메틸아미노에틸 메타크릴레이트 및/또는 그 유도체의 중합체와 2-아미노-2-히드록시메틸-1, 3-프로판디올로 핵산, 헤파린, 히알루론산, 덱스트란황산, 폴리스티렌 설폰산, 폴리아크릴산, 폴리메타크릴산, 폴리인산, 황산화 다당류, 커드란 및 폴리알긴산, 및 이들의 알칼리금속염으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 음이온성 물질을 포함한다.
(C1)의 DMAEMA 및/또는 그 유도체의 중합체는, 온도 응답성 폴리머이고, 그 담점은 32℃이다. (C2)의 트리스는, 담점의 약간의 저하, 및/또는 담점보다도 고온에서 형성된 폴리머가, 담점 이하로 냉각되었을 때에 재용해하는 속도를 저감시키는 역할을 하고, 또한, 소수화된 폴리머층 중에서도 친수성을 유지하면서, 아미노기에 유래하는 양전하에 의해 세포에 자극을 제공하는 역할을 하는 것으로 추정된다. (C3)의 음이온성 물질은, 배양하는 세포의 유주나 배향을 가능하게 하는 역할이나 세포상해성을 억제하는 역할을 하는 것으로 추정된다.
이 혼합형 온도 응답성 폴리머 조성물에 의하면, 담점을 실온(25℃) 이하로 저감시킬 수 있다.
상기 조성물에서는, DMAEMA 및/또는 그 유도체의 중합체의 측쇄와 트리스가, 서로 상호작용(예를 들면, 가교하는 작용)하여, 상기 중합체가 응집하기 쉬워지게 되는 것으로 추정된다.
여기서, 상기 (C1)에 대해서, DMAEMA 및/또는 그 유도체의 중합체로서는, 수평균분자량(Mn)이, 10 ~ 500 kDa인 분자가 바람직하다. 또한, 중량평균분자량(Mw)과 수평균분자량(Mn)의 비(Mw/Mn)는, 1.1 ~ 6.0인 분자가 바람직하다.
또한, (C1)의 DMAEMA의 유도체로서는, 예를 들면, 메타크릴레이트의 메틸기의 수소원자를 할로겐 치환한 유도체, 메타크릴레이트의 메틸기를 저급 알킬기로 치환한 유도체, 디메틸아미노기의 메틸기의 수소원자를 할로겐 치환한 유도체, 디메틸아미노기의 메틸기를 저급 알킬기로 치환한 유도체를 들 수 있다.
상기 (C2)에 대해서, 트리스는, 순도 99.9% 이상의 순수물질이거나, 또는 트리스 수용액을, 알칼리성 물질의 첨가 등에 의해, 사용시에 중성 또는 염기성으로 하는 것이 바람직하다. 트리스는, 염산염 상태로 시판되고 있을 때, 이것을 이용했을 경우에는, 트리스 수용액의 pH가 떨어지기 때문에, 조성물의 담점이 70℃ 정도까지 상승해 버린다. 그 때문에, 트리스 염산염은 바람직하지 않다.
상기 (C3)에 열거한 음이온성 물질 중, 핵산은, DNA, RNA, 그 외 1개 쇄, 2개 쇄, 올리고체, 헤어핀 등의 인공 핵산 등을 들 수 있다.
또한, 상기 (C3)에 열거한 음이온성 물질은, 어느 정도의 크기, 예를 들면 1 ~ 5,000 kDa의 분자량(M)을 가지고 있는 것이 바람직하다.
분자량을 상기 범위로 하면, 음이온성 물질은, 양이온성 물질과 이온결합하여, 양이온성 물질을, 장시간 포착하는 역할을 할 수 있고, 안정한 이온 복합체 미립자를 형성시킬 수 있다. 또한, 일반적으로 양이온성 물질이 가지는, 세포의 세포막 표면에 대한 정전적상호작용에 기인하는 세포상해성을 완화할 수도 있다.
(C3)에 열거한 음이온성 물질 외에도, 예를 들면, 양이온성 폴리머인 폴리(4-아미노스티렌)의 4 위치의 아미노기에 대해서 옥살산 등의 디카르복실산을 탈수 축합시킴으로써, 음이온성 관능기를 도입한, 실질적으로 음이온성 물질로서 기능하는 폴리머 유도체도, 이용할 수 있다.
또한 상기 (C3)에 열거한 음이온성 물질은, 2종 이상 포함되어 있어도 좋다.
여기서, (C1) 2-N, N-디메틸아미노에틸 메타크릴레이트(DMAEMA) 및/또는 그 유도체의 중합체에 대한, (C2) 2-아미노-2-히드록시메틸-1, 3-프로판디올(트리스)의 비율((C2)/(C1))을, 1.0 이하로 한 혼합형 온도 응답성 폴리머 조성물을 이용하는 것이 바람직하다.
또한 비율((C2)/(C1))은 질량 비율인 것으로 한다.
상기 비율의 혼합형 온도 응답성 폴리머 조성물을 이용했을 경우, 후술의 배양 공정에서, 세포구조체를 형성하기 쉽게 할 수 있다.
이 조성물에 의하면, 상기 조성물의 친수성과 소수성의 밸런스를 더욱 호적하게 할 수 있다. 그리고, 이 호적한 밸런스가, 배양면에의 세포의 접착성을 호적하게 조정하고, 세포의 유주나 배향을 활성화하고 있는 것으로 추정된다.
또한, 상기 비율((C2)/(C1))는, 0.1 이상인 것이 바람직하다.
상기 비율을 0.1 이상으로 함으로써, 담점을 저감시킨다고 하는 상기 효과가 수득되기 쉽다. 또한, 세포구조체를 형성하기 쉽게 한다고 하는 상기 효과가 수득되기 쉽다.
상기와 마찬가지의 이유에 의해, 상기 비율((C2)/(C1))는, 0.1 ~ 0.5인 것이 더욱 바람직하다.
여기서, 혼합형 온도 응답성 폴리머 조성물 중의 C/A비(양전하/음전하)가, 0.5 ~ 16인 것이 바람직하다.
또한 본원 명세서에서는, C/A비란, 조성물 중에 포함되는 물질이 가지는 양전하의, 조성물 중에 포함되는 물질이 가지는 음전하에 대한 비율을 가리킨다. 구체적으로는, C/A비는, (C1) DMAEMA 및/또는 그 유도체의 중합체의 몰 수를 N1, (C3) 음이온성 물질의 몰 수를 N3로 했을 때에, ｛(중합체 1 분자당 양전하)×N1｝/｛(음이온성 물질 1 분자당 음전하)×N3｝이라는 식으로 나타낸다.
또한 본원 명세서에서는, 음이온성 물질을 DNA로 했을 경우, 음이온성 물질 1 분자당 음전하수는, DNA의 염기쌍의 수(bp수)×2로 계산하고, 분자량(Da)은, bp수×660(AT페어 및 CG페어의 평균분자량)으로 계산하는 것으로 한다.
C/A비를 0.5 ~ 16으로 함으로써, 관상 세포구조체를 형성시키기 쉽게 한다고 하는 상기 효과가 수득하기 쉬워진다.
상기 조성물 중의 양전하와 음전하의 밸런스를 호적하게 해서, 양전하에 의한 세포상해성을 억제할 수 있는 것으로 추정된다. 또한, 상기 조성물의 친수성과 소수성의 밸런스를 더욱 호적하게 해서, 세포의 유주나 배향을 일으키기 쉽게 할 수 있는 것으로 추정된다.
상기와 마찬가지의 이유에 의해, 상기 C/A비는, 2 ~ 10으로 하는 것이 더욱 바람직하고, 특히 C/A비는 8 부근인 것이 가장 바람직하다.
(준비 공정)
일례의 제조 방법에서는, 그 다음에, 상기 온도 응답성 폴리머 및/또는 상기 온도 응답성 폴리머 조성물로 배양면의 일부를 피복하여 피복배양면을 준비한다 (준비 공정)(도 1(i) ~ (iii) 참조).
여기서, 피복배양면 이외의 배양면은, 세포접착성으로 해도, 세포 비접착성으로 해도 좋지만, 소망한 형상의 세포괴를 수득하기 쉽게 하는 관점에서, 세포 비접착성으로 하는 것이 바람직하다. 세포 비접착성의 배양면의 조제 방법은, 특별히 한정되는 일 없이, 예를 들면, 세포 비접착성의 배양면을 구비하는 세포배양기, 예를 들면, SUMILON 사 제의 PrimeSurface(등록상표)나, 대장균 배양용의 세포배양기 등의 세포접착을 위한 표면 처리를 실시하지 않은 것 등을 이용해도 좋고, 세포 비접착성의 시트나 깔개 등을 이용해도 좋다.
여기서, 도 1에 나타낸 바와 같이, 피복배양면은, 세포의 벽과의 접촉을 억제하여, 세포괴의 형상을 갖추는 관점에서, 비피복배양면으로 둘러싸여 있도록 설치되는 것이 바람직하다(도 1(ii), (iii) 참조).
피복배양면의 형상은, 소망하는 연골 세포괴의 형상에 맞춰, 적절히 조정해도 좋고, 평면시, 원형, 직사각형, 도너츠형(링형) 등을 들 수 있다.
상기 준비 공정은, 예를 들면, 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물을 용매에 용해하고, 온도 응답성 폴리머 용액으로 한 후, 세포배양기의 배양면 상에 도포하고, 건조시켜 피복 세포배양기를 준비하는 공정(준비 공정 I)으로 해도 좋고, 또한, 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물을 포함하는 수용액(온도 응답성 폴리머 수용액)을 온도 응답성 폴리머의 담점 이하로 냉각하고, 냉각한 온도 응답성 폴리머 수용액을 세포배양기의 배양면 상에 유연(流延)시켜, 담점 초과의 온도까지 가열하여 피복 세포배양기를 준비하는 공정(준비 공정 II)으로 해도 좋다.
상기 준비 공정 I에서 온도 응답성 폴리머 용액에서의 용매로서는, 예를 들면, 물； 생리식염수； 완충액； 메탄올, 에탄올, n-프로필알코올, 이소프로필 알코올, 1-부탄올, 이소부틸 알코올, 2-부탄올, t-부틸알코올, 1-펜탄올, 2-펜탄올, 3-펜탄올, 2-메틸-1-부탄올, 3-메틸-1-부탄올, 2-메틸-2-부탄올, 3-메틸-2-부탄올, 2, 2-디메틸-1-프로판올, 1-펜탄올, 2-펜탄올, 3-펜탄올, 2-메틸-1-부탄올, 3-메틸-1-부탄올, 2-메틸-2-부탄올, 3-메틸-2-부탄올, 2, 2-디메틸-1-프로판올, 1-헥산올, 2-메틸-2-펜탄올, 알릴알코올, 벤질알코올, 살리실알코올 등의 알코올； 아세톤, 에틸메틸케톤, 디에틸케톤, 메틸프로필케톤, 메틸이소부틸케톤, 메틸비닐케톤, 시클로헥사논, 2-메틸시클로펜타논, 아세토페논, 벤조페논, 이소포론 등의 케톤； 아세트산 메틸, 아세트산 에틸, 아세트산 프로필, 아세트산 이소프로필, 아세트산 n-부틸, 아세트산 이소부틸, 아세트산 sec-부틸, 아세트산 tert-부틸, 아세트산 비닐, 포름산 메틸, 포름산 에틸, 포름산 프로필, 상기 알코올과 인산의 에스테르, 상기 알코올과 탄산의 에스테르 등의 에스테르； 클로로포름； 벤젠； 톨루엔； 디에틸에테르； 디클로로메탄； 등을 들 수 있다.
그 중에서도, 배양면에 균일하게 피복하기 쉽고, 또한, 온도 응답성 폴리머의 용해성이 우수하다고 하는 관점에서, 메탄올, 에탄올, n-프로필알코올, 이소프로필 알코올, 2-부탄올, t-부틸알코올, 알릴알코올 등의 알코올； 아세톤, 에틸메틸케톤, 디에틸케톤, 메틸비닐케톤 등의 케톤； 아세트산 메틸, 아세트산 에틸, 아세트산 이소프로필, 아세트산 tert-부틸, 아세트산 비닐 등의 에스테르； 클로로포름； 벤젠； 톨루엔； 디에틸에테르； 디클로로메탄이 바람직하다. 또한, 단시간에 건조시킬 수 있어 배양면에 한층 균일하게 도포하기 쉽다고 하는 관점에서, 비점이 낮은 유기 용매(예를 들면, 탄소수 1 ~ 4의 저급알코올, 탄소수 3 ~ 5의 저급 케톤, 및 탄소수 1 ~ 4의 알킬기를 가지는 아세트산 알킬에스테르로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종, 특히, 물보다 비점이 낮은, 탄소수 1 ~ 4의 저급알코올, 탄소수 3 ~ 5의 저급 케톤, 및 탄소수 1 ~ 4의 알킬기를 가지는 아세트산 알킬에스테르로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1종)가 더 바람직하고, 코스트, 조작성도 우수한 관점에서, 메탄올, 에탄올이 특히 바람직하다.
상기 용매는, 1종 단독으로 사용해도 좋고, 2종 이상을 병용해도 좋다.
용매는, 온도 응답성 폴리머의 용해성이 우수하기 때문에, 담점 이상의 온도(예를 들면, 실온이나 37℃ 등)로 해도, 온도 응답성 폴리머가 부용화(不溶化)해 침전하기 어렵다. 그 때문에, 온도 응답성 폴리머를 도포할 때에, 온도 응답성 폴리머 용액의 온도 관리를 하는 수고를 줄일 수 있고, 간이하게 피복 세포배양기를 준비할 수 있다.
상기 준비 공정 I에서, 온도 응답성 폴리머 용액에는, 세포가 자기 응집하기 쉬워진다고 하는 관점에서, 친수성 분자가 포함되는 것이 바람직하다. 친수성 분자로서는, 온도 응답성 폴리머의 C/A비에 영향을 주지 않는 비이온성이고 친수성인 것, 예를 들면, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 디메틸아크릴아미드(DMAA), 글리세린, TritonX, 폴리프로필렌글리콜 등을 들 수 있다.
상기 준비 공정 I에서, 온도 응답성 폴리머 용액 중의 온도 응답성 폴리머의 함유량은, 온도 응답성 폴리머가 배양면에 균일하게 피복되기 쉬워진다고 하는 관점에서, 온도 응답성 폴리머 용액(100 중량%)에 대해서, 0.00075 ~ 0.015 중량%인 것이 바람직하고, 0.001 ~ 0.01 중량%인 것이 보다 바람직하다.
상기 준비 공정 I에서, 온도 응답성 폴리머 용액 중의 친수성 분자의 함유량은, 세포가 자기 응집하기 쉬워진다고 하는 관점에서, 온도 응답성 폴리머(100 중량%)에 대해서, 0.00001 ~ 0.00015 중량%인 것이 바람직하고, 0.00003 ~ 0.0001 중량%인 것이 보다 바람직하다.
상기 준비 공정 I에서, 온도 응답성 폴리머 용액은, 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물이 배양면에 균일하게 피복되기 쉬워진다고 하는 관점에서, 물이 포함되지 않는 것이 바람직하고, 온도 응답성 폴리머 용액(100 중량%) 중의 물의 중량 비율이 0.5 중량% 이하인 것이 보다 바람직하고, 0.1 중량% 이하인 것이 더 바람직하다.
또한 물의 중량 비율은, 가스크로마토그래피, 칼피셔(Karl Fischer)법 등 당업자에게 주지의 방법에 의해 측정 가능하다.
상기 준비 공정 I에서, 온도 응답성 폴리머 용액은, 배양면의 전면에 도포해도 좋고, 배양면의 일부에 도포해도 좋다. 그 중에서도, 간이하게 세포구조체가 수득된다는 관점에서, 배양면의 전면에 도포하는 것이 바람직하다.
상기 준비 공정 I에서, 도포한 온도 응답성 폴리머 용액을 건조시키는 조건으로서는, 배양면에 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물을 균일하게 피복하는 관점에서, 대기압 하에서, 온도 10 ~ 70℃, 시간 1 ~ 3,000분이 바람직하다. 도포한 온도 응답성 폴리머 용액을, 빠르게 건조시킴으로써, 배양면 상에 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물이 치우치는 일 없이, 균일하게 피복되기 쉬워진다.
도포한 온도 응답성 폴리머 용액은, 예를 들면, 세포배양기를 37℃의 인큐베이터 중에서 정치함으로써 건조시켜도 좋다.
상기 준비 공정 II에서, 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물을 용해하는 용매로서는, 예를 들면, 물； 생리적 식염수； 인산완충액, 인산완충 생리식염수(PBS), 트리스완충액 등의 완충액； 등을 들 수 있다.
상기 준비 공정 II에서, 온도 응답성 폴리머 수용액을 냉각하는 방법으로서는, 예를 들면, 온도 응답성 폴리머 수용액을 약 4℃의 냉장고에 넣어 담점 이하의 온도까지 냉각하는 방법 등을 들 수 있다.
상기 준비 공정 II에서, 온도 응답성 폴리머 수용액을 배양면 상에 유연시키는 방법으로서는, 예를 들면, 담점 이하의 온도를 가지는 온도 응답성 폴리머 수용액을, 세포배양기의 배양면을 기울임으로써 펼치는 방법, 스패츌러를 이용하여 온도 응답성 폴리머 수용액을 펼치는 방법 등을 들 수 있다.
상기 준비 공정 II에서, 유연한 온도 응답성 폴리머 수용액을 담점 초과까지 가열하는 방법으로서는, 예를 들면, 유연공정 후의 세포배양기를 37℃의 인큐베이터 중에서 정치하는 방법 등을 들 수 있다.
도 1에 나타내는 일례의 연골 세포괴의 제조 방법에서는, 준비 공정을, 세포배양기(도 1(i) 참조)의 배양면의 중앙 부분에, 소망한 형상을 그리면서, 상기 온도 응답성 폴리머 및/또는 상기 온도 응답성 폴리머 조성물을 도포하고(도 1(ii) 참조), 도포 부분을 건조함으로써 (도 1(iii) 참조) 행하고 있다.
또한, 본 실시 형태(I)에서의 준비 공정은, 세포배양기의 배양면에, 소망한 형상의 구멍(속이 빔)을 가지는 마스킹 시트(도시하지 않음)를 깔고, 시트 위에서부터 상기 온도 응답성 폴리머 및/또는 상기 온도 응답성 폴리머 조성물을 배치하고, 그 후, 시트를 제거함으로써 행할 수 있다.
이러한 마스킹 시트의 소재로서는, 당업자에게 주지의 소재가 사용 가능하고, 예를 들면, 접촉각이 70°이하의 소재, 구체적으로는, 친수성 기로 수식한 폴리에틸렌 테레프탈레이트, 폴리스티렌, 폴리카보네이트, 유리, 폴리프로필렌 등을 들 수 있고, 특히, 세포 배양에 사용하기 위해서 용출물을 줄이는 관점에서, 예를 들면, N, N-디메틸아크릴아미드가 방사선 그래프트 중합에 의해 도입 고정된 폴리스티렌 등이 바람직하다.
시트의 형상, 사이즈, 두께 등은, 특별히 한정되지 않지만, 두께 0.05 ~ 2.0 mm인 것이 바람직하다.
피복배양면의 면적은, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, φ35 mm의 세포배양기를 이용하여, 외경 1 ~ 20 mm, 내경 0.1 ~ 19 mm사이즈의 도너츠형의 연골 세포괴를 제조하는 경우, 0.5 ~ 300 ㎟로 해도 좋다.
피복배양면이 단위면적당 가지는 온도 응답성 폴리머 및 온도 응답성 폴리머 조성물의 양은, 0.1 ~ 3.0μg/㎠로 하는 것이 바람직하고, 0.5 ~ 2.5μg/㎠로 하는 것이 보다 바람직하다.
피복배양면의 제타 전위로서는, 0 ~ 50 mV가 바람직하고, 보다 바람직하게는 0 ~ 35 mV, 더욱 바람직하게는 10 ~ 25 mV이다. 제타 전위가 0 mV 이상인 것에 의해, 음으로 대전되는 세포가 접착하기 쉬워진다. 또한, 제타 전위가 50 mV 이하인 것에 의해, 세포 독성을 경감할 수 있다.
또한, 제타 전위를 상기 범위로 함으로써, 세포를 적절한 배양 조건에서 배양하는 것만으로, 괴상(펠릿상)의 구조를 가지는 세포구조체를 한층 간편하게 제작할 수 있다. 이것은, 표면 제타 전위를 상기 범위로 함으로써, 피복배양면의 표면에 세포 독성을 야기하지 않는 미약한 양전하를 제공할 수 있고, 또한, 파종한 세포의 빠른 접착을 확보하여 세포의 활성의 향상 및 세포외 매트릭스의 분비를 촉진하고, 또한, 세포 유주를 적절히 억제하여 세포간의 결합을 강하게 할 수 있는 것에 의한 것으로 추측된다.
또한 제타 전위란, 폴리스티렌 라텍스를 히드록시프로필셀룰로오스로 피복한 입자(제타 전위： 5 ~ ＋5 mV)를 표준의 모니터 입자로 하고, 제타 전위계(예를 들면, 형번(型番) 「ELSZ」, Otsuka Electronics Co., Ltd. 제 등)로 측정한, Smoluchowski식에 의해 산출되는 값을 말한다.
피복배양면의 표면에 대한 물의 접촉각으로서는, 본 발명(I)의 효과를 높이는 관점에서, 50 ~ 90°이 바람직하고, 보다 바람직하게는 60 ~ 80°, 더욱 바람직하게는 62 ~ 78°이다.
또한 피복배양면에 대한 물의 접촉각이란, 피복배양면 내의 임의의 수개의 점에서, JIS　R3257에 준거해 측정되는 접촉각의 평균치를 말한다.
도 3에, 준비 공정의 변형예 및 이것에 계속해서 파종 배양 공정의 개략을 나타낸다.
도 3(a)에, 준비 공정의 제1 변형예를 나타낸다.
준비 공정의 제1 변형예에서는, 세포배양기의 배양면 내에 들어갈 평면시 형상을 갖고, 소정 정도의 두께를 갖고, 중앙 부분이 소망한 평면시 형상으로 속을 비게 한 세포 비접착성의 깔개(패드)를 이용한다 (도 3(a)(i) 참조).
또한 세포 비접착성이란, 세포가 접착하지 않는 또는 접착하기 어려운 것을 말한다.
그리고, 이 제1 변형예의 준비 공정에서는, 우선, 세포배양기의 배양면 전면에 상기 온도 응답성 폴리머 및/또는 상기 온도 응답성 폴리머 조성물을 배치하고, 그 다음에, 폴리머 및/또는 폴리머 조성물 위에 상기 세포 비접착성 시트를 깐다. 이것에 의해, 피복배양면은 벽으로 둘러싸인, 즉, 요부(凹部)의 바닥면에 설치되게 된다.
이러한 제1 변형예에 의하면, 후술의 파종 배양 공정에서 세포괴의 형상을 삼차원적으로 제어하는 것이 가능해지고, 소망한 형상을 가지는 연골 세포괴를 보다 정밀하게 제조하는 것이 가능해진다.
제1 변형예에서 이용할 수 있는 세포 비접착성의 깔개의 소재로서는, 당업자에게 주지의 소재가 사용 가능하고, 예를 들면, 접촉각이 70°이하의 소재, 구체적으로는, 친수성 기로 수식한 폴리에틸렌 테레프탈레이트, 폴리스티렌, 폴리카보네이트, 유리, 폴리프로필렌 등을 들 수 있고, 특히, 세포에 사용하기 위해서 용출물을 줄이는 관점에서, 예를 들면, N, N-디메틸아크릴아미드가 방사선 그래프트 중합에 의해 도입 고정된 폴리스티렌 등이 바람직하다.
깔개의 형상, 사이즈, 두께 등은, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, φ35 mm의 세포배양기를 이용하는 경우, 경(徑)(최대경) 0.1 ~ 10 mm인 것이 바람직하다.
또한 상기 제1 변형예에서는, 세포배양기의 배양면 내에 들어갈 사이즈를 갖고, 중앙 부분에 소망한 평면시 형상의 요부를 구비하는 세포 비접착성의 깔개를 이용해도 좋다(도시하지 않음).
이 경우의 준비 공정에서는, 깔개의 요부의 바닥면에만 상기 온도 응답성 폴리머 및/또는 상기 온도 응답성 폴리머 조성물을 배치하고, 요부의 바닥면 이외의 면, 즉, 요부의 벽면 및 요부 이외의 깔개의 표면에는, 상기 폴리머 및/또는 상기 폴리머 조성물을 배치하지 않는다(도시하지 않음).
이러한 예에 의해서, 후술의 파종 배양 공정에서 소망한 형상을 가지는 연골 세포괴를 요부에서 보다 정밀하게 제조하는 것이 가능해진다.
또한, 본 실시 형태(I)에서는, 다른 사이즈의 세포 비접착성의 깔개를 이용해도 좋고, 예를 들면, 파종 배양 공정을 거쳐 사이즈가 확대한 연골 세포괴를, 보다 큰 사이즈의 세포 비접착성의 깔개의 요부로 옮겨, 다음의 파종 배양 공정을 행할 수도 있다.
이러한 수법에 의하면, 각 파종 배양 공정에서의, 연골 세포괴의 사이즈에 대한 피복배양면의 사이즈를, 일정 정도로 유지할 수 있고, 연골 세포괴의 형상을 보다 소망한 형상에 접근하는 것이 가능하게 된다.
도 3(b)에, 준비 공정의 제2 변형예를 나타낸다.
준비 공정의 제2 변형예에서는, 세포배양기의 배양면에 소망한 평면시 형상의 요부를 음각한다 (도 3(b) 참조).
그리고, 이 제2 변형예의 준비 공정에서는, 음각한 요부의 바닥면에만 온도 응답성 폴리머 및/또는 상기 온도 응답성 폴리머 조성물을 배치하고, 요부의 바닥면 이외의 면, 요부의 벽면 및 요부 이외의 시트의 표면에는, 상기 폴리머 및/또는 상기 폴리머 조성물을 배치하고 있지 않다 (도 3(b)(i) 참조).
이러한 제2 변형예에 의하면, 후술의 파종 배양 공정에서 세포괴의 형상을 삼차원적으로 제어하는 것이 가능해지고, 소망한 형상을 가지는 연골 세포괴를 보다 정밀하게 제조하는 것이 가능해진다.
또한 전술의 준비 공정의 제1 변형예 및 제2 변형예에서, 파종되는 세포와 요부의 벽면의 접착을 억제하고, 수득되는 세포괴의 형상을 갖추는 관점에서, 특히 요부의 벽면은 세포 비접착성으로 하는 것이 바람직하다.
(파종 배양 공정)
본 실시 형태(I)에서의 일례의 제조 방법에서는, 그 다음에, 피복배양면에서, 세포괴의 존재하에서, 연골 세포로 분화할 수 있는 세포를 파종하고, 세포괴 및 연골 세포로 분화할 수 있는 세포를 공배양함으로써, 연골 세포괴를 조제한다(파종 배양 공정).
또한 도 1에 나타낸 바와 같이, 본 실시 형태(I)에서의 일례의 제조 방법에서는, 전술의 준비 공정 후, 후술하는 파종 배양 공정의 전에, 전술의 준비 공정에서 준비한 피복배양면에 연골 세포로 분화할 수 있는 세포를 파종하고, 이것을 배양함으로써, 후술하는 파종 배양 공정에서 이용되는 세포괴를 조제하고 있다 (도 1(iｖ) ~ (ｖiii) 참조).
그러나, 본 실시 형태(I)의 제조 방법은, 이것에 한정되는 일 없이, 파종 배양 공정에서 이용하는 세포괴를, 별도, (예를 들면, 다른 세포배양기에서) 조제해도 좋다(도시하지 않음).
도 1에 나타내는 예에서는, 파종 배양 공정을, 피복배양면 상에 세포괴를 존재시킨 상태로, 세포배양기에 세포 및 세포배양용 배지를 가하고(도 2(i) 참조), 그 후, 이 세포배양기를 일반적인 37℃의 세포 인큐베이터에 넣어(도 2(ii) 참조), 배지 교환에 의해 새로운 세포배양용 배지를 가하고(도 2(iii) 참조), 세포배양기를 세포 인큐베이터에 더 넣는 (도 2(iｖ), (ｖ) 참조) 것에 의해 행하고 있다. 또한 도 2(iｖ)에서의 괄호 내에는, 구조물의 단면도를 나타낸다.
이 공정에서, 도 2(i)에 나타내는 바와 같이, 세포괴는 피복배양면의 중앙 부분에 존재시키는 것이, 연골 세포괴의 전체 형상을 갖추는 관점에서, 바람직하다.
배지 교환 전에 이용하는 세포배양용 배지와 배지 교환 후에 이용하는 세포배양용 배지는, 목적이나 용도에 따라 적절히 선택되어도 좋고, 예를 들면, 전의 배지를 증식용 배지로 하고, 후의 배지를 분화용 배지나 재분화용 배지로 해도 좋다.
연골 세포로 분화할 수 있는 세포로서는, 연골 세포, 지방, 활막, 근막, 골막, 치근막, 치수, 골수 유래의 간엽계 줄기세포, 및 iPS 세포를 들 수 있다.
상기 연골 세포로 분화할 수 있는 세포는, 1종 단독으로 사용해도 좋고, 2종 이상을 병용해도 좋다.
파종 배양 공정에서 세포를 파종할 때의 세포 밀도는, 0.3×104개/㎠ 이상, 바람직하게는 0.3×105개/㎠ 이상, 보다 바람직하게는 0.5×105개/㎠ 이상이고, 또한, 배양 중의 세포끼리의 접촉에 의한 증식 정지 등의, 세포주기에 관한 문제를 생기기 어렵게 하기 위해서, 10.0×105개/㎠ 이하로 하는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 4.5×105개/㎠ 이하이다.
배양 조건은, 사용하는 세포종이나 실험 목적에 기초해서, 당업자가 적절히 정할 수 있거나, 적절히 정해도 좋고, 예를 들면, 37℃, 5% CO2 분위기 등으로 해도 좋다.
여기서, 파종 배양 공정에서 생기는 현상을, 도 2를 참조하면서, 이하에 기재한다.
이 공정에서는, 우선, 파종된 세포가, 중앙 부분에 세포괴가 존재하고 있는 피복배양면 상, 및 비피복배양면 상에, 침강한다. 이 때, 피복배양면 상에 침강한 세포는, 피복배양면 상에 접착하여, 생존하는 한편, 비피복배양면 상에 침강한 세포는, 비피복배양면 상에는 접착하는 일 없이 존재할 때 (도 2(ii) 참조), 파종 후 1회째의 배지 교환에 의해, 접착하지 않은 세포는 흡인 제거된다 (도 2(iii) 참조). 또한 이러한 세포의 제거는, 아포토시스(apoptosis)에 수반하는 열충격 프로테인이나 염증성 사이토킨 등의 유해 성분의 방출을 억제하는 관점에서, 신속히 행하는 것이 바람직하다.
그리고, 피복배양면에 접착한 세포를 더욱 배양하면, 피복배양면과 비피복배양면의 경계 부근에 위치하는 세포가, 상기 세포보다도 피복배양면의 중앙 부분 측에 위치하는 세포도 수반하면서, 중앙 부분에 있는 세포괴를 감싸도록, 피복배양면부터 응집하기 시작한다 (도 2(iｖ) 참조). 바꾸어 말하면, 접착하고 있는 세포가, 배양면으로부터 멀어지도록, 피복배양면의 중앙 부분을 향해, 박리하고, 시트상이었던 세포 전체가 그 주변에서 휜다.
최종적으로, 미리 배치되어 있던 세포괴와 파종된 세포가, 단면시에 적층 구조를 이루도록, 일체화한다 (도 2(ｖ) 참조).
본 발명(I)의 파종 배양 공정에서 이용된 연골로 분화할 수 있는 세포는, 상기 응집의 과정을 거쳐 연골 세포로 분화, 성숙하지만, 연골 세포는, 당업자에게 주지된 바와 같이, 성숙하면 저산소 상태를 허용하는 특수한 성질을 가지는 세포이다. 따라서, 응집의 과정을 거쳐 수득된 세포괴 중의 연골 세포는 저산소 상태에서도 생존하는 것이 가능해지고, 다음의 파종 배양 공정에서, 새로운 연골로 분화할 수 있는 세포로 감싸져서, 저산소 상태에 놓여도, 계속 생존할 수 있다.
또한 파종된 세포는, 피복배양면 이외에 세포괴 자체 위에도, 침강하게 되지만, 세포가 응집할 때에, 아울러 일체화하게 된다.
그리고, 본 실시 형태(I)에서의 일례의 제조 방법에서는, 전술의 파종 배양 공정을 복수회 행한다 (도 2(ｖi) 참조).
파종 배양 공정을 복수회 행함으로써, 사이즈가 큰 연골 세포괴를 수득할 수 있고, 또한, 그 사이즈를 목적이나 용도에 따른 것으로 조정할 수 있다.
이러한 양태에 의하면, 전의 파종 배양 공정에서 형성된 성숙한 세포로 구성되는 세포괴의 주위에, 후의 파종 배양 공정에서 미성숙의 세포를 순차 배치해 나가는 것이 가능해지고, 연골로 분화할 수 있는 세포의 성숙과 세포괴의 성장을 양립하는 것이 가능해진다.
또한 여기서, 미성숙의 세포(증식하지만 연골의 성질은 불충분한 세포)와 성숙한 세포(증식하지 않지만 연골 세포의 성질을 획득한 세포； 저산소 환경을 허용할 수 있는, 고탄성 유연성을 가지는 등의 특성을 구비한다)와의 제어는, 배지를 적절히 선택함으로써 행하는 것이 가능하다. 예를 들면, 사용하는 배지에 TGF β1 등의 분화유도인자를 혼합하면, 세포의 분화를 촉진하는 것이 가능해진다.
전의 파종 배양 공정에서 세포괴가 피복배양면의 중앙 부분에 형성된 후, 다음의 파종 배양 공정에서 세포를 파종할 때까지의 시간은, 특별히 한정되지 않지만, 형성한 세포괴를 연골 세포괴로 성숙시키는 것, 및 연골 세포괴의 활성의 저하를 억제하는 것을 고려하고, 또한, 사용하는 재분화 배지의 종류나 농도 등을 종합적으로 감안해서, 당업자에 의해서 적절히 설정되어도 좋다.
(연골 세포괴)
본 실시 형태(I)의 연골 세포괴는, 본 실시 형태(I)의 연골 세포괴의 제조 방법에 의해 제조된 것이다.
연골 세포괴의 사이즈로서는, 특별히 한정되지 않지만, 경(최대경)은 1 ~ 100 mm로 해도 좋고, 특히 도너츠형의 연골 세포괴의 경우, 외경은 3 ~ 50 mm로 해도 좋고, 내경은 0.3 ~ 49 mm로 해도 좋다.
(이식 재료의 제조 방법)
본 실시 형태(I)의 이식 재료의 제조 방법은, 본 실시 형태(I)의 연골 세포괴의 제조 방법에 의해 제조된 연골 세포괴의 존재하에서, 간엽계 세포를 파종하고, 연골 세포괴 및 간엽계 세포를 공배양함으로써, 이식 재료를 조제하는 공정을 포함한다.
도 4에, 본 실시 형태(I)의 이식 재료의 제조 방법의 개요에 대해 나타낸다.
본 실시 형태(I)의 이식 재료의 제조 방법에서의 상기 공정은, 이용하는 세포를 간엽계 세포로 하는 것 이외, 전술의 본 실시 형태(I)의 연골 세포괴의 제조 방법에서의 파종 배양 공정과 마찬가지로 행해도 좋다.
여기서, 간엽계 세포로서는, 연골 세포, 선유아세포, ADSC 등을 들 수 있다.
(이식 재료)
본 실시 형태(I)의 이식 재료는, 본 실시 형태(I)의 이식 재료의 제조 방법에 의해 제조된 것이다.
본 실시 형태(I)의 이식 재료는, 연골 세포괴의 최외측에 간엽계 세포, 특히 선유아세포가 배치되어 있는 것이기 때문에, 생체에 이식했을 때에, 이식 부위의 주위 조직과 완강하게 접착하기 쉬운 경향이 있다. 이 때문에, 이식 부위에서의 치유의 효과를 높여 예후를 보다 양호한 것으로 할 수 있다.
도 5에, 본 실시 형태(I)에서의 다른 예의 연골 세포괴의 제조 방법의 개요에 대해 나타낸다.
본 실시 형태(I)에서의 다른 예의 연골 세포괴의 제조 방법은, 전술의 준비 공정의 제1 변형예를 포함하는 것이다.
구체적으로는, 다른 예의 제조 방법은, 중앙 부분에 평면시 도너츠형(예를 들면, 외경(φo) 8 mm, 내경(φi) 4 mm, 폭 2 mm)의 속이 빈 것을 설치한, 세포 비접착성의 깔개(예를 들면, 두께 1 mm)를 이용하는 것이다.
여기서, 피복배양면의 외윤곽선이 이루는 선과 피복배양면의 외윤곽선이 이루는 선이, 동심원을 이루는 것이, 연골 세포괴의 도너츠 형상을 갖추는 의미에서, 바람직하다.
본 실시 형태(I)에서의 다른 예의 연골 세포괴의 제조 방법에서의 각 공정의 상세는, 전술의 본 실시 형태(I)에서의 일례의 연골 세포괴의 제조 방법에서의 각 공정과 마찬가지로 해도 좋다(도 5(i) ~ (ix) 참조).
다른 예의 제조 방법에서, 예를 들면, 세포배양기로서 φ35 mm 플레이트를 이용하는 경우, 보다 형태를 갖춘 도너츠형(링형)의 연골 세포괴를 수득하는 관점에서, 피복배양면의 폭을 3 mm 이하로 하는 것이 바람직하고, 2.5 mm 이하로 하는 것이 보다 바람직하고, 벽의 높이를 3 mm 이하로 하는 것이 바람직하고, 2.5 mm 이하로 하는 것이 보다 바람직하다.
(복합재의 제조 방법)
본 실시 형태(I)의 복합재의 제조 방법은, 본 실시 형태(I)의 연골 세포괴의 중 특히 도너츠형의 연골 세포괴를 관상 구조체에 끼움으로써, 복합체를 조제하는 복합체 조제 공정과, 복합체를 배양하여, 복합재를 조제하는 배양 공정을 포함한다.
호적하게는, 본 실시 형태(I)의 복합재의 제조 방법은, 관상 구조체와 심재를 준비한 후(도 6(i) 참조), 심재를 관상 구조체의 중공부의 일방 단으로부터 타방 단을 향해 삽입하는 (도 6(ii) 참조) 공정과, 본 실시 형태(I)의 도너츠형의 연골 세포괴를 상기 관상 구조체에 끼움으로써, 복합체를 조제하는 복합체 조제 공정(도 6(iii) 참조)과, 복합체를 배양하여 복합재를 조제하는 (도 6(iｖ) 참조) 배양 공정과, 상기 복합재로부터 심재를 꺼내는 (도 6(ｖ) 참조) 공정을 포함한다.
도 6(i) ~ (ｖ)에, 본 실시 형태(I)에서의 일례의 복합재의 제조 방법의 개요에 대해 나타낸다.
이하, 본 실시 형태(I)에서의 일례의 연골 세포괴의 제조 방법에서의 각 공정의 상세를 기재한다.
관상 구조체로서는, 중공부를 가지고 있는 것으로 해도 좋고, 바이오 튜브(인공혈관), 콜라겐제 튜브, 엘라스틴제 튜브, 폴리글루콘산제 튜브, 폴리젖산제 튜브 등으로 해도 좋다.
바이오 튜브는, 콜라겐을 주성분으로 하는 것으로 해도 좋고, 예를 들면, 일본 특허공개 2004-261260호 공보의 실시예에 기재되는 방법으로 작성되어도 좋다.
관상 구조체의 외경으로서는, 본 실시 형태(I)의 도너츠형의 세포구조체의 내경과 마찬가지로 해도 좋고, 예를 들면, 1 ~ 100 mm로 해도 좋고, 관상 구조체의 내경으로서는, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 0.1 ~ 50 mm로 해도 좋다. 관상 구조체의 길이로서는, 목적이나 용도에 따라 적절히 정해도 좋고, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 1 ~ 300 mm로 해도 좋다.
심재로서는, 중실체이어도 다공체이어도 사용 가능하고, 구체적으로는, 실리콘제의 봉상 구조물, 아크릴제의 봉상 구조물, 금속제의 봉상 구조물, 초벌구이한 도기, 금속 메쉬 압축 구조체 등으로 해도 좋고, 다공체를 사용하면, 복합체 내강 측으로부터의 배지, 산소의 확산도 가능해진다.
심재의 외경으로서는, 상기 관상 구조체의 내경과 마찬가지로 해도 좋고, 예를 들면, 0.1 ~ 50 mm로 해도 좋다.
심재의 길이로서는, 관상 구조체의 길이와 마찬가지로 해도 좋고, 관상 구조체의 길이보다도, 예를 들면 0.1 ~ 10 mm만큼 길어도 또는 짧아도 좋다.
상기 복합체 조제 공정에서는, 예를 들면, 본 실시 형태(I)의 도너츠형의 연골 세포괴를 핀셋으로 고정하면서, 전술의 공정에서 조제된 (심재가 내부에 설치된) 관상 구조체를 연골 세포괴의 고리에 통과함으로써, 실시할 수 있다.
관상 구조체 1개에 대해서 이용되는 도너츠형의 연골 세포괴의 수는, 목적이나 용도에 따라 적절히 정해도 좋고, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 1 ~ 1,000개로 해도 좋다.
또한, 연골 세포괴를 복수 이용했을 경우의, 인접하는 2개의 연골 세포괴 간의 거리로서는, 목적이나 용도에 따라 적절히 정해도 좋고, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 이 공정 후·후술의 배양 공정 전에서, 0.1 ~ 100 mm로 해도 좋다.
전술의 복합체 조제 공정에서 관상 구조체의 끼움이 종료되고 나서, 후술의 배양 공정에서 복합체의 배양을 개시할 때까지의 시간으로서는, 세포의 활성을 유지하는 관점에서, 1 ~ 180분간으로 하는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 1 ~ 120분간이다.
상기 배양 공정은, 예를 들면, 전술의 복합체 조제 공정에서 조제된 복합체를, 적절한 조건(예를 들면, 37℃, 5% CO2 분위기 등) 하에서, 소정 시간(예를 들면, 12시간 ~ 150일간) 배치함으로써 행할 수 있다.
또한 상기 배양 공정은, 생체 내에서, 실시할 수도 있고, 예를 들면, 전술의 복합체를 생체 내에 매입하고, 이것을 소정 시간 유치(留置)하고, 복합체의 외표면을 포위하도록 형성되는 생체 조직과 복합체를 일체화함으로써, 행할 수도 있다.
복합재로부터의 심재의 취득은, 핀셋 등을 이용하여, 적절히 행할 수 있다.
또한 상기 공정에서의 각 조작은, 수동으로 행해도 좋고, 기계나 장치를 이용해서 행해도 좋고, 특별히 한정되지 않는다.
(복합재)
본 실시 형태(I)의 복합재는, 본 실시 형태(I)의 연골 세포괴 중 특히 도너츠형의 연골 세포괴가 관상 구조체의 외표면에 설치되어 있는 것이다(도 6(ｖ) 참조).
관상 구조체의 소재, 외경, 내경, 길이 등； 관상 구조체 1개에 대해서 이용되는 도너츠형의 연골 세포괴의 수 등은, 본 실시 형태(I)의 복합재의 제조 방법에 대해 전술한 바와 같이 해도 좋다.
또한, 연골 세포괴를 복수 이용했을 경우의, 인접하는 2개의 연골 세포괴(연골 조직) 간의 거리로서는, 목적이나 용도에 따라 적절히 정해도 좋고, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 0.1 ~ 100 mm로 해도 좋고, 인접하는 2개의 연골 세포괴(연골 조직)가 서로 겹쳐 있어도 좋다(즉, 거리 0 mm).
본 실시 형태(I)의 복합재에서는, 관상 구조체의 내부에 심재가 설치되어 있어도 좋다(도 6(ｖ) 참조).
심재의 소재, 외경, 길이 등은, 본 실시 형태(I)의 복합재의 제조 방법에 대해 전술한 바와 같이 해도 좋다.
본 실시 형태(I)의 복합재는, 본 실시 형태의 복합재의 제조 방법에 의해 제조된 것으로 해도 좋다.
본 실시 형태(I)의 연골 세포괴, 이식 재료, 복합재는, 관절, 기관, 코 등의 치료에 유용하고, 보다 구체적으로는, 반월판, 기관 연골, 코 연골, 귀 연골, 추간 판, 관절 연골, 인대, 아킬레스건, 등의 치료에 호적하게 이용할 수 있다.
본 실시 형태(I)의 연골 세포괴, 이식 재료, 복합재의 제조 방법에 의하면, 예를 들면, 환자의 환부의 CT화상을 CAD 도면화하고, 이러한 도면에 따라서 연골 세포괴 및 이식 재료의 형상을 갖추는 것도 가능해지기 때문에, 본 실시 형태의 연골 세포괴, 이식 재료, 복합재의 제조 방법은, 테일러 메이드 의료의 실현에 크게 공헌할 가능성을 가지고 있다.
[[발명(II)]]
상피계 세포는, 세포배양기에 접착하기 어려운, 배양기에의 접착이 불충분하면 증식 후의 세포의 형태가 불안정하게 되는 등의 문제가 있고, 종래의 방법에서는 안정한 세포배양이 어려웠다. 또한, 상피계 세포는 악틴 필라멘트가 발달하고 있지 않고 세포간의 결합이 약하기 때문에, 세포배양기에의 접착이 약하면 세포 배양면으로부터 박리하기 쉬웠다. 또한, 상피계 세포로부터 형성한 스페로이드도 세포배양기에 접착하기 어렵고, 세포배양기 중에서 부유하기 쉽기 때문에, 배지 교환 등의 경우, 오흡인할 우려가 매우 컸다.
발명(II)에 관해, 본 발명자들은, 온도 응답성 폴리머로 피복한 세포배양기는, 상피계 세포의 접착성이 매우 우수한 것, 특히, 상피계 세포 이외의 세포는, 온도 응답성 폴리머로 피복한 세포배양기에 적절한 힘으로 접착하고, 밀도가 일정 이상이 되면 자기 응집하는 성질을 가지는 경우가 많지만, 상피계 세포와 온도 응답성 폴리머로 피복한 세포배양기를 조합하면, 다른 세포와는 달리, 배양면과 강하게 접착하는 것을 찾아냈다. 그리고, 온도 응답성 폴리머로 피복한 세포배양기를 이용함으로써, 상피계 세포의 배양이 용이하게 되고, 증식 중의 세포의 형태도 우수한 것을 찾아냈다. 또한, 세포구조체가 피복 세포배양면으로부터 박리하기 어려워져, 배지 교환 등의 경우에 오흡인하기 어려워져, 효율 좋게 상피계 세포의 세포구조체를 형성할 수 있는 방법을 찾아냈다.
[상피계 세포의 배양 방법]
본 발명(II)의 상피계 세포의 배양 방법은, 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물을 조제하는 조제 공정과, 상기 온도 응답성 폴리머 또는 상기 온도 응답성 폴리머 조성물로 세포배양기의 배양면의 적어도 일부를 피복하여 피복 영역 A를 형성하고, 피복 영역 A를 가지는 피복 세포배양기를 준비하는 배양기 준비 공정과, 상피계 세포를 상기 피복 세포배양기에 파종하는 파종 공정과, 상기 피복 영역 A에 접착한 상기 상피계 세포를 배양하는 배양 공정을 포함하고, 상기 피복 영역 A에서의 상기 온도 응답성 폴리머 또는 상기 온도 응답성 폴리머 조성물의 농도가 0.3 pg/㎟ 이상이다.
본 발명(II)의 상피계 세포의 배양 방법에 의하면, 배양 중의 상피계 세포의 의도하지 않은 박리가 일어나기 어려워져, 용이하게 상피계 세포를 배양할 수 있다.
상기 피복 세포배양기는, 배양면 전면이 피복 영역 A이어도 좋고, 배양면의 일부가 피복 영역 A이어도 좋다. 또한, 배양면에 1개의 피복 영역 A를 가지고 있어도 좋고, 복수의 피복 영역 A를 가지고 있어도 좋다.
(조제 공정)
실시 형태(II)에서의 조제 공정으로서는, 상기 발명(I)에서의 조제 공정과 마찬가지의 공정을 들 수 있고, 호적예로서도 마찬가지의 것을 들 수 있다.
또한 본 실시 형태(II)에서, 배양 방법에 이용되는 온도 응답성 폴리머 및 온도 응답성 폴리머 조성물로서는, 상피계 세포의 접착성이 한층 우수하다고 하는 관점에서, (A)가 바람직하다.
또한, 본 실시 형태(II)에서, 2-N, N-디메틸아미노에틸 메타크릴레이트(DMAEMA)를 포함하는 혼합물을 조제하는 조제 공정을, 혼합물 조제 공정으로 칭하는 경우가 있다.
(배양기 준비 공정)
본 발명(II)의 실시 형태(이하, 「본 실시 형태(II)」라고도 말한다.)의 배양 방법에서, 상기 배양기 준비 공정은, 상기 온도 응답성 폴리머 또는 상기 온도 응답성 폴리머 조성물로 세포배양기의 배양면의 적어도 일부를 피복하여 피복 영역 A를 형성하고, 피복 영역 A를 가지는 피복 세포배양기를 준비하는 공정이다.
상기 배양기 준비 공정은, 예를 들면, 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물을, 용매에 용해하여, 온도 응답성 폴리머 용액으로 한 후, 세포배양기의 배양면 상에 도포하고, 건조시켜 피복 세포배양기를 준비하는 공정(배양기 준비 공정 I)으로 해도 좋고, 또한, 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물을 포함하는 수용액(온도 응답성 폴리머 수용액)을 온도 응답성 폴리머의 담점 이하로 냉각하고, 냉각한 온도 응답성 폴리머 수용액을 세포배양기의 배양면 상에 유연시켜, 담점 초과의 온도까지 가열하여 피복 세포배양기를 준비하는 공정(배양기 준비 공정 II)으로 해도 좋다.
여기서, 피복 영역 A를 형성할 때에 사용하는 온도 응답성 폴리머 용액을 온도 응답성 폴리머 용액 A, 피복 영역 A를 형성할 때에 사용하는 온도 응답성 폴리머 수용액을, 온도 응답성 폴리머 수용액 A를 칭하는 경우가 있다.
상기 배양기 준비 공정 I에서의 온도 응답성 폴리머 용액에서의 용매로서는, 예를 들면, 물； 생리식염수； 완충액； 메탄올, 에탄올, n-프로필알코올, 이소프로필 알코올, 1-부탄올, 이소부틸 알코올, 2-부탄올, t-부틸알코올, 1-펜탄올, 2-펜탄올, 3-펜탄올, 2-메틸-1-부탄올, 3-메틸-1-부탄올, 2-메틸-2-부탄올, 3-메틸-2-부탄올, 2, 2-디메틸-1-프로판올, 1-펜탄올, 2-펜탄올, 3-펜탄올, 2-메틸-1-부탄올, 3-메틸-1-부탄올, 2-메틸-2-부탄올, 3-메틸-2-부탄올, 2, 2-디메틸-1-프로판올, 1-헥산올, 2-메틸-2-펜탄올, 알릴알코올, 벤질알코올, 살리실알코올 등의 알코올； 아세톤, 에틸메틸케톤, 디에틸케톤, 메틸프로필케톤, 메틸이소부틸케톤, 메틸비닐케톤, 시클로헥사논, 2-메틸시클로펜타논, 아세토페논, 벤조페논, 이소포론 등의 케톤； 아세트산 메틸, 아세트산 에틸, 아세트산 프로필, 아세트산 이소프로필, 아세트산 n-부틸, 아세트산 이소부틸, 아세트산 sec-부틸, 아세트산 tert-부틸, 아세트산 비닐, 포름산 메틸, 포름산 에틸, 포름산 프로필, 상기 알코올과 인산의 에스테르, 상기 알코올과 탄산의 에스테르 등의 에스테르； 클로로포름； 벤젠； 톨루엔； 디에틸에테르； 디클로로메탄； 등을 들 수 있다.
그 중에서도, 배양면에 균일하게 피복하기 쉽고, 또한, 온도 응답성 폴리머의 용해성이 우수하다고 하는 관점에서, 물, 메탄올, 에탄올, n-프로필알코올, 이소프로필 알코올, 2-부탄올, t-부틸알코올, 알릴알코올 등의 알코올； 아세톤, 에틸메틸케톤, 디에틸케톤, 메틸비닐케톤 등의 케톤； 아세트산 메틸, 아세트산 에틸, 아세트산 이소프로필, 아세트산 tert-부틸, 아세트산 비닐 등의 에스테르； 클로로포름； 벤젠； 톨루엔； 디에틸에테르； 디클로로메탄이 바람직하다. 또한, 단시간에 건조시킬 수 있어 배양면에 한층 균일하게 도포하기 쉽다고 하는 관점에서, 비점이 낮은 유기 용매(예를 들면, 탄소수 1 ~ 4의 저급알코올, 탄소수 3 ~ 5의 저급 케톤, 및 탄소수 1 ~ 4의 알킬기를 가지는 아세트산 알킬에스테르로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종, 특히, 물보다 비점이 낮은, 탄소수 1 ~ 4의 저급알코올, 탄소수 3 ~ 5의 저급 케톤, 및 탄소수 1 ~ 4의 알킬기를 가지는 아세트산 알킬에스테르로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 1종)가 더 바람직하고, 코스트, 조작성도 우수한 관점에서, 메탄올, 에탄올이 특히 바람직하다.
상기 용매는, 1종 단독으로 사용해도 좋고, 2종 이상을 병용해도 좋다.
용매는, 온도 응답성 폴리머의 용해성이 우수하기 때문에, 담점 이상의 온도(예를 들면, 실온이나 37℃ 등)로 해도, 온도 응답성 폴리머가 부용화해서 침전하기 어렵다. 그 때문에, 온도 응답성 폴리머를 도포할 때에, 온도 응답성 폴리머 용액의 온도 관리를 하는 수고를 줄일 수 있고, 간이하게 피복 세포배양기를 준비할 수 있다.
상기 배양기 준비 공정 I에서, 온도 응답성 폴리머 용액에는, 상피계 세포의 접착성을 조정하는 목적으로, 적절히 친수성 분자를 가해도 좋다. 친수성 분자로서는, 온도 응답성 폴리머의 C/A비에 영향을 주지 않는 비이온성이고 친수성인 것, 예를 들면, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 디메틸아크릴아미드(DMAA), 글리세린, TritonX, 폴리프로필렌글리콜 등을 들 수 있다.
상기 배양기 준비 공정 I에서, 온도 응답성 폴리머 용액 A 중의 온도 응답성 폴리머의 함유량은, 온도 응답성 폴리머가 배양면에 균일하게 피복되기 쉬워진다고 하는 관점에서, 온도 응답성 폴리머 용액(100질량%)에 대해서, 0.00000009 ~ 0.01질량%인 것이 바람직하고, 0.0000009 ~ 0.01질량%인 것이 보다 바람직하다.
상기 배양기 준비 공정 I에서, 온도 응답성 폴리머 용액 A 중의 친수성 분자의 함유량은, 세포가 자기 응집하기 쉬워진다고 하는 관점에서, 온도 응답성 폴리머(100질량%)에 대해서, 0.00001 ~ 0.00015질량%인 것이 바람직하고, 0.00003 ~ 0.0001질량%인 것이 보다 바람직하다.
상기 배양기 준비 공정 I에서, 온도 응답성 폴리머 용액 A는, 배양면의 전면에 도포해도 좋고, 배양면의 일부에 도포해도 좋다.
배양면의 일부에 온도 응답성 폴리머 용액을 도포하는 경우는, 배양면 상에, 피복 영역을 1개 설치해도 좋고, 복수의 피복 영역을 설치해도 좋다. 또한 배양면의 일부에 온도 응답성 폴리머 용액을 도포하는 경우는, 배양면이 세포 비접착성인 세포배양기를 이용하는 것이 바람직하다.
또한, 온도 응답성 폴리머 용액은, 피복 영역 A 전체에서 균일의 농도로 되도록 도포해도 좋고, 일부분에 진하게 도포하고 다른 부분은 연하게 도포해도 좋다.
또한 「세포 비접착성」이란, 접착계 세포(예를 들면, 선유아세포, 심근 세포, 혈관 내피세포 등)가, 통상의 배양 조건하에서, 접착하지 않는 또는 접착하기 어려운 성질을 말하고, 이른바 「저접착성」의 것도 포함한다.
상기 배양기 준비 공정 I에서, 도포한 온도 응답성 폴리머 용액을 건조시키는 조건으로서는, 배양면에 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물을 균일하게 피복하는 관점에서, 대기압 하에서, 온도 10 ~ 70℃, 시간 1 ~ 3,000분이 바람직하다. 도포한 온도 응답성 폴리머 용액을, 빠르게 건조시킴으로써, 배양면 상에 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물이 치우치는 일 없이, 균일하게 피복되기 쉬워진다.
도포한 온도 응답성 폴리머 용액은, 예를 들면, 세포배양기를 37℃의 인큐베이터 중에서 정치함으로써 건조시켜도 좋다.
상기 배양기 준비 공정 II에서, 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물을 용해하는 용매로서는, 예를 들면, 물； 생리식염수； 인산완충액, 인산완충 생리식염수(PBS), 트리스완충액 등의 완충액； 등을 들 수 있다.
상기 배양기 준비 공정 II에서, 온도 응답성 폴리머 수용액을 냉각하는 방법으로서는, 예를 들면, 온도 응답성 폴리머 수용액을 약 4℃의 냉장고에 넣어 담점 이하의 온도까지 냉각하는 방법 등을 들 수 있다.
상기 배양기 준비 공정 II에서, 온도 응답성 폴리머 수용액을 배양면 상에 유연시키는 방법으로서는, 예를 들면, 담점 이하의 온도를 가지는 온도 응답성 폴리머 수용액을, 세포배양기의 배양면을 기울임으로써 펼치는 방법, 스패츌러를 이용하여 온도 응답성 폴리머 수용액을 펼치는 방법 등을 들 수 있다.
상기 배양기 준비 공정 II에서, 유연한 온도 응답성 폴리머 수용액을 담점 초과까지 가열하는 방법으로서는, 예를 들면, 유연공정 후의 세포배양기를 37℃의 인큐베이터 중에서 정치하는 방법 등을 들 수 있다.
상기 세포배양기로서는, 시판의 멀티 웰 플레이트, 디쉬, 플라스크 등을 들 수 있다. 상기 세포배양기의 재질로서는, 폴리스티렌, 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET), 폴리프로필렌, 폴리부텐, 폴리에틸렌, 폴리카보네이트, 유리 등을 들 수 있다. 그 중에서도, 정밀한 성형 가공이 용이하고, 다양한 멸균법을 적용하는 것이 가능하고, 투명성이 있기 때문에 현미경 관찰에 적합한 관점에서, 폴리스티렌, 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET)가 바람직하다.
상기 세포배양기는, 배양면 표면에 세포접착 처리 등의 처리가 실시된 것이어도 좋고, 표면이 무처리이어도 좋다. 상기 배양면 표면은, 세포의 접착성을 조정하기 위해서, 코팅 처리, 가공 처리 등이 되어 있어도 좋다.
상기 배양면의 평면시 형상은, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 대략 사각형 등의 대략 다각형, 대략 원형 등의 형상을 들 수 있다. 그 중에서도, 보다 균질한 세포구조체가 수득되기 쉽다고 하는 관점에서, 대략 원형이 바람직하다.
상기 배양면의 바닥 형상(바닥면의 단면 형상)은, 특별히 한정되지 않지만, 평평한 바닥, 둥근 바닥 (U 바닥), V 바닥, 요철상 바닥 등을 들 수 있다. 특히, 상피계 세포의 배양 방법, 및 후술의 세포구조체의 배양 공정에서, 상피계 세포가 스페로이드상의 세포구조체
상기 배양면의 적어도 일부에 오목부를 가지고 있어도 좋다. 그 경우, 상기 피복 영역 A 내에 오목부를 설치하는 것이 바람직하다. 그 중에서도, 오목부는 피복 영역 A의 중앙부에 설치되는 것이 바람직하다.
상기 오목부의 깊이는, 예를 들면, 0.001 ~ 10.0 mm인 것이 바람직하고, 0.01 ~ 1 mm인 것이 보다 바람직하다.
또한, 상기 오목부의 평면시 면적은, 예를 들면, 0.01 ~ 10.0 ㎟인 것이 바람직하고, 0.1 ~ 1 ㎟인 것이 보다 바람직하다.
상기 세포배양기의 배양면의 면적은, 150 ㎠ 이하인 것이 바람직하고, 21 ㎠ 이하인 것이 보다 바람직하고, 200 ㎟ 이하인 것이 더 바람직하다. 또한 상기 세포배양기의 배양면의 면적의 하한치는, 시판 사이즈의 것이면 사용 가능하고, 특별히 한정되지 않는다.
피복 영역 A의 면적은, 150 ㎠ 이하인 것이 바람직하고, 21 ㎠ 이하인 것이 보다 바람직하고, 200 ㎟ 이하인 것이 더 바람직하다.
또한, 세포배양기의 배양면의 전면적(100%)에 대한, 피복 영역 A의 면적은, 50 ~ 100%인 것이 바람직하고, 80 ~ 100%인 것이 보다 바람직하다.
상기 피복 영역 A에서의, 단위면적당 가지는 온도 응답성 폴리머의 양은, 0.3 pg/㎟ 이상이고, 3.0pg/㎟ 이상인 것이 바람직하고, 30 pg/㎟ 이상인 것이 보다 바람직하고, 또한, 200 ng/㎟ 이하인 것이 바람직하다. 상기 범위로 하면, 상피계 세포가 배양면에 접착해 한층 배양이 용이하게 된다.
상기 피복 세포배양기에서의, 피복 영역 A의 제타 전위로서는, 0 ~ 50 mV가 바람직하고, 보다 바람직하게는 0 ~ 35 mV, 더욱 바람직하게는 10 ~ 25 mV이다. 제타 전위가 0 mV 이상인 것에 의해, 음으로 대전되는 세포가 접착하기 쉬워진다. 또한, 제타 전위가 50 mV 이하인 것에 의해, 세포 독성을 경감할 수 있다.
또한, 제타 전위를 상기 범위로 함으로써, 상피계 세포와 피복 영역 A의 접착성이 한층 향상한다. 이것은, 표면 제타 전위를 상기 범위로 함으로써, 피복 영역 A에 세포 독성을 야기하지 않는 미약한 양전하를 제공할 수 있고, 또한, 파종한 세포의 빠른 접착을 확보해, 세포의 활성의 향상 및 세포외 매트릭스의 분비를 촉진하고, 또한, 세포 유주를 적절히 억제하여, 세포간의 결합을 강하게 할 수 있는 것에 의한 것으로 추측된다.
또한 제타 전위란, 폴리스티렌 라텍스를 히드록시프로필셀룰로오스로 피복한 입자(제타 전위： -5 mV ~ ＋5 mV)를 표준의 모니터 입자로 해서 제타 전위계(예를 들면, 형번 「ELSZ」, Otsuka Electronics Co., Ltd. 제 등)로 측정한, Smoluchowski식에 의해 산출되는 값을 말한다.
상기 피복 영역 A에 대한 물의 접촉각으로서는, 본 발명(II)의 효과를 높이는 관점에서, 50 ~ 90°이 바람직하고, 보다 바람직하게는 60 ~ 80°, 더욱 바람직하게는 62 ~ 78°이다. 또한 피복 영역 A에 대한 물의 접촉각이란, 피복 영역 A 내의 임의의 수개의 점에서, JIS　R3257에 준거해 측정되는 접촉각의 평균치를 말한다.
(파종 공정)
상기 파종 공정은, 상피계 세포를 상기 피복 세포배양기에 파종하는 공정이다. 세포를 복수회로 나누어 파종해도 좋다.
상피계 세포로서는, 예를 들면, 창약시험에서 다용되는 HepG2, HepaRG, HepaRA 등의 간암 유래 배양 세포, 간세포, BxPC-3 등의 췌장암 유래 세포, 생체로부터 채취한 이러한 초대 배양 세포 등을 들 수 있다. 그 중에서도, 세포가 가지는 고유의 성질의 모든 것이 평균적이고, 당업자에게 주지인, HepaRG, HepaRA 세포 등의 간암 유래 배양 세포가 창약시험에는 바람직하고, 초대 세포가 항암제 개발이나 임상 검사에 호적하다.
상기 상피계 세포는, 1종 단독으로 사용해도 좋고, 2종 이상을 병용해도 좋다.
상기 파종 공정에서, 상기 상피계 세포 이외에도, 간엽계 줄기세포, 간질 세포 등의 다른 세포가 포함되어 있어도 좋다.
상기 파종 공정에서, 파종 후의 상기 상피계 세포의 피복 영역 A 상의 밀도는, 너무 연해서 상피계 세포가 사멸하지 않는 정도의 밀도이면 특별히 한정되지 않고, 예를 들면, 상기 피복 영역 A의 표면적에 대해서, 5 ~ 100% 컨플루언트가 바람직하고, 보다 바람직하게는 50 ~ 100% 컨플루언트, 더 바람직하게는 80 ~ 100% 컨플루언트이다. 파종하는 세포 밀도가 상기 범위이면, 상피계 세포를 한층 용이하게 배양할 수 있다.
파종 후의 세포의 피복 영역 A 상의 밀도로서는, 너무 연해서 상피계 세포가 사멸하지 않는 정도의 밀도이면 특별히 한정되지 않고, 예를 들면, 20 ~ 15,000개/㎟가 바람직하고, 50 ~ 1,500개/㎟가 보다 바람직하다. 예를 들면, 배양면의 면적이 8.4 ㎟인 384 웰 세포 배양 플레이트에, 25μL의 세포액을 가해 파종하는 경우, 세포액 중의 세포수는 7 ~ 5040개/μL가 바람직하다. 또한 파종되는 세포는, 살아있는 세포로 한다.
세포의 파종은, 예를 들면, 37℃의 인큐베이터 중에 정치해 둔 피복 세포배양기를, 실온의 클린벤치에 꺼내서 행할 수 있다.
또한 세포는 배지에 희석해 파종하는 것이 바람직하다. 희석하는 배지로서는, 상피계 세포의 배양이 가능한 배지이면, 특별히 한정되지 않는다.
(배양 공정)
상기 배양 공정은, 상기 피복 영역 A에 접착한 상기 상피계 세포를 배양하는 공정이다.
상피계 세포의 배양은, 예를 들면, 일반적인 37℃의 세포 인큐베이터를 이용해 행할 수 있다.
배양한 상피계 세포는, PBS 등으로 세정한 후, 트립신, 트립신 EDTA, 시판의 세포 박리 용액 등을 사용하여, 박리하고, 희석해 계대를 할 수 있다.
[상피 간엽 전이 유도제]
발명자들은, 상술의 본 발명(II)의 실시 형태의 배양 방법에 이용되는 온도 응답성 폴리머 및 온도 응답성 폴리머 조성물이, 상피계 세포의 간엽계 세포에의 전이(상피 간엽 전이(EMT))를 유도하는 효과를 가지는 것을 찾아냈다.
즉, 본 발명(II)은 상피 간엽 전이 유도제에 관해, 상기 상피 간엽 전이 유도제는, 상술의 본 발명(II)의 실시 형태의 배양 방법에 이용되는 온도 응답성 폴리머 및 온도 응답성 폴리머 조성물을 포함하고, 호적하게는 상기 온도 응답성 폴리머 및 온도 응답성 폴리머 조성물로 이루어진다.
상피 간엽 전이를 유발시키는 종래의 기술로서는, TGF(Transforming　Growth　Factor)-β, EGF(Epidermal　Growth　Factor) 등의 증식 인자를 사용해 EMT를 유발시키는 기술이나, 상피계 암세포를 타입 IV 콜라겐 상에서 배양함으로써 EMT를 유발시키는 기술이 공지이다.
그러나, 상술의 종래 기술에서는, TGF-β나 EGF 등의 증식 인자로서 천연물 유래의 것을 이용했을 경우, 증식 인자에 미지 물질이나 병원성 물질이 포함될 가능성을 부정할 수 없고, 또한, 로트간의 편차 등에 의해 실험의 재현성에 악영향을 미칠 가능성이 있다. 또한, 증식 인자로서 유전자 재조합 기술로 조제한 것을 이용했을 경우, 증식 인자에 대장균 유래의 엔도톡신이 혼입하는 문제나, 수득되는 단백질이 숙주 대장균 특유의 당쇄 수식을 받아 천연물 유래의 증식 인자와는 구조도 성질도 다른 것이 되어 버린다고 하는 문제가 있다.
본 발명(II)의 상피 간엽 전이 유도제에 의하면, 메카니즘은 불명하지만 증식 인자를 필요로 하는 일 없이, 100% 화학합성에 의한 온도 응답성 폴리머 및 온도 응답성 폴리머 조성물이 도포된 배양면 상에 상피계 세포를 배양하는 것만으로, 상피 간엽 전이를 유발시킬 수 있다. 그 때문에, 전이에 악영향을 미칠 수 있는 물질의 혼입의 리스크, 로트간의 편차가 적고, 증식 인자를 이용했을 경우에 필요한 엄밀한 온도 관리도 불필요하고, 동물 자원의 절감에 공헌하는 것도 가능해진다. 본 발명(II)의 상피 간엽 전이 유도제에 의하면, 염가이고 간편하게 상피 간엽 전이를 실현할 수 있다.
본 실시 형태(II)에서의 온도 응답성 폴리머 및 온도 응답성 폴리머 조성물로서는, 본 실시 형태(II)에서 전술의, (A) 2-N, N-디메틸아미노에틸 메타크릴레이트(DMAEMA) 단위 및 음이온성 모노머 단위를 포함하는 온도 응답성 폴리머, (B) N-이소프로필 아크릴아미드(NIPAM) 단위, 양이온성 모노머 단위, 및 음이온성 모노머 단위를 포함하는 온도 응답성 폴리머, (C) 2-N, N-디메틸아미노에틸 메타크릴레이트(DMAEMA) 및/또는 그 유도체의 중합체와, 2-아미노-2-히드록시메틸-1, 3-프로판디올(트리스)와, 핵산, 헤파린, 히알루론산, 덱스트란황산, 폴리스티렌 설폰산, 폴리아크릴산, 폴리메타크릴산, 폴리인산, 황산화 다당류, 커드란 및 폴리알긴산, 및 이들의 알칼리금속염으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 음이온성 물질을 포함하는 온도 응답성 폴리머 조성물 등을 들 수 있고, 그 중에서도, 상피계 세포의 접착성이 한층 우수하다고 하는 관점에서, (A)가 바람직하다.
여기서, 상기 (A)로서는, 예를 들면, (A-1) DMAEMA를 물 존재하에서 중합하는 방법에 의해 수득되는 온도 응답성 폴리머, (A-2) 주로 DMAEMA를 포함하는 폴리머 블록(중합쇄 α말단)와 주로 DMAEMA와 음이온성 모노머를 포함하는 코폴리머 블록(중합쇄 ω말단)을 포함하는, 온도 응답성 폴리머 등을 들 수 있고, 그 중에서도, 상피 간엽 전이의 유발을 높이는 관점에서, (A-1)가 바람직하다.
(A) ~ (C)의 온도 응답성 폴리머 및 온도 응답성 폴리머 조성물의 상세에 대하여는 상술한 바와 같이 해도 좋다.
본 실시 형태(II)에서는, 온도 응답성 폴리머 또는 상기 온도 응답성 폴리머 조성물로 세포배양기의 배양면의 적어도 일부를 피복하여 피복 영역 A를 형성하고, 피복 영역 A를 가지는 피복 세포배양기를 준비하고, 그 다음에, 상피계 세포를 상기 피복 세포배양기에 파종하고, 그 후, 상기 피복 영역 A에 접착한 상기 상피계 세포를 배양함으로써, 상피 간엽 전이 유도제로서의 상피 간엽 전이의 효과를 수득할 수 있다.
배양기의 준비, 세포의 파종, 세포의 배양의 상세에 대하여는, 특별히 한정되는 일 없이, 본 실시 형태(II)의 상피계 세포의 배양 방법, 본 실시 형태(II)의 세포구조체의 제조 방법의 경우와 마찬가지로 해도 좋다.
[세포구조체의 제조 방법]
본 발명(II)의 세포구조체의 제조 방법은, 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물을 조제하는 조제 공정과, 상기 온도 응답성 폴리머 또는 상기 온도 응답성 폴리머 조성물로 세포배양기의 배양면의 적어도 일부를 피복하여 피복 영역 A를 형성하고, 피복 영역 A를 가지는 피복 세포배양기를 준비하는 배양기 준비 공정과, 상피계 세포를 상기 피복 세포배양기에 파종하는 파종 공정과, 상기 상피계 세포로부터 괴상의 세포구조체를 형성하고, 상기 피복 영역 A에 접착한 세포구조체를 수득하는 배양 공정을 포함하고, 상기 피복 영역 A에서의 상기 온도 응답성 폴리머 또는 상기 온도 응답성 폴리머 조성물의 농도가 0.3 pg/㎟ 이상이다.
(조제 공정)
본 실시 형태(II)의 세포구조체의 제조 방법에서의 조제 공정으로서는, 상술의 본 실시 형태(II)의 상피계 세포의 배양 방법에서의 조제 공정과 마찬가지의 공정을 들 수 있다.
(배양기 준비 공정)
본 실시 형태(II)의 세포구조체의 제조 방법에서의 조제 공정으로서는, 상술의 본 실시 형태(II)의 상피계 세포의 배양 방법에서의 조제 공정과 마찬가지의 공정을 들 수 있다.
본 실시 형태(II)의 세포구조체의 제조 방법에서의 조제 공정의 상기 배양기 준비 공정 I에서, 온도 응답성 폴리머 용액 A 중의 온도 응답성 폴리머의 함유량은, 온도 응답성 폴리머가 배양면에 균일하게 피복되기 쉬워진다고 하는 관점에서, 온도 응답성 폴리머 용액(100질량%)에 대해서, 0.00000009 ~ 0.0001질량%인 것이 바람직하고, 0.00000009 ~ 0.0000009질량%인 것이 보다 바람직하다.
본 실시 형태(II)의 세포구조체의 제조 방법에서의 조제 공정의 상기 세포배양기의 배양면의 면적은, 상피계 세포를 포함하는 세포구조체의 제조가 한층 용이하게 되는 관점에서, 200 ㎟ 이하인 것이 바람직하고, 50 ㎟ 이하인 것이 보다 바람직하고, 10 ㎟ 이하인 것이 더 바람직하다. 또한 상기 세포배양기의 배양면의 면적의 하한치는, 시판 사이즈의 것이면 사용 가능하고, 특별히 한정되지 않는다.
본 실시 형태(II)의 세포구조체의 제조 방법에서의 조제 공정의 피복 영역 A의 면적은, 상피계 세포를 포함하는 세포구조체가 피복 영역 A에 의해 강고하게 접착하고, 피펫팅 등의 조작에 의해서 세포구조체가 박리하기 어려워지는 관점에서, 10 ㎟ 이하인 것이 바람직하고, 1.0 ㎟ 이하인 것이 보다 바람직하고, 0.1 ㎟ 이하인 것이 더 바람직하다.
또한, 본 실시 형태(II)의 세포구조체의 제조 방법에서의 조제 공정의 세포배양기의 배양면의 전 면적(100%)에 대한, 피복 영역 A의 면적은, 0.1 ~ 50%인 것이 바람직하고, 0.1 ~ 10%인 것이 보다 바람직하다.
또한 피복 영역 A는, 세포배양기의 바닥부 뿐만 아니라 측면에도 미치는 것이, 세포구조체를 형성하기 쉽게 하는 관점에서 바람직하다.
본 실시 형태(II)의 세포구조체의 제조 방법에서의 조제 공정의 상기 피복 영역 A에서의, 단위면적당 가지는 온도 응답성 폴리머의 양은, 0.3 pg/㎟ 이상이고, 0.3 ~ 200 pg/㎟인 것이 바람직하고, 0.3 ~ 150 pg/㎟인 것이 보다 바람직하고, 0.3 ~ 9 pg/㎟인 것이 더 바람직하다. 상기 범위로 하면, 세포구조체가 피복 영역 A에 한층 강고하게 접착한다.
본 실시 형태(II)의 세포구조체의 제조 방법에서의 조제 공정에서, 세포외 매트릭스가 풍부하게 분비되어 세포의 활성이 높은 세포구조체가 수득되는 관점에서, 배양면의 전면에 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물을 도포하는 것이 바람직하다.
사람의 손으로는 배지 교환 등의 조작이 곤란한 384 웰 플레이트, 1536 웰 플레이트로 세포를 배양하는 경우나, 세포를 수많은 웰로 배양하는 경우에는, 자동 배양기에 의해서 세포배양의 조작이 행해지는 경우가 많다. 그러나, 자동 배양기에 의한 조작에서는, 부유하는 세포구조체를 오흡인하지 않게, 배지를 흡인하는 흡인구의 위치를 웰 마다 조정하는 것이 곤란하고, 부유하는 세포구조체를 오흡인하기 쉽고, 세포구조체의 배양 효율이 나빴다. 특히, 상피계 세포의 세포구조체는, 배양면에 접착하기 어렵기 때문에, 오흡인이 일어나기 쉬웠다.
배양면의 바닥부(예를 들면, 피복 영역 A)의 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물의 농도가 높고, 측면의 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물의 농도는 낮거나 또는 0으로 하면, 측면은 상피계 세포가 일시적으로 접착하지만 중력의 영향으로 박리하기 쉽고, 바닥면은 측면으로부터 박리해서 떨어진 상피계 세포가 집합해 형성된 세포구조체가 강하게 접착하기 때문에, 제작이 용이함과 함께, 배지 교환 시에 오흡인하기 어려운 상피계 세포의 세포구조체를 형성할 수 있다. 또한, 측면의 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물의 농도는 낮게 하면, 상피계 세포가 측면에 한 번 접착해 세포 매트릭스를 분비한 후에, 박리해 바닥부에 낙하함으로써, 세포의 활성이 높은 상피계 세포를 포함하는 세포구조체를 수득할 수 있다.
배양면의 바닥부의 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물의 농도가 높고, 측면의 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물의 농도는 낮은 세포배양기로서는, 예를 들면, 배양면의 적어도 일부에 피복 영역 A를 갖고, 배양면의 적어도 일부로서, 피복 영역 A와는 다른 위치에 피복 영역 B를 가지는 세포배양기를 들 수 있다.
피복 영역 B는, 피복 영역 A의 주위를 둘러싸도록 형성되어 있는 것이 바람직하다. 예를 들면, 환저의 배양면에서, 그 중앙부(최심부)에 피복 영역 A를 설치하고, 그 이외의 부분에 피복 영역 B를 설치함으로써, 피복 영역 B 상의 상피계 세포는 중력의 영향으로 낙하하고, 중앙부의 피복 영역 A에 모여, 세포구조체를 한층 형성하기 쉬워진다. 또한, 형성된 세포구조체는, 피복 영역 A에서 강고하게 접착하기 때문에, 피펫팅 등의 조작에 의해서 박리하기 어려워진다.
피복 영역 B에서의 상기 온도 응답성 폴리머 또는 상기 온도 응답성 폴리머 조성물의 농도는, 피복 영역 A보다 낮은 것이 바람직하고, 200 pg/㎟ 미만인 것이 보다 바람직하고, 100 pg/㎟ 미만인 것이 보다 바람직하고, 50 pg/㎟ 이하인 것이 더 바람직하다.
또한, 피복 영역 B의 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물의 농도는, 피복 영역 A의 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물의 농도에 대해서, 5 ~ 90%의 농도인 것이 바람직하고, 10 ~ 50%의 농도인 것이 보다 바람직하다.
피복 영역 B에서의 상기 온도 응답성 폴리머 또는 상기 온도 응답성 폴리머 조성물의 농도는, 전영역에서 균일한 농도이어도 좋고, 일부분에서 진하고 다른 부분에서 연해도 좋다. 또한, 피복 영역 B에는, 상기 온도 응답성 폴리머 또는 상기 온도 응답성 폴리머 조성물이 없는 부분이 존재하고 있어도 좋다.
본 실시 형태(II)의 세포구조체의 제조 방법에서의 조제 공정에서, 배양면의 바닥 형상(바닥면의 단면 형상)은, 상피계 세포가 배양면의 최심부에 모여 세포구조체를 형성하기 쉬워지는 관점에서, 둥근 바닥(U 바닥), V 바닥, 요상(凹狀) 바닥인 것이 바람직하고, 스페로이드상의 세포구조체를 형성하기 쉬워지는 관점에서, 둥근 바닥(U 바닥, 방추 바닥)인 것이 특히 바람직하다.
둥근 바닥(U 바닥, 방추 바닥)를 가지는 세포배양기에 대해서,
세포배양기의 깊이 방향에 따르는 단면에서의 배양면의 바닥부의 윤곽선의 곡률 반경 R는, 둥근 바닥(U바닥, 방추바닥) 전체의 평균으로, 50 mm 이하인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 10 mm 이하이고, 더 바람직하게는 5 mm 이하이고, 특히 바람직하게는 2 mm 이하이고, 또한, 0.1 mm 이상인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 0.2 mm 이상이고, 더 바람직하게는 0.4 mm 이상이고, 특히 바람직하게는 0.8 mm 이상이다.
세포배양기의 최대폭 L는, 100 mm 이하인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 50 mm 이하이고, 더 바람직하게는 20 mm 이하이고, 특히 바람직하게는 10 mm 이하이고, 또한, 1 mm 이상인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 2 mm 이상이고, 더 바람직하게는 3 mm 이상이고, 특히 바람직하게는 4 mm 이상이다.
둥근 바닥(U 바닥, 방추 바닥)의 최심부는, 도 15에 나타내는 형상에 한정되지 않고, 소정폭을 가지는 평면이어도 좋다.
피복 영역 A에서 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물의 농도를 높게 하고, 피복 영역 B에서 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물의 농도를 피복 영역 A보다 낮게 하는 방법으로서는, 예를 들면, 배양면의 바닥부에 요부상의 오목부(도 16(i) 참조)을 설치한 배양기를 이용하여, 온도 응답성 폴리머 용액을 첨가하고, 오목부의 온도 응답성 폴리머 용액을 많게 하고, 측면의 온도 응답성 폴리머 용액을 적게 한 상태에서 건조시키는 방법 등을 들 수 있다.
또한 오목부의 형상으로서는, 상술의 형상을 들 수 있다.
(파종 공정)
본 실시 형태(II)의 세포구조체의 제조 방법에서의 파종 공정으로서는, 상술의 본 실시 형태(II)의 상피계 세포의 배양 방법에서의 파종 공정과 마찬가지의 공정을 들 수 있다.
본 실시 형태(II)의 세포구조체의 제조 방법에서의 파종 공정에서, 파종 후의 상기 상피계 세포의 피복 영역 A 상의 밀도는, 너무 연해서 상피계 세포가 사멸하지 않는 정도의 밀도이면 특별히 한정되지 않고, 예를 들면, 상기 피복 영역 A의 표면적에 대해서, 5 ~ 100% 컨플루언트가 바람직하고, 보다 바람직하게는 50 ~ 100% 컨플루언트, 더 바람직하게는 80 ~ 100% 컨플루언트이다. 파종하는 세포 밀도가 상기 범위이면, 상피계 세포의 세포구조체를 한층 용이하게 조제할 수 있다.
이 파종 공정에서, 파종하는 세포 수로서는, 세포구조체를 한층 형성하기 쉬워진다고 하는 관점에서, 20개/㎟ 이상인 것이 바람직하고, 50개/㎟ 이상인 것이 보다 바람직하고, 100개/㎟ 이상인 것이 더 바람직하고, 500개/㎟ 이상인 것이 특히 바람직하고, 15,000개/㎟ 이하, 10,000개/㎟ 이하, 5,000개/㎟ 이하, 1,500개/㎟ 이하인 것이 바람직하다. 예를 들면, 배양면의 면적이 8.4 ㎟인 384 웰 세포 배양 플레이트에, 25μL의 세포액을 가해 파종하는 경우, 세포액 중의 세포수는 7 ~ 5040개/μL가 바람직하다. 또한 파종되는 세포는, 살아있는 세포로 한다.
(배양 공정)
상기 배양 공정은, 상기 상피계 세포로부터 괴상의 세포구조체를 형성하고, 상기 피복 영역 A에 접착한 세포구조체를 수득하는 공정이다.
파종한 세포는, 정치하는 것이 바람직하다. 파종한 세포를 정치하는 온도는, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 30℃ 이상이 바람직하고, 보다 바람직하게는 35 ~ 38℃, 더 바람직하게는 37℃이다.
파종한 세포를 정치할 시간은, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 1 ~ 240시간 배양하는 것이 바람직하고, 10 ~ 96시간 배양하는 것이 보다 바람직하다.
이하에, 본 실시 형태(II)의 세포구조체의 제조 방법의 예에 대해서, 도 15, 16을 이용해 설명한다.
도 15는, 상피계 세포를 포함하는 세포구조체의 제조 방법의 일례이다.
둥근 바닥의 배양면을 가지는 세포배양기(예를 들면, 384 웰 플레이트, 1536 웰 플레이트 등)에 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물을 도포하여 피복하고, 피복 영역 A를 가지는 피복 세포배양기를 준비한다 (도 15(i)(ii) 참조). 그 후, 피복 세포배양기에, 배지로 희석한, 상피계 세포를 포함하는 세포액을 가한다 (도 15(iii) 참조). 파종한 상피계 세포는, 피복 영역 A 전면에 접착한다 (도 15(iｖ) 참조). 또한 이 예에서는, 상피계 세포의 밀도는, 100% 컨플루언트이다(도 15(iｖ) 참조). 상피계 세포는, 피복 영역 A에 한 번 접착함으로써, 세포외 매트릭스 성분을 분비하고, 세포의 활성을 높게 유지할 수 있다. 피복 영역 A에 접착한 측면의 상피계 세포는, 중력의 영향을 받아 피복 영역 A로부터 박리하고, 배양면 바닥면에 모인다. 바닥면에 모인 상피계 세포는, 접착해 세포구조체를 형성한다 (도 15(ｖ) 참조). 형성된 세포구조체는, 배양면 바닥면에서 피복 세포배양기에 접착하고 있다 (도 15(ｖ) 참조).
또한 이 예에서, 피복 영역 A에서의 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물의 농도는, 측면에 접착한 상피계 세포는 중력의 영향으로 박리하지만, 바닥부에 접착한 상피계 세포는 피펫팅 등의 조작에 의해서도 박리하기 어려운 정도로 강고하게 접착하고 있다.
도 16은, 상피계 세포를 포함하는 세포구조체의 제조 방법의 일례이다.
바닥면에 오목부(요부)를 가지는 둥근 바닥의 배양면의 세포배양기(예를 들면, 384 웰 플레이트, 1536 웰 플레이트 등)에 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물을 포함하는 용액을 첨가한다. 여기서, 용액은 바닥면의 오목부에 모이고, 오목부에는 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물의 농도가 높은 피복 영역 A가 형성된다. 한편, 측면의 용액은 오목부에 비해 양이 적어지기 때문에, 측면에는 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물의 농도가 피복 영역 A에 비해 낮은 피복 영역 B가 형성된다. 그리고, 피복 영역 A 및 피복 영역 B를 가지는 피복 세포배양기를 준비한다 (도 16(i)(ii) 참조). 측면의 피복 영역 B에서는, 상피계 세포가 일시적으로 접착하는 것의 중력의 영향으로 박리하기 쉽고, 바닥면의 피복 영역 A는, 측면으로부터 박리해서 떨어진 상피계 세포가 집합해 형성된 세포구조체가 강하게 접착한다. 이것에 의해, 배지 교환 시의 오흡인을 억제할 수 있다 (도 16(ii) 참조). 피복 세포배양기에, 배지로 희석한, 상피계 세포를 포함하는 세포액을 가한다 (도 16(iii) 참조). 파종한 상피계 세포는, 피복 영역 A 및 피복 영역 B에 접착한다 (도 16(iｖ) 참조). 또한 이 예에서는, 상피계 세포의 밀도는, 100% 컨플루언트이다(도 16(iｖ) 참조). 상피계 세포는, 피복 영역 A 및 피복 영역 B에 한 번 접착함으로써, 세포외 매트릭스 성분을 분비하고, 세포의 활성을 높게 유지할 수 있다. 피복 영역 B에 접착한 측면의 상피계 세포는, 중력의 영향을 받아 피복 영역 B로부터 박리하고, 배양면 바닥면에 모인다. 바닥면에 모인 상피계 세포는, 접착해 세포구조체를 형성한다 (도 16(ｖ) 참조). 형성된 세포구조체는, 피복 영역 A에서 피복 세포배양기에 접착하고 있다 (도 16(ｖ) 참조).
[상피계 세포용 세포배양기]
본 발명(II)의 상피계 세포용 세포배양기는, 배양면의 적어도 일부에, 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물로 피복된 피복 영역 A를 갖고, 상기 피복 영역 A에서의 상기 온도 응답성 폴리머 또는 상기 온도 응답성 폴리머 조성물의 농도가 0.3 pg/㎟ 이상이다.
본 발명(II)의 상피계 세포용 세포배양기에 의하면, 배양 중에 상피계 세포가 박리하기 어렵고, 용이하게 상피계 세포를 배양하는 것이 가능해진다. 또한, 용이하게 상피계 세포를 포함하는 세포구조체를 제조할 수 있다.
본 실시 형태(II)의 상피계 세포용 세포배양기에서의, 온도 응답성 폴리머 및 온도 응답성 폴리머 조성물로서는, 상술과 마찬가지의 것을 들 수 있다.
본 실시 형태(II)의 상피계 세포용 세포배양기로서는, 상술의 피복 세포배양기를 들 수 있다.
본 실시 형태(II)의 상피계 세포용 세포배양기는, 예를 들면, 상술의 조제 공정, 배양기 준비 공정에 의해 제조할 수 있다.
[[발명(III)]]
[입체조직체의 제작 장치]
본 실시 형태(III)의 입체조직체의 제작 장치는, 적어도 1개의 관통공을 가지는 배양면과 상기 관통공을 삽통하는 심봉으로 이루어지는 입체조직체의 제작 장치로서, 상기 배양면에 온도 응답성 폴리머 또는 상기 온도 응답성 폴리머 조성물로 피복된 피복배양면을 적어도 1개 포함하고, 1개의 상기 피복배양면의 내측에, 적어도 1개의 상기 관통공을 갖고, 상기 배양면이 상기 심봉의 연재 방향으로 가동한다.
또한 본 발명(III)에서, 폴리머의 「담점」이란, 반드시 엄밀한 의미로, 「소정의 온도 미만에서는 용해하지만, 소정의 온도 이상에서는 부용화해서 침전하는, 그 온도」를 가리키는 것이 아니고, 「부용화해서 침전한 폴리머를 소정의 온도 미만의 조건하에서 용해할 때에, 용해에 필요로 하는 시간이 10분 이상인, 그 온도」를 가리킨다.
본 실시 형태(III)의 입체조직체의 제작 장치는, 구성부품이 적고 의료용품으로서의 적용이 비교적 용이하고, 감염의 리스크가 적다. 또한, 밀봉된 플라스틱 용기 내에 설치하여, 위생적으로, 무균적으로, 입체조직체를 제작할 수 있다. 또한, 구성부품이 적고, 소형이기 때문에, 의료용품으로서 폐기할 때의 폐기물의 양을 줄일 수 있다.
(심봉)
상기 심봉은, 수득되는 입체조직체의 치수안정성을 확보할 수 있으면 특별히 한정되지 않고, 구체적으로는, 상기 심봉의 재질로서는, 예를 들면, 폴리스티렌, 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET), 폴리프로필렌, 폴리부텐, 폴리에틸렌, 아크릴수지, 폴리우레탄수지, 요소 수지, 폴리카보네이트 등의 플라스틱； 실리콘 고무, 클로로프렌 고무(네오프렌(등록상표) 등), SBR 등의 고무·엘라스토머； 세라믹； 유리； 스테인리스, 티탄, 니티놀(등록상표) 등의 금속·무기 재료 등을 들 수 있다. 그 중에서도, 다양한 멸균법을 적용하는 것이 가능하고, 용출물이 적고 의료재료로서의 실적이 있다고 하는 관점에서, 포치스티렌, 폴리우레탄수지, 아크릴수지, 폴리카보네이트 등의 플라스틱, 스테인리스, 니티놀(등록상표) 등의 금속이 바람직하다.
상기 심봉의 표면은, 세포접착성이어도 좋고, 세포 비접착성이어도 좋다. 그 중에서도, 심봉에 감긴 입체조직체의 구조를 유지하기 쉽다고 하는 관점에서, 심봉의 표면은 세포 비접착성인 것이 바람직하다. 또한, 세포로부터 분비된 물질을 포함하는 입체조직체를 심봉으로부터 벗기기 쉬운(빼내기 쉬운) 관점에서, 심봉의 표면에는 단백질이 포함되지 않는 것이 바람직하다.
심봉의 표면의 세포접착성은, 심봉의 표면에 세포접착성 물질을 코팅하는 방법, 세포접착성 물질의 막으로 심봉의 표면을 피복하는 방법, 방사선·플라즈마 방전 등을 해서 세포접착성의 분자단(分子團)을 심봉의 표면에 도입하는 방법 등에 의해, 조정할 수 있다.
상기 세포접착성 물질로서는, 라미닌, 콜라겐, 피브로넥틴, 펩티드, 양이온성 폴리머, 폴리스티렌 등을 들 수 있다. 상기 펩티드로서는, 알기닌-글리신-아스파라긴산의 배열을 가지는 펩티드, 알기닌 잔기가 8개 이상 연속하는 배열을 가지는 펩티드 등을 들 수 있다. 상기 양이온성 폴리머로서는, 아미노스티렌 등을 들 수 있다. 이들 중에서도, 세포접착성이 높은, 라미닌, 콜라겐, 피브로넥틴이 바람직하다. 또한, 상기 열거의 세포접착성 물질을 포함하는 시약도 호적하게 이용할 수 있고, 이러한 시약으로서는, 혈청 등을 들 수 있다.
심봉의 주위에 감긴 링상의 입체조직체는, 스스로 분비한 세포외 매트릭스에 덮여 있기 때문에, 심봉의 표면을 세포접착성으로 하는 처리를 하지 않아도, 심봉 주위에 감길 수 있다.
또한 「세포접착성」이란, 접착계 세포(예를 들면, 혈관 내피세포, 혈관 세포, 연골 세포, 선유아세포 등)가, 통상의 배양 조건하에서, 접착하는 성질을 말하고, 이른바 「저접착성」의 것도 포함한다.
또한 심봉의 주위에 감기도록 해서 형성한 링상 또는 관강상 등의 입체조직체는, 심봉의 표면이 세포접착성인 경우에도, 심봉 표면으로부터 벗길 수 있다. 또한, 심봉 표면이, 테프론(등록상표), 실리콘 고무, 친수성 코팅 등의 세포 비접착성인 경우는, 예를 들면, 심봉 표면을 콜라겐 튜브로 피복함으로써, 콜라겐 튜브와 함께 링상 또는 관강상 등의 입체조직체를 빼낼 수 있다.
상기 심봉의 연재 방향(길이 방향)으로 수직인 면의 단면 형상으로서는, 예를 들면, 대략 원형, 대략 다각형, 반월형, 초승달형, 현형(弦形), 누형(淚形) 등을 들 수 있다. 그 중에서도, 연골 고리(軟骨輪), 혈관, 기관 등의 형상에 가까운 입체조직체가 수득하는 관점에서, 대략 원형이 바람직하다. 즉, 상기 심봉은, 대략 원주상이 바람직하다.
또한 상기 심봉의 연재 방향에 수직인 면의 단면 형상은, 연재 방향으로, 동일 형상이어도 좋고, 다른 형상이어도 좋다.
또한, 심봉의 연재 방향의 형상은, 직선상(도 18 ~ 20 참조)이어도 좋고, C자상, U자상, 소용돌이상 등의 곡선상이어도 좋다.
상기 심봉의 치수는, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 길이는 0.1 ~ 600 mm인 것이 바람직하고, 1 ~ 300 mm인 것이 보다 바람직하다. 또한, 심봉의 연재 방향에 수직인 면의 단면 형상이 대략 원형인 경우, 그 최대경은, 0.01 ~ 150 mm인 것이 바람직하고, 0.1 ~ 50 mm인 것이 보다 바람직하다.
상기 심봉의 표면은, 평활해도 좋고, 요철이 있어도 좋다. 또한, 표면에 구멍을 가지고 있어도 좋고, 망목상, 다수의 세공이 설치된 다공질상 등이어도 좋다.
또한, 상기 심봉은, 내부가 공동(空洞)이어도 좋다.
그 중에서도, 심봉의 주위에 감긴 입체조직체에 포함되는 세포 전체에, 배지 성분, 산소를 안정적으로 공급할 수 있고, 세포의 활성을 높게 유지할 수 있다고 하는 관점, 세포의 대사 산생물을 빠르게 배제할 수 있다고 하는 관점에서, 상기 심봉의 내부가 공동이고, 심봉의 표면이 다공질상인 것이 바람직하다.
심봉이 스펀지와 같은 연속 기포체로 이루어지는 다공질체의 경우, 세포가 심봉 내부에 침윤하고, 심부까지 도달한 세포가 괴사할 가능성이나, 형성되는 입체조직체와 심봉이 완강하게 접착해 박리 곤란해질 가능성이 있기 때문에, 심봉 표면의 최대 공경(孔徑)이 200μm 이하인 것이 바람직하다. 심봉이 금속 섬유의 직포와 같은 섬유 집합체로 이루어지는 경우, 세포가 심봉 표면에 접착하기 쉽고, 또한, 세포의 분화에 영향을 줄 가능성이 있기 때문에, 10μm 이상인 것이 바람직하다.
또한 복수개의 심봉이 이용되는 경우, 각 심봉의 재질, 치수, 형상 등은, 같아도 좋고 달라도 좋다. 또한, 심봉간의 거리는 특별히 한정되지 않고, 예를 들면, 복수개의 심봉이 접하고 있어도 좋다.
(배양면)
상기 배양면은, 적어도 일부의 표면 상에, 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물로 피복된 피복배양면을 적어도 하나 가진다. 상기 배양면에는, 1개의 피복배양면이 설치되어 있어도 좋고, 복수의 피복배양면이 설치되어 있어도 좋다.
1개의 피복배양면이 설치되어 있는 경우, 상기 배양면은, 전면이 피복배양면이어도 좋고(도 18, 20 참조), 일부가 피복배양면이어도 좋다(도 19 참조). 그 중에서도, 제조가 용이한 관점에서, 배양면의 전면이 피복배양면인 것이 바람직하다.
또한, 배양면이, 판상, 원반상 등의 두 개의 표면을 가지는 형상인 경우, 한 면에만 피복배양면을 가지고 있어도 좋고, 양면에 피복배양면을 가지고 있어도 좋다.
상기 배양면의 재질로서는, 폴리스티렌, 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET), 폴리프로필렌, 폴리부텐, 폴리에틸렌, 폴리카보네이트, 유리, 실리콘 수지, 아크릴수지, 폴리우레탄수지 등을 들 수 있다. 그 중에서도, 정밀한 성형 가공이 용이하고, 다양한 멸균법을 적용하는 것이 가능하다는 관점에서, 폴리스티렌, 폴리에틸렌 테레프탈레이트, 유리, 실리콘 수지, 아크릴수지가 바람직하다.
상기 배양면은, 표면에 세포접착 처리 등의 처리가 실시된 것이어도 좋고, 표면이 무처리이어도 좋다. 상기 배양면 표면은, 세포의 접착성을 조정하기 위해서, 코팅 처리, 가공 처리 등이 되어 있어도 좋다.
상기 배양면의 평면시 형상은, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 대략 사각형 등의 대략 다각형(관통공을 가지는 대략 다각형), 대략 원형(링상 등의 관통공을 가지는 대략 원형) 등의 형상을 들 수 있다.
상기 배양면의 면적은, 링상 또는 관강상 등의 입체조직체를 한층 용이하게 제조할 수 있다고 하는 관점에서, 0.1 ㎟ ~ 150 ㎠인 것이 바람직하고, 8.4 ㎟ ~ 21 ㎠인 것이 보다 바람직하다.
상기 배양면의 바닥 형상(바닥면의 단면 형상)은, 특별히 한정되지 않지만, 평평한 바닥, 둥근 바닥, 요철상 바닥 등을 들 수 있다. 그 중에서도, 링상 또는 관강상 등의 입체조직체가 수득되기 쉽다고 하는 관점에서, 평평한 바닥이 바람직하다.
상기 배양면은, 동시에 복수의 입체조직체를 형성할 수 있고, 보다 단시간에 보다 효율적으로 관강상의 입체조직체를 형성할 수 있는 관점에서, 복수(예를 들면, 2 이상, 5 이상, 10 이상 등) 설치되어 있어도 좋다. 또한 배양면의 상한수는, 세포의 파종, 배양 등이 가능하고, 입체조직체를 제작할 수 있는 범위이면, 특별히 한정되지 않는다.
배양면이 복수 설치되어 있는 경우, 1개의 상기 심봉이, 적어도 2의 상기 배양면의 상기 관통공을 삽통하고 있는 것이 바람직하고, 1개의 상기 심봉이, 모든 상기 배양면의 상기 관통공을 삽통하고 있는 것이 보다 바람직하다.
또한 본 실시 형태(III)의 입체조직체의 제작 장치로서는, 예를 들면, 1개의 심봉이 삽통되어 있는 복수의 배양면(심봉의 연재 방향으로 배양면이 선반 형상으로 배치된, 심봉과 복수의 배양면으로 이루어지는 부재)을 1개 가지고 있어도 좋고, 복수개 가지고 있어도 좋다.
배양면이 복수 설치되어 있는 경우, 상기 심봉의 연재 방향에서의 각 배양면 간의 거리는, 같아도 좋고, 달라도 좋다. 상기 심봉의 연재 방향에서의 각 배양면간의 거리는, 각 배양면에서 제작한 링상 또는 관강상의 입체조직체가, 용이하게 연결된다고 하는 관점에서, 예를 들면, 사용하는 세포의 심봉의 연재 방향의 길이에 대해서 10배 이하인 것이 바람직하고, 7.5배 이하인 것이 보다 바람직하다. 구체적으로는, 상기 심봉의 연재 방향에서의 각 배양면 간의 거리는, 0.1 ~ 10 mm인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 0.2 ~ 2.0 mm이다.
또한 각 배양면에서 제작한 링상 또는 관강상의 입체조직체가 연결된다는 것은, 각 배양면에서 제작한, 링상 또는 관강상의 각 입체조직체를 구성하는 세포끼리 접착하는 것 외에도, 각 배양면에서 제작한, 링상 또는 관강상의 각 입체조직체를 구성하는 세포로부터 분비된 단백질(예를 들면, 세포외 매트릭스를 구성하는 단백질 등)을 통해, 각 배양면에서 제작한 링상 또는 관강상의 입체조직체가 연결되어 있는 경우도 포함한다.
상기 피복배양면의 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물로서는, 후술의 조제 공정에 기재한 것을 들 수 있다.
상기 피복배양면에서, 단위면적당 포함되는 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물의 함유량으로서는, 링상 또는 관강상 등의 입체조직체가 보다 용이하게 수득되는 관점에서, 5 ~ 50 ng/㎟가 바람직하고, 보다 바람직하게는 15 ~ 40 ng/㎟이다.
또한 피복배양면이 복수 설치되어 있는 경우, 각 피복배양면의 단위면적당 포함되는 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물의 함유량은, 같아도 좋고 달라도 좋다.
상기 피복배양면의 평면시 형상은, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 대략 사각형 등의 대략 다각형(관통공을 가지는 대략 다각형), 대략 원형(링상 등의 관통공을 가지는 대략 원형) 등의 형상을 들 수 있다. 그 중에서도, 세포의 분포가 보다 균질한 입체조직체가 수득되기 쉽다고 하는 관점에서, 대략 원형이 바람직하다.
또한 피복배양면이 복수 설치되어 있는 경우, 각 피복배양면의 평면시 형상은, 같아도 좋고 달라도 좋다.
상기 피복배양면의 표면적으로서는, 세포의 분포가 보다 균질한 입체조직체가 수득되기 쉽다고 하는 관점에서, 0.1 ㎟ ~ 150 ㎠가 바람직하고, 8.4 ㎟ ~ 21 ㎠가 보다 바람직하다. 피복배양면이 복수 설치되어 있는 경우, 각 피복배양면의 표면적은, 같아도 좋고 달라도 좋다.
또한, 피복배양면의 면적이 작으면 심봉에 감기는 세포수가 줄어 들고, 세포 매트릭스를 주성분으로 하는 입체조직체를 형성하기 쉬워진다. 세포 매트릭스를 주성분으로 하는 입체조직체를 형성할 때의 피복배양면의 면적으로서는, 예를 들면, 0.1 ~ 50 ㎟를 들 수 있다.
또한 피복배양면의 표면적은, 현미경 사진의 화상 해석 등의 당업자에게 주지의 방법에 의해 측정할 수 있다.
상기 피복배양면 표면의 제타 전위로서는, 0 ~ 50 mV가 바람직하고, 보다 바람직하게는 0 ~ 35 mV, 더욱 바람직하게는 10 ~ 25 mV이다. 제타 전위가 0 mV 이상인 것에 의해, 음으로 대전되는 세포가 접착하기 쉬워진다. 또한, 제타 전위가 50 mV 이하인 것에 의해, 세포 독성을 경감할 수 있다.
또한, 제타 전위를 상기 범위로 함으로써, 세포를 적절한 배양 조건에서 배양하는 것만으로, 파종한 세포를, 심봉의 주위에 감긴 링상의 입체조직체로 할 수 있다. 이것은, 표면 제타 전위를 상기 범위로 함으로써, 피복배양면 표면에 세포 독성을 야기하지 않는 미약한 양전하를 제공할 수 있고, 또한, 파종한 세포의 빠른 접착을 확보하여 세포의 활성의 향상 및 세포외 매트릭스의 분비를 촉진하고, 또한, 세포 유주를 적절히 억제하여 세포간의 결합을 강하게 할 수 있는 것에 의한 것으로 추측된다.
피복배양면이 복수 설치되어 있는 경우, 각 피복배양면의 제타 전위는, 같아도 좋고 달라도 좋다.
또한 제타 전위란, 폴리스티렌 라텍스를 히드록시프로필셀룰로오스로 피복한 입자(제타 전위： -5 mV ~ ＋5 mV)를 표준의 모니터 입자로 해서 제타 전위계(예를 들면, 형번 「ELSZ」, Otsuka Electronics Co., Ltd. 제 등)로 측정한, Smoluchowski식에 의해 산출되는 값을 말한다.
상기 피복배양면에 대한 물의 접촉각으로서는, 본 발명(III)의 효과를 높이는 관점에서, 50 ~ 90°이 바람직하고, 보다 바람직하게는 60 ~ 80°, 더욱 바람직하게는 62 ~ 78°이다. 피복배양면이 복수 설치되어 있는 경우, 각 피복배양면에 대한 물의 접촉각은, 같아도 좋고 달라도 좋다.
또한 피복배양면에 대한 물의 접촉각이란, 피복배양면 내의 임의의 수개의 점에서, JIS　R3257에 준거해 측정되는 접촉각의 평균치를 말한다.
상기 배양면은, 적어도 1개의 관통공을 가진다. 상기 관통공이 1개인 경우, 배양면의 중앙부에 있는 것이 바람직하다. 상기 관통공에 상기 심봉을 삽통함으로써, 상기 배양면과 상기 심봉이 일체가 된 입체조직체의 제작 장치로 된다.
상기 관통공의 평면시 형상은, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 대략 다각형, 대략 원형 등의 형상을 들 수 있고, 세포가 보다 균일하게 분포한 입체조직체가 수득되기 쉽다고 하는 관점에서, 상기 심봉의 연재 방향에 수직인 면의 단면 형상과 같은 형상인 것이 바람직하다. 그 중에서도, 상기 심봉의 연재 방향에 수직인 면의 단면 형상, 및 상기 관통공의 평면시 형상이, 모두 대략 원형인 것(도 18 ~ 20 참조)이 바람직하다.
또한 관통공은, 심봉이 삽통하는 형상이면, 심봉의 연재 방향에 수직인 면의 단면 형상과 같은 형상이어도 좋고, 다른 형상이어도 좋다. 또한, 관통공이 복수개 설치되어 있는 경우, 각 관통공의 평면시 형상은 같아도 좋고 달라도 좋다.
상기 관통공은, 상기 피복배양면의 내측에 적어도 1개 설치되어 있고 1개 설치되어 있는 것이 바람직하다.
상기 관통공은, 상기 피복배양면의 내측에 설치되어 있고, 1개의 관통공이 상기 피복배양면의 중앙부에 설치되어 있는 것이 바람직하고, 상기 피복배양면의 중심을 포함하는 부분에 설치되어 있는 것이 보다 바람직하다. 상기 피복배양면이 대략 원형인 경우는, 피복배양면의 중심으로부터 0.75 r 이내(r는, 피복배양면의 반경)의 영역에 관통공이 설치되어 있는 것이 바람직하다. 상기 관통공이, 피복배양면의 중앙부에 설치되어 있으면, 세포가 응집하는 방향을 중앙부에 집중시킬 수 있고, 세포의 분포가 한층 균질한 입체조직체를 제작할 수 있다. 또한 관통공을 피복배양면의 중앙부로부터 어긋나게 설치함으로써, 링의 고리의 굵기가 불균일한 입체조직체를 제작할 수 있다.
상기 관통공은, 치수 형상이 좋은 입체조직체가 수득되기 쉽다고 하는 관점에서, 1개의 상기 피복배양면의 내측에, 1개 설치되어 있는 것이 바람직하다.
또한 본 실시 형태(III)의 제작 장치는, 복수의 피복배양면이 설치되어 있는 경우, 전 피복배양면 중 적어도 1개의 피복배양면에서, 피복배양면의 내측에 적어도 1개의 관통공이 설치되어 있으면 좋고, 피복배양면의 수와 관통공의 수가 동수이고, 각 피복배양면의 내측에 1개의 관통공이 설치되어 있어도 좋다. 예를 들면, 본 실시 형태(III)의 제작 장치는, 배양면에 5개의 피복배양면이 설치되어 있고, 그 중의 하나의 피복배양면의 내측에, 1개 관통공이 설치된, 5개의 피복배양면과 1개의 관통공을 가지는 제작 장치이어도 좋고, 배양면에 5개의 피복배양면이 설치되어 있고, 각 피복배양면의 내측에 각각 1 개씩 관통공이 설치된, 5개의 피복배양면과 5개의 관통공을 가지는 제작 장치 등이어도 좋다.
상기 관통공의 표면적으로서는, 0.1 ㎟ ~ 150 ㎠가 바람직하고, 8.4 ㎟ ~ 21 ㎠가 보다 바람직하다. 또한, 관통공이 대략 원형인 경우, 최대경은 0.01 ~ 150 mm인 것이 바람직하다. 또한 관통공이 복수개 설치되어 있는 경우, 각 관통공의 표면적은, 같아도 좋고 달라도 좋다.
피복배양면의 내측에 1개의 관통공이 설치되어 있는 피복배양면에서, 상기 피복배양면의 표면적(100%)에 대한, 상기 관통공의 표면적의 비율은, 0.1 ~ 50%가 바람직하고, 보다 바람직하게는 1 ~ 30%이다. 비율이 상기 범위인 것에 의해, 심봉의 주위에 감긴 입체조직체를 한층 용이하게 수득할 수 있다.
(심봉과 배양면의 위치 관계)
상기 심봉은, 상기 관통공을 삽통하고 있으면 좋고, 심봉과 배양면은 접하고 있어도 좋고(도 18, 19 참조), 심봉과 배양면의 사이에 틈이 있어도 좋다(도 20 참조). 심봉과 배양면의 사이의 틈으로서는, 응집한 세포가 틈을 뛰어넘어 심봉에 감길 수 있고, 및/또는 배양면을 심봉의 연재 방향으로 이동시켰을 때에 심봉의 주위에 감긴 입체조직체가 벗겨지지 않는 거리인 것이 바람직하고, 5.0 mm 이내인 것이 보다 바람직하고, 0.5 mm 이내인 것이 더 바람직하다.
상기 배양면이 복수 설치되어 있는 경우, 각 배양면에 세포가 균일하게 분포하기 쉬워지고, 각 배양면에서 제작한 링상 또는 관강상의 입체조직체를 용이하게 연결할 수 있는 관점에서, 심봉과 배양면의 사이에 틈이 있는 것이 바람직하다.
상기 배양면은, 심봉의 연재 방향으로 가동하고, 그 중에서도, 배양면을 움직일 때에 생기는 배지의 유동에 의해서, 심봉의 주위에 감긴 입체조직체에 물리적 스트레스를 제공할 우려가 적고, 보다 용이하게 링상 또는 관강상 등의 입체조직체가 수득하는 관점에서, 피복배양면으로부터 배양면을 향하는 방향으로 가동하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 배양면과 심봉의 연재 방향이 이루는 각도는, 특별히 한정되지 않지만, 수직인 것이 바람직하다.
관통공이 복수개 설치되어 있는 경우, 모든 관통공에 심봉이 삽통하고 있어도 좋고, 일부의 관통공에 심봉이 삽통하고 있어도 좋다. 그 중에서도, 파종한 세포가 배양면보다 하측으로 떨어지기 어려워지고, 파종한 세포를 피복배양면에 접착시킬 수 있다고 하는 관점에서, 모든 관통공에 심봉이 삽통하고 있는 것이 바람직하다.
이하에, 본 실시 형태(III)의 입체조직체의 제작 장치의 일례에 대해서, 도 18 ~ 21, 26을 이용해 설명한다. 도 18 ~ 21, 26의 제작 장치는, 구성부품이 적고 의료용품으로서의 적용이 비교적 용이하고, 감염의 리스크가 적다고 하는 관점, 및 바이오 튜브의 제작이 용이하다는 관점에서 바람직하다. 그 중에서도, 한층 용이하게 링상 또는 관강상 등의 입체조직체가 수득하는 관점에서, 도 20, 26의 입체조직체의 제작 장치가 바람직하다.
도 18은, 본 실시 형태(III)의 일례의 입체조직체의 제작 장치의 개략도이다.
이 예에서는, 원반상의 배양면의 한편의 표면의 전면에, 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물로 피복된 피복배양면이 설치되어 있다. 피복배양면의 중앙부에는 관통공이 있고, 원주상의 심봉이 관통공을 삽통하고 있다. 피복배양면과 심봉의 사이에 틈은 없고, 피복배양면과 심봉은 접하고 있다. 배양면은, 심봉의 연재 방향에 대해서 수직이고, 심봉의 연재 방향으로 가동한다. 또한 도 18 ~ 21의 배양면은, 도면의 상방향(배양면으로부터 피복배양면을 향하는 방향)으로도, 도면의 하방향(피복배양면으로부터 배양면을 향하는 방향)으로도 가동한다. 배양면이 움직이는 방향, 움직이는 거리, 및/또는 움직이는 타이밍은, 예를 들면, 컴퓨터 등으로 제어해 자동적으로 행해도 좋다.
도 19는, 본 실시 형태(III)의 일례의 입체조직체의 제작 장치의 개략도이다.
이 예에서는, 원반상의 배양면의 한편의 표면의 일부에, 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물로 피복된 피복배양면이 설치되어 있다.
도 20은, 본 실시 형태(III)의 일례의 입체조직체의 제작 장치의 개략도이다.
이 예에서는, 원반상의 배양면의 한편의 표면의 전면에, 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물로 피복된 피복배양면이 설치되어 있다. 피복배양면과 심봉의 사이에는 틈이 있다. 즉, 관통공의 공경에 대해서, 심봉의 경(徑)이 작다.
도 21은, 본 실시 형태(III)의 일례의 입체조직체의 제작 장치의 사진이다.
이 예에서는, 원반상의 플라스틱 제의 배양면의 한편의 표면의 전면에 온도 응답성 폴리머로 피복된 피복배양면이 설치되어 있다. 피복배양면의 중앙부에는 관통공이 있어, 원주상의 심봉이 관통공을 삽통하고 있다. 심봉의 내부는 공동, 심봉의 표면은 망목상이고, 심봉의 내부에 금속봉을 통해 제작 장치를 고정하고 있다. 피복배양면과 심봉의 사이에는 틈이 있다. 배양면은, 심봉의 연재 방향에 대해서 수직이고, 심봉의 연재 방향으로 가동한다.
본 실시 형태(III)의 입체조직체의 제작 장치는, 배양면의 외경보다 조금 큰 내경의 용기에 넣어져 있다. 이것에 의해, 도 21의 상부로부터 파종한 세포가, 배양면보다 하측으로 떨어지기 어려워지고, 파종한 세포를 피복배양면에 접착시킬 수 있다.
도 26은, 본 실시 형태(III)의 일례의 입체조직체의 제작 장치의 개략도이다.
이 예에서는, 원반상의 배양면의 한편의 표면의 전면에, 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물로 피복된 피복배양면이 설치된 배양면이 2개 설치되어 있다. 1개의 심봉이, 2의 배양면의 관통공을 삽통하고 있고, 2개의 배양면에서, 동시에 링상 또는 관강상의 입체조직체를 형성할 수 있다. 피복배양면과 심봉의 사이에는 틈이 있다. 2개의 배양면간의 거리를 조정함으로써, 2개의 배양면에서 제작한 링상 또는 관강상의 각 입체조직체는, 각 입체조직체에 포함되는 세포끼리 접착하고, 또는 각 입체조직체에 포함되는 세포가 분비한 단백질을 통해, 용이하게 연결할 수 있다.
(입체조직체의 제작 장치의 제조 방법)
본 실시 형태(III)의 입체조직체의 제작 장치의 제조 방법으로서는, 예를 들면,
온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물을 조제하는 조제 공정과, 상기 온도 응답성 폴리머 또는 상기 온도 응답성 폴리머 조성물로 상기 배양면을 피복하여 피복배양면을 준비하는 피복배양면 준비 공정
을 포함하는 방법 등을 들 수 있다.
-조제 공정-
실시 형태(III)에서의 조제 공정으로서는, 상기 발명(I)에서의 조제 공정과 마찬가지의 공정을 들 수 있고, 호적예로서도 마찬가지의 것을 들 수 있다.
또한 본 실시 형태(III)에서, 배양 방법에 이용되는 온도 응답성 폴리머 및 온도 응답성 폴리머 조성물로서는, 링상 또는 관강상 등의 입체조직체가 한층 용이하게 수득되는 관점에서, (A)가 바람직하다.
또한, 본 실시 형태(III)에서, 2-N, N-디메틸아미노에틸 메타크릴레이트(DMAEMA)를 포함하는 혼합물을 조제하는 조제 공정을, 혼합물 조제 공정으로 칭하는 경우가 있다.
또한, 본 실시 형태(III)에서, (A-1)의 온도 응답성 폴리머에 의하면, 후술한 바와 같이, 세포를 적절한 배양 조건에서 배양함으로써, 링상 또는 관강상 등의 입체조직체를 형성시킬 수 있다.
또한, 본 실시 형태(III)에서, (A-2)의 온도 응답성 폴리머에 의하면, 후술한 바와 같이, 세포를 적절한 배양 조건에서 배양함으로써, 링상 또는 관강상 등의 입체조직체를 형성시킬 수 있다.
또한, 본 실시 형태(III)에서, (B)의 온도 응답성 폴리머에 의하면, 후술한 바와 같이, 세포를 적절한 배양 조건에서 배양함으로써, 링상 또는 관강상 등의 입체조직체를 형성시킬 수 있다.
또한, 본 실시 형태(III)에서, 상기 비율의 혼합형 온도 응답성 폴리머 조성물을 이용했을 경우, 후술의 배양 공정에서, 입체조직체를 형성하기 쉽게 할 수 있다.
또한, 본 실시 형태(III)에서, C/A비를 0.5 ~ 16으로 함으로써, 링상 또는 관강상 등의 입체조직체를 형성시키기 쉽게 한다고 하는 상기 효과가 수득하기 쉬워진다.
- 피복배양면 준비 공정 -
상기 피복배양면 준비 공정은, 상기 온도 응답성 폴리머 또는 상기 온도 응답성 폴리머 조성물로 배양면을 피복하여 피복배양면을 준비하는 공정이다.
상기 피복배양면 준비 공정은, 예를 들면, 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물을, 용매에 용해하여, 온도 응답성 폴리머 용액으로 한 후, 배양면 상에 도포하고, 건조시켜 피복배양면을 준비하는 공정(피복배양면 준비 공정 I)으로 해도 좋고, 또한, 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물을 포함하는 수용액(온도 응답성 폴리머 수용액)을 온도 응답성 폴리머의 담점 이하로 냉각하고, 냉각한 온도 응답성 폴리머 수용액을 배양면 상에 유연시키고, 담점 초과의 온도까지 가열하여, 피복배양면을 준비하는 공정(피복배양면 준비 공정 II)으로 해도 좋다.
상기 피복배양면 준비 공정 I에서의 온도 응답성 폴리머 용액에서의 용매로서는, 예를 들면, 물； 생리식염수； 완충액； 메탄올, 에탄올, n-프로필알코올, 이소프로필 알코올, 1-부탄올, 이소부틸 알코올, 2-부탄올, t-부틸알코올, 1-펜탄올, 2-펜탄올, 3-펜탄올, 2-메틸-1-부탄올, 3-메틸-1-부탄올, 2-메틸-2-부탄올, 3-메틸-2-부탄올, 2, 2-디메틸-1-프로판올, 1-펜탄올, 2-펜탄올, 3-펜탄올, 2-메틸-1-부탄올, 3-메틸-1-부탄올, 2-메틸-2-부탄올, 3-메틸-2-부탄올, 2, 2-디메틸-1-프로판올, 1-헥산올, 2-메틸-2-펜탄올, 알릴알코올, 벤질알코올, 살리실알코올 등의 알코올； 아세톤, 에틸메틸케톤, 디에틸케톤, 메틸프로필케톤, 메틸이소부틸케톤, 메틸비닐케톤, 시클로헥사논, 2-메틸시클로펜타논, 아세토페논, 벤조페논, 이소포론 등의 케톤； 아세트산 메틸, 아세트산 에틸, 아세트산 프로필, 아세트산 이소프로필, 아세트산 n-부틸, 아세트산 이소부틸, 아세트산 sec-부틸, 아세트산 tert-부틸, 아세트산 비닐, 포름산 메틸, 포름산 에틸, 포름산 프로필, 상기 알코올과 인산의 에스테르, 상기 알코올과 탄산의 에스테르 등의 에스테르； 클로로포름； 벤젠； 톨루엔； 디에틸에테르； 디클로로메탄； 등을 들 수 있다.
그 중에서도, 배양면에 균일하게 피복하기 쉽고, 또한, 온도 응답성 폴리머의 용해성이 우수하다고 하는 관점에서, 물, 메탄올, 에탄올, n-프로필알코올, 이소프로필 알코올, 2-부탄올, t-부틸알코올, 알릴알코올 등의 알코올； 아세톤, 에틸메틸케톤, 디에틸케톤, 메틸비닐케톤 등의 케톤； 아세트산 메틸, 아세트산 에틸, 아세트산 이소프로필, 아세트산 tert-부틸, 아세트산 비닐 등의 에스테르； 클로로포름； 벤젠； 톨루엔； 디에틸에테르； 디클로로메탄이 바람직하다. 또한, 단시간에 건조시킬 수 있어 배양면에 한층 균일하게 도포하기 쉽다고 하는 관점에서, 비점이 낮은 유기 용매(예를 들면, 탄소수 1 ~ 4의 저급알코올, 탄소수 3 ~ 5의 저급 케톤, 및 탄소수 1 ~ 4의 알킬기를 가지는 아세트산 알킬에스테르로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종, 특히, 물보다 비점이 낮은, 탄소수 1 ~ 4의 저급알코올, 탄소수 3 ~ 5의 저급 케톤, 및 탄소수 1 ~ 4의 알킬기를 가지는 아세트산 알킬에스테르로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 1종)가 더 바람직하고, 코스트, 조작성도 우수한 관점에서, 메탄올, 에탄올이 특히 바람직하다.
상기 용매는, 1종 단독으로 사용해도 좋고, 2종 이상을 병용해도 좋다.
용매는, 온도 응답성 폴리머의 용해성이 우수하기 때문에, 담점 이상의 온도(예를 들면, 실온이나 37℃ 등)로 해도, 온도 응답성 폴리머가 부용화해서 침전하기 어렵다. 그 때문에, 온도 응답성 폴리머를 도포할 때에, 온도 응답성 폴리머 용액의 온도 관리를 하는 수고를 줄일 수 있고, 간이하게 피복배양면을 준비할 수 있다.
상기 피복배양면 준비 공정 I에서, 온도 응답성 폴리머 용액에는, 사용하는 세포종에 따라, 예를 들면, 접착성이 강한 간엽계 세포나, 응집력이 약한 암 세포의 경우, 세포가 자기 응집하기 쉬워진다고 하는 관점에서, 친수성 분자가 포함되는 것이 바람직한 경우가 있다. 친수성 분자로서는, 온도 응답성 폴리머의 C/A비에 영향을 주지 않는 비이온성이고 친수성인 것, 예를 들면, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 디메틸아크릴아미드(DMAA), 글리세린, TritonX, 폴리프로필렌글리콜 등을 들 수 있다.
상기 피복배양면 준비 공정 I에서, 온도 응답성 폴리머 용액 중의 온도 응답성 폴리머의 함유량은, 온도 응답성 폴리머가 배양면에 균일하게 피복되기 쉬워진다고 하는 관점에서, 온도 응답성 폴리머 용액(100질량%)에 대해서, 0.0010 ~ 3.0질량%인 것이 바람직하고, 0.0012 ~ 2.5질량%인 것이 보다 바람직하다.
상기 피복배양면 준비 공정 I에서, 온도 응답성 폴리머 용액 중의 친수성 분자의 함유량은, 세포가 자기 응집하기 쉬워진다고 하는 관점에서, 온도 응답성 폴리머(100질량%)에 대해서, 0.00001 ~ 0.00015질량%인 것이 바람직하고, 0.00003 ~ 0.0001질량%인 것이 보다 바람직하다.
상기 피복배양면 준비 공정 I에서, 온도 응답성 폴리머 용액은, 배양면의 전면에 도포해도 좋고, 배양면의 일부에 도포해도 좋다. 배양면의 일부에 온도 응답성 폴리머 용액을 도포하는 경우는, 배양면 상에, 피복배양면을 1개 설치해도 좋고, 복수의 피복배양면을 설치해도 좋다. 또한 배양면의 일부에 온도 응답성 폴리머 용액을 도포하는 경우는, 배양면이 세포 비접착성인 세포배양기를 이용하는 것이 바람직하다.
상기 피복배양면 준비 공정 I에서, 도포한 온도 응답성 폴리머 용액을 건조시키는 조건으로서는, 배양면에 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물을 균일하게 피복하는 관점에서, 대기압 하에서, 온도 10 ~ 70℃, 시간 1 ~ 3,000분이 바람직하다. 도포한 온도 응답성 폴리머 용액을, 빠르게 건조시킴으로써, 배양면 상에 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물이 치우치는 일 없이, 균일하게 피복되기 쉬워진다.
도포한 온도 응답성 폴리머 용액은, 예를 들면, 세포배양기를 37℃ 또는 40℃의 인큐베이터 중에서 정치함으로써 건조시켜도 좋다.
상기 피복배양면 준비 공정 II에서, 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물을 용해하는 용매로서는, 예를 들면, 물； 생리식염수； 인산완충액, 인산완충 생리식염수(PBS), 트리스완충액 등의 완충액； 등을 들 수 있다.
상기 피복배양면 준비 공정 II에서, 온도 응답성 폴리머 수용액을 냉각하는 방법으로서는, 예를 들면, 온도 응답성 폴리머 수용액을 약 4℃의 냉장고에 넣어 담점 이하의 온도까지 냉각하는 방법 등을 들 수 있다.
상기 피복배양면 준비 공정 II에서, 온도 응답성 폴리머 수용액을 배양면 상에 유연시키는 방법으로서는, 예를 들면, 담점 이하의 온도를 가지는 온도 응답성 폴리머 수용액을, 배양면을 기울임으로써 펼치는 방법, 스패츌러를 이용하여 온도 응답성 폴리머 수용액을 펼치는 방법 등을 들 수 있다.
상기 피복배양면 준비 공정 II에서, 유연한 온도 응답성 폴리머 수용액을 담점 초과까지 가열하는 방법으로서는, 예를 들면, 유연공정 후의 배양면을 37℃의 인큐베이터 중에서 정치하는 방법 등을 들 수 있다.
[입체조직체의 제작 방법]
본 실시 형태(III)의 입체조직체의 제작 방법에는, 상술의 본 실시 형태(III)의 입체조직체의 제작 장치를 이용한다.
본 실시 형태(III)의 입체조직체의 제작 방법은, 상기 피복배양면 상에 적어도 1종의 세포를 파종하는 파종 공정(본 발명(III)에서 「1회째의 파종 공정」이라고 칭하는 경우가 있다)과, 파종한 상기 세포를 배양하여 상기 심봉의 주위에 감긴 링상의 입체조직체를 수득하는 배양 공정(본 발명(III)에서 「1회째의 배양 공정」이라고 칭하는 경우가 있다)를 포함한다.
또한 본 발명(III)에서, 1회의 파종, 배양 공정에서 수득되는, 심봉의 주위에 감긴 입체조직체를 「링상의 입체조직체」, 링상의 입체조직체가 복수개 겹친 입체조직체를 「관강상의 입체조직체」라고 칭하는 경우가 있다.
또한 1회째의 파종 공정, 1회째의 배양 공정의 조작은, 사람의 손으로 조작하지 않는 것으로, 보다 무균적, 위생적으로 조작할 수 있을 가능성이 있다고 하는 관점에서, 컴퓨터 등을 이용해 제어하고, 자동적으로 행해도 좋다.
(1회째의 파종 공정)
상기 파종 공정에서 파종하는 세포로서 예를 들면, 혈관 내피세포, 혈관 평활근 세포 등의 혈관 세포, 심근 세포, 연골 세포, 신경 세포, 지방세포, 지방 줄기세포, 간세포, 선유아세포, 신장 세포, 평활근 세포, iPS 세포, ES 세포 등을 들 수 있다. 세포외 매트릭스를 주성분으로 하는 입체조직체를 제조하는 경우, 혈관 내피세포, 혈관 평활근 세포 등의 혈관 세포, 심근 세포, 연골 세포, 신경 세포, 지방세포, 지방 줄기세포, 간세포, 선유아세포, 신장 세포, 평활근 세포가 바람직하고, 선유아세포, 간엽계 세포가 보다 바람직하다. 상기 세포는, 1종 단독으로 사용해도 좋고, 2종 이상을 병용해도 좋다.
특히, 혈관 내피세포, 평활근 세포를 이용함으로써, 인공혈관을 수득할 수 있다. 또한, 연골 세포, 선유아세포를 이용함으로써, 인공 기관을 수득할 수 있다. 또한, 세포외 매트릭스를 구성하는 물질 등의 세포로부터 분비된 물질을 포함하는 입체조직체를 제조하는 경우, SV40 프로모터 등의 프로모터를 갖고, 엘라스틴, 콜라겐 등의 세포외 매트릭스를 구성하는 단백질을 발현하는 유전자를 조합한 발현 벡터를 도입한, LargeT 항원을 발현하는 수립 세포(예를 들면, COS 세포 등)를 이용해도 좋다. COS 세포 등의 상기 수립 세포를 이용하면, 도입한 유전자의 카피가 지지 가능해져, 다량의 유전자 발현에 의해 효율 좋게, 세포외 매트릭스를 주성분으로 하는 입체조직체를 제조할 수 있다.
상기 파종 공정에서, 파종 후의 전세포의 피복배양면 상의 밀도는, 상기 피복배양면의 표면적에 대해서, 90 ~ 100% 컨플루언트가 바람직하고, 보다 바람직하게는 95 ~ 100% 컨플루언트, 더 바람직하게는 99 ~ 100% 컨플루언트이다. 파종한 세포는, 증식을 할 때에 성질이 변화하는 경우가 있다. 파종하는 세포 밀도가 상기 범위이면, 파종한 세포가 증식하기 어려워져, 세포가 증식하기 전에 심봉의 주위에 감긴 링상의 입체조직체를 형성할 수 있기 때문에, 파종시와 같은 성질의 세포를 포함하는 입체조직체를 형성할 수 있다.
세포의 종류에도 의존하지만, 파종 후의 전세포의 피복배양면 상의 밀도로서는, 20 ~ 15,000개/㎟가 바람직하다. 또한 파종되는 세포는, 살아있는 세포로 한다.
상기 파종 공정에서, 파종한 세포가 배양면보다 하측으로 분산하지 않고, 피복배양면에 세포가 접착하기 쉬워지는 관점에서, 배양면의 외측 단부에 벽면을 설치해도 좋다. 또한, 본 실시 형태(III)의 입체조직체의 제작 장치를, 배양면의 외경보다 큰 내경을 가지는 용기에 넣어도 좋다(도 21 참조). 이것에 의해, 파종한 세포가, 배양면보다도 하측으로 떨어지기 어려워져, 파종한 세포를 피복배양면에 접착시킬 수 있다. 또한 배양면의 외경과 상기 용기의 내경의 차이는, 파종한 세포가 틈에서 떨어지기 어렵고, 배지의 확산을 저해하지 않는다고 하는 관점에서, 15.0 mm 이하가 바람직하다.
세포의 파종은, 예를 들면, 37℃의 인큐베이터 중에 정치해 둔 입체조직체의 제작 장치를, 실온의 클린벤치에 꺼내, 행할 수 있다.
또한 세포는 배지에 희석해 파종하는 것이 바람직하다. 희석하는 배지로서는, 세포의 배양이 가능한 배지이면, 특별히 한정되지 않는다.
(1회째의 배양 공정)
파종한 세포를 배양하는 조건으로서는, 예를 들면, 일반적인 37℃의 세포 인큐베이터를 이용해 행할 수 있다. 세포의 배양은, 심봉의 주위에 감긴 링상의 입체조직체가 수득될 때까지 계속하는 것이 바람직하고, 구체적으로는, 10 ~ 96시간 배양하는 것이 바람직하고, 15 ~ 48시간 배양하는 것이 보다 바람직하다.
상기 피복배양면에 접착, 배양한 세포는, 피복배양면의 내측을 향해 자기 응집을 하고, 심봉의 주위에 링상의 형태로 감긴다. 심봉의 주위에 감긴 링상의 입체조직체는, 그 입체조직체 내에 생존하고 있는 세포를 가진다.
심봉의 주위에 감긴 링상의 입체조직체로서는, 세포를 주성분으로 하는 입체조직체를 들 수 있고, 세포로 이루어지는 입체조직체이어도 좋다. 또한, 심봉의 주위에 감긴 링상의 입체조직체는, 세포외 매트릭스를 구성하는 단백질 등을 분비해 세포외 매트릭스를 구축하고, 세포외 매트릭스를 주성분으로 하는 입체조직체이어도 좋다. 또한, 심봉의 주위에 감긴 링상의 입체조직체는, 세포로부터 분비된 물질(예를 들면, 세포외 매트릭스를 구성하는 단백질 등의 단백질 등)을 포함하는 입체조직체이어도 좋고, 세포로부터 분비된 물질을 주성분으로 하는 입체조직체인 것이 바람직하고, 세포로부터 분비된 물질만으로 이루어지는 입체조직체이어도 좋다. 상기 세포로부터 분비된 물질로서는, 예를 들면, 단백질, 당, 지질 등을 들 수 있고, 단백질이 바람직하다.
여기서, 「주성분으로 한다」란, 입체조직체의 질량(100질량%)에 대해서, 50질량% 초과를 말하고, 60질량% 이상이 바람직하고, 70질량% 이상이 보다 바람직하다.
모든 피복배양면에 세포를 파종하고, 파종한 세포를 배양하여 입체조직체를 수득하는 것이 바람직하다.
(배양면 이동 공정)
본 실시 형태(III)의 입체조직체의 제작 방법은, 심봉의 주위에 감긴 링상의 상기 입체조직체가 수득된 후에, 상기 배양면을 상기 심봉의 연재 방향으로 이동시키는 배양면 이동 공정과, 상기 이동 후의 상기 피복배양면 상에 적어도 1종의 세포를 파종하는 파종 공정(본 발명(III)에서 「2회째 이후의 파종 공정」이라고 칭하는 경우가 있다)과, 파종한 상기 세포를 배양하여 심봉의 주위에 감긴 링상의 상기 입체조직체에 인접하는, 상기 심봉의 주위에 감긴 링상의 입체조직체를 수득하는 배양 공정(본 발명(III)에서 「2회째 이후의 배양 공정」이라고 칭하는 경우가 있다)의 반복을 더 포함하는 것이 바람직하다. 즉, 1회째의 파종 공정, 1회째의 배양 공정을 거쳐, 링상의 입체조직체가 수득된 후에, 배양면 이동 공정과, 2회째 이후의 파종 공정과, 2회째 이후의 배양 공정의 반복을 포함하고 있어도 좋다.
또한 배양면 이동 공정, 2회째 이후의 파종 공정, 2회째 이후의 배양 공정의 조작은, 사람의 손으로 조작하지 않는 것으로, 보다 무균적, 위생적으로 조작할 수 있을 가능성이 있다고 하는 관점에서, 컴퓨터 등을 이용해 제어하고, 자동적으로 행해도 좋다.
배양면 이동 공정은, 전회의 파종 공정에서, 심봉의 주위에 감긴 링상의 상기 입체조직체가 수득된 후에 설치되는 공정이다. 배양면 이동 공정은, 전회의 배양 공정에서, 심봉의 주위에 감긴 링상의 상기 입체조직체가 수득되는 직후에 설치되어도 좋고, 간격(예를 들면, 1분 ~ 96시간의 간격 등)을 두고 설치되어도 좋다.
상기 배양면 이동 공정에서, 배양면을 심봉의 연재 방향으로 이동시키는 거리로서는, 0.01 ~ 50 mm가 바람직하고, 0.1 ~ 10 mm가 보다 바람직하다.
또한 1회째의 파종 공정, 1회째의 배양 공정을 거쳐 수득된 링상의 입체조직체, 및 2회째의 파종 공정, 2회째의 배양 공정을 거쳐 수득된 링상 입체조직체는, 서로 세포끼리 접착하고 있어도 좋고, 떨어져 있어도 좋다. 떨어져 있는 2개의 링상의 입체조직체간의 거리로서는, 배양면을 심봉의 연재 방향으로 이동시키는 상기 거리를 들 수 있다. 링상의 입체조직체 내의 세포가 신축·유주 등을 하고, 2개의 링상의 입체조직체 내의 세포끼리 접착하고, 2개의 링상의 입체조직체가 연결되는； 2개의 링상의 입체조직체 내의 세포가 분비하는 물질(예를 들면, 단백질 등)을 통해 2개의 링상의 입체조직체가 연결되는； 별도 제작한 단백질, 세포 등을 2개의 링상의 입체조직체간 외에 2개의 링상의 입체조직체가 연결되는； 이들의 조합에 의해, 2개의 링상의 입체조직체가 연결되는； 등에 의해, 떨어져 있는 2개의 링상의 입체조직체를 용이하게 연결할 수 있다. 또한 배양면의 이동시는, 배양면을 고정하고 심봉을 움직여도 좋고, 심봉을 고정해 배양면을 움직여도 좋고, 배양면 및 심봉을 움직여도 좋다.
또한 입체조직체의 두께를 제어하는 관점에서, 예를 들면, 배양면 이동 공정을 설치하지 않고, 2회째 이후의 파종 공정 및 2회째 이후의 배양 공정, 또는 2회째 이후의 파종 공정 및 2회째 이후의 배양 공정의 반복을 설치함으로써, 전회의 파종 공정에서 수득된, 심봉의 주위에 감긴 링상의 상기 입체조직체의 주위에, 또 다른 링상의 입체조직체를 감고, 입체조직체의 일부를 두껍게 하는 것도 가능하다.
또한, 심봉의 주위에 감긴 링상의 상기 입체조직체의 주위에, 또 다른 링상의 입체조직체를 감은 후에, 배양면 이동 공정을 설치해 마찬가지의 조작을 계속함으로써, 입체조직체의 전체를 두껍게 하는 것도 가능하다. 심봉의 주위에 감긴 링상의 입체조직체를 형성하는 세포와 그 주위에 감긴 링상의 입체조직체를 형성하는 세포의 종류를 변경함으로써, 다른 세포의 층을 가지는 입체조직체를 수득할 수 있다.
(2회째 이후의 파종 공정)
상기 2회째 이후의 파종 공정으로서는, 1회째의 파종 공정과 마찬가지의 공정을 들 수 있다.
상기 2회째 이후의 파종 공정에서 이용하는 세포의 종류, 농도 등은, 1회째의 파종 공정과 같아도 좋고, 달라도 좋다. 또한, 2회째 이후의 파종 공정에서 이용하는 세포의 종류, 농도 등은, 2회째 이후의 각 회의 파종 공정과 같아도 좋고, 달라도 좋다.
(2회째 이후의 배양 공정)
파종한 세포를 배양하는 조건으로서는, 상술의 1회째의 배양 공정과 마찬가지의 조건을 들 수 있다.
상기 2회째 이후의 배양 공정의 조건 등은, 1회째의 배양 공정과 같아도 좋고, 달라도 좋다. 또한, 2회째 이후의 배양 공정의 조건 등은, 2회째 이후의 각 회의 배양 공정에서 같아도 좋고, 달라도 좋다.
2회째 이후의 배양 공정에 의해, 전회의 배양 공정에서 수득된, 심봉의 주위에 감긴 링상의 상기 입체조직체(전회의 링상의 입체조직체)에 인접하는, 새로운 심봉의 주위에 감긴 링상의 입체조직체(새로운 링상의 입체조직체)가 형성된다. 전회의 링상의 입체조직체와 새로운 링상의 입체조직체는, 예를 들면, 37℃에서 1시간 ~ 30일간 배양함으로써 서로 접착하고, 관강상의 입체조직체가 수득된다.
상기 배양면 이동 공정, 상기 2회째 이후의 파종 공정, 상기 2회째 이후의 배양 공정의 반복수는, 관강상의 입체조직체의 두께, 길이에 따라 적절히 선택할 수 있고, 예를 들면, 1 ~ 20회의 반복이 바람직하고, 1 ~ 10회의 반복이 보다 바람직하다.
세포외 매트릭스를 포함하는 입체조직체 등의 파종 공정에서 파종한 세포로부터 분비된 물질(특히, 단백질)을 포함하는 입체조직체를 제조하는 경우, 예를 들면, 배양 공정 후에, 입체조직체에 포함되는 세포를 제거하는 공정을 설치해도 좋다. 입체조직체에 포함되는 세포를 제거하는 방법으로서는, 예를 들면, 고압 처리, 알코올 처리, 계면활성제 처리 등의 처리나, 세포가 생존 곤란한 조건에서의 배양 등에서 세포를 사멸시키는 방법 등을 들 수 있다. 입체조직체에 포함되는 세포를 제거하는 공정을 설치함으로써, 입체조직체 중의 적어도 일부의 세포를 제거할 수 있다.
또한, 복수종의 세포를 이용해 입체조직체를 제조하고, 특정의 세포만을 제거(예를 들면, 연골 세포, 및 세포외 매트릭스를 구성하는 단백질을 발현하는 유전자를 조합한 COS 세포를 포함하는 입체조직체로부터, COS 세포만을 제거)해도 좋다. 특정의 세포만을 제거하는 방법으로서는, 예를 들면, 세포의 항생 물질에의 감수성을 증대시켜서 항생 물질을 포함하는 배지에서 배양하는, 수득되는 입체조직체 중에 남기고 싶은 세포에만 항생 물질에의 내성을 부여하여 항생 물질을 포함하는 배지에서 배양하는 등의, 특정의 세포만이 생존 가능 또는 생존 곤란한 조건에서 배양을 하는 등의 방법을 들 수 있다.
본 실시 형태(III)의 입체조직체의 제작 방법에서 수득되는 입체조직체는, 링상의 입체조직체이어도 좋고, 관강상의 입체조직체이어도 좋다. 입체조직체의 내경은, 0.01 ~ 100 mm인 것이 바람직하고, 0.1 ~ 50 mm인 것이 보다 바람직하다. 또한, 입체조직체의 외경은, 0.1 ~ 120 mm인 것이 바람직하고, 0.2 ~ 70 mm인 것이 보다 바람직하다. 관강상의 입체조직체의 길이는, 0.1 ~ 300 mm인 것이 바람직하고, 1 ~ 250 mm인 것이 보다 바람직하다.
본 실시 형태(III)의 입체조직체의 제작 방법으로 수득하는 입체조직체는, 세포를 주성분으로 하는 입체조직체이어도 좋고, 세포외 매트릭스를 주성분으로 하는 입체조직체 등의 세포로부터 분비된 물질을 포함하는 입체조직체이어도 좋다.
세포외 매트릭스를 주성분으로 하는 입체조직체의 제작에 바람직한 조건으로서는, 예를 들면, i) 콜라겐, 라미닌, 피브로넥틴, 엘라스틴 등의 세포 매트릭스의 산생능(産生能)이 높은 세포(예를 들면, 선유아세포, 간엽계 세포 등)를 이용하는, ii) 세포외 매트릭스의 산생을 촉성(促成)하는 아스코빈산을 배지에 첨가하는, iii) 세포의 파종 밀도를 낮추고, 세포에 대한 세포외 매트릭스의 비율을 높게 하는, iｖ) 심봉의 주위에 감긴 링상 또는 관강상 등의 입체조직체를 배양하는 시간을 늘리는 (예를 들면, 상기 1회째의 배양 공정, 및 또는 상기 2회째의 배양 공정에서 24 ~ 350시간(바람직하게는 48 ~ 170시간) 배양하는) 것으로 세포외 매트릭스의 산생(분비)량을 늘리고, 세포외 매트릭스의 결합(예를 들면, 콜라겐 선유(線維)의 결합)을 성숙시키는, ｖ) 표면에 구멍을 가지는 심봉을 이용함으로써, 세포에 영양과 산소를 안정하게 공급하고, 세포의 대사물을 배지 중에 확산하기 쉽게 함으로써 세포외 매트릭스의 산생을 촉진하는, ｖi) 배양면 이동 공정에서의 배양면의 이동거리를 크게 함으로써 심봉의 연재 방향의 세포 밀도를 낮게 하는 등의 조건을 들 수 있다.
수득되는 세포외 매트릭스를 주성분으로 하는 입체조직체로서는, 예를 들면, 인공혈관, 인공 기관 등에 이용하는 것도 가능한, 콜라겐성의 관강상의 바이오 튜브 등을 들 수 있다.
본 실시 형태(III)의 입체조직체는, 예를 들면, 인공혈관, 인공 기관 등에 이용할 수 있는, 파종 공정에서 파종한 세포를 포함하는 입체조직체； 세포로부터 분비된 단백질을 주성분으로 하는 입체조직체, 세포외 매트릭스를 포함하는 입체조직체, 세포외 매트릭스를 주성분으로 하는 입체조직체 등의, 세포로부터 분비된 물질을 포함하는 입체조직체； 등을 들 수 있다.
인공혈관에 이용할 수 있는 입체조직체로서는, 예를 들면, 이하의 방법에서 수득되는 입체조직체를 들 수 있다.
1회째의 파종 공정, 1회째의 배양 공정에서, 심봉의 주위에 혈관 내피세포의 링상의 입체조직체(예를 들면, 2 ~ 3회, 혈관 내피세포의 파종 공정, 배양 공정을 계속함으로써, 두꺼운 혈관 내피세포의 링상의 입체조직체로 해도 좋다)를 수득한 후에, 2회째의 파종 공정, 2회째의 배양 공정에서, 상기 혈관 내피세포의 링상의 입체조직체의 주위에, 평활근 세포의 링상의 입체조직체(예를 들면, 3 ~ 30회, 평활근 세포의 파종 공정, 배양 공정을 계속함으로써, 두꺼운 평활근 세포의 입체조직체로 해도 좋다)를 감고, 심봉의 주위의 혈관 내피세포의 층 및 혈관 내피세포의 층의 외측의 평활근 세포의 층을 가지는 2층 구조의 링상의 입체조직체로 해도 좋다. 또한 배양면 이동 공정을 설치하고, 마찬가지의 조작을 실시함으로써, 내벽에 혈관 내피세포의 층, 그 외주에 평활근 세포의 층을 가지는, 생체 중의 혈관과 유사 구조를 가지는, 2층 구조의 링상 또는 관강상의 입체조직체를 수득할 수 있다.
또한, 상기 입체조직체에서, 각 층을 형성하는 세포가 섞이기 어려워지는 관점, 및 혈관의 강도, 유연성을 조정하는 관점에서, 예를 들면, 혈관 내피세포의 층을 형성하는 공정과 평활근 세포의 층을 형성하는 공정의 사이에, 간엽계 줄기세포나 선유아세포 등의 콜라겐, 엘라스틴을 분비하는 세포를 파종, 배양하는 공정을 설치하는； 혈관 내피세포의 층을, 콜라겐의 튜브나 엘라스틴의 튜브(예를 들면, 본 실시 형태(III)의 입체조직체의 제조 방법에서 제조된 세포로부터 분비된 단백질을 포함하는 입체조직체 등)로 피복하는； 등의 방법에 의해, 혈관 내피세포의 층과 평활근 세포의 층의 사이에, 콜라겐, 엘라스틴 등을 주성분으로 하는 (특히, 엘라스틴을 주성분으로 하는), 혈관 내피세포와 평활근 세포가 섞이기 어렵게 하는, 배리어로서의 기능을 가지는 층을 배치할 수도 있다. 생체의 혈관 중에 보여지는 내탄성판과 같은, 배리어로서의 기능을 가지는 상기 층을 배치함으로써, 유주성을 가지는 세포가 입체조직체를 형성한 후에 각 층간을 이동하는 것을 막아, 한층 생체의 혈관에 가까운 구조를 가지는 입체조직체가 수득된다.
인공 기관에 이용할 수 있는 입체조직체로서는, 예를 들면, 이하의 방법에서 수득되는 입체조직체를 들 수 있다.
제1의 파종 공정, 제1의 배양 공정에 의해, 연골 세포의 링상의 입체조직체(a)를 수득한 후에, 배양면 이동 공정을 설치하여, 제2의 파종 공정, 제2의 배양 공정에 의해, 연골 세포의 링상의 입체조직체에 인접하는, 새로운 선유아세포의 링상의 입체조직체(b)가 형성된다. 상기 공정을 적절히 반복함으로써, 예를 들면, 심봉의 연재 방향으로, a-b-b-a-b-b 등의 순서로 링상의 입체조직체가 겹친 관강상의 입체조직체를 수득할 수 있다. 또한 링상의 입체조직체간에는, 세포외 매트릭스를 주성분으로 하는 링상의 입체조직체, 세포로부터 분비된 물질을 포함하는 입체조직체, 세포외 매트릭스를 구성하는 성분 등의 물질을 분비하는 세포를 포함하는 링상의 입체조직체 등을 설치해도 좋다. 또한, 강도를 조정하는 관점에서, 수득되는 관강상의 입체조직체를, 콜라겐의 튜브나 엘라스틴의 튜브(예를 들면, 본 실시 형태(III)의 입체조직체의 제조 방법에서 제조된 세포로부터 분비된 단백질을 포함하는 입체조직체 등)로 피복해도 좋다.
또한 연골 세포의 링상의 입체조직체만을 이용했을 경우에도, 연골 세포로부터 분비되는 세포외 매트릭스로, 연골 세포의 링상의 각 입체조직체가 연결되어 인공 기관을 형성할 수 있다. 인공 기관의 강도의 관점, 및 이식 후에 혈관이 기어 들어가기 쉬워진다고 하는 관점에서, 인공 기관은, 연골 세포의 링상의 입체조직체와 선유아세포의 링상의 입체조직체를 포함하는 것이 바람직하다.
세포로부터 분비된 물질을 포함하는 입체조직체로서는, 예를 들면, 이하의 방법에서 수득되는 단백질(예를 들면, 세포외 매트릭스를 구성하는 단백질) 등의 물질을 포함하는 입체조직체를 들 수 있다.
SV40 프로모터의 배열을 갖고, 엘라스틴, 콜라겐 등의 세포외 매트릭스를 구성하는 단백질을 발현하는 유전자를 조합한 발현 벡터를 도입한, COS 세포를 이용해 링상 또는 관강상의 입체조직체를 형성하고, COS 세포로부터 단백질 등을 분비시킨다. 배양 공정 후에, 고압 처리, 알코올 처리, 계면활성제 처리 등의 처리나, COS 세포가 생존 곤란한 조건(예를 들면, COS 세포의 항생 물질에의 감수성을 증대시키고, 항생 물질을 포함하는 배지에서 COS 세포를 배양하는 등)에서의 배양 등에서 사멸시키는 등의 방법에 의해, COS 세포를 사멸시켜, 제거한다. 또한 본 실시 형태(III)의 입체조직체는, 세포가 완전하게 제거되어 있지 않은, 사멸한 세포, 생존하고 있는 세포 등을 포함하는 입체조직체이어도 좋다.
수득되는 세포외 매트릭스를 구성하는 단백질을 포함하는 입체조직체는, 예를 들면, 본 실시 형태(III)의 제조 방법에서 수득되는 입체조직체의 강도를 보강하는 피복 재료, 인공혈관, 심근 패치, 결손부 보충재 등에 이용할 수 있다.
이하에, 본 실시 형태(III)의 입체조직체의 제작 방법의 일례에 대해서, 도 22, 도 23, 도 27을 이용해 설명한다.
도 22는, 본 실시 형태(III)의 일례의 입체조직체의 제작 방법의 개략도이다.
배양면의 관통공에, 심봉이 삽통되어 있는 입체조직체의 제작 장치(도 22(i) 참조)의 배양면에, 온도 응답성 폴리머를 도포하여 피복하고, 피복배양면을 준비한다 (도 22(ii) 참조). 또한 이 예에서는, 배양면과 심봉은 접하고 있다. 그 후, 입체조직체의 제작 장치를, 배양면의 외경보다 조금 큰 내경을 가지는 용기에 넣고 배지에 담궈, 세포를 파종한다 (1회째의 파종 공정, 도 22(iii) 참조). 파종한 세포는, 피복배양면에 접착한다 (도 22(iｖ) 참조). 또한 이 예에서는, 세포의 밀도는, 100% 컨플루언트이다. 그 후, 피복배양면에 접착한 세포는, 피복배양면 중앙부를 향해 응집하기 시작하고, 단부가 피복배양면으로부터 떨어져 휘기 시작하고, 단부가 휘어진 세포구조체가 된다 (도 22(ｖ) 참조). 그 후, 응집을 더 계속해 링상이 되어, 심봉의 주위에 감긴 링상의 입체조직체가 수득된다 (도 22(ｖi) 참조). 여기서, 심봉의 주위에 감긴 링상의 입체조직체는, 심봉으로부터 어긋나서 떨어지지 않는 정도로 심봉에 감겨 있기 때문에, 심봉이 세포접착성이 아닌 경우에도, 입체조직체의 제작 중에 감긴 위치가 크게 바뀌는 것은 없다. 그 후, 배양면을 심봉의 연재 방향 하측으로 이동시키고, 수득된 링상의 입체조직체의 하측에 인접하는, 다른 링상의 입체조직체를 형성하는 틈을 설치한다 (배양면 이동 공정, 도 22(ｖii) 참조). 그 후, 재차 세포를 파종하고(2회째의 파종 공정, 도 22(ｖiii) 참조), 배양함으로써 링상의 입체조직체가 적층한 관강상의 입체조직체가 수득된다. 배양면 이동 공정, 2회째 이후의 파종 공정, 2회째 이후의 배양 공정을 반복함으로써, 긴 관강상의 입체조직체가 수득된다 (도 22(ix) 참조).
또한 상기의 예에서, 예를 들면, 파종하는 세포수를 줄이거나 심봉의 주위에 감긴 링상의 입체조직체가 수득된 후에 정치해 세포외 매트릭스를 구성하는 단백질의 분비를 기다리는 것 등에 의해, 세포외 매트릭스를 주성분으로 하는 입체조직체를 수득할 수도 있다. 또한 상기의 모두, 또는 일부의 공정을, 컴퓨터 등을 이용해 제어하고, 자동적으로 행해도 좋다.
도 23은, 배양면과 심봉의 사이에 틈이 있는 입체조직체의 제작 장치를 이용한, 본 실시 형태(III)의 일례의 입체조직체의 제작 방법의 개략도이다.
배양면의 관통공에, 심봉이 삽통되어 있는 입체조직체의 제작 장치(도 23(i) 참조)의 배양면에, 온도 응답성 폴리머를 도포하여 피복하고, 피복배양면을 준비한다 (도 23(ii) 참조). 또한 이 예에서는, 심봉의 경(徑)은, 관통공의 공경보다 작고, 배양면과 심봉의 사이에 틈이 있다. 그 후, 입체조직체의 제작 장치를, 배양면의 외경보다 조금 큰 내경을 가지는 용기에 넣고 배지에 담궈, 세포를 파종한다 (1회째의 파종 공정, 도 23(iii) 참조). 파종한 세포는, 피복배양면에 접착한다 (도 23(iｖ) 참조). 또한 이 예에서는, 세포의 밀도는, 100% 컨플루언트이다. 그 후, 피복배양면에 접착한 세포는, 피복배양면 중앙부를 향해 응집하기 시작하고, 단부가 피복배양면으로부터 떨어져 휘기 시작해, 단부가 휘어진 세포구조체가 된다 (도 23(ｖ) 참조). 그 후, 응집을 더 계속해 링상이 되고, 응집하는 세포구조체는, 배양면과 심봉의 사이에는 틈을 뛰어넘도록 하여, 심봉의 주위에 감겨, 링상의 입체조직체를 형성한다 (도 23(ｖi) 참조). 그 후, 배양면을 심봉의 연재 방향 상측으로 이동시키고, 수득된 링상의 입체조직체의 상측에 인접하는, 다른 링상의 입체조직체를 형성하는 틈을 설치한다 (배양면 이동 공정, 도 23(ｖii) 참조). 그 후, 재차 세포를 파종해(2회째의 파종 공정, 도 23(ｖiii) 참조), 배양함으로써 링상의 입체조직체가 적층한 관강상의 입체조직체가 수득된다. 배양면 이동 공정, 2회째 이후의 파종 공정, 2회째 이후의 배양 공정을 반복함으로써, 긴 관강상의 입체조직체가 수득된다 (도 23(ix) 참조).
또한 상기의 모두, 또는 일부의 공정을, 컴퓨터 등을 이용해 제어하고, 자동적으로 행해도 좋다.
도 27은, 배양면을 복수 갖고, 배양면과 심봉의 사이에 틈이 있는 입체조직체의 제작 장치를 이용한, 본 실시 형태(III)의 일례의 입체조직체의 제작 방법의 개략도이다.
2개의 배양면의 관통공에, 1개의 심봉이 삽통되어 있는 입체조직체의 제작 장치(도 27(i) 참조)의 2개의 배양면에, 온도 응답성 폴리머를 도포하여 피복하고, 피복배양면을 준비한다 (도 27(ii) 참조). 또한 이 예에서는, 심봉의 경(徑)은, 관통공의 공경보다도 작고, 배양면과 심봉의 사이에 틈이 있다. 그 후, 입체조직체의 제작 장치를, 배양면의 외경보다 큰 내경을 가지는 용기에 넣고 배지에 담궈, 세포를 파종한다 (1회째의 파종 공정, 도 27(iii) 참조). 파종한 세포는, 피복배양면에 접착한다 (도 27(iｖ) 참조). 또한 이 예에서는, 세포의 밀도는, 100% 컨플루언트이다. 그 후, 피복배양면에 접착한 세포는, 피복배양면 중앙부를 향해 응집하기 시작하고, 단부가 피복배양면으로부터 떨어져 휘기 시작해, 단부가 휘어진 세포구조체가 된다 (도 27(ｖ) 참조). 그 후, 응집을 더 계속해 링상이 되고, 응집하는 세포구조체는, 배양면과 심봉의 사이에는 틈을 뛰어넘도록 하여, 심봉의 주위에 감고, 링상의 입체조직체를 형성한다 (도 27(ｖi) 참조). 그 후, 배양함으로써, 2개의 링상의 입체조직체가 연결되어, 관강상의 입체조직체가 수득된다 (도 27(ｖii) 참조).
또한 도 27(ｖii)에서는, 관강상의 입체조직체를 보기 쉽게 하기 위해, 배양면의 도시를 생략하고 있다. 도 27에서는, 배양면과 심봉의 사이에 틈이 있기 때문에, 배양면이 있는 상태에서도, 배양면을 제거한 상태에서도, 2개의 링상의 입체조직체는 연결되어, 관강상의 입체조직체가 수득된다.
또한, 배양면의 수를 늘리는, 배양면 이동 공정, 2회째 이후의 파종 공정, 2회째 이후의 배양 공정을 설치하는 등의 방법에 의해, 더욱 긴 관강상의 입체조직체를 수득할 수도 있다.
또한 상기의 모두, 또는 일부의 공정을, 컴퓨터 등을 이용해 제어하고, 자동적으로 행해도 좋다.
[[발명(IV)]]
(세포구조체의 제조 방법)
본 발명(IV)의 실시 형태의 세포구조체의 제조 방법(이하, 「본 실시 형태(IV)의 제조 방법」이라고도 말한다.)은, 배양면에 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물로 피복된 피복 영역을 조제하고, 상기 피복 영역에 세포 현탁액의 액적을 형성하고, 상기 액적 중에서 세포 배양을 행하는 것이다.
보다 구체적으로는, 본 실시 형태(IV)의 제조 방법의 일례에서는, 도 32에 나타낸 바와 같이, 우선, 배양면을 준비하고(도 32(i) 참조), 배양면 상에 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물을 배치하고(도 32(ii) 참조), 배양면을 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물로 피복하여 피복 영역을 조제하고(도 32(iii) 참조), 피복 영역에 세포 현탁액의 액적을 형성해(도 32(iｖ) 참조), 액적 중에서 세포배양을 행하여(도 32(ｖ) 참조), 세포구조체를 형성시킨다 (도 32(ｖi) 참조).
여기서, 본 실시 형태(IV)의 제조 방법에서는, 후술한 바와 같이 세포구조체를 자발적으로 형성하는 효과를 수득하는 관점에서, 배양면에 조제한 피복 영역의 표면 제타 전위를, 0 ~ 50 mV로 하는 것이 중요하다.
이하, 본 실시 형태(IV)의 제조 방법에서의 작용 효과에 대해서 기재한다.
세포구조체의 제조 방법으로서 공지의 행잉드롭법에서는, 관상 부재의 선단에 세포 현탁액의 액적을 조제하고, 액적의 표면장력을 이용해 액적의 형상을 구상으로 유지하면서 액적을 소정 기간(예를 들면, 2주간 정도) 유지함으로써, 액적 중에서 스페로이드상의 세포구조체를 제조하고 있다. 그러나, 액적을 유지하기 위해서 조작이 번잡한 것이 되고, 스페로이드상의 세포구조체를 간편하게 제조하는 것이 곤란하다.
한편, 본 실시 형태(IV)의 제조 방법에 의하면, 액적을 배양면에 배치한 상태로 유지할 수 있기 때문에, 스페로이드상의 세포구조체를 간편하게 제조하는 것이 가능해진다.
또한, 예를 들면, 배양면과 벽면으로 구획되는 1개 또는 복수의 웰을 구비하는 세포배양기를 이용하여, 웰의 배양면에 피복 영역과 피복 영역이 아닌 영역인 비피복 영역을 조제하고, 웰에 세포 현탁액을 가하는 방법도 생각되지만, 이러한 방법에 대해서는 본 실시 형태(IV)의 제조 방법은 하기의 효과를 가지고 있다.
상술의 방법에서는, 피복 영역도 비피복 영역도 세포 현탁액에 담기도록, 세포 유체를 세포배양기에 대해 가하기 때문에, 비피복 영역에 파종한 세포가 접착할 우려가 있다. 이 때, 비피복 영역의 세포가, 피복 영역에서의 형상이 갖춰진 스페로이드상의 세포구조체의 형성을 저해하는 일이 있다. 그 때문에, 벽면을 가지는 세포배양기를 이용하는 경우에는, 배양면의 전부 또는 일부에 세포 비접착성을 제공하는 처리를 실시하는 것이 필요하기도 한다. 그리고, 때로는 이러한 처리에 기인해 세포에 독성이 있는 물질이 배지에 용출되기도 한다.
한편, 본 실시 형태(IV)의 제조 방법에 의하면, 피복 영역에서의 세포 현탁액의 액적은 비피복 영역으로부터 격리되어 있기 때문에, 상기의 세포 비접착성을 제공하는 처리가 필요하지 않고, 세포의 생육에 나쁜 영향을 줄 가능성이 낮아진다.
또한, 상술의 방법에서는, 웰에 세포 현탁액을 첨가한 후, 피복 영역에는 세포가 접착하고, 세포 비접착성을 제공하는 처리를 실시한 비피복 영역에는 세포가 접착하지 않게 된다. 비피복 영역에서의 접착하지 않은 세포는, 아포토시스(apoptosis)를 일으키거나 열충격 프로테인을 산생시키거나 하고, 피복 영역에서 접착한 세포의 생육에 대해서 나쁜 영향을 줄 우려가 있다. 그 때문에, 이 방법에서는, 비피복 영역의 세포를 배지 교환 등의 조작에 의해 웰로부터 제거하는 것이 필요한 경우가 있다.
한편, 본 실시 형태(IV)의 제조 방법에 의하면, 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물로 피복됨으로써 세포접착성을 구비하게 된 피복 영역에, 비피복 영역으로부터 격리된 상태로, 세포 현탁액의 액적을 형성하기 때문에, 비피복 영역의 세포를 제거할 필요성이 작으므로, 사용하는 세포의 양을 저감할 수 있고, 또한, 배지 교환 어느 조작의 필요성이 작기 때문에, 사용하는 배지의 양을 저감할 수 있다. 대체로, 본 실시 형태(IV)의 제조 방법에 의하면, 제조 코스트를 저감하는 것이 가능하게 된다.
본 실시 형태(IV)의 제조 방법에서는, 384 웰 세포 배양 플레이트 등에 사용되고 있는 자동 배양 장치를 그대로 이용하는 것이 가능(예를 들면, 16열 노즐로 세포 부유액을 멀티플레이트에 주입하는 프로그램으로, 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물을 도포한 배양면에 세포 현탁액의 액적을 토출한 것이 가능)하고, 또한, 세포 배양 플레이트의 분석기기도 해당 기술 분야에서 통상 이용되고 있는 것을 이용하는 것이 가능하다. 그 때문에, 본 실시 형태(IV)의 제조 방법에 의하면, 세포구조체의 제조 코스트를 억제할 수 있음과 더불어, 상기 장치나 기기의 용도를 넓힌다고 하는 의미에서 경제 효과를 낳을 수 있다.
본 발명(IV)의 실시 형태의 세포구조체의 제조 방법에서는, 전술한 바와 같이, 피복 영역의 표면 제타 전위를 0 ~ 50 mV로 하는 것이 중요하다. 표면 제타 전위를 0 mV 이상으로 하면, 음으로 대전되는 세포를 접착시킬 수 있고, 또한, 50 mV 이하로 하면, 세포 독성을 경감할 수 있다.
상기와 마찬가지의 이유로부터, 표면 제타 전위는, 호적하게는 0 ~ 35 mV이고, 더욱 호적하게는 10 ~ 25 mV이다.
표면 제타 전위는, 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물에서의, C/A비를 조정함으로써, 조정할 수 있다.
상기 특정의 범위의 표면 제타 전위를 가지는 배양면에 의하면, 세포를 적절한 배양 조건에서 배양하는 것만으로, 괴상(펠릿상)의 구조를 가지는 세포구조체(스페로이드)를 간편하게 형성시킬 수 있다.
이것은, 상기 특정의 범위의 표면 제타 전위로 함으로써, 배양면에 세포 독성을 야기하지 않는 미약한 양전하를 제공할 수 있고, 또한, 파종한 세포의 빠른 접착을 확보하여 세포의 활성의 향상 및 세포외 매트릭스의 분비를 촉진하고, 또한, 세포 유주를 적절히 억제하여 세포간의 결합을 강하게 할 수 있는 것으로 추측된다.
상기 특정의 범위의 표면 제타 전위를 가지는 배양면에서의 세포구조체를 형성하는 현상의 재현성은 매우 높고, 균질한 세포구조체를 제작하는 것이 가능해진다.
종래의 세포배양기를 이용해 제작된 세포의 괴는, 세포 비접착성의 배양면에 접착할 수 없는 세포가 모인 것에 지나지 않기 때문에, 세포의 괴를 구성하는 세포의 바이어빌리티가 낮다고 하는 문제가 있었다.
한편, 본 실시 형태(IV)의 제조 방법에서 제조된 세포구조체(스페로이드)는, 배양면 상에 빠르게 접착하고, 증식하면서 신장한다고 하는 경과를 거친 후에 형성되는 것이기 때문에, 세포간에 산생된 세포외 매트릭스가 풍부하게 존재한다. 그 때문에, 세포구조체 자체의 바이어빌리티(활성)가 매우 높다.
그리고, 본 실시 형태(IV)의 제조 방법에서는, 세포구조체의 사이즈는, 실험자가 목적에 따라 적절히 정할 수 있어 사이즈에 분포를 갖게 하는 것도, 사이즈를 균일하게 하는 것도 가능해진다.
세포구조체의 사이즈는, 미소 사이즈(예를 들면, 수백 μm 이하의 사이즈)로 할 수 있고, 50 ~ 1,500μm 경(徑)이어도 좋고, 50 ~ 200μm 경(徑)인 것이 바람직하다.
또한, 본 실시 형태(IV)의 제조 방법에서는, 평판 배양면에서 세포구조체를 제작하는 것이 가능하기 때문에, 세포배양기를 이용해 제작한 세포구조체에 대해서 어세이(assay)를 행하는 경우에, 이 배양기를 직접적으로 현미경에 의해 관찰하는 것도 가능해진다.
또한, 본 실시 형태(IV)의 제조 방법에 의하면, 세포가 세포배양기의 배양면과 벽의 경계인 배양면의 외연(外緣)에 접착시키지 않는 것도 가능해져, 사이즈의 균질성을 장시간 유지할 수 있다.
이하, 본 발명(IV)의 실시 형태의 세포배양기의 제조 방법에서의 각 공정에 대해서 상세하게 기재한다.
본 실시 형태(IV)의 제조 방법의 일례에서는, 우선, 배양면을 준비한다 (도 32(i) 참조).
여기서, 배양면으로서는, 세포배양기의 배양면이어도 좋고, 세포배양기 이외의 부재의 배양면이어도 좋고, 예를 들면, 시판의 플레이트, 디쉬, 플라스크, 유리판, 실리콘 시트 등을 들 수 있다.
배양면은, 세포접착성이어도 세포 비접착성이어도 좋다.
또한 「세포 비접착성」이란, 부착세포(예를 들면, 선유아세포, 간세포, 혈관 내피세포 등)가, 통상의 배양 조건하에서, 접착하지 않는 또는 접착하기 어려운 성질을 말한다.
배양면의 재질로서는, 폴리스티렌, 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET), 폴리프로필렌, 폴리부텐, 폴리에틸렌, 폴리카보네이트 등을 들 수 있고, 정밀한 성형 가공이 용이하고, 다양한 멸균법을 적용하는 것이 가능하고, 투명성이 있기 때문에 현미경 관찰에 적합한 관점에서, 폴리스티렌, 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET)가 바람직하다.
또한 일반적인 세포용의 플레이트는, 폴리스티렌 등의 플라스틱으로 되어 있지만, 표면 처리(예를 들면, 플라즈마 처리)가 실시되어 있어 배양면에 세포가 접착하기 쉬워지고 있다.
또한 본 발명(IV)의 세포구조체의 제조 방법에서는, 배양면을 준비하면 좋고, 세포배양기를 이용하지 않아도 좋다.
그 다음에, 배양면 상에 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물을 배치한다 (도 32(ii) 참조).
이하, 본 발명(IV)의 실시 형태의 제조 방법에서 배양면에 배치되는 온도 응답성 폴리머 및 온도 응답성 폴리머 조성물에 대해 상술한다.
실시 형태(IV)에서의 온도 응답성 폴리머 및 온도 응답성 폴리머 조성물로서는, 상기 발명(I)에서의 온도 응답성 폴리머 및 온도 응답성 폴리머 조성물과 마찬가지의 것을 들 수 있고, 호적예로서도 마찬가지의 것을 들 수 있다.
또한 본 실시 형태(IV)에서, (A-1)의 온도 응답성 폴리머의 제조 방법은, 2-N, N-디메틸아미노에틸 메타크릴레이트(DMAEMA)를 포함하는 혼합물을 조제하는 조제 공정과, 혼합물에 자외선을 조사하는 조사 공정을 포함하고, 여기서, 조제 공정에서, 혼합물은 중합금지제 및 물을 더 포함하고, 조사 공정에서, 자외선은 불활성 분위기 하에서 조사되는 것을 특징으로 하는 방법으로 한정되지 않고, 다른 방법이어도 좋다.
또한, 본 실시 형태(IV)에서, (A-1)의 온도 응답성 폴리머에 의하면, 후술한 바와 같이, 세포를 적절한 배양 조건에서 배양함으로써, 관강상(튜브상) 및 괴상(펠릿상)의 구조를 가지는 세포구조체를 형성시킬 수 있다.
또한, 본 실시 형태(IV)에서, (A-2)의 온도 응답성 폴리머의 제조 방법은, 2-N, N-디메틸아미노에틸 메타크릴레이트(DMAEMA)를 포함하는 제1 혼합물에 자외선을 조사하는 제1 중합 공정과, 제1 중합 공정에서의 중합물의 수평균분자량이 소정치 이상이 된 시점에서, 제1 혼합물에 음이온성 모노머를 첨가해 제2 혼합물을 조제하는 첨가 공정과, 제2 혼합물에 자외선을 조사하는 제2 중합 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법으로 한정되지 않고, 다른 방법이어도 좋다.
또한, 본 실시 형태(IV)에서, (C)의 온도 응답성 폴리머 조성물은, 상기와 같이, 2-N, N-디메틸아미노에틸 메타크릴레이트 및/또는 그 유도체의 중합체와, 2-아미노-2-히드록시메틸-1, 3-프로판디올과, 핵산, 헤파린, 히알루론산, 덱스트란황산, 폴리스티렌 설폰산, 폴리아크릴산, 폴리메타크릴산, 폴리인산, 황산화 다당류, 커드란 및 폴리알긴산, 및 이들의 알칼리금속염으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 음이온성 물질을 포함하고 있어도 좋다.
또한, 본 실시 형태(IV)에서, 상기 (C3)에 열거한 음이온성 물질에서의 DNA로서는, iPS 세포, ES 세포, 간엽계 줄기세포 등의 줄기세포를 분화 세포, 특히, 심근 세포, 간세포, 신경 세포, 혈관 내피세포로 분화 유도할 수 있는 DNA가 바람직하다.
여기서, 본 실시 형태(IV)의 제조 방법의 일례에서는, 배양면 전면에 피복 영역을 조제해도 좋고(도 33(i), (ii) 참조), 배양면에 복수의 피복 영역을 조제해도 좋다(도 33(iii) 참조).
배양면 전면에 피복 영역을 조제하는 경우, 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물 용액을 배양면에 유연시켜도 좋다.
배양면에 복수의 피복 영역을 조제하는 경우, 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물의 배치(스폿) 수법으로서는, 예를 들면, 8열 마이크로 피펫터에 의한 손기술, 용액을 정량 토출한 스퍼터 인쇄법, 회전 스크린 드럼 인쇄법 등을 들 수 있다.
특히, 배양면에 복수의 피복 영역을 조제하는 경우,
피복 영역의 면적은, 0.1 ~ 30 ㎟인 것이 바람직하다. 상기 범위로 하면, 목적의 미소 사이즈의 스페로이드가 수득되기 쉽다.
피복 영역간의 거리가, 0.1 ~ 10 mm인 것이 바람직하다. 또한 「피복 영역간의 거리」란, 피복 영역간의 배양면 상에서의 최단 거리를 말한다. 0.1 mm 이상으로 하면, 인접하는 피복 영역간에서, 각각의 영역에 파종된 세포끼리 접착해 버리는 것을 억제할 수 있다. 10 mm 이하로 하면, 대량의 세포구조체(스페로이드 등)를 효율 좋게 제작할 수 있다.
특히, 배양면에 복수의 피복 영역을 조제하는 경우, 피복 영역의 수는, 실험자가 목적에 따라 적절히 정해도 좋고, 2 이상으로 해도 좋고, 10 이상으로 해도 좋고, 1,000 이상으로 해도 좋다.
특히, 배양면에 복수의 피복 영역을 조제하는 경우, 피복 영역의 평면시 형상은, 원형, 타원형, 외윤곽선의 내측에 곡률 중심을 가지는 형상인 것이 바람직하다.
곡률 반경으로서는, 0.1 ~ 50 mm인 것이 바람직하고, 1 ~ 10 mm인 것이 더욱 바람직하다.
원형의 피복 영역의 직경으로서는, 10μm ~ 10 mm인 것이 바람직하고, 30μm ~ 1500μm인 것이 더욱 바람직하다.
이러한 형상은, 1종 단독으로 이용해도 좋고, 2종 이상을 조합해 이용해도 좋다.
본 실시 형태(IV)의 제조 방법의 일례에서는, 배양면의 피복 영역이, 단위면적당 가지는 온도 응답성 폴리머의 양이, 5.0 ~ 50 ng/㎟인 것이 바람직하고, 15 ~ 40 ng/㎟인 것이 더욱 바람직하다. 상기 범위로 하면, 세포구조체를 형성시키기 쉽게 한다고 하는 효과가 수득되기 쉽다.
본 실시 형태(IV)의 제조 방법의 일례에서는, 온도 응답성 폴리머는, 수용액 상태로부터의 침전, 용액의 도포 및 용매의 건조, 방사선 조사, 저온 플라즈마 조사, 코로나 방전, 글로우방전, 자외선, 라디칼 발생제를 사용한 그래프트중합 등의 수법에 의해 세포배양기의 배양면에 피복되어 있어도 좋다.
배양면을 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물로 피복하는 방법, 및 피복 영역이 되는 복수의 배양면 상에서의 위치에 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물을 배치하는 방법에 대해서는 후술한다.
본 실시 형태(IV)의 제조 방법에서의 배양면은, 세포배양용 플레이트(예를 들면, 35 mm 디쉬 등)를 베이스로 해서 제작되어도 좋고, 예를 들면, 재생 의료의 분야에서 호적하게 이용할 수 있다.
한편, 배양면은, 마이크로플레이트(예를 들면, 96 구멍 플레이트 등)를 베이스로 해서 제작되어도 좋고, 예를 들면, 창약 분야(특히, 약제 스크리닝)에서 호적하게 이용할 수 있다.
상기 온도 응답성 폴리머 또는 상기 온도 응답성 폴리머 조성물은, 가열 건조, 동결건조, 감압 증류 등에 의해 수분을 제거하여, 메탄올, 에탄올 등의 알코올, 케톤, 에스테르 등의 유기 용매에 용해해도 좋다. 이들 중에서도, 표면장력과 비점이 낮고 빠른 건조가 가능하고, 온도 응답성 폴리머를 보다 균일하게 피복할 수 있는 관점에서, 메탄올에 용해시키는 것이 바람직하다. 또한, 유기 용매에 용해하는 경우에는, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 디메틸아크릴아미드(DMAA), 글리세린, TritonX, 폴리프로필렌글리콜 등의 비이온성이고 친수성인 친수성 분자를 더 가해도 좋다.
이렇게 하여, 이 제조 방법의 일례에서는, 배양면을 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물로 피복하여 피복 영역을 조제한다 (도 32(iii) 참조).
본 실시 형태(IV)의 제조 방법에서는, 전술한 바와 같이, 피복 영역의 표면 제타 전위가, 0 ~ 50 mV로 하는 것이 중요하고, 0 ~ 35 mV인 것이 바람직하고, 10 ~ 25 mV인 것이 더욱 바람직하다.
또한, 본 실시 형태(IV)의 제조 방법에서는, 본 발명(IV)의 효과를 높이는 관점에서, 배양면의 피복 영역에 대한 물의 접촉각이, 50 ~ 90°인 것이 바람직하고, 60 ~ 80°인 것이 더욱 바람직하고, 62 ~ 78°인 것이 특히 바람직하다.
또한 피복 영역에 대한 물의 접촉각이란, 피복 영역 내의 임의의 수개의 점에서, JIS　R3257에 준거해, 측정되는 접촉각의 평균치를 가리킨다.
상기와 같이, 피복 영역은, 세포 표면과의 사이의 상호작용을 높이고, 세포의 피복 영역에 대한 접착성을 높이는 관점에서, 소정 정도 이상의 소수성을 가지는 영역인 것이 바람직하다.
배양면의 피복 영역에 대한 물의 접촉각은, 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물에서의 소수성 기의 구조나 양을 조정함으로써, 조정할 수 있다.
본 실시 형태(IV)의 제조 방법의 일례에서는, 각 피복 영역에서, 액적의 바닥 면적을 피복 영역의 면적보다도 작게 하는 것이 바람직하다.
배양면을 피복하는 공정에서는, 피복 영역의 단연(端緣)에서는 피복 영역의 중앙 부분과 비교하여, 단위면적당 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물의 양이 많아져, 때로는 피복 영역의 단연이 중앙 부분에 대해서 부풀어오르는 일이 있다. 이 경우, 피복 영역에 접착한 세포가 이루는 세포구조체의 형상을 갖추기 어려운 경향이 있다. 액적의 바닥 면적을 피복 영역의 면적보다도 작게 하면, 피복 영역에서 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물의 양이 불균일하게 될 우려가 있는 영역에는 세포를 접착시키지 않도록 할 수 있게 되기 때문에, 형상이 갖춰진 세포구조체를 조제하기 쉬워진다.
상기와 마찬가지의 이유로부터, 구체적으로는, 각 피복 영역에서, 피복 영역의 면적에 대한 액적의 바닥 면적의 비율의 상한을 99% 이하로 해도 좋고, 상한은, 97%, 95%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50% 로 하는 것도 바람직하다.
또한, 상기 비율의 하한을 10% 이상으로 해도 좋고, 하한은, 20%, 30%로 하는 것도 바람직하다. 상기 비율을 10% 이상으로 하면, 충분한 사이즈의 세포구조체를 효율 좋게 조제하는 것이 가능해진다.
본 발명(IV)의 실시 형태의 세포배양기를 이용한 세포 배양 방법의 일례에서는, 피복 영역에 세포 현탁액의 액적을 형성한다 (도 32(iｖ) 참조).
본 실시 형태(IV)의 제조 방법은, 제조한 세포구조체의 직경에 매우 높은 균질성이 요구되는 세포(예를 들면, 창약시험에 이용되는 세포나 다분화능 줄기세포 등)나, 분화 상태의 정밀 제어를 위해서 배양 코스트가 고액이 되는 세포(구체적으로는, iPS 세포, ES 세포, 간엽계 줄기세포, 암 줄기세포 등의 줄기세포, 및 이들의 분화 유도 세포； 혈관 내피세포, 지방세포, 지방 줄기세포, 선유아세포, 심근 세포, 근아세포 등의 간엽계 세포； HepaRA, HepaRG, HepG2, BxPC-3 등의 상피계의 세포； 등)에 대해서, 특히 호적하게 적용할 수 있다. 초대 세포의 경우는, 콜로니를 형성하는 접착성 세포를 선택하면 좋고, 당업자에 의해서 적절히 선택 가능하다.
이 제조 방법의 일례에서는, 피복 영역에 세포 현탁액의 액적을 형성하는 것에 있어서, 바닥면의 형상이 호적하게는 원형이 되도록, 세포 현탁액을 적하하는 것이 바람직하다. 이러한 수법에 의하면, 형상이 갖춰진 스페로이드상의 세포구조체를 수득하기 쉬워진다.
본 실시 형태(IV)의 제조 방법의 일례에서는, 액적에 포함되는 세포의 수를, 3.0×105개/mL 이하로 하는 것이 바람직하다.
세포를 파종하는 공정에서, 세포 밀도가 너무 높은 경우에는, 세포가 서로 겹친 상태로 침전해 버려, 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물과 접촉하지 않는 세포가 생기게 된다. 이 경우, 이러한 폴리머 또는 폴리머 조성물과 비접촉의 세포는, 예를 들면, 다른 세포와의 융합에 의해 그 성질을 바꾸어 버리는 등의 유해한 영향을 일으킬 가능성이 있다. 액적에 포함되는 세포의 수를 3.0×105개/mL 이하로 하면, 피복 영역에 거의 단층으로 세포를 침전시킬 수 있어 세포를 호적한 조건하에서 배양하는 것이 가능해진다.
또한, 액적에 포함되는 세포의 수는, 충분한 사이즈의 세포구조체를 조제하는 관점에서, 1.0×104개/mL 이상으로 하는 것이 바람직하다.
상기와 마찬가지의 이유로부터, 액적에 포함되는 세포의 수는, 더욱 호적하게는 1.0×105개 ~ 3.0×105개/mL이고, 특히 호적하게는 2.0×105개 ~ 3.0×105개/mL이고, 파종한 세포의 형태나 사이즈 등을 고려해 당업자에 의해서 적절히 조정 가능하다. 또한 상기의 세포의 수란, 생세포의 수를 의미한다.
이 제조 방법의 일례에서는, 액적의 경(徑)을 1μm ~ 8 mm로 하는 것이 바람직하다.
액적의 경(徑)이 1μm보다 적으면 배지 양이 너무 적어지기 때문에, 건조가 발생하는 등 세포배양에서 적절하지 않은 환경이 될 가능성이 있다.
액적의 경(徑)이 8 mm를 넘으면, 세포가 액적 내에서 폴리머 또는 폴리머 조성물 상에 침전할 때에, 폴리머 상에 배치되는 세포의 세포 밀도에 편차가 생겨 스페로이드 형성이 복수 개소에서 생기고(세포의 응집의 핵이 되는 응력 발생점이 복수 개소가 되어), 스페로이드가 진구상이 되기 어려울 우려가 있다.
상기와 마찬가지의 이유로부터, 액적의 경(徑)은, 더욱 호적하게는 100μm ~ 4 mm이고, 특히 호적하게는 300μm ~ 3 mm이다.
본 실시 형태(IV)의 제조 방법의 일례에서는, 형상이 갖춰진 세포구조체를 조제하기 쉽게 하는 관점에서, 액적의 양을 0.5 ~ 50μL로 하는 것이 바람직하고, 1.0 ~ 40μL로 하는 것이 더욱 바람직하고, 5.0 ~ 25μL로 하는 것이 특히 바람직하다.
또한, 이 제조 방법의 일례에서는, 1개의 피복 영역에, 1개의 액적을 형성해도 좋고, 복수의 액적을 형성해도 좋다.
특히, 1개의 피복 영역에 복수의 액적을 형성하는 경우에는, 액적간의 간격(액적간의 최근접 거리)으로서는, 1 ~ 500μm인 것이 바람직하다.
1μm보다 적으면 액적끼리 결합해 버릴 가능성이 있다. 500μm를 넘으면, 효율적으로 스페로이드를 대량 생산한다고 하는 목적을 달성할 수 없을 가능성이 있다.
상기와 마찬가지의 이유로부터, 액적간의 간격은, 2 ~ 250μm인 것이 더욱 바람직하고, 5 ~ 100μm인 것이 특히 바람직하다.
이 제조 방법의 일례에서는, 액적 중에서 세포 배양을 행한다 (도 32(ｖ) 참조).
배양 조건은, 사용하는 세포에 따라 적절히 정해도 좋고, 예를 들면, 37℃, 5% CO2 분위기 등으로 해도 좋다.
세포배양 시에는, 물 미스트의 분무 등에 의해 배양기 내를 적극적으로 가습하는 방법, 인 지질, 고급 카르복실산, 유동 파라핀 등의 저비중에서 불활성인 유성 성분의 피막에서 세포 현탁액의 액적 표면을 덮음으로써, 액적 중의 수분의 휘발을 억제하는 방법을 이용해도 좋다. 이러한 방법은, 특히, 세포 현탁액의 액적의 양이 10μL 미만인 경우에, 액적을 유지하기 위해서 특히 유효하다.
그 후, 이 제조 방법의 일례에서는, 배양을 더 계속함으로써, 세포구조체를 형성시킨다 (도 32(ｖi) 참조).
배양 조건은, 사용하는 세포에 따라 적절히 정해도 좋고, 예를 들면, 37℃, 5% CO2 분위기 등으로 해도 좋다.
이 때, 특정의 특성을 가지는 피복 영역에서, 괴상(펠릿상)의 구조를 가지는 세포구조체를 간편하게 형성시킬 수 있다.
이하, 본 발명(IV)의 실시 형태의 세포구조체의 제조 방법에서 이용되는 호적한 배양면에 대해 기재한다.
호적한 배양면은, 유리제의 배양면, 및 배양면으로부터 시단(始端)하는 전술의 본 발명(IV)의 실시 형태의 세포구조체의 제조 방법에서 이용되는 온도 응답성 폴리머를 포함하는 것이다.
호적한 배양면에 의하면, 유리 자체가 유기 용매에 대한 내성을 구비하기 때문에, 배양면을 유기 용매로 세정하는 것이 가능해지고, 보다 세포 독성 물질을 저감하는 것이 가능해진다.
또한, 이 배양면은, 종래적으로 이용되어 온 방사선 조사를 수반하는 그래프트중합 방법을 이용하는 일 없이 제조하는 것이 가능한 것(후술), 또한, 모아 두어 방사선 조사에 의해 생기는 중합체의 분해물의 양을 저감할 수 있어 세포의 생육에 양호한 환경을 제공할 수 있다.
유리제의 배양면으로서는, 유리제의 세포배양기의 배양면이나 유리판의 표면 등으로 해도 좋다.
온도 응답성 폴리머로서는, 전술의 (A) 2-N, N-디메틸아미노에틸 메타크릴레이트(DMAEMA) 단위 및 음이온성 모노머 단위를 포함하는 온도 응답성 폴리머, (B) N-이소프로필 아크릴아미드(NIPAM) 단위, 양이온성 모노머 단위, 및 음이온성 모노머 단위를 포함하는 온도 응답성 폴리머 등을 들 수 있다.
보다 구체적으로는, 이러한 호적한 세포배양기의 제조 방법으로서는, 예를 들면, (a) 유리제의 배양면을 비닐기를 가지는 실란 커플링제로 처리하고, 처리된 배양면 상에서 2-N, N-디메틸아미노에틸 메타크릴레이트(DMAEMA)를 물 존재하에서 자외선을 조사하면서 중합시키는 방법,
(b) 유리제의 배양면을 할로겐화 알킬기를 가지는 실란 커플링제로 처리하고, 또한, 할로겐화 알킬기와 N, N-디알킬 치환 디티오카바밀산의 치환반응으로, N, N-디알킬 치환 디티오카르바모일기를 배양면에 도입하고, 이러한 배양면 상에서, N, N-디알킬 치환 디티오카르바모일기를 라디칼 중합 개시점으로서 2-N, N-디메틸아미노에틸 메타크릴레이트(DMAEMA)를 물 존재하에서 자외선을 조사하면서 이니퍼터 중합시키는 방법을 들 수 있다.
상기 (a) 방법에 관해서, 비닐기를 가지는 실란 커플링제로서는, 유기물과의 반응이나 상호작용을 하는 기능을 구비하는 반응성 관능기(Y)로서 비닐기, 스티릴기, 메타크릴기, 아크릴기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개를 갖고, 유리와의 반응이나 상호작용을 하는 기능을 구비하는 반응성 관능기(X)로서 알콕시기, 할로겐으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개를 가지는 것을 들 수 있다.
구체적으로는, 비닐 트리메톡시실란, p-스티릴 트리메톡시실란, 3-메타크릴로일옥시 프로필 트리메톡시실란, 3-아크릴로일옥시 프로필 트리에톡시실란 등을 들 수 있다.
실란 커플링제로의 처리의 조건은, 상법과 같이 해도 좋다.
처리된 배양면 상에서의 DMAEMA의 중합 방법으로서는, (A) 2-N, N-디메틸아미노에틸 메타크릴레이트(DMAEMA) 단위 및 음이온성 모노머 단위를 포함하는 온도 응답성 폴리머에 대해 기재한 바와 같이 해도 좋다.
특히, 상기 (a) 방법에서는 하기의 조건으로 하는 것이 바람직하다.
·자외선 조사에서의 자외선의 파장으로서는, 중합체의 분해물의 양을 저감하는 관점에서, 근자외선의 파장인 것이 바람직하고, 330 ~ 400 nm인 것이 더욱 바람직하고, 350 ~ 390 nm인 것이 특히 바람직하다.
·처리된 배양면 후측으로부터 광을 조사하면 (유리를 투과시키도록 광을 조사하면), 광원에 포함되는 단파장의 자외선을 컷트하고, 근자외선 영역의 파장의 광선을 선택적으로 조사하는 일도 가능해지고, 비닐기를 가지는 실란 커플링제 측으로부터 DMAEMA 측을 향해 광조사하여, 모노머의 분해 등보다도 중합반응을 우선시키는 일도 가능해지기 때문에, 바람직하다.
상기 (b) 방법에 관해서, 할로겐화 알킬기를 가지는 실란 커플링제로서는, 유기물과의 반응이나 상호작용을 하는 기능을 구비하는 반응성 관능기(Y)로서 할로겐화 알킬기, 보다 구체적으로는, p-클로로메틸 벤질기, 3-클로로프로필기, p-브로모메틸 벤질기, 3-브로모 프로필기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개를 갖고, 유리와의 반응이나 상호작용을 하는 기능을 구비하는 반응성 관능기(X)로서 알콕시기, 할로겐으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개를 가지는 것을 들 수 있다.
구체적으로는, 3-클로로프로필 트리메톡시실란, p-클로로메틸 벤질 트리클로로실란, 3-클로로프로필 트리클로로실란 등을 들 수 있다.
실란 커플링제로의 처리의 조건은, 상법과 같이 해도 좋다.
유리 표면(배양면)에 도입된 N, N-디알킬 치환 디티오카르바모일기를 라디칼 중합 개시점으로 하는 2-N, N-디메틸아미노에틸 메타크릴레이트(DMAEMA)의 이니퍼터 중합의 반응 조건은, 상법과 같이 해도 좋다.
특히, 상기 (b) 방법에서는 하기의 조건으로 하는 것이 바람직하다.
·자외선 조사에서의 자외선의 파장으로서는, 중합체의 분해물의 양을 저감하는 관점에서, 근자외선의 파장인 것이 바람직하고, 330 ~ 400 nm인 것이 더욱 바람직하고, 350 ~ 390 nm인 것이 특히 바람직하다.
·처리된 배양면 후측으로부터 광을 조사하면 (유리를 투과시키도록 광을 조사하면), 광원에 포함되는 단파장의 자외선을 컷트하고, 근자외선 영역의 파장의 광선을 선택적으로 조사하는 일도 가능해지고, 실란 커플링제측으로부터 DMAEMA 측을 향해 광조사하여, 모노머의 분해 등보다도 중합반응을 우선시키는 일도 가능해지기 때문에, 바람직하다
이상, 도면을 참조하여, 본 발명(IV)의 세포구조체의 제조 방법의 실시 형태에 대해 예시 설명했지만, 본 발명(IV)의 세포구조체의 제조 방법은, 상기의 예로 한정되는 것은 없고, 상기 실시 형태(IV)에는, 적절히 변경을 가할 수 있다.
[[발명(V)]]
이하, 도면을 참조하여, 본 발명(V)의 세포구조체의 제조 방법, 본 발명(V)의 세포구조체, 본 발명(V)의 세포배양기의 실시 형태에 대해 상세하게 예시 설명한다.
본 발명(V)의 실시 형태(이하, 「본 실시 형태(V)」라고도 말한다.)의 세포구조체의 제조 방법은,
세포배양기의 배양면에, 온도 응답성 폴리머 및/또는 온도 응답성 폴리머 조성물로 피복된 제1 피복 영역과 상기 제1 피복 영역의 단부에 설치된, 세포접착성 물질로 피복된 복수의 제2 피복 영역을 준비하는 준비 공정과,
세포를 상기 제1 피복 영역 및 상기 제2 피복 영역에 파종하고, 상기 세포를 배양하는 파종 배양 공정
을 포함한다.
본 실시 형태(V)에서의 일례의 제조 방법은, 온도 응답성 폴리머 및/또는 온도 응답성 폴리머 조성물을 조제하는 조제 공정과, 전술의 준비 공정과, 전술의 파종 배양 공정을 포함한다.
도 35(i) ~ (ｖiii)에, 본 실시 형태(V)에서의 일례의 세포구조체의 제조 방법의 개요에 대해 나타낸다.
이하, 본 실시 형태(V)에서의 일례의 세포구조체의 제조 방법에서의 각 공정의 상세를 기재한다.
(조제 공정)
실시 형태(V)에서의 조제 공정으로서는, 상기 발명(I)에서의 조제 공정과 마찬가지의 공정을 들 수 있고, 호적예로서도 마찬가지의 것을 들 수 있다.
(준비 공정)
일례의 제조 방법에서는, 그 다음에, 세포배양기의 배양면에, 온도 응답성 폴리머 및/또는 온도 응답성 폴리머 조성물로 피복된 제1 피복 영역, 및 제1 피복 영역의 단부에 설치된, 세포접착성 물질로 피복된 복수의 제2 피복 영역을 준비한다 (준비 공정)(도 35(i) ~ (iii) 참조).
여기서, 제1 피복 영역 및 제2 피복 영역 이외의 배양면은, 세포접착성으로 해도, 세포 비접착성으로 해도 좋지만, 소망한 형상의 세포구조체를 수득하기 쉽게 하는 관점에서, 세포 비접착성으로 하는 것이 바람직하다.
세포 비접착성의 배양면의 조제 방법은, 특별히 한정되는 일 없이, 예를 들면, 세포 비접착성의 배양면을 구비하는 세포배양기, 예를 들면, SUMILON 사 제의 PrimeSurface(등록상표)를 이용해도 좋고, 세포 비접착성의 시트나 깔개 등을 이용해도 좋고, 미처리의 폴리스티렌 제의 배양면을 구비하는 세포배양기를 이용해도 좋다.
여기서, 도 35에 나타낸 바와 같이, 제1 피복 영역 및 제2 피복 영역은, 세포배양기의 벽과의 접촉을 억제하여, 세포구조체의 형상을 갖추는 관점에서, 비피복 영역(배양면에 특히 피복이 실시되지 않은 영역)으로 둘러싸여 있도록 설치되는 것이 바람직하다(도 35(ii), (iii) 참조).
제1 피복 영역의 면적은, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, φ35 mm의 세포배양기의 배양면을 이용하여, 1 ~ 30 mm 사이즈의 세포구조체를 제조하는 경우, 1 ~ 750 ㎟로 해도 좋고, 바람직하게는 10 ~ 700 ㎟이다.
제1 피복 영역의 형상은, 특별히 한정되는 일 없이, 평면시, 원형(원, 타원 등), 직사각형(정방형, 장방형, 삼각형 등), 선형이어도 좋고, 직사각형은 모서리가 둥글어도 좋다.
그 중에서도, 상기 형상은, 세포의 응집 양식을 제어하는 관점에서, 소정 방향으로 연장되는 형상, 보다 구체적으로는, 장축 방향 및 단축 방향이 존재하는 형상, 외윤곽선 상의 임의의 2 점간의 거리에 최대 및 최소가 존재하는 형상이 바람직하고, 장방형이 더욱 바람직하다.
제1 피복 영역의 형상이 직사각형인 경우, 그 어스펙트비(장변길이：단변길이)로서는, 1 ~ 50로 해도 좋고, 5 ~ 50이 바람직하고, 보다 바람직하게는 10 ~ 50이다.
제1 피복 영역의 형상이 장방형인 경우, 세포구조체의 형상을 제어하는 관점에서, 그 폭은 0.1 ~ 50 mm인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 0.1 ~ 30 mm이고, 그 길이는 0.1 ~ 150 mm인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 0.1 ~ 100 mm이다.
제1 피복 영역 표면의 제타 전위로서는, 0 ~ 50 mV가 바람직하고, 보다 바람직하게는 0 ~ 35 mV, 더욱 바람직하게는 10 ~ 25 mV이다. 제타 전위가 0 mV 이상인 것에 의해, 음으로 대전되는 세포가 접착하기 쉬워진다. 또한, 제타 전위가 50 mV 이하인 것에 의해, 세포 독성을 경감할 수 있다.
또한, 제타 전위를 상기 범위로 함으로써, 세포를 적절한 배양 조건에서 배양하는 것만으로, 괴상(펠릿상)의 구조를 가지는 세포구조체를 한층 간편하게 제작시킬 수 있다. 이것은, 표면 제타 전위를 상기 범위로 함으로써, 제1 피복 영역 표면에 세포 독성을 야기하지 않는 미약한 양전하를 제공할 수 있고, 또한, 파종한 세포의 빠른 접착을 확보하여 세포의 활성의 향상 및 세포외 매트릭스의 분비를 촉진하고, 또한, 세포 유주를 적절히 억제하여 세포간의 결합을 강하게 할 수 있는 것에 의한 것으로 추측된다.
또한 제타 전위란, 폴리스티렌 라텍스를 히드록시프로필셀룰로오스로 피복한 입자(제타 전위： -5 mV ~ ＋5 mV)를 표준의 모니터 입자로 해서 제타 전위계(예를 들면, 형번 「ELSZ」, Otsuka Electronics Co., Ltd. 제 등)로 측정한, Smoluchowski식에 의해 산출되는 값을 말한다.
제1 피복 영역 표면에 대한 물의 접촉각으로서는, 본 발명(V)의 효과를 높이는 관점에서, 50 ~ 90°이 바람직하고, 보다 바람직하게는 60 ~ 80°, 더욱 바람직하게는 62 ~ 78°이다.
또한 제1 피복 영역에 대한 물의 접촉각이란, 피복 영역 내의 임의의 수개의 점에서, JIS　R3257에 준거해 측정되는 접촉각의 평균치를 말한다.
제2 피복 영역에 피복되는 세포접착성 물질로서는, 라미닌, 콜라겐, 피브로넥틴, 펩티드, 양이온성 폴리머, 폴리스티렌 등을 들 수 있다. 상기 펩티드로서는, 알기닌 글리신 아스파라긴산의 배열을 가지는 펩티드, 알기닌 잔기가 8개 이상 연속하는 배열을 가지는 펩티드 등을 들 수 있다. 상기 양이온성 폴리머로서는, 아미노스티렌 등을 들 수 있다. 이들 중에서도, 세포접착성이 높은, 라미닌, 콜라겐, 피브로넥틴이 바람직하다.
또한, 상기 열거의 세포접착성 물질을 포함하는 시약도 호적하게 이용할 수 있고, 이러한 시약으로서는, 혈청 등을 들 수 있다.
상기 세포접착성 물질은, 1종 단독으로 이용해도 좋고, 복수종을 병용해도 좋다.
제2 피복 영역의 면적은, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, φ35 mm의 세포배양기의 배양면을 이용하여, 1 ~ 30 mm 사이즈의 세포구조체를 제조하는 경우, 0.1 ~ 75 ㎟로 해도 좋고, 바람직하게는 0.1 ~ 10 ㎟이다.
제2 피복 영역의 형상은, 특별히 한정되는 일 없이, 평면시, 원형(원, 타원 등), 직사각형(정방형, 장방형, 삼각형 등)으로 해도 좋고, 직사각형은 모서리가 둥글어도 좋다.
그 중에서도, 상기 형상은, 세포가 응집할 때에 제2 피복 영역에 접착한 세포에 관련된 힘을 완화하는 관점에서, 원형이 바람직하다.
제2 피복 영역의 형상이 원형인 경우, 세포구조체의 형상을 제어하는 관점에서, 그 직경은 0.1 ~ 50 mm인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 0.1 ~ 10 mm이다.
상기 제2 피복 영역의 면적(S2)의 상기 제1 피복 영역의 면적(S1)에 대한 비율(S2/S1)은, 특별히 한정되지 않지만, 세포의 응집 양식을 제어하기 쉽게 하는 관점에서, 0.001 ~ 1.0인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 0.01 ~ 0.5이다.
본 실시 형태(V)에서는, 제1 피복 영역 및 제2 피복 영역은, 서로 겹쳐 있어도 좋고, 서로의 외윤곽선이 접하고 있어도 좋고, 서로의 최단 거리로 0.1 ~ 10 mm만큼 이간하고 있어도 좋다.
또한 제1 피복 영역의 배양면에서의 위치, 및 제2 피복 영역의 배양면에서의 위치는, 각각의 중심의 위치로 해도 좋다.
본 실시 형태(V)에서는, 제2 피복 영역은 제1 피복 영역의 단부에 설치되어 있으면 좋고, 여기서, 단부란, 제1 피복 영역의 외윤곽선으로부터 내측으로 0.01 ~ 1 mm의 영역을 말한다.
본 실시 형태(V)에서는, 제1 피복 영역의 단부에 설치되는 제2 피복 영역의 수는, 복수이면 특별히 한정되는 일 없이, 3 이상, 4 이상 등으로 해도 좋다. 또한 복수의 제2 피복 영역간에서, 피복되는 세포접착성 물질은, 같아도 좋고, 달라도 좋다.
도 36(a) ~ (c)에, 본 실시 형태(V)에서의 제1 피복 영역과 제1 피복 영역과의 배치 양태에 대해 나타낸다.
도 36(a)(i) 및 도 35(i) ~ (ｖiii)에 나타내는 예에서는, 제1 피복 영역을 평면시 원형으로 하고, 제2 피복 영역을, 원형의 제1 피복 영역의 양단부에, 제1 피복 영역과 겹치면서, 배치하고 있다.
본 실시 형태(V)에서는, 원형의 제1 피복 영역의 단부에, 제2 피복 영역을, 제1 피복 영역과 겹치면서, 3개소에 배치해도 좋고(도 36(a)(ii) 참조), 4개소에 배치해도 좋다(도 36(a)(iii) 참조).
또한, 본 실시 형태(V)에서는, 도 36(b)에 나타낸 바와 같이, 모서리가 둥근 장방형의 제1 피복 영역의 양단부에, 제2 피복 영역을, 제1 피복 영역과 겹치면서, 배치해도 좋다.
또한, 본 실시 형태(V)에서는, 도 36(c)에 나타낸 바와 같이, 소망한 형상의 제1 피복 영역의 복수(도면에서는 5개소)의 단부에, 제2 피복 영역을, 제1 피복 영역과 겹치면서, 배치해도 좋다.
또한 도 35에 나타내는 일례의 세포구조체의 제조 방법에서는, 준비 공정을, 세포배양기(도 35(i) 참조)의 배양면의 중앙 부분에, 평면시 원형의 형상을 그리면서, 상기 온도 응답성 폴리머 및/또는 상기 온도 응답성 폴리머 조성물을 도포하고(도 35(ii) 참조), 도포 부분을 건조하는 (도 35(iii) 참조) 것에 의해, 제1 피복 영역을 설치하고, 그 후, 이 원형의 제1 피복 영역의 중심을 통과하는 직선 상에 위치하고, 제1 피복 영역의 단부에 위치하는 2개소에, 평면시 원형의 형상을 그리면서, 세포접착성 물질을 도포하고(도 35(ii) 참조), 도포 부분을 건조하는 (도 35(iii) 참조) 것에 의해, 제2 피복 영역을 설치하고 있다.
상기 준비 공정은, 예를 들면, 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물을, 용매에 용해하여, 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물을 포함하는 용액(온도 응답성 폴리머 용액)으로 한 후, 세포배양기의 배양면 상에 도포하고, 건조시켜 피복 세포배양기를 준비하는 공정(준비 공정 I)으로 해도 좋고, 또한, 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물을 포함하는 수용액(온도 응답성 폴리머 수용액)을 온도 응답성 폴리머의 담점 이하로 냉각하고, 냉각한 온도 응답성 폴리머 수용액을 세포배양기의 배양면 상에 유연시켜, 담점 초과의 온도까지 가열하여, 피복 세포배양기를 준비하는 공정(준비 공정 II)으로 해도 좋다.
상기 준비 공정 I에서의 온도 응답성 폴리머 용액에서의 용매로서는, 예를 들면, 물； 생리식염수； 완충액； 메탄올, 에탄올, n-프로필알코올, 이소프로필 알코올, 1-부탄올, 이소부틸 알코올, 2-부탄올, t-부틸알코올, 1-펜탄올, 2-펜탄올, 3-펜탄올, 2-메틸-1-부탄올, 3-메틸-1-부탄올, 2-메틸-2-부탄올, 3-메틸-2-부탄올, 2, 2-디메틸-1-프로판올, 1-펜탄올, 2-펜탄올, 3-펜탄올, 2-메틸-1-부탄올, 3-메틸-1-부탄올, 2-메틸-2-부탄올, 3-메틸-2-부탄올, 2, 2-디메틸-1-프로판올, 1-헥산올, 2-메틸-2-펜탄올, 알릴알코올, 벤질알코올, 살리실알코올 등의 알코올； 아세톤, 에틸메틸케톤, 디에틸케톤, 메틸프로필케톤, 메틸이소부틸케톤, 메틸비닐케톤, 시클로헥사논, 2-메틸시클로펜타논, 아세토페논, 벤조페논, 이소포론 등의 케톤； 아세트산 메틸, 아세트산 에틸, 아세트산 프로필, 아세트산 이소프로필, 아세트산 n-부틸, 아세트산 이소부틸, 아세트산 sec-부틸, 아세트산 tert-부틸, 아세트산 비닐, 포름산 메틸, 포름산 에틸, 포름산 프로필, 상기 알코올과 인산의 에스테르, 상기 알코올과 탄산의 에스테르 등의 에스테르； 클로로포름； 벤젠； 톨루엔； 디에틸에테르； 디클로로메탄； 등을 들 수 있다.
그 중에서도, 배양면에 균일하게 피복하기 쉽고, 또한, 온도 응답성 폴리머의 용해성이 우수하다고 하는 관점에서, 메탄올, 에탄올, n-프로필알코올, 이소프로필 알코올, 2-부탄올, t-부틸알코올, 알릴알코올 등의 알코올； 아세톤, 에틸메틸케톤, 디에틸케톤, 메틸비닐케톤 등의 케톤； 아세트산 메틸, 아세트산 에틸, 아세트산 이소프로필, 아세트산 tert-부틸, 아세트산 비닐 등의 에스테르； 클로로포름； 벤젠； 톨루엔； 디에틸에테르； 디클로로메탄이 바람직하다. 또한, 단시간에 건조시킬 수 있어 배양면에 한층 균일하게 도포하기 쉽다고 하는 관점에서, 비점이 낮은 유기 용매(예를 들면, 탄소수 1 ~ 4의 저급알코올, 탄소수 3 ~ 5의 저급 케톤, 및 탄소수 1 ~ 4의 알킬기를 가지는 아세트산 알킬에스테르로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종, 특히, 물보다 비점이 낮은, 탄소수 1 ~ 4의 저급알코올, 탄소수 3 ~ 5의 저급 케톤, 및 탄소수 1 ~ 4의 알킬기를 가지는 아세트산 알킬에스테르로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 1종)가 더 바람직하고, 코스트, 조작성도 우수한 관점에서, 메탄올, 에탄올이 특히 바람직하다.
상기 용매는, 1종 단독으로 사용해도 좋고, 2종 이상을 병용해도 좋다.
용매는, 온도 응답성 폴리머의 용해성이 우수하기 때문에, 담점 이상의 온도(예를 들면, 실온이나 37℃ 등)로 해도, 온도 응답성 폴리머가 부용화해서 침전하기 어렵다. 그 때문에, 온도 응답성 폴리머를 도포할 때에, 온도 응답성 폴리머 용액의 온도 관리를 하는 수고를 줄일 수 있고, 간이하게 피복 세포배양기를 준비할 수 있다.
상기 준비 공정 I에서, 온도 응답성 폴리머 용액에는, 세포가 자기 응집하기 쉬워진다고 하는 관점에서, 친수성 분자가 포함되는 것이 바람직하다. 친수성 분자로서는, 온도 응답성 폴리머의 C/A비에 영향을 주지 않는 비이온성이고 친수성인 것, 예를 들면, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 디메틸아크릴아미드(DMAA), 글리세린, TritonX, 폴리프로필렌글리콜 등을 들 수 있다.
상기 준비 공정 I에서, 온도 응답성 폴리머 용액 중의 온도 응답성 폴리머의 함유량은, 온도 응답성 폴리머가 배양면에 균일하게 피복되기 쉬워진다고 하는 관점에서, 온도 응답성 폴리머 용액(100 중량%)에 대해서, 0.00075 ~ 0.015 중량%인 것이 바람직하고, 0.001 ~ 0.01 중량%인 것이 보다 바람직하다.
상기 준비 공정 I에서, 온도 응답성 폴리머 용액 중의 친수성 분자의 함유량은, 세포가 자기 응집하기 쉬워진다고 하는 관점에서, 온도 응답성 폴리머(100 중량%)에 대해서, 0.00001 ~ 0.00015 중량%인 것이 바람직하고, 0.00003 ~ 0.0001 중량%인 것이 보다 바람직하다.
상기 준비 공정 I에서, 온도 응답성 폴리머 용액은, 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물이 배양면에 균일하게 피복되기 쉬워진다고 하는 관점에서, 물이 포함되지 않는 것이 바람직하고, 온도 응답성 폴리머 용액(100 중량%) 중의 물의 중량 비율이 0.5 중량% 이하인 것이 보다 바람직하고, 0.1 중량% 이하인 것이 더 바람직하다.
또한 물의 중량 비율은, 가스크로마토그래피, 컬피셔법 등 당업자에게 주지의 방법에 의해 측정 가능하다.
상기 준비 공정 I에서, 온도 응답성 폴리머 용액은, 배양면의 전면에 도포해도 좋고, 배양면의 일부에 도포해도 좋다. 그 중에서도, 간이하게 세포구조체가 수득되는 관점에서, 배양면의 전면에 도포하는 것이 바람직하다.
상기 준비 공정 I에서, 도포한 온도 응답성 폴리머 용액을 건조시키는 조건으로서는, 배양면에 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물을 균일하게 피복하는 관점에서, 대기압 하에서, 온도 10 ~ 70℃, 시간 1 ~ 3,000분이 바람직하다. 도포한 온도 응답성 폴리머 용액을, 빠르게 건조시킴으로써, 배양면 상에 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물이 치우치는 일 없이, 균일하게 피복되기 쉬워진다.
도포한 온도 응답성 폴리머 용액은, 예를 들면, 세포배양기를 37℃의 인큐베이터 중에서 정치함으로써 건조시켜도 좋다.
상기 준비 공정 II에서, 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물을 용해하는 용매로서는, 예를 들면, 물； 생리식염수； 인산완충액, 인산완충 생리식염수(PBS), 트리스완충액 등의 완충액； 등을 들 수 있다.
상기 준비 공정 II에서, 온도 응답성 폴리머 수용액을 냉각하는 방법으로서는, 예를 들면, 온도 응답성 폴리머 수용액을 약 4℃의 냉장고에 넣어 담점 이하의 온도까지 냉각하는 방법 등을 들 수 있다.
상기 준비 공정 II에서, 온도 응답성 폴리머 수용액을 배양면 상에 유연시키는 방법으로서는, 예를 들면, 담점 이하의 온도를 가지는 온도 응답성 폴리머 수용액을, 세포배양기의 배양면을 기울임으로써 펼치는 방법, 스패츌러를 이용하여 온도 응답성 폴리머 수용액을 펼치는 방법 등을 들 수 있다.
상기 준비 공정 II에서, 유연한 온도 응답성 폴리머 수용액을 담점 초과까지 가열하는 방법으로서는, 예를 들면, 유연공정 후의 세포배양기를 37℃의 인큐베이터 중에서 정치하는 방법 등을 들 수 있다.
본 실시 형태(V)의 세포 배양 방법에서는, 준비 공정에서, 제1 피복 영역 및 제2 피복 영역이 차지하는 영역을, 세포 비접착성의 벽으로 둘러싸는 것이 바람직하고, 구체적으로는, 하기의 변형예를 들 수 있다.
또한 세포 비접착성이란, 부착세포가 접착하지 않는 또는 접착하기 어려운 것을 말한다.
이러한 양태에 의하면, 후술의 파종 배양 공정에서, 파종되는 세포와 요부의 벽면의 접착을 억제하고, 세포의 응집 양식을 제어하는 것이 용이하게 되어, 소망한 배향성을 가지는 세포구조체를 보다 정밀하게 제조하는 것이 가능해진다.
도 37에, 준비 공정의 변형예 및 이것에 계속해서 파종 배양 공정의 개략을 나타낸다.
준비 공정의 변형예에서는, 세포배양기의 배양면에, 도 35에서의 제1 피복 영역 및 제2 피복 영역의 형상을 이루는 평면시 형상(큰 사이즈의 원, 및 그 단부 2개소에 배치된 작은 사이즈의 원)의 요부를 음각한다 (도 37 참조).
그리고, 이 변형예의 준비 공정에서는, 음각한 요부의 바닥면에만 온도 응답성 폴리머 및/또는 상기 온도 응답성 폴리머 조성물, 및 세포접착성 물질을 배치하여, 요부의 바닥면 이외의 면, 요부의 벽면의 표면에는, 상기 폴리머 및/또는 상기 폴리머 조성물, 및 세포접착성 물질을 배치하고 있지 않다 (도 37(i) 참조).
이러한 변형예에 의하면, 소망한 배향성을 가지는 세포구조체를 보다 정밀하게 제조할 수 있다 (도 37(ii) 참조).
(파종 배양 공정)
본 실시 형태(V)에서의 일례의 제조 방법에서는, 그 다음에, 세포를 제1 피복 영역 및 제2 피복 영역에 파종하고, 세포를 배양함으로써, 세포구조체를 조제한다(파종 배양 공정).
도 35에 나타내는 예에서는, 파종 배양 공정을, 세포배양기에 세포 및 세포배양용 배지를 가하고(도 35(iｖ) 참조), 그 후, 이 세포배양기를 일반적인 37℃의 세포 인큐베이터에 넣어(도 35(ｖ) 참조), 배지 교환에 의해 새로운 세포배양용 배지를 가하고(도 35(ｖi) 참조), 세포배양기를 세포 인큐베이터에 더 넣는 (도 35(ｖii), (ｖiii) 참조) 것에 의해 행하고 있다.
본 실시 형태(V)의 세포 배양 방법에 이용하는 것이 가능한 세포로서는, ADSC, 심근 세포, 심근 선유아세포, 신경 세포, 신경아세포, 선유아세포, 연골 세포, 혈관 내피세포, 혈관 간질 세포, 평활근 세포 등을 들 수 있다.
상기 세포는, 1종 단독으로 사용해도 좋고, 2종 이상을 병용해도 좋다.
파종 배양 공정에서 세포를 파종할 때의 세포 밀도는, 0.3×104개/㎠ 이상으로 하는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 1.0×104개/㎠ 이상이고, 또한, 배양 중의 세포끼리의 접촉에 의한 증식 정지 등의, 세포주기에 관한 문제를 생기기 어렵게 하기 위해서, 5.0×104개/㎠ 이하로 하는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 4.5×104개/㎠ 이하이다.
파종 후의 제1 피복 영역에서는, 90 ~ 100% 컨플루언트가 바람직하고, 보다 바람직하게는 95 ~ 100% 컨플루언트, 더 바람직하게는 99 ~ 100% 컨플루언트이다.
상기 범위이면, 각 세포가 각각 콜로니를 형성하지 않고, 균질 분산한 상태를 유지해 응집하여 세포구조체를 형성할 수 있다. 또한, 세포의 밀도가 높으면 파종한 세포가 증식하기 어려워져, 세포가 증식하기 전에 괴상의 세포구조체를 형성할 수 있다. 또한, 파종한 세포는, 증식할 때의 성질이 변화하는 경우가 있지만, 세포가 증식하기 어려우면 파종시와 같은 성질의 세포를 포함하는 세포구조체를 형성할 수 있다.
배양 조건은, 사용하는 세포종이나 실험 목적에 기초해서, 당업자가 적절히 정할 수 있거나, 적절히 정해도 좋고, 예를 들면, 37℃, 5% CO2 분위기 등으로 해도 좋다.
여기서, 파종 배양 공정에서 생기는 현상을, 도 35를 참조하면서, 이하에 기재한다.
이 공정에서는, 우선, 파종된 세포가, 제1 피복 영역 및 제2 피복 영역 상에, 침강한다. 이 때, 제1 피복 영역 및 제2 피복 영역 상에 침강한 세포는, 피복 영역 상에 접착하여 생존하는 한편, 비피복 영역 상에 침강한 세포는, 비피복 영역 상에 접착하는 일 없이, 사멸한다 (도 35(ｖ) 참조).
그 다음에, 배지 교환에 의해, 배양면에 접착하지 않은 세포가 세포배양기로부터 제거된다 (도 35(ｖi) 참조).
그리고, 제1 피복 영역 및 제2 피복 영역에 접착한 세포를 더욱 배양하면, 제1 피복 영역과 비피복 영역의 경계 부근에 위치하는 세포가, 상기 세포보다 제1 피복 영역의 중앙 부분 측에 위치하는 세포도 수반하면서, 중앙 부분을 향해 응집하기 시작한다 (도 35(ｖii) 참조). 바꾸어 말하면, 접착하고 있는 세포가, 제1 피복 영역으로부터 멀어지도록 박리하고, 제1 피복 영역의 중앙 부분을 향해 휜다.
한편, 제2 피복 영역에 접착한 세포는, 제2 피복 영역으로부터 박리하는 일 없이, 당초의 위치에 계속 접착한다 (도 35(ｖii) 참조).
최종적으로, 제1 피복 영역에 접착하고 있는 세포는, 제2 피복 영역에 계속 접착하는 2개의 세포집단의 사이를 연결하도록, 제1 피복 영역의 중앙 부분에서, 직선상의 구조를 가지는 세포구조체를 형성한다 (도 35(ｖiii) 참조).
여기서, 파종 배양 공정에서 수득된 세포구조체 중, 제1 피복 영역에 접착하고 있는 세포에 의해 형성되는 부분에서는, 세포가, 직선상의 구조의 연재 방향에 따라서 길게 늘어진 형상을 이루고, 2개의 제2 피복 영역을 잇는 선의 방향에 따른 방향으로의 배향성을 구비한다.
이렇게 해서 수득된 세포구조체를 복수 이용하여, 적절히, 조직해 넣거나 연결시키거나 함으로써, 소망한 형상의 세포구조체를 제작하는 것도 가능하다.
또한, 수득된 세포구조체는, 바이어빌리티의 관점에서, 가능한 한 형성 직후에 실험 등에 이용하는 것이 바람직하고, 24시간 이내에 사용하는 것이 더욱 바람직하다.
본 실시 형태(V)의 세포구조체의 제조 방법에 의하면, 단층 구조로 영양과 산소를 충분히 공급되고 있는 세포가 단시간 내에 응집해 세포구조체를 형성하기 때문에, 상기 세포구조체의 내부의 세포가 산소결핍으로 괴사하는 등의 종래 기술에서의 문제가 생기기 어렵다. 특히, 산소 공급의 필요성이 특히 높은 심근 세포로 이루어지는 세포구조체의 배양에 유용하다.
생체 내의 환경에서의 세포구조체를 시험관 내에서 수득하는 것은, 실험 기술의 관점에서, 매우 중요한 의미를 가지는 경우, 본 실시 형태(V)의 세포구조체의 제조 방법에 의하면, 세포의 배향성을 생체 내에서의 것과 마찬가지로 갖추는 (예를 들면, 심근 세포의 경우, 소정 방향에의 방추 형태) 것이 가능해진다.
예를 들면, 심근 세포에 관한 창약시험에서는, 부정맥 야기 등의 심독성의 유무를 검출하기 때문에, 배양 심근 세포의 심 전파형을 평가하는 것이 행해지고 있고, 여기에서는, 측정 정도(SN비)를 높이는 관점에서, 세포로부터의 상기 신호를 가능한 한 크게 하는 것이 바람직한다.
본 실시 형태(V)의 세포구조체의 제조 방법에 의하면, 상술한 바와 같이, 큰 사이즈의 세포구조체를, 생래(生來)의 배향성을 구비한 상태로 수득할 수 있기 때문에, 생체 내에서 살아 있는 심근 세포를 모방한 검체를 수득할 수 있다. 이 때문에, 심근 세포에 관한 창약시험의 정도를 높이는 것이 가능해진다.
[[발명(VI)]]
[세포구조체의 제조 방법]
본 발명(VI)의 세포구조체의 제조 방법은, 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물을 조제하는 조제 공정과, 상기 온도 응답성 폴리머 또는 상기 온도 응답성 폴리머 조성물로 세포배양기의 배양면을 피복하여 피복 세포배양기를 준비하는 배양기 준비 공정과, 심근 세포와 상기 심근 세포 100개에 대해서 200 ~ 300개의 비율의 선유아세포를 상기 피복 세포배양기에 파종하는 파종 공정과, 파종한 세포를 배양하여 괴상의 세포구조체를 수득하는 배양 공정을, 이 순서로 포함한다.
또한 본 명세서에서, 세포배양기의 배양면에서의, 상기 온도 응답성 폴리머 또는 상기 온도 응답성 폴리머 조성물로 피복된 부분을 「피복배양면」이라고 칭하는 경우가 있다. 또한, 피복 세포배양기란, 피복배양면을 가지는 세포배양기이다. 피복 세포배양기는, 배양면 전면이 피복배양면이어도 좋고, 배양면의 일부가 피복배양면이어도 좋다. 또한, 배양면에 1개의 피복배양면을 가지고 있어도 좋고, 복수의 피복배양면을 가지고 있어도 좋다.
심근 세포와 선유아세포를 포함하는 세포구조체는, 공지의 U자 바닥 접착성 배양접시나 행잉드롭법으로 1 ~ 2주간의 긴 시간에 걸쳐 스페로드를 형성시키는 것도 가능하지만, 제작에 시간이 걸리기 때문에, 저산소 상태에 매우 약한 심근 세포의 유지가 곤란해지는 문제, 증식속도가 다른 세포끼리의 공배양이 곤란한 문제 등이 있었다.
본 발명자들은, 놀랄 만한 것으로, 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물로 세포배양기의 배양면을 피복한 피복 세포배양기에, 심근 세포와 선유아세포를 파종함으로써, 심부전을 일으킨 심 질환의 조직을 모방한 세포구조체를 용이하게 형성할 수 있는 것을 찾아냈다.
본 실시 형태(VI)의 세포구조체의 제조 방법에 의하면, 심근 세포와 선유아세포가 균질 분산한 상태를 유지해 응집시키는 것이 가능하고, 심근 세포와 선유아세포를 포함하는, 생체 내에 존재하는 상태에 가까운, 심부전을 일으킨 조직을 재현할 수 있다.
본 실시 형태(VI)의 세포구조체의 제조 방법에 의하면, 파종된 혼합 세포는 피복배양면에 접착하고, 더 배양하면, 혼합 세포는 자기 응집을 하여 수축하여, 시트상에 퍼진 세포의 단부가 피복배양면으로부터 떨어져 휘도록 하여 응집하고, 괴상의 세포구조체를 형성한다.
특히, 본 실시 형태(VI)의 세포구조체의 제조 방법에서는, 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물로 배양면이 피복되어 있고, 피복배양면과 세포의 접착력이 적절한 범위에 있기 때문에, 응집하기 어려운 성질을 가지는 심근 세포를 포함하는 혼합 세포이어도, 괴상의 세포구조체를 형성할 수 있다. 또한, 응집하기 쉬운 선유아세포와 조합함으로써, 용이하게 괴상의 세포구조체를 형성할 수 있다.
심근 세포와 선유아세포는, 증식속도가 다르기 때문에, 종래의 장시간 배양을 하여 세포구조체를 형성하는 방법에서는, 심근 세포를 많이 포함하는 세포구조체를 형성할 수 없었다. 본 실시 형태(VI)의 세포구조체의 제조 방법에 의하면, 심근 세포와 선유아세포를 증식시키는 일 없이 세포구조체를 형성할 수 있기 때문에, 파종시의 심근 세포와 선유아세포의 세포비와 거의 마찬가지의 비율의 세포로 구성되는 세포구조체를 수득할 수 있다. 그 때문에, 세포구조체를 구성하는 세포의 혼합 비율을 용이하게 조정할 수 있다. 또한, 본 실시 형태(VI)의 세포구조체의 제조 방법에 의하면, 피복배양면과 세포의 접착력이 적절한 범위에 있는 피복 세포배양기를 이용하고 있기 때문에, 세포의 증식을 필요로 하지 않고, 예를 들면, 파종 후 24시간 이내 등의 단시간에, 심근 세포와 선유아세포의 혼합 세포가 응집해서 둥글게 되기 때문에, 증식속도가 다른 2종 이상의 세포로 이루어지고, 심근 세포를 살아있는 상태로 포함하고, 박동하고 있는 괴상의 세포구조체를 용이하게 형성할 수 있다.
(조제 공정)
실시 형태(VI)의 세포배양기에 이용되는 온도 응답성 폴리머 및 온도 응답성 폴리머 조성물을 조제하는 조제 공정으로서는, 상기 발명(I)에서의 조제 공정과 마찬가지의 공정을 들 수 있고, 호적예로서도 마찬가지의 것을 들 수 있다.
또한 본 실시 형태(VI)에서, 제조 방법에 이용되는 온도 응답성 폴리머 및 온도 응답성 폴리머 조성물로서는, 심근 세포와 선유아세포를 포함하는, 괴상의 세포구조체가 한층 수득되기 쉽다고 하는 관점에서, (A)가 바람직하다.
또한, 본 실시 형태(VI)에서, 2-N, N-디메틸아미노에틸 메타크릴레이트(DMAEMA)를 포함하는 혼합물을 조제하는 조제 공정을, 혼합물 조제 공정으로 칭하는 경우가 있다.
(배양기 준비 공정)
본 발명(VI)의 실시 형태의 제조 방법에서, 상기 배양기 준비 공정은, 상기 온도 응답성 폴리머 또는 상기 온도 응답성 폴리머 조성물로 세포배양기의 배양면을 피복하여 피복 세포배양기를 준비하는 공정이다.
상기 배양기 준비 공정은, 예를 들면, 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물을, 용매에 용해하여, 온도 응답성 폴리머 용액으로 한 후, 세포배양기의 배양면 상에 도포하고, 건조시켜 피복 세포배양기를 준비하는 공정(배양기 준비 공정 I)으로 해도 좋고, 또한, 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물을 포함하는 수용액(온도 응답성 폴리머 수용액)을 온도 응답성 폴리머의 담점 이하로 냉각하고, 냉각한 온도 응답성 폴리머 수용액을 세포배양기의 배양면 상에 유연시켜, 담점 초과의 온도까지 가열하여, 피복 세포배양기를 준비하는 공정(배양기 준비 공정 II)으로 해도 좋다.
상기 배양기 준비 공정 I에서의 온도 응답성 폴리머 용액에서의 용매로서는, 예를 들면, 물； 생리식염수； 완충액； 메탄올, 에탄올, n-프로필알코올, 이소프로필 알코올, 1-부탄올, 이소부틸 알코올, 2-부탄올, t-부틸알코올, 1-펜탄올, 2-펜탄올, 3-펜탄올, 2-메틸-1-부탄올, 3-메틸-1-부탄올, 2-메틸-2-부탄올, 3-메틸-2-부탄올, 2, 2-디메틸-1-프로판올, 1-펜탄올, 2-펜탄올, 3-펜탄올, 2-메틸-1-부탄올, 3-메틸-1-부탄올, 2-메틸-2-부탄올, 3-메틸-2-부탄올, 2, 2-디메틸-1-프로판올, 1-헥산올, 2-메틸-2-펜탄올, 알릴알코올, 벤질알코올, 살리실알코올 등의 알코올； 아세톤, 에틸메틸케톤, 디에틸케톤, 메틸프로필케톤, 메틸이소부틸케톤, 메틸비닐케톤, 시클로헥사논, 2-메틸시클로펜타논, 아세토페논, 벤조페논, 이소포론 등의 케톤； 아세트산 메틸, 아세트산 에틸, 아세트산 프로필, 아세트산 이소프로필, 아세트산 n-부틸, 아세트산 이소부틸, 아세트산 sec-부틸, 아세트산 tert-부틸, 아세트산 비닐, 포름산 메틸, 포름산 에틸, 포름산 프로필, 상기 알코올과 인산의 에스테르, 상기 알코올과 탄산의 에스테르 등의 에스테르； 클로로포름； 벤젠； 톨루엔； 디에틸에테르； 디클로로메탄； 등을 들 수 있다.
그 중에서도, 배양면에 균일하게 피복하기 쉽고, 또한, 온도 응답성 폴리머의 용해성이 우수하다고 하는 관점에서, 물, 메탄올, 에탄올, n-프로필알코올, 이소프로필 알코올, 2-부탄올, t-부틸알코올, 알릴알코올 등의 알코올； 아세톤, 에틸메틸케톤, 디에틸케톤, 메틸비닐케톤 등의 케톤； 아세트산 메틸, 아세트산 에틸, 아세트산 이소프로필, 아세트산 tert-부틸, 아세트산 비닐 등의 에스테르； 클로로포름； 벤젠； 톨루엔； 디에틸에테르； 디클로로메탄이 바람직하다. 또한, 단시간에 건조시킬 수 있어 배양면에 한층 균일하게 도포하기 쉽다고 하는 관점에서, 비점이 낮은 유기 용매(예를 들면, 탄소수 1 ~ 4의 저급알코올, 탄소수 3 ~ 5의 저급 케톤, 및 탄소수 1 ~ 4의 알킬기를 가지는 아세트산 알킬에스테르로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종, 특히, 물보다 비점이 낮은, 탄소수 1 ~ 4의 저급알코올, 탄소수 3 ~ 5의 저급 케톤, 및 탄소수 1 ~ 4의 알킬기를 가지는 아세트산 알킬에스테르로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 1종)가 더 바람직하고, 코스트, 조작성도 우수한 관점에서, 메탄올, 에탄올이 특히 바람직하다.
상기 용매는, 1종 단독으로 사용해도 좋고, 2종 이상을 병용해도 좋다.
용매는, 온도 응답성 폴리머의 용해성이 우수하기 때문에, 담점 이상의 온도(예를 들면, 실온이나 37℃ 등)로 해도, 온도 응답성 폴리머가 부용화해서 침전하기 어렵다. 그 때문에, 온도 응답성 폴리머를 도포할 때에, 온도 응답성 폴리머 용액의 온도 관리를 하는 수고를 줄일 수 있고, 간이하게 피복 세포배양기를 준비할 수 있다.
상기 배양기 준비 공정 I에서, 온도 응답성 폴리머 용액에는, 세포가 자기 응집하기 쉬워진다고 하는 관점에서, 친수성 분자가 포함되는 것이 바람직하다. 친수성 분자로서는, 온도 응답성 폴리머의 C/A비에 영향을 주지 않는 비이온성이고 친수성인 것, 예를 들면, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 디메틸아크릴아미드(DMAA), 글리세린, TritonX, 폴리프로필렌글리콜 등을 들 수 있다.
상기 배양기 준비 공정 I에서, 온도 응답성 폴리머 용액 중의 온도 응답성 폴리머의 함유량은, 온도 응답성 폴리머가 배양면에 균일하게 피복되기 쉬워진다고 하는 관점에서, 온도 응답성 폴리머 용액(100질량%)에 대해서, 0.05 ~ 2.0질량%인 것이 바람직하고, 0.1 ~ 1.5질량%인 것이 보다 바람직하다.
상기 배양기 준비 공정 I에서, 온도 응답성 폴리머 용액 중의 친수성 분자의 함유량은, 세포가 자기 응집하기 쉬워진다고 하는 관점에서, 온도 응답성 폴리머(100질량%)에 대해서, 0.00001 ~ 0.00015질량%인 것이 바람직하고, 0.00003 ~ 0.0001질량%인 것이 보다 바람직하다.
상기 배양기 준비 공정 I에서, 온도 응답성 폴리머 용액은, 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물이 배양면에 균일하게 피복되기 쉬워진다고 하는 관점에서, 물이 포함되지 않는 것이 바람직하고, 온도 응답성 폴리머 용액(100질량%) 중의 물의 질량 비율이 0.5질량% 이하인 것이 보다 바람직하고, 0.1질량% 이하인 것이 더 바람직하다.
또한 물의 질량 비율은, 가스크로마토그래피, 컬피셔법 등 당업자에게 주지의 방법에 의해 측정 가능하다.
상기 배양기 준비 공정 I에서, 온도 응답성 폴리머 용액은, 배양면의 전면에 도포해도 좋고, 배양면의 일부에 도포해도 좋다. 배양면의 일부에 온도 응답성 폴리머 용액을 도포하는 경우는, 배양면 상에, 피복배양면을 1개 설치해도 좋고, 복수의 피복배양면을 설치해도 좋다. 또한 배양면의 일부에 온도 응답성 폴리머 용액을 도포하는 경우는, 배양면이 세포 비접착성인 세포배양기를 이용하는 것이 바람직하다.
또한 「세포 비접착성」이란, 부착세포(예를 들면, 선유아세포, 심근 세포, 혈관 내피세포 등)가, 통상의 배양 조건하에서, 접착하지 않는 또는 접착하기 어려운 성질을 말한다.
상기 배양기 준비 공정 I에서, 도포한 온도 응답성 폴리머 용액을 건조시키는 조건으로서는, 배양면에 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물을 균일하게 피복하는 관점에서, 대기압 하에서, 온도 10 ~ 70℃, 시간 1 ~ 3,000분이 바람직하다. 도포한 온도 응답성 폴리머 용액을, 빠르게 건조시킴으로써, 배양면 상에 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물이 치우치는 일 없이, 균일하게 피복되기 쉬워진다.
도포한 온도 응답성 폴리머 용액은, 예를 들면, 세포배양기를 37℃의 인큐베이터 중에서 정치함으로써 건조시켜도 좋다.
상기 배양기 준비 공정 II에서, 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물을 용해하는 용매로서는, 예를 들면, 물； 생리식염수； 인산완충액, 인산완충 생리식염수(PBS), 트리스완충액 등의 완충액； 등을 들 수 있다.
상기 배양기 준비 공정 II에서, 온도 응답성 폴리머 수용액을 냉각하는 방법으로서는, 예를 들면, 온도 응답성 폴리머 수용액을 약 4℃의 냉장고에 넣어 담점 이하의 온도까지 냉각하는 방법 등을 들 수 있다.
상기 배양기 준비 공정 II에서, 온도 응답성 폴리머 수용액을 배양면 상에 유연시키는 방법으로서는, 예를 들면, 담점 이하의 온도를 가지는 온도 응답성 폴리머 수용액을, 세포배양기의 배양면을 기울임으로써 펼치는 방법, 스패츌러를 이용하여 온도 응답성 폴리머 수용액을 펼치는 방법 등을 들 수 있다.
상기 배양기 준비 공정 II에서, 유연한 온도 응답성 폴리머 수용액을 담점 초과까지 가열하는 방법으로서는, 예를 들면, 유연공정 후의 세포배양기를 37℃의 인큐베이터 중에서 정치하는 방법 등을 들 수 있다.
상기 세포배양기로서는, 시판의 멀티 웰 플레이트, 디쉬, 플라스크 등을 들 수 있다. 상기 세포배양기의 재질로서는, 폴리스티렌, 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET), 폴리프로필렌, 폴리부텐, 폴리에틸렌, 폴리카보네이트, 유리 등을 들 수 있다. 그 중에서도, 정밀한 성형 가공이 용이하고, 다양한 멸균법을 적용하는 것이 가능하고, 투명성이 있기 때문에 현미경 관찰에 적합한 관점에서, 폴리스티렌, 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET)가 바람직하다.
상기 세포배양기는, 배양면 표면에 세포접착 처리 등의 처리가 실시된 것이어도 좋고, 표면이 무처리이어도 좋다. 상기 배양면 표면은, 세포의 접착성을 조정하기 위해서, 코팅 처리, 가공 처리 등이 되어 있어도 좋다.
상기 배양면의 평면시 형상은, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 대략 사각형 등의 대략 다각형, 대략 원형 등의 형상을 들 수 있다. 그 중에서도, 보다 균질한 세포구조체가 수득되기 쉽다고 하는 관점에서, 대략 원형이 바람직하다.
상기 배양면의 바닥 형상(바닥면의 단면 형상)은, 특별히 한정되지 않지만, 평평한 바닥, 둥근 바닥, 요철상 바닥 등을 들 수 있다. 그 중에서도, 보다 균질로 구상의 세포구조체가 수득되기 쉽다고 하는 관점에서, 평평한 바닥 또는 약간의 R가 붙은 요면 바닥이 바람직하다.
상기 세포배양기의 배양면의 면적은, 심근 세포에의 산소 공급의 관점에서, 200 ㎟ 이하인 것이 바람직하고, 75 ㎟ 이하인 것이 보다 바람직하고, 32 ㎟ 이하인 것이 더 바람직하다. 또한 상기 세포배양기의 배양면의 면적의 하한치는, 시판 사이즈의 것이면 사용 가능하고, 특별히 한정되지 않는다.
상기 피복배양면의 각 면적(온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물로 피복된 부분의 각 면적)은, 심근 세포에의 산소 공급의 관점에서, 200 ㎟ 이하인 것이 바람직하고, 75 ㎟ 이하인 것이 보다 바람직하고, 32 ㎟ 이하인 것이 더 바람직하다.
상기 피복 세포배양기는, 피복배양면이 단위면적당 가지는 온도 응답성 폴리머의 양이, 0.1 ~ 10.0ng/㎟인 것이 바람직하고, 0.5 ~ 5.0ng/㎟인 것이 더욱 바람직하다. 상기 범위로 하면, 괴상의 세포구조체를 형성시키기 쉽게 한다고 하는 효과가 수득되기 쉽다.
상기 피복 세포배양기에서의, 피복배양면의 제타 전위로서는, 0 ~ 50 mV가 바람직하고, 보다 바람직하게는 0 ~ 35 mV, 더욱 바람직하게는 10 ~ 25 mV이다. 제타 전위가 0 mV 이상인 것에 의해, 음으로 대전되는 세포가 접착하기 쉬워진다. 또한, 제타 전위가 50 mV 이하인 것에 의해, 세포 독성을 경감할 수 있다.
또한, 제타 전위를 상기 범위로 함으로써, 세포를 적절한 배양 조건에서 배양하는 것만으로, 괴상(펠릿상)의 세포구조체를 한층 제작하기 쉬워진다. 이것은, 표면 제타 전위를 상기 범위로 함으로써, 피복배양면에 세포 독성을 야기하지 않는 미약한 양전하를 제공할 수 있고, 또한, 파종한 세포의 빠른 접착을 확보하여 세포의 활성의 향상 및 세포외 매트릭스의 분비를 촉진하고, 또한, 세포 유주를 적절히 억제하여 세포간의 결합을 강하게 할 수 있는 것에 의한 것으로 추측된다.
또한 제타 전위란, 폴리스티렌 라텍스를 히드록시프로필셀룰로오스로 피복한 입자(제타 전위： -5 mV ~ ＋5 mV)를 표준의 모니터 입자로 해서 제타 전위계(예를 들면, 형번 「ELSZ」, Otsuka Electronics Co., Ltd. 제 등)로 측정한, Smoluchowski식에 의해 산출되는 값을 말한다.
상기 피복배양면에 대한 물의 접촉각으로서는, 본 발명(VI)의 효과를 높이는 관점에서, 50 ~ 90°이 바람직하고, 보다 바람직하게는 60 ~ 80°, 더욱 바람직하게는 62 ~ 78°이다. 또한 피복배양면에 대한 물의 접촉각이란, 피복배양면 내의 임의의 수개의 점에서, JIS　R3257에 준거해 측정되는 접촉각의 평균치를 말한다.
(파종 공정)
상기 파종 공정은, 심근 세포와 상기 심근 세포 100개에 대해서 200 ~ 300개의 비율의 선유아세포를 상기 피복 세포배양기에 파종하는 공정이다. 세포의 파종은, 전세포를 혼합해 한 번에 파종해도 좋고, 복수회로 나누어 파종해도 좋다. 또한, 각 세포는, 한 번에 파종해도 좋고, 복수회로 나누어 파종해도 좋다.
상기 피복 세포배양기의 상기 피복배양면에 파종하는 세포는, 적어도 심근 세포, 선유아세포를 포함한다.
상기 심근 세포로서는, 심근 세포와 선유아세포가 한층 균질하게 분산한 세포구조체가 수득되기 쉽다고 하는 관점에서, 심근 세포, 심근 줄기세포, 및 분화 유도 단계의 iPS 세포, ES 세포 등이 바람직하다.
상기 심근 세포는, 1종 단독으로 사용해도 좋고, 2종 이상을 병용해도 좋다.
상기 선유아세포로서는, 심근 선유아세포, 피하지방, 근막, 활막, 골막 유래의 간엽계 줄기세포 등을 들 수 있다. 그 중에서도, 심근 세포와 선유아세포가 한층 균질하게 분산한 세포구조체가 수득되기 쉽다고 하는 관점에서, 심근 선유아세포, 피하지방 유래의 간엽계 줄기세포가 바람직하다.
상기 선유아세포는, 1종 단독으로 사용해도 좋고, 2종 이상을 병용해도 좋다.
상기 파종 공정에서, 혈관 내피세포나 혈관 간질 세포를 더 파종해도 좋다. 이들은, 1종 단독으로 사용해도 좋고, 2종 이상을 병용해도 좋다.
상기 파종 공정에서, 면역계 세포를 더 파종해도 좋다. 상기 면역계 세포로서는, 예를 들면 마크로파지, CD4 양성 T세포 등의 T세포, 단구 등을 들 수 있다. 그 중에서도, 심부전 등의 심 질환을 일으킨 조직에 한층 가까운 세포구조체가 수득되는 관점에서, 마크로파지 및/또는 T세포를 포함하는 것이 바람직하다.
상기 면역계 세포는, 1종 단독으로 사용해도 좋고, 2종 이상을 병용해도 좋다.
상기 파종 공정에서, 심근 세포 100개에 대한 선유아세포의 비율은, 200 ~ 300개이고, 200 ~ 250개인 것이 바람직하고, 200 ~ 230개인 것이 보다 바람직하다. 선유아세포의 비율을, 심근 세포 100개에 대해서 200개 이상으로 함으로써, 혼합 세포가 둥글게 되어 괴상의 세포구조체를 형성하기 쉬워진다. 또한, 300개 이하로 함으로써, 심부전 등의 심 질환을 일으킨 조직에 더 가까운 세포구조체를 수득할 수 있다.
상기 파종 공정에서, 파종하는 전세포 중의 심근 세포의 비율은, 심부전 등의 심 질환을 일으킨 조직에 더 가까운 세포구조체가 수득되는 관점에서, 전세포수(100%)에 대해서, 25 ~ 50%인 것이 바람직하고, 25 ~ 30%인 것이 보다 바람직하다.
상기 파종 공정에서, 심근 세포 100개에 대한 혈관 내피세포의 비율은, 심부전 등의 심 질환을 일으킨 조직에 더 가까운 세포구조체가 수득되는 관점에서, 5 ~ 50개인 것이 바람직하고, 10 ~ 30개인 것이 보다 바람직하다.
상기 파종 공정에서, 심근 세포 100개에 대한 면역계 세포의 비율은, 심부전 등의 심 질환을 일으킨 조직에 더 가까운 세포구조체가 수득되는 관점에서, 5 ~ 50개인 것이 바람직하고, 10 ~ 30개인 것이 보다 바람직하다.
상기 파종 공정에서, 파종 후의 전세포의 피복배양면 상의 밀도는, 상기 피복배양면의 표면적에 대해서, 90 ~ 100% 컨플루언트가 바람직하고, 보다 바람직하게는 95 ~ 100% 컨플루언트, 더 바람직하게는 99 ~ 100% 컨플루언트이다. 파종하는 세포 밀도가 상기 범위이면, 각 세포가 각각 콜로니를 형성하지 않고, 균질 분산한 상태를 유지해 응집하여 세포구조체를 형성할 수 있다. 또한, 세포의 밀도가 높으면 파종한 세포가 증식하기 어려워져, 세포가 증식하기 전에 괴상의 세포구조체를 형성할 수 있기 때문에, 파종한 세포와 세포수의 비율이 같은 세포구조체를 형성할 수 있다. 또한, 세포의 증식속도의 차이에 의한 영향을 받기 어렵다. 또한, 파종한 세포는, 증식할 때의 성질이 변화하는 경우가 있지만, 세포가 증식하기 어려우면 파종시와 같은 성질의 세포를 포함하는 세포구조체를 형성할 수 있다.
세포의 종류에도 의존하지만, 파종 후의 전세포의 피복배양면 상의 밀도로서는, 20 ~ 15,000개/㎟가 바람직하다. 예를 들면, 피복배양면의 면적이 200 ㎟인 24 웰 세포 배양 플레이트에, 1.0 mL의 세포액을 가해 파종하는 경우, 4×104 ~ 30×104개/mL가 바람직하다. 또한 파종되는 세포는, 살아있는 세포로 한다.
세포의 파종은, 예를 들면, 37℃의 인큐베이터 중에 정치해 둔 피복 세포배양기를, 실온의 클린벤치에 꺼내 행할 수 있다.
또한 세포는 배지에 희석해 파종하는 것이 바람직하다. 희석하는 배지로서는, 세포의 배양이 가능한 배지이면, 특별히 한정되지 않는다.
(배양 공정)
상기 배양 공정은, 파종한 세포를 배양하여 괴상의 세포구조체를 수득하는 공정이다.
심근염을 일으킨 조직에서는, 심근 세포가 괴사하고, 괴사한 심근 세포로 치환되어 선유아세포가 과증식하고 있는 것 외에 염증성의 면역 세포도 많이 침윤하고 있는 것이 알려져 있다. 면역계 세포가 침윤한 심근염 조직을 시험관 내에서 재현하려면, 심근 세포, 선유아세포 외에 부유 세포인 면역계 세포를 침윤시킨 세포구조체를 제작하는 것이 바람직하다. 그러나, 세포구조체의 제작에 1 ~ 2주간을 필요로 하는 종래의 행잉드롭법이나 저접착성 배양접시에서는, 이것은 곤란했다.
본 실시 형태(VI)의 제조 방법에서는, 상기 배양 공정에서, 면역계 세포를 피복 세포배양기에 더 첨가해도 좋다. 면역계 세포를 첨가하는 타이밍으로서는, 상기 파종 공정 이후(세포의 파종과 동시 이후)이고 세포구조체가 수득되기 전인 것이 바람직하고, 파종한 세포가 피복배양면에 부착해 시트상의 세포구조체를 형성(도 40의 (iii) 참조) 한 이후, 시트상의 세포구조체가 피복배양면 중앙부를 향해 응집하기 시작하고, 단부가 피복배양면으로부터 떨어져 휘기 시작해, 단부가 휘어진 세포구조체를 형성하기 전까지가 보다 바람직하다. 즉, 면역계 세포의 첨가는, 파종 공정시에 파종해도 좋고, 파종 공정 후에 첨가해도 좋다.
구체적으로는, 세포의 파종과 동시 이후, 세포(예를 들면, 마지막에 파종하는 세포)의 파종 후 48시간 이내에 면역계 세포를 첨가하는 것이 바람직하다.
면역계 세포를 상기의 타이밍에 첨가함으로써, 부유 세포인 면역계 세포가 중력의 작용으로 침강하고, 피복배양면에 접착한 세포가 주머니상으로 응집할 때에 면역계 세포가 내부에 받아들여지고, 이것에 의해서 내부에 면역계 세포를 포함하는 세포구조체를 형성할 수 있어 심근염, 심부전 등을 일으킨 심 질환 모델의 조직에 한층 가까운 세포구조체를 수득할 수 있다(도 40 참조).
파종한 세포를 배양하는 조건으로서는, 예를 들면, 일반적인 37℃의 세포 인큐베이터를 이용해 실시할 수 있다. 세포의 배양은, 괴상 세포구조체가 형성될 때까지 계속하는 것이 바람직하고, 구체적으로는, 10 ~ 96시간 배양하는 것이 바람직하고, 15 ~ 50시간 배양하는 것이 보다 바람직하다.
또한 본 실시 형태(VI)의 세포구조체의 제조 방법에서는, 놀랄 만한 것으로, 접착 세포(예를 들면, 심근 세포 등)와 부유 세포(예를 들면, 면역계 세포 등)를 혼합하고, 파종, 배양하는 경우에도, 특수한 배지를 준비하는 일 없이, 사용하는 접착 세포에 적절한 배지 또는 사용하는 부유 세포에 적절한 배지(바람직하게는 접착 세포에 적절한 배지)를 이용하여, 접착 세포와 부유 세포를 동시에, 파종, 배양하면, 세포구조체를 수득할 수 있다.
상기 피복배양면에 접착, 배양한, 상기 심근 세포 및 상기 선유아세포를 포함하는 혼합 세포는, 자기 응집을 하여, 괴상의 세포구조체를 형성한다. 수득된 세포구조체는, 그 괴상의 구조체 내에 생존하고 있는 세포를 가진다.
상기 세포구조체의 크기는, 내부에 살아있는 심근 세포를 포함하고, 박동한 세포구조체가 수득되는 관점에서, 예를 들면, 외경이 30 ~ 200μm인 것이 바람직하고, 40 ~ 150μm인 것이 보다 바람직하고, 50 ~ 100μm인 것이 더 바람직하다.
본 실시 형태(VI)의 세포구조체의 제조 방법에 의해 수득하는 세포구조체는, 심부전 등의 심 질환을 일으킨 조직을 재현한 심 질환 모델이고, 예를 들면, 심근경색, 심부전, 심근염 등의 심 질환의 연구, 심 질환의 약제 개발, 심 질환의 치료법 개발의 용도에 이용할 수 있다.
이하에, 본 실시 형태(VI)의 세포구조체의 제조 방법의 일례에 대해서, 도 39, 40을 이용해 설명한다.
도 39는, 심근 세포와 선유아세포를 포함하는 세포구조체의 제조 방법의 일례이다.
세포배양기의 배양면에, 온도 응답성 폴리머를 도포하여 피복하고, 피복배양면을 가지는 피복 세포배양기를 준비한다 (도 39(i)(ii) 참조). 그 후, 피복배양면에, 배지로 희석한, 심근 세포와 선유아세포의 혼합 세포를 가하고, 혼합 세포를 파종한다 (도 39(ii) 참조). 파종한 혼합 세포는, 피복배양면 전면에 접착한다 (도 39(iii) 참조). 또한 이 예에서는, 혼합 세포의 밀도는, 100% 컨플루언트이다(도 39(iii) 참조). 그 후, 피복배양면에 접착한 혼합 세포는, 피복배양면 중앙부를 향해 응집하기 시작하고, 단부가 피복배양면으로부터 떨어져 휘기 시작해, 단부가 휘어진 세포구조체가 된다 (도 39(iｖ) 참조). 그 후, 응집을 더 계속해 괴상의 세포구조체가 되어, 피복배양면으로부터 부유한다 (도 39(ｖ) 참조).
도 40은, 심근 세포, 선유아세포, 마크로파지 등의 면역계 세포(부유 세포)를 포함하는 세포구조체의 제조 방법의 일례이다.
세포배양기의 배양면에, 온도 응답성 폴리머를 도포하여 피복하고, 피복배양면을 가지는 피복 세포배양기를 준비한다 (도 40(i)(ii) 참조). 그 후, 피복배양면에, 배지로 희석한, 심근 세포와 선유아세포의 혼합 세포를 가하고, 혼합 세포를 파종한다 (도 40(ii) 참조). 파종한 혼합 세포는, 피복배양면 전면에 접착해, 시트상의 세포구조체(단층)를 형성한다 (도 40(iii) 참조). 또한 이 예에서는, 혼합 세포의 밀도는, 100% 컨플루언트이다(도 40(iii) 참조).
심근 세포와 선유아세포가 시트상의 세포구조체를 형성한 후에, 마크로파지 등의 면역계 세포를 첨가한다(도 40(iｖ)). 그 후, 피복배양면에 접착한 혼합 세포는, 피복배양면 중앙부를 향해 응집하기 시작하고, 단부가 피복배양면으로부터 떨어져 휘기 시작해, 단부가 휘어진 세포구조체가 된다 (도 40(ｖ) 참조). 그 때, 시트상의 세포구조체에 부착하거나 배양면 중에 부유하거나 하고 있는 면역계 세포를 감싼다. 그 후, 응집을 더 계속해 심근 세포, 선유아세포 및 면역계 세포를 포함하는 괴상의 세포구조체가 되어, 피복배양면으로부터 부유한다 (도 40(ｖi) 참조).
[[발명(VII)]]
[세포구조체의 제조 방법]
본 발명(VII)의 세포구조체의 제조 방법은, 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물을 조제하는 조제 공정과, 상기 온도 응답성 폴리머 또는 상기 온도 응답성 폴리머 조성물로 세포배양기의 배양면을 피복하여 피복 세포배양기를 준비하는 배양기 준비 공정과, 간세포와 상기 간세포 100개에 대해서 10 ~ 50개의 비율의 선유아세포를 상기 피복 세포배양기에 파종하는 파종 공정과, 파종한 세포를 배양하여 괴상의 세포구조체를 수득하는 배양 공정을, 이 순서로 포함한다.
또한 본 명세서에서, 세포배양기의 배양면에서의, 상기 온도 응답성 폴리머 또는 상기 온도 응답성 폴리머 조성물로 피복된 부분을 「피복배양면」이라고 칭하는 경우가 있다. 또한, 피복 세포배양기란, 피복배양면을 가지는 세포배양기이다. 피복 세포배양기는, 배양면 전면이 피복배양면이어도 좋고, 배양면의 일부가 피복배양면이어도 좋다. 또한, 배양면에 1개의 피복배양면을 가지고 있어도 좋고, 복수의 피복배양면을 가지고 있어도 좋다.
간세포와 선유아세포를 포함하는 세포구조체는, 공지의 U자 바닥 접착성 배양접시나 행잉드롭법으로 1 ~ 2주간의 긴 시간에 걸쳐 스페로드를 형성시키는 것도 가능하지만, 제작에 시간이 걸리기 때문에, 증식속도, 배양면에의 접착성, 적합 배양 조건이 다른 세포끼리의 공배양이 곤란하는 문제 등이 있었다.
본 발명자들은, 놀랄 만한 것으로, 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물로 세포배양기의 배양면을 피복한 피복 세포배양기에, 간세포와 선유아세포를 파종함으로써, 간부전을 일으킨 조직을 모방한 세포구조체를 용이하게 형성할 수 있는 것을 찾아냈다.
본 실시 형태(VII)의 세포구조체의 제조 방법에 의하면, 간세포와 선유아세포가 균질 분산한 상태를 유지해 응집시키는 것이 가능하고, 간세포와 선유아세포를 포함하는, 생체 내에 존재하는 상태에 가까운, 간부전을 일으킨 조직을 재현할 수 있다.
간세포와 선유아세포는, 증식속도, 배양면에의 접착성, 및 배양 조건이 다르기 때문에, 종래의 장시간 배양을 해서 세포구조체를 형성하는 방법에서는, 간세포와 선유아세포를 포함하는 세포구조체를 형성하는 것이 매우 곤란했다. 본 실시 형태(VII)의 세포구조체의 제조 방법에 의하면, 피복배양면과 세포의 접착력이 적절히 한 범위에 있는 피복 세포배양기를 이용하고 있기 때문에, 세포의 증식을 필요로 하지 않고, 예를 들면, 파종 후 24시간 이내 등의 단시간에, 간세포와 선유아세포가 응집해서 둥글게 되기 때문에, 간세포와 선유아세포를 포함하는 괴상의 세포구조체를 용이하게 형성할 수 있다.
(조제 공정)
실시 형태(VII)의 세포배양기에 이용되는 온도 응답성 폴리머 및 온도 응답성 폴리머 조성물을 조제하는 조제 공정으로서는, 상기 발명(I)에서의 조제 공정과 마찬가지의 공정을 들 수 있고, 호적예로서도 마찬가지의 것을 들 수 있다.
또한 본 실시 형태(VII)에서, 제조 방법에 이용되는 온도 응답성 폴리머 및 온도 응답성 폴리머 조성물로서는, 간세포와 선유아세포를 포함하는, 괴상의 세포구조체가 한층 수득되기 쉽다고 하는 관점에서, (A)가 바람직하다.
또한, 본 실시 형태(VII)에서, 2-N, N-디메틸아미노에틸 메타크릴레이트(DMAEMA)를 포함하는 혼합물을 조제하는 조제 공정을, 혼합물 조제 공정으로 칭하는 경우가 있다.
(배양기 준비 공정)
본 발명(VII)의 실시 형태의 제조 방법에서, 상기 배양기 준비 공정은, 상기 온도 응답성 폴리머 또는 상기 온도 응답성 폴리머 조성물로 세포배양기의 배양면을 피복하여 피복 세포배양기를 준비하는 공정이다.
상기 배양기 준비 공정은, 예를 들면, 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물을, 용매에 용해하여, 온도 응답성 폴리머 용액으로 한 후, 세포배양기의 배양면 상에 도포하고, 건조시켜 피복 세포배양기를 준비하는 공정(배양기 준비 공정 I)으로 해도 좋고, 또한, 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물을 포함하는 수용액(온도 응답성 폴리머 수용액)을 온도 응답성 폴리머의 담점 이하로 냉각하고, 냉각한 온도 응답성 폴리머 수용액을 세포배양기의 배양면 상에 유연시켜, 담점 초과의 온도까지 가열하여 피복 세포배양기를 준비하는 공정(배양기 준비 공정 II)으로 해도 좋다.
상기 배양기 준비 공정 I에서의 온도 응답성 폴리머 용액에서의 용매로서는, 예를 들면, 물； 생리식염수； 완충액； 메탄올, 에탄올, n-프로필알코올, 이소프로필 알코올, 1-부탄올, 이소부틸 알코올, 2-부탄올, t-부틸알코올, 1-펜탄올, 2-펜탄올, 3-펜탄올, 2-메틸-1-부탄올, 3-메틸-1-부탄올, 2-메틸-2-부탄올, 3-메틸-2-부탄올, 2, 2-디메틸-1-프로판올, 1-펜탄올, 2-펜탄올, 3-펜탄올, 2-메틸-1-부탄올, 3-메틸-1-부탄올, 2-메틸-2-부탄올, 3-메틸-2-부탄올, 2, 2-디메틸-1-프로판올, 1-헥산올, 2-메틸-2-펜탄올, 알릴알코올, 벤질알코올, 살리실알코올 등의 알코올； 아세톤, 에틸메틸케톤, 디에틸케톤, 메틸프로필케톤, 메틸이소부틸케톤, 메틸비닐케톤, 시클로헥사논, 2-메틸시클로펜타논, 아세토페논, 벤조페논, 이소포론 등의 케톤； 아세트산 메틸, 아세트산 에틸, 아세트산 프로필, 아세트산 이소프로필, 아세트산 n-부틸, 아세트산 이소부틸, 아세트산 sec-부틸, 아세트산 tert-부틸, 아세트산 비닐, 포름산 메틸, 포름산 에틸, 포름산 프로필, 상기 알코올과 인산의 에스테르, 상기 알코올과 탄산의 에스테르 등의 에스테르； 클로로포름； 벤젠； 톨루엔； 디에틸에테르； 디클로로메탄； 등을 들 수 있다.
그 중에서도, 배양면에 균일하게 피복하기 쉽고, 또한, 온도 응답성 폴리머의 용해성이 우수하다고 하는 관점에서, 물, 메탄올, 에탄올, n-프로필알코올, 이소프로필 알코올, 2-부탄올, t-부틸알코올, 알릴알코올 등의 알코올； 아세톤, 에틸메틸케톤, 디에틸케톤, 메틸비닐케톤 등의 케톤； 아세트산 메틸, 아세트산 에틸, 아세트산 이소프로필, 아세트산 tert-부틸, 아세트산 비닐 등의 에스테르； 클로로포름； 벤젠； 톨루엔； 디에틸에테르； 디클로로메탄이 바람직하다. 또한, 단시간에 건조시킬 수 있어 배양면에 한층 균일하게 도포하기 쉽다고 하는 관점에서, 비점이 낮은 유기 용매(예를 들면, 탄소수 1 ~ 4의 저급알코올, 탄소수 3 ~ 5의 저급 케톤, 및 탄소수 1 ~ 4의 알킬기를 가지는 아세트산 알킬에스테르로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종, 특히, 물보다 비점이 낮은, 탄소수 1 ~ 4의 저급알코올, 탄소수 3 ~ 5의 저급 케톤, 및 탄소수 1 ~ 4의 알킬기를 가지는 아세트산 알킬에스테르로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 1종)가 더 바람직하고, 코스트, 조작성도 우수한 관점에서, 메탄올, 에탄올이 특히 바람직하다.
상기 용매는, 1종 단독으로 사용해도 좋고, 2종 이상을 병용해도 좋다.
용매는, 온도 응답성 폴리머의 용해성이 우수하기 때문에, 담점 이상의 온도(예를 들면, 실온이나 37℃ 등)로 해도, 온도 응답성 폴리머가 부용화해서 침전하기 어렵다. 그 때문에, 온도 응답성 폴리머를 도포할 때에, 온도 응답성 폴리머 용액의 온도 관리를 하는 수고를 줄일 수 있고, 간이하게 피복 세포배양기를 준비할 수 있다.
상기 배양기 준비 공정 I에서, 온도 응답성 폴리머 용액에는, 세포가 자기 응집하기 쉬워진다고 하는 관점에서, 친수성 분자가 포함되는 것이 바람직하다. 친수성 분자로서는, 온도 응답성 폴리머의 C/A비에 영향을 주지 않는 비이온성이고 친수성인 것, 예를 들면, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 디메틸아크릴아미드(DMAA), 글리세린, TritonX, 폴리프로필렌글리콜 등을 들 수 있다.
상기 배양기 준비 공정 I에서, 온도 응답성 폴리머 용액 중의 온도 응답성 폴리머의 함유량은, 온도 응답성 폴리머가 배양면에 균일하게 피복되기 쉬워진다고 하는 관점에서, 온도 응답성 폴리머 용액(100질량%)에 대해서, 0.01 ~ 3.0질량%인 것이 바람직하고, 0.25 ~ 2.5질량%인 것이 보다 바람직하다.
상기 배양기 준비 공정 I에서, 온도 응답성 폴리머 용액 중의 친수성 분자의 함유량은, 세포가 자기 응집하기 쉬워진다고 하는 관점에서, 온도 응답성 폴리머(100질량%)에 대해서, 0.00001 ~ 0.00015질량%인 것이 바람직하고, 0.00003 ~ 0.0001질량%인 것이 보다 바람직하다.
상기 배양기 준비 공정 I에서, 온도 응답성 폴리머 용액은, 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물이 배양면에 균일하게 피복되기 쉬워진다고 하는 관점에서, 물이 포함되지 않는 것이 바람직하고, 온도 응답성 폴리머 용액(100질량%) 중의 물의 질량 비율이 0.5질량% 이하인 것이 보다 바람직하고, 0.1질량% 이하인 것이 더 바람직하다.
또한 물의 질량 비율은, 가스크로마토그래피, 컬피셔법 등 당업자에게 주지의 방법에 의해 측정 가능하다.
상기 배양기 준비 공정 I에서, 온도 응답성 폴리머 용액은, 배양면의 전면에 도포해도 좋고, 배양면의 일부에 도포해도 좋다. 배양면의 일부에 온도 응답성 폴리머 용액을 도포하는 경우는, 배양면 상에, 피복배양면을 1개 설치해도 좋고, 복수의 피복배양면을 설치해도 좋다. 또한 배양면의 일부에 온도 응답성 폴리머 용액을 도포하는 경우는, 배양면이 세포 비접착성인 세포배양기를 이용하는 것이 바람직하다.
또한 「세포 비접착성」이란, 부착세포(예를 들면, 선유아세포, 간세포, 혈관 내피세포 등)가, 통상의 배양 조건하에서, 접착하지 않는 또는 접착하기 어려운 성질을 말한다.
상기 배양기 준비 공정 I에서, 도포한 온도 응답성 폴리머 용액을 건조시키는 조건으로서는, 배양면에 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물을 균일하게 피복하는 관점에서, 대기압 하에서, 온도 10 ~ 70℃, 시간 1 ~ 3,000분이 바람직하다. 도포한 온도 응답성 폴리머 용액을, 빠르게 건조시킴으로써, 배양면 상에 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물이 치우치는 일 없이, 균일하게 피복되기 쉬워진다.
도포한 온도 응답성 폴리머 용액은, 예를 들면, 세포배양기를 37℃의 인큐베이터 중에서 정치함으로써 건조시켜도 좋다.
상기 배양기 준비 공정 II에서, 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물을 용해하는 용매로서는, 예를 들면, 물； 생리식염수； 인산완충액, 인산완충 생리식염수(PBS), 트리스완충액 등의 완충액； 등을 들 수 있다.
상기 배양기 준비 공정 II에서, 온도 응답성 폴리머 수용액을 냉각하는 방법으로서는, 예를 들면, 온도 응답성 폴리머 수용액을 약 4℃의 냉장고에 넣어 담점 이하의 온도까지 냉각하는 방법 등을 들 수 있다.
상기 배양기 준비 공정 II에서, 온도 응답성 폴리머 수용액을 배양면 상에 유연시키는 방법으로서는, 예를 들면, 담점 이하의 온도를 가지는 온도 응답성 폴리머 수용액을, 세포배양기의 배양면을 기울임으로써 펼치는 방법, 스패츌러를 이용하여 온도 응답성 폴리머 수용액을 펼치는 방법 등을 들 수 있다.
상기 배양기 준비 공정 II에서, 유연한 온도 응답성 폴리머 수용액을 담점 초과까지 가열하는 방법으로서는, 예를 들면, 유연공정 후의 세포배양기를 37℃의 인큐베이터 중에서 정치하는 방법 등을 들 수 있다.
상기 세포배양기로서는, 시판의 멀티 웰 플레이트, 디쉬, 플라스크 등을 들 수 있다. 상기 세포배양기의 재질로서는, 폴리스티렌, 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET), 폴리프로필렌, 폴리부텐, 폴리에틸렌, 폴리카보네이트, 유리 등을 들 수 있다. 그 중에서도, 정밀한 성형 가공이 용이하고, 다양한 멸균법을 적용하는 것이 가능하고, 투명성이 있기 때문에 현미경 관찰에 적합한 관점에서, 폴리스티렌, 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET)가 바람직하다.
상기 세포배양기는, 배양면 표면에 세포접착 처리 등의 처리가 실시된 것이어도 좋고, 표면이 무처리이어도 좋다. 상기 배양면 표면은, 세포의 접착성을 조정하기 위해서, 코팅 처리, 가공 처리 등이 되어 있어도 좋다.
상기 배양면의 평면시 형상은, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 대략 사각형 등의 대략 다각형, 대략 원형 등의 형상을 들 수 있다. 그 중에서도, 보다 균질한 세포구조체가 수득되기 쉽다고 하는 관점에서, 대략 원형이 바람직하다.
상기 배양면의 바닥 형상(바닥면의 단면 형상)은, 특별히 한정되지 않지만, 평평한 바닥, 둥근 바닥, 요철상 바닥 등을 들 수 있다. 그 중에서도, 보다 균질하고 구상의 세포구조체가 수득되기 쉽다고 하는 관점에서, 평평한 바닥 또는 약간의 R가 붙은 요면 바닥이 바람직하다.
상기 세포배양기의 배양면의 면적은, 괴상의 세포구조체를 한층 용이하게 제조할 수 있다고 하는 관점에서, 32 ㎟ 이하인 것이 바람직하고, 10 ㎟ 이하인 것이 보다 바람직하고, 8 ㎟ 이하인 것이 더 바람직하다. 또한 상기 세포배양기의 배양면의 면적의 하한치는, 시판 사이즈의 것이면 사용 가능하고, 특별히 한정되지 않는다.
상기 피복배양면의 각 면적(온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물로 피복된 부분의 각 면적)은, 괴상의 세포구조체를 한층 용이하게 제조할 수 있다고 하는 관점에서, 32 ㎟ 이하인 것이 바람직하고, 10 ㎟ 이하인 것이 보다 바람직하고, 8 ㎟ 이하인 것이 더 바람직하다.
상기 피복 세포배양기는, 피복배양면이 단위면적당 가지는 온도 응답성 폴리머의 양이, 0.15 ~ 15.0ng/㎟인 것이 바람직하고, 1.0 ~ 5.0ng/㎟인 것이 더욱 바람직하다. 상기 범위로 하면, 괴상의 세포구조체를 형성시키기 쉽게 한다고 하는 효과가 수득되기 쉽다.
상기 피복 세포배양기에서의, 피복배양면의 제타 전위로서는, 0 ~ 50 mV가 바람직하고, 보다 바람직하게는 0 ~ 35 mV, 더욱 바람직하게는 10 ~ 25 mV이다. 제타 전위가 0 mV 이상인 것에 의해, 음으로 대전되는 세포가 접착하기 쉬워진다. 또한, 제타 전위가 50 mV 이하인 것에 의해, 세포 독성을 경감할 수 있다.
또한, 제타 전위를 상기 범위로 함으로써, 세포를 적절한 배양 조건에서 배양하는 것만으로, 괴상(펠릿상)의 세포구조체를 한층 제작하기 쉬워진다. 이것은, 표면 제타 전위를 상기 범위로 함으로써, 피복배양면에 세포 독성을 야기하지 않는 미약한 양전하를 제공할 수 있고, 또한, 파종한 세포의 빠른 접착을 확보하여 세포의 활성의 향상 및 세포외 매트릭스의 분비를 촉진하고, 또한, 세포 유주를 적절히 히 억제하여 세포간의 결합을 강하게 할 수 있는 것에 의한 것으로 추측된다.
또한 제타 전위란, 폴리스티렌 라텍스를 히드록시프로필셀룰로오스로 피복한 입자(제타 전위： -5 mV ~ ＋5 mV)를 표준의 모니터 입자로 해서 제타 전위계(예를 들면, 형번 「ELSZ」, Otsuka Electronics Co., Ltd. 제 등)로 측정한, Smoluchowski식에 의해 산출되는 값을 말한다.
상기 피복배양면에 대한 물의 접촉각으로서는, 본 발명(VII)의 효과를 높이는 관점에서, 50 ~ 90°이 바람직하고, 보다 바람직하게는 60 ~ 80°, 더욱 바람직하게는 62 ~ 78°이다. 또한 피복배양면에 대한 물의 접촉각이란, 피복배양면 내의 임의의 수개의 점에서, JIS　R3257에 준거해 측정되는 접촉각의 평균치를 말한다.
(파종 공정)
상기 파종 공정은, 간세포와 상기 간세포 100개에 대해서 10 ~ 50개의 비율의 선유아세포를 상기 피복 세포배양기에 파종하는 공정이다. 세포의 파종은, 전세포를 혼합해 한 번에 파종해도 좋고, 복수회로 나누어 파종해도 좋다. 또한, 각 세포는, 한 번에 파종해도 좋고, 복수회로 나누어 파종해도 좋다.
상기 피복 세포배양기의 상기 피복배양면에 파종하는 세포는, 적어도 간세포, 선유아세포를 포함한다.
상기 간세포로서는, 예를 들면, 생체로부터 채취한 초대 세포, iPS 세포나 ES 세포로부터 유도한 간세포, HepG2 세포, HepRA 세포 등의 간암 세포 등이 사용 가능하지만, 그 중에서도, 트랜스포터, 대사 활성, 알부민생산 등의 간세포기능이 평균적이고, 선유아세포와 균질 분산한 세포구조체가 수득되기 쉽다고 하는 관점에서, HepG2 세포, HepRA 세포가 바람직하다.
상기 간세포는, 1종 단독으로 사용해도 좋고, 2종 이상을 병용해도 좋다.
상기 선유아세포로서는, 피하 조직 유래 선유아세포, 활막, 치수, 골수, 피하지방 유래의 간엽계 줄기세포 등을 들 수 있다. 그 중에서도, 면역관용으로 공배양하는 세포에의 영향이 적고, 접착성이 강하고, 간세포와 선유아세포가 한층 균질하게 분산한 세포구조체가 수득되기 쉽다고 하는 관점에서, 피하지방 유래 간엽계 줄기세포가 바람직하다.
상기 선유아세포는, 1종 단독으로 사용해도 좋고, 2종 이상을 병용해도 좋다.
상기 파종 공정에서, 혈관 내피세포를 더 파종해도 좋다.
상기 혈관 내피세포는, 1종 단독으로 사용해도 좋고, 2종 이상을 병용해도 좋다.
상기 파종 공정에서, 지방세포를 더 파종해도 좋다. 상기 지방세포로서는, 예를 들면, 지방조직 유래의 접착성 지방세포 등을 들 수 있다.
상기 지방세포는, 1종 단독으로 사용해도 좋고, 2종 이상을 병용해도 좋다.
상기 파종 공정에서, 면역계 세포를 더 파종해도 좋다. 상기 면역계 세포로서는, 간부전을 일으킨 조직에 한층 가까운 세포구조체가 수득되는 관점에서, 단구, 과립구, 림프구, 및 마크로파지로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종을 포함하는 것이 바람직하다.
상기 면역계 세포는, 1종 단독으로 사용해도 좋고, 2종 이상을 병용해도 좋다.
상기 파종 공정에서, 간세포 100개에 대한 선유아세포의 비율은, 10 ~ 50개이고, 10 ~ 45개인 것이 바람직하다. 선유아세포의 비율을, 간세포 100개에 대해서 10개 이상으로 함으로써, 혼합 세포가 둥글게 되어 괴상의 세포구조체를 형성하기 쉬워진다. 또한, 50개 이하로 함으로써, 간부전을 일으킨 조직에 더 가까운 세포구조체를 수득할 수 있다.
상기 파종 공정에서, 파종하는 전세포 중의 간세포의 비율은, 간부전을 일으킨 조직에 더 가까운 세포구조체가 수득되는 관점에서, 전세포수(100%)에 대해서, 50 ~ 95%인 것이 바람직하다.
상기 파종 공정에서, 간세포 100개에 대한 혈관 내피세포의 비율은, 간부전을 일으킨 조직에 더 가까운 세포구조체가 수득되는 관점에서, 10 ~ 100개인 것이 바람직하다.
상기 파종 공정에서, 간세포 100개에 대한 지방세포의 비율은, 간부전을 일으킨 조직에 더 가까운 세포구조체가 수득되는 관점에서, 10 ~ 100개인 것이 바람직하고, 50개인 것이 보다 바람직하다.
또한, 선유아세포 100개에 대한 지방세포의 비율은, 간부전을 일으킨 조직에 더 가까운 세포구조체가 수득되는 관점에서, 100 ~ 500개인 것이 바람직하다.
그 중에서도, 간세포 100개에 대해서 지방세포를 50개의 비율로 포함하고, 선유아세포 100개에 대해서 지방세포를 100 ~ 500개의 비율로 포함하는 것이 바람직하다.
상기 파종 공정에서, 간세포 100개에 대한 면역계 세포의 비율은, 간부전을 일으킨 조직에 더 가까운 세포구조체가 수득되는 관점에서, 10 ~ 100개인 것이 바람직하다.
상기 파종 공정에서, 파종 후의 세포의 피복배양면 상의 밀도는, 상기 피복배양면의 표면적에 대해서, 90 ~ 100% 컨플루언트가 바람직하고, 보다 바람직하게는 95 ~ 100% 컨플루언트, 더 바람직하게는 99 ~ 100% 컨플루언트이다. 파종하는 세포 밀도가 상기 범위이면, 각 세포가 각각 콜로니를 형성하지 않고, 균질 분산한 상태를 유지해 응집하여 세포구조체를 형성할 수 있다. 또한, 세포의 밀도가 높으면 파종한 혼합 세포가 증식하기 어려워져, 세포가 증식하기 전에 괴상의 세포구조체를 형성할 수 있기 때문에, 파종한 혼합 세포와 세포수의 비율이 같은 세포구조체를 형성할 수 있다. 또한, 세포의 증식속도의 차이에 의한 영향을 받기 어렵다. 또한, 파종한 세포는, 증식할 때의 성질이 변화하는 경우가 있지만, 세포가 증식하기 어려우면 파종시와 같은 성질의 세포를 포함하는 세포구조체를 형성할 수 있다.
세포의 종류에도 의존하지만, 파종 후의 세포의 피복배양면 상의 밀도로서는, 20 ~ 15,000개/㎟가 바람직하다. 예를 들면, 피복배양면의 면적이 200 ㎟인 24 웰 세포 배양 플레이트에, 1.0 mL의 세포액을 가해 파종하는 경우, 4×104 ~ 30×104개/mL가 바람직하다. 또한 파종되는 세포는, 살아있는 세포로 한다.
세포의 파종은, 예를 들면, 37℃의 인큐베이터 중에 정치해 둔 피복 세포배양기를, 실온의 클린벤치에 꺼내 행할 수 있다.
또한 세포는 배지에 희석해 파종하는 것이 바람직하다. 희석하는 배지로서는, 세포의 배양이 가능한 배지이면, 특별히 한정되지 않는다.
(배양 공정)
상기 배양 공정은, 파종한 세포를 배양하여 괴상의 세포구조체를 수득하는 공정이다.
간부전을 일으킨 조직에서는, 선유아세포가 과증식하고 있는 것 외에 염증성의 면역 세포도 많이 존재하고 있는 경우가 있는 것이 알려져 있다. 면역계 세포를 포함하는 간부전 조직을 시험관 내에서 재현하려면, 간세포, 선유아세포 외에 부유 세포인 면역계 세포를 가한 세포구조체를 제작하는 것이 바람직하다. 그러나, 세포구조체의 제작에 1 ~ 2주간을 필요로 하는 종래의 행잉드롭법이나 저접착성 배양접시에서는, 이것은 곤란했다. 그 이유는, 예를 들면, 증식속도가 다른 것이나, 최적배지의 조성이 다른 것 이외에, 혼합한 마크로파지가 긴 배양 기간중에 선유아세포로 분화해 버릴 가능성이 높은 것을 들 수 있다.
본 실시 형태(VII)의 제조 방법에서는, 상기 배양 공정에서, 한층 더 면역계 세포를 피복 세포배양기에 첨가해도 좋다. 면역계 세포를 첨가하는 타이밍으로서는, 상기 파종 공정 이후(세포의 파종과 동시 이후)이고 세포구조체가 수득되기 전인 것이 바람직하고, 파종한 세포가 피복배양면에 부착해 시트상의 세포구조체를 형성(도 42의 (iii) 참조) 한 이후, 시트상의 세포구조체가 피복배양면 중앙부를 향해 응집하기 시작하고, 단부가 피복배양면으로부터 떨어져 휘기 시작해, 단부가 휘어진 세포구조체를 형성하기 전까지가 보다 바람직하다. 즉, 면역계 세포는, 파종 공정시에 파종해도 좋고, 파종 공정 후에 첨가해도 좋다.
구체적으로는, 세포의 파종과 동시 이후, 세포(예를 들면, 마지막에 파종하는 세포)의 파종 후 48시간 이내에 면역계 세포를 첨가하는 것이 바람직하다.
면역계 세포를 상기의 타이밍에 첨가함으로써, 부유 세포인 면역계 세포가 중력의 작용으로 침강하고, 피복배양면에 접착한 세포가 주머니상으로 응집할 때에 면역계 세포가 내부에 받아들여지고, 이것에 의해서 내부에 면역계 세포를 포함하는 세포구조체를 형성할 수 있고, 간부전 모델의 조직에 한층 가까운 세포구조체를 수득할 수 있다(도 42 참조).
파종한 혼합 세포를 배양하는 조건으로서는, 예를 들면, 일반적인 37℃의 세포 인큐베이터를 이용해 행할 수 있다. 세포의 배양은, 괴상 세포구조체가 형성될 때까지 계속하는 것이 바람직하고, 구체적으로는, 5 ~ 96시간 배양하는 것이 바람직하고, 9 ~ 50시간 배양하는 것이 보다 바람직하다.
또한 본 실시 형태(VII)의 세포구조체의 제조 방법에서는, 놀랄 만한 것으로, 접착 세포(예를 들면, 간세포 등)와 부유 세포(예를 들면, 면역계 세포 등)를 혼합하여, 파종, 배양하는 경우에도, 특수한 배지를 준비하는 일 없이, 사용하는 접착 세포에 적절한 배지 또는 사용하는 부유 세포에 적절한 배지(바람직하게는 접착 세포에 적절한 배지)를 이용하여, 접착 세포와 부유 세포를 동시에, 파종, 배양하면, 세포구조체를 수득할 수 있다.
상기 피복배양면에 접착, 배양한, 상기 간세포 및 상기 선유아세포를 포함하는 혼합 세포는, 자기 응집을 하여, 괴상의 세포구조체를 형성한다. 수득된 세포구조체는, 그 괴상의 구조체 내에 생존하고 있는 세포를 가진다.
상기 세포구조체의 크기는, 간세포와 선유아세포가 균질하게 분포하는 세포구조체가 수득되는 관점에서, 예를 들면, 외경이 50 ~ 2,500μm인 것이 바람직하고, 50 ~ 500μm인 것이 보다 바람직하고, 50 ~ 150μm인 것이 더 바람직하다.
본 실시 형태(VII)의 세포구조체의 제조 방법에 의해 수득되는 세포구조체는, 간부전을 일으킨 조직을 재현한 간부전 모델이고, 예를 들면, 간부전이나 간장 재생의 연구, 간부전의 약제 개발, 간부전의 치료법 개발의 용도에 이용할 수 있다.
이하에, 본 실시 형태(VII)의 세포구조체의 제조 방법의 일례에 대해서, 도 41, 42를 이용해 설명한다.
도 41은, 간세포와 선유아세포를 포함하는 세포구조체의 제조 방법의 일례이다.
세포배양기의 배양면에, 온도 응답성 폴리머를 도포하여 피복하고, 피복배양면을 가지는 피복 세포배양기를 준비한다 (도 41(i)(ii) 참조). 그 후, 피복배양면에, 배지로 희석한, 간세포와 선유아세포의 혼합 세포를 가하고, 혼합 세포를 파종한다 (도 41(ii) 참조). 파종한 혼합 세포는, 피복배양면 전면에 접착한다 (도 41(iii) 참조). 또한 이 예에서는, 혼합 세포의 밀도는, 100% 컨플루언트이다(도 41(iii) 참조). 그 후, 피복배양면에 접착한 혼합 세포는, 피복배양면 중앙부를 향해 응집하기 시작하고, 단부가 피복배양면으로부터 떨어져 휘기 시작해, 단부가 휘어진 세포구조체가 된다 (도 41(iｖ) 참조). 그 후, 응집을 더 계속해 괴상의 세포구조체가 되어, 피복배양면으로부터 부유한다 (도 41(ｖ) 참조).
도 42는, 간세포, 선유아세포, 마크로파지 등의 면역계 세포(부유 세포)를 포함하는 세포구조체의 제조 방법의 일례이다.
세포배양기의 배양면에, 온도 응답성 폴리머를 도포하여 피복하고, 피복배양면을 가지는 피복 세포배양기를 준비한다 (도 42(i)(ii) 참조). 그 후, 피복배양면에, 배지로 희석한, 간세포와 선유아세포의 혼합 세포를 가하고, 혼합 세포를 파종한다 (도 42(ii) 참조). 파종한 혼합 세포는, 피복배양면 전면에 접착해, 시트상의 세포구조체(단층)를 형성한다 (도 42(iii) 참조). 또한 이 예에서는, 혼합 세포의 밀도는, 100% 컨플루언트이다(도 42(iii) 참조).
간세포와 선유아세포가 시트상의 세포구조체를 형성한 후에, 마크로파지 등의 면역계 세포를 첨가한다(도 42(iｖ)). 그 후, 피복배양면에 접착한 혼합 세포는, 피복배양면 중앙부를 향해 응집하기 시작하고, 단부가 피복배양면으로부터 떨어져 휘기 시작해, 단부가 휘어진 세포구조체가 된다 (도 42(ｖ) 참조). 그 때, 시트상의 세포구조체에 부착하거나 배양면 중에 부유하거나 하고 있는 면역계 세포를 감싼다. 그 후, 응집을 더 계속해 간세포, 선유아세포 및 면역계 세포를 포함하는 괴상의 세포구조체가 되고, 피복배양면으로부터 부유한다 (도 42(ｖi) 참조).
실시예
이하, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 하기의 실시예로 아무런 한정되는 것은 아니다.
[[발명(I)의 실시예]
하기의 시험에서, 시판의 시약은, 특히 거절이 없는 한 더욱 정제하는 일 없이 이용했다.
(시험 I-A) 온도 응답성 폴리머의 조제
용량 50 mL의 연질유리제의 투명 바이알병에, 2-N, N-디메틸아미노에틸 메타크릴레이트(DMAEMA) 10.0 g, 및 물 5,000μL를 가하고, 자기교반기를 이용해 교반했다. 그리고, 이 혼합물(액체)에 대해서 G1 그레이드의 고순도(순도：99.99995%)의 질소가스를 10분간 퍼지(유속：2.0L/분) 함으로써, 이 혼합물을 탈산소했다. 또한 이용한 DMAEMA에는, 중합금지제인 메틸 히드로퀴논(MEHQ)이 0.5 중량% 포함되어 있었다.
그 후, 이 반응물에 대해서, 환형블랙 형광등(NEC 사 제, 형번：FCL20BL, 18 W)을 이용하여, 22시간 자외선 조사함으로써, 상기 반응물을 중합시켰다. 반응물은, 5시간 후에 점성을 띠고 15시간 후에 고화하여, 중합체가 반응 생성물로서 수득되었다. 이 반응 생성물을 2-프로판올에 용해시켜, 용액을 투석 튜브로 옮겼다. 그리고, 투석을 72시간 행해, 반응 생성물을 정제했다.
반응 생성물을 포함하는 용액을, 셀룰로오스 혼합에스테르제의 0.2μm 필터(Toyo Roshi Kaisha, Ltd. 제, 형번：25AS020)로 여과하고, 수득된 여액을 동결건조시킴으로써, 분자내 이온 복합체형의 온도 응답성 폴리머가 수득되었다(수량：6.8 g, 전화율：68%). 이 폴리머의 수평균분자량(Mn)을, GPC(Shimadzu Corporation 제, 형번：LC-10ｖp 시리즈)를 이용하여, 폴리에틸렌글리콜(Shodex 사 제, TSK 시리즈)을 표준 물질로서 측정해, Mn=100,000(Mw/Mn=10.0)로 결정했다.
(시험 I-B) 피복배양면의 준비
(시험 I-B-1) 마스킹 시트를 사용한 피복배양면의 준비
세포배양기로서 φ35 mm 플레이트(PrimeSurface(등록상표), SUMILON 사 제)(세포 저흡착성 플레이트)를 이용했다.
친수성 기로 수식한 실리콘제의 부재(TIGERS POLYMER CORPORATION 제, K 125)(두께 1.0 mm)를 준비하고, 이 시트의 중앙 부분에 평면시 도너츠형(외경(φo) 8 mm, 내경(φi) 4 mm, 폭 2 mm)의 속이 빈 것을 설치했다. 이 도너츠형의 구멍을 가지는 시트를 마스킹 시트로서 이용했다.
상기 플레이트의 배양면 상에 상기 마스킹 시트를 깔고, 여기에, 실온 조건하에서, 전술의 시험 I-A로 조제한 폴리머의 수용액(농도：3ng/μL) 22.5μL를 가하고 그 후, 상기 수용액을 45℃에서 3시간 건조시켰다. 건조 후, 상기 실리콘제의 시트를 벗겼다.
(시험 I-B-2) 세포 비접착성의 시트를 사용한 피복배양면의 준비
세포배양기로서 φ35 mm 플레이트(PrimeSurface(등록상표), SUMILON 사 제)(세포 저흡착성 플레이트)를 이용했다.
친수성 기로 수식한 실리콘제의 부재를 준비하고, 이 시트의 중앙 부분에 평면시 도너츠형(외경(φo) 8 mm, 내경(φi) 4 mm 또는 3 mm, 폭 2 mm 또는 2.5 mm)의 속이 빈 것을 설치했다. 이 도너츠형의 구멍을 가지는 시트를 깔개로서 이용했다.
상기 플레이트의 배양면 상에, 실온 조건하에서, 전술의 시험 I-A에서 조제한 폴리머의 수용액(농도：3ng/μL) 22.5μL를 가하고 그 후, 상기 수용액을 45℃에서 3시간 건조시켰다. 건조 후, 피복된 배양면 상에 상기 깔개를 깔았다.
피복배양면의 표면의 제타 전위를, 제타 전위계(Otsuka Electronics Co., Ltd. 제, 형번：ELSZ) 및 평판 시료용 셀 유닛을 이용해 측정했다. 측정에서는, 셀로서는, 석영 셀을 이용해 표준의 모니터 입자로서는, 폴리스티렌 라텍스(입자 경：약 500 nm)를 히드록시프로필셀룰로오스(Mw=30,000)로 피복한 입자(제타 전위： 5 mV ~ ＋5 mV)를 이용해 용매로서 10 mM의 염화나트륨 수용액을 pH=7, 37℃의 조건하에서 이용했다. 제타 전위는, Smoluchowski식에 의해 산출했다.
그 결과, 온도 응답성 폴리머에 의해 피복된 제1 피복 영역의 표면의 제타 전위는, ＋20 mV였다. 또한 당업자에게 주지한 바와 같이, 상기 제타 전위의 측정치는, ±10% 정도의 편차를 가지는 것이다.
세포 배양 플레이트의 제1 피복 영역에 대한 물의 접촉각을, JIS　R3257에 준거해, 접촉각계(상품명：DMs-400, Kyowa Interface Science Co., Ltd. 제)를 이용해 측정했는데, 70°±10°였다.
(시험 I-C) 세포의 파종·배양
(시험 I-C-1)(참고예 I)
상기 시험 I-B-1에서 준비한 세포배양기를 이용했다.
GFP 재조합 래트 연골 세포 A(Rat　Chondrocyte A(GFP))를, 증식용 배지(RPMI-1640＋10% 소 태아 혈청(FBS)＋10ng/μL　FGF 2； DMEM： Gibco 사 제； FBS：Biological　Industries Ltd.　 제, 로트번호 715929； FGF-2：PeproTech, Inc. 제, 카탈로그 번호 400-29) 중에 부유시키고, 세포 현탁액을 조제했다.
상기 플레이트에, 실온 조건하에서, 세포 밀도 1.0×105개/㎠ 이상이 되도록, 세포 현탁액을 가했다.
그리고, 이 세포를, 37℃, 5% CO2의 세포 인큐베이터 중에서 배양했다.
배양 개시부터 약 15시간 후, 연골 세포는 피복배양면으로부터 응집하기 시작하고, 배양 개시부터 24시간 후, 도너츠형(링형)의 세포구조체를 형성했다.
배양 개시부터 3시간 후에, 재분화용 배지(둘베코 개변 이글 배지(DMEM)＋10% 소 태아 혈청(FBS)＋10ng/μL　재조합 래트 TGF-β1(Rat　TGF-β1　recombinant)＋50μg/mL　아스코빈산 2 인산； DMEM： Gibco 사 제, 형번 11965； FBS：Biological Industries Ltd. 제, 로트번호 715929； 재조합 래트 TGF-β1：PeproTech, Inc. 제, 카탈로그 번호 100-21； 아스코빈산 2 인산(Wako Pure Chemical Corporation 제, 카탈로그 번호 196-01252))으로 배지 교환했다.
배지 교환 후, 세포의 배양을 더욱 21시간 계속했다.
상기와 같이, 시험 I-C-1(참고예 I)에서는, 세포괴의 비존재하에서, 파종 배양을 1회 행했다.
도 7에, 시험 I-C-1(참고예 I)에서의, 배양 개시부터 24시간 후(1일 후), 2일 후, 6일 후, 10일 후의 세포구조체의 상태를 형광현미경을 이용해 관찰했을 때의 사진을 나타낸다. 특히, 하측 도면은, 10일 후의 세포구조체의 사진의 일부를 확대해 나타낸 것이다.
도 7에 나타내는 사진으로부터, 수득된 세포구조체를 구성하는 세포가, 연골 유사 원형의 세포 형태를 나타내고 있는 것을 알 수 있었다.
도 8에, 시험 I-C-1(참고예 I)에서 수득된 세포구조체를 단축 방향 단면으로 절단했을 때의 사진을 나타낸다.
도 8에 나타내는 사진으로부터, 수득된 세포구조체를 구성하는 세포는, 환형이고 고치상의 방을 이루는 독특한 연골 소강구조를 가지고 있고, 주변의 핵이 없는 부분에는, 콘드로틴이나 콜라겐 등의 세포외 매트릭스가 존재하고 있는 것이 분명해져, 세포구조체는 연골 유사의 조직을 이루고 있는 것을 알 수 있었다.
(시험 I-C-2)
상기 시험 I-B-2에서 준비한 세포배양기를 이용했다.
GFP 재조합 래트 연골 세포 A(Rat　Chondrocyte-A(GFP))를, 증식용 배지(RPMI-1640＋10% 소 태아 혈청(FBS)＋10ng/μL　FGF-2； DMEM： Gibco 사 제； FBS：Biological Industries Ltd. 제, 로트번호 715929； FGF-2：PeproTech, Inc. 제, 카탈로그 번호 400-29) 중에 부유시키고, 세포 현탁액을 조제했다.
상기 플레이트에, 실온 조건하에서, 세포 밀도 1.0×105개/㎠ 이상이 되도록, 세포 현탁액을 가했다.
그리고, 이 세포를, 37℃, 5% CO2의 세포 배양 인큐베이터 중에서 배양했다.
배양 개시부터 15시간 후, 연골 세포는 피복배양면으로부터 응집하기 시작하고, 배양 개시부터 24시간 후, 도너츠형(링형)의 세포구조체를 형성했다. 세포구조체는, 깔개의 요부의 바닥면의 폭방향 중앙 부분에 침강하고 있었다.
배양 개시부터 3 ~ 5시간 후에 재분화용 배지(둘베코 개변 이글 배지(DMEM)＋10% 소 태아 혈청(FBS)＋10ng/μL　재조합 래트 TGF-β1(Rat　TGF-β1　recombinant)＋50μg/mL　아스코빈산 2 인산； DMEM： Gibco 사 제, 형번 11965； FBS：Biological Industries Ltd. 제, 로트번호 715929； 재조합 래트 TGF-β1：PeproTech, Inc. 제, 카탈로그 번호 100-21； 아스코빈산 2 인산(Wako Pure Chemical Corporation 제, 카탈로그 번호 196-01252))으로 배지 교환했다.
배지 교환 후, 세포의 배양을 더욱 24시간 계속했다.
배지를 다시 증식용 배지에 되돌린 다음, 세포구조체의 존재하에서, 실온 조건하에서, 세포 밀도 1.0×105개/㎠ 이상이 되도록, 세포 현탁액을 가했다.
그리고, 이 세포를, 37℃, 5% CO2의 세포 배양 인큐베이터 중에서 배양했다.
배양 개시부터 15시간 후, 파종한 연골 세포는 피복배양면으로부터 응집하기 시작하고, 도너츠형(링형)의 세포구조체를 감싸도록 응집하고, 한층 사이즈가 확대한 도너츠형(링형)의 세포구조체를 형성했다. 세포구조체는, 깔개의 요부의 바닥면의 폭방향 중앙 부분에 침강하고 있었다. 배양 개시부터 27시간 후의 세포구조체의 상태를 도 9에 나타낸다.
상기의 세포구조체의 존재하에서의 파종 배양을 3회 반복했다. 1 ~ 3회의 반복 후의 세포구조체의 상태를 도 9에 나타낸다.
도 9에, 시험 I-C-2에서의, 배양 개시부터 27시간 후, 44시간 후, 70시간 후, 122시간 후의 세포구조체의 상태를 형광현미경을 이용해 관찰했을 때의 사진을 나타낸다. 상측 도면에, 폭 2 mm의 도너츠형의 속이 빈 깔개를 이용했을 경우의 세포구조체의 상태를 나타내고, 하측 도면에, 폭 2.5 mm의 도너츠형의 속이 빈 깔개를 이용했을 경우의 세포구조체의 상태를 나타낸다.
도 9에 나타내는 사진으로부터, 새로운 세포의 파종 및 배양을 거쳐 도너츠형(링형)의 연골 세포괴의 사이즈가 확대한 것을 알 수 있었다.
(시험 I-C-3)
상기 시험 I-B-2에서 준비한 세포배양기를 이용했다.
GFP 재조합 루이스 래트의 지방조직 유래 간엽계 줄기세포(ADSC(Adipose-deriｖed　ｖascular　stromal　cell))를, 증식용 배지(둘베코 개변 이글 배지(DMEM)＋10% 소 태아 혈청(FBS)； DMEM： Gibco 사 제, 형번 11965； FBS：Biological Industries Ltd. 제, 로트번호 715929) 중에 부유시키고, 세포 현탁액을 조제했다.
상기 플레이트에, 실온 조건하에서, 세포 밀도 1.0×105개/㎠ 이상이 되도록, 세포 현탁액을 가했다.
그리고, 이 세포를, 37℃, 5% CO2의 세포 배양 인큐베이터 중에서 배양했다.
배양 개시부터 6시간 후, 연골 세포는 피복배양면으로부터 응집하기 시작하고, 배양 개시부터 8시간 후, 도너츠형(링형)의 세포구조체를 형성했다. 세포구조체는, 깔개의 요부의 바닥면의 폭방향 중앙 부분에 침강하고 있었다.
배양 개시부터 1.5시간 후에, 연골 분화용 배지(둘베코 개변 이글 배지(DMEM)＋10% 소 태아 혈청(FBS)＋1%ITS　Premix＋50μg/mL　아스코빈산 2 인산＋10ng/μL　재조합 래트 TGF-β1(Rat　TGF-β1　recombinant)＋10M　덱사메타존； DMEM： Gibco 사 제, 형번 11965； FBS：Biological Industries Ltd. 제, 로트번호 715929； ITS　Premix：BD bioscience 사 제, 카탈로그 번호 354341； 아스코빈산 2 인산(Wako Pure Chemical Corporation 제, 카탈로그 번호 196-01252)； 재조합 래트 TGF-β1：PeproTech, Inc. 제, 카탈로그 번호 100-21； 덱사메타존：Wako Pure Chemical Corporation 제, 카탈로그 번호 047-18863)으로 배지 교환했다.
배지 교환 후, 세포의 배양을 더욱 24시간 계속했다.
배지를 다시 증식용 배지에 되돌린 다음, 세포구조체의 존재하에서, 실온 조건하에서, 세포 밀도 1.0×105개/㎠ 이상이 되도록 세포 현탁액을 가했다.
그리고, 이 세포를, 37℃, 5% CO2의 세포 인큐베이터 중에서 배양했다.
배양 개시부터 6시간 후, 파종한 연골 세포는 피복배양면으로부터 응집하기 시작하고 도너츠형(링형)의 세포구조체를 감싸도록 응집하여, 한층 사이즈가 확대한 도너츠형(링형)의 세포구조체를 형성했다. 배양 개시부터 8시간 후의 세포구조체의 상태를 도 10에 나타낸다.
상기의 세포구조체의 존재하에서의 파종 배양을 3회 반복했다. 1 ~ 3회의 반복 후의 세포구조체의 상태를 도 10에 나타낸다.
도 10에, 시험 I-C-3에서의, 배양 개시부터 8시간 후, 20시간 후, 32시간 후, 42시간 후의 세포구조체의 상태를 형광현미경을 이용해 관찰했을 때의 사진을 나타낸다. 상측 도면에, 폭 2 mm의 도너츠형의 속이 빈 깔개를 이용했을 경우의 세포구조체의 상태를 나타내고, 하측 도면에, 폭 2.5 mm의 도너츠형의 속이 빈 깔개를 이용했을 경우의 세포구조체의 상태를 나타낸다. 또한 최하측 도면에는, 42시간 후의 세포구조체의 상태를 실체현미경을 이용해 관찰했을 때의 사진을 나타낸다.
도 10에 나타내는 사진으로부터, 새로운 세포의 파종 및 배양을 거쳐 도너츠형(링형)의 연골 세포괴의 사이즈가 확대한 것을 알 수 있었다.
특히, 3회의 파종 배양의 반복 후(배양 개시부터 42시간 후)에, 도너츠형(링형)의 연골 세포괴는, 깔개의 요부의 밖에 나온 것을 알 수 있다.
또한 시험 I-C-2및 시험 I-C-3에서 수득된 도너츠형(링형)의 연골 세포괴에 대해서, 간엽계 세포인 ADSC 세포를 이용해 파종 배양 공정을 더욱 1회 행하고, 이식 재료를 조제할 수 있었다(도시하지 않음).
(시험 I-D) 복합재의 조제
우선, 관상 구조체로서 콜라겐을 주성분으로 하는 바이오 튜브(예를 들면, 일본 특허공개 2004-261260호 공보의 실시예에 기재의 방법 참조)(외경：3 mm, 내경：2 mm, 길이：20 mm)를 준비했다. 또한, 심재로서 실리콘제의 봉상 구조물(원주상의 형상, 길이：20 mm, 외경：1.8 mm)를 준비했다(도 6(i) 참조).
그 다음에, 봉상 구조물을 바이오 튜브의 중공부의 일방 단으로부터 타방 단을 향해 삽입했다(도 6(ii) 참조).
그리고, 시험 I-C-2에서 제작한 도너츠형의 연골 세포괴 4 개를 상기 바이오 튜브에 약 1 mm의 간격을 두면서 끼우고, 복합체를 조제했다(도 6(iii) 참조).
끼움 종료 후 3 분 후에, 복합체를 37℃, 5% CO2의 세포 배양 인큐베이터 중에서 배양하기 시작했다. 그 후, 복합체를 21일간 배양했다. 배양 개시부터 21일 후의 시점에서, 바이오 튜브와 연골 세포괴가 일체화해서, 복합재가 조제되었다 (도 6(iｖ) 참조).
도 11(a)에, 시험 I-D에서의 배양 개시부터 6일 후의 복합재의 상태를 육안으로 관찰했을 때의 사진을 나타낸다.
도 11(b)에, 시험 I-D에서의 배양 개시부터 21일 후의 복합재의 상태를 육안으로 관찰했을 때의 사진을 나타낸다.
도 12에, 시험 I-D에서의 배양 개시부터 21일 후의 복합재의 일부의 상태를 육안으로 관찰했을 때의 사진을 확대해 나타낸다.
도 12에 나타낸 바와 같이, 바이오 튜브의 외표면에는 연골 조직이 형성되어 있었다.
또한 복합체를 조제했을 때에 약 1 mm인 연골 세포괴간의 간격은, 약 1 mm가 되어 있었다.
도 13에, 시험 I-D에서 조제된 복합재에 대해서 핀셋으로 조작했을 때의 상태를 육안으로 관찰했을 때의 사진을 나타낸다. (a)는 무조작시의 외주면, (b)는 무조작시 내강면, (c)는 전체에의 압궤시, (d)는 측면의 일부에의 인장시, 의 상태를 나타낸다.
도 13(a) ~ (d)에 나타낸 바와 같이, 복합재는 상기 통상의 조작에 견딜 수 있는 기계적 강도를 구비하고 있어 연골 조직도 바이오 튜브에 강고하게 접착한 채로 있는 것을 알 수 있었다.
도 14에, 시험 I-D에서 조제된 복합재를 헤마톡실린·에오신 염색(HE 염색)에 제공했을 때의 상태를 현미경을 이용해 관찰했을 때의 사진을 나타낸다. (a)에, 복합재의 외관 사진을 나타내고, (b)에, (a)의 선 A-A에 따르는 면에 의해 절단했을 때의 단면도를 나타내고, (c) 및 (d)에, (b)에 나타내는 사진을 부분 확대한 것을 나타낸다.
도 14(c), (d) 중, 핑크색으로 염색한 부분(도면중, 실선 화살표에서 나타낸다)은 콜라겐이고, 청자색으로 염색한 부분이 세포이다. 여기에 나타낸 바와 같이, 바이오 튜브의 콜라겐 선유와 연골 세포의 세포외 매트릭스가 일체화하고 있는 것을 알 수 있다.
[[발명(II)의 실시예]
이하에, 실시예에 기초해 본 발명(II)을 보다 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이러한 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
(온도 응답성 폴리머의 조제)
용량 50 mL의 연질유리제의 투명 바이알병에, 2-N, N-디메틸아미노에틸 메타크릴레이트(DMAEMA) 10.0 g, 및 물 5 mL를 가하고, 자기교반기를 이용해 교반했다. 그리고, 이 혼합물(액체)에 대해서 G1 그레이드의 고순도(순도：99.99995%)의 질소 가스를 10분간 퍼지(유속：2.0L/분) 함으로써, 이 혼합물을 탈산소했다. 또한 이용한 DMAEMA에는, 중합금지제인 메틸 히드로퀴논(MEHQ)이 0.5질량% 포함되어 있었다.
그 후, 이 반응물에 대해서, 환형블랙 형광등(NEC 사 제, 형번：FCL20BL, 18 W)을 이용하여, 22시간 자외선 조사함으로써, 상기 반응물을 중합시켰다. 반응물은, 5시간 후에 점성을 띠고 15시간 후에 고화하여, 중합체가 반응 생성물로서 수득되었다. 이 반응 생성물을 2-프로판올에 용해시켜, 용액을 투석 튜브로 옮겼다. 그리고, 투석을 72시간 실시해, 반응 생성물을 정제했다.
반응 생성물을 포함하는 용액을, 셀룰로오스 혼합에스테르제의 0.2μm 필터(Toyo Roshi Kaisha, Ltd. 제, 형번：25AS020)로 여과하고, 수득된 여액을 동결건조시킴으로써, 온도 응답성(호모) 폴리머가 수득되었다(수량：6.8 g, 전화율：68%). 이 폴리머의 수평균분자량(Mn)을, GPC(Shimadzu Corporation 제, 형번：LC-10ｖp 시리즈)를 이용하여, 폴리에틸렌글리콜(Shodex 사 제, TSK 시리즈)을 표준 물질로서 측정해, Mn=1.0×105g/mol(Mw/Mn=10.0)로 결정했다.
상술의 온도 응답성 폴리머의 핵자기공명 스펙트럼(NMR)을, 핵자기공명 장치(Varian 사 제, 형번：Gemini300)를 이용하여, 중수(D2O)를 표준 물질로서 측정했다. 하기에는, 대표적인 피크를 나타낸다.
Figure pct00003
여기서, 주쇄의 메틸기(δ　0.8-1.2)의 프로톤 수(DMAEMA의 호모폴리머의 경우는 모노머 1분자에 대해 3개) A와 측쇄의 디메틸아미노기(δ　2.2-2.4)의 메틸프로톤 수(DMAEMA의 호모폴리머의 경우는 모노머 1분자에 대해 6개로) B로부터, 측쇄가 가지는 아미노기의 관능기 수와 중합반응과 동시에 진행하는 측쇄의 에스테르 결합의 가수분해반응에 의해 생긴 측쇄의 카르복실기의 관능기 수의 비를 산출했다.
그 결과, 상술의 온도 응답성 폴리머의 경우는 94：6이 되었다. 이것은, 양이온성 폴리머와 음이온성 폴리머를 포함하는 2성분 혼합계에서의 이온 복합체라고 말하는 C/A비로 환산하면, C/A비=15.6이 된다.
상술의 온도 응답성 폴리머의 담점을 이하의 방법으로 측정했다.
온도 응답성 폴리머의 3% 수용액을 조제해, 이 수용액의 660 nm에서의 흡광도를, 20 ~ 40℃의 사이에 측정했다.
그 결과, 20 ~ 30℃에서는, 수용액은 투명하고, 흡광도가 거의 0이었지만, 31℃ 부근에서 수용액 중에 백탁이 보이도록 되어, 32℃에서 흡광도가 급격하게 상승했다. 이것에 의해, 온도 응답성 폴리머는, 약 32℃의 담점을 가지는 것을 확인했다.
또한 온도 응답성 폴리머를 37℃까지 승온시키면, 폴리머 수용액은, 양호한 응답성으로, 현탁하고, 그 후, 수용액 전체가 고화했다. 이 고화물을 실온(25℃)에서 유지했는데, 수십 시간 동안, 고화한 상태인 채였다. 그 후, 고화물이 서서히 용해하고, 균질한 수용액으로 변화했다. 고화한 폴리머는 4℃까지 냉각하면, 빠르게 용해했다. 그리고, 상기 승온 및 강온의 조작을 반복해 행해도, 응답성으로 변화는 생기지 않았기 때문에, 폴리머가 가역적으로 상전이를 일으키게 하는 것이 확인되었다.
(피복 세포배양기의 제조)
상술의 온도 응답성 폴리머를, 순수에 용해하고, 온도 응답성 폴리머 용액을 조제했다. 각 온도 응답성 폴리머 용액 중의 온도 응답성 폴리머의 농도는, 온도 응답성 폴리머 a：0.125ng/μL, 온도 응답성 폴리머 b：0.25ng/μL, 온도 응답성 폴리머 c：0.5ng/μL, 온도 응답성 폴리머 d：1.0ng/μL로 했다.
384 웰 플레이트(Sumitomo Bakelite Co., Ltd. 제, 품명 「PrimeSurface」(등록상표), MS-9384 U)의 웰에, 온도 응답성 폴리머 용액 a ~ d 25μL를, 첨가했다.
그리고, 인큐베이터(40℃) 중에서 6시간 방치함으로써, 도포한 온도 응답성 폴리머의 수용액을 건조시켜, 피복 영역 A를 가지는 피복 세포배양기 a ~ d를 준비했다.
상술의 온도 응답성 폴리머를, 생리식염수에 용해하여, 온도 응답성 폴리머 용액을 조제했다. 각 온도 응답성 폴리머 용액 중의 온도 응답성 폴리머의 농도는, 온도 응답성 폴리머 e：6ng/μL, 온도 응답성 폴리머 f：12ng/μL, 온도 응답성 폴리머 g：24ng/μL로 했다.
384 웰 플레이트(Sumitomo Bakelite Co., Ltd. 제, 품명 「PrimeSurface」(등록상표), MS-9384 U)의 웰에, 온도 응답성 폴리머 용액 e ~ g 25μL를, 첨가했다. 또한 이 플레이트의 웰에서는, 둥근 바닥의 곡률 반경(평균) R는 약 1.6 mm이고, 최대폭 L는 약 2.5 mm였다.
그리고, 인큐베이터(37℃) 중에서 3시간 방치하고, 피복 영역 A를 가지는 피복 세포배양기 e ~ g를 준비했다. 또한 피복 세포배양기 e ~ g에서, 웰 중에 첨가한 온도 응답성 폴리머 용액은, 건조시키지 않았다.
상술의 온도 응답성 폴리머를, 순수에 용해하여, 온도 응답성 폴리머 용액을 조제했다. 각 온도 응답성 폴리머 용액 중의 온도 응답성 폴리머의 농도는, 온도 응답성 폴리머 h：0.9pg/μL, 온도 응답성 폴리머 i：1.8pg/μL, 온도 응답성 폴리머 j：7.5pg/μL, 온도 응답성 폴리머 k：15pg/μL, 온도 응답성 폴리머 l：31pg/μL, 온도 응답성 폴리머 m：67pg/μL, 온도 응답성 폴리머 n：125pg/μL, 온도 응답성 폴리머 o：500pg/μL로 했다.
384 웰 플레이트(Sumitomo Bakelite Co., Ltd. 제, 품명 「PrimeSurface」(등록상표), MS-9384 U)의 웰에, 온도 응답성 폴리머 용액 h ~ o 2.5μL를, 첨가했다.
그리고, 인큐베이터(40℃) 중에서 6시간 방치함으로써, 도포한 온도 응답성 폴리머의 수용액을 건조시켜, 피복 영역 A를 가지는 피복 세포배양기 h ~ o를 준비했다.
384 웰 플레이트(Sumitomo Bakelite Co., Ltd. 제, 품명 「PrimeSurface」(등록상표), MS-9384 U)의 웰에, 생리식염수 25μL를, 첨가했다.
그리고, 인큐베이터(37℃) 중에서 3시간 방치하고, 세포배양기 p를 준비했다. 또한 세포배양기 p는, 온도 응답성 폴리머가 피복되어 있지 않은 세포배양기이다.
[상피계 세포의 배양 방법]
(실시예 II-1 ~ II-35)
사람 간암 세포(COSMO BIO CO.,LTD., 품번 「HepG2-500」)를, 배지(DMAEM＋10%FBS(Gibco 사 제, 로트번호：715929) 중에 혼합하고, 0.5×103 cells/50μL(세포용액 I), 1.0×103 cells/50μL(세포용액 II), 2.0×103 cells/50μL(세포용액 III), 4.0×103 cells/50μL(세포용액 IV), 8.0×103 cells/50μL(세포용액 V)의 밀도의 세포용액을 조제했다.
그리고, 피복 세포배양기 a ~ g의 각 웰에, 세포용액 I ~ V를 50μL 가하고 세포를 파종했다. 각 실시예에서의 피복 세포배양기, 세포용액의 조합은, 표 1에 기재한 바와 같다.
그 후, 세포 인큐베이터(37℃, 5% CO2) 중에서, 24시간 배양했다. 그 후, 현미경(Nikon Corporation 제, ECLIPSE-Ti)으로 관찰했다.
(실시예 II-36 ~ II-75)
사람 간암 세포(COSMO BIO CO.,LTD., 품번 「HepG2-500」)를, 배지(DMAEM＋10%FBS(Gibco 사 제, 로트번호：715929) 중에 혼합하고, 0.5×103 cells/25μL(세포용액 VI), 1.0×103 cells/25μL(세포용액 VII), 2.0×103 cells/25μL(세포용액 VIII), 4.0×103 cells/25μL(세포용액 IX), 8.0×103 cells/25μL(세포용액 X), 의 농도의 세포용액을 조제했다.
그리고, 피복 세포배양기 h ~ o의 각 웰에, 세포용액 VI ~ X를 25μL 가하고 세포를 파종했다. 각 실시예에서의 피복 세포배양기, 세포용액의 조합은, 표 1에 기재한 바와 같다.
그 후, 세포 인큐베이터(37℃, 5% CO2) 중에서, 24시간 배양했다. 그 후, 현미경(Nikon Corporation 제, ECLIPSE-Ti)으로 관찰했다.
(비교예 II-1 ~ II-5)
세포배양기 p의 웰에, 세포용액 I ~ V를 50μL 가하고 세포를 파종했다. 각 비교예에서의 피복 세포배양기, 세포용액의 조합은, 표 1에 기재한 바와 같다.
그 후, 세포 인큐베이터(37℃, 5% CO2) 중에서, 24시간 배양했다. 그 후, 현미경(Nikon Corporation 제, ECLIPSE-Ti)으로 관찰했다.
[세포구조체의 제조 방법]
(실시예 II-76 ~ II-80)
피복 세포배양기 e의 웰에, 세포용액 I ~ V를 50μL 가하고 세포를 파종했다. 각 실시예에서의 피복 세포배양기, 세포용액의 조합은, 표 2에 기재한 바와 같다.
그 후, 세포 인큐베이터(37℃, 5% CO2) 중에서, 24시간 배양하고, 현미경(Nikon Corporation 제, ECLIPSE-Ti)으로 관찰했다. 그리고, 전웰의 바닥면에 괴상의 세포구조체가 형성된 것을 확인했다. 또한, 하기의 세포구조체의 박리하기 어려움의 평가를 행했다. 그 결과를 표 2에 나타낸다.
(실시예 II-81 ~ II-100)
피복 세포배양기 h ~ k의 웰에, 세포용액 VI ~ X를 25μL 가하고 세포를 파종했다. 각 실시예에서의 피복 세포배양기, 세포용액의 조합은, 표 2에 기재한 바와 같다.
그 후, 세포 인큐베이터(37℃, 5% CO2) 중에서, 24시간 배양해, 현미경(Nikon Corporation 제, ECLIPSE-Ti)으로 관찰했다. 그리고, 전웰의 바닥면에 괴상의 세포구조체가 형성된 것을 확인했다. 또한, 하기의 세포구조체의 박리하기 어려움의 평가를 실시했다. 그 결과를 표 2에 나타낸다
(비교예 II-6 ~ II-10)
세포배양기 p의 웰에, 세포용액 I ~ V를 50μL 가하고 세포를 파종했다. 각 비교예에서의 세포배양기, 세포용액의 조합은, 표 2에 기재한 바와 같다.
그 후, 세포 인큐베이터(37℃, 5% CO2) 중에서, 24시간 배양하고, 현미경(Nikon Corporation 제, ECLIPSE-Ti)으로 관찰했다.
HepG2는 배양면에 부착하지 않고, 바닥면에서 응집하고 있었다. 응집한 세포구조체는, 플레이트를 흔드는 것만으로 이동하고, 바닥면에 부착하지 않았다. 또한, 피펫팅을 행했는데, 세포외 매트릭스의 분비가 적기 때문이거나, 세포구조체가 무너지는 예도 보였다.
[평가]
(피복 영역에의 세포의 접착)
실시예 II-1 ~ II-75, 비교예 II-1 ~ II-5에서 배양한 HepG2를, 현미경(Nikon Corporation 제, ECLIPSE-Ti)으로 관찰했다. 그리고, HepG2가 피복 영역에 접착하고 있어, 배양 가능한 경우를 양호(○), 피복 영역에 접착하고 있지 않는 경우를 불량(×)이라고 평가했다.
(세포구조체의 외관)
실시예 II-76 ~ II-100, 비교예 II-6 ~ II-10에서 수득된 세포구조체를, 현미경(Nikon Corporation 제, ECLIPSE-Ti)으로 관찰했다. 그 후, 피펫터(Eppendorf 사 제, 상품명 「Reference」)를 이용해 강하게 피펫팅 해, 재차 세포구조체를 관찰했다. 그리고, 이하의 기준으로 세포구조체의 외관을 평가했다.
○(양호)：괴상의 세포구조체가 형성되어 있었다. 또한, 강하게 피펫팅을 해도, 세포구조체가 무너지지 않았다.
×(불량)：괴상의 세포구조체가 형성되어 있었지만, 강하게 피펫팅을 하면, 세포구조체가 무너졌다.
(세포구조체의 박리하기 어려움)
실시예 II-76 ~ II-100, 비교예 II-6 ~ II-10에서 수득된 세포구조체를, 피펫터(Eppendorf 사 제, 상품명 「Reference」)를 이용해 수동으로 피펫팅 해, 세포구조체가 배양면으로부터 박리할 때까지의 회수를 측정했다.
◎(우수)：10회 초과 피펫팅 해도 세포구조체가 박리하지 않았다.
○(양호)：2 ~ 10회 피펫팅으로 세포구조체가 박리했다.
△(보통)：1회 피펫팅으로 세포구조체가 박리했다.
×(불량)：세포구조체가 배양면에 접착하지 않았다.
[표 1－1]
Figure pct00004
[표 1－2]
Figure pct00005
Figure pct00006
[상피 간엽 전이 유도제]
(실시예 II-101)
사람 간암 세포(COSMO BIO CO.,LTD., 품번 「HepG2-500」)를, 배지(DMAEM＋10%FBS(Gibco 사 제, 로트번호：715929) 중에 혼합하고, 4.0×103 cells/25μL의 농도의 세포용액을 조제했다.
24 웰 플레이트(Sumitomo Bakelite Co., Ltd. 제, 품명 「Sumilon cell-tight」, MS-9024 X)의 웰의 중심부분에, 상술의 온도 응답성 폴리머 d(1.0ng/μL)를 마이크로 피펫터(Sibata Scientific Technology LTD. 제, Desifit)를 이용해 0.5μL를 액적으로서 적하했다.
그리고, 인큐베이터(37℃) 중에서 3시간 방치함으로써, 도포한 온도 응답성 폴리머의 수용액을 건조시켜, 피복 영역 A를 가지는 피복 세포배양기 q를 준비했다.
그리고, 피복 세포배양기 q의 웰에, 세포용액 I를 1,000μL 가하고 세포를 파종했다.
그 후, 세포 인큐베이터(37℃, 5% CO2) 중에서, 96시간 배양했다. 그 후, 현미경(Nikon Corporation 제, ECLIPSE-Ti)으로 관찰했다.
(상피세포로부터 간질 세포에의 전이의 유무)
실시예 II-101에서 배양한 HepG2를, 현미경(Nikon Corporation제, ECLIPSE-Ti)으로 관찰했다. 그리고, 피복 영역에 접착한 HepG2의 접착의 상태를 평가해, 상피세포로부터 간질 세포에의 전이의 유무를 판정했다.
Figure pct00007
도 17에, 본 발명에서 이용되는 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물 상에서 상피계 세포를 96시간 배양했을 때의 상태의 사진을 나타낸다. 도면 중, 파선으로 둘러싸인 부분은 피복 영역 A를 나타내고, 흑색 테투리 화살표는 피복 영역 A로 접착·생육하고 있는 세포를 나타내고, 흑색 채워진 화살표는 비피복 영역에서 접착·생육하고 있는 세포를 나타낸다.
도 17에 나타낸 바와 같이, 배양 96시간 후에, 피복 영역 A 상에서 배양된 세포는 컨플루언트에 이르고 있고, 선유아세포 유사 형태를 가지고 있고, 한편 비피복 영역 상에서 배양된 세포는 포석 유사(섬상)으로 산재하고, 상피계 세포의 특징을 유지하고 있는 것을 알았다.
이 결과로부터, 본 발명에서 이용되는 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물이 상피 간질 전이의 효과를 가지는 것이 나타났다.
[[발명(III)의 실시예]
이하에 실시예에 기초해 본 발명(III)을 보다 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이러한 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
(실시예 III-1)
(입체조직체의 제작 장치의 제조)
심봉으로서 표면이 망목 구조의 스테인리스 튜브(FUJI FILTER MFG.CO.,LTD.　제, 3φ)를, 배양면으로서 상품명 「PrimeSurface」(등록상표)(Sumitomo Bakelite Co., Ltd. 제, 품번 「MS-9024 X」)의 일부를 잘라내고 관통공(약 3 mm 경(徑))을 설치한 것을, 사용해, 배양면과 관통공이 접하고 있는 장치를 제조했다. 배양면은, 대략 원형이고, 그 외경은 약 25 mm였다. 또한 장치의 형상은, 도 18의 형상으로 했다.
용량 50 mL의 연질유리제의 투명 바이알병에, 2-N, N-디메틸아미노에틸 메타크릴레이트(DMAEMA) 10.0 g, 및 물 5 mL를 가하고, 자기교반기를 이용해 교반했다. 그리고, 이 혼합물(액체)에 대해서 G1 그레이드의 고순도(순도：99.99995%)의 질소 가스를 10분간 퍼지(유속：2.0L/분) 함으로써, 이 혼합물을 탈산소했다. 또한 이용한 DMAEMA에는, 중합금지제인 메틸 히드로퀴논(MEHQ)이 0.5질량% 포함되어 있었다.
그 후, 이 반응물에 대해서, 환형블랙 형광등(NEC 사 제, 형번：FCL20BL, 18 W)을 이용하여, 22시간 자외선 조사함으로써, 상기 반응물을 중합시켰다. 반응물은, 5시간 후에 점성을 띠고 15시간 후에 고화하여, 중합체가 반응 생성물로서 수득되었다. 이 반응 생성물을 2-프로판올에 용해시켜, 용액을 투석 튜브로 옮겼다. 그리고, 투석을 72시간 실시해, 반응 생성물을 정제했다.
반응 생성물을 포함하는 용액을, 셀룰로오스 혼합에스테르제의 0.2μm 필터(Toyo Roshi Kaisha, Ltd. 제, 형번：25AS020)로 여과하고, 수득된 여액을 동결건조시킴으로써, 온도 응답성(호모) 폴리머가 수득되었다(수량：6.8 g, 전화율：68%). 이 폴리머의 수평균분자량(Mn)을, GPC(Shimadzu Corporation 제, 형번：LC-10ｖp 시리즈)를 이용하여, 폴리에틸렌글리콜(Shodex 사 제, TSK 시리즈)을 표준 물질로서 측정해, Mn=1.0×105 g/mol(Mw/Mn=10.0)로 결정했다.
상술의 온도 응답성 폴리머의 핵자기공명 스펙트럼(NMR)을, 핵자기공명 장치(Varian 사 제, 형번：Gemini300)를 이용하여, 중수(D2O)를 표준 물질로서 측정했다. 하기에는, 대표적인 피크를 나타낸다.
Figure pct00008
여기서, 주쇄의 메틸기(δ　0.8-1.2)의 프로톤 수(DMAEMA의 호모폴리머의 경우는 모노머 1분자에 대해 3개) A와 측쇄의 디메틸아미노기(δ　2.2-2.4)의 메틸프로톤 수(DMAEMA의 호모폴리머의 경우는 모노머 1분자에 대해 6개로) B로부터, 측쇄가 가지는 아미노기의 관능기 수와 중합반응과 동시에 진행하는 측쇄의 에스테르 결합의 가수분해반응에 의해 생긴 측쇄의 카르복실기의 관능기 수의 비를 산출했다.
그 결과, 상술의 온도 응답성 폴리머의 경우는 94：6이 되었다. 이것은, 양이온성 폴리머와 음이온성 폴리머를 포함하는 2성분 혼합계에서의 이온 복합체라고 말하는 C/A비로 환산하면, C/A비=15. 6이 된다.
상술의 온도 응답성 폴리머의 담점을 이하의 방법으로 측정했다.
온도 응답성 폴리머의 3% 수용액을 조제해, 이 수용액의 660 nm에서의 흡광도를, 20 ~ 40℃의 사이에 측정했다.
그 결과, 20 ~ 30℃에서는, 수용액은 투명하고, 흡광도가 거의 0이었지만, 31℃ 부근에서 수용액 중에 백탁이 보이도록 되어, 32℃에서 흡광도가 급격하게 상승했다. 이것에 의해, 온도 응답성 폴리머는, 약 32℃의 담점을 가지는 것을 확인했다.
또한 온도 응답성 폴리머를 37℃까지 승온시키면, 폴리머 수용액은, 양호한 응답성으로, 현탁하고, 그 후, 수용액 전체가 고화했다. 이 고화물을 실온(25℃)으로 유지했는데, 수십 시간 동안, 고화한 상태인 채였다. 그 후, 고화물이 서서히 용해하고, 균질한 수용액으로 변화했다. 고화한 폴리머는 4℃까지 냉각하면, 빠르게 용해했다. 그리고, 상기 승온 및 강온의 조작을 반복해 행해도, 응답성으로 변화는 생기지 않았기 때문에, 폴리머가 가역적으로 상전이를 일으키게 하는 것이 확인되었다.
상술의 온도 응답성 폴리머를, 순수에 용해하고, 온도 응답성 폴리머 용액(종 농도 15 ng/μL)을 조제했다. 이 용액을 상술의 장치의 배양면의 전면에 도포하고, 인큐베이터(40℃) 중에서 1시간 방치함으로써, 도포한 온도 응답성 폴리머의 수용액을 건조시켜, 피복배양면을 가지는 입체조직체의 제작 장치를 준비했다.
(실시예 III-2)
심봉으로서 표면이 망목 구조의 스테인리스 튜브(FUJI FILTER MFG.CO.,LTD.　제, 3φ)를, 배양면으로서 상품명 「PrimeSurface」(등록상표)(Sumitomo Bakelite Co., Ltd. 제, 품번 「MS-9024 X」)의 일부를 잘라내 관통공(약 3.2 mm 경(徑))을 설치한 것을, 사용해, 배양면과 관통공의 사이에 틈이 있는 장치를 제조했다. 배양면은, 대략 원형이고, 그 외경은 약 25 mm이고, 배양면과 관통공의 틈은 0.2 mm였다. 또한 장치의 형상은, 도 20의 형상으로 했다.
실시예 III-1과 마찬가지로 하고, 온도 응답성 폴리머로 배양면을 피복해, 피복배양면을 가지는 입체조직체의 제작 장치를 준비했다.
(실시예 III-3)
(링상의 입체조직체의 제작)
실시예 III-1에서 제조한 입체조직체의 제작 장치를, 내경 30 mm의 코니칼 튜브(IWAKI&CO.,LTD. 제, 상품 코드 「2345-050」)에 넣어 배지(DMEM＋10%FBS(Biological Industries Ltd.　 제, 로트번호：715929)＋50μg/mL 아스코빈산 2 인산염(Wako Pure Chemical Corporation 제, 상품 번호：196-1252)) 중에 담그었다. 그 후, GFP 재조합 루이스 래트 지방조직 유래 간엽계 줄기세포(ADSC)를, 제작 장치를 담근 배지와 마찬가지의 배지 중에 혼합해 세포 부유액을 조제했다. 그 후, 60×105개/mL의 세포 부유액을 2 mL 첨가해, 세포를 파종했다.
그 후, 세포 인큐베이터(37℃, 5% CO2) 중에서, 24시간 배양해, 심봉의 주위에 감긴 링상의 입체조직체가 수득되는 것을 확인했다.
수득된 링상의 입체조직체는, 도 24와 거의 마찬가지의 것이었다. 수득된 링상의 입체조직체는, ADSC를 주성분으로 하는 입체조직체였다.
(실시예 III-4)
(링상의 입체조직체의 제작)
실시예 III-2에서 제작한 입체조직체의 제작 장치를 이용한 이외는, 실시예 III-3과 마찬가지로 해 링상의 입체조직체를 제작했는데, 응집한 세포는, 배양면과 관통공의 사이의 틈을 뛰어넘고, 심봉의 주위에 감긴 링상의 입체조직체가 수득된 것을 확인했다.
도 24에, 실시예 III-4에서 수득된 링상의 입체조직체를 나타낸다. 수득된 링상의 입체조직체는, ADSC를 주성분으로 하는 입체조직체였다.
(실시예 III-5)
(관강상의 입체조직체의 제작)
실시예 III-1에서 제조한 입체조직체의 제작 장치를, 내경 30 mm의 코니칼 튜브(IWAKI&CO.,LTD. 제, 상품 코드 「2345-050」) 넣어 배지(RPMI-1640＋10%FBS(Biological　Industries 사 제, 로트번호：715929)＋10ng/μL　래트　TGF-β1　재조합(PEPROTECH 사 제, 상품 번호：100-21)＋50μg/mL 아스코빈산 2 인산(Wako Pure Chemical Corporation 제, 상품 번호：196-01252)) 중에 담그었다. 그 후, GFP 재조합 루이스 래트 슬관절로부터 정법에 따라서 채취한 연골 세포를, 제작 장치를 담근 배지와 마찬가지의 배지 중에 혼합해 세포 부유액을 조제했다. 그 후, 60×105개/mL의 세포 부유액을 2 mL 첨가해, 세포를 파종하고, 세포 인큐베이터(37℃, 5% CO2) 중에서, 48시간 배양해, 심봉의 주위에 감긴 링상의 입체조직체가 수득된 것을 확인했다.
그 후, 배양면을 심봉의 연재 방향 하측에 0.5 mm 이동시켜, 더욱 상기 세포 부유액을 2 mL 첨가해, 세포를 재차 파종하고, 세포 인큐베이터(37℃, 5% CO2) 중에서, 48시간 배양했다(2회째의 세포 파종, 배양).
마찬가지로 해서, 세포의 파종, 배양을 계속해 파종과 배양의 반복을 합계 9회 행했다.
그리고, 9개의 링상의 입체조직체가 서로 늘어서 접착한, 관강상의 입체조직체가 수득된 것을 확인했다.
도 25에, 실시예 III-5에서 수득된 관강상의 입체조직체를 나타낸다. 또한 도 25는, 심봉인 스테인리스 튜브를 빼내고, 실리콘 수지제의 튜브와 바꿔 넣은 후에 촬영한 사진이다.
(실시예 III-6)
(관강상의 입체조직체의 제작)
실시예 III-2에서 제조한 입체조직체의 제작 장치를 이용해 배양면을 심봉의 연재 방향 상측으로 0.2 mm 이동시킨 것 이외는, 실시예 III-5와 마찬가지로 해 관강상의 입체조직체를 제작하고, 9개의 링상의 입체조직체가 서로 늘어서 접착한, 관강상의 입체조직체가 수득된 것을 확인했다.
수득된 관강상의 입체조직체는, 도 25와 거의 마찬가지의 것이었다.
(실시예 III-7)
(복수의 배양면을 가지는 입체조직체의 제작 장치의 제조)
심봉으로서 표면이 망목 구조의 스테인리스 튜브(FUJI FILTER MFG.CO.,LTD.　제, 3φ)를, 배양면으로 해서 상품명 「PrimeSurface」(등록상표)(Sumitomo Bakelite Co., Ltd. 제, 품번 「MS-9024 X」)의 일부를 잘라내 관통공(약 3.2 mm 경(徑))을 설치한 것을, 사용해, 배양면과 관통공의 사이에 틈이 있는, 9개의 배양면을 가지는 장치를 제조했다. 모든 배양면은, 대략 원형이고, 그 외경은 약 24 mm이고, 배양면과 관통공의 틈은 0.2 mm였다. 또한 장치의 형상은, 1개의 심봉이 9개의 배양면의 관통공을 상통한, 도 26에서 배양면을 9개 가지는 형상으로 했다.
실시예 III-1과 마찬가지로 해서, 온도 응답성 폴리머로 모든 배양면을 피복해, 피복배양면을 가지는 입체조직체의 제작 장치를 준비했다.
또한 각 배양면의 간격은 1 mm로 했다.
(실시예 III-8)
(관강상의 입체조직체의 제작)
실시예 III-7에서 제조한 입체조직체의 제작 장치를, 내경 30 mm의 코니칼 튜브(IWAKI&CO.,LTD. 제, 상품 코드 「2345-050」) 넣어 배지(DMEM＋10%FBS(Biological　Industries 사 제, 로트번호：715929) 중에 담그었다. 그 후, 래트 피하지방 유래 간엽계 줄기세포를, 제작 장치를 담근 배지와 마찬가지의 배지 중에 혼합해 세포 부유액을 조제했다. 그 후, 60×106개/mL의 세포 부유액을 2 mL 첨가해, 각 피복배양면 상에 세포를 파종하고, 세포 인큐베이터(37℃, 5% CO2) 중에서, 48시간 배양해, 각 피복배양면으로부터 심봉의 주위에 감긴 링상의 입체조직체가 수득된 것을 확인했다.
그 후, 더욱 48시간 배양을 계속했는데, 각 피복배양면으로부터 형성된 9개의 링상의 입체조직체가 서로 늘어서 접착해, 관강상의 입체조직체가 수득된 것을 확인했다.
도 28 A에, 실시예 III-8에서 수득된 관강상의 입체조직체(3.8%글루타르알데히드 고정 후의 사진)을, 도 28 B에, HE염색 절편상을 나타낸다.
(실시예 III-9)
(인공혈관)
실시예 III-7에서 제조한 입체조직체의 제작 장치의 9개의 배양면에, 셀 링커 키트(cell linker kit)으로 적색 형광 표지한 제대혈 유래 혈관 내피세포를, 배지(DMEM＋10%FBS(Biological　Industries 사 제, 로트번호：715929) 중에 혼합해 60×105개/mL의 밀도로 1 mL씩 첨가하고 세포 파종을 실시했다. 이것을, 내경 30 mm의 코니칼 튜브(IWAKI&CO.,LTD. 제, 상품 코드 「2345-050」) 넣어 배지(DMEM＋10%FBS(Biological　Industries 사 제, 로트번호：715929) 중에 담그어, 세포 인큐베이터(37℃, 5% CO2) 중에서, 48시간 배양해, 심봉의 주위에 감긴 혈관 내피세포의 링상의 입체조직체가 수득된 것을 확인했다.
그 후, GFP 노크 인 래트 피하지방 유래의 간엽계 줄기세포, 제작 장치를 담근 배지와 마찬가지의 배지 중에 혼합해 간엽계 줄기세포 부유액을 조제했다. 60×105개/mL를 10 mL 첨가해, 세포를 파종하고, 세포 인큐베이터(37℃, 5% CO2) 중에서, 48시간 배양해, 혈관 내피세포의 층의 외주에, 간엽계 줄기세포의 층을 가지는, 2층 구조의 9개의 링상의 입체조직체가 서로 늘어서 접착한, 관강상의 입체조직체(인공혈관)가 수득된 것을 확인했다.
도 29에, 실시예 III-9에서 수득된 인공혈관의 형광현미경 상을 나타낸다.
(실시예 III-10)
(인공 기관)
실시예 III-1에서 제조한 입체조직체의 제작 장치를, 내경 30 mm의 코니칼 튜브(IWAKI&CO.,LTD. 제, 상품 코드 「2345-050」)에 넣어 배지(DMEM＋10%FBS(Bioiogical　Industries 사 제, 로트번호：715929)＋50μg/mL 아스코빈산 2 인산염(Wako Pure Chemical Corporation 제, 상품 번호：196-1252)) 중에 담그었다.
그 후, 비글개 슬관절 유래의 연골 세포를, 제작 장치를 담근 배지와 마찬가지의 배지 중에 혼합해 연골 세포 부유액을 조제했다. 그 후, 60×105개/mL의 연골 세포 부유액을 2 mL 첨가해, 세포를 파종하고, 세포 인큐베이터(37℃, 5% CO2) 중에서, 48시간 배양해, 심봉의 주위에 감긴 연골 세포의 링상의 입체조직체가 수득된 것을 확인했다.
그 후, 배양면을 심봉의 연재 방향 하측에 0.5 mm 이동시켜, 래트 지방조직 유래 간엽계 줄기세포(ADSC)를, 제작 장치를 담근 배지와 마찬가지의 배지 중에 혼합해 조제한 선유아세포 부유액(60×105개/mL)를 2 mL 첨가해, 세포를 재차 파종하고, 세포 인큐베이터(37℃, 5% CO2) 중에서, 48시간 배양했다(2회째의 세포 파종, 배양).
연골 세포, 간엽계 줄기세포를, 교대로 사용했다. 그리고, 6개의 링상의 입체조직체가 서로 늘어서 접착한, 관강상의 입체조직체(인공 기관)가 수득된 것을 확인했다.
도 30에, 실시예 III-10에서 수득된 인공 기관을 나타낸다. 또한 도 30은, 심봉인 스테인리스 튜브를 빼내고, 실리콘 수지 제의 튜브와 바꿔 넣은 후에 촬영한 사진이다.
(실시예 III-11)
(단백질을 주성분으로 하는 입체조직체)
실시예 III-1에서 제조한 입체조직체의 제작 장치를, 내경 30 mm의 코니칼 튜브(IWAKI&CO.,LTD. 제, 상품 코드 「2345-050」)에 넣어 배지(DMEM＋10%FBS(Biological　Industries 사 제, 로트번호：715929)＋50μg/mL 아스코빈산 2 인산염(Wako Pure Chemical Corporation 제, 상품 번호：196-1252)) 중에 담그었다.
그 후, 래트 지방조직 유래 간엽계 줄기세포(ADSC) 세포를, 제작 장치를 담근 배지와 마찬가지의 배지 중에 혼합해 세포 부유액을 조제했다. 그 후, 60×105개/mL의 세포 부유액을 2 mL 첨가해, 세포를 파종하고, 세포 인큐베이터(37℃, 5% CO2) 중에서, 48시간 배양해, 심봉의 주위에 감긴 링상의 입체조직체가 수득된 것을 확인했다.
그 후, 배양면을 심봉의 연재 방향 하측에 0.5 mm 이동시켜, 상기 세포 부유액을 2 mL 더 첨가해, 세포를 재차 파종하고, 세포 인큐베이터(37℃, 5% CO2) 중에서, 48시간 배양했다(2회째의 세포 파종, 배양).
마찬가지로 해서, 세포의 파종, 배양을 계속해 파종과 배양의 반복을 합계 6회 행했다.
그리고, 6개의 링상의 입체조직체가 서로 늘어서 접착한, 관강상의 입체조직체가 수득된 것을 확인했다.
그 후, 수득하는 관강상의 입체조직체를, 도데실황산나트륨 및 에탄올로 처리 후, 3.8% 글루타르 알데히드로 처리함으로써, 입체조직체중의 세포를 사멸시켜, 관강상의 단백질을 주성분으로 하는 입체조직체가 수득된 것을 확인했다.
도 31에, 실시예 III-11에서 수득된 단백질을 주성분으로 하는 입체조직체를 나타낸다.
[[발명(IV)의 실시예]
이하, 실시예에 의해 본 발명(IV)을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 하기의 실시예로 아무런 한정되는 것은 아니다.
하기의 시험에서, 시판의 시약은, 특히 거절이 없는 한 더욱 정제하는 일 없이 이용했다.
(실시예 IV-A1)
(시험 IV-A1) 폴리머의 제조
용량 50 mL의 연질유리제의 투명 바이알병에, 2-N, N-디메틸아미노에틸 메타크릴레이트(DMAEMA) 10.0 g, 및 물 5 mL를 가하고, 자기교반기를 이용해 교반했다. 그리고, 이 혼합물(액체)에 대해서 G1 그레이드의 고순도(순도：99.99995%)의 질소 가스를 10분간 퍼지(유속：2.0L/분) 함으로써, 이 혼합물을 탈산소했다. 또한 이용한 DMAEMA에는, 중합금지제인 메틸 히드로퀴논(MEHQ)이 0.5질량% 포함되어 있었다.
그 후, 이 반응물에 대해서, 환형블랙 형광등(NEC 사 제, 형번：FCL20BL, 18 W)을 이용하여, 22시간 자외선 조사함으로써, 상기 반응물을 중합시켰다. 반응물은, 5시간 후에 점성을 띠고 15시간 후에 고화하여, 중합체가 반응 생성물로서 수득되었다. 이 반응 생성물을 2-프로판올에 용해시켜, 용액을 투석 튜브로 옮겼다. 그리고, 투석을 72시간 실시해, 반응 생성물을 정제했다.
반응 생성물을 포함하는 용액을, 셀룰로오스 혼합에스테르제의 0.2μm 필터(Toyo Roshi Kaisha, Ltd. 제, 형번：25AS020)로 여과하고, 수득된 여액을 동결건조시킴으로써, 온도 응답성(호모) 폴리머가 수득되었다(수량：6.8 g, 전화율：68%). 이 폴리머의 수평균분자량(Mn)을, GPC(Shimadzu Corporation 제, 형번：LC-10ｖp 시리즈)를 이용하여, 폴리에틸렌글리콜(Shodex 사 제, TSK 시리즈)을 표준 물질로서 측정해, Mn=1.0×105g/mol(Mw/Mn=10.0)로 결정했다(실시예 폴리머 1).
상술의 온도 응답성 폴리머의 핵자기공명 스펙트럼(NMR)을, 핵자기공명 장치(Varian 사 제, 형번：Gemini300)를 이용하여, 중수(D2O)를 표준 물질로서 측정했다. 하기에는, 대표적인 피크를 나타낸다.
Figure pct00009
여기서, 주쇄의 메틸기(δ　0.8-1.2)의 프로톤 수(DMAEMA의 호모폴리머의 경우는 모노머 1분자에 대해 3개) A와 측쇄의 디메틸아미노기(δ　2.2-2.4)의 메틸프로톤 수(DMAEMA의 호모폴리머의 경우는 모노머 1분자에 대해 6개로) B로부터, 측쇄가 가지는 아미노기의 관능기 수와 중합반응과 동시에 진행하는 측쇄의 에스테르 결합의 가수분해반응에 의해 생긴 측쇄의 카르복실기의 관능기 수의 비를 산출했다.
그 결과, 상술의 온도 응답성 폴리머의 경우는 94：6이 되었다. 이것은, 양이온성 폴리머와 음이온성 폴리머를 포함하는 2성분 혼합계에서의 이온 복합체라고 말하는 C/A비로 환산하면, C/A비=15.6이 된다.
실시예 폴리머 1의 3% 수용액을 조제해, 이 수용액의 660 nm에서의 흡광도를, 20℃ ~ 40℃의 사이에 측정했다.
그 결과, 20℃ ~ 30℃에서는, 수용액은 투명하고, 흡광도가 거의 0이었지만, 31℃부근에서 수용액 중에 백탁이 보이도록 되어, 32℃에서 흡광도가 급격하게 상승했다. 이것에 의해, 상기 폴리머는, 약 32℃의 담점을 가지는 것을 확인했다.
또한 실시예 폴리머를 37℃까지 승온시키면, 폴리머 수용액은, 양호한 응답성으로, 현탁하고, 그 후, 수용액 전체가 고화했다. 이 고화물을 실온(25℃)으로 유지했는데, 수십 시간 동안, 고화한 상태인 채였다. 그 후, 고화물이 서서히 용해하고, 균질한 수용액으로 변화했다. 고화한 폴리머는 4℃까지 냉각하면, 빠르게 용해했다. 그리고, 상기 승온 및 강온의 조작을 반복해 행해도, 응답성으로 변화는 생기지 않았기 때문에, 폴리머가 가역적으로 상전이를 일으키게 하는 것이 확인되었다.
(시험 IV-A2) 세포구조체의 제조
실시예 IV-A1에서는, 도포·건조에 의해 조제한 배양면을 이용하여, 세포구조체의 제조를 실시했다.
세포배양기로서 폴리스티렌 제의 35 mm 세포 배양 플레이트(IWAKI&CO.,LTD. 제, 형번：3000-035-MYP, 1 웰 당의 바닥 면적：9 ㎠)를 이용했다.
그 다음에, 배양면 상에, 담점 이하로 냉각한 온도 응답성 폴리머의 수용액(농도：15μg/mL) 40μL를, 전면에 걸쳐 도포했다.
그리고, 클린벤치 내에서 방치함으로써, 도포한 온도 응답성 폴리머의 수용액을 건조시켰다.
이렇게 하여, 세포 배양 플레이트의 배양면에 온도 응답성 폴리머로 피복한 피복 영역을 설치했다.
(시험 IV-A3) 제타 전위의 측정
세포 배양 플레이트의 소편에(시험 IV-A2)의 순서와 마찬가지의 순서에 따라서 설치한 피복 영역의 표면 제타 전위를, 제타 전위계(Otsuka Electronics Co., Ltd. 제, 형번：ELSZ) 및 평판 시료용 셀 유닛을 이용해 측정했다.
구체적으로는, 석영 셀의 하면에 소편의 시료를 밀착시켜, 셀 내부에 모니터 입자 현탁액을 주입했다. 여기서, 표준의 모니터 입자로서 폴리스티렌 라텍스(입자 경：약 500 nm)를 히드록시프로필셀룰로오스(Mw=30,000)로 피복한 입자(제타 전위： -5 mV ~ ＋5 mV)를 이용했다. 또한, 용매로서 10 mM의 염화나트륨 수용액을 pH=7, 37℃의 조건하에서 이용했다. 그리고, 제타 전위는, Smoluchowski식을 이용해 산출했다.
비피복의 세포 배양 플레이트의 소편의 표면의 제타 전위는 -68 mV이고, 일반적인 열가소성 수지의 고체 표면의 제타 전위로서 당업자에게 주지의 값이었다.
한편, 온도 응답성 폴리머에 의해 피복된 세포 배양 플레이트의 소편의 표면의 제타 전위는, ＋20 mV였다.
또한 당업자에게 주지한 바와 같이, 현재의 기술에서는, 고체 표면의 제타 전위의 측정치는, ±10% 정도의 편차를 가지는 것이고, 또한, 시료의 조제 공정에서도, 코팅 조작 자체에 편차가 존재하는 것이기 때문에, 상기 제타 전위의 측정치는 어느 정도의 오차가 있을 수 있다.
(시험 IV-A4) 접촉각의 측정
세포 배양 플레이트의 피복 영역에 대한 물의 접촉각을, JIS　R3257에 준거해, 접촉각계(상품명：DMs-400, Kyowa Interface Science Co., Ltd. 제)를 이용해 측정했는데, 70°±10°였다.
(시험 IV-A5) 세포 배양
여기서, GFP로 태그 붙인 래트 피하지방 유래의 간엽계 지방 줄기세포 3.0×105개/mL를, 완전 배지(둘베코 개변 이글 배지(DMEM)＋10% 소 태아 혈청(FBS) 용액, DMEM：Gibco 사 제, 형번：11995-065, FCS：Invitrogen 사 제, 로트번호：928696) 중에 부유시켜, 세포 현탁액을 조제했다.
세포 현탁액을 피펫터로, 0.5μL, 2μL, 4μL, 20μL의 양을 적절히 선택하면서, 100개소에 액적으로서 적하했다(도 32(iｖ) 참조). 액적의 형상은 거의 진원형이고, 액적의 경(徑)은, 0.5μL의 경우에 대해 1 mm, 2μL의 경우에 대해 2 mm, 4μL의 경우에 대해 3 mm, 20μL의 경우에 대해 5.5 mm였다. 액적 사이의 간격은, 어느 액적 사이에 대해서도, 200μm 이상이 되도록 했다. 액적의 바닥 면적의 피복 영역의 면적에 대한 비율은 약 75%였다.
이 파종한 래트 피하지방 유래의 지방 줄기세포를, 37℃, 5% CO2 분위기의 세포 배양 인큐베이터 중에서 8시간 배양했다.
배양 개시부터 0시간 후(적하 직후)에는, 지방 줄기세포가 피복 영역의 전면에 접착하고 있었다(도 32(ｖ) 참조).
배양 개시부터 2시간 후에, 피복 영역의 외연 부근에 위치하는 세포가, 자발적으로 박리하기 시작했다.
배양 개시부터 3시간 후 ~ 6시간 후에 걸쳐, 세포의 자발적인 박리는, 피복 영역의 외연 측으로부터 피복 영역의 중심 측에 향하고, 서서히 진행했다.
배양 개시부터 8시간 후에, 마침내는, 각 피복 영역에서의 배양으로부터, 피복 영역의 수만큼, 스페로이드상의 구조를 가지는 세포구조체를 형성했다(도 32(ｖi) 참조).
형성한 스페로이드상의 세포구조체는, 모두 액적의 양에 따른 소망한 사이즈의, 거의 구형상의 형상이 갖춰진 것이었다.
(실시예 IV-A2 ~ IV-A5)
실시예 IV-A2에 대해서는, 폴리머의 제조의 조건을 조정함으로써, 피복 영역의 표면 제타 전위를＋20 mV에서＋15 mV로 변경한 이외는 상기 실시예 IV-A1와 마찬가지로, 실험을 행했는데, 실시예 IV-A1와 마찬가지로 소망한 사이즈의 형상이 갖춰진 스페로이드상의 구조를 가지는 세포구조체가 수득되었다.
실시예 IV-A3에 대해서는, 폴리머의 제조의 조건을 조정함으로써, 피복 영역의 표면 제타 전위를＋20 mV에서＋35 mV로 변경한 이외는 상기 실시예 IV-A1와 마찬가지로, 실험을 행했는데, 실시예 IV-A1와 마찬가지로 소망한 사이즈의 형상이 갖춰진 스페로이드상의 구조를 가지는 세포구조체가 수득되었다.
실시예 IV-A4에 대해서는, 폴리머의 제조의 조건을 조정함으로써, 피복 영역에 대한 물의 접촉각을 70°±10°에서 65°±7°으로 변경한 이외는 상기 실시예 IV-A1와 마찬가지로, 실험을 행했는데, 실시예 IV-A1와 마찬가지로 소망한 사이즈의 형상이 갖춰진 스페로이드상의 구조를 가지는 세포구조체가 수득되었다.
실시예 IV-A5에 대해서는, 폴리머의 제조의 조건을 조정함으로써, 피복 영역에 대한 물의 접촉각을 70°±10°에서 75°±5°로 변경한 이외는 상기 실시예 IV-A1와 마찬가지로, 실험을 행했는데, 실시예 IV-A1와 마찬가지로 소망한 사이즈의 형상이 갖춰진 스페로이드상의 구조를 가지는 세포구조체가 수득되었다.
(실시예 IV-B1)
(시험 IV-B1) 배양면의 조제
Matsunami Glass Ind.,Ltd.제의 정밀 유리판：MICRO　COVER　GLASS(30 mm×40mm×0.15 mm 두께)를 디에틸에테르로 세정해 건조시켰다. 유리판끼리의 붙여 부착 방지용의 유성 성분이나 이물을 청정 하는 목적으로 행했다.
(시험 IV-B1-1)＜폴리머를 배양면의 전면에 피복했을 경우＞
비닐트리메톡시실란을 4% 아세트산 수용액에 용해해, 종 농도가 0.5% 또는 2.0%가 되도록 조정했다. 이 실란화합물 용액을 유리의 전면에 유연해, 용액 두께가 약 0.1μm가 되도록 액절(液切)하고, 염화칼륨의 포화 용액으로 84%가 되도록 가습한 25℃의 밀폐 디지게이터 중에서 72시간 정치했다. RO수로 세정한 후에 100℃에서 10분간 처리해 수분을 증발시켜, RO수 및 2-프로판올로 더 세정했다. IR의 분석에 의해 실란 커플링제 비닐트리메톡시실란에 유래하는 비닐기가 유리 표면에 고정되어 있는 것이 확인되었다.
2-(N, N-디메틸아미노에틸) 메타크릴레이트를 10 g, RO를 5 g 혼합한 용액을 10분간 질소 가스로 버블링했다. 상기 (1)에서 제작한 비닐기가 도입된 유리판을 100 mm 경(徑) 샬레에 배치해, 질소 가스 버블링에 의해 탈산소한 모노머 수용액 10 mL를 가해 유리판을 침지하고, 내부가 질소 분위기가 되도록 밀폐했다. 샬레의 바닥면으로부터 375 nm의 블랙라이트를 10시간 조사해, 유리판을 RO수, 2-프로파롤로 세정해 건조해, 세포배양기(1)를 수득했다.
시험 IV-B1-1에서 조제한 세포배양기(1)에 대해서, 액적의 양과 액적의 경(徑)의 상관을 조사했다.
공중합체가 고정된 유리판 표면 상에 래트 피하지방 유래의 간엽계 줄기세포 부유액(세포 밀도：3.0×105개/mL, 완전 배지(둘베코 개변 이글 배지(DMEM)＋10% 소 태아 혈청(FBS) 용액, DMEM：Gibco 사 제, 형번：11995-065, FCS：Invitrogen 사 제, 로트번호：928696))을 피펫터로 0.5μL ~ 50μL의 액적으로서 적하해, 바닥면의 투영상으로부터 액적의 직경을 측정했다. 액적의 양과 액적의 경(徑)은, 도 34(A)와 같이, 0.5μL ~ 50μL의 액적 용량의 전 범위에서는 일차 상관은 없었다.
한편, 도 34(B), (C)와 같이, 0.5μL ~ 5.0μL의 범위 및 5.0μL ~ 50μL의 범위로 분리하면, 각각의 영역에서 선형 상관이 확인되어 액적 용량으로 액적의 직경을 제어할 수 있는 것이 시사되었다.
도 34(A) ~ (C)에, 실시예에서 배양면에서의 액적의 양과 액적의 경(徑)의 상관을 조사한 결과를 나타낸다.
(시험 IV-B1-2)＜폴리머를 배양면의 복수 개소에 피복했을 경우＞
비닐트리메톡시실란을 4% 아세트산 수용액에 용해해, 종 농도가 2.0%가 되도록 조정했다. 이 실란 커플링제의 용액을 Matsunami Glass Ind.,Ltd. 제의 정밀 유리판 상에, 0.5μL씩, 액적의 중심부로부터 기산해 1.2 mm ~ 12 mm의 간격을 두고 4열×5행의 20 적을 적하해, 염화칼륨의 포화 용액에서 84%로 가습한 25℃의 디지게이터 중에서 72시간 정치했다. 액적을 캐피러리로 흡인하고, 물 및 메탄올로 세정 후에 건조해, 세포배양기(2)을 수득했다.
시험 IV-B1-1의 경우와 마찬가지로, 그래프트중합을 행했다. IR의 분석에 의해 실란 커플링제 비닐트리메톡시실란 용액을 적하한 액적(도트) 위에만 공중합체가 고정되어 있는 것이 확인되었다.
(시험 IV-B2) 세포구조체의 제조
실시예 IV-B2에서는, 그래프트중합에 의해 조제한 배양면을 이용하여, 세포구조체의 제조를 행했다.
(시험 IV-B2-1)
시험 IV-B1-1에서 제조한 공중합체가 고정된 유리판 표면 상에 래트 피하지방 유래의 간엽계 줄기세포 부유액(세포 밀도：3.0×105개/mL, 완전 배지(둘베코 개변 이글 배지(DMEM)＋10% 소 태아 혈청(FBS) 용액, DMEM：Gibco 사 제, 형번：11995-065, FCS：Invitrogen 사 제, 로트번호：928696))을 피펫터로 0.5μL ~ 2.0μL의 범위에서 4열×5행의 20 적의 액적으로서 적하해, 세포 인큐베이터(SANYO Electric Co., Ltd., MCO-5C)로 24시간 배양했다(37℃, 5% 탄산가스).
개개의 액적 중에서 세포는 단층을 형성해 유리 표면 상에 접착해, 세포 위에 세포가 적재되는 상태는 거의 확인되지 않았다. 액적의 적하로부터 1시간 후에는 전수의 세포가 유리판 상에 접착해 신장하고 있었다. 한층 더 배양을 계속하면 약 9시간 후부터 액적의 외주로부터 중심을 향해 응집이 시작되고, 21시간 후에는 전세포가 1 개소에 집합해 괴가 되어 중심부에서 스페로이드를 형성했다.
유리판을 0.3% 메틸셀룰로오스의 PBS 용액에 침지하면, 모든 스페로이드를 스페로이드 부유액으로서로서 회수 가능했다.
액적과 액적의 사이의 거리가 30μm 이하가 되면 액적끼리 인력이나 공기상에 대한 표면장력의 관계 때문이거나, 서로 융합해, 그 결과, 유리판의 전면에 부유액이 유연한 상태가 되어, 세포 응집의 현상은 여기저기에서 동시에 일어나는 결과가 되었다.
[[발명(V)의 실시예]
이하, 실시예에 의해 본 발명(V)을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 하기의 실시예로 아무런 한정되는 것은 아니다.
하기의 시험에서, 시판의 시약은, 특히 거절이 없는 한 더욱 정제하는 일 없이 이용했다.
(실시예 V-1)
(시험 V-A) 온도 응답성 폴리머의 조제
용량 50 mL의 연질유리제의 투명 바이알병에, 2-N, N-디메틸아미노에틸 메타크릴레이트(DMAEMA) 10.0 g, 및 물 5,000μL를 가하고, 자기교반기를 이용해 교반했다. 그리고, 이 혼합물(액체)에 대해서 G1 그레이드의 고순도(순도：99.99995%)의 질소 가스를 10분간 퍼지(유속：2.0L/분) 함으로써, 이 혼합물을 탈산소했다. 또한 이용한 DMAEMA에는, 중합금지제인 메틸 히드로퀴논(MEHQ)이 0.5 중량% 포함되어 있었다.
그 후, 이 반응물에 대해서, 환형블랙 형광등(NEC 사 제, 형번：FCL20BL, 18 W)을 이용하여, 22시간 자외선 조사함으로써, 상기 반응물을 중합시켰다. 반응물은, 5시간 후에 점성을 띠고 15시간 후에 고화하여, 중합체가 반응 생성물로서 수득되었다. 이 반응 생성물을 2-프로판올에 용해시켜, 용액을 투석 튜브로 옮겼다. 그리고, 투석을 72시간 실시해, 반응 생성물을 정제했다.
반응 생성물을 포함하는 용액을, 셀룰로오스 혼합에스테르제의 0.2μm 필터(Toyo Roshi Kaisha, Ltd. 제, 형번：25AS020)로 여과하고, 수득된 여액을 동결건조시킴으로써, 분자내 이온 복합체형의 온도 응답성 폴리머가 수득되었다(수량：6.8 g, 전화율：68%). 이 폴리머의 수평균분자량(Mn)을, GPC(Shimadzu Corporation 제, 형번：LC-10ｖp 시리즈)를 이용하여, 폴리에틸렌글리콜(Shodex 사 제, TSK 시리즈)을 표준 물질로서 측정해, Mn=100,000(Mw/Mn=10.0)로 결정했다.
온도 응답성 폴리머의 핵자기공명 스펙트럼(NMR)을, 핵자기공명 장치(Varian 사 제, 형번：Gemini300)를 이용하여, 중수(D2O)를 표준 물질로서 측정했다. 하기에는, 실시예 폴리머 V-1에 공통되는 대표적인 피크를 나타낸다.
Figure pct00010
여기서, α 위치에 결합한 메틸기(δ　0.8-1.2)의 프로톤 수(DMAEMA 유닛의 경우도 메타크릴산 유닛의 경우도 3개) A와 측쇄의 에스테르 결합의 산소에 결합하고 있는 에틸기(δ　4.0-4.2)의 메틸프로톤 수(DMAEMA 유닛의 경우는 2개이고, 메타크릴산 유닛의 경우는 0개) B로부터, DMAEMA의 측쇄가 가지는 아미노기의 관능기 수와 메타 아크릴산의 측쇄의 카르복실기의 관능기 수의 비를 산출했다.
그 결과, 수득된 폴리머 V-1의 경우 94：6이 되었다. 이것은, 양이온성 폴리머와 음이온성 폴리머를 포함하는 2성분 혼합계에서의 이온 복합체라고 말하는 C/A비로 환산하면, C/A비=15.6이 된다.
또한, 수득된 온도 응답성 폴리머의 3% 수용액을 조제해, 이 수용액의 660 nm에서의 흡광도를, 20℃ ~ 40℃의 사이에 측정했는데, 약 32℃였다.
(시험 V-B) 제1 피복 영역 및 제2 피복 영역의 준비
세포배양기로서 φ35 mm 플레이트(PrimeSurface(등록상표), SUMILON 사 제)(세포 저흡착성 플레이트)를 이용했다.
상기 플레이트의 배양면 상의 6개소에, 실온 조건하에서, 전술의 시험 V-A에서 조제한 폴리머의 수용액(농도：15ng/μL)을 4.0μL씩 스폿팅 하고, 그 후, 이 수용액을 37℃에서 30분간 건조시키고, 각각 원형의 제1 피복 영역(면적 4.5 ㎟)를 준비했다.
건조 후, 6개소의 원형의 제1 피복 영역 중 하나에서, 제1 피복 영역의 중심을 통과하는 직선 위에 위치해, 제1 피복 영역의 단부에 위치하는 2개소에, 제1 피복 영역과 서로 겹치도록, 피브로넥틴 용액(사람 혈장 유래)(농도：200ng/μL)(BD bioscience 사 제, 로트번호 3353563)를 0.2μL씩 스폿팅 하고, 그 후, 이 용액을 37℃에서 5분간 건조시키고, 각각 원형의 제2 피복 영역(면적 0.8 ㎟)를 준비한다(도 38(a) 참조).
제1 피복 영역의 표면의 제타 전위를, 제타 전위계(Otsuka Electronics Co., Ltd. 제, 형번：ELSZ) 및 평판 시료용 셀 유닛을 이용해 측정했다. 측정에서는, 셀로서는, 석영 셀을 이용해 표준의 모니터 입자로서는, 폴리스티렌 라텍스(입자 경：약 500 nm)를 히드록시프로필셀룰로오스(Mw=30,000)로 피복한 입자(제타 전위： -5 mV ~ ＋5 mV)를 이용해 용매로서 10 mM의 염화나트륨 수용액을 pH=7, 37℃의 조건하에서 이용했다. 제타 전위는, Smoluchowski식에 의해 산출했다.
그 결과, 온도 응답성 폴리머에 의해 피복된 제1 피복 영역의 표면의 제타 전위는, ＋20 mV였다. 또한 당업자에게 주지한 바와 같이, 상기 제타 전위의 측정치는, ±10% 정도의 편차를 가지는 것이다.
세포 배양 플레이트의 제1 피복 영역에 대한 물의 접촉각을, JIS　R3257에 준거해, 접촉각계(상품명：DMs-400, Kyowa Interface Science Co., Ltd. 제)를 이용해 측정했는데, 70°±10°였다.
(시험 V-C) 세포의 파종·배양
상기 시험 V-B에서 준비한 세포배양기를 이용했다.
GFP 재조합 루이스 래트의 지방조직 유래 간엽계 줄기세포(ADSC(Adipose- deriｖed　ｖascular　stromal　cell))를, 배지(둘베코 개변 이글 배지(DMEM)＋10% 소 태아 혈청(FBS)； DMEM：Gibco 사 제, 형번 11965； FBS：Biological Industries Ltd. 제, 로트번호 715929) 중에 부유시키고, 세포 현탁액을 조제했다.
상기 플레이트에, 실온 조건하에서, 세포 밀도 2.5×105개/㎠)로 되도록, 세포 현탁액을 가했다(95% 컨플루언트).
그리고, 이 세포를, 37℃, 5% CO2의 세포 배양 인큐베이터 중에서 2시간 배양했다.
배양 개시부터 2시간 후, 전술의 배지에서 배지 교환을 행해, 사멸한 세포를 제거했다.
도 38(a)에, 시험 V-C에서, 시험 V-B에서 준비한 제1 피복 영역 및 제2 피복 영역에서 GFP 재조합 루이스 래트의 ADSC를 2시간 배양한 후의 상태를, 현미경을 이용해 관찰했을 때의 사진을 나타낸다.
그리고, 세포를, 37℃, 5% CO2의 세포 인큐베이터 중에서 18시간 더 배양했다.
한층 더 18시간의 배양 중, 제1 피복 영역에 접착하고 있는 세포는, 중앙 부분을 향해 응집하고, 한편 제2 피복 영역에 접착한 세포는, 당초의 위치에 계속 접착했다. 파종된 세포의 성숙에 의한 세포간의 네트워크의 결합력이, 세포의 제1 피복 영역에 대한 접착력을 웃돌게 되어, 세포의 응집현상이 생겼다. 이 때, 장축 방향에의 응집·수축은 제한되는 한편, 단축 방향에의 응집·수축이 우선되었다. 최종적으로, 제2 피복 영역에 계속 접착하는 2 개의 세포집단과 이러한 세포집단의 사이를 연결하는 스틱상의 세포집단으로 이루어지는, 직선상의 구조를 가지는 세포구조체를 형성했다.
도 38(b)에, 시험 V-C에서, 시험 V-B에서 준비한 제1 피복 영역 및 제2 피복 영역에서 GFP 재조합 루이스 래트의 ADSC를 20시간 배양한 후의 상태를, 현미경을 이용해 관찰했을 때의 사진을 나타낸다.
또한 도 38(c)에, 도 38(b)에 나타내는 세포구조체를 배율을 낮춰 관찰했을 때의 사진을 나타낸다.
도 38(d)에, 도 38(b)의 파선에 나타내는 세포구조체의 상태를 형광현미경을 이용해 관찰했을 때의 사진을 나타낸다.
시험 V-C에서 수득된 세포구조체 중 스틱상의 세포집단에서는, 세포가 세포구조체의 연재 방향에 따라서 신장된 형상을 이루어, 제2 피복 영역에 계속 접착하는 2개의 세포집단을 잇는 선의 방향에 따른 방향으로의 배향성을 구비하는 것을 알 수 있었다.
(실시예 V-2)
이용하는 세포접착성 물질을, 피브로넥틴 용액으로부터, 라미닌(농도：50ng/μL)(Nippi. Inc. 제) 대신에, 전술의 실시예 V-1의 시험 V-B와 마찬가지의 시험을 행했다.
그리고, 이용하는 세포를, GFP 재조합 루이스 래트의 ADSC로부터, 심근 세포(생후 1일째의 신생 루이스계 래트로부터 정법에 따라서 분리) 대신에, 전술의 실시예 V-1의 시험 V-C와 마찬가지의 시험을 실시했다.
이 경우에서, 전술의 도 38에 나타내는 세포구조체와 마찬가지의 구조를 구비하는 세포구조체가 수득되었다.
Figure pct00011
[[발명(VI)의 실시예]
이하에, 실시예에 기초해 본 발명(VI)을 보다 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이러한 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
(실시예 VI-1)
용량 50 mL의 연질유리제의 투명 바이알병에, 2-N, N-디메틸아미노에틸 메타크릴레이트(DMAEMA) 10.0 g, 및 물 5 mL를 가하고, 자기교반기를 이용해 교반했다. 그리고, 이 혼합물(액체)에 대해서 G1 그레이드의 고순도(순도：99.99995%)의 질소 가스를 10분간 퍼지(유속：2.0L/분) 함으로써, 이 혼합물을 탈산소했다. 또한 이용한 DMAEMA에는, 중합금지제인 메틸 히드로퀴논(MEHQ)이 0.5질량% 포함되어 있었다.
그 후, 이 반응물에 대해서, 환형블랙 형광등(NEC 사 제, 형번：FCL20BL, 18 W)을 이용하여, 22시간 자외선 조사함으로써, 상기 반응물을 중합시켰다. 반응물은, 5시간 후에 점성을 띠고 15시간 후에 고화하여, 중합체가 반응 생성물로서 수득되었다. 이 반응 생성물을 2-프로판올에 용해시켜, 용액을 투석 튜브로 옮겼다. 그리고, 투석을 72시간 행해, 반응 생성물을 정제했다.
반응 생성물을 포함하는 용액을, 셀룰로오스 혼합에스테르제의 0.2μm 필터(Toyo Roshi Kaisha, Ltd. 제, 형번：25AS020)로 여과하고, 수득된 여액을 동결건조시킴으로써, 온도 응답성(호모) 폴리머가 수득되었다(수량：6.8 g, 전화율：68%). 이 폴리머의 수평균분자량(Mn)을, GPC(Shimadzu Corporation 제, 형번：LC-10ｖp 시리즈)를 이용하여, 폴리에틸렌글리콜(Shodex 사 제, TSK 시리즈)을 표준 물질로서 측정해, Mn=1.0×105g/mol(Mw/Mn=10.0)로 결정했다.
상술의 온도 응답성 폴리머의 핵자기공명 스펙트럼(NMR)을, 핵자기공명 장치(Varian 사 제, 형번：Gemini300)를 이용하여, 중수(D2O)를 표준 물질로서 측정했다. 하기에는, 대표적인 피크를 나타낸다.
Figure pct00012
여기서, 주쇄의 메틸기(δ　0.8-1.2)의 프로톤 수(DMAEMA의 호모폴리머의 경우는 모노머 1분자에 대해 3개) A와 측쇄의 디메틸아미노기(δ　2.2-2.4)의 메틸프로톤 수(DMAEMA의 호모폴리머의 경우는 모노머 1분자에 대해 6개로) B로부터, 측쇄가 가지는 아미노기의 관능기 수와 중합반응과 동시에 진행하는 측쇄의 에스테르 결합의 가수분해반응에 의해 생긴 측쇄의 카르복실기의 관능기 수의 비를 산출했다.
그 결과, 상술의 온도 응답성 폴리머의 경우는 94：6이 되었다. 이것은, 양이온성 폴리머와 음이온성 폴리머를 포함하는 2성분 혼합계에서의 이온 복합체라고 말하는 C/A비로 환산하면, C/A비=15.6이 된다.
상술의 온도 응답성 폴리머의 담점을 이하의 방법으로 측정했다.
온도 응답성 폴리머의 3% 수용액을 조제해, 이 수용액의 660 nm에서의 흡광도를, 20 ~ 40℃의 사이에 측정했다.
그 결과, 20 ~ 30℃에서는, 수용액은 투명하고, 흡광도가 거의 0이었지만, 31℃부근에서 수용액 중에 백탁이 보이도록 되어, 32℃에서 흡광도가 급격하게 상승했다. 이것에 의해, 온도 응답성 폴리머는, 약 32℃의 담점을 가지는 것을 확인했다.
또한 온도 응답성 폴리머를 37℃까지 승온시키면, 폴리머 수용액은, 양호한 응답성으로, 현탁하고, 그 후, 수용액 전체가 고화했다. 이 고화물을 실온(25℃)에서 유지했는데, 수십 시간 동안, 고화한 상태인 채였다. 그 후, 고화물이 서서히 용해하고, 균질한 수용액으로 변화했다. 고화한 폴리머는 4℃까지 냉각하면, 빠르게 용해했다. 그리고, 상기 승온 및 강온의 조작을 반복해 행해도, 응답성으로 변화는 생기지 않았기 때문에, 폴리머가 가역적으로 상전이를 일으키게 하는 것이 확인되었다.
상술의 온도 응답성 폴리머를, 순수에 용해하고, 온도 응답성 폴리머 용액(종 농도 6 ng/μL)을 조제했다. 35 mm디쉬(Sumitomo Bakelite Co., Ltd. 제, 품명 「PrimeSurface」(등록상표), MS 9035 X)의 배양면 상의 10개소에, 온도 응답성 폴리머 용액 0.5μL를, 원형 모양에 도포했다.
1개소 근처의 원형의 피복배양면의 직경은, 약 2,000μm이고, 또한, 각 피복배양면간의 거리는, 약 2,000μm였다.
그리고, 인큐베이터(40℃) 중에서 1시간 방치함으로써, 도포한 온도 응답성 폴리머의 수용액을 건조시켜, 복수의 피복배양면을 가지는 피복 세포배양기를 준비했다.
신생 Lewis계 래트 심근 세포 100개에 대해서, GFP 재조합 루이스 래트 지방조직 유래 간엽계 줄기세포(ADSC) 300개의 비율로 혼합한 혼합 세포를, 배지(SkGM(Lonza 주식회사, 형번：CC 3245)＋10%FBS(Gibco 사 제, 로트번호：715929) 중에 혼합해 조제한, 7.2×106개/mL의 혼합 세포용액 5 mL를 피복 세포배양기에 가하고 세포를 파종했다.
그 후, 세포 인큐베이터(37℃, 5% CO2) 중에서, 1시간 배양해, 새로운 배지를 이용해 배지 교환해, 세포 인큐베이터(37℃, 5% CO2) 중에서, 48시간 더 배양하고, 괴상의 세포구조체를 수득했다.
(실시예 VI-2)
신생 Lewis계 래트 심근 세포 100개에 대해서, GFP 재조합 루이스 래트 지방조직 유래 간엽계 줄기세포를 233개의 비율로 혼합한 것 이외, 실시예 VI-1과 마찬가지로 해 괴상의 세포구조체를 수득했다.
(실시예 VI-3)
세포에는, 심근 세포로서의 신생 Lewis계 래트 심근 세포, 간엽계 줄기세포로서의 GFP 재조합 루이스 래트 지방조직 유래 간엽계 줄기세포(ADSC), 면역계 세포로서의 마크로파지의 3종을 사용했다. 마크로파지로서는, 래트 골수 유래의 단구로부터 분화 유도해 사용했다(COSMO BIO CO.,LTD. 제, 골수 단구 배양 키트, 품번：BMM01).
제1단계로서 신생 Lewis계 래트 심근 세포 100개에 대해서, GFP 재조합 루이스 래트 지방조직 유래 간엽계 줄기세포 250개의 비율로 혼합한 세포를 실시예 VI-1과 마찬가지로 해 파종하고, 5시간 후에, 세포가 접착해 단층을 형성한 후에, 배지 교환을 행했다. 이 단층 위에, 신생 Lewis계 래트 심근 세포 100개에 대해서, 래트 유래 마크로파지 5개의 비율로 되도록, 마크로파지를 포함하는 래트 유래 마크로파지 부유액을 가해 정치배양을 계속한 것 이외, 실시예 VI-1으로 마찬가지의 조작을 행했다.
심근 세포와 간엽계 줄기세포로 이루어지는 단층 배양층이 주머니상으로 응집할 때에, 상기 단층 배양층 위에 침강하고 있는 마크로파지는 응집에 말려 들어 1개의 괴상의 세포구조체를 수득했다. 노출한 배양면에 마크로파지는 확인되지 않고, 파종한 마크로파지의 전수가 세포 응집괴 중에 받아들여진 것이 확인되었다.
(비교예 VI-1)
신생 Lewis계 래트 심근 세포 100개에 대해서, GFP 재조합 루이스 래트 지방조직 유래 간엽계 줄기세포를 75개의 비율로 혼합한 것 이외, 실시예 VI-1과 마찬가지로 해 괴상의 세포구조체를 수득했다.
(비교예 VI-2)
GFP 재조합 루이스 래트 지방조직 유래 간엽계 줄기세포를 혼합하지 않고, 신생 Lewis계 래트 심근 세포만으로부터 세포용액을 조제한 것 이외, 실시예 VI-1과 마찬가지로 해 괴상의 세포구조체를 수득했다.
(비교예 VI-3)
신생 Lewis계 래트 심근 세포 100개에 대해서, GFP 재조합 루이스 래트 지방조직 유래 간엽계 줄기세포를 33개의 비율로 혼합한 것 이외, 실시예 VI-1과 마찬가지로 해 괴상의 세포구조체를 수득했다.
(비교예 VI-4)
신생 Lewis계 래트 심근 세포 100개에 대해서, GFP 재조합 루이스 래트 지방조직 유래 간엽계 줄기세포를 25개의 비율로 혼합한 것 이외, 실시예 VI-1과 마찬가지로 해 괴상의 세포구조체를 수득했다.
(비교예 VI-5)
신생 Lewis계 래트 심근 세포 100개에 대해서, GFP 재조합 루이스 래트 지방조직 유래 간엽계 줄기세포를 100개의 비율로 혼합한 것 이외, 실시예 VI-1과 마찬가지로 해 괴상의 세포구조체를 수득했다.
[평가]
(세포구조체의 외관)
실시예, 비교예에서 수득된 괴상의 세포구조체를, 현미경(Nikon Corporation 제, 상품명 「ECLIPES-Ti」)으로 관찰해, 이하의 기준으로 세포의 외관을 평가했다.
○(양호)：10개소 모든 피복배양면에서, 구형의 괴상의 세포구조체가 수득되었다.
△(불량)：10개소의 몇개의 피복배양면에서, 피복배양면에 접착한 세포가 응집하지 않고 단층인 채, 또는 응집하는 부분과 피복배양면으로부터 박리하지 않는 접착부분이 혼재하는 단부가 휘어진 세포구조체의 예가 보였다.
(박동의 유무)
실시예, 비교예에서 수득된 괴상의 세포구조체를, 현미경(Nikon Corporation 제, 상품명 「ECLIPES-Ti」)으로 관찰했다. 그 후, 48시간에 걸쳐서, 관찰을 행했다. 그리고, 이하의 기준으로 박동의 유무를 평가했다.
○(양호)：48시간의 관찰 기간 중, 당초는 박동이 확인되었지만, 그 후 박동이 보이지 않았다.
×(불량)：48시간의 관찰 기간 중, 매회의 관찰에서 박동이 확인되었다.
Figure pct00013
표 5에 나타낸 바와 같이, 실시예의 세포구조체는, 세포구조체 형성 직후는 박동하고 있었지만, 그 후 박동이 보이게 되고, 심 질환 모델로서 사용 가능하다고 판단했다. 한편 비교예의 세포구조체는, 48시간의 관찰 기간에서, 박동이 관찰되어 건강한 심장에 가까운 형태라고 판단했다.
[[발명(VII)의 실시예]
이하에, 실시예에 기초해 본 발명(VII)을 보다 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이러한 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
(실시예 VII-1)
용량 50 mL의 연질유리제의 투명 바이알병에, 2-N, N-디메틸아미노에틸 메타크릴레이트(DMAEMA) 10.0 g, 및 물 5 mL를 가하고, 자기교반기를 이용해 교반했다. 그리고, 이 혼합물(액체)에 대해서 G1 그레이드의 고순도(순도：99.99995%)의 질소 가스를 10분간 퍼지(유속：2.0L/분) 함으로써, 이 혼합물을 탈산소했다. 또한 이용한 DMAEMA에는, 중합금지제인 메틸 히드로퀴논(MEHQ)이 0.5질량% 포함되어 있었다.
그 후, 이 반응물에 대해서, 환형블랙 형광등(NEC 사 제, 형번：FCL20BL, 18 W)을 이용하여, 22시간 자외선 조사함으로써, 상기 반응물을 중합시켰다. 반응물은, 5시간 후에 점성을 띠고 15시간 후에 고화하여, 중합체가 반응 생성물로서 수득되었다. 이 반응 생성물을 2-프로판올에 용해시켜, 용액을 투석 튜브로 옮겼다. 그리고, 투석을 72시간 실시해, 반응 생성물을 정제했다.
반응 생성물을 포함하는 용액을, 셀룰로오스 혼합에스테르제의 0.2μm 필터(Toyo Roshi Kaisha, Ltd. 제, 형번：25AS020)로 여과하고, 수득된 여액을 동결건조시킴으로써, 온도 응답성(호모) 폴리머가 수득되었다(수량：6.8 g, 전화율：68%). 이 폴리머의 수평균분자량(Mn)을, GPC(Shimadzu Corporation 제, 형번：LC-10ｖp 시리즈)를 이용하여, 폴리에틸렌글리콜(Shodex 사 제, TSK 시리즈)을 표준 물질로서 측정해, Mn=1.0×105g/mol(Mw/Mn=10.0)로 결정했다.
상술의 온도 응답성 폴리머의 핵자기공명 스펙트럼(NMR)을, 핵자기공명 장치(Varian 사 제, 형번：Gemini300)를 이용하여, 중수(D2O)를 표준 물질로서 측정했다. 하기에는, 대표적인 피크를 나타낸다.
Figure pct00014
여기서, 주쇄의 메틸기(δ　0.8-1.2)의 프로톤 수(DMAEMA의 호모폴리머의 경우는 모노머 1분자에 대해 3개) A와 측쇄의 디메틸아미노기(δ　2.2-2.4)의 메틸프로톤 수(DMAEMA의 호모폴리머의 경우는 모노머 1분자에 대해 6개로) B로부터, 측쇄가 가지는 아미노기의 관능기 수와 중합반응과 동시에 진행하는 측쇄의 에스테르 결합의 가수분해반응에 의해 생긴 측쇄의 카르복실기의 관능기 수의 비를 산출했다.
그 결과, 상술의 온도 응답성 폴리머의 경우는 94：6이 되었다. 이것은, 양이온성 폴리머와 음이온성 폴리머를 포함하는 2성분 혼합계에서의 이온 복합체라고 말하는 C/A비로 환산하면, C/A비=15.6이 된다.
상술의 온도 응답성 폴리머의 담점을 이하의 방법으로 측정했다.
온도 응답성 폴리머의 3% 수용액을 조제해, 이 수용액의 660 nm에서의 흡광도를, 20 ~ 40℃의 사이에 측정했다.
그 결과, 20 ~ 30℃에서는, 수용액은 투명하고, 흡광도가 거의 0이었지만, 31℃ 부근에서 수용액 중에 백탁이 보이도록 되어, 32℃에서 흡광도가 급격하게 상승했다. 이것에 의해, 온도 응답성 폴리머는, 약 32℃의 담점을 가지는 것을 확인했다.
또한 온도 응답성 폴리머를 37℃까지 승온시키면, 폴리머 수용액은, 양호한 응답성으로, 현탁하고, 그 후, 수용액 전체가 고화했다. 이 고화물을 실온(25℃)으로 유지했는데, 수십 시간 동안, 고화한 상태인 채였다. 그 후, 고화물이 서서히 용해하고, 균질한 수용액으로 변화했다. 고화한 폴리머는 4℃까지 냉각하면, 빠르게 용해했다. 그리고, 상기 승온 및 강온의 조작을 반복해 행해도, 응답성으로 변화는 생기지 않았기 때문에, 폴리머가 가역적으로 상전이를 일으키게 하는 것이 확인되었다.
상술의 온도 응답성 폴리머를, 순수에 용해하고, 온도 응답성 폴리머 용액(종 농도 15 ng/μL)을 조제했다. 35 mm 디쉬(Sumitomo Bakelite Co., Ltd. 제, 품명 「PrimeSurface」(등록상표), MS-9035 X)의 배양면 상의 8개소에, 온도 응답성 폴리머 용액 0.5μL를, 원형상으로 도포했다.
1개소 당의 원형의 피복배양면의 직경은, 약 2,000μm이고, 또한, 각 피복배양면간의 거리는, 약 2,500μm였다.
그리고, 인큐베이터(37℃) 중에서 30분간 방치함으로써, 도포한 온도 응답성 폴리머의 수용액을 건조시켜, 복수의 피복배양면을 가지는 피복 세포배양기를 준비했다.
사람 간암 세포(COSMO BIO CO.,LTD., 품번 「HepG2-500」)를, PKH26　Red　Fluorescent　Cell　Linker　Kit(Sigma 사 제)를 이용하여, 염색했다. 염색한 사람 간암 세포 100개에 대해서, GFP 재조합 루이스 래트 지방조직 유래 간엽계 줄기세포(ADSC) 33개의 비율로 혼합한 혼합 세포를, 배지(DMAEM＋10%FBS(Gibco 사 제, 로트번호：715929) 중에 혼합해 조제한, 3.2×105개/mL의 혼합 세포 부유액 25μL를 피복 세포배양기에 가하고, 혼합 세포를 파종했다.
그 후, 세포 인큐베이터(37℃, 5% CO2) 중에서, 2시간 배양해, 새로운 배지를 이용해 배지 교환해, 한층 더 세포 인큐베이터(37℃, 5% CO2) 중에서, 48시간 더 배양하고, 괴상의 세포구조체를 수득했다.
(실시예 VII-2)
사람 간암 세포 100개에 대해서, GFP 재조합 루이스 래트 지방조직 유래 간엽계 줄기세포를 10개의 비율로 혼합한 것 이외, 실시예 VII-1과 마찬가지로 해 괴상의 세포구조체를 수득했다.
(실시예 VII-3)
사람 간암 세포 100개에 대해서, GFP 재조합 루이스 래트 지방조직 유래 간엽계 줄기세포를 50개의 비율로 혼합한 것 이외, 실시예 VII-1과 마찬가지로 해 괴상의 세포구조체를 수득했다.
(실시예 VII-4)
사람 간암 세포 100개에 대해서, GFP 재조합 루이스 래트 지방조직 유래 간엽계 줄기세포를 33개, 루이스 래트 지방조직 유래의 접착성 지방세포를 33개, 의 비율로 혼합한 것 이외, 실시예 VII-1과 마찬가지로 해 괴상의 세포구조체를 수득했다.
(실시예 VII-5)
세포에는, 간세포로서 실시예 VII-1과 마찬가지로 해 염색한 사람 간암 세포(HepG2), 선유아세포로서 GFP 재조합 루이스 래트 지방조직 유래 간엽계 줄기세포(ADSC), 면역계 세포로서 마크로파지를 사용했다. 마크로파지는, 래트 골수 유래의 단구로부터 분화 유도해 사용했다(COSMO BIO CO.,LTD. 제, 골수 단구 배양 키트, 품번：BMM01).
제1단계로서 사람 간암 세포 100개에 대해서, GFP 재조합 루이스 래트 지방조직 유래 간엽계 줄기세포 25개의 비율로 혼합한 세포를, 실시예 VII-1과 마찬가지로 해 파종하고, 5시간 후에, 세포가 접착해 단층을 형성한 후에, 배지 교환을 행했다. 이 단층 위에, 사람 간암 세포 100개에 대해서, 마크로파지 5개의 비율로 되도록, 마크로파지를 포함하는 마크로파지 부유액을 가해 정치배양을 계속한 것 이외, 실시예 VII-1으로 마찬가지의 조작을 행했다.
간암 세포와 간엽계 줄기세포로 이루어지는 단층 배양층이 주머니상으로 응집할 때에, 상기 단층 배양층 위에 침강하고 있는 마크로파지는 응집에 말려 들어 1개의 괴상의 세포구조체를 수득했다. 노출한 배양면에 마크로파지는 확인되지 않고, 파종한 마크로파지의 전수가 세포 응집괴 중에 받아들여진 것이 확인되었다.
(비교예 VII-1)
사람 간암 세포 100개에 대해서, GFP 재조합 루이스 래트 지방조직 유래 간엽계 줄기세포를 300개의 비율로 혼합한 것 이외, 실시예 VII-1과 마찬가지로 해 괴상의 세포구조체를 수득했다.
(비교예 VII-2)
사람 간암 세포 100개에 대해서, GFP 재조합 루이스 래트 지방조직 유래 간엽계 줄기세포를 100개의 비율로 혼합한 것 이외, 실시예 VII-1과 마찬가지로 해 괴상의 세포구조체를 수득했다.
(비교예 VII-3)
GFP 재조합 루이스 래트 지방조직 유래 간엽계 줄기세포를 혼합하지 않고, 사람 간암 세포만으로부터 세포용액을 조제한 것 이외, 실시예 VII-1과 마찬가지로 해 괴상의 세포구조체를 수득했다.
(비교예 VII-4)
사람 간암 세포 100개에 대해서, GFP 재조합 루이스 래트 지방조직 유래 간엽계 줄기세포를 5개의 비율로 혼합한 것 이외, 실시예 VII-1과 마찬가지로 해 괴상의 세포구조체를 수득했다.
(비교예 VII-5)
사람 간암 세포 100개에 대해서, GFP 재조합 루이스 래트 지방조직 유래 간엽계 줄기세포를 67개의 비율로 혼합한 것 이외, 실시예 VII-1과 마찬가지로 해 괴상의 세포구조체를 수득했다.
[평가]
(세포구조체의 외관)
실시예, 비교예에서 수득된 괴상의 세포구조체(배양 48시간 후)를, 현미경(Nikon Corporation 제, 상품명 「ECLIPES-Ti」)으로 관찰하고, 이하의 기준으로 세포의 외관을 평가했다.
○(양호)：8개소 모든 피복배양면에서, 구형의 괴상의 세포구조체가 수득되었다.
△(불량)：8개소의 몇개의 피복배양면에서, 피복배양면에 접착한 세포가 응집하지 않고 단층인 채, 또는 응집하는 부분과 피복배양면으로부터 박리하지 않는 접착부분이 혼재하는 단부가 휘어진 세포구조체, 의 예가 보였다.
(세포구조체 중의 세포의 형태)
파종, 배양한 세포를, 배양 2시간 후에, 현미경(Nikon Corporation 제, 상품명 「ECLIPES-Ti」)으로 관찰했는데, 피복배양면에 접착하고 있었다. 접착한 세포 중, 간세포의 형태를, 이하의 기준으로 평가했다. 또한 어느 쪽의 예에서도, 파종하는 간세포(피복배양면에 접착하기 전의 간세포)의 형태는, 포석상이었다.
○(양호)：많은 간세포의 형태가 변화해, 방추형의 선유아세포 유사의 형태를 하고 있었다.
×(불량)：간세포의 형태의 변화는 보이지 않았다.
Figure pct00015
표 6에 나타낸 바와 같이, 특정의 비율로 간세포와 선유아세포를 혼합한 실시예의 세포구조체에서는, 간세포의 형태가 포석상으로부터 선유아세포 유사로 변화하고 있었다. 그 때문에, 실시예의 세포구조체에 포함되는 간세포는, 침투성이 보다 높고, 악성도가 높은 암세포로 변화하고 있어, 간부전 모델로서 사용 가능하다고 판단했다. 또한 각 실시예의 세포구조체를 무너뜨려 배양접시에 재파종하고, 형태를 관찰했는데, 간세포는 선유아세포 유사의 형태를 하고 있었다.
한편, 비교예의 세포구조체 중의 간세포의 형태는, 포석상인 채 변화는 보이지 않았다. 또한 비교예의 세포구조체를 무너뜨려 배양접시에 재파종하고, 형태를 관찰했는데, 간세포는 포석상의 형태를 하고 있었다.
본 발명에 의하면, 세포괴, 세포구조체, 또는 입체조직체를 효율 좋게 제조하는 방법을 제공할 수 있다.
특히, 본 발명(I)에 의하면, 관절, 기관, 코 등의 치료에 유용한 연골 세포괴 및 이식 재료를 간편하게 제조할 수 있다. 또한, 본 발명(II)에 의하면, 상피계 세포를 용이하게 배양할 수 있고, 또한, 상피계 세포를 포함하는 세포구조체를 용이하게 제조할 수 있고, 또한, 상피계 세포의 배양 및 그 세포구조체의 제조가 가능하다. 또한, 본 발명(III)에 의하면, 용이하게 링상 또는 관강상 등의 입체조직체를 제작할 수 있다. 또한, 용이하게 링상 또는 관강상 등의 입체조직체를 제작할 수 있다. 또한, 본 발명(IV)에 의하면, 소망한 사이즈의 형상이 갖춰진 스페로이드상의 세포구조체를 간편하게 제조할 수 있다. 또한, 본 발명(V)에 의하면, 세포의 응집 양식을 제어하고, 소망한 형태의 세포구조체를 제조할 수 있다. 또한, 본 발명(VI)에 의하면, 심 질환 모델로서 유용한, 심근 세포와 선유아세포를 포함하는 세포구조체를 용이하게 형성할 수 있다. 또한, 본 발명(VII)에 의하면, 간부전 모델로서 유용한, 간세포와 선유아세포를 포함하는 세포구조체를 용이하게 형성할 수 있다.

Claims (55)

  1. 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물로 피복된 피복배양면에서, 세포괴의 존재하에서, 연골 세포로 분화할 수 있는 세포를 파종하고, 상기 세포괴 및 상기 연골 세포로 분화할 수 있는 세포를 배양함으로써, 연골 세포괴를 조제하는 파종 배양 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는, 연골 세포괴의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 연골 세포로 분화할 수 있는 세포를 파종하고, 이것을 배양함으로써, 상기 세포괴를 조제하는, 연골 세포괴의 제조 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 파종 배양 공정을 복수회 행하는, 연골 세포괴의 제조 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 피복배양면은 세포 비접착성의 벽으로 둘러싸여 있는, 연골 세포괴의 제조 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 피복배양면의 폭을 3 mm 이하로 하고, 상기 벽의 높이를 3 mm 이하로 하는, 연골 세포괴의 제조 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 피복배양면이 단위면적당 가지는 상기 온도 응답성 폴리머 및 온도 응답성 폴리머 조성물의 양을 0.1 ~ 3.0μg/㎠로 하는, 연골 세포괴의 제조 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 파종 배양 공정에서, 상기 연골 세포로 분화할 수 있는 세포를 0.3×104 ~ 10.0×105개/㎠의 세포 밀도로 파종하는, 연골 세포괴의 제조 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 기재된 연골 세포괴의 제조 방법에 의해 제조된 것을 특징으로 하는, 연골 세포괴.
  9. 제8항에 있어서,
    도너츠형인, 연골 세포괴.
  10. 제8항 또는 제9항에 기재된 연골 세포괴의 존재하에서, 간엽계 세포를 파종하고, 상기 연골 세포괴 및 상기 간엽계 세포를 배양함으로써 이식 재료를 조제하는, 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는, 이식 재료의 제조 방법.
  11. 제10항에 기재된 이식 재료의 제조 방법에 의해 제조된 것을 특징으로 하는, 이식 재료.
  12. 제9항에 기재된 연골 세포괴가 관상 구조체의 외표면에 설치되어 있는 것을 특징으로 하는, 복합재.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 관상 구조체의 내부에 심재가 설치되어 있는, 복합재.
  14. 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물을 조제하는 조제 공정,
    상기 온도 응답성 폴리머 또는 상기 온도 응답성 폴리머 조성물로 세포배양기의 배양면의 적어도 일부를 피복하여 피복 영역 A를 형성하고, 피복 영역 A를 가지는 피복 세포배양기를 준비하는 배양기 준비 공정,
    상피계 세포를 상기 피복 세포배양기에 파종하는 파종 공정, 및
    상기 피복 영역 A에 접착한 상기 상피계 세포를 배양하는 배양 공정
    을 포함하고,
    상기 피복 영역 A에서의 상기 온도 응답성 폴리머 또는 상기 온도 응답성 폴리머 조성물의 농도가 0.3 pg/㎟ 이상인 것을 특징으로 하는, 상피계 세포의 배양 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 세포배양기의 배양면의 적어도 일부에 오목부를 가지고 있고, 상기 피복 영역 A 내에 상기 오목부가 있는, 상피계 세포의 배양 방법.
  16. 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물을 조제하는 조제 공정,
    상기 온도 응답성 폴리머 또는 상기 온도 응답성 폴리머 조성물로 세포배양기의 배양면의 적어도 일부를 피복하여 피복 영역 A를 형성하고, 피복 영역 A를 가지는 피복 세포배양기를 준비하는 배양기 준비 공정,
    상피계 세포를 상기 피복 세포배양기에 파종하는 파종 공정, 및
    상기 상피계 세포로부터 괴상의 세포구조체를 형성하고, 상기 피복 영역 A에 접착한 세포구조체를 수득하는 배양 공정
    을 포함하고,
    상기 피복 영역 A에서의 상기 온도 응답성 폴리머 또는 상기 온도 응답성 폴리머 조성물의 농도가 0.3 pg/㎟ 이상인 것을 특징으로 하는, 세포구조체의 제조 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 배양기 준비 공정에서, 상기 온도 응답성 폴리머 또는 상기 온도 응답성 폴리머 조성물로, 세포배양기의 배양면의 적어도 일부로서 상기 피복 영역 A와는 다른 위치에 피복 영역 B를 형성하고,
    상기 피복 영역 B에서의 상기 온도 응답성 폴리머 또는 상기 온도 응답성 폴리머 조성물의 농도가 200 pg/㎟ 미만인, 세포구조체의 제조 방법.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서,
    상기 세포배양기의 배양면의 적어도 일부에 오목부를 가지고 있고, 상기 피복 영역 A 내에 상기 오목부가 있는, 세포구조체의 제조 방법.
  19. 배양면의 적어도 일부에, 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물로 피복된 피복 영역 A를 갖고,
    상기 피복 영역 A에서의 상기 온도 응답성 폴리머 또는 상기 온도 응답성 폴리머 조성물의 농도가 0.3 pg/㎟ 이상인 것을 특징으로 하는, 상피계 세포용 세포배양기.
  20. 제19항에 있어서,
    배양면의 적어도 일부로서, 상기 피복 영역 A와 다른 위치에 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물로 피복된 피복 영역 B를 갖고,
    상기 피복 영역 B에서의 상기 온도 응답성 폴리머 또는 상기 온도 응답성 폴리머 조성물의 농도가 200 pg/㎟ 미만인, 상피계 세포용 세포배양기.
  21. 제19항에 있어서,
    상기 세포배양기의 배양면의 적어도 일부에 오목부를 가지고 있고, 상기 피복 영역 A 내에 상기 오목부가 있는, 상피계 세포용 세포배양기.
  22. 적어도 1개의 관통공을 가지는 배양면과 상기 관통공을 삽통하는 심봉으로 이루어지는 입체조직체의 제작 장치로서,
    상기 배양면에 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물로 피복된 피복배양면을 적어도 1개 포함하고,
    1개의 상기 피복배양면의 내측에 적어도 1개의 상기 관통공을 갖고,
    상기 배양면이 상기 심봉의 연재 방향으로 가동하는 것을 특징으로 하는, 입체조직체의 제작 장치.
  23. 제22항에 있어서,
    복수의 상기 배양면을 갖고,
    1개의 상기 심봉이 상기 복수의 상기 배양면의 상기 관통공을 삽통하고 있는, 입체조직체의 제작 장치.
  24. 제22항 또는 제23항에 기재된 입체조직체의 제작 장치를 이용한 입체조직체의 제작 방법으로서,
    상기 피복배양면 상에 적어도 1종의 세포를 파종하는 파종 공정, 및
    파종한 상기 세포를 배양하여 상기 심봉의 주위에 감긴 링상의 입체조직체를 수득하는 배양 공정
    을 포함하는 것을 특징으로 하는, 입체조직체의 제작 방법.
  25. 제24항에 있어서,
    심봉의 주위에 감긴 링상의 입체조직체가 수득된 후에, 상기 배양면을 상기 심봉의 연재 방향으로 이동시키는 배양면 이동 공정,
    이동 후의 상기 피복배양면 상에 적어도 1종의 세포를 파종하는 파종 공정, 및
    파종한 상기 세포를 배양하여 심봉의 주위에 감긴 링상의 상기 입체조직체에 인접하는, 심봉의 주위에 감긴 링상의 입체조직체를 수득하는 배양 공정
    의 반복을 더 포함하는, 입체조직체의 제작 방법.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서,
    모든 상기 피복배양면에 상기 세포를 파종하고, 파종한 상기 세포를 배양하여 입체조직체를 수득하는, 입체조직체의 제작 방법.
  27. 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 파종 공정에서 파종한 상기 세포를 포함하는 입체조직체를 수득하는, 입체조직체의 제작 방법.
  28. 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 배양 공정 후에, 상기 세포를 제거하고,
    상기 세포로부터 분비된 물질을 포함하는 입체조직체를 수득하는, 입체조직체의 제작 방법.
  29. 제28항에 있어서,
    상기 물질이 단백질인, 입체조직체의 제작 방법.
  30. 배양면에 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물로 피복된 피복 영역을 조제해, 상기 피복 영역에 세포 현탁액의 액적을 형성하고, 상기 액적 중에서 세포 배양을 행하고,
    여기서, 상기 피복 영역의 표면 제타 전위를 0 ~ 50 mV로 하는 것을 특징으로 하는, 세포구조체의 제조 방법.
  31. 제30항에 있어서,
    상기 피복 영역에 대한 물의 접촉각을 50 ~ 90°으로 하는, 세포구조체의 제조 방법.
  32. 제30항 또는 제31항에 있어서,
    상기 배양면에 복수의 상기 피복 영역을 조제하는, 세포구조체의 제조 방법.
  33. 제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 피복 영역에 복수의 상기 액적을 형성하는, 세포구조체의 제조 방법.
  34. 제30항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서,
    각 상기 피복 영역에서, 상기 액적의 바닥 면적을 상기 피복 영역의 면적보다도 작게 하는, 세포구조체의 제조 방법.
  35. 제30항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 액적에 포함되는 세포의 수를 3.0×105개/mL 이하로 하는, 세포구조체의 제조 방법.
  36. 제30항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 액적의 경(徑)을 1μm ~ 8 mm로 하는, 세포구조체의 제조 방법.
  37. 제30항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 액적의 양을 0.5 ~ 50μL로 하는, 세포구조체의 제조 방법.
  38. 세포배양기의 배양면에 온도 응답성 폴리머 및/또는 온도 응답성 폴리머 조성물로 피복된 제1 피복 영역과 상기 제1 피복 영역의 단부에 설치된 세포접착성 물질로 피복된 복수의 제2 피복 영역을 준비하는 준비 공정, 및
    세포를 상기 제1 피복 영역 및 상기 제2 피복 영역에 파종하고 상기 세포를 배양함으로써, 세포구조체를 조제하는 파종 배양 공정
    을 포함하는 것을 특징으로 하는, 세포구조체의 제조 방법.
  39. 제38항에 있어서,
    상기 배양면을, 세포 비접착성으로 하는, 세포구조체의 제조 방법.
  40. 제38항 또는 제39항에 있어서,
    상기 세포접착성 물질을 라미닌, 콜라겐, 피브로넥틴으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종으로 하는, 세포구조체의 제조 방법.
  41. 제38항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 피복 영역 및 상기 제2 피복 영역이 차지하는 영역을, 세포 비접착성의 벽으로 둘러싸는, 세포구조체의 제조 방법.
  42. 제38항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 피복 영역을 소정 방향으로 연장되는 형상으로 하고, 상기 제1 피복 영역의 상기 단부를 상기 소정 방향에 대한 단부로 하는, 세포구조체의 제조 방법.
  43. 제38항 내지 제42항 중 어느 한 항에 기재된 세포구조체의 제조 방법에 의해 제조된 것을 특징으로 하는, 세포구조체.
  44. 배양면에,
    온도 응답성 폴리머 및/또는 온도 응답성 폴리머 조성물로 피복된 제1 피복 영역과
    상기 제1 피복 영역의 단부에 설치된, 세포접착성 물질로 피복된 복수의 제2 피복 영역
    을 가지는 것을 특징으로 하는, 세포배양기.
  45. 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물을 조제하는 조제 공정,
    상기 온도 응답성 폴리머 또는 상기 온도 응답성 폴리머 조성물로 세포배양기의 배양면을 피복하여 피복 세포배양기를 준비하는 배양기 준비 공정,
    심근 세포와 상기 심근 세포 100개에 대해서 200 ~ 300개의 비율의 선유아세포를 상기 피복 세포배양기에 파종하는 파종 공정, 및
    파종한 세포를 배양하여 괴상의 세포구조체를 수득하는 배양 공정
    을 포함하는 것을 특징으로 하는, 세포구조체의 제조 방법.
  46. 제45항에 있어서,
    상기 파종 공정에서 혈관 내피세포를 더 파종하는, 세포구조체의 제조 방법.
  47. 제45항 또는 제46항에 있어서,
    상기 파종 공정 이후이고 상기 세포구조체가 수득되기 전에, 면역계 세포를 상기 피복 세포배양기에 더 첨가하는, 세포구조체의 제조 방법.
  48. 제47항에 있어서,
    상기 면역계 세포는 마크로파지 및/또는 T세포인, 세포구조체의 제조 방법.
  49. 제45항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 온도 응답성 폴리머 또는 상기 온도 응답성 폴리머 조성물로 피복된 부분의 면적이 200 ㎟ 이하인, 세포구조체의 제조 방법.
  50. 온도 응답성 폴리머 또는 온도 응답성 폴리머 조성물을 조제하는 조제 공정,
    상기 온도 응답성 폴리머 또는 상기 온도 응답성 폴리머 조성물로 세포배양기의 배양면을 피복하여 피복 세포배양기를 준비하는 배양기 준비 공정,
    간세포와 상기 간세포 100개에 대해서 10 ~ 50개의 비율의 선유아세포를 상기 피복 세포배양기에 파종하는 파종 공정, 및
    파종한 세포를 배양하여 괴상의 세포구조체를 수득하는 배양 공정
    을 포함하는 것을 특징으로 하는, 세포구조체의 제조 방법.
  51. 제50항에 있어서,
    상기 파종 공정에서 혈관 내피세포를 더 파종하는, 세포구조체의 제조 방법.
  52. 제50항 또는 제51항에 있어서,
    상기 파종 공정에서 지방세포를 더 파종하는, 세포구조체의 제조 방법.
  53. 제52항에 있어서,
    상기 파종 공정에서 상기 간세포 100개에 대해서 상기 지방세포를 10 ~ 50개의 비율로, 그리고 상기 선유아세포 100개에 대해서 상기 지방세포를 100 ~ 500개의 비율로 파종하는, 세포구조체의 제조 방법.
  54. 제50항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 파종 공정 이후이고 상기 세포구조체가 수득되기 전에, 면역계 세포를 상기 피복 세포배양기에 더 첨가하는, 세포구조체의 제조 방법.
  55. 제54항에 있어서,
    상기 면역계 세포는 단구, 과립구, 림프구, 및 마크로파지로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종인, 세포구조체의 제조 방법.
KR1020187021598A 2016-01-29 2017-01-27 세포괴, 세포구조체 및 입체조직체 KR20180103075A (ko)

Applications Claiming Priority (19)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JPJP-P-2016-016459 2016-01-29
JP2016016459A JP2017131198A (ja) 2016-01-29 2016-01-29 軟骨細胞塊及び移植材料の製造方法、軟骨細胞塊及び移植材料並びに複合材
JP2016026293A JP6800436B2 (ja) 2016-02-15 2016-02-15 細胞構造体の製造方法、細胞構造体、細胞培養器
JPJP-P-2016-026293 2016-02-15
JPJP-P-2016-053082 2016-03-16
JP2016053084 2016-03-16
JPJP-P-2016-053081 2016-03-16
JPJP-P-2016-053086 2016-03-16
JP2016053082A JP2017163912A (ja) 2016-03-16 2016-03-16 細胞構造体の製造方法
JP2016053081A JP2017163911A (ja) 2016-03-16 2016-03-16 細胞構造体の製造方法
JPJP-P-2016-053084 2016-03-16
JP2016053086 2016-03-16
JPJP-P-2016-124458 2016-06-23
JP2016124458A JP2017169552A (ja) 2016-03-16 2016-06-23 立体組織体の作製装置、及び立体組織体の作製方法
JP2016148977A JP6780816B2 (ja) 2016-03-16 2016-07-28 上皮系細胞の培養方法、細胞構造体の製造方法、及び上皮系細胞用細胞培養器
JPJP-P-2016-148977 2016-07-28
JPJP-P-2016-162950 2016-08-23
JP2016162950A JP6704197B2 (ja) 2016-08-23 2016-08-23 細胞構造体の製造方法
PCT/JP2017/003879 WO2017131241A1 (ja) 2016-01-29 2017-01-27 細胞塊、細胞構造体及び立体組織体

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20180103075A true KR20180103075A (ko) 2018-09-18

Family

ID=63286992

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020187021598A KR20180103075A (ko) 2016-01-29 2017-01-27 세포괴, 세포구조체 및 입체조직체

Country Status (5)

Country Link
US (1) US11149252B2 (ko)
EP (1) EP3409763A4 (ko)
KR (1) KR20180103075A (ko)
CN (1) CN108699520A (ko)
SG (3) SG10201913270YA (ko)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110292657A (zh) * 2019-08-12 2019-10-01 郑州大学第一附属医院 一种用于组织修复的生物胶囊及其构建方法
KR102228619B1 (ko) * 2019-11-25 2021-03-17 경희대학교 산학협력단 히알루론산 및 폴리에틸렌글리콜을 포함하여 제조된 세포 시트 및 이의 제조방법
DE102019132214B3 (de) * 2019-11-27 2021-04-29 Cellbricks Gmbh Mit biologischen Zellen besiedeltes 3D-Gerüst aus biokompatiblem Polymer und dessen Herstellung
WO2022115800A2 (en) * 2020-11-30 2022-06-02 Torres Lugo Madeline Synthetic matrices for cell culture, methods of making and use thereof

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH05260950A (ja) 1992-03-18 1993-10-12 Sumitomo Bakelite Co Ltd コラーゲンコート細胞培養器具およびその製造方法
JPH0614764A (ja) 1992-06-30 1994-01-25 Sumitomo Bakelite Co Ltd ファイブロネクチンコート細胞培養器具及びその製造方法
JPH08173144A (ja) 1994-12-28 1996-07-09 Sumitomo Bakelite Co Ltd ラミニンコート細胞培養器及びその製造方法
EP1264877B1 (en) * 2000-03-16 2013-10-02 Cellseed Inc. Cell cultivation-support material, method of cocultivation of cells and cocultivated cell sheet obtained therefrom
JP3646162B2 (ja) 2001-07-04 2005-05-11 独立行政法人産業技術総合研究所 軟骨組織の再生用移植体
JP3680067B2 (ja) 2003-04-15 2005-08-10 矢永博子 移植用軟骨細胞の製法
JP4921353B2 (ja) * 2005-02-28 2012-04-25 株式会社セルシード 培養細胞シート、製造方法及びその利用方法
US20100136645A1 (en) 2007-04-17 2010-06-03 Byoung-Hyun Min Method for preparing a cell-derived extracellular matrix scaffold
JP4822012B2 (ja) * 2007-05-22 2011-11-24 大日本印刷株式会社 紐状の心筋細胞集合体を形成するための細胞培養支持体
JP2009050194A (ja) 2007-08-27 2009-03-12 Sumitomo Bakelite Co Ltd 細胞凝集塊形成培養用容器
EP2330182A4 (en) * 2008-09-08 2012-04-25 Univ Tokyo Sci Educ Found SPHEROID COMPOSITE, HYDROGEL CONTAINING SPHEROIDS AND METHODS OF MAKING SAME
US9598668B2 (en) * 2008-10-14 2017-03-21 Cellseed Inc. Temperature-responsive cell culture substrate and method for producing the same
JP2013013368A (ja) 2011-07-04 2013-01-24 Dainippon Printing Co Ltd 治療用細胞フラグメント回収用基材およびそれを用いた治療用細胞フラグメントの製造方法、ならびに、継代用細胞フラグメント回収用基材およびそれを用いた継代用細胞フラグメントの製造方法
JP6202621B2 (ja) 2011-11-20 2017-09-27 学校法人東京女子医科大学 細胞培養用基材及びその製造方法
JP2014027918A (ja) 2012-04-24 2014-02-13 National Cerebral & Cardiovascular Center 細胞構造体の製造方法、及び該方法により製造された細胞構造体
JP6062733B2 (ja) * 2012-04-24 2017-01-18 国立研究開発法人国立循環器病研究センター 細胞培養用組成物及び細胞培養器
JP5746240B2 (ja) 2013-02-26 2015-07-08 国立研究開発法人国立循環器病研究センター 温度応答性ポリマーの製造方法、温度応答性ポリマー、細胞培養器の製造方法、及び細胞培養器
JP2015043892A (ja) 2013-08-28 2015-03-12 独立行政法人国立循環器病研究センター 人工気管、人工気管の生産方法、及び人工気管形成用基材
JP6277684B2 (ja) * 2013-11-18 2018-02-14 大日本印刷株式会社 細胞積層体の製造方法
JP6468714B2 (ja) 2014-03-31 2019-02-13 学校法人東京女子医科大学 培養容器及びそれを利用した複数の積層細胞シートの作製方法
JP6796332B2 (ja) * 2015-06-26 2020-12-09 国立研究開発法人国立循環器病研究センター 細胞培養器、細胞構造体の製造方法
JP6704197B2 (ja) * 2016-08-23 2020-06-03 国立研究開発法人国立循環器病研究センター 細胞構造体の製造方法

Also Published As

Publication number Publication date
SG10201913267YA (en) 2020-02-27
EP3409763A1 (en) 2018-12-05
US20190040359A1 (en) 2019-02-07
SG11201806445UA (en) 2018-08-30
US11149252B2 (en) 2021-10-19
EP3409763A4 (en) 2019-10-30
SG10201913270YA (en) 2020-03-30
CN108699520A (zh) 2018-10-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Yamato et al. Thermo-responsive culture dishes allow the intact harvest of multilayered keratinocyte sheets without dispase by reducing temperature
Tang et al. Recent development of temperature-responsive surfaces and their application for cell sheet engineering
JP7125717B2 (ja) 培養方法
JP6796332B2 (ja) 細胞培養器、細胞構造体の製造方法
WO2018169007A1 (ja) 腫瘍組織を用いた初代がん細胞の３次元培養
US20090041825A1 (en) Cell culture well-plates having inverted colloidal crystal scaffolds
Chen et al. Biomaterial-assisted scalable cell production for cell therapy
KR20140072883A (ko) 시험관내 연구 용도를 위한 조작된 조직, 이의 어레이 및 이의 제조방법
KR20180103075A (ko) 세포괴, 세포구조체 및 입체조직체
JP2010161954A (ja) 生体組織の作製方法
JP6690001B2 (ja) 細胞組織の製造方法、及び多孔フィルム
JP2010161953A (ja) 生体組織の作製方法
CN112292447A (zh) 脐带间充质干细胞及其细胞膜片的制备方法
US11697797B2 (en) Manufacturing method of a cell structure
Akiyama et al. Temperature-responsive polymers for cell culture and tissue engineering applications
Wang et al. Current hydrogel solutions for repairing and regeneration of complex tissues
Kobayashi et al. Design of temperature-responsive cell culture surfaces for cell sheet-based regenerative therapy and 3D tissue fabrication
JP7256818B2 (ja) 心筋細胞のシート化方法
CN108486156A (zh) 一种永生化树鼩小肠上皮细胞系及其构建方法与应用
JP2023021274A (ja) 立体的細胞構造体の製造方法
KR101755041B1 (ko) 패턴화된 세포 배양기판 및 이를 이용한 패턴을 갖는 세포시트 제조방법
WO2021065984A1 (ja) 心筋細胞のシート化方法
JP6558432B2 (ja) 組織の作製方法
Ota et al. Fabrication of scaffold-free mesenchyme tissue bands by cell self-aggregation technique for potential use in tissue regeneration
WO2018225703A1 (ja) 分化誘導細胞の調製方法

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal