JP2014027918A - 細胞構造体の製造方法、及び該方法により製造された細胞構造体 - Google Patents

Abstract

【課題】細胞にペレット状（準組織状）の構造体を自発的に形成させるのに好適な、細胞構造体の製造方法、及細胞構造体を提供する。
【解決手段】２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体の重合体と、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオールと、核酸、ヘパリン、ヒアルロン酸、デキストラン硫酸、ポリスチレンスルホン酸、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリリン酸、硫酸化多糖類、カードラン及びポリアルギン酸並びにこれらのアルカリ金属塩からなる群から選択される一種以上のアニオン性物質とを混合して細胞培養用組成物を調製する調製工程と、細胞培養用組成物で細胞培養器の培養面を被覆して、被覆細胞培養器を準備する準備工程と、細胞を、１．０×１０^３個／ｍｍ^２以上の細胞密度で、被覆細胞培養器の培養面上に播種する播種工程と、播種した細胞を培養する培養工程とを備える。
【選択図】図１

Description

本発明は、細胞構造体の製造方法、及び該方法により製造された細胞構造体に関し、特に、細胞の凝集により形成されるペレット状の細胞構造体の製造に好適な、細胞構造体の製造方法、及び該方法により製造された細胞構造体に関する。

近年、患者のＱＯＬの向上を目的として、オーダーメイド医療の実現が望まれている。オーダーメイド医療では、患者自身の細胞を用いて機能障害や機能欠損に陥った組織や臓器の再生を図る、再生医療が主要な役割を担う。

再生医療は、患者の組織から採取した細胞を、細胞培養器中で培養し、組織を形成させ、その後、その組織を患者に移植するというオペレーションを必要とする。

そのため、細胞を培養して、組織等の細胞構造体を形成させる技術や、細胞構造体をそのままの状態で回収する技術が所望されている。

一般的に、生体外に取り出された細胞は、その遺伝子制御に乱れを生じさせる様々なストレスを受けて、脱分化してしまうことが多く、また、細胞を増殖させるために脱分化させることが必要となる場合も多い。これにより、患者から採取した細胞を、単純な培養条件で培養しても、細胞は元の遺伝子発現状態を維持できないことが多いため、細胞構造体、ひいては組織を形成させることができず、また、その細胞の高度な機能を発揮することができないという問題がある。例えば、一般的なポリスチレン製の細胞培養皿で細胞培養を行った場合には、細胞が単層状の構造を形成するに留まり、高度に分化した細胞に見られる構造、例えば、軟骨細胞が生体内に存在している場合の形状であるペレット状の構造と同様の構造を有する細胞構造体を形成させることは困難であり、また、軟骨細胞に特異的な多くの機能が消失されてしまう。

上記問題に関しては、例えば、細胞に適当な刺激を与える（例えば、血管内皮細胞に増殖因子ＶＥＧＦを添加する）ことによって、細胞を分化させる細胞培養方法が知られている。

また、組織の構造を模倣した立体的構造を構築する細胞培養方法、例えば、スフェロイド培養、クラスター培養、ペレット培養、三次元担体培養等の方法が開発されている。立体的な構造を有する細胞外マトリックスを、細胞培養の足場（スキャホールド）として用いることにより、立体的な構造を有する細胞を作製する細胞培養方法（例えば、特許文献１参照）も知られている。

更に、緩やかなサインカーブを描く運動により生じる遠心力を利用して、細胞が所定の場所に偏らない条件として、細胞に、層状（シート状）の構造でなく、ペレット状（準組織状）の構造を形成させる細胞培養方法（例えば、特許文献２参照）や、細胞培養皿の底面を、平底形状ではなく、丸みを帯びた凹レンズ状の形状とすることにより、細胞の構造をペレット状の構造とする細胞培養方法も知られている。

特開２０１０−５２４４５８号公報 特開平７−０７５５５０号公報

しかしながら、従来のスフェロイド培養、クラスター培養、ペレット培養の場合には、機械的応力を印加する操作が含まれるため、細胞がつくる立体的構造の再現性や均質性が良好ではない。すなわち、操作者の技量やさじ加減に依存して、得られる細胞構造体がにバラツキが生じる。そのため、この細胞構造体を用いて得られる実験結果が、研究機関ごとに異なってしまう虞がある。
また、丸みを帯びた凹レンズ状の底面を有する細胞培養皿を用いた場合には、操作が単純であるために上記バラツキの問題は生じにくいものの、この培養方法で得られる細胞構造体は、少数の細胞からなる小さな凝集塊にすぎない。そのため、移植などの臨床目的での利用は困難であり、また、研究目的での利用も試料の量が少ないために効率が悪いという問題があった。

そこで、本発明は、細胞にペレット状の構造体を自発的に形成させることにより、操作者の技量に依存することなく簡便に、肉眼で視認できるほどのサイズの細胞構造体を製造することを可能にする、細胞構造体の製造方法を提供することを目的とする。
また、本発明は、上記製造方法により製造された細胞構造体を提供することも目的とする。

本発明の要旨は以下の通りである。
本発明の細胞構造体の製造方法は、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（以下、「ＤＭＡＥＭＡ」ともいう。）及び／又はその誘導体の重合体と、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール（以下、「トリス」ともいう。）と、核酸、ヘパリン、ヒアルロン酸、デキストラン硫酸、ポリスチレンスルホン酸、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリリン酸、硫酸化多糖類、カードラン及びポリアルギン酸並びにこれらのアルカリ金属塩からなる群から選択される一種以上のアニオン性物質とを混合して細胞培養用組成物を調製する調製工程と、前記細胞培養用組成物で細胞培養器の培養面を被覆して、被覆細胞培養器を準備する準備工程と、細胞を１．０×１０^３個／ｍｍ^２以上の細胞密度で、前記被覆細胞培養器の前記培養面上に播種する播種工程と、前記播種した細胞を培養する培養工程とを備えることを特徴とする。
なお、上記細胞密度は、生きた細胞の細胞密度とする。
またなお、本願明細書中に用いられる細胞密度の単位「個／ｍｍ^２」と、一般的な細胞密度の単位「個／ｍＬ」との対応関係は、各種細胞培養器（例えば、３５ｍｍ径〜１５０ｍｍ径のディッシュ、６ウェル〜９６ウェルのプレート、Ｔ２５〜Ｔ１６０のフラスコ等）の培養面の面積及びその適切な培地量を考慮すれば、当業者に明確に理解される。例えば、上記「１．０×１０^３個／ｍｍ^２以上の細胞密度」とは、当業者に周知の２４ウェル細胞培養プレートを細胞培養器として用いた場合には、「２０×１０^４個／ｍＬ以上の細胞密度」に相当する。

また、本発明の細胞構造体の製造方法では、前記細胞培養用組成物において、前記重合体に対する、前記２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオールの割合が、１．０以下であることが好ましい。

更に、本発明の細胞構造体の製造方法では、前記細胞培養用組成物において、Ｃ／Ａ比が０．５〜１６であることが好ましい。なお、本発明において「Ｃ／Ａ比」とは、組成物中に含まれる物質が有する正電荷の、組成物中に含まれる物質が有する負電荷に対する割合を指す。

更に、本発明の細胞構造体の製造方法では、前記被覆細胞培養器において、該被覆細胞培養器の培養面が、単位面積当たりに有する２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体の重合体の量が、５〜２００ｎｇ／ｍｍ^２であることが好ましい。

本発明の細胞構造体は、上記いずれかに記載の製造方法により製造されたことを特徴とする。

本発明の細胞構造体の製造方法によれば、細胞にペレット状の構造体を自発的に形成させることにより、操作者の技量に依存することなく簡便に、肉眼で視認できるほどのサイズの細胞構造体を製造することができる。
また、本発明の細胞構造体によれば、上記製造方法により製造されたペレット状の細胞構造体を提供することができる。

本発明の細胞構造体の製造方法に従って培養された、ペレット状の構造を有するラット皮下脂肪由来の血管内皮細胞を位相差顕微鏡で観察したときの写真である。 血管内皮細胞から無数の繊維芽細胞様の細胞が拡散した様子を捉えた写真である。 （ａ）は、本発明の細胞培養用組成物及び細胞培養器を用いて培養された、ペレット状の構造を有するラット皮下脂肪由来の間質細胞の細胞構造体がバイオチューブに接着した様子を実体顕微鏡で観察したときの写真であり、（ｂ）は、細胞構造体が接着したバイオチューブを（ａ）中のＸ−Ｘ’に沿って切断したときの断面を蛍光顕微鏡で観察したときの写真である。 本発明の細胞構造体の製造方法に従って培養された、管腔状（チューブ状）の構造を有するラット皮下脂肪由来の血管内皮細胞を位相差顕微鏡で観察したときの写真である。 本発明の細胞構造体の製造方法に従って、様々な細胞密度で培養された、ラット皮下脂肪由来の血管内皮細胞を位相差顕微鏡及び肉眼で観察したときの写真である。 細胞培養用組成物中のＣ／Ａ比を変化させて調製した、細胞培養用組成物を用いて、本発明の細胞構造体の製造方法に従って培養された、ラット皮下脂肪由来の血管内皮細胞を位相差顕微鏡で観察したときの写真である。 細胞培養用組成物中の重合体の含有量を変化させて調製した、細胞培養器を用いて、本発明の細胞構造体の製造方法に従って培養された、ラット皮下脂肪由来の血管内皮細胞を位相差顕微鏡で観察したときの写真である。 アニオン性物質を含まない組成物で被覆した細胞培養器を用いて培養された、ラット皮下脂肪由来の血管内皮細胞を位相差顕微鏡で観察したときの写真である。 （ａ）、（ｂ）本発明の細胞構造体の製造方法に従って培養された細胞の構造と、培養条件との相関を示す図である。 細胞培養用組成物中のＣ／Ａ比を変化させて調製した、本発明の細胞培養用組成物及び細胞培養器を用いて培養された、ラット皮下脂肪由来の間質細胞を位相差顕微鏡で観察したときの写真である。 曇点以上の温度で凝集させた重合体／トリス混合物を２５℃の条件にしたときの光透過率（濁度）の経時変化を示す図である。 細胞培養用組成物中の重合体に対するトリスの割合を変化させて調製した、本発明の細胞培養用組成物について、異なる温度で^１Ｈ ＮＭＲ測定した結果について示す図である。 細胞培養用組成物中の重合体に対するトリスの割合を変化させて調製した、本発明の細胞培養用組成物の示差走査熱量測定（ＤＳＣ）の結果について示す図である。 細胞培養用組成物中のＣ／Ａ比を変化させて調製した、本発明の細胞培養器の表面（固体表面）のゼータ電位を測定した結果について示す図である。 細胞培養用組成物中のＣ／Ａ比を変化させて調製した、本発明の細胞培養器の表面に沈殿させる前の微粒子のゼータ電位を測定した結果について示す図である。 （ａ）は、細胞培養プレートの表面を、ダイナミックタッピングモードで測定した画像を示す図であり、（ｂ）は、細胞培養プレートの表面を、位相モードで測定した画像を示す図である。 細胞培養用組成物中のＣ／Ａ比を変化させて調製した、本発明の細胞培養器の表面を、蛍光顕微鏡により観察したときの写真である（蛍光はアニオン性物質として用いた蛍光標識したＤＮＡに由来する）。 細胞培養用組成物中のＣ／Ａ比を変化させて調製した、本発明の細胞培養器の表面を、水中ＡＦＭにより観察したときの写真である。

ＤＭＡＥＭＡの重合体は、温度応答性高分子として公知であり、その下限臨界溶解温度（Lower Critical Solution Temperature、以下、「曇点」ともいう。）は３２℃程度である。そのため、ＤＭＡＥＭＡの重合体を含む細胞培養用組成物を被覆してなる細胞培養器を用いた場合には、例えば、室温（約２５℃）のクリーンベンチ内で細胞培養の操作を行う際に、被覆したポリマー層が再溶解して流失してしまうという問題があった。
なお、本願明細書中では、組成物の「曇点」とは、必ずしも厳密な意味で、「所定の温度未満では溶解するが、所定の温度以上では不溶化して沈殿する、その温度」を指すものではなく、「不溶化して沈殿した組成物を所定の温度未満の条件下で溶解する際に、溶解に要する時間が１０分以上である、その温度」をも指す。

本発明の課題を解決するにあたり、発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、室温（２５℃）程度の曇点を有する細胞培養用組成物を調製することに成功した。この細胞培養用組成物は、（１）２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）及び／又はその誘導体の重合体と、（２）２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール（トリス）と、（３）核酸、ヘパリン、ヒアルロン酸、デキストラン硫酸、ポリスチレンスルホン酸、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリリン酸、硫酸化多糖類、カードラン及びポリアルギン酸並びにこれらのアルカリ金属塩からなる群から選択される一種以上のアニオン性物質とを含む。
また、発明者らは、室温のクリーンベンチ内で操作しても、培養中の細胞を細胞培養器に接着させ続けることができ、培養した細胞構造体をそのままの状態で回収することができる、上記細胞培養用組成物を被覆してなる細胞培養器を調製した。

そして、この細胞培養器を用いて、一般的な細胞インキュベーター中で（３７℃で）、血管内皮細胞、脂肪幹細胞、肝細胞、軟骨細胞、線維芽細胞等の細胞を培養したところ、細胞は互いに集まって、ペレット状（準組織状）や管腔状（チューブ状）の細胞構造体を形成した。ここで、細胞構造体の形状は、細胞培養器に播種される細胞の密度に依存する傾向があることが見出された。

（細胞構造体の製造方法）
本発明の細胞培養方法は、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）及び／又はその誘導体の重合体と、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール（トリス）と、核酸、ヘパリン、ヒアルロン酸、デキストラン硫酸、ポリスチレンスルホン酸、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリリン酸、硫酸化多糖類、カードラン及びポリアルギン酸並びにこれらのアルカリ金属塩からなる群から選択される一種以上のアニオン性物質とを混合して細胞培養用組成物を調製する調製工程と、細胞培養用組成物で細胞培養器の培養面を被覆して、被覆細胞培養器を準備する準備工程と、細胞を、１．０×１０^３個／ｍｍ^２以上の細胞密度で、被覆細胞培養器の培養面上に播種する播種工程と、播種した細胞を培養する培養工程とを備えることを特徴とする。
以下、各工程の詳細を記載する。

（調製工程）
本発明の一例の細胞培養方法では、まず、細胞培養用組成物を調製する（調製工程）。具体的には、（１）２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）及び／又はその誘導体の重合体と、（２）２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール（トリス）と、（３）核酸、ヘパリン、ヒアルロン酸、デキストラン硫酸、ポリスチレンスルホン酸、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリリン酸、硫酸化多糖類、カードラン及びポリアルギン酸並びにこれらのアルカリ金属塩からなる群から選択される一種以上のアニオン性物質とを混合する。

（１）のＤＭＡＥＭＡ及び／又はその誘導体の重合体は、温度応答性ポリマーであり、その曇点は３２℃である。（２）のトリスは、曇点の若干の低下、及び／又は曇点よりも高温で形成されたポリマーが、曇点以下に冷却された際に再溶解する速度を低減させる役割を果たし、また、疎水化されたポリマー層中でも親水性を維持しながら、アミノ基に由来する陽電荷により細胞に刺激を与える役割を果たすと推定される。（３）のアニオン性物質は、培養する細胞の遊走や配向を可能にする役割や細胞傷害性を抑制する役割を果たすと推定される。

この細胞培養用組成物によれば、曇点を室温（２５℃）以下に低減させることができる。
上記組成物では、ＤＭＡＥＭＡ及び／又はその誘導体の重合体の側鎖とトリスとが、互いに相互作用（例えば、架橋する作用）して、上記重合体が凝集しやすくなっていると推定される。

ここで、上記（１）について、ＤＭＡＥＭＡ及び／又はその誘導体の重合体としては、数平均分子量（Ｍｎ）が、１０ｋＤａ〜５００ｋＤａである分子が好ましい。また、重量平均分子量（Ｍｗ）と数平均分子量（Ｍｎ）との比（Ｍｗ／Ｍｎ）は、１．１〜６．０である分子が好ましい。

また、（１）のＤＭＡＥＭＡの誘導体としては、例えば、メタクリレートのメチル基の水素原子をハロゲン置換した誘導体、メタクリレートのメチル基を低級アルキル基で置換した誘導体、ジメチルアミノ基のメチル基の水素原子をハロゲン置換した誘導体、ジメチルアミノ基のメチル基を低級アルキル基で置換した誘導体が挙げられる。

上記（２）について、トリスは、純度９９．９％以上の純物質であるか、又は、トリス水溶液を、アルカリ性物質の添加などにより、使用時に中性又は塩基性とすることが好ましい。トリスは、塩酸塩の状態で市販されているところ、これを用いた場合には、トリス水溶液のｐＨが下がるため、組成物の曇点が７０℃程度にまで上昇してしまう。そのため、トリス塩酸塩は好ましくない。

上記（３）に列挙したアニオン性物質のうち、核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、その他１本鎖、２本鎖、オリゴ体、ヘアピンなどの人工核酸などが挙げられる。

また、上記（３）に列挙したアニオン性物質は、ある程度の大きさ、例えば１ｋＤａ〜５，０００ｋＤａの分子量（Ｍ）を有していることが好ましい。
分子量を上記範囲とすれば、アニオン性物質は、カチオン性物質とイオン結合して、カチオン性物質を、長時間捕捉する役割を果たすことができ、安定したイオン複合体微粒子を形成させることがでる。また、一般的にカチオン性物質が有する、細胞の細胞膜表面に対する静電的相互作用に起因する細胞傷害性を緩和することもできる。

（３）に列挙したアニオン性物質の他にも、例えば、カチオン性ポリマーであるポリ（４−アミノスチレン）の４−位のアミノ基に対してシュウ酸などのジカルボン酸を脱水縮合させることによって、アニオン性官能基を導入した、実質的にアニオン性物質として機能するポリマー誘導体も、本発明では用いることができる。

なお、上記（３）に列挙したアニオン性物質は、二種以上含まれていてもよい。

本発明の細胞構造体の製造方法では、（１）２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）及び／又はその誘導体の重合体に対する、（２）２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール（トリス）の割合（（２）／（１））が、１．０以下とした細胞培養用組成物を用いることが好ましい。
なお、割合（（２）／（１））は、重量割合であるものとする。

上記割合の細胞培養用組成物を用いた細胞構造体の製造方法によれば、培養工程で、細胞構造体を形成しやすくすることができる。
この組成物によれば、上記組成物の親水性と疎水性とのバランスを更に好適にすることができる。そして、この好適なバランスが、培養面への細胞の接着性を好適に調整し、細胞の遊走や配向を活性化していると推定される。

また、上記割合は、０．１以上あることが好ましい。
上記割合を０．１以上とすることにより、曇点を低減させるという上記効果が得られやすい。また、細胞構造体を形成しやすくするという上記効果が得られやすい。

上記と同様の理由により、上記割合（（２）／（１））は、０．１〜０．５であることが更に好ましい。

本発明の細胞構造体の製造方法では、細胞培養用組成物中のＣ／Ａ比（正電荷／負電荷）が、０．５〜１６であることが好ましい。
なお、本発明において、Ｃ／Ａ比とは、組成物中に含まれる物質が有する正電荷の、組成物中に含まれる物質が有する負電荷に対する割合を指す。具体的には、Ｃ／Ａ比は、（１）ＤＭＡＥＭＡ及び／又はその誘導体の重合体のモル数をＮ１、（３）アニオン性物質のモル数をＮ３としたときに、｛（重合体１分子当たりの正電荷）×Ｎ１｝／｛（アニオン性物質１分子当たりの負電荷）×Ｎ３｝という式で表される。
またなお、本発明ではアニオン性物質をＤＮＡとした場合、アニオン性物質１分子当たりの負電荷数は、ＤＮＡの塩基対の数（ｂｐ数）×２で計算し、分子量（Ｄａ）は、ｂｐ数×６６０（ＡＴペア及びＣＧペアの平均分子量）で計算するものとする。

Ｃ／Ａ比を０．５〜１６とすることにより、細胞構造体を形成させやすくするという上記効果が得られやすくなる。
上記組成物中の正電荷と負電荷とのバランスを好適にして、正電荷による細胞傷害性を抑制することができると推定される。また、上記組成物の親水性と疎水性とのバランスを更に好適にして、細胞の遊走や配向を生じやすくすることができると推定される。

上記と同様の理由により、上記Ｃ／Ａ比は、２〜１０とすることが更に好ましく、特にＣ／Ａ比は８付近であることが最も好ましい。

（準備工程）
次いで、調製した細胞培養用組成物を細胞培養器の培養面に被覆して、被覆細胞培養器を準備する（準備工程）。

この被覆細胞培養器によれば、細胞を培養した場合に、例えば、室温のクリーンベンチ内で操作する際においても、上記組成物はある程度の時間、具体的には５分〜４０分間、固化したままであるため、上記組成物、ひいては培養中の細胞を細胞培養器に接着させ続けることができる。

上記被覆細胞培養器では、培養工程で、上記組成物に含まれるＤＭＡＥＭＡ及び／又はその誘導体の重合体の疎水性側鎖と、トリスのアミノ基とが、何らかの相互作用をしながら、細胞に刺激を与えるものと推定される。
また、上記組成物に含まれるアニオン性物質は、培養工程で、上記組成物中の正電荷と負電荷とのバランスを好適にして、細胞傷害性を抑制し（哺乳類細胞の細胞膜の表面は負電荷を帯びているため、カチオン性物質は細胞傷害性を有することが多い）、且つ、上記組成物の親水性と疎水性とのバランスを好適にして、細胞の遊走や配向を可能にするものと推定される。
なお、上記被覆細胞培養器は、培養面に上記（１）及び上記（２）のみからなる組成物を被覆してなる被覆細胞培養器と比較して、細胞毒性、細胞傷害性が抑制され、細胞培養に適した表面状態を有していると推定される。

ここで、上記被覆細胞培養器では、該細胞培養器の培養面が単位面積当たりに有する、細胞培養用組成物中に含まれる（１）２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）及び／又はその誘導体の重合体の量が、５〜２００ｎｇ／ｍｍ^２であることが好ましい。

上記（１）の単位面積当たりの量を、５〜２００ｎｇ／ｍｍ^２とすれば、細胞構造体を形成しやすくするという本発明の細胞培養用組成物の効果が得られやすい。

上記と同様の理由及びコスト上の理由により、上記重合体の単位面積当たりの量は、５〜５０ｎｇ／ｍｍ^２であることが更に好ましい。

ここで、上記被覆細胞培養器は、例えば、曇点以下の温度まで冷却した細胞培養用組成物の水溶液を、被覆細胞培養器のウェルの底面に流延させて、その後、３７℃のインキュベーター中で静置して、上記組成物を被覆するために使用した不要な水（上澄液）を除去して、その後、上記組成物を固化させることにより調製することができる。
上澄液の除去を、アスピレーターを用いて行うことが好ましい。これにより、培地の希釈を避け、且つ、上澄液中の微量の成分の影響を除くことができる。

（播種工程）
そして、準備した被覆細胞培養器に、細胞を、１．０×１０^３個／ｍｍ^２以上の細胞密度で、被覆細胞培養器の培養面上に播種する（播種工程）。
この工程は、例えば、３７℃のインキュベーター中に静置しておいた被覆細胞培養器を、室温のクリーンベンチに取り出して、行うことができる。

上記細胞密度に関して、例えば、２００ｍｍ^２の培養面の面積及び１ｍＬの培地容量を有する２４ウェルプレートに、播種する場合に、１．０×１０^３個／ｍｍ^２以上の細胞密度で播種を行うためには、２０×１０^４個／ｍＬ以上の細胞密度を有する細胞浮遊液を用いる必要がある。

本発明の細胞培養方法は、軟骨細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞、心筋細胞等の間葉系細胞に対して、特に好適に適用することができる。初代細胞の場合は、コロニーを形成する接着性細胞を選択すれば良く、当業者によって適宜選択可能である。

上記細胞密度で細胞を播種すれば、詳細なメカニズムは不明であるが、下記の培養工程で、ペレット状の構造を有する細胞構造体を形成させることができる。この細胞構造体は、そのペレット状の構造内に生存している細胞を有する。

また、上記細胞密度は、培養中の細胞同士の接触による増殖停止などの、細胞周期に関する問題を生じにくくするため、５．０×１０^３個／ｍｍ^２以下とすることが好ましい。

そして、上記細胞密度は、１．５×１０^３個／ｍｍ^２〜３．０×１０^３個／ｍｍ^２とすることが更に好ましい。上記細胞密度を上記範囲とすれば、下記の培養工程で、ペレット状の構造を有する細胞構造体を形成しやすくするという上記効果が得られやすい。

（培養工程）
最後に、播種された細胞を培養する（培養工程）。
この工程は、例えば、一般的な３７℃の細胞インキュベーターを用いて行うことができる。

また、培養時間、使用される培地等の培養条件は、細胞種や実験目的に基づいて、当業者は適切に定めることができる。

本発明の細胞構造体の製造方法によれば、軟骨細胞などが分化したときに見られるペレット状の構造と同様な構造を有する、ペレット状の細胞構造体を細胞培養器内に再現することを可能にし、分化した細胞中で発現しているＤＮＡ、ｍＲＮＡ、タンパク質等の情報を得ることができる。具体的には、細胞内におけるタンパク質間の相互作用や、細胞の生理活性物質に対する応答性の解析などが可能になる。そのため、本発明の細胞構造体の製造方法は、医薬品の研究や分子生物学の基礎研究のための有用なツールを提供することができる。

（細胞構造体）
本発明の細胞構造体は、上記本発明の細胞構造体の製造方法により製造することができる。

以下、試験例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明は下記の試験例に何ら限定されるものではない。

（試験Ａ）
（試験Ａ１）細胞構造体の製造
（試験Ａ１ａ）細胞培養用組成物の調製（調整工程）
（Ａ１ａ−１）温度応答性ポリマーの合成
容量５０ｍＬの軟質ガラス製の透明なバイアル瓶に、２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）メタクリレート７．０ｇを加えて、磁気撹拌器を用いて撹拌した。そして、この混合物（液体）に対してＧ１グレードの高純度（純度：９９．９９９９５％）の窒素ガスを１０分間パージ（流速：２．０Ｌ／分）することにより、この混合物を脱酸素した。
その後、この反応物に対して、丸型ブラック蛍光灯（ＮＥＣ社製、型番ＦＣＬ２０ＢＬ、１８Ｗ）を用いて、２１時間紫外線照射することにより、上記反応物を、溶媒を用いることなく（すなわち、ニート条件下で）、重合させた。反応物は、５時間後に粘性を帯び、１５時間後に固化して、重合体が、反応生成物として得られた。この反応生成物を、クロロホルムに溶解させ、その後、ｎ−ヘキサンを用いて再沈殿させた。クロロホルム／ｎ−ヘキサンを用いた上記再沈殿を、計６回繰り返すことにより、反応生成物を精製した。
精製した重合体をエバポレーションすることにより、その中に残留する溶媒を除去した。その後、重合体を１５０ｍＬのベンゼンに溶解させ、ＰＴＦＥ製の０．４５μｍフィルター（ポール社製、型番：Ｅｋｉｃｒｏｄｉｓｋ ２５ＣＲ）で濾過し、得られた濾液を凍結乾燥させることにより、カチオン性の温度応答性（ホモ）ポリマーが得られた（収量４．３ｇ、転化率：６１．４％）。このポリマーの数平均分子量（Ｍｎ）を、ＧＰＣ（島津社製、型番：ＬＣ−１０ｖｐシリーズ）を用いて、ポリエチレングリコール（Ｓｈｏｄｅｘ社製、ＴＳＫシリーズ）を標準物質として測定し、Ｍｎ＝９７，０００（Ｍｗ／Ｍｎ＝４．１）と決定した。
また、このポリマーの核磁気共鳴スペクトル（ＮＭＲ）を、核磁気共鳴装置（Ｖａｒｉａｎ社製、型番：Ｇｅｍｉｎｉ３００）を用いて、重水（Ｄ_２Ｏ）中で測定した。結果は下記の通りである。
¹H-NMR (in D₂O) δ 0.8-1.2 (br, 3H, -CH₂-C(CH₃)-), 1.6-2.0 (br, 2H, -CH₂-C(CH₃)-), 2.2-2.4 (br, 6H, -N(CH₃)₂), 2.5-2.7 (br, 2H, -CH₂-N(CH₃)₂), 4.0-4.2 (br, 2H, -O-CH₂-)

（Ａ１ａ−２）ポリマー／トリス／アニオン性物質混合物の調製
以下、ＤＮａｓｅ及びＲＮａｓｅフリーの無菌水を用いた。
（Ａ１ａ−１）で合成した温度応答性ポリマーを水溶液を調製し、この水溶液を４℃まで冷却することにより、この溶液を液体状態とし、冷却下で２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール（トリス）（和光純薬製、Ｔｒｉｓ９９９）の顆粒を加えて、速やかに溶解させ、０．２μｍ混合セルロース膜フィルターでろ過し、ポリマー／トリス混合物の水溶液（最終濃度は、ポリマー：１００μｇ／ｍＬ、トリス：１００μｇ／ｍＬ）を得た。
一方、アニオン性物質として、ホタルルシフェラーゼレポーターベクター（ＤＮＡ）（プロメガ社製、ｐＧＬ３−Ｃｏｎｔｒｏｌ、型番：Ｅ１７４１）を用い、このＤＮＡを無菌水に溶解させた（最終濃度：３３μｇ／ｍＬ）。このＤＮＡ溶液３００μLに、上記ポリマー／トリス混合物の水溶液４００μＬを少しずつ滴下して混合した。
そして、この混合物を水１，３００μＬで希釈して、溶液の全量が約２，０００μＬとなるように調整し、ポリマー／トリス／アニオン性物質混合物、すなわち、本発明の細胞構造体の製造方法に用いる細胞培養用組成物の水溶液（最終濃度、ポリマー：２０μｇ／ｍＬ、トリス：２０μｇ／ｍＬ、ＤＮＡ：５μｇ／ｍＬ）を得た。
この細胞培養用組成物のＣ／Ａ比（正電荷／負電荷）は、８．０であった。

（Ａ１ａ−３）ポリマー／トリス／アニオン性物質混合物の曇点の測定
（Ａ１ａ−２）で調製したポリマー／トリス／アニオン性物質混合物の水溶液の、６６０ｎｍにおける吸光度を、２０℃〜４０℃の間で、低温側から高温側に向かって測定した。
その結果、２０℃〜２８℃では、水溶液は透明であり、吸光度がほぼ０であったが、２９℃付近から水溶液中に白濁が見られるようになり、３０℃付近から吸光度が急激に上昇した。これにより、上記ポリマーは、約３０℃の曇点を有することを確認した。
また、冷蔵庫中で冷却して透明な水溶液に戻した、（Ａ１ａ−３）で調整した混合物水溶液を３７℃まで昇温させると、混合物水溶液は、良好な応答性で、懸濁し、その後、水溶液全体が固化した。この固化物を室温（２５℃）で維持したところ、２４時間〜４８時間の間、固化した状態のままであったが、その後、固化物が徐々に溶解して、均質な水溶液に変化した。これにより、室温付近における固相から液相への相転移の速度が小さくなっていることが確認された。
上記（Ａ１ａ−２）における、温度応答性ポリマー単体の曇点の測定では、温度変化（昇温及び降温速度は共に１℃／分）に対して良好な応答性で、相転移が生じたことを考慮すると、応答性の遅延が顕著であった。

（試験Ａ１ｂ）細胞培養器に対する細胞培養組成物の被覆（被覆工程）
（Ａ１ａ−２）で調整した細胞培養用組成物の水溶液を４℃まで冷却することにより、この溶液を液体状態とし、ポリスチレン製の２４ウェル細胞培養プレート（イワキ社製、マイクロプレート、型番：３８１５−０２４、１ウェル当たりの底面積：２００ｍｍ^２）の各ウェルに、この溶液を２００μＬずつ、室温下で加えて、素早く穴の底面の全面に流延させた。そして、この細胞培養皿を、細胞培養インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）中で６時間インキュベートした。
こうして、培養面であるウェルに細胞培養用組成物を被覆してなる２４ウェル細胞培養プレート（細胞培養器）が得られた。

（試験Ａ１ｃ、Ａ１ｄ）細胞の培養（播種工程、培養工程）
室温条件下において、試験Ａ１ｂで準備した２４ウェル細胞培養プレートの各ウェルに、ラット皮下脂肪由来の血管内皮細胞（初代培養細胞）を、完全培地（ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）＋１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）溶液、
ＤＭＥＭ：ギブコ社製、型番：１１９６５、ＦＣＳ：インビトロジェン社製、ロット番号：８５２５４６）中に浮遊させ、細胞密度を１５×１０^２個／ｍｍ^２（３０×１０^４個／ｍＬ）に調整した、培養液を１ｍＬずつ加えた。播種初期の状態の顕微鏡写真の撮影も含めてこの操作には、５分〜１０分を要した。そして、この細胞を３７℃の細胞培養インキュベーター中で培養した（試験例Ａ１）。
７０時間後に、細胞はコンフルエントの状態となった。更に培養を続けたところ、培養５日目に、培養皿の端部から全ての細胞が一度に剥離して、まるでシートが丸まりながら収縮して行くような動作で、細胞が互いに一箇所に凝集する現象が生じた。上記現象は、肉眼で十分に視認可能であった。互いに集まった細胞は、立体的なペレット状の構造を形成した（図１）。この構造を、位相差顕微鏡で更に詳細に観察すると、これらの細胞が、あたかも何らかの組織を形成するかのように自発的に集合していることを示した（試験例Ａ１）。

得られたペレット状の構造体を、コーティング処理が施されていない通常の２４ウェル細胞培養プレートに移して、更に培養を続けたところ、ペレット状の構造体から無数の繊維芽細胞様の細胞が、ブリードするように放射状に拡散して、培養皿の全面に広がって接着した。これにより、肉眼で視認できるほどの大きさの細胞塊では、通常、内部の細胞がネクローシスを生じ、死滅してしまうこととは対照的に、ペレット状の構造体中の細胞は、生存していることが確認された（図２）。

（比較試験Ａ１）
（比較試験Ａ１ａ、Ａ１ｂ）細胞培養用組成物及び細胞培養器の調製
試験Ａ１ａと同様に、細胞培養用組成物を調製し、試験１ｂと同様に、細胞培養器を調製した。

（比較試験Ａ１ｃ、Ａ１ｄ）細胞の培養
比較試験Ａ１ｂで準備した２４ウェル細胞培養プレートの各ウェルに、ラット皮下脂肪由来の血管内皮細胞（初代培養細胞）を、上記完全培地中に浮遊させ、細胞密度を５．０×１０^２個／ｍｍ^２（１０×１０^４個／ｍＬ）に調整した、培養液を１ｍＬずつ加えた。そして、この細胞を細胞培養インキュベーター中で培養した（比較試験例Ａ１）。
７０時間後に、細胞はコンフルエントの状態となった。更に培養を続けたところ、一部の細胞がプレート上を移動し、細胞が互いに集まる現象が生じて、プレート表面の露出が確認されるようになった。
５日目に、上記露出する領域は、肉眼で確認できるようになり、一方、互いに集まった細胞は、二次元平面で見て網目状の構造を形成した。この網目状の構造を、更に詳細に観察したところ、細胞の集合体は、管腔状（チューブ状）の構造を形成していることが確認され、これらの細胞が、あたかも血管を形成するかのように自発的に集合していることを示した（図４）。

（試験Ａ２）細胞密度の検討
下記に示す条件以外は、試験Ａ１と同様とした。詳細な条件は表１に示す。
（試験Ａ２ａ）細胞培養用組成物の調製（調整工程）
アニオン性物質として、ＧＦＰ発現ベクターｐＱＢＩ２５（ＤＮＡ）を用いた。また、重合体に対するトリスの割合を０．１とした。
トリスの含有量のみを変えることにより、重合体に対するトリスの割合を０．１とした、ポリマー／トリス混合物の水溶液を、試験Ａ１ａの（Ａ１ａ−２）と同様に、調製した。
この細胞培養用組成物のＣ／Ａ比（正電荷／負電荷）を８．４とした。

（試験Ａ２ｃ、Ａ２ｄ）細胞の培養（播種工程、培養工程）
接着性のラット皮下脂肪由来の血管内皮細胞（初代培養細胞）を用いた。そして、細胞密度を、３．８×１０^２個／ｍｍ^２（７．５×１０^４個／ｍＬ）、７．５×１０^２個／ｍｍ^２（１５×１０^４個／ｍＬ）、１５×１０^２個／ｍｍ^２（３０×１０^４個／ｍＬ）とした（それぞれ、試験例Ａ２、試験例Ａ３、試験例Ａ４）。
上記以外は、試験Ａ１ｃ、Ａ１ｄと同様に、細胞培養を行った。図５に、位相差顕微鏡で観察した図を示す。
７０時間後に、細胞はコンフルエントの状態となった。更に培養を続けたところ、５日目に、試験例Ａ２及び試験例Ａ３では、一部の細胞がプレート上を移動し、細胞が互いに集まる現象が生じ、その細胞の集合体は、管腔状（チューブ状）の構造を形成した（図５）。一方、試験例Ａ４では、細胞の集合体が凝集してペレット状の構造を形成した（図５）。図５から、試験例Ａ２の管腔状の構造の方が、試験例Ａ３の管腔状の構造よりも均質性が高く、また、試験例Ａ４では、一部の細胞層が完全に剥離してペレット構造体を形成しつつあることが分かる。

（試験Ａ３）アニオン性物質の割合の検討（Ｃ／Ａ比の検討）
下記に示す条件以外は、試験例１と同様とした。詳細な条件は表１に示す。
（試験Ａ３ａ）細胞培養用組成物の調製（調整工程）
アニオン性物質の含有量のみを変えることにより、細胞培養用組成物中のＣ／Ａ比（正電荷／負電荷）を、０．５、２、４、８、１６として、ポリマー／トリス／アニオン性物質混合物を、試験Ａ１ａの（Ａ１ａ−２）と同様に、調製した（それぞれ、試験例Ａ５、試験例Ａ６、試験例Ａ７、試験例Ａ８、試験例Ａ９）。

（試験Ａ３ｃ、Ａ３ｄ）細胞の培養（播種工程、培養工程）
接着性のラット皮下脂肪由来の血管内皮細胞（初代培養細胞）を用いた以外は、試験Ａ１ｂと同様に、細胞培養を行った。ここで、細胞密度は、７．５×１０^２個／ｍｍ^２（１５×１０^４個／ｍＬ）とした。図６に、位相差顕微鏡で観察した図を示す。
５日目に、試験例Ａ８では、細胞の集合体は、管腔状（チューブ状）の構造を形成していることが確認された（図６）。一方、試験例Ａ５及び試験例Ａ６では、接着した細胞が、通常の培養をした場合に観察されるような良好な接着伸展性を示し（図６）、試験例Ａ７では、一部の細胞がプレート上を移動し、細胞が互いに集まる現象が生じて、多くの小さな凝集体が形成され（図６）、試験例Ａ９では、ほとんどの細胞が死滅した（図６）。

（試験Ａ４）細胞培養用組成物の水溶液中に含まれるポリマーの含有量の検討
下記に示す条件以外は、試験Ａ１と同様とした。詳細な条件は表１に示す。
（試験Ａ４ａ）細胞培養用組成物の調製（調整工程）
トリスの含有量のみを変えることにより、重合体に対するトリスの割合を０．１とした、ポリマー／トリス混合物の水溶液を、試験Ａ１ａの（Ａ１ａ−２）と同様に、調製した。
この細胞培養用組成物のＣ／Ａ比（正電荷／負電荷）を８．４とした。

（試験Ａ４ｂ）細胞培養器の準備（準備工程）
ポリスチレン製の２４ウェル細胞培養プレートの各ウェルに加える細胞培養用組成物の水溶液中に含まれる温度応答性ポリマーの含有量を１．０、２．０、４．０、８．０μｇとして、試験Ａ１ｂと同様に、細胞培養器に対して細胞培養組成物を被覆した（ウェルが単位面積当たりに有する温度応答性ポリマーの量は、それぞれ、５、１０、２０、４０ｎｇ／ｍｍ^２）。そして、培養面に細胞培養用組成物を被覆してなる２４ウェル細胞培養プレート（細胞培養器）が得られた（それぞれ、試験例Ａ１０、試験例Ａ１１、試験例Ａ１２、試験例Ａ１３）。

（試験Ａ４ｃ、Ａ４ｄ）細胞の培養（播種工程、培養工程）
接着性のラット皮下脂肪由来の血管内皮細胞（初代培養細胞）を用いた。そして、細胞密度を３．８×１０^２個／ｍｍ^２（７．５×１０^４個／ｍＬ）とした。
上記以外は、試験Ａ１ｄと同様に、細胞培養を行った。図７に、位相差顕微鏡で観察した図を示す。
５日目に、試験例Ａ１１では、細胞の集合体は、ペレット状の構造を形成した（図７）。一方、試験例Ａ１０では、接着した細胞が、通常の培養をした場合に観察されるような良好な接着伸展性を示し（図７）、試験例Ａ１２及び試験例Ａ１３では、細胞の集合体は、管腔状（チューブ状）の構造を形成した（図７）。

（試験Ａ５）アニオン性物質の検討：ヘパリンを用いた場合
下記に示す条件以外は、試験Ａ１と同様とした。詳細な条件は表１に示す。
（試験Ａ５ａ）細胞培養用組成物及び細胞培養器の調製
アニオン性物質としてヘパリンを用いた。ポリマー／トリス／アニオン性物質混合物は、３０〜３２℃の曇点を有することが確認でき、また、３７℃まで昇温させて固化させた上記混合物を室温（２５℃）で維持したところ、数分〜２４時間の間、固化した状態のままであったが、その後、固化物が徐々に溶解して、均質な水溶液に変化することが確認できた。
そして、培養面に上記混合物を被覆してなる細胞培養器が得られた。この細胞培養器は、高い細胞親和性を有し、また、抗血栓性を示した。
発明者らは、上記試験Ａ５に係る細胞培養用組成物について、非特許文献“Nakayama, Y., Yamaoka, S., Nemoto, Y., Alexey, B., Uchida, K., Thermoresponsive Heparin Bioconjugate as Novel Aqueous Anti throrombogenic Coating Material, Bioconjugate Chem., 2011, 22, 193-199.”に報告した。

（比較試験Ａ２）非被覆の細胞培養器
下記に示す条件以外は、試験１と同様とした。詳細な条件は表１に示す。
未処理の、又はフィブロネクチンを被覆した、ポリスチレン製の２４ウェル細胞培養プレートの各ウェルに、試験Ａ１ｃと同様に、細胞播種を行い、この細胞を細胞培養インキュベーター中で培養した。
３日後に、細胞はコンフルエントの状態となった。更に培養を続けたところ、大部分の細胞は増殖を止めたものの、ごく一部の細胞は、培養面に接着した細胞の上に重なるように増殖した。そして、ネクローシス、融合、剥離浮遊等を生じる細胞が増加して、多くの細胞が死滅した（この細胞死は、死細胞から放出された分解酵素やＨＳＰ（ヒートショックプロテイン）の影響であると推測される）（下記の図８に示す結果と同様の結果が得られた）。実施例Ａ１ｂのように、プレート表面の露出や、細胞の管腔状（チューブ状）やペレット状の構造は、確認されなかった。

（比較試験Ａ３）アニオン性物質を含まない組成物で被覆した細胞培養器
下記に示す条件以外は、試験Ａ１と同様とした。詳細な条件は表１に示す。
アニオン性物質を含まない、（Ａ１ａ−２）で調製したポリマー／トリス混合物の水溶液を用いて、試験Ａ１ｂと同様に、細胞培養器の培養面に細胞培養用組成物を被覆した。そして、細胞培養用組成物を被覆してなる２４ウェル細胞培養プレート（細胞培養器）が得られた。

ラット皮下脂肪由来の血管内皮細胞（初代培養細胞）を用いた。そして、細胞密度を７．５×１０^２個／ｍｍ^２（１５×１０^４個／ｍＬ）とした。
上記以外は、試験Ａ１ｄと同様に、細胞培養を行った。培養初期（培養６時間後）に、ほとんどの細胞は接着しておらず、培養２日目には、ほとんどの細胞がネクローシスしていることが確認された（図８）。

（試験Ａ１０）細胞構造体の製造
（試験Ａ１０ａ）細胞培養用組成物の調製
（Ａ１０ａ−２）ポリマー／アニオン性物質混合物の調製
アニオン性物質として、ポリアクリル酸ナトリウム（ＰＡＡＮａ）を用いた。ポリアクリル酸（数平均分子量Ｍｎ＝４．０×１０^６ｇ／ｍｏＬ）を秤量し、これに分子中のカルボキシル基と化学量論的に等モル数の水酸化ナトリウムを混合し、更に水を加えて水溶液とした。この水溶液を７２時間攪拌した後に凍結乾燥させることにより粉末を得て、この粉末を以下の実験に用いた。この粉末の調整方法は当業者に周知である。２０μＬのポリマーの水溶液（８５μｇ／ｍＬ）、３０μＬのポリアクリル酸ナトリウム水溶液（３３μｇ／ｍＬ）、及び生理食塩水を調整した。試験Ａ１と同様に、これらを混合し、Ｃ／Ａ比を０．５、１、２、４、６とした混合物を、異なるポリマー及びポリアクリル酸ナトリウム量について、調整した。そして、この混合物をそれぞれの条件において適量の生理食塩水で希釈して、溶液の全量が２００μＬとなるように調整し、ポリマー／アニオン性物質混合物、すなわち細胞培養用組成物の水溶液を得た。詳細な条件は表１に示す。

（Ａ１０ｂ）細胞培養器に対する細胞培養用組成物の被覆（被覆工程）
（Ａ１０ａ−２）で調整した細胞培養用組成物の水溶液を用いて、（Ａ１ａ−７）と同様に、ポリスチレン製の２４ウェル細胞培養プレート（１ウェル当たりの底面積：２００ｍｍ^２）の各ウェルを被覆した。
こうして、培養面であるウェルに細胞培養用組成物を被覆してなる２４ウェル細胞培養プレート（細胞培養器）が得られた。

（試験Ａ１０ｃ−１、１０ｄ−１）細胞の培養（播種工程、培養工程）
ラット皮下脂肪由来の間質細胞（初代培養細胞）を用いて、細胞密度を１０×１０^４個／ｍＬ（細胞密度：５．０×１０^２個／ｍｍ^２）とした以外は、（試験Ａ１ｃ）、（試験Ａ１ｄ）と同様に、細胞培養を行った（試験例Ａ１４〜Ａ２８）。
６日後に、細胞を観察した。Ｃ／Ａ比を０．５とした試験例Ａ１４では細胞に変化は見られず、Ｃ／Ａ比を１、２とした試験例Ａ１５、Ａ１６では、細胞の集合体は多数の小さな凝集体を形成し、Ｃ／Ａ比を４とした試験例Ａ１７では、細胞の集合体は管腔状（チューブ状）の構造を形成し、Ｃ／Ａ比を６とした試験例Ａ１８では、ほとんどの細胞が死滅した（図１０、上段）。また、Ｃ／Ａ比を０．５とした試験例Ａ１９では細胞に変化は見られず、Ｃ／Ａ比を１とした試験例Ａ２０では、細胞の集合体は多数の小さな凝集体を形成し、Ｃ／Ａ比を２とした試験例Ａ２１では、細胞の集合体は管腔状（チューブ状）の構造を形成し、Ｃ／Ａ比を４、６とした試験例Ａ２２、Ａ２３では、ほとんどの細胞が死滅した（図１０、中段）。更に、Ｃ／Ａ比を０．５とした試験例Ａ２４では細胞に変化は見られず、Ｃ／Ａ比を１とした試験例Ａ２５では、細胞の集合体は多数の小さな凝集体を形成し、Ｃ／Ａ比を２、４、６とした試験例Ａ２６、Ａ２７、Ａ２８では、ほとんどの細胞が死滅した（図１０、下段）。

（試験Ａ１０ｃ−２、１０ｄ−２）細胞の培養（播種工程、培養工程）
ラット皮下脂肪由来の間質細胞（初代培養細胞）、及びＧＦＰ発現ベクターｐＱＢＩ ２５（ＤＮＡ）を用いて、細胞密度を１０．０×１０^４個／ｍＬ（細胞密度：５．０×１０^２個／ｍｍ^２）とした以外は、（試験Ａ１ｃ）と同様に、細胞培養を行った（試験例Ａ２９）。詳細な条件は表１に示す。１日後に、（試験Ａ１ｃ）と同様に、ペレット状の細胞構造体（直径約１ｍｍ）が形成した。
１００ｍｍ径の細胞培養皿に１０ｍＬの培地を入れ、ここにバイオチューブを沈めた。上記（試験Ａ１ｃ）で得たペレット状の細胞構造体をピンセットで掴み、これをバイオチューブ上に載せたところ、５分後に細胞構造体はバイオチューブに接着して剥がれなくなった（図３（ａ）参照）。そのまま３７℃で７日間インキュベートすると、ペレット状の細胞構造体は、その体積を減少させて、バイオチューブとの境界が実体顕微鏡を用いた観察では区別できなくなった。このバイオチューブを共焦点レーザー顕微鏡を用いて、バイオチューブのＸ−Ｘ’に沿ってクロスセクション観察したところ、ＧＦＰ陽性の細胞がバイオチューブ中へ浸潤して生着していることが分かった。（図３（ｂ）。上記現象は、ペレット状の細胞構造体からブリードした細胞が速やかに接着したものと考えられる。
これらの結果から、ペレット状の細胞構造体を、（１）培養細胞の層に載せることによって簡単に異種細胞の共培養を行える可能性、（２）生体組織と接触させることによって、細胞構造体を形成する細胞を組織に向かって浸潤させて接着させる可能性、（３）生体組織の欠損部位へ載せたり被覆したりすることによって、欠損部位に細胞を補填できる可能性が示された。

なお、本実施例で用いたバイオチューブ（人工血管とも言う）は、コラーゲンを主成分とするものであり、特開平２００４−２６１２６０号公報、の実施例に記載される方法で作成されたものであるが、単にコラーゲンフィルムを巻いて作成したチューブを用いた場合にも同様の現象が生じる。

上記試験例Ａ及び比較試験例Ａの結果を表１に示す。また、本発明の細胞培養用組成物及び細胞培養器を用いて培養された細胞の構造と、培養条件との相関を図９に示す。

（試験Ｂ）ポリマー／トリス混合物の解析
（試験Ｂ１）ポリマー／トリス混合物の曇点の測定
ポリマーの最終濃度を０．１％、重合体に対するトリスの割合を０、０．５、１、２、４、８として、（試験Ａ）の（試験Ａ１ａ）（Ａ１ａ−３）と同様に、ポリマー／トリス混合物の水溶液を調整した（それぞれ、試験例Ｂ１、試験例Ｂ２、試験例Ｂ３、試験例Ｂ４、試験例Ｂ５、試験例Ｂ６）。

（試験Ａ）の（試験Ａ１ａ）（Ａ１ａ−３）で調製したポリマー／トリス混合物の水溶液の、６００ｎｍにおける吸光度を、２０℃〜３７℃の間で測定した。
具体的には、上記の各水溶液２ｍＬを、１０ｍｍ×１０ｍｍの角型石英セル（厚さ１ｍｍ）にそれぞれ加えた。そして、初期温度２０℃から１℃ずつ昇温させながら、各温度における吸光度を測定した。ここで、各温度における吸光度は、ポリマーの温度応答性の影響を受けないように、その温度を３０分間維持した後の吸光度を測定することによって決定した。
その結果、トリスを含まない場合（試験例Ｂ１）には、ポリマーの曇点は、３２℃であり、ポリマー／トリス混合物（試験例Ｂ２〜試験例Ｂ６）の曇点は、３１．０℃〜３０．５℃に低下した。

また、上記ポリマー／トリス混合物の水溶液の温度応答性について解析を行った。具体的には、上記各ポリマー／トリス混合物の水溶液を３７℃で３０分間静置して白濁させ、その後すぐに２５℃で維持し、水溶液の透過率が１００％（対照は水）となるまでに要する時間を測定した。
図１１に結果を示す。ポリマーに対するトリスの割合が増加するほど、固相から液相への相転移の速度が小さくなっていることが確認された。

（試験Ｂ２）ポリマー／トリス混合物の^１Ｈ ＮＭＲによる解析
ポリマーの最終濃度を４．１ｍｇ／ｍＬ、重合体に対するトリスの割合を１、２、４、８として、（試験Ａ）の（試験Ａ１ａ）（Ａ１ａ−２）に記載した方法に準拠してポリマー／トリス混合物の重水（Ｄ_２Ｏ）溶液を調製した（それぞれ、試験例Ｂ７、試験例Ｂ８、試験例Ｂ９、試験例Ｂ１０）。
このポリマー／トリス混合物の核磁気共鳴スペクトル（ＮＭＲ）を、核磁気共鳴装置（Ｖａｒｉａｎ社製、型番：Ｇｅｍｉｎｉ３００）を用いて、４℃、２５℃、３７℃の条件で測定した。詳細な条件は表２に示す。

図１２に結果を示す。ポリマーの^１Ｈ ＮＭＲシグナルの積分値とはポリマー側鎖の−Ｎ（ＣＨ_３）_２基のプロトンの積分値を指し、トリスの積分値とは−Ｃ（ＣＨ_２ＯＨ）_３基のプロトンの積分値を指す。４℃では、ポリマーに対するトリスの重量比（相対比）と、ポリマーに対するトリスの^１Ｈ ＮＭＲシグナルの積分値の比とが、ほぼ理論値通りの値を示した。２５℃では、ポリマーに対するトリスの重量比（相対比）が増大するにつれて、ポリマーに対するトリスの^１Ｈ ＮＭＲシグナルの積分値の比が急激に増大した。３７℃では、ポリマー側鎖のプロトンのピークは検出されなかった。これらの結果から、ポリマー／トリス混合物は２５℃付近を超えると、疎水凝集により凝集塊を形成し、これにより温度応答性に凝集するポリマーが磁場環境から遮蔽されること、またその一方で、水溶性のポリマー／トリス混合物では、いかなる温度においてもトリスはポリマーと比較して溶媒中に存在している割合が多いことがわかった（無論、トリス分子の一部はポリマーとの水素結合によりポリマーと共に凝集塊の内部に取り込まれていると考えられる）。

（試験Ｂ３）ポリマー／トリス混合物の示差走査熱量計による解析
ポリマーの最終濃度を４．１ｍｇ／ｍＬ、重合体に対するトリスの割合を０、０．５、１、２、４、８として、（試験Ａ）の（試験Ａ１ａ）（Ａ１ａ−２）と同様に、ポリマー／トリス混合物の水溶液を調整した（それぞれ、試験例Ｂ１１、試験例Ｂ１２、試験例Ｂ１３、試験例Ｂ１４、試験例Ｂ１５、試験例Ｂ１６）。
以下に記載する温度制御は熱分析装置のプログラムを使用して行なった。ポリマー／トリス混合物の水溶液を４０℃まで加熱して３分間維持し、密閉式測定セル内で沈殿を生じさせた後、この混合物を瞬時に２５℃まで冷却し、そのまま２５℃で維持した。そして、この混合物を、示差走査熱量計（島津製作所製、型番：ＤＳＣ６０）を用いて、微分示差走査熱量測定（ｄＤＳＣ）に供した。詳細な条件は表２に示す。

図１３に結果を示す。ポリマー／トリス混合物は２５℃付近で溶解し、この際に吸熱が生じるところ、ポリマーに対するトリスの重量比が増大するにつれて、２５℃に冷却してから吸熱が生じるまでの時間が長くなることがわかった。

そして、（試験Ｂ１）〜（試験Ｂ３）の結果から、温度応答性を有するポリマーにトリスを加えることによって、ポリマーを含む組成物の温度応答性に変化が生じることが明らかとなった。より詳細には、トリスを加えることによって、一度３７℃で培養皿の底面にポリマーを含む組成物を、凝集、沈殿させて塗布することによって調製した細胞培養器に対して、室温（約２５℃）で（例えば、クリーンベンチ内で）細胞播種の操作を行う際に、細胞培養器に被覆したポリマー層がその温度応答性により再溶解して流失してしまうことを防ぐことができる。

上記試験例Ｂの結果を表２に示す。

（試験Ｃ）細胞培養器表面のゼータ電位の測定
（試験Ｃ１）細胞培養器表面全体のゼータ電位の測定
（試験Ｃ１−１）細胞培養器に対する細胞培養用組成物の被覆
ポリスチレン製の細胞培養プレート（ｎｕｎｃ社、Ｎｕｎｃｌｏｎ（登録商標） Δ Ｓｕｒｆａｃｅ、１００ｍ径）を、３５ｍｍ×１４ｍｍ×１ｍｍのサイズの小片に裁断した。なお、上記細胞培養プレートは、アンモニア及び酸素を含む混合ガス中でプラズマ放電を行うことによって調製され、この処理により、アンモニア由来のアミノ基（−ＮＨ_２）及び酸素由来のカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）が導入されたものである。
ここで、（試験Ａ）の（試験Ａ３）と同様に、Ｃ／Ａ比を０．５、２、４、８、１６として、ポリマー／トリス／アニオン性物質混合物を調製し、そして、（試験Ａ）の（試験Ａ１）（Ａ１ａ−７）と同様に、各ポリマー／トリス混合物を、上記裁断された細胞培養プレートに対して被覆した（それぞれ、試験例Ｃ１、試験例Ｃ２、試験例Ｃ３、試験例Ｃ４、試験例Ｃ５）。
具体的には、ポリマー／トリス／アニオン性物質混合物の水溶液を、上記小片の細胞接着面の全表面に流延させ、この細胞培養プレートの小片を別の細胞培養プレート内に置き蓋をした。
加湿用水の存在下で乾燥を防ぎながら細胞培養インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）中で６時間インキュベートを行い、その後、加湿用水の使用をやめると同時に細胞培養プレートの蓋を外すことによりインキュベーター内は乾燥条件にして、２４時間インキュベートを行った。その結果、約２１時間後には、混合物を流延させた面の水分は、ほとんど蒸発していた。走査型電子顕微鏡による観察により、ポリマー／トリス混合物の水溶液を流延した小片のほぼ全面に、ポリマー／トリス／アニオン性物質混合物による被覆層が均質に形成されていることがわかった。

（試験Ｃ１−２）ゼータ電位の測定１
（試験Ｃ１−２ａ）Ｃ／Ａ比との関係について
上記被覆された小片の被覆表面のゼータ電位を、ゼータ電位計（大塚電子社製、型番：ＥＬＳＺ）及び平板試料用セルユニットを用いて測定した。
具体的には、石英セルの下面に小片の試料を密着させ、セル内部にモニター粒子懸濁液を注入した。ここで、標準のモニター粒子として、ポリスチレンラテックス（粒子径：約５００ｎｍ）をヒドロキシプロピルセルロース（Ｍｗ＝３０，０００）で被覆した粒子（ゼータ電位：−５ｍＶ〜＋５ｍＶ）を用いた。また、溶媒として、１０ｍＭの塩化ナトリウム水溶液をｐＨ＝７、３７℃の条件下で用いた。そして、ゼータ電位は、Ｓｍｏｌｕｃｈｏｗｓｋｉ式を用いて算出した。
非被覆の細胞培養プレートの表面のゼータ電位は−６８ｍＶであり、一般的な熱可塑性樹脂の固体表面のゼータ電位として当業者に周知の値であった（比較試験例Ｃ１）。
一方、ポリマー／トリス／アニオン性物質混合物により被覆された細胞培養プレートの表面のゼータ電位は、正の値を示し、また、Ｃ／Ａ比依存的に増加することがわかった。具体的には、Ｃ／Ａ比＝０．５の試験例Ｃ１では、−２８ｍＶ、Ｃ／Ａ比＝２の試験例Ｃ３では、０．５ｍＶ、Ｃ／Ａ比＝４の試験例Ｃ３では、１９ｍＶ、Ｃ／Ａ比＝８の試験例Ｃ４では、２０ｍＶ、Ｃ／Ａ比＝１６の試験例Ｃ５では、２２ｍＶであった。
この結果を（試験Ａ）の（試験Ａ３）の結果と比較することによって、細胞培養器の表面のゼータ電位が細胞の分化に影響を及ぼす可能性が示唆された。
なお、当業者に周知の通り、現在の技術では、固体表面のゼータ電位の測定値は、±１０％程度のバラツキを有するものであり、また、試料の調製工程においても、コーティング操作自体にバラツキが存在するものであるため、上記ゼータ電位の測定値はある程度の誤差を有し得る。図１４に結果を示す。細胞培養器表面全体のゼータ電位は、Ｃ／Ａ比が増大するにつれて飽和する傾向が見られた。
（試験Ｃ１−２ｂ）ｐＨとの関係について
（試験Ｃ１−２ａ）と同様に、上記被覆された小片の被覆表面のゼータ電位を測定した。
モニター粒子懸濁液の溶媒をｐＨ＝５の条件下で用いた。まず、非被覆の細胞培養プレートの表面のゼータ電位を測定したところ、−４０ｍＶであった（比較試験例Ｃ２）。これは、酸性条件とすることにより、培養プレート表面に導入されたカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）のプロトンの解離が抑制されると共に、アミノ基（−ＮＨ２）のプロトン化が促進されて、陽電荷が増加した結果であると推測される。一方、ポリマー／トリス／アニオン性物質混合物により被覆された細胞培養プレートの表面のゼータ電位は、正の値を示し、また、Ｃ／Ａ比依存的に増加することがわかった。具体的には、Ｃ／Ａ比＝２の試験例Ｃ６では、３６ｍＶであった。試験例Ｃ２の結果（ｐＨ＝７、０．５ｍＶ）と比較すると、電位が大きく高まった。
この結果は、ポリマーが有する三級アミノ基のプロトン化が促進されて、陽電荷が増加した結果であると推測される。なお、ｐＨ＝５、Ｃ／Ａ比＝２の条件における３６ｍＶというゼータ電位は、ｐＨ＝７、Ｃ／Ａ比＝１６の条件における（試験例Ｃ５）２２ｍＶというゼータ電位と比較して高い。
なお、モニター粒子懸濁液の溶媒をｐＨ＝９の条件下で用いたところ、非被覆の細胞培養プレートの表面のゼータ電位は−７１ｍＶであり（比較試験例Ｃ３）、ポリマー／トリス／アニオン性物質混合物により被覆された細胞培養プレートの表面のゼータ電位は、Ｃ／Ａ比＝２の試験例Ｃ１０では、−１２ｍＶとなり、負の値に転じた。
これらの結果より、細胞の分化に影響を及ぼす可能性がある、細胞培養器の表面のゼータ電位は、細胞培養用組成物のｐＨによっても調製することが可能であることが示された。

（試験Ｃ１−３）ゼータ電位の測定２
標準のモニター粒子として、ＦＣＳ（ウシ胎児血清、インビトロジェン社製、オーストラリア産、ロット番号８５２５４６）溶液中のタンパク粒子を用いた以外は、（試験Ｃ２）と同様にゼータ電位を測定した。
なお、ＦＣＳは当業者に周知の通り混合物であるため、ＦＣＳ溶液にレーザー光を照射した際に中性域で一番強い光散乱のピークが観察された（ほとんどの場合単一ピークとして観察される）粒子をモニター粒子とした。
１０％ＦＣＳ水溶液中で測定した上記標準のモニター粒子のゼータ電位は、約−２０ｍＶであった。
非被覆の細胞培養プレートの表面のゼータ電位は−１９ｍＶであり（比較試験例Ｃ４）、一方、ポリマー／トリス／アニオン性物質混合物により被覆された細胞培養プレートの表面のゼータ電位は、いずれのＣ／Ａ比においても約−１４ｍＶであった（試験例Ｃ１１〜Ｃ１４）。
非被覆の細胞培養プレートの場合には、その表面のゼータ電位は、ＦＣＳのモニター粒子のゼータ電位とほぼ同程度であることから、プレート表面にＦＣＳに含まれるタンパク質成分が吸着していることが示唆された。一方、細胞培養用組成物で被覆した細胞培養プレートの場合には、その表面のゼータ電位は、ＦＣＳのモニター粒子のゼータ電位と比較して、絶対値が小さい値であることから、ＦＣＳに含まれるタンパク質成分のプレート表面への吸着の阻害、又は一部のタンパク質成分のプレート表面への選択的吸着が生じていることが示唆された。

（試験Ｃ２）細胞培養器表面の微粒子のゼータ電位の測定
上記（Ａ１ａ−２）ポリマー／トリス／アニオン性物質混合物の調製の記載に準拠してポリマー／アニオン性物質混合物、すなわち、本発明の細胞構造体の製造方法に用いる細胞培養用組成物の水溶液を調製した。
アニオン性物質として、ホタルルシフェラーゼレポーターベクター（ＤＮＡ）（プロメガ社製、型番：Ｅ１７４１）を当業者に周知の方法で脱塩し、ＤＮａｓｅフリー水にＤＮＡを溶解させた（最終濃度：３３μｇ／ｍＬ）。
ポリマーの水溶液は最終濃度１００μｇ／ｍＬに調整し、５０μＬ、１００μＬ、２００μＬ、４００μＬ、８００μＬを前記ＤＮＡ溶液３００μLに少しずつ滴下して混合した。そして、この混合物を水で希釈して、いずれの溶液も全量が約２，０００μＬとなるように調整し、ポリマー／アニオン性物質混合物、すなわち、本発明の細胞構造体の製造方法に用いる細胞培養用組成物の水溶液を得た（それぞれ、試験例Ｃ１５、試験例Ｃ１６、試験例Ｃ１７、試験例Ｃ１８、試験例Ｃ１９）。ＣＡ比としては、それぞれ１、２、４、８、１６となる。調製した溶液をゼータ電位計（シスメックス社、ゼーターサイザーナノ）を使用して溶液中でブラウン運動している微粒子のゼータ電位を測定した。

図１５に結果を示す。細胞培養器表面に凝集して沈殿する前の微粒子についても、そのゼータ電位は、Ｃ／Ａ比が増大するにつれて飽和する傾向が見られた。この結果は、細胞培養器表面全体のゼータ電位の測定結果と相関を有していた。

上記試験例Ｃ及び比較試験例Ｃの結果を表３に示す。

（試験Ｄ）原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）による表面構造解析
（試験Ｄ−１）原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）による表面構造解析
図１６（ａ）に、非被覆又は細胞培養用組成物で被覆した細胞培養プレートの表面を、接触タッピングモードで測定した画像を示す。この結果から、プレートの表面のナノスケールでの凹凸が、Ｃ／Ａ比により変化する様子が確認された（試験例Ｄ１、試験例Ｄ２、試験例Ｄ３、試験例Ｄ４）。
図１６（ｂ）に、非被覆又は細胞培養用組成物で被覆した細胞培養プレートの表面を、位相モードで画像化したものを示す。この結果から、プレートの表面の粘弾性的又は吸着的性質も、プレート表面のナノスケールでの凹凸と同様に、Ｃ／Ａ比により変化する様子が確認された（試験例Ｄ１、試験例Ｄ２、試験例Ｄ３、試験例Ｄ４）。

（試験Ｄ−２）蛍光顕微鏡による表面観察
アニオン性物質として、Ｃｙ３で蛍光標識した２．７ｋｂのＤＮＡ（Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ、型番：ＭＩＲ７９０４）を用いた。（Ａ０ａ）と同様に、Ｃ／Ａ比を２、４、８、１６（それぞれ、試験例Ｄ５、試験例Ｄ６、試験例Ｄ７、試験例Ｄ８）としたポリマー／アニオン性物質混合物を調整した。そして、（Ａ１ｂ）と同様に、ポリスチレン製の２４ウェル細胞培養プレート（１ウェル当たりの底面積：２００ｍｍ^２）の各ウェルを被覆した。プレートを３７℃で６時間インキュベーションした後、各ウェルを蛍光顕微鏡（ニコン社製、商品名：ＴＥ２０００−Ｕ）を用いて観察した（励起波長：４８８ｎｍ、蛍光波長：５７０ｎｍ）。詳細な条件は表４に示す。
図１７に、観察結果を示す。Ｃ／Ａ比を２とした試験例Ｄ５から、Ｃ／Ａ比を１６とした試験例Ｄ８に向かって、蛍光強度が低くなる傾向が見られた。この結果は、Ｃ／Ａ比が大きい場合にはＣｙ３標識ＤＮＡがポリマーに被覆されるため、レーザー光がポリマーに遮断されたことを示唆している。

（試験Ｄ−３）水中ＡＦＭによる表面観察
アニオン性物質として、ホタルルシフェラーゼレポーターベクター（ＤＮＡ）（プロメガ社製、型番：Ｅ１７４１）を当業者に周知の方法で脱塩し、ＤＮａｓｅフリー水へ溶解して用いた。（Ａ１ａ−５）と同様に、Ｃ／Ａ比を２、４、８、１６（それぞれ、試験例Ｄ９、試験例Ｄ１０、試験例Ｄ１１、試験例Ｄ１２）としたポリマー／アニオン性物質混合物を調整した。そして、（Ａ１ａ−７）と同様に、ポリスチレン製の２４ウェル細胞培養プレート（１ウェル当たりの底面積：２００ｍｍ^２）の各ウェルを被覆した。プレートを３７℃で３時間インキュベーションした後、各ウェルを原子間力顕微鏡（島津製作所社製、ＳＰＭ−９７００）を用いて観察した（共振周波数７５ｋＨｚ〜１４５ｋＨｚ、バネ定数０．１Ｎ／ｍ、窒化ケイ素）。詳細な条件は表４に示す。
図１８に、観察結果を示す。図１８上段は、ダイナミックタッピングモードによる画像を示し、図１８下段は、位相モードでの画像を示す。Ｃ／Ａ比を２とした試験例Ｄ９から、Ｃ／Ａ比を１６とした試験例Ｄ１２に向かって、微粒子の数（密度）が増大する傾向が見られた。微粒子は直径５０ｎｍ〜５００ｎｍであった。この結果から、ポリマー／アニオン性物質混合物は、被覆時に流延してフィルムになることなく、培養皿の底面に微粒子として沈殿して堆積していること、これによりウェルにポリスチレンが露出する領域が存在することが確認された。

上記試験例Ｄ及び比較試験例Ｄの結果を表４に示す。

本発明の細胞培養用方法は、分化した細胞に見られるペレット状の構造と同様な構造を有する、ペレット状の細胞構造体を、操作者の技量に依存することなく簡便に、細胞培養器内に再現することを可能にする。そして、分化した細胞中で発現しているＤＮＡ、ｍＲＮＡ、タンパク質等の情報を得るための有用なツールを提供することができる。
例えば、軟骨細胞に対して本発明を適用した場合には、生体内に存在している場合と同様のペレット状の細胞構造体を、培養して維持することができる。この細胞構造体は、人工軟骨などとして再生医療に応用することができるばかりでなく、軟骨細胞の機能や応答性などを、分化させた状態で解析することも可能にする。

Claims (5)

1. ２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体の重合体と、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオールと、核酸、ヘパリン、ヒアルロン酸、デキストラン硫酸、ポリスチレンスルホン酸、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリリン酸、硫酸化多糖類、カードラン及びポリアルギン酸並びにこれらのアルカリ金属塩からなる群から選択される一種以上のアニオン性物質とを混合して細胞培養用組成物を調製する調製工程と、
   前記細胞培養用組成物で細胞培養器の培養面を被覆して、被覆細胞培養器を準備する準備工程と、
   細胞を、１．０×１０^３個／ｍｍ^２以上の細胞密度で、前記被覆細胞培養器の前記培養面上に播種する播種工程と、
   前記播種した細胞を培養する培養工程と
   を備えることを特徴とする、細胞構造体の製造方法。
2. 前記細胞培養用組成物において、前記重合体に対する、前記２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオールの割合が、１．０以下であることを特徴とする、請求項１に記載の細胞構造体の製造方法。
3. 前記細胞培養用組成物において、Ｃ／Ａ比が０．５〜１６であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の細胞構造体の製造方法。
4. 前記被覆細胞培養器において、該被覆細胞培養器の培養面が、単位面積当たりに有する２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体の重合体の量が、５〜２００ｎｇ／ｍｍ^２であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞構造体の製造方法。
5. 請求項１〜４のいずれか一項に記載の細胞構造体の製造方法により製造されたことを特徴とする、細胞構造体。