JP2017131198A

JP2017131198A - 軟骨細胞塊及び移植材料の製造方法、軟骨細胞塊及び移植材料並びに複合材

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Publication number: JP2017131198A
Application number: JP2016016459A
Authority: JP
Inventors: 中山　泰秀; Yasuhide Nakayama; 泰秀中山; 良輔岩井; Ryosuke Iwai; 根本　泰; Yasushi Nemoto; 泰根本
Original assignee: Bridgestone Corp; National Cerebral and Cardiovascular Center
Current assignee: Bridgestone Corp; National Cerebral and Cardiovascular Center
Priority date: 2016-01-29
Filing date: 2016-01-29
Publication date: 2017-08-03

Abstract

【課題】本発明は、関節や気管の治療に有用な軟骨細胞塊及び移植材料並びに複合材を簡便に製造することを目的とする。
【解決手段】温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物で被覆された被覆培養面において、細胞塊の存在下、軟骨細胞に分化し得る細胞を播種し、細胞塊及び軟骨細胞に分化し得る細胞を培養することによって、軟骨細胞塊を調製する、播種培養工程を含むことを特徴とする、軟骨細胞塊の製造方法、該軟骨細胞塊の製造方法を用いる移植材料の製造方法。
【選択図】図１

Description

本発明は、軟骨細胞塊及び移植材料の製造方法、軟骨細胞塊及び移植材料並びに複合材に関する。

近年、患者のＱＯＬの向上を目的として、オーダーメイド医療の実現が望まれている。オーダーメイド医療では、患者自身の細胞を用いて機能障害や機能欠損に陥った組織や臓器の再生を図る、再生医療が主要な役割を担う。
ここで、再生医療は、患者の組織から採取した細胞を、細胞培養器中で培養し、組織を形成させ、その後、その組織を患者に移植するというオペレーションを必要とする。そのため、細胞を培養して、組織等の細胞構造体を形成させる技術や、細胞構造体をそのままの状態で回収する技術が所望されている。

一般的に、生体外に取り出された細胞は、その遺伝子制御に乱れを生じさせる様々なストレスを受けて、脱分化してしまうことが多く、また、細胞を増殖させるために脱分化させることが必要となる場合も多い。これにより、患者から採取した細胞を、単純な培養条件で培養しても、細胞は元の遺伝子発現状態を維持できないことが多いため、細胞構造体、ひいては組織を形成させることができず、また、その細胞の高度な機能を発揮することができないという問題がある。例えば、一般的なポリスチレン製の細胞培養皿で細胞培養を行った場合には、細胞が単層状の構造を形成するに留まり、高度に分化した細胞に見られる構造、例えば、軟骨細胞が生体内に存在している場合の形状であるペレット状の構造と同様の構造を有する細胞構造体を形成させることは困難であり、また、軟骨細胞に特異的な多くの機能が消失されてしまう。

上記問題に関して、例えば、組織の構造を模倣した立体的構造を構築する細胞培養方法、例えば、スフェロイド培養、クラスター培養、ペレット培養、三次元担体培養等の方法が開発されている。立体的な構造を有する細胞外マトリックスを、細胞培養の足場（スキャホールド）として用いることにより、立体的な構造を有する細胞を作製する細胞培養方法が知られている。

また、近年では、生体組織再生の分野において、無人自動化の細胞培養法、分化制御のための薬剤の発見、ウイルス感染検査方法等の関連技術の完成度が高まっていることを受けて、生体内の構造を模倣する高次的有形構造体を自在に設計する研究が盛んになっている（非特許文献１、２参照）。

特に、培養軟骨の三次元化に関しては，脱分化した軟骨細胞を有形の鋳型に注入して、細胞にＢＭＰ２やｂ−ＦＧＦ等を用いた化学刺激により分化誘導することで、直径１０ｍｍ、厚さ１ｍｍのサイズの軟骨ディスクを調製することに成功した例が知られている。

Ｍ．Ｍａｔｓｕｓａｋｉｅｔａｌ，Ａｄｖ．ＨｅａｌｔｈｃａｒｅＭａｔｅｒ．，２，５３４（２０１３）Ｍ．Ｍａｔｓｕｓａｋｉｅｔａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，４５７，３６３（２０１５）

しかしながら、上記従来の方法により、より大きなサイズの及び／又はより複雑な構造の培養軟骨を調製しようとすると、構造体内部の細胞の壊死を招き、細胞がネクローシスにより死滅することが報告されている。

そこで、本発明は、関節、気管、鼻等の治療に有用な軟骨細胞塊及び移植材料並びに複合材を簡便に製造することを目的とする。

本発明の要旨は以下の通りである。
本発明の軟骨細胞塊の製造方法は、温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物で被覆された被覆培養面において、細胞塊の存在下、軟骨細胞に分化し得る細胞を播種し、前記細胞塊及び前記軟骨細胞に分化し得る細胞を培養することによって、軟骨細胞塊を調製する、播種培養工程を含むことを特徴とする。
ここで、本発明の軟骨細胞塊の製造方法では、前記細胞塊を、前記軟骨細胞に分化し得る細胞を播種し、これを培養することによって、調製することが好ましい。
本発明の軟骨細胞塊の製造方法では、前記播種培養工程を複数回行うことが好ましい。
本発明の軟骨細胞塊の製造方法では、前記被覆培養面は、細胞非接着性の壁で囲まれていることが好ましい。
本発明の軟骨細胞塊の製造方法では、前記被覆培養面の幅を３ｍｍ以下として、前記壁の高さを３ｍｍ以下とすることが好ましい。
本発明の軟骨細胞塊の製造方法では、前記被覆培養面が単位面積当たりに有する前記温度応答性ポリマー及び温度応答性ポリマー組成物の量を、０．１〜３．０μｇ／ｃｍ²とすることが好ましい。
本発明の軟骨細胞塊の製造方法では、前記播種培養工程において、前記軟骨細胞に分化し得る細胞を、０．３×１０⁴〜１０．０×１０⁵個／ｃｍ²の細胞密度で播種することが好ましい。

本発明の軟骨細胞塊は、上記本発明の軟骨細胞塊の製造方法により製造されたことを特徴とする。
ここで、本発明の軟骨細胞塊は、ドーナツ形であることが好ましい。

本発明の移植材料の製造方法は、上記本発明の軟骨細胞塊の存在下、間葉系細胞を播種し、前記軟骨細胞塊及び前記間葉系細胞を培養することによって、移植材料を調製する、工程を含むことを特徴とする。

本発明の移植材料は、本発明の移植材料の製造方法により製造されたことを特徴とする。

本発明の複合材は、上記本発明の軟骨細胞塊が管状構造体の外表面に設けられていることを特徴とする。
ここで、本発明の複合材は、管状構造体の内部に芯材が設けられていることが好ましい。

本発明によれば、関節、気管、鼻等の治療に有用な軟骨細胞塊及び移植材料並びに複合材を簡便に製造することができる。

（ｉ）〜（ｖｉｉｉ）は、本実施形態における一例の軟骨細胞塊の製造方法の概要について示す図である。（ｉ）〜（ｖｉ）は、本実施形態における一例の軟骨細胞塊の製造方法の概要について示す図である。（ｉｖ）における括弧内には、構造物の断面図を示す。準備工程の変形例及びこれに続く播種培養工程の概略を示す図である。（ａ）は、準備工程の第一変形例を示す図であり、（ｂ）は、準備工程の第二変形例を示す図である。本実施形態の移植材料の製造方法の概要について示す図である。本実施形態における別の例の軟骨細胞塊の製造方法の概要について示す図である。（ｉ）〜（ｖ）は、本実施形態における一例の複合材の製造方法の概要について示す図である。試験Ｃ−１（参考例）における、培養開始から２４時間後（１日後）、２日後、６日後、１０日後の細胞構造体の様子を蛍光顕微鏡を用いて観察したときの写真を示す図である。特に、下図は、１０日後の細胞構造体の写真の一部を拡大して示したものである。試験Ｃ−１（参考例）において得られた細胞構造体を短軸方向断面で切断したときの写真を示す図である。試験Ｃ−２における、培養開始から２７時間後、４４時間後、７０時間後、１２２時間後の細胞構造体の様子を蛍光顕微鏡を用いて観察したときの写真を示す図である。上図は、幅２ｍｍのドーナツ形のくり抜きを有する中敷きを用いた場合の細胞構造体の様子を示す図であり、下図は、幅２．５ｍｍのドーナツ形のくり抜きを有する中敷きを用いた場合の細胞構造体の様子を示す図である。試験Ｃ−３における、培養開始から８時間後、２０時間後、３２時間後、４２時間後の細胞構造体の様子を蛍光顕微鏡を用いて観察したときの写真を示す図である。上図は、幅２ｍｍのドーナツ形のくり抜きを有する中敷きを用いた場合の細胞構造体の様子を示す図であり、下図は、幅２．５ｍｍのドーナツ形のくり抜きを有する中敷きを用いた場合の細胞構造体の様子を示す図である。最下図は、４２時間後の細胞構造体の様子を実体顕微鏡を用いて観察したときの写真を示す図である。（ａ）は、試験Ｄにおける培養開始から６日後の複合材の様子を肉眼で観察したときの写真を示す図であり、（ｂ）は、試験Ｄにおける培養開始から２１日後の複合材の様子を肉眼で観察したときの写真を示す図である。試験Ｄにおける培養開始から２１日後の複合材の一部の様子を肉眼で観察したときの写真を拡大して示す図である。試験Ｄにおいて調製された複合材に対してピンセットで操作したときの様子を肉眼で観察したときの写真を示す図である。（ａ）は、無操作時の外周面、（ｂ）は、無操作時の内腔面、（ｃ）は、全体への圧潰時、（ｄ）は、側面の一部への引張時、の様子を示す図である。試験Ｄにおいて調製された複合材をヘマトキシリン・エオジン染色（ＨＥ染色）に供したときの様子を顕微鏡を用いて観察したときの写真を示す図である。（ａ）は、複合材の外観写真を示し、（ｂ）は、（ａ）の線Ａ−Ａに沿う面により切断したときの断面図を示す図であり、（ｃ）及び（ｄ）は、（ｂ）に示す写真を部分拡大したものを示す図である。

発明者らはこれまでに、特定の物性を備え、細胞構造体の製造に極めて有用な、温度応答性ポリマー及び温度応答性ポリマー組成物を開発している。かかるポリマー及び／又はポリマー組成物で細胞培養器の培養面を被覆し、ここに約１００％コンフルエントに相当する数の細胞を播種・培養すると、細胞は被覆物に接着し、その後、被覆培養面上で一気に凝集して、被覆培養面の中央部分で細胞塊を形成する。この現象は、細胞間のネットワークによる収縮が、細胞の被覆培養面への接着を上回り、細胞が被覆培養面から剥離するためと考察されている。
本発明の軟骨細胞塊及び移植材料の製造方法は、この温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物を用いるものである。

以下、図面を参照して、本発明の軟骨細胞塊及び移植材料の製造方法、並びに本発明の軟骨細胞塊及び移植材料の実施形態について、詳細に例示説明する。

（軟骨細胞塊の製造方法）
本発明の実施形態（以下、「本実施形態」ともいう。）の軟骨細胞塊の製造方法は、温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物で被覆された被覆培養面において、細胞塊の存在下、軟骨細胞に分化し得る細胞を播種し、細胞塊及び軟骨細胞に分化し得る細胞を共培養することによって、軟骨細胞塊を調製する、播種培養工程を含む。

好適には、本実施形態の製造方法は、温度応答性ポリマー及び／又は温度応答性ポリマー組成物を調製する、調製工程と、上記温度応答性ポリマー及び／又は上記温度応答性ポリマー組成物で培養面の一部を被覆して、被覆培養面を準備する、準備工程と、上記被覆培養面において、細胞塊の存在下、軟骨細胞に分化し得る細胞を播種し、細胞塊及び軟骨細胞に分化し得る細胞を共培養することによって、軟骨細胞塊を調製する、播種培養工程と、を含む。

図１（ｉ）〜（ｖｉｉｉ）及び図２（ｉ）〜（ｖｉ）に、本実施形態における一例の軟骨細胞塊の製造方法の概要について示す。

以下、本実施形態における一例の軟骨細胞塊の製造方法における各工程の詳細を記載する。

（調製工程）
一例の製造方法では、まず、温度応答性ポリマー及び／又は温度応答性ポリマー組成物を調製する（調製工程）。

本実施形態で用いられる温度応答性ポリマー及び温度応答性ポリマー組成物としては、（Ａ）２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）単位と、アニオン性モノマー単位とを含む温度応答性ポリマー、（Ｂ）Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）単位と、カチオン性モノマー単位と、アニオン性モノマー単位とを含む温度応答性ポリマー、（Ｃ）２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）及び／又はその誘導体の重合体と、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール（トリス）と、核酸、ヘパリン、ヒアルロン酸、デキストラン硫酸、ポリスチレンスルホン酸、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリリン酸、硫酸化多糖類、カードラン及びポリアルギン酸並びにこれらのアルカリ金属塩からなる群から選択される１種以上のアニオン性物質とを含む温度応答性ポリマー組成物等が挙げられる。
ここで、上記（Ａ）としては、例えば、（Ａ−１）ＤＭＡＥＭＡを水存在下で重合する方法により得られる温度応答性ポリマー、（Ａ−２）主としてＤＭＡＥＭＡを含むポリマーブロック（重合鎖α末端）と、主としてＤＭＡＥＭＡとアニオン性モノマーとを含むコポリマーブロック（重合鎖ω末端）とを含む、温度応答性ポリマー等が挙げられる。
本実施形態において、これらは、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

以下、上記（Ａ−１）の温度応答性ポリマー及びその製造方法について記載する。

（温度応答性ポリマーの製造方法）
（Ａ−１）の温度応答性ポリマーの製造方法は、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）を含む混合物を調製する調製工程と、混合物に紫外線を照射する照射工程とを含み、ここで、調製工程において、混合物は重合禁止剤及び水を更に含み、照射工程において、紫外線は不活性雰囲気下において照射される、ことを特徴とする。

（Ａ−１）の温度応答性ポリマーの製造方法では、まず、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）を含む混合物を調製する（調製工程）。ここで、混合物は、重合禁止剤及び水を更に含む。

２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）としては、市販品を用いることができる。重合禁止剤としては、メチルヒドロキノン（ＭＥＨＱ）、ヒドロキノン、ｐ−ベンゾキノリン、Ｎ，Ｎ−ジエチルヒドロキシルアミン、Ｎ−ｎｉｔｒｏｓｏ−Ｎ−ｐｈｅｎｙｌｈｙｄｒｏｘｙｌａｍｉｎｅ（Ｃｕｐｆｅｒｒｏｎ）、ｔ−ブチルハイドロキノン、等が挙げられる。また、市販のＤＭＡＥＭＡに含まれるＭＥＨＱ等をそのまま用いてもよい。水としては、超純水が挙げられる。

重合禁止剤の上記混合物に対する重量割合は、０．０１〜１．５％であることが好ましく、０．１〜０．５％であることが更に好ましい。上記範囲とすれば、ラジカル重合反応の暴走を抑制して、制御できない架橋を低減することができ、製造される温度応答性ポリマーの溶媒に対する溶解性を確保することができる。
水の上記混合物に対する重量割合は、１．０〜５０％であることが好ましく、９．０〜３３％であることが更に好ましい。上記範囲とすれば、側鎖の加水分解反応の反応速度と、重合するポリマー鎖の成長反応の反応速度とを、バランスよく調和させることができる。これにより、側鎖が加水分解されたＤＭＡＥＭＡに対する、側鎖が加水分解されていないＤＭＡＥＭＡの割合（共重合割合）が１．０〜２０程度の温度応答性ポリマーを得ることができる。

次いで、（Ａ−１）の温度応答性ポリマーの製造方法では、混合物に紫外線を照射する（照射工程）。ここで、紫外線は、不活性雰囲気下において、照射される。ＤＭＡＥＭＡは、紫外線の照射により、ラジカル重合して、ポリマーとなる。
この工程では、例えば、透明な密封バイアルに、上記混合物を加え、不活性ガスをバブリングすることによってバイアル内を不活性雰囲気とした後に、バイアルの外部から紫外線照射装置を用いて紫外線を照射する。

紫外線の波長としては、２１０〜６００ｎｍであることが好ましく、３６０〜３８０ｎｍであることが更に好ましい。上記範囲とすれば、効率よく重合反応を進行させることができ、所期の共重合割合を有する高分子材料を安定的に得ることができる。また、製造したポリマー材料が着色することを防ぐこともできる。
不活性ガスとしては、窒素、アルゴン、ヘリウム、ネオン等が挙げられる。

反応条件に関して、温度条件としては、１５〜５０℃であることが好ましく、２０〜３０℃であることが更に好ましい。上記範囲とすれば、熱による開始反応を抑制し、光照射による開始反応を優先的に進行させることができる。また、加水分解反応の反応速度をポリマー鎖の成長反応の反応速度に対してバランスのよいものにすることができる。
反応時間としては、７〜２４時間であることが好ましく、１７〜２１時間であることが更に好ましい。上記範囲とすれば、（Ａ−１）の温度応答性ポリマーを高収率で得ることができ、また、光分解反応や不要な架橋反応を抑制しながらラジカル重合を行うことができる。

なお、調製工程において混合物が調製され終えてから、照射工程において紫外線の照射が開始されるまでの時間は、１０分〜１時間であることが好ましい。

混合物を加えたバイアルの内部の気体を置換して、バイアル内を不活性雰囲気とする際には、１０分程度の時間を要する。そのため、上記時間を１０分未満とすると、ラジカル重合に必要となる不活性雰囲気が得られない虞がある。また、混合物中では、ＤＭＡＥＭＡの加水分解反応が、紫外線の照射が開始される前に開始される。そのため、上記時間を１時間超とすると、ラジカル重合反応に不活性なメタクリル酸が混合物中に多数生じてしまう。

（Ａ−１）の温度応答性ポリマーの製造方法では、混合物に水が含まれるため、ＤＭＡＥＭＡのラジカル重合反応と、ポリ２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＰＤＭＡＥＭＡ）の側鎖のエステル結合の加水分解反応とを、拮抗させることができる。
この拮抗により、得られる生成物は、式（Ｉ）で表される繰り返し単位（Ａ）
、及び式（ＩＩ）で表される繰り返し単位（Ｂ）
を含むポリマーとなる。
そのため、ポリマーが有するカチオン性官能基、すなわち、ジメチルアミノ基と、ポリマーが有するアニオン性官能基、すなわち、側鎖のエステル結合が加水分解されてできたカルボキシル基の両方を、バランスよく備えることができる。そして、（Ａ−１）の温度応答性ポリマーの製造方法によれば、カチオン性官能基及びアニオン性官能基を有する、ポリ（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート）由来のポリマーを、少ない工程で簡便に製造することができる。

なお、（Ａ−１）の温度応答性ポリマーの製造方法と同一の製造方法ではなくとも、ＤＭＡＥＭＡ、重合禁止剤、及び水が、紫外線照射時に反応系中に共存していれば、本発明の温度応答性ポリマーの製造方法の上記効果と同様の効果を得ることができる。
例えば、ＤＭＡＥＭＡ及び重合禁止剤を含む混合物と、水とを別々に準備し、次いで、混合物と水とに不活性ガスをバブリングし、その後、混合物と水とを不活性雰囲気下で混合すると同時に紫外線を照射するという、温度応答性ポリマーの製造方法も、（Ａ−１）の温度応答性ポリマーに含めることができる。

（温度応答性ポリマー）
（Ａ−１）の温度応答性ポリマーは、上記（Ａ−１）の製造方法により製造される。

ここで、（Ａ−１）の温度応答性ポリマーとしては、数平均分子量（Ｍｎ）が、１０〜５００ｋＤａである分子が好ましい。また、重量平均分子量（Ｍｗ）と数平均分子量（Ｍｎ）との比（Ｍｗ／Ｍｎ）は、１．１〜１０．０である分子が好ましい。
（Ａ−１）の温度応答性ポリマーの分子量は、紫外線の照射時間及び照射強度の条件により、適宜調整することができる。

（Ａ−１）の温度応答性ポリマーによれば、曇点を、例えば室温（２５℃）以下に、低下させることができる。

上記（Ａ−１）の温度応答性ポリマーでは、曇点以上の温度で形成された温度応答性ポリマーの不溶化物が、室温（約２５℃）条件下で再溶解するまでの時間が顕著に遅延する。これは、得られた（Ａ−１）の温度応答性ポリマーは、分子内にカチオン性官能基とアニオン性官能基とが存在するため、高い自己凝集性を有するためであると推定される。

また、この（Ａ−１）の温度応答性ポリマーを用いて、後述するように、培養面にこの温度応答性ポリマーが被覆されている細胞培養器を調製することができる。

更に、（Ａ−１）の温度応答性ポリマーによれば、後述するように、細胞を適切な培養条件で培養することにより、管腔状（チューブ状）、塊状（ペレット状）等の構造を有する細胞構造体を形成させることができる。

（Ａ−１）の温度応答性ポリマーが有する、カチオン性官能基（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ基）の官能基数と、アニオン性官能基（カルボキシル基）の官能基数との比（Ｃ／Ａ比）は、０．５〜３２であることが好ましく、４〜１６であることが更に好ましい。

Ｃ／Ａ比を上記範囲とすれば、曇点を低減させるという上記効果が得られやすい。上記Ｃ／Ａ比を有する温度応答性ポリマーでは、上記温度応答性ポリマー中でカチオン性官能基とアニオン性官能基とが、イオン結合的に分子間及び／又は分子内の凝集に作用して、温度応答性ポリマーの凝集力が強くなった結果であると推測される。

また、Ｃ／Ａ比を上記範囲とすれば、上記温度応答性ポリマー中の正電荷と負電荷とのバランスを特に好適にして、正電荷による細胞傷害性を抑制することができ、また、上記温度応答性ポリマーの親水性と疎水性とのバランスを特に好適にして、細胞の遊走や配向を生じやすくすることができるものと推定される。

以下、上記（Ａ−２）の温度応答性ポリマー及びその製造方法について記載する。

（温度応答性ポリマーの製造方法）
（Ａ−２）の温度応答性ポリマーの製造方法は、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）を含む第一混合物に紫外線を照射する第一重合工程と、第一重合工程における重合物の数平均分子量が所定値以上となった時点で、第一混合物にアニオン性モノマーを添加して第二混合物を調製する添加工程と、第二混合物に紫外線を照射する第二重合工程と、を含むことを特徴とする。

（Ａ−２）の温度応答性ポリマーの製造方法では、まず、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）を含む第一混合物に紫外線を照射する（第一重合工程）。
ここで、第一混合物は、ＤＭＡＥＭＡ以外に、任意選択的に、例えば、他のモノマー、溶媒等を含んでよい。
また、紫外線は、不活性雰囲気下において、照射されてよい。

ＤＭＡＥＭＡとしては、市販品としてよい。
第一混合物に含まれ得る他のモノマーとしては、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、ポリエチレングリコール側鎖を有するアクリル酸やメタクリル酸のエステル、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリルアミド等が挙げられ、特に、イオンバランスの調整を安定的に行うことを可能にする観点から、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、ポリエチレングリコール側鎖を有するアクリル酸やメタクリル酸のエステル、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドが好ましい。これらは、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。ここで、他のモノマーの使用量のＤＭＡＥＭＡの使用量に対する割合（モル割合）は、０．００１〜１とすることが好ましく、０．０１〜０．５とすることが更に好ましい。

溶媒としては、例えば、トルエン、ベンゼン、クロロホルム、メタノール、エタノール等が挙げられ、特に、ＤＭＡＥＭＡのエステル結合に対して不活性であるため、トルエン、ベンゼンが好ましい。これらは、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

この工程では、例えば、透明な密封バイアルに、上記第一混合物を加え、不活性ガスをバブリングすることによってバイアル内を不活性雰囲気とした後に、バイアルの外部から紫外線照射装置を用いて紫外線を照射する。

紫外線の波長としては、２１０〜６００ｎｍであることが好ましく、３６０〜３８０ｎｍであることが更に好ましい。上記範囲とすれば、効率よく重合反応を進行させることができ、所期の共重合割合を有する高分子材料を安定的に得ることができる。また、製造したポリマー材料が着色することを防ぐこともできる。
紫外線の照射強度としては、０．０１〜５０ｍＷ／ｃｍ²であることが好ましく、０．１〜５ｍＷ／ｃｍ²であることが更に好ましい。上記範囲とすれば、無用な化学結合の切断等による分解を抑制しつつ、安定的に、適切な速度（時間）で重合反応を進行させることができる。
不活性ガスとしては、窒素、アルゴン、ヘリウム、ネオン等が挙げられる。

温度条件としては、１０〜４０℃あることが好ましく、２０〜３０℃あることが更に好ましい。上記範囲とすれば、通常の実験室の室温において反応を行うことができ、また、光とは別の手段（加熱等）により反応を抑制することが可能となる。
反応時間としては、１０分〜４８時間であることが好ましく、６０分〜２４時間であることが更に好ましい。

この工程において、ＤＭＡＥＭＡは、紫外線の照射により、ラジカル重合して、ポリマー（ポリ（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート）（ＰＤＭＡＥＭＡ））となり、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートを含むホモポリマーブロックが形成される。他のモノマーも用いた場合には、ＤＭＡＥＭＡと他のモノマーとを含むポリマーブロックが形成される。

次いで、（Ａ−２）の温度応答性ポリマーの製造方法では、第一重合工程における重合物（具体的には、ポリマー化した２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート）の数平均分子量が所定値以上となった時点で、第一混合物にアニオン性モノマーを添加して第二混合物を調製する（添加工程）。
ここで、第二混合物は、第一重合工程後の第一混合物、及びアニオン性モノマー以外に、例えば、他のモノマー、前述の第一混合物に含まれ得る溶媒（トルエン、ベンゼン、メタノール等）等を含んでよい。
また、アニオン性モノマーは、不活性雰囲気下において、添加されてよい。

アニオン性モノマーとしては、例えば、アクリル酸、メタクリル酸、側鎖にカルボキシル基、スルホン酸基、リン酸基を有するビニル誘導体等が挙げられ、特に、化学的安定性の観点から、アクリル酸、メタクリル酸が好ましい。
これらは、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

第二混合物に含まれ得る他のモノマーとしては、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、ポリエチレングリコール側鎖を有するアクリル酸やメタクリル酸のエステル、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリルアミド等が挙げられ、特に、電気的に中性であり、且つ親水性である、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドが好ましい。これらは、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。ここで、他のモノマーの使用量のＤＭＡＥＭＡの使用量に対する割合（モル）は、０．０１〜１０とすることが好ましく、０．１〜５とすることが更に好ましい。

この工程では、例えば、バイアルに不活性ガスをフローさせることによってバイアル内を不活性雰囲気に保ちながら、上記第二混合物を添加する。

数平均分子量の所定値は、曇点低減の効果を十分に得る観点から、好適には５，０００であり、更に好適には２０，０００であり、特に好適には１００，０００である。
なお、第一重合工程後の第一混合物中におけるポリマー化したＰＤＭＡＥＭＡの数平均分子量は、所定の時点で重合系から少量の反応混合物を採取して、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）や光散乱法（ＳＬＳ）等の当業者に周知の方法により、測定することができる。

この工程において、重合中のＤＭＡＥＭＡを含むホモポリマーに加えて、アニオン性モノマーも重合系に含められることとなり、バイアル内の重合系が、ＤＭＡＥＭＡの単独重合系から、ＤＭＡＥＭＡとアニオン性モノマーとの共重合系に、変わることとなる。

そして、（Ａ−２）の温度応答性ポリマーの製造方法では、第二混合物に紫外線を照射する（第二重合工程）。
ここで、紫外線は、不活性雰囲気下において、照射されてよい。

この工程では、例えば、第二混合物を添加した後のバイアルの外部から紫外線照射装置を用いて紫外線を照射する。

第二重合工程における、紫外線の波長、紫外線の照射強度、用いる不活性ガス、反応温度、反応時間等の諸条件は、第一重合工程における条件と同様としてよい。

この工程において、ＤＭＡＥＭＡとアニオン性モノマーとが、紫外線の照射により、ラジカル重合して、第一重合工程において形成したＤＭＡＥＭＡを含むホモポリマーブロックの重合鎖α末端に連続する形態で、ＤＭＡＥＭＡとアニオン性モノマーとを含むコポリマーブロックが形成される。他のモノマーも用いた場合には、ＤＭＡＥＭＡとアニオン性モノマーと他のモノマーとを含むコポリマーブロックが形成される。

上記の通り、ＤＭＡＥＭＡを含むホモポリマーブロックと、ＤＭＡＥＭＡとアニオン性モノマーとのコポリマーブロックとを含む温度応答性ポリマーが得られる。

なお、（Ａ−２）の製造方法では、当業者に理解される通り、種々の分子量及び分子構造を有するポリマーの混合物が生成するところ、ＤＭＡＥＭＡを含むホモポリマーブロックと、ＤＭＡＥＭＡとアニオン性モノマーとのコポリマーブロックとを含む温度応答性ポリマーを主成分として得る観点から、第一重合工程、添加工程、及び第二重合工程に亘って、同一の条件下で重合を行うことが好ましい。

（温度応答性ポリマー）
（Ａ−２）の温度応答性ポリマーは、上記（Ａ−２）の製造方法により製造される。

（Ａ−２）の温度応答性ポリマーは、主として２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートを含み、任意選択的にジメチルアクリルアミド、ポリエチレングリコール側鎖を有するアクリル酸やメタクリル酸等の親水性モノマー等の他のモノマー単位を含むポリマーブロック（重合鎖α末端）と、主として２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートとアニオン性モノマー（重合鎖ω末端）とを含み、任意選択的に他のモノマー単位を含むコポリマーブロックとを含む。
好適には、（Ａ−２）の温度応答性ポリマーは、ＤＭＡＥＭＡのホモポリマーブロックと、ＤＭＡＥＭＡとアニオン性モノマーとのコポリマーブロックとを含み、更に好適には、これらブロックからなる。

ここで、（Ａ−２）の温度応答性ポリマーとしては、重合鎖α末端のポリマーブロック（例えば、ＤＭＡＥＭＡのホモポリマーブロック）の数平均分子量が５０００Ｄａ以上であることが好ましく、２００００Ｄａ以上であることが更に好ましい。

（Ａ−２）の温度応答性ポリマーとしては、数平均分子量（Ｍｎ）が、１０〜５００ｋＤａである分子が好ましい。また、重量平均分子量（Ｍｗ）と数平均分子量（Ｍｎ）との比（Ｍｗ／Ｍｎ）は、１．１〜１０．０である分子が好ましい。
温度応答性ポリマーの分子量は、紫外線の照射時間及び照射強度の条件により、適宜調整することができる。

（Ａ−２）の温度応答性ポリマーによれば、曇点を、例えば室温（２５℃）以下に、低下させることができる。

上記（Ａ−２）の温度応答性ポリマーでは、曇点以上の温度で形成された温度応答性ポリマーの不溶化物が、室温（約２５℃）条件下で再溶解するまでの時間が顕著に遅延する。これは、得られた温度応答性ポリマーは、分子内にカチオン性官能基とアニオン性官能基とが存在するため、高い自己凝集性を有するためであると推定される。

特に、（Ａ−２）の温度応答性ポリマーは、重合鎖α末端に、高分子量（例えば、５０００Ｄａ以上）を有するＤＭＡＥＭＡのホモポリマーブロックを備えるため、ＤＭＡＥＭＡの側鎖の温度依存的なグロビュール転移が生じやすく、曇点を効果的に低減することが可能となると考えられる。

また、この温度応答性ポリマーを用いて、後述するように、培養面にこの温度応答性ポリマーを被覆してなる細胞培養器を調製することができる。

更に、（Ａ−２）の温度応答性ポリマーによれば、後述するように、細胞を適切な培養条件で培養することにより、管腔状（チューブ状）や塊状（ペレット状）等の構造を有する細胞構造体を形成させることができる。

（Ａ−２）の温度応答性ポリマーが有する、カチオン性官能基（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ基）の官能基数と、アニオン性官能基（カルボキシル基）の官能基数との比（Ｃ／Ａ比）は、０．５〜３２であることが好ましく、４〜１６であることが更に好ましい。

以下、上記（Ｂ）の温度応答性ポリマー及びその製造方法について記載する。

（温度応答性ポリマーの製造方法）
（Ｂ）の温度応答性ポリマーの製造方法は、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）（以下、「モノマー（Ａ）」ともいう。）と、カチオン性モノマー（以下、「モノマー（Ｂ）」ともいう。）と、アニオン性モノマー（以下、「モノマー（Ｃ）」ともいう。）とを重合させるものである。任意選択的に、上記３種類のモノマーにこれら以外の他のモノマーを加えて重合させてよい。

Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）としては、市販品としてよい。

カチオン性モノマーとしては、カチオン性官能基を有するモノマーが挙げられ、カチオン性官能基としては、第１級〜第４級アミノ基等のアミノ基、グアニジン基等が挙げられ、特に、化学的安定性、低細胞傷害性、滅菌安定性、強陽電荷性の観点から、第３級アミノ基が好ましい。
より具体的には、カチオン性モノマーとしては、生理活性物質を担持したり、アルカリ性条件下においたりしても、安定性が高いものが好ましく、例えば、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピル）−（メタ）アクリルアミド、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピル）−（メタ）アクリレート、アミノスチレン、２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）−（メタ）アクリルアミド、２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）−（メタ）アクリレート等が挙げられる。
これらの中で、特に、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピル）アクリルアミドは、高い陽電荷強度を有することから、アニオン性物質の担持を容易にするため、好ましい。
また、アミノスチレンは、高い陽電荷強度を有することから、アニオン性物質の担持を容易にすると共に、分子内の芳香環が水溶液中において他の物質の疎水性構造と相互作用することから、担持可能なアニオン性物質のバリエーションを広げるため、好ましい。
更に、２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）−メタクリルアミドは、中性域のｐＨで微弱な陽電荷を有し、且つ、水への溶解性が温度に影響されないことから、一度担持したアニオン性物質の放出を容易にするため、好ましい。
これらは、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

アニオン性モノマーとしては、アニオン性官能基を有するモノマーが挙げられ、アニオン性官能基としては、カルボン酸基、スルホン酸基、硫酸基、リン酸基、ボロン酸基等が挙げられ、特に、化学的安定性、細胞親和性、高い精製度の観点から、カルボン酸基、スルホン酸基、リン酸基が好ましい。
より具体的には、アクリル酸、メタクリル酸、ビニル安息香酸、等が挙げられ、特に、化学的安定性、細胞親和性の観点から、メタクリル酸、ビニル安息香酸が好ましい。
これらは、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

他のモノマーとしては、例えば、ジメチルアクリルアミド、ポリエチレングリコール側鎖を有するアクリル酸やメタクリル酸等の中性の親水性モノマー等が挙げられる。
これらは、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
他のモノマーは、電荷以外の親水性・疎水性のバランスの調整に使用可能であり、バリエーションを広げることが可能となる。

ここで、（Ｂ）の温度応答性ポリマーの製造方法におけるＮＩＰＡＭの使用量、カチオン性モノマーの使用量、他のモノマーの使用量それぞれの、モノマー（Ａ）〜（Ｃ）の合計の使用量に対する割合（モル）は、モノマーの重合反応における反応性を考慮して、所望のモノマー成分の割合を得られるよう、当業者が適宜調整することができる。

ここで、重合方法としては、ラジカル重合、イオン重合等が挙げられる。
ラジカル重合としては、リビングラジカル重合が好ましく、リビングラジカル重合としては、可逆的付加開裂連鎖移動（ＲＡＦＴ）重合、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）、イニファーター重合等が挙げられ、イニファーター重合が好ましい。
イオン重合としては、リビングアニオン重合が好ましい。

（Ｂ）の温度応答性ポリマーの製造方法の一例は、ラジカル重合を用いる方法である。
この製造方法の一例は、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）を含む第一混合物に紫外線を照射する第一重合工程と、第一混合物に、カチオン性モノマーとアニオン性モノマーとを添加して第二混合物を調製する添加工程と、第二混合物に紫外線を照射する第二重合工程と、を含む。

この製造方法の一例では、まず、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）を含む第一混合物に紫外線を照射する（第一重合工程）。
ここで、第一混合物は、ＤＭＡＥＭＡ以外に、任意選択的に、例えば、他のモノマー、溶媒、連鎖移動剤、安定剤、界面活性剤等を含んでよい。
また、紫外線は、不活性雰囲気下において、照射されてよい。

溶媒としては、例えば、ベンゼン、トルエン、クロロホルム、メタノール、水、等が挙げられ、特に、溶解力の点、及び重合に不活性である点から、ベンゼン、トルエンが好ましい。これらは、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

紫外線の波長としては、２１０〜６００ｎｍであることが好ましく、３６０〜３８０ｎｍであることが更に好ましい。上記範囲とすれば、効率よく重合反応を進行させることができ、所期の共重合割合を有する高分子材料を安定的に得ることができる。また、製造したポリマー材料が着色することを防ぐこともできる。
紫外線の照射強度としては、０．０１〜５０ｍＷ／ｃｍ²であることが好ましく、０．１〜５ｍＷ／ｃｍ²であることが更に好ましい。
不活性ガスとしては、窒素、アルゴン、ヘリウム、ネオン等が挙げられる。

温度条件としては、１０〜４０℃あることが好ましく、２０〜３０℃あることが更に好ましい。上記範囲とすれば、通常の実験室の室温において重合反応を行うことを可能とすることができ、また、光照射という手段とは別の加熱という手段での反応制御を可能とすることもできる。
反応時間としては、反応時間としては、１０分〜４８時間であることが好ましく、６０分〜２４時間であることが更に好ましい。

この工程において、ＮＩＰＡＭは、紫外線の照射により、ラジカル重合して、ポリマー（ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＰＮＩＰＡＭ））となり、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドを含むホモポリマーブロックが形成される。他のモノマーも用いた場合には、ＮＩＰＡＭと他のモノマーとを含むポリマーブロックが形成される。

次いで、（Ｂ）の温度応答性ポリマーの製造方法では、第一重合工程後の第一混合物にカチオン性モノマーとアニオン性モノマーとを添加して第二混合物を調製する（添加工程）。
ここで、第二混合物は、第一重合工程後の第一混合物、カチオン性モノマー、及びアニオン性モノマー以外に、例えば、他のモノマー、溶媒、連鎖移動剤、安定剤、界面活性剤等を含んでよい。
また、カチオン性モノマーとアニオン性モノマーとは、不活性雰囲気下において、添加されてよい。

この工程では、例えば、バイアルに不活性ガスをフローさせることによってバイアル内を不活性雰囲気に保ちながら、上記カチオン性モノマーとアニオン性モノマーとを添加する。

この工程において、重合中のＮＩＰＡＭを含むホモポリマーに加えて、カチオン性モノマー及びアニオン性モノマーも重合系に含められることとなり、バイアル内の重合系が、ＮＩＰＡＭの単独重合系から、ＮＩＰＡＭとカチオン性モノマーとアニオン性モノマーとの共重合系に、変わることとなる。

そして、（Ｂ）の温度応答性ポリマーの製造方法では、第二混合物に紫外線を照射する（第二重合工程）。
ここで、紫外線は、不活性雰囲気下において、照射されてよい。

この工程では、例えば、カチオン性モノマーとアニオン性モノマーとを添加した後のバイアルの外部から紫外線照射装置を用いて紫外線を照射する。

この工程において、ＮＩＰＡＭとカチオン性モノマーとアニオン性モノマーとが、紫外線の照射により、ラジカル重合して、第一重合工程において形成したＮＩＰＡＭを含むホモポリマーブロックの重合鎖α末端に連続する形態で、ＮＩＰＡＭとカチオン性モノマーとアニオン性モノマーとを含むコポリマーブロックが形成される。他のモノマーも用いた場合には、ＮＩＰＡＭと他のモノマーとを含むポリマーブロック、及び／又は、ＮＩＰＡＭとカチオン性モノマーとアニオン性モノマーと他のモノマーとを含むコポリマーブロックが形成される。

上記の通り、ＮＩＰＡＭを含むホモポリマーブロックと、ＮＩＰＡＭとカチオン性モノマーとアニオン性モノマーとのコポリマーブロックとを含む温度応答性ポリマーが得られる。

なお、この一例の製造方法では、効率的な反応を実現する観点から、第一重合工程、添加工程、及び第二重合工程に亘って紫外線を照射することが好ましい。

（Ｂ）の温度応答性ポリマーの製造方法の別の例は、ラジカル重合を用いる方法であり、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）と、カチオン性モノマーと、アニオン性モノマーと、任意選択的に他のモノマーを含む混合物に紫外線を照射する。
ここで、上記混合物は、例えば、溶媒、連鎖移動剤、安定剤、界面活性剤等を含んでよい。
また、紫外線は、不活性雰囲気下において、照射されてよい。
他の条件については、前述の一例の製造方法と同様としてよい。

更には、イニファーター重合を用いる場合、イニファーターとして、ベンジル−（Ｎ，Ｎ−ジエチル）ジチオカルバメートを、溶媒として、トルエン等を用いてよく、近紫外線の照射によりリビング重合を行ってよい。ここで、１番目のモノマーによる重合後、単離操作を経て、２番目のモノマーによる重合を行うことによって、ブロック共重合体を得ることができる。

更には、イオン重合を用いる場合、触媒として、ＮａＯＨ粉末を、溶媒として、精製に用いられる再沈殿用溶媒と共に非プロトン系溶媒を用いてよい。１番目のモノマーによる重合後、再沈殿操作（この操作後もω末端にイオン種が残る）を経て、２番目のモノマーによる重合を行うことによって、ブロック共重合体を得ることができる。

（温度応答性ポリマー）
（Ｂ）の温度応答性ポリマーは、上記（Ｂ）の製造方法により製造される。

（Ｂ）の温度応答性ポリマーは、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）単位と、カチオン性モノマー単位と、アニオン性モノマー単位とを含み、任意選択的に、他のモノマー単位を含む。本ポリマーは、前述の一例、別の例の製造方法により製造することができる。
好適には、（Ｂ）の温度応答性ポリマーは、主としてＮ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）単位を含み、任意選択的に他のモノマー単位を含むポリマーブロック（重合鎖α末端）と、主としてカチオン性モノマー単位と、アニオン性モノマー単位とを含み、任意選択的に他のモノマー単位を含むコポリマーブロックとを含む。更に好適には、（Ｂ）の温度応答性ポリマーは、ＮＩＰＡＭのホモポリマーブロックと、ＮＩＰＡＭとカチオン性モノマーとアニオン性モノマーとのコポリマーブロックとを含み、特に好適には、これらブロックからなる。本ポリマーは、前述の一例の製造方法により製造することができる。

従来の温度応答性ポリマーのうちの１つ（特開２０１４−１６２８６５号公報参照）では、ポリマーに温度応答性を与えるＤＭＡＥＭＡが、同時に、（アニオン性モノマーと共に）細胞構造体の形成に必要となるカチオン性モノマーであり、また、温度応答性に関わるＤＭＡＥＭＡは、ポリマーブロックとして重合鎖α末端に含まれている。
かかる温度応答性ポリマーでは、重合鎖α末端に必ずカチオン性モノマーが存在することから、重合鎖中におけるカチオン性サイトの位置の調整の自由度が高くはなく、また、カチオン性モノマーが主としてＤＭＡＥＭＡに限られることから、カチオン性サイトの陽電荷強度の調整や、温度応答性ポリマー水溶液のｐＨの調整も必ずしも容易とは言えなかった。
そして、上記温度応答性ポリマーを、例えば、温度応答性ポリマーを薬物送達（ＤＤＳ）に用いた場合、担持可能な薬剤の種類や量が限られる可能性があった。ＤＤＳの手法としては、例えば、細胞培養器に薬剤を担持させた温度応答性ポリマーを塗布して、塗布後の細胞培養器で細胞や組織を培養することによって、被覆物から細胞・組織に対して薬剤を徐放するといった手法等が挙げられる。ここで、上記従来の温度応答性ポリマーでは、陽電荷強度が小さいＤＭＡＥＭＡを含むため、アニオン性物質の薬剤の担持は必ずしも容易とは言えず、担持可能な薬剤の種類や量が限られる可能性があった。

一方、（Ｂ）の温度応答性ポリマーでは、ポリマーに温度応答性を与えるＮＩＰＡＭは中性のモノマーであり、（アニオン性モノマーと共に）細胞構造体の形成に必要となるカチオン性モノマーはＮＩＰＡＭとは異なるモノマーである。
（Ｂ）の温度応答性ポリマーでは、重合鎖α末端に必ずしもカチオン性モノマーが存在する必要はなく、重合鎖中におけるカチオン性サイトの位置を自由に調整することが可能であり、また、広範なカチオン性モノマーを用いることができるため、カチオン性サイトの陽電荷強度や温度応答性ポリマー水溶液のｐＨを容易に調整することが可能である。
（Ｂ）の温度応答性ポリマーによれば、例えば、温度応答性ポリマーを薬物送達（ＤＤＳ）に用いた場合、担持可能な薬剤の種類を拡大しつつ、その量を増加させることが可能となり、ひいては、温度応答性ポリマーの応用範囲を拡大することができる。

（Ｂ）の温度応答性ポリマーでは、ＮＩＰＡＭ単位の、ＮＩＰＡＭ単位、カチオン性モノマー単位、アニオン性モノマー単位の合計に対する割合（モル）が、０．６〜０．９であることが好ましく、０．７〜０．９であることが更に好ましく、０．９であることが特に好ましい。
他のモノマーも用いた場合には、他のモノマー単位の、ＮＩＰＡＭ単位、カチオン性モノマー単位、アニオン性モノマー単位の合計に対する割合（モル）が、０．００１〜０．２であることが好ましく、０．０１〜０．１であることが更に好ましい。

（Ｂ）の温度応答性ポリマーとしては、重合鎖α末端のポリマーブロック（例えば、ＮＩＰＡＭのホモポリマーブロック）の数平均分子量が５０００Ｄａ以上であることが好ましく、２００００Ｄａ以上であることが更に好ましい。

（Ｂ）の温度応答性ポリマーとしては、数平均分子量（Ｍｎ）が、１０〜５００ｋＤａである分子が好ましい。また、重量平均分子量（Ｍｗ）と数平均分子量（Ｍｎ）との比（Ｍｗ／Ｍｎ）は、１．１〜１０．０である分子が好ましい。
温度応答性ポリマーの分子量は、重合条件により、適宜調整することができる。

（Ｂ）の温度応答性ポリマーによれば、曇点を、例えば室温（２５℃）以下に、低下させることができる。

上記温度応答性ポリマーでは、曇点以上の温度で形成された温度応答性ポリマーの不溶化物が、室温（約２５℃）条件下で再溶解するまでの時間が顕著に遅延する。これは、得られた温度応答性ポリマーは、分子内にカチオン性官能基とアニオン性官能基とが存在するため、高い自己凝集性を有するためであると推定される。

特に、前述の（Ｂ）の温度応答性ポリマーは、重合鎖α末端に、高分子量を有するＮＩＰＡＭのホモポリマーブロックを備えるため、ＮＩＰＡＭの側鎖の温度依存的なグロビュール転移が生じやすく、曇点を効果的に低減することが可能となると考えられる。

更に、（Ｂ）の温度応答性ポリマーによれば、後述するように、細胞を適切な培養条件で培養することにより、管腔状（チューブ状）や塊状（ペレット状）等の構造を有する細胞構造体を形成させることができる。

（Ｂ）の温度応答性ポリマーが有する、カチオン性官能基の官能基数と、アニオン性官能基の官能基数との比（Ｃ／Ａ比）は、０．５〜３２であることが好ましく、４〜１６であることが更に好ましい。

以下、上記（Ｃ）の温度応答性ポリマー及びその製造方法について記載する。

（温度応答性ポリマー組成物の製造方法）
（Ｃ）の温度応答性ポリマー組成物の製造方法は、まず、混合型温度応答性ポリマー組成物を調製する（混合物調製工程）。具体的には、（Ｃ１）２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）及び／又はその誘導体の重合体と、（Ｃ２）２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール（トリス）と、（Ｃ３）核酸、ヘパリン、ヒアルロン酸、デキストラン硫酸、ポリスチレンスルホン酸、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリリン酸、硫酸化多糖類、カードラン及びポリアルギン酸並びにこれらのアルカリ金属塩からなる群から選択される一種以上のアニオン性物質とを混合する。なお、（Ｃ２）トリスは任意選択的な成分である。

（温度応答性ポリマー組成物）
（Ｃ）の温度応答性ポリマー組成物は、上記の通り、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体の重合体と、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオールと、核酸、ヘパリン、ヒアルロン酸、デキストラン硫酸、ポリスチレンスルホン酸、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリリン酸、硫酸化多糖類、カードラン及びポリアルギン酸並びにこれらのアルカリ金属塩からなる群から選択される一種以上のアニオン性物質とを含む。

（Ｃ１）のＤＭＡＥＭＡ及び／又はその誘導体の重合体は、温度応答性ポリマーであり、その曇点は３２℃である。（Ｃ２）のトリスは、曇点の若干の低下、及び／又は曇点よりも高温で形成されたポリマーが、曇点以下に冷却された際に再溶解する速度を低減させる役割を果たし、また、疎水化されたポリマー層中でも親水性を維持しながら、アミノ基に由来する陽電荷により細胞に刺激を与える役割を果たすと推定される。（Ｃ３）のアニオン性物質は、培養する細胞の遊走や配向を可能にする役割や細胞傷害性を抑制する役割を果たすと推定される。

この混合型温度応答性ポリマー組成物によれば、曇点を室温（２５℃）以下に低減させることができる。
上記組成物では、ＤＭＡＥＭＡ及び／又はその誘導体の重合体の側鎖とトリスとが、互いに相互作用（例えば、架橋する作用）して、上記重合体が凝集しやすくなっていると推定される。

ここで、上記（Ｃ１）について、ＤＭＡＥＭＡ及び／又はその誘導体の重合体としては、数平均分子量（Ｍｎ）が、１０〜５００ｋＤａである分子が好ましい。また、重量平均分子量（Ｍｗ）と数平均分子量（Ｍｎ）との比（Ｍｗ／Ｍｎ）は、１．１〜６．０である分子が好ましい。

また、（Ｃ１）のＤＭＡＥＭＡの誘導体としては、例えば、メタクリレートのメチル基の水素原子をハロゲン置換した誘導体、メタクリレートのメチル基を低級アルキル基で置換した誘導体、ジメチルアミノ基のメチル基の水素原子をハロゲン置換した誘導体、ジメチルアミノ基のメチル基を低級アルキル基で置換した誘導体が挙げられる。

上記（Ｃ２）について、トリスは、純度９９．９％以上の純物質であるか、又は、トリス水溶液を、アルカリ性物質の添加等により、使用時に中性又は塩基性とすることが好ましい。トリスは、塩酸塩の状態で市販されているところ、これを用いた場合には、トリス水溶液のｐＨが下がるため、組成物の曇点が７０℃程度にまで上昇してしまう。そのため、トリス塩酸塩は好ましくない。

上記（Ｃ３）に列挙したアニオン性物質のうち、核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、その他１本鎖、２本鎖、オリゴ体、ヘアピンなどの人工核酸等が挙げられる。

また、上記（Ｃ３）に列挙したアニオン性物質は、ある程度の大きさ、例えば１〜５，０００ｋＤａの分子量（Ｍ）を有していることが好ましい。
分子量を上記範囲とすれば、アニオン性物質は、カチオン性物質とイオン結合して、カチオン性物質を、長時間捕捉する役割を果たすことができ、安定したイオン複合体微粒子を形成させることがでる。また、一般的にカチオン性物質が有する、細胞の細胞膜表面に対する静電的相互作用に起因する細胞傷害性を緩和することもできる。

（Ｃ３）に列挙したアニオン性物質の他にも、例えば、カチオン性ポリマーであるポリ（４−アミノスチレン）の４−位のアミノ基に対してシュウ酸などのジカルボン酸を脱水縮合させることによって、アニオン性官能基を導入した、実質的にアニオン性物質として機能するポリマー誘導体も、用いることができる。

なお、上記（Ｃ３）に列挙したアニオン性物質は、二種以上含まれていてもよい。

ここで、（Ｃ１）２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）及び／又はその誘導体の重合体に対する、（Ｃ２）２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール（トリス）の割合（（Ｃ２）／（Ｃ１））が、１．０以下とした混合型温度応答性ポリマー組成物を用いることが好ましい。
なお、割合（（Ｃ２）／（Ｃ１））は、重量割合であるものとする。

上記割合の混合型温度応答性ポリマー組成物を用いた場合、後述の培養工程で、細胞構造体を形成しやすくすることができる。
この組成物によれば、上記組成物の親水性と疎水性とのバランスを更に好適にすることができる。そして、この好適なバランスが、培養面への細胞の接着性を好適に調整し、細胞の遊走や配向を活性化していると推定される。

また、上記割合（（Ｃ２）／（Ｃ１））は、０．１以上あることが好ましい。
上記割合を０．１以上とすることにより、曇点を低減させるという上記効果が得られやすい。また、細胞構造体を形成しやすくするという上記効果が得られやすい。

上記と同様の理由により、上記割合（（Ｃ２）／（Ｃ１））は、０．１〜０．５であることが更に好ましい。

ここで、混合型温度応答性ポリマー組成物中のＣ／Ａ比（正電荷／負電荷）が、０．５〜１６であることが好ましい。
なお、本願明細書では、Ｃ／Ａ比とは、組成物中に含まれる物質が有する正電荷の、組成物中に含まれる物質が有する負電荷に対する割合を指す。具体的には、Ｃ／Ａ比は、（Ｃ１）ＤＭＡＥＭＡ及び／又はその誘導体の重合体のモル数をＮ１、（Ｃ３）アニオン性物質のモル数をＮ３としたときに、｛（重合体１分子当たりの正電荷）×Ｎ１｝／｛（アニオン性物質１分子当たりの負電荷）×Ｎ３｝という式で表される。
またなお、本願明細書では、アニオン性物質をＤＮＡとした場合、アニオン性物質１分子当たりの負電荷数は、ＤＮＡの塩基対の数（ｂｐ数）×２で計算し、分子量（Ｄａ）は、ｂｐ数×６６０（ＡＴペア及びＣＧペアの平均分子量）で計算するものとする。

Ｃ／Ａ比を０．５〜１６とすることにより、管状細胞構造体を形成させやすくするという上記効果が得られやすくなる。
上記組成物中の正電荷と負電荷とのバランスを好適にして、正電荷による細胞傷害性を抑制することができると推定される。また、上記組成物の親水性と疎水性とのバランスを更に好適にして、細胞の遊走や配向を生じやすくすることができると推定される。

上記と同様の理由により、上記Ｃ／Ａ比は、２〜１０とすることが更に好ましく、特にＣ／Ａ比は８付近であることが最も好ましい。

（準備工程）
一例の製造方法では、次いで、上記温度応答性ポリマー及び／又は上記温度応答性ポリマー組成物で培養面の一部を被覆して、被覆培養面を準備する（準備工程）（図１（ｉ）〜（ｉｉｉ）参照）。

ここで、被覆培養面以外の培養面は、細胞接着性としても、細胞非接着性としてもよいが、所望の形状の細胞塊を得られやすくする観点から、細胞非接着性とすることが好ましい。細胞非接着性の培養面の調製方法は、特に限定されることなく、例えば、細胞非接着性の培養面を備える細胞培養器、例えば、ＳＵＭＩＬＯＮ社製のＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ（登録商標）や、大腸菌培養用の細胞培養器等の細胞接着のための表面処理を施していないもの等を用いてもよく、細胞非接着性のシートや中敷き等を用いてもよい。

ここで、図１に示すように、被覆培養面は、細胞の壁との接触を抑制して、細胞塊の形状を整える観点から、非被覆培養面に取り囲まれるように設けられることが好ましい（図１（ｉｉ）、（ｉｉｉ）参照）。

被覆培養面の形状は、所望する軟骨細胞塊の形状に合わせて、適宜調整してよく、平面視で、円形、矩形、ドーナツ形（リング形）等が挙げられる。

上記準備工程は、例えば、温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物を、溶媒に溶解して、温度応答性ポリマー溶液としてから、細胞培養器の培養面上に塗布し、乾燥させて被覆細胞培養器を準備する工程（準備工程Ｉ）としてもよく、また、温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物を含む水溶液（温度応答性ポリマー水溶液）を温度応答性ポリマーの曇点以下に冷却し、冷却した温度応答性ポリマー水溶液を細胞培養器の培養面上に流延させ、曇点超の温度まで加熱して、被覆細胞培養器を準備する工程（準備工程ＩＩ）としてもよい。

上記準備工程Ｉにおける温度応答性ポリマー溶液における溶媒としては、例えば、水；生理食塩水；緩衝液；メタノール、エタノール、ｎ−プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、１−ブタノール、イソブチルアルコール、２−ブタノール、ｔ−ブチルアルコール、１−ペンタノール、２−ペンタノール、３−ペンタノール、２−メチル−１−ブタノール、３−メチル−１−ブタノール、２−メチル−２−ブタノール、３−メチル−２−ブタノール、２，２−ジメチル−１−プロパノール、１−ペンタノール、２−ペンタノール、３−ペンタノール、２−メチル−１−ブタノール、３−メチル−１−ブタノール、２−メチル−２−ブタノール、３−メチル−２−ブタノール、２，２−ジメチル−１−プロパノール、１−ヘキサノール、２−メチル−２−ペンタノール、アリルアルコール、ベンジルアルコール、サリチルアルコール等のアルコール；アセトン、エチルメチルケトン、ジエチルケトン、メチルプロピルケトン、メチルイソブチルケトン、メチルビニルケトン、シクロヘキサノン、２−メチルシクロペンタノン、アセトフェノン、ベンゾフェノン、イソホロン等のケトン；酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸ｎ−ブチル、酢酸イソブチル、酢酸ｓｅｃ−ブチル、酢酸ｔｅｒｔ−ブチル、酢酸ビニル、ギ酸メチル、ギ酸エチル、ギ酸プロピル、上記アルコールとリン酸のエステル、上記アルコールと炭酸のエステル等のエステル；クロロホルム；ベンゼン；トルエン；ジエチルエーテル；ジクロロメタン；等が挙げられる。
中でも、培養面に均一に被覆しやすく、また、温度応答性ポリマーの溶解性に優れるという観点から、メタノール、エタノール、ｎ−プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、２−ブタノール、ｔ−ブチルアルコール、アリルアルコール等のアルコール；アセトン、エチルメチルケトン、ジエチルケトン、メチルビニルケトン等のケトン；酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、酢酸ｔｅｒｔ−ブチル、酢酸ビニル等のエステル；クロロホルム；ベンゼン；トルエン；ジエチルエーテル；ジクロロメタンが好ましい。また、短時間で乾燥させることができ、培養面に一層均一に塗布しやすいという観点から、沸点が低い有機溶媒（例えば、炭素数１〜４の低級アルコール、炭素数３〜５の低級ケトン、及び炭素数１〜４のアルキル基を有する酢酸アルキルエステルからなる群より選ばれる少なくとも１種、特に、水より沸点が低い、炭素数１〜４の低級アルコール、炭素数３〜５の低級ケトン、及び炭素数１〜４のアルキル基を有する酢酸アルキルエステルからなる群より選ばれる少なくとも１種）がさらに好ましく、コスト、操作性にも優れる観点から、メタノール、エタノールが特に好ましい。
上記溶媒は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
溶媒は、温度応答性ポリマーの溶解性に優れるため、曇点以上の温度（例えば、室温や３７℃など）にしても、温度応答性ポリマーが不溶化して沈殿しにくい。そのため、温度応答性ポリマーを塗布する際に、温度応答性ポリマー溶液の温度管理をする手間が省け、簡易に被覆細胞培養器を準備することができる。

上記準備工程Ｉにおいて、温度応答性ポリマー溶液には、細胞が自己凝集しやすくなるという観点から、親水性分子が含まれることが好ましい。親水性分子としては、温度応答性ポリマーのＣ／Ａ比に影響しない非イオン性かつ親水性であるもの、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ジメチルアクリルアミド（ＤＭＡＡ）、グリセリン、ＴｒｉｔｏｎＸ、ポリプロピレングリコール等が挙げられる。

上記準備工程Ｉにおいて、温度応答性ポリマー溶液中の温度応答性ポリマーの含有量は、温度応答性ポリマーが培養面に均一に被覆されやすくなるという観点から、温度応答性ポリマー溶液（１００重量％）に対して、０．０００７５〜０．０１５重量％であることが好ましく、０．００１〜０．０１重量％であることがより好ましい。

上記準備工程Ｉにおいて、温度応答性ポリマー溶液中の親水性分子の含有量は、細胞が自己凝集しやすくなるという観点から、温度応答性ポリマー（１００重量％）に対して、０．００００１〜０．０００１５重量％であることが好ましく、０．００００３〜０．０００１重量％であることがより好ましい。

上記準備工程Ｉにおいて、温度応答性ポリマー溶液は、温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物が培養面に均一に被覆されやすくなるという観点から、水が含まれないことが好ましく、温度応答性ポリマー溶液（１００重量％）中の水の重量割合が０．５重量％以下であることがより好ましく、０．１重量％以下であることがさらに好ましい。
なお、水の重量割合は、ガスクロマトグラフィー、カールフィッシャー法など当業者に周知の方法により測定可能である。

上記準備工程Ｉにおいて、温度応答性ポリマー溶液は、培養面の全面に塗布してもよいし、培養面の一部に塗布してもよい。中でも、簡易に細胞構造体が得られるという観点から、培養面の全面に塗布することが好ましい。

上記準備工程Ｉにおいて、塗布した温度応答性ポリマー溶液を乾燥させる条件としては、培養面に温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物を均一に被覆する観点から、大気圧下、温度１０〜７０℃、時間１〜３，０００分が好ましい。塗布した温度応答性ポリマー溶液を、素早く乾燥させることにより、培養面上に温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物が偏ることなく、均一に被覆されやすくなる。
塗布した温度応答性ポリマー溶液は、例えば、細胞培養器を３７℃のインキュベーター中で静置することによって乾燥させてもよい。

上記準備工程ＩＩにおいて、温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物を溶解する溶媒としては、例えば、水；生理食塩水；リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、トリス緩衝液等の緩衝液；等が挙げられる。

上記準備工程ＩＩにおいて、温度応答性ポリマー水溶液を冷却する方法としては、例えば、温度応答性ポリマー水溶液を約４℃の冷蔵庫に入れて曇点以下の温度まで冷却する方法等が挙げられる。

上記準備工程ＩＩにおいて、温度応答性ポリマー水溶液を培養面上に流延させる方法としては、例えば、曇点以下の温度を有する温度応答性ポリマー水溶液を、細胞培養器の培養面を傾けることによって伸ばす方法、スパチュラを用いて温度応答性ポリマー水溶液を延ばす方法等が挙げられる。

上記準備工程ＩＩにおいて、流延した温度応答性ポリマー水溶液を曇点超まで加熱する方法としては、例えば、流延工程後の細胞培養器を３７℃のインキュベーター中で静置する方法等が挙げられる。

図１に示す一例の軟骨細胞塊の製造方法では、準備工程を、細胞培養器（図１（ｉ）参照）の培養面の中央部分に、所望の形状を描きながら、上記温度応答性ポリマー及び／又は上記温度応答性ポリマー組成物を塗布し（図１（ｉｉ）参照）、塗布部分を乾燥する（図１（ｉｉｉ）参照）ことによって、行っている。

また、本実施形態における準備工程は、細胞培養器の培養面に、所望の形状の穴（くり抜き）を有するマスキングシート（図示せず）を敷き、そして、シートの上から上記温度応答性ポリマー及び／又は上記温度応答性ポリマー組成物を配置し、その後、シートを取り除くことによっても、行うことができる。
かかるマスキングシートの素材としては、当業者に周知の素材が使用可能であり、例えば、接触角が７０°以下の素材、具体的には、親水性基で修飾したポリエチレンテレフタレート、ポリスチレン、ポリカーボネート、ガラス、ポリプロピレン等が挙げられ、特に、細胞培養に使用するために溶出物を少なくする観点から、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクルリルアミドが放射線グラフト重合により導入固定されたポリスチレン等が好ましい。
シートの形状、サイズ、厚さ等は、特に限定されないが、厚さ０．０５〜２．０ｍｍであることが好ましい。

被覆培養面の面積は、特に限定されないが、例えば、Φ３５ｍｍの細胞培養器を用いて、外径１〜２０ｍｍ、内径０．１〜１９ｍｍサイズのドーナツ形の軟骨細胞塊を製造する場合、０．５〜３００ｍｍ²としてよい。

被覆培養面が単位面積当たりに有する温度応答性ポリマー及び温度応答性ポリマー組成物の量は、０．１〜３．０μｇ／ｃｍ²とすることが好ましく、０．５〜２．５μｇ／ｃｍ²とすることがより好ましい。

被覆培養面のゼータ電位としては、０〜５０ｍＶが好ましく、より好ましくは０〜３５ｍＶ、更に好ましくは１０〜２５ｍＶである。ゼータ電位が０ｍＶ以上であることにより、負に帯電する細胞が接着しやすくなる。また、ゼータ電位が５０ｍＶ以下であることにより、細胞毒性を軽減することができる。
また、ゼータ電位を上記範囲とすることにより、細胞を適切な培養条件で培養するだけで、塊状（ペレット状）の構造を有する細胞構造体を一層簡便に作製させることができる。これは、表面ゼータ電位を上記範囲とすることによって、被覆培養面の表面に細胞毒性を惹起しない微弱な陽電荷を与えることができ、また、播種した細胞の速やかな接着を確保し、細胞の活性の向上及び細胞外マトリックスの分泌を促進し、更には、細胞遊走を適度に抑制して、細胞間の結合を強くすることができることによるものと推測される。
なお、ゼータ電位とは、ポリスチレンラテックスをヒドロキシプロピルセルロースで被覆した粒子（ゼータ電位：−５〜＋５ｍＶ）を標準のモニター粒子として、ゼータ電位計（例えば、型番「ＥＬＳＺ」、大塚電子社製等）で測定した、Ｓｍｏｌｕｃｈｏｗｓｋｉ式により算出される値をいう。

被覆培養面の表面に対する水の接触角としては、本発明の効果を高める観点から、５０〜９０°が好ましく、より好ましくは６０〜８０°、更に好ましくは６２〜７８°である。
なお、被覆培養面に対する水の接触角とは、被覆培養面内の任意の数点において、ＪＩＳＲ３２５７に準拠して測定される接触角の平均値をいう。

図３に、準備工程の変形例及びこれに続く播種培養工程の概略を示す。
図３（ａ）に、準備工程の第一変形例を示す。
準備工程の第一変形例では、細胞培養器の培養面内に納まる平面視形状を有し、所定程度の厚さを有し、中央部分が所望の平面視形状にくり抜かれた細胞非接着性の中敷き（パッド）を用いる（図３（ａ）（ｉ）参照）。
なお、細胞非接着性とは、細胞が接着しない又は接着しにくいことをいう。
そして、この第一変形例の準備工程では、まず、細胞培養器の培養面全面に上記温度応答性ポリマー及び／又は上記温度応答性ポリマー組成物を配置し、次いで、ポリマー及び／又はポリマー組成物の上に上記細胞非接着性のシートを敷く。これにより、被覆培養面は壁で囲まれる、すなわち、凹部の底面に設けられることとなる。
かかる第一変形例によれば、後述の播種培養工程において細胞塊の形状を三次元的に制御することが可能となり、所望の形状を有する軟骨細胞塊をより精密に製造することが可能となる。

第一変形例において用いることができる細胞非接着性の中敷きの素材としては、当業者に周知の素材が使用可能であり、例えば、接触角が７０°以下の素材、具体的には、親水性基で修飾したポリエチレンテレフタレート、ポリスチレン、ポリカーボネート、ガラス、ポリプロピレン等が挙げられ、特に、細胞培養に使用するために溶出物を少なくする観点から、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクルリルアミドが放射線グラフト重合により導入固定されたポリスチレン等が好ましい。
中敷きの形状、サイズ、厚さ等は、特に限定されないが、例えば、Φ３５ｍｍの細胞培養器を用いる場合、径（最大径）０．１〜１０ｍｍであることが好ましい。

なお、上記第一変形例では、細胞培養器の培養面内に納まるサイズを有し、中央部分に所望の平面視形状の凹部を備える細胞非接着性の中敷きを用いてもよい（図示せず）。
この場合の準備工程では、中敷きの凹部の底面のみに上記温度応答性ポリマー及び／又は上記温度応答性ポリマー組成物を配置し、凹部の底面以外の面、すなわち、凹部の壁面及び凹部以外の中敷きの表面には、上記ポリマー及び／又は上記ポリマー組成物を配置しない（図示せず）。
かかる例によっても、後述の播種培養工程において所望の形状を有する軟骨細胞塊を凹部においてより精密に製造することが可能となる。

また、本実施形態においては、異なるサイズの細胞非接着性の中敷きを用いてもよく、例えば、播種培養工程を経てサイズが拡大した軟骨細胞塊を、より大きなサイズの細胞非接着性の中敷きの凹部に移し、次の播種培養工程を行うこともできる。
かかる手法によれば、各播種培養工程における、軟骨細胞塊のサイズに対する被覆培養面のサイズを、一定程度に保持することができ、軟骨細胞塊の形状をより所望の形状に近づけることが可能になる。

図３（ｂ）に、準備工程の第二変形例を示す。
準備工程の第二変形例では、細胞培養器の培養面に所望の平面視形状の凹部を彫り込む（図３（ｂ）参照）。
そして、この第二変形例の準備工程では、彫り込んだ凹部の底面のみに温度応答性ポリマー及び／又は上記温度応答性ポリマー組成物を配置し、凹部の底面以外の面、すわわち、凹部の壁面及び凹部以外のシートの表面には、上記ポリマー及び／又は上記ポリマー組成物を配置していない（図３（ｂ）（ｉ）参照）。
かかる第二変形例によれば、後述の播種培養工程において細胞塊の形状を三次元的に制御することが可能となり、所望の形状を有する軟骨細胞塊をより精密に製造することが可能となる。

なお、前述の準備工程の第一変形例及び第二変形例において、播種される細胞と凹部の壁面との接着を抑制して、得られる細胞塊の形状を整える観点から、特に凹部の壁面は細胞非接着性とすることが好ましい。

（播種培養工程）
本実施形態における一例の製造方法では、次いで、被覆培養面において、細胞塊の存在下、軟骨細胞に分化し得る細胞を播種し、細胞塊及び軟骨細胞に分化し得る細胞を共培養することによって、軟骨細胞塊を調製する（播種培養工程）。

なお、図１に示すように、本実施形態における一例の製造方法では、前述の準備工程の後、後述する播種培養工程の前に、前述の準備工程において準備した被覆培養面に軟骨細胞に分化し得る細胞を播種し、これを培養することによって、後述する播種培養工程において用いられる細胞塊を調製している（図１（ｉｖ）〜（ｖｉｉｉ）参照）。
しかしながら、本実施形態の製造方法は、これに限定されることなく、播種培養工程において用いる細胞塊を、別途、（例えば、別の細胞培養器で、）調製してもよい（図示せず）。

図１に示す例では、播種培養工程を、被覆培養面上に細胞塊を存在させた状態で、細胞培養器に細胞及び細胞培養用培地を加え（図２（ｉ）参照）、その後、この細胞培養器を一般的な３７℃の細胞インキュベーターに入れ（図２（ｉｉ）参照）、培地交換により新たな細胞培養用培地を加え（図２（ｉｉｉ）参照）、細胞培養器を更に細胞インキュベーターに入れる（図２（ｉｖ）、（ｖ）参照）ことによって、行っている。なお、図２（ｉｖ）における括弧内には、構造物の断面図を示す。

この工程において、図２（ｉ）に示す通り、細胞塊は被覆培養面の中央部分に存在させることが、軟骨細胞塊の全体形状を整える観点から、好ましい。

培地交換前に用いる細胞培養用培地と、培地交換後に用いる細胞培養用培地とは、目的や用途に応じて適宜選択されてよく、例えば、前の培地を増殖用培地とし、後の培地を分化用培地や再分化用培地としてもよい。

軟骨細胞に分化し得る細胞としては、軟骨細胞、脂肪、滑膜、筋膜、骨膜、歯根膜、歯髄、骨髄由来の間葉系幹細胞、およびｉＰＳ細胞が挙げられる。
上記軟骨細胞に分化し得る細胞は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。

播種培養工程において細胞を播種する際の細胞密度は、０．３×１０⁴個／ｃｍ²以上、好ましくは０．３×１０⁵個／ｃｍ²以上、より好ましくは０．５×１０⁵個／ｃｍ²以上であり、また、培養中の細胞同士の接触による増殖停止等の、細胞周期に関する問題を生じにくくするため、１０．０×１０⁵個／ｃｍ²以下とすることが好ましく、より好ましくは４．５×１０⁵個／ｃｍ²以下である。

培養条件は、使用する細胞種や実験目的に基づいて、当業者は適切に定めることができ適宜定めてよく、例えば、３７℃、５％ＣＯ₂雰囲気等としてよい。

ここで、播種培養工程において生じる現象を図２を参照しながら、以下に記載する。
この工程においては、まず、播種された細胞が、中央部分に細胞塊が存在している被覆培養面上、及び非被覆培養面上に、沈降する。このとき、被覆培養面上に沈降した細胞は、被覆培養面上に接着して、生存する一方、非被覆培養面上に沈降した細胞は、非被覆培養面上には接着することなく存在する（図２（ｉｉ）参照）ところ、播種後１回目の培地交換により、接着しなかった細胞は吸引除去される（図２（ｉｉｉ）参照）。なお、かかる細胞の除去は、アポトーシスに伴うヒートショックプロテインや炎症性サイトカイン等の有害成分の放出を抑制する観点から、迅速に行うことが好ましい。
そして、被覆培養面に接着した細胞を更に培養すると、被覆培養面と非被覆培養面との境界付近に位置する細胞が、該細胞よりも被覆培養面の中央部分側に位置する細胞をも伴いながら、中央部分にある細胞塊を包み込むように、被覆培養面から凝集し始める（図２（ｉｖ）参照）。言い換えると、接着していた細胞が、培養面から遠ざかるように、被覆培養面の中央部分に向かって、剥離して、シート状であった細胞全体がその周縁において反り返る。
最終的に、予め配置されていた細胞塊と播種された細胞とが、断面視で積層構造をなすように、一体化する（図２（ｖ）参照）。

本発明の播種培養工程において用いられた軟骨に分化し得る細胞は、上記凝集の過程を経て軟骨細胞に分化、成熟するが、軟骨細胞は、当業者に周知のように、成熟すると低酸素状態を許容する特殊な性質を有する細胞である。従って、凝集の過程を経て得られた細胞塊中の軟骨細胞は低酸素状態でも生存することが可能となり、次の播種培養工程において、新たな軟骨に分化し得る細胞に包み込まれて、低酸素状態に置かれても、生存し続けることができる。

なお、播種された細胞は、被覆培養面以外に細胞塊自体の上にも、沈降することとなるが、細胞が凝集する際に、併せて一体化することとなる。

そして、本実施形態における一例の製造方法では、前述の播種培養工程を複数回行う（図２（ｖｉ）参照）。
播種培養工程を複数回行うことによって、サイズの大きな軟骨細胞塊を得ることができ、また、そのサイズを目的や用途に応じたものに調整することができる。
かかる態様によれば、前の播種培養工程において形成された成熟した細胞で構成される細胞塊の周囲に、後の播種培養工程において未成熟の細胞を順次配置していくことが可能となり、軟骨に分化し得る細胞の成熟と、細胞塊の成長とを両立することが可能となる。
なお、ここで、未成熟の細胞（増殖するが軟骨の性質は不十分な細胞）と、成熟した細胞（増殖しないが軟骨細胞の性質を獲得した細胞；低酸素環境を許容できる、高弾性な柔軟性を有する等の特性を備える）との制御は、培地を適切に選択することで行うことが可能である。例えば、使用する培地にＴＧＦ−β１等の分化誘導因子を混合すれば、細胞の分化を促進することが可能となる。

前の播種培養工程において細胞塊が被覆培養面の中央部分に形成されてから、次の播種培養工程において細胞を播種するまでの時間は、特に限定されないが、形成した細胞塊を軟骨細胞塊に成熟させること、及び、軟骨細胞塊の活性の低下を抑制することを考慮し、また、使用する再分化培地の種類や濃度等を総合的に勘案して、当業者によって適宜設定されてよい。

（軟骨細胞塊）
本実施形態の軟骨細胞塊は、本実施形態の軟骨細胞塊の製造方法により製造されたものである。
軟骨細胞塊のサイズとしては、特に限定されないが、径（最大径）は１〜１００ｍｍとしてよく、特にドーナツ形の軟骨細胞塊の場合、外径は３〜５０ｍｍとしてよく、内径は０．３〜４９ｍｍとしてよい。

（移植材料の製造方法）
本実施形態の移植材料の製造方法は、本実施形態の軟骨細胞塊の製造方法により製造された軟骨細胞塊の存在下、間葉系細胞を播種し、軟骨細胞塊及び間葉系細胞を共培養することによって、移植材料を調製する、工程を含む。
図４に、本実施形態の移植材料の製造方法の概要について示す。

本実施形態の移植材料の製造方法における上記工程は、用いる細胞を間葉系細胞とすること以外、前述の本実施形態の軟骨細胞塊の製造方法における播種培養工程と同様に行ってよい。

ここで、間葉系細胞としては、軟骨細胞、線維芽細胞、ＡＤＳＣ等が挙げられる。

（移植材料）
本実施形態の移植材料は、本実施形態の移植材料の製造方法により製造されたものである。
本実施形態の移植材料は、軟骨細胞塊の最外側に間葉系細胞、特に線維芽細胞が配置されているものであるため、生体に移植した際に、移植部位の周囲組織と頑強に接着しやすい傾向がある。このため、移植部位における治癒の効果を高め、予後をより良好なものとすることができる。

図５に、本実施形態における別の例の軟骨細胞塊の製造方法の概要について示す。
本実施形態における別の例の軟骨細胞塊の製造方法は、前述の準備工程の第一変形例を含むものである。

具体的には、別の例の製造方法は、中央部分に平面視でドーナツ形（例えば、外径（Φｏ）８ｍｍ、内径（Φｉ）４ｍｍ、幅２ｍｍ）のくり抜きを設けた、細胞非接着性の中敷き（例えば、厚さ１ｍｍ）を用いるものである。
ここで、被覆培養面の外輪郭線がなす線と、被覆培養面の外輪郭線がなす線とが、同心円をなすことが、軟骨細胞塊のドーナツ形状を整える意味で、好ましい。

本実施形態における別の例の軟骨細胞塊の製造方法における各工程の詳細は、前述の本実施形態における一例の軟骨細胞塊の製造方法における各工程と同様としてよい（図５（ｉ）〜（ｉｘ）参照）。

別の例の製造方法において、例えば、細胞培養器としてΦ３５ｍｍプレートを用いる場合、より形の整ったドーナツ形（リング形）の軟骨細胞塊を得る観点から、被覆培養面の幅を３ｍｍ以下とすることが好ましく、２．５ｍｍ以下とすることがより好ましく、壁の高さを３ｍｍ以下とすることが好ましく、２．５ｍｍ以下とすることがより好ましい。

（複合材の製造方法）
本実施形態の複合材の製造方法は、本実施形態の軟骨細胞塊のうち特にドーナツ形の軟骨細胞塊を管状構造体に嵌装させることによって、複合体を調製する複合体調製工程と、複合体を培養して、複合材を調製する培養工程とを含む。

好適には、本実施形態の複合材の製造方法は、管状構造体と芯材とを準備したうえで（図６（ｉ）参照）、芯材を管状構造体の中空部の一方端から他方端に向かって挿入する（図６（ｉｉ）参照）工程と、本実施形態のドーナツ形の軟骨細胞塊を上記管状構造体に嵌装させることによって、複合体を調製する複合体調製工程（図６（ｉｉｉ）参照）と、複合体を培養して、複合材を調製する（図６（ｉｖ）参照）培養工程と上記複合材から芯材を取り出す（図６（ｖ）参照）工程とを含む。

図６（ｉ）〜（ｖ）に、本実施形態における一例の複合材の製造方法の概要について示す。

管状構造体としては、中空部を有しているものとしてよく、バイオチューブ（人工血管）、コラーゲン製チューブ、エラスチン製チューブ、ポリグルコン酸製チューブ、ポリ乳酸製チューブ等としてよい。
バイオチューブは、コラーゲンを主成分とするものとしてよく、例えば、特開２００４−２６１２６０号公報の実施例に記載される方法で作成されてよい。
管状構造体の外径としては、本実施形態のドーナツ形の細胞構造体の内径と同様としてよく、例えば、１〜１００ｍｍとしてよく、管状構造体の内径としては、特に限定されないが、例えば、０．１〜５０ｍｍとしてよい。管状構造体の長さとしては、目的や用途に応じて適宜定められてよく、特に限定されないが、例えば、１〜３００ｍｍとしてよい。

芯材としては、中実体でも多孔体でも使用可能であり、具体的には、シリコン製の棒状構造物、アクリル製の棒状構造物、金属製の棒状構造物、素焼き、金属メッシュ圧縮構造体等としてよく、多孔体を使用すると、複合体の内腔側からの培地、酸素の拡散も可能となる。
芯材の外径としては、上記管状構造体の内径と同様としてよく、例えば、０．１〜５０ｍｍとしてよい。
芯材の長さとしては、管状構造体の長さと同様としてよく、管状構造体の長さよりも、例えば０．１〜１０ｍｍだけ長くても又は短くてもよい。

上記複合体調製工程では、例えば、本実施形態のドーナツ形の軟骨細胞塊をピンセットで固定しつつ、前述の工程で調製された（芯材が内部に設けられた）管状構造体を軟骨細胞塊の輪に通すことによって、行うことができる。
管状構造体１個に対して用いられるドーナツ形の軟骨細胞塊の数は、目的や用途に応じて適宜定められてよく、特に限定されないが、例えば、１〜１，０００個としてよい。
また、軟骨細胞塊を複数用いた場合の、隣接する２つ軟骨細胞塊間の距離としては、目的や用途に応じて適宜定められてよく、特に限定されないが、例えば、この工程後・後述の培養工程前において、０．１〜１００ｍｍとしてよい。

前述の複合体調製工程において管状構造体の嵌装が終了してから、後述の培養工程において複合体の培養を開始するまでの時間としては、細胞の活性を維持する観点から、１〜１８０分間とすることが好ましく、より好ましくは１〜１２０分間である。

上記培養工程は、例えば、前述の複合体調製工程で調製された複合体を、適切な条件（例えば、３７℃、５％ＣＯ₂雰囲気等）の下に、所定時間（例えば、１２時間〜１５０日間）置くことによって、行うことができる。
なお、上記培養工程は、生体内にて、行うこともでき、例えば、前述の複合体を生体内に埋入し、これを所定時間留置して、複合体の外表面を包囲するように形成される生体組織と複合体とを一体化することによって、行うこともできる。

複合材からの芯材の取り出しは、ピンセット等を用いて、適宜行うことができる。

なお、上記工程における各操作は、手動で行ってもよく、機械や装置を用いて行ってもよく、特に限定されない。

（複合材）
本実施形態の複合材は、本実施形態の軟骨細胞塊のうち特にドーナツ形の軟骨細胞塊が管状構造体の外表面に設けられているものである（図６（ｖ）参照）。
管状構造体の素材、外径、内径、長さ等；管状構造体１個に対して用いられるドーナツ形の軟骨細胞塊の数等は、本実施形態の複合材の製造方法について前述した通りとしてよい。
また、軟骨細胞塊を複数用いた場合の、隣接する２つ軟骨細胞塊（軟骨組織）間の距離としては、目的や用途に応じて適宜定められてよく、特に限定されないが、例えば、０．１〜１００ｍｍとしてよく、隣接する２つ軟骨細胞塊（軟骨組織）が重なり合っていてもよい（すなわち、距離０ｍｍ）。

本実施形態の複合材では、管状構造体の内部に芯材が設けられていてもよい（図６（ｖ）参照）。
芯材の素材、外径、長さ等は、本実施形態の複合材の製造方法について前述した通りとしてよい。

本実施形態の複合材は、本実施形態の複合材の製造方法により製造されたものとしてよい。

本実施形態の軟骨細胞塊、移植材料、複合材は、関節、気管、鼻等の治療に有用であり、より具体的には、半月板、気管軟骨、鼻軟骨、耳軟骨、椎間板、関節軟骨、靭帯、アキレス腱、等の治療に好適に用いることができる。
本実施形態の軟骨細胞塊、移植材料、複合材の製造方法によれば、例えば、患者の患部のＣＴ画像をＣＡＤ図面化し、かかる図面に従って軟骨細胞塊及び移植材料の形状を整えることも可能となることから、本実施形態の軟骨細胞塊、移植材料、複合材の製造方法は、テーラーメイド医療の実現に大きく貢献する可能性を秘めている。

以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明は下記の実施例に何ら限定されるものではない。

下記の試験において、市販の試薬は、特に断りのない限り更に精製することなく用いた。

（試験Ａ）温度応答性ポリマーの調製
容量５０ｍＬの軟質ガラス製の透明なバイアル瓶に、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）１０．０ｇ、及び水５，０００μＬを加えて、磁気撹拌器を用いて撹拌した。そして、この混合物（液体）に対してＧ１グレードの高純度（純度：９９．９９９９５％）の窒素ガスを１０分間パージ（流速：２．０Ｌ／分）することにより、この混合物を脱酸素した。なお、用いたＤＭＡＥＭＡには、重合禁止剤であるメチルヒドロキノン（ＭＥＨＱ）が０．５重量％含まれていた。
その後、この反応物に対して、丸型ブラック蛍光灯（ＮＥＣ社製、型番：ＦＣＬ２０ＢＬ、１８Ｗ）を用いて、２２時間紫外線照射することにより、上記反応物を重合させた。反応物は、５時間後に粘性を帯び１５時間後に固化して、重合体が反応生成物として得られた。この反応生成物を２−プロパノールに溶解させ、溶液を透析チューブに移した。そして、透析を７２時間行い、反応生成物を精製した。
反応生成物を含む溶液を、セルロース混合エステル製の０．２μｍフィルター（東洋濾紙社製、型番：２５ＡＳ０２０）で濾過し、得られた濾液を凍結乾燥させることにより、分子内イオン複合体型の温度応答性ポリマーが得られた（収量：６．８ｇ、転化率：６８％）。このポリマーの数平均分子量（Ｍｎ）を、ＧＰＣ（島津社製、型番：ＬＣ−１０ｖｐシリーズ）を用いて、ポリエチレングリコール（Ｓｈｏｄｅｘ社製、ＴＳＫシリーズ）を標準物質として測定し、Ｍｎ＝１００，０００（Ｍｗ／Ｍｎ＝１０．０）と決定した。

（試験Ｂ）被覆培養面の準備
（試験Ｂ−１）マスキングシートを使用した被覆培養面の準備
細胞培養器として、Φ３５ｍｍプレート（ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ（登録商標）、ＳＵＭＩＬＯＮ社製）（細胞低吸着性プレート）を用いた。
親水性基で修飾したシリコン製の部材（タイガースポリマー株式会社製、Ｋ−１２５）（厚さ１．０ｍｍ）を準備し、このシートの中央部分に平面視でドーナツ形（外径（Φｏ）８ｍｍ、内径（Φｉ）４ｍｍ、幅２ｍｍ）のくり抜きを設けた。このドーナツ形の穴を有するシートをマスキングシートとして用いた。
上記プレートの培養面上に上記マスキングシートを敷き、ここに、室温条件下において、前述の試験Ａで調製したポリマーの水溶液（濃度：３ｎｇ／μＬ）２２．５μＬを加え、その後、該水溶液を４５℃で３時間乾燥させた。乾燥後、上記シリコン製のシートを剥がした。

（試験Ｂ−２）細胞非接着性のシートを使用した被覆培養面の準備
細胞培養器として、Φ３５ｍｍプレート（ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ（登録商標）、ＳＵＭＩＬＯＮ社製）（細胞低吸着性プレート）を用いた。
親水性基で修飾したシリコン製の部材を準備し、このシートの中央部分に平面視でドーナツ形（外径（Φｏ）８ｍｍ、内径（Φｉ）４ｍｍ又は３ｍｍ、幅２ｍｍ又は２．５ｍｍ）のくり抜きを設けた。このドーナツ形の穴を有するシートを中敷きとして用いた。
上記プレートの培養面上に、室温条件下において、前述の試験Ａで調製したポリマーの水溶液（濃度：３ｎｇ／μＬ）２２．５μＬを加え、その後、該水溶液を４５℃で３時間乾燥させた。乾燥後、被覆された培養面上に上記中敷きを敷いた。

被覆培養面の表面のゼータ電位を、ゼータ電位計（大塚電子社製、型番：ＥＬＳＺ）及び平板試料用セルユニットを用いて測定した。測定では、セルとしては、石英セルを用い、標準のモニター粒子としては、ポリスチレンラテックス（粒子径：約５００ｎｍ）をヒドロキシプロピルセルロース（Ｍｗ＝３０，０００）で被覆した粒子（ゼータ電位：−５ｍＶ〜＋５ｍＶ）を用い、溶媒として、１０ｍＭの塩化ナトリウム水溶液をｐＨ＝７、３７℃の条件下で用いた。ゼータ電位は、Ｓｍｏｌｕｃｈｏｗｓｋｉ式により算出した。
その結果、温度応答性ポリマーにより被覆された第一被覆領域の表面のゼータ電位は、＋２０ｍＶであった。なお、当業者に周知の通り、上記ゼータ電位の測定値は、±１０％程度のバラツキを有するものである。

細胞培養プレートの第一被覆領域に対する水の接触角を、ＪＩＳＲ３２５７に準拠して、接触角計（商品名：ＤＭｓ−４００、協和界面科学社製）を用いて測定したところ、７０°±１０°であった。

（試験Ｃ）細胞の播種・培養
（試験Ｃ−１）（参考例）
上記試験Ｂ−１で準備した細胞培養器を用いた。
ＧＦＰ組換えラット軟骨細胞Ａ（ＲａｔＣｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ−Ａ（ＧＦＰ））を、増殖用培地（ＲＰＭＩ−１６４０＋１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）＋１０ｎｇ／μＬＦＧＦ−２；ＤＭＥＭ：ギブコ社製；ＦＢＳ：バイオロジカルインダストリー社製、ロット番号７１５９２９；ＦＧＦ−２：ぺプロテック社製、カタログ番号４００−２９）中に浮遊させて、細胞懸濁液を調製した。
上記プレートに、室温条件下で、細胞密度１．０×１０⁵個／ｃｍ²以上となるように、細胞懸濁液を加えた。
そして、この細胞を、３７℃、５％ＣＯ₂の細胞培養インキュベーター中で培養した。
培養開始から約１５時間後、軟骨細胞は被覆培養面から凝集し始め、培養開始から２４時間後、ドーナツ形（リング形）の細胞構造体を形成した。
培養開始から３時間後に、再分化用培地（ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）＋１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）＋１０ｎｇ／μＬ組換えラットＴＧＦ−β１（ＲａｔＴＧＦ−β１ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）＋５０μｇ／ｍＬアスコルビン酸二リン酸；ＤＭＥＭ：ギブコ社製、型番１１９６５；ＦＢＳ：バイオラッド社製、ロット番号７１５９２９；組換えラットＴＧＦ−β１：ぺプロテック社製、カタログ番号１００−２１；アスコルビン酸二リン酸（和光純薬社製、カタログ番号１９６−０１２５２））で培地交換した。
培地交換後、細胞の培養を更に２１時間継続した。
上記の通り、試験Ｃ−１（参考例）では、細胞塊の非存在下で、播種培養を１回行った。

図７に、試験Ｃ−１（参考例）における、培養開始から２４時間後（１日後）、２日後、６日後、１０日後の細胞構造体の様子を蛍光顕微鏡を用いて観察したときの写真を示す。特に、下図は、１０日後の細胞構造体の写真の一部を拡大して示したものである。
図７に示す写真から、得られた細胞構造体を構成する細胞が、軟骨様の円形の細胞形態を示していることがわかった。

図８に、試験Ｃ−１（参考例）において得られた細胞構造体を短軸方向断面で切断したときの写真を示す。
図８に示す写真から、得られた細胞構造体を構成する細胞は、丸形であり繭状の部屋をなす独特の軟骨小腔構造を有しており、周辺の核がない部分には、コンドロイチンやコラーゲン等の細胞外マトリックスが存在していることが明らかとなり、細胞構造体は軟骨様の組織をなしていることがわかった。

（試験Ｃ−２）
上記試験Ｂ−２で準備した細胞培養器を用いた。
ＧＦＰ組換えラット軟骨細胞Ａ（ＲａｔＣｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ−Ａ（ＧＦＰ））を、増殖用培地（ＲＰＭＩ−１６４０＋１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）＋１０ｎｇ／μＬＦＧＦ−２；ＤＭＥＭ：ギブコ社製；ＦＢＳ：バイオラッド社製、ロット番号７１５９２９；ＦＧＦ−２：ぺプロテック社製、カタログ番号４００−２９）中に浮遊させて、細胞懸濁液を調製した。
上記プレートに、室温条件下で、細胞密度１．０×１０⁵個／ｃｍ²以上となるように、細胞懸濁液を加えた。
そして、この細胞を、３７℃、５％ＣＯ₂の細胞培養インキュベーター中で培養した。
培養開始から１５時間後、軟骨細胞は被覆培養面から凝集し始め、培養開始から２４時間後、ドーナツ形（リング形）の細胞構造体を形成した。細胞構造体は、中敷きの凹部の底面の幅方向中央部分に沈降して留まっていた。
培養開始から３〜５時間後に、再分化用培地（ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）＋１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）＋１０ｎｇ／μＬ組換えラットＴＧＦ−β１（ＲａｔＴＧＦ−β１ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）＋５０μｇ／ｍＬアスコルビン酸二リン酸；ＤＭＥＭ：ギブコ社製、型番１１９６５；ＦＢＳ：バイオラッド社製、ロット番号７１５９２９；組換えラットＴＧＦ−β１：ぺプロテック社製、カタログ番号１００−２１；アスコルビン酸二リン酸（和光純薬社製、カタログ番号１９６−０１２５２））で培地交換した。
培地交換後、細胞の培養を更に２４時間継続した。

培地を再び増殖用培地に戻した上で、細胞構造体の存在下、室温条件下で、細胞密度１．０×１０⁵個／ｃｍ²以上となるように、細胞懸濁液を加えた。
そして、この細胞を、３７℃、５％ＣＯ₂の細胞培養インキュベーター中で培養した。
培養開始から１５時間後、播種した軟骨細胞は被覆培養面から凝集し始め、ドーナツ形（リング形）の細胞構造体を包み込むように凝集して、一回りサイズが拡大したドーナツ形（リング形）の細胞構造体が形成した。細胞構造体は、中敷きの凹部の底面の幅方向中央部分に沈降して留まっていた。培養開始から２７時間後の細胞構造体の様子を図９に示す。
上記の細胞構造体の存在下での播種培養を３回繰り返した。１〜３回の繰り返し後の細胞構造体の様子を図９に示す。

図９に、試験Ｃ−２における、培養開始から２７時間後、４４時間後、７０時間後、１２２時間後の細胞構造体の様子を蛍光顕微鏡を用いて観察したときの写真を示す。上図に、幅２ｍｍのドーナツ形のくり抜きを有する中敷きを用いた場合の細胞構造体の様子を示し、下図に、幅２．５ｍｍのドーナツ形のくり抜きを有する中敷きを用いた場合の細胞構造体の様子を示す。
図９に示す写真から、新たな細胞の播種及び培養を経てドーナツ形（リング形）の軟骨細胞塊のサイズが拡大したことがわかった。

（試験Ｃ−３）
上記試験Ｂ−２で準備した細胞培養器を用いた。
ＧＦＰ組換えルイスラットの脂肪組織由来間葉系幹細胞（ＡＤＳＣ（Ａｄｉｐｏｓｅ−ｄｅｒｉｖｅｄｖａｓｃｕｌａｒｓｔｒｏｍａｌｃｅｌｌ））を、増殖用培地（ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）＋１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）；ＤＭＥＭ：ギブコ社製、型番１１９６５；ＦＢＳ：バイオラッド社製、ロット番号７１５９２９）中に浮遊させて、細胞懸濁液を調製した。
上記プレートに、室温条件下で、細胞密度１．０×１０⁵個／ｃｍ²以上となるように、細胞懸濁液を加えた。
そして、この細胞を、３７℃、５％ＣＯ₂の細胞培養インキュベーター中で培養した。
培養開始から６時間後、軟骨細胞は被覆培養面から凝集し始め、培養開始から８時間後、ドーナツ形（リング形）の細胞構造体を形成した。細胞構造体は、中敷きの凹部の底面の幅方向中央部分に沈降して留まっていた。
培養開始から１．５時間後に、軟骨分化用培地（ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）＋１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）＋１％ＩＴＳＰｒｅｍｉｘ＋５０μｇ／ｍＬアスコルビン酸二リン酸＋１０ｎｇ／μＬ組換えラットＴＧＦ−β１（ＲａｔＴＧＦ−β１ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）＋１０Ｍデキサメタゾン；ＤＭＥＭ：ギブコ社製、型番１１９６５；ＦＢＳ：バイオラッド社製、ロット番号７１５９２９；ＩＴＳＰｒｅｍｉｘ：ＢＤバイオサイエンス社製、カタログ番号３５４３４１；アスコルビン酸二リン酸（和光純薬社製、カタログ番号１９６−０１２５２）；組換えラットＴＧＦ−β１：ぺプロテック社製、カタログ番号１００−２１；デキサメタゾン：和光純薬社製、カタログ番号０４７−１８８６３）で培地交換した。
培地交換後、細胞の培養を更に２４時間継続した。

培地を再び増殖用培地に戻した上で、細胞構造体の存在下、室温条件下で、細胞密度１．０×１０⁵個／ｃｍ²以上となるように、細胞懸濁液を加えた。
そして、この細胞を、３７℃、５％ＣＯ₂の細胞培養インキュベーター中で培養した。
培養開始から６時間後、播種した軟骨細胞は被覆培養面から凝集し始め、ドーナツ形（リング形）の細胞構造体を包み込むように凝集して、一回りサイズが拡大したドーナツ形（リング形）の細胞構造体が形成した。培養開始から８時間後の細胞構造体の様子を図１０に示す。
上記の細胞構造体の存在下での播種培養を３回繰り返した。１〜３回の繰り返し後の細胞構造体の様子を図１０に示す。

図１０に、試験Ｃ−３における、培養開始から８時間後、２０時間後、３２時間後、４２時間後の細胞構造体の様子を蛍光顕微鏡を用いて観察したときの写真を示す。上図に、幅２ｍｍのドーナツ形のくり抜きを有する中敷きを用いた場合の細胞構造体の様子を示し、下図に、幅２．５ｍｍのドーナツ形のくり抜きを有する中敷きを用いた場合の細胞構造体の様子を示す。なお、最下図には、４２時間後の細胞構造体の様子を実体顕微鏡を用いて観察したときの写真を示す。
図１０に示す写真から、新たな細胞の播種及び培養を経てドーナツ形（リング形）の軟骨細胞塊のサイズが拡大したことがわかった。
特に、３回の播種培養の繰り返し後（培養開始から４２時間後）に、ドーナツ形（リング形）の軟骨細胞塊は、中敷きの凹部の外に、はみ出ることとなったことがわかる。

なお、試験Ｃ−２及び試験Ｃ−３において得られたドーナツ形（リング形）の軟骨細胞塊に対して、間葉系細胞であるＡＤＳＣ細胞を用いて播種培養工程を更に１回行って、移植材料を調製することができた（図示せず）。

（試験Ｄ）複合材の調製
まず、管状構造体として、コラーゲンを主成分とするバイオチューブ（例えば、特開２００４−２６１２６０号公報の実施例に記載の方法参照）（外径：３ｍｍ、内径：２ｍｍ、長さ：２０ｍｍ）を準備した。また、芯材として、シリコン製の棒状構造物（円柱状の形状、長さ：２０ｍｍ、外径：１．８ｍｍ）を準備した（図６（ｉ）参照）。
次いで、棒状構造物をバイオチューブの中空部の一方端から他方端に向かって挿入した（図６（ｉｉ）参照）。
そして、試験Ｃ−２において作製したドーナツ形の軟骨細胞塊４つを上記バイオチューブに約１ｍｍの間隔を空けながら嵌装させて、複合体を調製した（図６（ｉｉｉ）参照）。
嵌装終了後３分後に、複合体を３７℃、５％ＣＯ₂の細胞培養インキュベーター中で培養し始めた。その後、複合体を２１日間培養した。培養開始から２１日後の時点で、バイオチューブと軟骨細胞塊とが一体化して、複合材が調製された（図６（ｉｖ）参照）。

図１１（ａ）に、試験Ｄにおける培養開始から６日後の複合材の様子を肉眼で観察したときの写真を示す。
図１１（ｂ）に、試験Ｄにおける培養開始から２１日後の複合材の様子を肉眼で観察したときの写真を示す。

図１２に、試験Ｄにおける培養開始から２１日後の複合材の一部の様子を肉眼で観察したときの写真を拡大して示す。
図１２に示すように、バイオチューブの外表面には軟骨組織が形成されていた。
なお、複合体を調製した際に約１ｍｍであった軟骨細胞塊間の間隔は、約１ｍｍとなっていた。

図１３に、試験Ｄにおいて調製された複合材に対してピンセットで操作したときの様子を肉眼で観察したときの写真を示す。（ａ）は、無操作時の外周面、（ｂ）は、無操作時の内腔面、（ｃ）は、全体への圧潰時、（ｄ）は、側面の一部への引張時、の様子を示す。
図１３（ａ）〜（ｄ）に示すように、複合材は上記通常の操作に耐え得る機械的強度を備えており、軟骨組織もバイオチューブに強固に接着したままであることがわかった。

図１４に、試験Ｄにおいて調製された複合材をヘマトキシリン・エオジン染色（ＨＥ染色）に供したときの様子を顕微鏡を用いて観察したときの写真を示す。（ａ）に、複合材の外観写真を示し、（ｂ）に、（ａ）の線Ａ−Ａに沿う面により切断したときの断面図を示し、（ｃ）及び（ｄ）に、（ｂ）に示す写真を部分拡大したものを示す。
図１４（ｃ）、（ｄ）中、ピンク色に染まっている部分（図中、実線矢印にて示す）はコラーゲンであり、青紫色に染まっている部分が細胞である。ここに示すように、バイオチューブのコラーゲン線維と軟骨細胞の細胞外マトリックスとが一体化していることがわかる。

本発明によれば、関節、気管、鼻等の治療に有用な軟骨細胞塊及び移植材料を簡便に製造することができる。

Claims

温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物で被覆された被覆培養面において、細胞塊の存在下、軟骨細胞に分化し得る細胞を播種し、前記細胞塊及び前記軟骨細胞に分化し得る細胞を培養することによって、軟骨細胞塊を調製する、播種培養工程を含むことを特徴とする、軟骨細胞塊の製造方法。
前記細胞塊を、前記軟骨細胞に分化し得る細胞を播種し、これを培養することによって、調製する、請求項１に記載の軟骨細胞塊の製造方法。
前記播種培養工程を複数回行う、請求項１又は２に記載の軟骨細胞塊の製造方法。
前記被覆培養面は、細胞非接着性の壁で囲まれている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の軟骨細胞塊の製造方法。
前記被覆培養面の幅を３ｍｍ以下として、前記壁の高さを３ｍｍ以下とする、請求項４に記載の軟骨細胞塊の製造方法。
前記被覆培養面が単位面積当たりに有する前記温度応答性ポリマー及び温度応答性ポリマー組成物の量を、０．１〜３．０μｇ／ｃｍ²とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の軟骨細胞塊の製造方法。
前記播種培養工程において、前記軟骨細胞に分化し得る細胞を、０．３×１０⁴〜１０．０×１０⁵個／ｃｍ²の細胞密度で播種する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の軟骨細胞塊の製造方法。
請求項１〜７のいずれか一項に記載の軟骨細胞塊の製造方法により製造されたことを特徴とする、軟骨細胞塊。
ドーナツ形である、請求項８に記載の軟骨細胞塊。
請求項８又は９に記載の軟骨細胞塊の存在下、間葉系細胞を播種し、前記軟骨細胞塊及び前記間葉系細胞を培養することによって、移植材料を調製する、工程を含むことを特徴とする、移植材料の製造方法。
請求項１０に記載の移植材料の製造方法により製造されたことを特徴とする、移植材料。
請求項９に記載の軟骨細胞塊が管状構造体の外表面に設けられていることを特徴とする、複合材。
前記管状構造体の内部に芯材が設けられている、請求項１２に記載の複合材。