CN108699520A - 细胞块、细胞结构体以及立体组织体 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的在于提供一种利用以温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物包覆的培养面来高效地制造细胞块、细胞结构体或立体组织体的方法。本发明的细胞块、细胞结构体或立体组织体的制造方法的特征在于，在用温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物包覆的培养面种植细胞，进行培养。

Description

细胞块、细胞结构体以及立体组织体
技术领域
本发明涉及一种利用以温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物包覆的培养面来高效地制造细胞块、细胞结构体或立体组织体的方法，以及通过该方法而得到的细胞块、细胞结构体以及立体组织体。
特别地，本发明(I)涉及软骨细胞块和移植材料的制造方法、软骨细胞块、移植材料以及复合材料。此外，本发明(II)涉及上皮细胞的培养方法、细胞结构体的制造方法以及上皮细胞用细胞培养器。此外，本发明(III)涉及立体组织体的制作装置和立体组织体的制作方法。此外，本发明(IV)涉及细胞结构体的制造方法。此外，本发明(V)涉及细胞结构体的制造方法、细胞结构体、细胞培养器。此外，本发明(VI)涉及细胞结构体的制造方法。此外，本发明(VII)涉及细胞结构体的制造方法。
背景技术
关于发明(I)，近年来，为了提高患者的QOL，期望实现定制医疗。在定制医疗中，再生医疗承担主要的作用，再生医疗使用患者自身的细胞而谋求陷于功能障碍、功能损伤的组织、器官的再生。
在此，在再生医疗中，需要在细胞培养器中培养从患者的组织采取的细胞而形成组织、然后将该组织移植到患者这样的操作。因此，期望有培养细胞而形成组织等细胞结构体的技术、以原本的状态回收细胞结构体的技术。
通常被取出到生物体外的细胞大多会受到使其基因调节中产生紊乱的各种压力而发生脱分化。此外，很多情况下为了使细胞增殖，也需要使其脱分化。由此，出现了以下问题：即使在简单的培养条件下培养从患者采取的细胞，细胞也大多无法维持原本的基因表达状态，因此无法形成细胞结构体甚至组织，此外，无法发挥该细胞的高度的功能。例如，在通常的聚苯乙烯制的细胞培养皿中进行细胞培养的情况下，细胞停留在形成单层状的结构，难以形成具有与高度分化的细胞中所见的结构、例如作为软骨细胞存在于生物体内时的形状的颗粒状结构同样的结构的细胞结构体，此外，软骨细胞中特殊的多个功能也会消失。
关于上述问题，正在开发例如构建模拟组织结构的立体结构的细胞培养方法，例如球形培养、团簇培养、颗粒培养、三维载体培养等方法。已知有通过使用具有立体结构的细胞外基质作为细胞培养的支持物(scaffold)，从而制作具有立体结构的细胞的细胞培养方法。
此外，近年来，在生物体组织再生领域中，随着无人自动化的细胞培养法、用于控制分化的药物的发现、细菌感染检查方法等相关技术的完成度的提高，逐渐盛行对模拟生物体内结构的高级的有形结构体进行自由设计的研究(参考非专利文献1、2)。
特别是关于培养软骨的三维化，已知有如下成功的例子，即，将经脱分化的软骨细胞注入到有形的模具中，通过使用了BMP2、b-FGF等的化学刺激对细胞进行分化诱导，由此制备直径10mm、厚1mm尺寸的软骨盘。
此外，关于发明(II)，在现有技术中，上皮细胞与细胞培养器的粘附性弱，使用通常的细胞培养器而进行上皮细胞的培养是极其困难的。此外，作为提高细胞粘附性的细胞培养器，已知有胶原蛋白包被细胞培养器(参考专利文献1)、纤连蛋白包被细胞培养器(参考专利文献2)、层粘附蛋白包被细胞培养器(参考专利文件3)等涂敷了细胞粘附因子的细胞培养器。然而，在使用来自天然产物的细胞粘附因子的情况下，有可能包含未知物质、病原性物质，此外，从节约动物资源的观点出发，也期望使用化学合成物质的细胞粘附因子的方法。
此外，在使用胶原蛋白、纤连蛋白、层粘附蛋白等现有的细胞粘附因子的方法中，上皮细胞与培养面的粘附性称不上充分，因此目前要求上皮细胞的粘附性优异的细胞培养器。
此外，关于发明(III)，现有技术中，作为具有立体结构的细胞结构体、人工组织体的制作方法，在球状、片状等简单的细胞结构体中，已知有悬滴法(参考非专利文献3)、低粘附性U字底培养皿(参考专利文献4)等。
此外，作为复杂的三维形状的细胞结构体方面，已知有利用了3D打印机的细胞结构体。
此外，关于发明(IV)，1900年前后开发的细胞培养技术是生物学领域中的重要的实验技术。开发初期，停留在致力于使培养基成分最优化等的驯化细胞方面，以单层培养、悬浮培养的技术为中心进行研究。
近年来，已经明确在单层培养体系的细胞和生物体内组织的细胞之间，各种性质、刺激响应性、细胞功能等不同，与形成单层结构的单层培养相比，形成与生物体内的组织结构相近的3D结构的3D培养、特别是球形培养的需求正在扩大(参考非专利文献4)。
已经积极开发的经典技术有：使细胞悬浮在蛋白质体系的凝胶中并使用任意的引发因素(热、光、化学交联剂等)使该细胞悬浮液凝胶化而形成3D凝胶，使细胞包埋于3D凝胶中的技术；使细胞植入多孔质的支持物中的技术；使用固定有NIPAM的培养皿来制备细胞片的层叠体的技术等。
近年来正在开发的方法有：Sumitomo Bakelite CO.,Ltd.的Prime Surface等的使细胞沉降至非粘附性的圆形底面的方法；JSR公司的Nano Culture Plate、日立制作所Nano Pillar Plate等的利用激光加工将平滑面制成规律的凹凸面从而提高粘附于培养面的细胞的迁移性，由此在培养面诱导细胞的自组织化的方法；可乐丽株式会社(KURARAYCO.,LTD.)的Elplasia、岩城株式会社(IWAKI&CO.,LTD)的EZSPHERE等的使用配设有无数个直径100～500μm、深度500μm左右的孔穴的培养皿，使种植于各孔穴内的细胞沉降至各孔穴的底面的方法等。
此外，近年来还已知有悬滴法，上述悬滴法是在管状构件的前端制备细胞悬浮液的液滴，利用液滴的表面张力保持液滴的形状呈球状，并且保持液滴规定时间(例如，2周左右)，由此在液滴中制造球状的细胞结构体。
此外，关于发明(V)，近年来，为了提高患者的QOL，期望实现定制医疗。在定制医疗中，再生医疗承担主要的作用，再生医疗使用患者自身的细胞而谋求陷于功能障碍、功能损伤的组织、器官的再生。
在此，在再生医疗中，需要在细胞培养器中培养从患者的组织采取的细胞而形成组织，然后将该组织移植到患者这样的操作。因此，期望培养细胞而形成组织等细胞结构体的技术、以原本的状态回收细胞结构体的技术。
通常被取出到生物体外的细胞大多会受到使其基因调节中产生紊乱的各种压力而发生脱分化。此外，很多情况下为了使细胞增殖，也需要使其脱分化。由此，出现了以下问题：即使在简单的培养条件下培养从患者采取的细胞，细胞也大多无法维持原本的基因表达状态，因此无法形成细胞结构体甚至组织，此外，无法发挥该细胞的高度的功能。例如，在通常的聚苯乙烯制的细胞培养皿中进行细胞培养的情况下，细胞停留在形成单层状的结构，难以形成具有与高度分化的细胞中所见的结构、例如作为软骨细胞存在于生物体内时的形状的颗粒状结构同样的结构的细胞结构体，此外，软骨细胞中特殊的多个功能也会消失。
关于上述问题，正在开发例如构建模拟组织结构的立体结构的细胞培养方法，例如球形培养、团簇培养、颗粒培养、三维载体培养等方法。已知有通过使用具有立体结构的细胞外基质作为细胞培养的支持物(scaffold)，从而制作具有立体结构的细胞结构体的细胞培养方法(参考专利文献5)。
此外，作为制作具有立体结构的细胞结构体的方法，还开发了使用U字底的低粘附性培养皿的方法、悬滴法。
近年来，报道有通过在用特殊的温度响应性聚合物和/或温度响应性聚合物组合物包覆的培养面种植、培养细胞，从而简单地制造具有三维结构的细胞结构体的方法(参考专利文献6)。
此外，关于发明(VI)，在心脏的功能障碍的研究中，作为动物的生物体心脏呈心力衰竭等状态的心脏病模型，公知的有通过冠状动脉的堵塞、给药、向下肢肌肉注射心肌肌球蛋白而引起自身免疫性心肌炎等方法制作的模型动物。
心脏是维持生命的极其重要的脏器，并且还左右其它脏器的状态，因此制作良好地再现降低了心脏功能的心脏病模型是很困难的。例如，如果为冠状动脉堵塞，当堵塞的程度轻时，则与健康状态基本上没有区别，当稍微过重一点时，则动物会立刻死亡，由于其程度的差别接近，因此调节恰当的程度是极其困难的。此外，在制作由于肌球蛋白给药而导致的自身免疫反应中的心肌炎模型中，根据免疫反应的程度心肌组织的病情有很大变化，进而由于心脏功能自身也对另外的其它脏器的状态有很大的影响，因此设计稳定的实验、有再现性的实验体系是极其困难的。
此外，即使从生物体内摘出制作的心脏病模型脏器，维持需要大量氧的心肌细胞也是很困难的。
此外，使用实验动物也存在动物保护、伦理上的问题。
已知通常发生了心力衰竭等的组织会呈以下状态：由于管状动脉的部分堵塞、病毒或细菌的感染、自身免疫反应等而导致心肌细胞坏死，代替坏死的心肌细胞，成纤维细胞过度增殖。
因此，尝试在试管内再现发生心力衰竭等的心脏病的组织。为此，需要保护在低氧环境下不易存活的心肌细胞，并且与增殖快的成纤维细胞进行共培养而制成细胞结构体，这在需要1～2周来制作细胞结构体的现有的悬滴法、低粘附性培养皿中是难以实现的。
作为短时间、高效地制造细胞块的方法，已知有使用涂敷有特定的温度响应性聚合物的细胞培养器的方法(参考专利文献6)。
此外，关于发明(VII)，在以Muse细胞(多功能干细胞)移植等为代表的肝脏再生疗法的研究中，有时使用肝功能衰竭模型动物。作为肝功能衰竭模型动物的制作方法，公知的有例如切除部分肝脏、对门静脉、上游血管进行结扎、反复给与四氯化碳等肝损伤性药物等的方法。此外，大多情况下，病态肝脏不从动物体内摘出而供于in vivo体系中的实验。
在使用动物的实验中，伴随着动物保护、伦理观的问题，实验目的、成功率、得到的见解的价值之间的平衡变得尤为重要。
此外，在通过切除部分脏器的方法中，肝功能衰竭的程度、动物个体的状态非常依赖于手术者的手术技术。此外，在使用肝损伤性药物的方法中，虽然存在公知的标准的方案，但是需要反复给药的情况多，难以控制症状的进行程度。像这样，难以设计稳定的、有再现性的使用了肝功能衰竭模型动物的实验体系。
虽然肝细胞的培养在积极地进行，但为了再现肝功能衰竭模型，需要对成纤维细胞等进行共培养。然而，就作为上皮细胞的肝细胞和作为间充质细胞的成纤维细胞而言，由于与培养皿的粘附性、培养方法不同，因此在需要1～2周来进行制作的现有的悬滴法、低粘附性培养皿中，难以制作包含肝细胞和成纤维细胞的三维结构的细胞结构体。
作为短时间高效地制造细胞块的方法，已知有使用涂敷有特定的温度响应性聚合物的细胞培养器的方法(参考专利文献6)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开平05-260950号公报；
专利文献2：日本特开平06-014764号公报；
专利文献3：日本特开平08-173144号公报；
专利文献4：日本特开2009-050194号公报；
专利文献5：日本特开2010-524458号公报；
专利文献6：日本特许第5746240号公报。
非专利文献
非专利文献1:M.Matsusaki et al,Adv.Healthcare Mater.,2,534(2013)
非专利文献2:M.Matsusaki et al,Biochem.Biophys.Res.Commun.,457,363(2015)
非专利文献3:Keller G.M.et al.,Curr.Opin.Cell Biol.,7,862-869(1995)
非专利文献4:Nature,Vol 424,P870-872,21August,2003。
发明内容
发明要解决的问题
本发明的目的在于提供一种在用温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物包覆的培养面高效地制造细胞块、细胞结构体或立体组织体的方法。
关于本发明(I)，报道有当想要使用上述现有的方法来制备更大尺寸的和/或更复杂的结构的培养软骨时，引起结构体内部的细胞坏死，细胞由于坏死(Necrosis)而死亡。
因此，本发明(I)的目的在于简便地制造在关节、气管、鼻等的治疗中有用的软骨细胞块和移植材料以及复合材料。
此外，本发明(II)的目的在于提供不易与细胞培养器粘附的上皮细胞的培养方法、包含不易与细胞培养器粘附的上皮细胞的细胞结构体的制造方法以及能够培养上皮细胞和制造其细胞结构体的细胞培养器。
此外，关于本发明(III)，在使用悬滴法、低粘附性U字底培养皿等的方法中，向细胞结构体内部存在的细胞供给氧、营养依赖于浓度梯度扩散，因此在尺寸上有所限制，通常直径0.1mm左右为最大，形状也限定为球体。
此外，在基于3D打印机的细胞结构体的制作方法中，使用利用胰酵素等酵素而使细胞各自分散的细胞悬浮液，从喷嘴中吐出细胞而制造细胞结构体。在该方法中，为了使吐出的细胞彼此结合，需要同时从外部向吐出的各细胞周围吐出粘附因子等。然而，该粘附因子并不是细胞分泌的，因此得到的3维形状的细胞结构体在细胞彼此的结合的强度、细胞的活性这些方面不能说是充分的。
此外，近年来，从谋求使功能障碍、功能缺陷的组织、脏器进行再生的再生医疗等的观点出发，在细胞培养器内培养细胞，形成例如环状、管腔状等的、具有模拟组织结构的立体结构的细胞结构体的技术的重要性日渐提高。此外，作为具有模拟组织结构的立体结构的细胞结构体，除了以细胞为主成分的细胞结构体以外、还要求制作以细胞外基质为主成分的细胞结构体的方法。
然而，目前没有找到容易地形成环状或管腔状等的、模拟组织结构的立体组织体的方法。
因此，本发明(III)的目的在于提供能够容易地得到环状或管腔状等的立体组织体的立体组织体的制作装置、以及能够容易地得到环状或管腔状等的立体组织体的立体组织体的制作方法。
此外，关于本发明(IV)，在使用上述现有的方法来制造球状的细胞结构体的情况下，存在有细胞结构体的生物能力低、不容易成为期望的尺寸、难以调控形状等问题。特别在细胞结构体的尺寸、形状不统一的情况下，需要对制造的细胞结构体进行分级操作，制造工序变得复杂，成本也增大。
因此，本发明(IV)的目的在于简便地制造期望尺寸的形状经调控的球状的细胞结构体。
此外，关于本发明(V)，在上述球形培养法等中，存在只能制备直径10μm左右的尺寸小、细胞间网络弱的球(多个细胞的凝聚体)这样的问题。
此外，在使用上述U字底的低粘附性培养皿的方法、悬滴法中，只能得到大致正球状的球形，而无法得到具有铺路石形态、纺锤形态这样的细胞固有形态的球形。
在近年开发的使用上述特殊的聚合物和/或聚合物组合物的方法中，也不一定能达到使得到的细胞结构体的形态成为期望的那样的程度，存在对关于该方法的各条件进行最优化、适宜化方面的余地。
因此，本发明(V)的目的在于通过控制细胞的凝聚方式从而制造期望形态的细胞结构体。
此外，关于本发明(VI)，在专利文献6记载的方法中，并未研究心力衰竭等心脏病组织的再现，而目前要求在试管内再现心脏病的方法。
因此，本发明(VI)的目的在于提供一种细胞结构体的制造方法，其能够容易地形成作为心脏病模型有用的、包含心肌细胞和成纤维细胞的细胞结构体。
此外，关于本发明(VII)，在专利文献6记载的方法中，并未研究肝功能衰竭组织的再现，而目前要求在试管内再现肝功能衰竭的方法。
因此，本发明(VII)的目的在于提供一种细胞结构体的制造方法，其能够容易地形成作为肝功能衰竭模型有用的、包含肝细胞和成纤维细胞的细胞结构体。
用于解决问题的方案
本发明(I)～(VII)的主要内容如下所述。
本发明(I)的软骨细胞块的制造方法的特征在于，包含种植培养工序，上述种植培养工序通过在用温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物包覆的包覆培养面，在细胞块的存在下，种植能够分化成软骨细胞的细胞，对上述细胞块和能够分化成上述软骨细胞的细胞进行培养，从而制备软骨细胞块。
在此，在本发明的(I)的软骨细胞块的制造方法中，优选通过种植上述能够分化成软骨细胞的细胞并对其进行培养从而制备上述细胞块。
在本发明(I)的软骨细胞块的制造方法中，优选进行多次上述种植培养工序。
在本发明(I)的软骨细胞块的制造方法中，优选上述包覆培养面被细胞非粘附性的壁包围。
在本发明(I)的软骨细胞块的制造方法中，优选将上述包覆培养面的宽度设为3mm以下、将上述壁的高度设为3mm以下。
在本发明(I)的软骨细胞块的制造方法中，优选将上述包覆培养面每单位面积具有的上述温度响应性聚合物和温度响应性聚合物组合物的量设为0.1～3.0μg/cm2。
在本发明(I)的软骨细胞块的制造方法中，优选在上述种植培养工序中，以0.3×104～10.0×105个/cm2的细胞密度种植上述能够分化成软骨细胞的细胞。
本发明(I)的软骨细胞块的特征在于，是通过上述本发明的软骨细胞块的制造方法而制造的。
在此，本发明(I)的软骨细胞块优选为甜甜圈形。
本发明(I)的移植材料的制造方法的特征在于，包含以下工序：通过在上述本发明的软骨细胞块的存在下，种植间充质细胞，对上述软骨细胞块和上述间充质细胞进行培养，从而制备移植材料。
本发明(I)的移植材料的特征在于，是通过本发明的移植材料的制造方法而制造的。
本发明的(I)复合材料的特征在于，上述本发明的软骨细胞块设置于管状结构体的外表面。
在此，本发明(I)的复合材料优选在管状结构体的内部设置有芯材。
本发明(II)提供一种上皮细胞的培养方法，其特征在于，包含以下工序：制备工序，制备温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物；培养器准备工序，用上述温度响应性聚合物或上述温度响应性聚合物组合物包覆细胞培养器的培养面的至少一部分而形成包覆区域A，准备具有包覆区域A的包覆细胞培养器；种植工序，将上皮细胞种植于上述包覆细胞培养器；培养工序，对粘附于上述包覆区域A的上述上皮细胞进行培养，上述包覆区域A中的上述温度响应性聚合物或上述温度响应性聚合物组合物的浓度为0.3pg/mm2以上。
本实施方式(II)的上皮细胞的培养方法优选上述细胞培养器的培养面的至少一部分具有凹陷部，优选上述包覆区域A内具有上述凹陷部。
此外，本发明(II)提供一种细胞结构体的制造方法，其特征在于，包含以下工序：制备工序，制备温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物；培养器准备工序，用上述温度响应性聚合物或上述温度响应性聚合物组合物包覆细胞培养器的培养面的至少一部分而形成包覆区域A，准备具有包覆区域A的包覆细胞培养器；种植工序，将上皮细胞种植于上述包覆细胞培养器；培养工序，由上述上皮细胞形成块状的细胞结构体，得到粘附于上述包覆区域A的细胞结构体，上述包覆区域A中的上述温度响应性聚合物或上述温度响应性聚合物组合物的浓度为0.3pg/mm2以上。
本实施方式(II)的细胞结构体的制造方法优选在上述培养器准备工序中，用上述温度响应性聚合物或上述温度响应性聚合物组合物在细胞培养器的培养面的至少一部分中与上述包覆区域A不同的位置形成包覆区域B，上述包覆区域B中的上述温度响应性聚合物或上述温度响应性聚合物组合物的浓度小于200pg/mm2。
本实施方式(II)的细胞结构体的制造方法优选上述细胞培养器的培养面的至少一部分具有凹陷部，优选上述包覆区域A内具有上述凹陷部。
此外，本发明(II)提供一种上皮细胞用细胞培养器，其特征在于，在培养面的至少一部分具有用温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物包覆的包覆区域A，上述包覆区域A中的上述温度响应性聚合物或上述温度响应性聚合物组合物的浓度为0.3pg/mm2以上。
本实施方式(II)的上皮细胞用细胞培养器优选在培养面的至少一部分中与上述包覆区域A不同的位置具有用温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物包覆的包覆区域B，上述包覆区域B中的上述温度响应性聚合物或上述温度响应性聚合物组合物的浓度小于200pg/mm2。
本实施方式(II)的上皮细胞用细胞培养器优选在上述细胞培养器的培养面的至少一部分具有凹陷部，优选上述包覆区域A内具有上述凹陷部。
本发明(III)提供一种立体组织体的制作装置，其特征在于，包含具有至少1个通孔的培养面和穿过上述通孔的轴，在上述培养面包含至少1个用温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物包覆的包覆培养面，在1个上述包覆培养面的内侧具有至少1个上述通孔，上述培养面能够在上述轴的延伸方向上移动。
上述立体组织体的制作装置优选具有多个上述培养面，1根上述轴穿过上述多个上述培养面的上述通孔。
此外，本发明(III)提供一种立体组织体的制作方法，其特征在于，使用了上述立体组织体的制作装置，并包含以下工序：种植工序，在上述包覆培养面上种植至少1种细胞；培养工序，对种植的上述细胞进行培养，得到缠绕于上述轴周围的环状的立体组织体。
上述立体组织体的制作方法优选进一步包含以下工序的重复操作：培养面移动工序，在得到缠绕于轴周围的环状的立体组织体后，使上述培养面在上述轴的延伸方向移动；种植工序，在移动后的上述包覆培养面上种植至少1种细胞；培养工序，对种植的上述细胞进行培养，得到与缠绕于轴周围的环状的上述立体组织体邻接的、缠绕于轴周围的环状的立体组织体。
上述立体组织体的制作方法优选在全部的上述包覆培养面种植上述细胞，对种植的上述细胞进行培养而得到立体组织体。
上述立体组织体的制作方法优选得到包含在上述种植工序中种植的上述细胞的立体组织体。
上述立体组织体的制作方法优选在上述培养工序后除去上述细胞，得到包含由上述细胞分泌的物质的立体组织体。
上述立体组织体的制作方法优选上述物质为蛋白质。
本发明(IV)的细胞结构体的制造方法的特征在于，在培养面制备用温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物包覆的包覆区域，在该包覆区域中形成细胞悬浮液的液滴，在该液滴中进行细胞培养，在此，将上述包覆区域的表面Zeta电位设为0～50mV。
在此，在本发明(IV)的细胞结构体的制造方法中，优选将水与上述包覆区域的接触角设为50～90°。
此外，在本发明(IV)的细胞结构体的制造方法中，优选在上述培养面制备多个上述包覆区域。
进而，在本发明(IV)的细胞结构体的制造方法中，优选在上述包覆区域形成多个上述液滴。
进而，在本发明(IV)的细胞结构体的制造方法中，优选在各上述包覆区域中，将上述液滴的底面积设为比上述包覆区域的面积小。
进而，在本发明(IV)的细胞结构体的制造方法中，优选将上述液滴中包含的细胞的数目设为3.0×105个/mL以下。
进而，在本发明(IV)的细胞结构体的制造方法中，优选将上述液滴的直径设为1μm～8mm。
进而，在本发明(IV)的细胞结构体的制造方法中，优选将上述液滴的量设为0.5～50μL。
本发明(V)的主要内容如下所述。
本发明(V)的细胞结构体的制造方法的特征在于，包含以下工序：准备工序，在细胞培养器的培养面准备用温度响应性聚合物和/或温度响应性聚合物组合物包覆的第一包覆区域、以及设置于上述第一包覆区域的端部的用细胞粘附性物质包覆的多个第二包覆区域；
种植培养工序，在上述第一包覆区域和上述第二包覆区域种植细胞，对上述细胞进行培养，由此制备细胞结构体。
在本发明(V)的细胞结构体的制造方法中，优选将上述培养面设为细胞非粘附性。
在本发明(V)的细胞结构体的制造方法中，优选将上述细胞粘附性物质设为选自层粘附蛋白、胶原蛋白、纤连蛋白中的至少1种。
在本发明(V)的细胞结构体的制造方法中，优选用细胞非粘附性的壁包围上述第一包覆区域和上述第二包覆区域所占的区域。
在本发明(V)的细胞结构体的制造方法中，优选将上述第一包覆区域设为沿规定方向延伸的形状，将上述第一包覆区域的上述端部设为上述规定方向上的端部。
本发明(V)的细胞结构体的特征在于，是通过上述任一项所记载的细胞结构体的制造方法而制造的。
本发明(V)的细胞的特征在于，在培养器培养面具有用温度响应性聚合物和/或温度响应性聚合物组合物包覆的第一包覆区域、以及设置于上述第一包覆区域的端部的用细胞粘附性物质包覆的多个第二包覆区域。
本发明(VI)提供一种细胞结构体的制造方法，其特征在于，包含以下工序：制备工序，制备温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物；培养器准备工序，用上述温度响应性聚合物或上述温度响应性聚合物组合物包覆细胞培养器的培养面，准备包覆细胞培养器；种植工序，在上述包覆细胞培养器中种植心肌细胞和相对于上述100个心肌细胞为200～300个的比例的成纤维细胞；培养工序，对种植的细胞进行培养而得到块状的细胞结构体。
在上述种植工序中，优选进一步种植血管内皮细胞。
优选在上述种植工序以后、且得到上述细胞结构体之前，在上述包覆细胞培养器中进一步添加免疫细胞。
上述免疫细胞优选为巨噬细胞和/或T细胞。
优选用上述温度响应性聚合物或上述温度响应性聚合物组合物包覆的部分的面积为200mm2以下。
本发明(VII)提供一种细胞结构体的制造方法，其特征在于，包含以下工序：制备工序，制备温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物；培养器准备工序，用上述温度响应性聚合物或上述温度响应性聚合物组合物包覆细胞培养器的培养面，准备包覆细胞培养器；种植工序，在上述包覆细胞培养器中种植肝细胞和相对于100个上述肝细胞为10～50个的比例的成纤维细胞；培养工序，对种植的细胞进行培养而得到块状的细胞结构体。
在上述种植工序中，优选进一步种植血管内皮细胞。
在上述种植工序中，优选进一步种植脂肪细胞。
在上述种植工序中，优选以相对于100个上述肝细胞为50个的比例、且相对于100个上述成纤维细胞为100～500个的比例种植上述脂肪细胞。
优选在上述种植工序以后、且得到上述细胞结构体之前，在上述包覆细胞培养器中进一步添加免疫细胞。
上述免疫细胞优选为选自单核细胞、粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞中的至少1种。
发明效果
根据本发明，能够提供高效地制造细胞块、细胞结构体或立体组织体的方法。
特别地，根据本发明(I)，能够简便地制造在关节、气管、鼻等的治疗中有用的软骨细胞块和移植材料以及复合材料。
此外，本发明(II)的上皮细胞的培养方法由于具有上述构成，因此能够容易地培养不易与细胞培养器粘附的上皮细胞。此外，本发明(II)的细胞结构体的制造方法由于具有上述构成，因此能够容易地制造包含不易与细胞培养器粘附的上皮细胞的细胞结构体。此外，本发明(II)的上皮细胞用细胞培养器由于具有上述构成，因此能够培养上皮细胞及制造其细胞结构体。
此外，本发明(III)的立体组织体的制作装置由于具有上述构成，因此能够容易地制作环状或管腔状等的立体组织体。此外，根据本发明(III)的立体组织体的制作方法，由于具有上述构成，因此能够容易地制作环状或管腔状等的立体组织体。
此外，根据本发明(IV)，能够简便地制造期望尺寸的形状经调控的球状的细胞结构体。
此外，根据本发明(V)，能够控制细胞的凝聚方式而制造期望形态的细胞结构体。
此外，本发明(VI)的细胞结构体的制造方法由于具有上述构成，因此能够容易地形成作为心脏病模型有用的、包含心肌细胞和成纤维细胞的细胞结构体。
此外，本发明(VII)的细胞结构体的制造方法由于具有上述构成，因此能够容易地形成作为肝功能衰竭模型有用的、包含肝细胞和成纤维细胞的细胞结构体。
附图说明
图1的(i)～(viii)表示本实施方式(I)中的一个例子的软骨细胞块的制造方法的概要的图。
图2的(i)～(vi)表示本实施方式(I)中的一个例子的软骨细胞块的制造方法的概要的图。在(iv)的括号内，表示结构物的剖面图。
图3表示本实施方式(I)中的准备工序的变形例及随后的种植培养工序的概略的图。(a)表示准备工序的第一变形例的图，(b)表示准备工序的第二变形例的图。
图4表示本实施方式(I)的移植材料的制造方法的概要的图。
图5表示本实施方式(I)中的另外一个例子的软骨细胞块的制造方法的概要的图。
图6的(i)～(v)表示本实施方式(I)中的一个例子的复合材料的制造方法的概要的图。
图7表示使用荧光显微镜观察本实施方式(I)的试验I-C-1(参考例I)中的、自开始培养起24小时后(1天后)、2天后、6天后、10天后的细胞结构体的状态时的照片的图。特别地，下图为放大表示10天后的细胞结构体的照片的一部分的图。
图8表示将本实施方式(I)的试验I-C-1(参考例I)中得到的细胞结构体在短轴方向截面切断时的照片的图。
图9表示使用荧光显微镜观察本实施方式(I)的试验I-C-2中的、自开始培养起27小时后、44小时后、70小时后、122小时后的细胞结构体的状态时的照片的图。上图表示在使用具有宽2mm的甜甜圈形状的中空的内底的情况下的细胞结构体的状态的图，下图表示在使用具有宽2.5mm的甜甜圈形状的中空的内底的情况下的细胞结构体的状态的图。
图10表示使用荧光显微镜观察本实施方式(I)的试验I-C-3中的、自开始培养起8小时后、20小时后、32小时后、42小时后的细胞结构体的状态时的照片的图。上图表示在使用具有宽2mm的甜甜圈形状的中空的内底的情况下的细胞结构体的状态的图，下图表示在使用具有宽2.5mm的甜甜圈形状的中空的内底的情况下的细胞结构体的状态的图。最下图表示使用立体显微镜观察42小时后的细胞结构体的状态时的照片的图。
图11(a)表示用肉眼观察本实施方式(I)的试验I-D中的自开始培养起6天后的复合材料的状态时的照片的图，图11的(b)表示用肉眼观察本实施方式(I)的试验I-D中的自开始培养起21天后的复合材料的状态时的照片的图。
图12为放大表示用肉眼观察本实施方式(I)的试验I-D中的自开始培养起21天后的复合材料的一部分的状态时的照片的图。
图13表示用肉眼观察对在本实施方式(I)的试验I-D中制备的复合材料用镊子进行操作时的状态时的照片的图。(a)表示无操作时的外周表面的状态的图，(b)表示无操作时的内腔表面的状态的图，(c)表示对全体进行挤压时的状态的图，(d)表示对侧面的一部分进行拉伸时的状态的图。
图14表示用显微镜观察将在本实施方式(I)的试验I-D中制备的复合材料供给苏木素伊红染色(HE染色)时的状态时的照片的图。(a)表示复合材料的外观照片的图，(b)表示通过沿着(a)的线A-A的面进行切断时的剖面图的图，(c)和(d)表示将(b)所示的照片部分放大的图。
图15为用于说明本发明(II)的一个实施方式的细胞结构体的制造方法的概略图。
图16为用于说明本发明(II)的一个实施方式的细胞结构体的制造方法的概略图。
图17表示在本发明(II)中使用的温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物上对上皮细胞进行了96小时培养时的状态的照片。图中，虚线包围的部分表示包覆区域A，黑框箭头表示在包覆区域A粘附、生长的细胞，黑色实心箭头表示在非包覆区域粘附、生长的细胞。
图18为用于说明本发明(III)的一个实施方式的立体组织体的制造装置的概略图(立体图)。
图19为用于说明本发明(III)的一个实施方式的立体组织体的制造装置的概略图(立体图)。
图20为用于说明本发明(III)的一个实施方式的立体组织体的制造装置的概略图(立体图)。
图21为本发明(III)的一个实施方式的立体组织体的制造装置的照片。
图22为用于说明本发明(III)的一个实施方式的立体组织体的制造方法的概略图。
图23为用于说明本发明(III)的一个实施方式的立体组织体的制造方法的概略图。
图24为本发明(III)的实施例III-4中得到的环状的立体组织体的照片。
图25为本发明(III)的实施例III-5中得到的管腔状的立体组织体的照片。
图26为用于说明本发明(III)的一个实施方式的立体组织体的制造装置的概略图(立体图)。
图27为用于说明本发明(III)的一个实施方式的立体组织体的制造方法的概略图。
图28的(A)为本发明(III)的实施例III-8中得到的管腔状的立体组织体的照片。图28的(B)为本发明(III)的实施例III-8中得到的管腔状的立体组织体的HE染色切片图像。
图29为本发明(III)的实施例III-9中得到的人工血管的照片。
图30为本发明(III)的实施例III-10中得到的人工气管的照片。
图31为本发明(III)的实施例III-11中得到的以蛋白质为主要成分的立体组织体的照片。
图32表示本发明(IV)的实施方式的细胞培养体的制造方法的一个例子的概略的图。
图33的(i)～(iii)表示本发明(IV)的实施方式的细胞培养体的制造方法的变形例的图。
图34的(A)～(C)表示对在本发明(IV)的实施例中培养面的液滴的量和液滴的直径的关系进行了调查的结果的图。
图35的(i)～(viii)表示本实施方式(V)中的一个例子的细胞结构体的制造方法的概要的图。
图36的(a)～(c)表示本实施方式(V)中的第一包覆区域和第二包覆区域的配置方式的图。
图37表示本实施方式(V)中的准备工序的变形例及随后的种植培养工序的概略的图。
图38的(a)表示将在本实施方式(V)的试验V-C中、在试验V-B中准备的第一包覆区域和第二包覆区域中对GFP重组Lewis鼠的ADSC进行培养2小时后的状态使用显微镜进行观察时的照片的图。(b)表示将在试验V-C中、在试验V-B中准备的第一包覆区域和第二包覆区域中对GFP重组Lewis鼠的ADSC进行培养20小时后的状态使用显微镜进行观察时的照片的图。(c)表示降低倍率观察(b)所示的细胞结构体时的照片的图。(d)表示使用荧光显微镜观察(b)的虚线所表示的细胞结构体的状态时的照片的图。
图39为用于说明本发明(VI)的一个实施方式的细胞结构体的制造方法的概略图。
图40为用于说明本发明(VI)的一个实施方式的细胞结构体的制造方法的概略图。
图41为用于说明本发明(VII)的一个实施方式的细胞结构体的制造方法的概略图。
图42为用于说明本发明(VII)的一个实施方式的细胞结构体的制造方法的概略图。
具体实施方式
本发明的特征在于，在用温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物包覆的培养面种植细胞，进行培养。具体而言，可举出下述的发明(I)～(VII)。
[[发明(I)]]
关于发明(I)，目前为止发明人等开发了具有特定物性的、对制造细胞结构体极其有用的温度响应性聚合物和温度响应性聚合物组合物。当用该聚合物和/或聚合物组合物包覆细胞培养器的培养面，并在该培养面种植、培养相当于约100％汇合(confluent)的数目的细胞时，细胞粘附于包覆物，然后，在包覆培养面上一次性凝聚，在包覆培养面的中央部分形成细胞块。该现象可认为是由于细胞间的网络而引起的收缩超过了细胞对包覆培养面的粘附，细胞从包覆培养面剥离的缘故。
本发明(I)的软骨细胞块和移植材料的制造方法使用了该温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物。
以下，参考附图，对本发明(I)的软骨细胞块和移植材料的制造方法、以及本发明(I)的软骨细胞块和移植材料的实施方式详细地示例说明。
(软骨细胞块的制造方法)
本发明(I)的实施方式(以下，也称为“本实施方式(I)”。)的软骨细胞块的制造方法包含种植培养工序，上述种植培养工序通过在用温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物包覆的包覆培养面，在细胞块的存在下种植能够分化成软骨细胞的细胞，对细胞块和能够分化成软骨细胞的细胞进行共培养，从而制备软骨细胞块。
优选本实施方式(I)的制造方法包含以下工序：制备工序，制备温度响应性聚合物和/或温度响应性聚合物组合物；准备工序，用上述温度响应性聚合物和/或上述温度响应性聚合物组合物包覆培养面的一部分而准备包覆培养面；种植培养工序，在上述包覆培养面，在细胞块的存在下，种植能够分化成软骨细胞的细胞，对细胞块和能够分化成软骨细胞的细胞进行共培养，由此制备软骨细胞块。
在图1的(i)～(viii)和图2的(i)～(vi)中，表示了本实施方式(I)中的一个例子的软骨细胞块的制造方法的概要。
以下，记载了本实施方式(I)中的一个例子的软骨细胞块的制造方法的各工序的详细过程。
(制备工序)
在一个例子的制造方法中，首先，制备温度响应性聚合物和/或温度响应性聚合物组合物(制备工序)。
作为本实施方式(I)中使用的温度响应性聚合物和温度响应性聚合物组合物，可举出：(A)包含2-N,N-二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯(DMAEMA)单元和阴离子型单体单元的温度响应性聚合物；(B)包含N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)单元、阳离子型单体单元以及阴离子型单体单元的温度响应性聚合物；(C)包含2-N,N-二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯(DMAEMA)和/或其衍生物的聚合物、2-氨基-2-羟甲基-1,3-丙二醇(Tris)、以及选自核酸、肝素、透明质酸、硫酸葡聚糖、聚苯乙烯磺酸、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚磷酸、硫酸化多糖、凝胶多糖及聚海藻酸以及它们的碱金属盐中的1种以上阴离子型物质的温度响应性聚合物组合物等。
在此，作为上述(A)，可举出例如：(A-1)通过在水的存在下将DMAEMA聚合的方法而得到的温度响应性聚合物；(A-2)含有主要包含DMAEMA的聚合物嵌段(聚合链α末端)、以及主要包含DMAEMA和阴离子型单体的共聚物嵌段(聚合链ω末端)的温度响应性聚合物等。
在本实施方式(I)中，这些可以单独使用1种，也可以组合2种以上使用。
以下，记载了上述(A-1)的温度响应性聚合物及其制造方法。
(温度响应性聚合物的制造方法)
(A-1)的温度响应性聚合物的制造方法的特征在于，包含以下工序：制备工序，制备包含2-N,N-二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯(DMAEMA)的混合物；照射工序，对混合物照射紫外线，其中，在制备工序中，混合物还包含阻聚剂和水，在照射工序中，在非活性气氛下照射紫外线。
在(A-1)的温度响应性聚合物的制造方法中，首先，制备包含2-N,N-二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯(DMAEMA)的混合物(制备工序)。在此，混合物还包含阻聚剂和水。
作为2-N,N-二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯(DMAEMA)，能够使用市售品。作为阻聚剂，可举出：甲基对苯二酚(MEHQ)、对苯二酚、对苯并喹啉、N,N-二乙基羟胺、N-亚硝基-N-苯基羟胺(Cupferron)、叔丁基对苯二酚等。此外，也可以直接使用市售的DMAEMA所包含的MEHQ等。作为水，可举出超纯水。
阻聚剂相对于上述混合物的质量比例优选为0.01～1.5％，进一步优选为0.1～0.5％。如果为上述范围，则能够抑制自由基聚合反应的失控从而减少不能控制的交联，能够确保制造的温度响应性聚合物在溶剂中的溶解性。
水相对于上述混合物的质量比例优选为1.0～50％，进一步优选为9.0～33％。如果为上述范围，则能够良好地协调侧链的水解反应的反应速度和进行聚合的聚合链的增长反应的反应速度。由此，能够得到侧链未被水解的DMAEMA相对于侧链已被水解的DMAEMA的比例(共聚比例)为1.0～20左右的温度响应性聚合物。
接着，在(A-1)的温度响应性聚合物的制造方法中，对混合物照射紫外线(照射工序)。在此，在非活性气氛下照射紫外线。DMAEMA通过照射紫外线进行自由基聚合而制成聚合物。
在该工序中，例如，在透明的密封小瓶(vial)中加入上述混合物，通过用非活性气体进行鼓泡而使小瓶内成为非活性气氛后，从小瓶的外部用紫外线照射装置照射紫外线。
作为紫外线的波长，优选为210nm～600nm，更优选为360～380nm。如果为上述范围，则能够高效地进行聚合反应，能够稳定地得到具有期望的共聚比例的高分子材料。此外，还能够防止制造的聚合物材料着色。
作为非活性气体，可出氮、氩、氦、氖等。
关于反应条件，作为温度条件，优选为15～50℃，进一步优选为20～30℃。如果为上述范围，则能够抑制由热引起的引发反应，使由光照引起的引发反应优先进行。此外，也能够使水解反应的反应速度相对于聚合物链的增长反应的反应速度的平衡良好。
作为反应时间，优选为7～24小时，进一步优选为17～21小时。如果为上述范围，则能够以高收率得到(A-1)的温度响应性聚合物，此外，还能够一边抑制光分解反应、不必要的交联反应一边进行自由基聚合。
另外，从在制备工序中混合物制备结束后、至在照射工序中开始照射紫外线为止的时间，优选为10分钟～1小时。
将加入了混合物的小瓶内部的气体进行置换而使小瓶内成为非活性气氛时需要10分钟左右的时间。因此，当上述时间小于10分钟时，有可能无法得到自由基聚合所需要的非活性气氛。此外，在混合物中，DMAEMA的水解反应在开始照射紫外线前开始。因此，如果上述时间超过1小时，则在自由基聚合反应中混合物中会大量产生非活性的甲基丙烯酸。
在(A-1)的温度响应性聚合物的制造方法中，由于混合物中包含水，因此能够使DMAEMA的自由基聚合反应和聚2-N,N-二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯(PDMAEMA)的侧链的酯键的水解反应进行拮抗。
通过该拮抗，得到的产物为包含由式(I)表示的重复单元(A)和由式(II)表示的重复单元(B)的聚合物。
[化学式1]
[化学式2]
因此，能够平衡良好地具有以下二者：聚合物具有的阳离子型官能团即二甲基氨基、以及聚合物具有的阴离子型官能团即侧链的酯键水解而得到的羧基。而且，根据(A-1)的温度响应性聚合物的制造方法，能够以少的工序简便地制造具有阳离子型官能团和阴离子型官能团的、来自聚(2-N,N-二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯)的聚合物。
另外，即使不是与(A-1)的温度响应性聚合物的制造方法相同的制造方法，如果DMAEMA、阻聚剂及水在照射紫外线时在反应体系中共存，则能够得到与本发明(I)的温度响应性聚合物的制造方法的上述效果同样的效果。
例如，分别准备包含DMAEMA和阻聚剂的混合物、以及水，接着在混合物和水中将非活性气体进行鼓泡，然后，在非活性气氛下将混合物和水进行混合，与此同时照射紫外线，这样的温度响应性聚合物的制造方法也能够包含在(A-1)的温度响应性聚合物中。
(温度响应性聚合物)
(A-1)的温度响应性聚合物可通过上述(A-1)的制造方法而制造。
在此，作为(A-1)的温度响应性聚合物，优选数均分子量(Mn)为10～500kDa的分子。此外，重均分子量(Mw)和数均分子量(Mn)的比(Mw/Mn)优选为1.1～10.0。
(A-1)的温度响应性聚合物的分子量能够通过紫外线的照射时间和照射强度的条件而适当调节。
基于(A-1)的温度响应性聚合物，能够使浊点下降到例如室温(25℃)以下。
在上述(A-1)的温度响应性聚合物中，在浊点以上的温度形成的温度响应性聚合物的不溶物在室温(约25℃)条件下至再溶解为止的时间显著地延迟。该现象推测是由于得到的(A-1)的温度响应性聚合物在分子内存在阳离子型官能团和阴离子型官能团，因此具有高的自凝聚性的原因。
此外，能够使用该(A-1)的温度响应性聚合物如后述那样制备在培养面包覆有该温度响应性聚合物的细胞培养器。
进而，根据(A-1)的温度响应性聚合物，通过如后述那样在合适的培养条件培养细胞，从而能够形成具有管腔状(管状)、块状(颗粒状)等结构的细胞结构体。
(A-1)的温度响应性聚合物具有的阳离子型官能团(2-N,N-二甲基氨基)的官能团数与阴离子型官能团(羧基)的官能团数的比(C/A比)优选为0.5～32，进一步优选为4～16。
如果C/A比为上述范围，则易于得到降低浊点这样的上述效果。可推测在具有上述C/A比的温度响应性聚合物中，上述温度响应性聚合物中阳离子型官能团和阴离子型官能团以离子键对分子间和/或分子内的凝聚产生作用，结果温度响应性聚合物的凝聚力增强。
此外，推测如果C/A比为上述范围，则能够使上述温度响应性聚合物中的正电荷和负电荷的平衡特别合适，从而抑制由于正电荷而导致的细胞损害性，此外，还能够使上述温度响应性聚合物的亲水性和疏水性的平衡特别合适，从而易于发生细胞的迁移、取向。
以下，记载了上述(A-2)的温度响应性聚合物及其制造方法。
(温度响应性聚合物的制造方法)
(A-2)的温度响应性聚合物的制造方法的特征在于，包含以下工序：第一聚合工序，对包含2-N,N-二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯(DMAEMA)的第一混合物照射紫外线；添加工序，在第一聚合工序中的聚合物的数均分子量达到规定值以上的时刻，在第一混合物中添加阴离子型单体而制备第二混合物；第二聚合工序，对第二混合物照射紫外线。
在(A-2)的温度响应性聚合物的制造方法中，首先，对包含2-N,N-二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯(DMAEMA)的第一混合物照射紫外线(第一聚合工序)。
在此，第一混合物除了包含DMAEMA以外，还可以任选地包含例如其它单体、溶剂等。
此外，可以在非活性气氛下照射紫外线。
作为DMAEMA，可以为市售品。
作为第一混合物中可包含的其它单体，可举出例如：N,N-二甲基丙烯酰胺、具有聚乙二醇侧链的丙烯酸、甲基丙烯酸的酯、N-异丙基丙烯酰胺、3-N,N-二甲基氨基丙基丙烯酰胺、2-N,N-二甲基氨基乙基甲基丙烯酰胺等，从能够稳定地进行离子平衡的调节的观点出发，优选N,N-二甲基丙烯酰胺、具有聚乙二醇侧链的丙烯酸、甲基丙烯酸的酯、N-异丙基丙烯酰胺。这些可以单独使用1种，也可以组合2种以上使用。在此，其它单体的使用量相对于DMAEMA的使用量的比例(摩尔比例)优选为0.001～1，进一步优选为0.01～0.5。
作为溶剂，可举出例如甲苯、二甲苯、氯仿、甲醇、乙醇等，由于甲苯、苯对于DMAEMA的酯键是非活性的，因此特别优选。这些可以单独使用1种，也可以组合2种以上使用。
在该工序中，例如，在透明的密封小瓶中加入上述第一混合物，通过用非活性气体进行鼓泡而使小瓶内成为非活性气氛后，从小瓶的外部用紫外线照射装置照射紫外线。
作为紫外线的波长，优选为210nm～600nm，更优选为360～380nm。如果为上述范围，则能够高效地进行聚合反应，能够稳定地得到具有期望的共聚比例的高分子材料。此外，还能够防止制造的聚合物材料着色。
作为紫外线的照射强度，优选为0.01～50mW/cm2，进一步优选为0.1～5mW/cm2。如果为上述范围，则能够抑制由于不需要的化学键的断裂等而引起的分解，并且使聚合反应以合适的速度(时间)稳定地进行。
作为非活性气体，可出氮、氩、氦、氖等。
作为温度条件，优选为10～40℃，进一步优选为20～30℃。如果为上述范围，则能够在通常的实验室的室温下进行反应，此外，能够通过与光不同的另外的方式(加热等)来抑制反应。
作为反应时间，优选为10分钟～48小时，进一步优选为60分钟～24小时。
在该工序中，DMAEMA通过紫外线的照射而进行自由基聚合，由此成为聚合物(聚(2-N,N-二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯)(PDMAEMA))，形成包含2-N,N-二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯的均聚物嵌段。在还使用了其它单体的情况下，可形成包含DMAEMA和其它单体的聚合物嵌段。
接着，在(A-2)的温度响应性聚合物的制造方法中，在第一聚合工序中的聚合物(具体而言，为经聚合化的2-N,N-二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯)的数均分子量达到规定值以上的时刻，在第一混合物中添加阴离子型单体而制备第二混合物(添加工序)。
在此，第二混合物除了包含第一聚合工序后的第一混合物和阴离子型单体以外，还可以包含例如其它单体、上述的在第一混合物中可包含的溶剂(甲苯、苯、甲醇等)等。
此外，可以在非活性气氛下添加阴离子型单体。
作为阴离子型单体，可举出例如丙烯酸、甲基丙烯酸、侧链具有选自羧基、磺酸基以及磷酸基中的至少1种的基团的乙烯基衍生物等，从化学稳定性的观点出发，特别优选丙烯酸、甲基丙烯酸。
这些可以单独使用1种，也可以组合2种以上使用。
作为第二混合物中可包含的其它单体，可举出例如：N,N-二甲基丙烯酰胺、具有聚乙二醇侧链的丙烯酸、甲基丙烯酸的酯、N-异丙基丙烯酰胺、3-N,N-二甲基氨基丙基丙烯酰胺、2-N,N-二甲基氨基乙基甲基丙烯酰胺等，由于N,N-二甲基丙烯酰胺为电中性且为亲水性，因此特别优选。这些可以单独使用1种，也可以组合2种以上使用。在此，其它单体的使用量相对于DMAEMA的使用量的比例(摩尔)优选为0.01～10，进一步优选为0.1～5。
在该工序中，一边通过例如使非活性气体流入小瓶而保持小瓶内为非活性气氛，一边添加上述第二混合物。
从充分得到浊点降低的效果的观点出发，数均分子量的规定值优选为5000，进一步优选为20000，特别优选为100000。
另外，第一聚合工序后的第一混合物中的经聚合化的PDMAEMA的数均分子量，能够通过在规定的时刻从聚合体系采集少量的反应混合物并利用凝胶渗透色谱法(GPC)、光散射法(SLS)等本领域技术人员公知的方法进行测定。
在该工序中，在聚合体系中除了包含聚合中的DMAEMA的均聚物以外，还包含阴离子型单体，从而使小瓶内的聚合体系从DMAEMA的均聚体系转换为DMAEMA和阴离子型单体的共聚体系。
然后，在(A-2)的温度响应性聚合物的制造方法中，对第二混合物照射紫外线(第二聚合工序)。
在此，可以在非活性气氛下照射紫外线。
在该工序中，例如使用紫外线照射装置从添加了第二混合物后的小瓶的外部照射紫外线。
第二聚合工序中的、紫外线的波长、紫外线的照射强度、使用的非活性气体、反应温度、反应时间等各条件可以与第一聚合工序中的条件相同。
在该工序中，DMAEMA和阴离子型单体通过紫外线的照射进行自由基聚合，并以连接于在第一聚合工序中形成的包含DMAEMA的均聚物嵌段的聚合链α末端的方式，形成包含DMAEMA和阴离子型单体的共聚物嵌段。在还使用了其它单体的情况下，形成包含DMAEMA和阴离子型单体以及其它单体的共聚物。
如上所述，可得到包含均聚物嵌段和共聚物嵌段的温度响应性聚合物，上述均聚物嵌段包含DMAEMA，上述共聚物嵌段是DMAEMA和阴离子型单体的共聚物嵌段。
另外，在(A-2)的制造方法中，如本领域技术人员理解的那样，在生成具有各种分子量和分子结构的聚合物的混合物的情况下，从得到下述温度响应性聚合物作为主成分的观点出发，优选在贯穿第一聚合工序、添加工序以及第二聚合工序地在同一条件下进行聚合，该温度响应性聚合物包含均聚物嵌段和共聚物嵌段，上述均聚物嵌段包含DMAEMA，上述共聚物嵌段包含DMAEMA和阴离子型单体。
(温度响应性聚合物)
(A-2)的温度响应性聚合物可通过上述(A-2)的制造方法而制造。
(A-2)的温度响应性聚合物包含下述嵌段：主要包含2-N,N-二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯，任选地包含二甲基丙烯酰胺、具有聚乙二醇侧链的丙烯酸、甲基丙烯酸等亲水性单体等其它单体单元的聚合物嵌段(聚合链α末端)；以及主要包含2-N,N-二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯和阴离子型单体(聚合链ω末端)，任选地包含其它单体单元的共聚物嵌段。
(A-2)的温度响应性聚合物优选包含DMAEMA的均聚物嵌段以及DMAEMA和阴离子型单体的共聚物嵌段，进一步优选由这些嵌段构成。
在此，作为(A-2)的温度响应性聚合物，聚合链α末端的聚合物嵌段(例如，DMAEMA的均聚物嵌段)的数均分子量优选为5000Da以上，进一步优选为20000Da以上。
作为(A-2)的温度响应性聚合物，优选数均分子量(Mn)为10～500kDa的分子。此外，优选重均分子量(Mw)和数均分子量(Mn)的比(Mw/Mn)为1.1～10.0的分子。
温度响应性聚合物的分子量能够通过紫外线的照射时间和照射强度的条件而适当调节。
基于(A-2)的温度响应性聚合物，能够使浊点下降到例如室温(25℃)以下。
在上述(A-2)的温度响应性聚合物中，在浊点以上的温度形成的温度响应性聚合物的不溶物在室温(约25℃)条件下至再溶解为止的时间显著地延迟。该现象可推测是由于得到的温度响应性聚合物在分子内存在阳离子型官能团和阴离子型官能团，因此具有高的自凝聚性的原因。
特别是，可认为(A-2)的温度响应性聚合物由于在聚合链α末端具备具有高分子量(例如，5000Da以上)的DMAEMA的均聚物嵌段，因此容易发生DMAEMA的侧链的温度依赖性的珠球转变(globule transition)，而能够有效地降低浊点。
此外，能够采用该温度响应性聚合物如后所述地制备在培养面包覆该温度响应性聚合物而成的细胞培养器。
进而，根据(A-2)的温度响应性聚合物，通过如后所述地在合适的培养条件下培养细胞，从而能够形成具有管腔状(管状)、块状(颗粒状)等结构的细胞结构体。
(A-2)的温度响应性聚合物具有的阳离子型官能团(2-N,N-二甲基氨基)的官能团数与阴离子型官能团(羧基)的官能团数的比(C/A比)优选为0.5～32，进一步优选为4～16。
如果C/A比为上述范围，则易于得到降低浊点这样的上述效果。可推测在具有上述C/A比的温度响应性聚合物中，上述温度响应性聚合物中阳离子型官能团和阴离子型官能团以离子键对分子间和/或分子内的凝聚产生作用，从而温度响应性聚合物的凝聚力增强。
此外，推测如果C/A比为上述范围，则能够使上述温度响应性聚合物中的正电荷和负电荷的平衡特别合适，从而抑制由于正电荷而导致的细胞伤害性，此外，还能够使上述温度响应性聚合物的亲水性和疏水性的平衡特别合适，从而易于发生细胞的迁移、取向。
以下，记载了上述(B)的温度响应性聚合物及其制造方法。
(温度响应性聚合物的制造方法)
(B)的温度响应性聚合物的制造方法是使N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)(以下也称为“单体(A)”。)、阳离子型单体(以下也称为“单体(B)”。)、以及阴离子型单体(以下也称为“单体(C)”。)聚合的方法。还可以任选地在上述三种单体中加入除此以外的其它单体而使其聚合。
作为N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)，可以为市售品。
作为阳离子型单体，可举出具有阳离子型官能团的单体，作为阳离子型官能团，可举出伯～季胺基等胺基、胍基等，特别从化学稳定性、低细胞伤害性、灭菌稳定性、强正电荷性的观点出发，优选叔胺基。
更具体而言，作为阳离子型单体，优选即使负载生理活性物质或置于碱性条件下也稳定性高的单体，可举出例如3-(N,N-二甲基氨基丙基)-(甲基)丙烯酰胺、3-(N,N-二甲基氨基丙基)-(甲基)丙烯酸酯、氨基苯乙烯、2-(N,N-二甲基氨基乙基)-(甲基)丙烯酰胺、2-(N,N-二甲基氨基乙基)-(甲基)丙烯酸酯等。
在这些中，3-(N,N-二甲基氨基丙基)丙烯酰胺由于具有高的正电荷强度因此易于负载阴离子型物质，所以特别优选。
另外，氨基苯乙烯由于具有高的正电荷强度，因此容易负载阴离子型物质，并且由于分子内的芳香环在水溶液中会与其它物质的疏水性结构相互作用，因此扩大了能够负载的阴离子型物质的多样性，所以优选。
进而，2-(N,N-二甲基氨基乙基)-甲基丙烯酰胺由于在中性区域的pH时具有微弱的正电荷、而且在水中的溶解性不受温度影响，因此容易释放曾经负载的阴离子型物质，所以优选。
这些可以单独使用1种，也可以组合2种以上使用。
作为阴离子型单体，可举出具有阴离子型官能团的单体，作为阴离子型官能团，可举出羧酸基、磺酸基、硫酸基、磷酸基、硼酸基等，从化学稳定性、细胞亲和性、高纯化度的观点出发，特别优选羧酸基、磺酸基、磷酸基。
更具体而言，可举出丙烯酸、甲基丙烯酸、乙烯基安息香酸等，从化学稳定性、细胞亲和性的观点出发，特别优选甲基丙烯酸、乙烯基安息香酸。
这些可以单独使用1种，也可以组合2种以上使用。
作为其它单体，可举出例如二甲基丙烯酰胺、具有聚乙二醇侧链的丙烯酸、甲基丙烯酸等中性的亲水性单体等。
这些可以单独使用1种，也可以组合2种以上使用。
其它单体能够用于调节除电荷以外的亲水性-疏水性的平衡，能够扩大多样性。
在此，对于(B)的温度响应性聚合物的制造方法中的NIPAM的使用量、阳离子型单体的使用量、其它单体的使用量各自相对于单体(A)～(C)的总使用量的比例(摩尔)，本领域技术人员能够考虑单体在聚合反应中的反应性，以能得到期望的单体成分的比例的方式进行适当调节。
在此，作为聚合方法，可举出自由基聚合、离子聚合等。
作为自由基聚合，优选活性自由基聚合，作为活性自由基聚合，可举出可逆加成-断裂链转移(RAFT)聚合、原子转移自由基聚合(ATRP)、引发转移终止剂(iniferter)聚合等，优选引发转移终止剂聚合。
作为离子聚合，优选活性阴离子聚合。
(B)的温度响应性聚合物的制造方法的一个例子是使用自由基聚合的方法。
该制造方法的一个例子包含以下工序：第一聚合工序，对包含N-异丙基丙烯酰(NIPAM)的第一混合物照射紫外线；添加工序，在第一混合物中添加阳离子型单体和阴离子型单体而制备第二混合物；第二聚合工序，对第二混合物照射紫外线。
在该制造方法的一个例子中，首先，对包含N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)的第一混合物照射紫外线(第一聚合工序)。
在此，第一混合物除了包含NIPAM以外，还可以任选地包含例如其它单体、溶剂、链转移剂、稳定剂、表面活性剂等。
此外，可以在非活性气氛下照射紫外线。
在该工序中，例如，在透明的密封小瓶中加入上述第一混合物，通过用非活性气体进行鼓泡而使小瓶内成为非活性气氛后，从小瓶的外部用紫外线照射装置照射紫外线。
作为溶剂，可举出例如苯、甲苯、氯仿、甲醇、水等，从溶解能力的方面以及对于聚合为非活性的方面出发，特别优选苯、甲苯。这些可以单独使用1种，也可以组合2种以上使用。
在该工序中，例如，在透明的密封小瓶中加入上述第一混合物，通过用非活性气体进行鼓泡而使小瓶内成为非活性气氛后，从小瓶的外部用紫外线照射装置照射紫外线。
作为紫外线的波长，优选为210～600nm，更优选为360～380nm。如果为上述范围，则能够高效地进行聚合反应，能够稳定地得到具有期望的共聚比例的高分子材料。此外，还能够防止制造的聚合物材料着色。
作为紫外线的照射强度，优选为0.01～50mW/cm2，进一步优选为0.1～5mW/cm2。
作为非活性气体，可出氮、氩、氦、氖等。
作为温度条件，优选为10～40℃，进一步优选为20～30℃。如果为上述范围，则能够在通常的实验室的室温条件下进行聚合反应，此外，还能够通过与光照的方式不同的加热这样的方式进行反应控制。
作为反应时间，作为反应时间，优选为10分钟～48小时，进一步优选为60分钟～24小时。
在该工序中，NIPAM通过紫外线的照射而进行自由基聚合，成为聚合物(聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAM))，形成包含N-异丙基丙烯酰胺的均聚物嵌段。在还使用了其它单体的情况下，可形成包含NIPAM和其它单体的聚合物嵌段。
接着，在(B)的温度响应性聚合物的制造方法中，在第一聚合工序后的第一混合物中添加阳离子型单体和阴离子型单体而制备第二混合物(添加工序)。
在此，第二混合物除了包含第一聚合工序后的第一混合物、阳离子型单体以及阴离子型单体以外，还可以包含例如其它单体、溶剂、链转移剂、稳定剂、表面活性剂等。
此外，可以在非活性气氛下添加阳离子型单体和阴离子型单体。
在该工序中，一边通过例如使非活性气体流入小瓶而保持小瓶内为非活性气氛，一边添加上述阳离子型单体和阴离子型单体。
在该工序中，聚合体系中除了包含聚合中的NIPAM的均聚物以外，还包含阳离子型单体和阴离子型单体，从而使小瓶内的聚合体系从NIPAM的均聚体系转换为NIPAM、阳离子型单体及阴离子型单体的共聚体系。
然后，在(B)的温度响应性聚合物的制造方法中，对第二混合物照射紫外线(第二聚合工序)。
在此，可以在非活性气氛下照射紫外线。
在该工序中，例如使用紫外线照射装置从添加了阳离子型单体和阴离子型单体后的小瓶的外部照射紫外线。
作为紫外线的波长，优选为210nm～600nm，更优选为360～380nm。如果为上述范围，则能够高效地进行聚合反应，能够稳定地得到具有期望的共聚比例的高分子材料。此外，还能够防止制造的聚合物材料着色。
作为紫外线的照射强度，优选为0.01～50mW/cm2，进一步优选为0.1～5mW/cm2。
作为非活性气体，可出氮、氩、氦、氖等。
作为温度条件，优选为10～40℃，进一步优选为20～30℃。如果为上述范围，则能够在通常的实验室的室温条件下进行聚合反应，此外，还能够通过与光照的方式不同的加热的方式进行反应控制。
作为反应时间，作为反应时间，优选是为10分钟～48小时，进一步优选为60分钟～24小时。
在该工序中，NIPAM、阳离子型单体以及阴离子型单体通过紫外线的照射进行自由基聚合，并以连接于在第一聚合工序中形成的包含NIPAM的均聚物嵌段的聚合链α末端的方式，形成包含NIPAM、阳离子型单体以及阴离子型单体的共聚物嵌段。在还使用了其它单体的情况下，可形成包含NIPAM和其它单体的聚合物嵌段，和/或包含NIPAM、阳离子型单体、阴离子型单体以及其它单体的共聚物嵌段。
如上所述，可得到包含如下嵌段的温度响应性聚合物：NIPAM的均聚物嵌段，以及NIPAM、阳离子型单体及阴离子型单体的共聚物嵌段。
另外，在该一个例子的制造方法中，从实现高效的反应的观点出发，优选贯穿第一聚合工序、添加工序以及第二聚合工序地照射紫外线。
(B)的温度响应性聚合物的制造方法的另一个例子为使用自由基聚合的方法，对包含N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)、阳离子型单体、阴离子型单体、以及任选的其它单体的混合物照射紫外线。
在此，上述混合物还可以包含例如溶剂、链转移剂、稳定剂、表面活性剂等。
此外，可以在非活性气氛下照射紫外线。
关于其它的条件，可以与上述一个例子的制造方法相同。
进而，在使用引发转移终止剂聚合的情况下，作为引发转移终止剂，可以使用苄基-(N,N-二乙基)二硫代氨基甲酸酯，作为溶剂，可以使用甲苯等，也可以通过近紫外线的照射进行活性聚合。在此，通过在第1单体的聚合之后经过分离操作再进行第2单体的聚合，从而能够得到嵌段共聚物。
进而，在使用离子聚合的情况下，作为催化剂，可以使用NaOH粉末，作为溶剂，可以将用于纯化的再沉积用溶剂与非质子系溶剂一起使用。第1单体的聚合后，经过再沉积操作(该操作后在ω末端也残留有离子种)，进行第2单体的聚合，由此能够得到嵌段共聚体。
(温度响应性聚合物)
(B)的温度响应性聚合物可通过上述(B)的制造方法而制造。
(B)的温度响应性聚合物包含N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)单元、阳离子型单体单元、阴离子型单体单元，并任选地包含其它单体单元。本聚合物能够通过上述一个例子、另一个例子的制造方法来制造。
优选(B)的温度响应性聚合物包含下述嵌段：主要包含N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)单元并任选地包含其它单体单元的聚合物嵌段(聚合链α末端)；以及主要包含阳离子型单体单元和阴离子型单体单元并任选地包含其它单体单元的共聚物嵌段。(B)的温度响应性聚合物更优选包含NIPAM的均聚物嵌段、以及NIPAM、阳离子型单体和阴离子型单体的共聚物嵌段，特别优选由这些嵌段构成。本聚合物能够通过上述一个例子的制造方法来制造。
在现有的温度响应性聚合物中的1个(参考日本特开2014-162865号公报)中，对聚合物赋予温度响应性的DMAEMA同时也为(与阴离子型单体共同地)形成细胞结构体所需要的阳离子型单体，此外，与温度响应性相关的DMAEMA作为聚合物嵌段包含于聚合链α末端。
在该温度响应性聚合物中，因为聚合链α末端必须存在阳离子型单体，所以聚合链中的阳离子型位点位置的调节自由度不高，此外，因为阳离子型单体主要限于DMAEMA，所以阳离子型位点的正电荷强度的调节、温度响应性聚合物水溶液的pH的调节也称不上是容易的。
而且，在例如将温度响应性聚合物用于药物传递(DDS)的情况下，上述温度响应性聚合物能够负载的药剂的种类、量可能受限。作为DDS的方式，可举出例如：通过将负载有药剂的温度响应性聚合物涂敷于细胞培养器，并使用涂敷后的细胞培养器对细胞、组织进行培养，从而从包覆物向细胞、组织缓慢释放药剂的方法等。在此，因为上述现有的温度响应性聚合物中包含正电荷强度小的DMAEMA，所以阴离子型物质的药剂的负载并称不上是容易的，而且能够负载的药剂的种类、量还可能受限。
另一方面，在(B)的温度响应性聚合物中，对聚合物赋予温度响应性的NIPAM是中性的单体，并且(与阴离子型单体共同地)形成细胞结构体所需要的阳离子型单体是与NIPAM不同的单体。
在(B)的温度响应性聚合物中，在聚合链α末端不一定需要存在阳离子型单体，能够自由调节聚合链中的阳离子型位点的位置，此外，因为能够广泛使用阳离子型单体，所以能够容易地调节阳离子型位点的正电荷强度、温度响应性聚合物水溶液的pH。
根据(B)的温度响应性聚合物，例如在将温度响应性聚合物用于药物传递(DDS)的情况下，能够拓展能负载的药剂的种类并使负载量增加，进而能够拓展温度响应性聚合物的应用范围。
在(B)的温度响应性聚合物中，NIPAM单元相对于NIPAM单元、阳离子型单体单元及阴离子型单体单元的合计的比例(摩尔)优选为0.6～0.9，进一步优选为0.7～0.9，特别优选为0.9。
在还使用了其它单体的情况下，其它单体单元相对于NIPAM单元、阳离子型单体单元及阴离子型单体单元的合计的比例(摩尔)优选为0.001～0.2，进一步优选为0.01～0.1。
作为(B)的温度响应性聚合物，聚合链α末端的聚合物嵌段(例如，NIPAM的均聚物嵌段)的数均分子量优选为5000Da以上，进一步优选为20000Da以上。
作为(B)的温度响应性聚合物，优选数均分子量(Mn)为10～500kDa的分子。此外，优选重均分子量(Mw)和数均分子量(Mn)的比(Mw/Mn)为1.1～10.0的分子。
温度响应性聚合物的分子量能够根据聚合条件进行适当调节。
基于(B)的温度响应性聚合物，能够使浊点下降到例如室温(25℃)以下。
在上述温度响应性聚合物中，在浊点以上的温度形成的温度响应性聚合物的不溶物在室温(约25℃)条件下至再溶解为止的时间显著地延迟。该现象可推测是由于得到的温度响应性聚合物在分子内存在阳离子型官能团和阴离子型官能团，因此具有高的自凝聚性的原因。
认为特别是由于上述(B)的温度响应性聚合物在聚合链α末端具备具有高分子量的NIPAM的均聚物嵌段，因此容易发生NIPAM侧链的温度依赖性的珠球转变，而能够有效地降低浊点。
此外，能够采用该温度响应性聚合物如后所述地制备在培养面包覆该温度响应性聚合物而成的细胞培养器。
进而，根据(B)的温度响应性聚合物，通过如后所述地在合适的培养条件下培养细胞，从而能够形成具有管腔状(管状)、块状(颗粒状)等结构的细胞结构体。
(B)的温度响应性聚合物具有的阳离子型官能团的官能团数与阴离子型官能团的官能团数的比(C/A比)优选为0.5～32，进一步优选为4～16。
如果C/A比为上述范围，则易于得到降低浊点这样的上述效果。可推测在具有上述C/A比的温度响应性聚合物中，上述温度响应性聚合物中阳离子型官能团和阴离子型官能团以离子键对分子间和/或分子内的凝聚产生作用，从而温度响应性聚合物的凝聚力增强。
此外，推测如果C/A比为上述范围，则能够使上述温度响应性聚合物中的正电荷和负电荷的平衡特别合适，从而抑制由于正电荷而导致的细胞伤害性，此外，还能够使上述温度响应性聚合物的亲水性和疏水性的平衡特别合适，从而易于发生细胞的迁移、取向。
以下，记载了上述(C)的温度响应性聚合物及其制造方法。
(温度响应性聚合物组合物的制造方法)
关于(C)的温度响应性聚合物组合物的制造方法，首先，制备混合型温度响应性聚合物组合物(混合物制备工序)。具体而言，将(C1)2-N,N-二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯(DMAEMA)和/或其衍生物的聚合物、(C2)2-氨基-2-羟甲基-1,3-丙二醇(Tris)、以及(C3)选自核酸、肝素、透明质酸、硫酸葡聚糖、聚苯乙烯磺酸、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚磷酸、硫酸化多糖、凝胶多糖及聚海藻酸及它们的碱金属盐中的一种以上阴离子型物质混合。应予说明，(C2)Tris为任选的成分。
(温度响应性聚合物组合物)
(C)的温度响应性聚合物组合物如上述那样地包含2-N,N-二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯和/或其衍生物的聚合物，2-氨基-2-羟甲基-1,3-丙二醇，以及选自核酸、肝素、透明质酸、硫酸葡聚糖、聚苯乙烯磺酸、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚磷酸、硫酸化多糖、凝胶多糖及聚海藻酸及它们的碱金属盐中的一种以上阴离子型物质。
(C1)的DMAEMA和/或其衍生物的聚合物为温度响应性聚合物，其浊点是32℃。(C2)的Tris推测发挥以下作用：使在比浊点低一些的温度和/或比浊点高的高温条件下形成的聚合物在被冷却至浊点以下时再溶解的速度降低，此外，即使在疎水化的聚合物层中也维持亲水性并且通过来自氨基的正电荷而给予细胞刺激。(C3)的阴离子型物质推测发挥以下作用：能够使培养的细胞迁移、取向的作用，抑制细胞伤害性的作用。
基于该混合型温度响应性聚合物组合物，能够使浊点下降到例如室温(25℃)以下。
推测在上述组合物中，DMAEMA和/或其衍生物的聚合物的侧链与Tris彼此进行相互作用(例如，交联作用)而使上述聚合物变得易于凝聚。
在此，关于上述(C1)，作为DMAEMA和/或其衍生物的聚合物，优选数均分子量(Mn)为10～500kDa的分子。此外，优选重均分子量(Mw)和数均分子量(Mn)的比(Mw/Mn)为1.1～6.0的分子。
此外，作为(C1)的DMAEMA的衍生物，可举出例如，甲基丙烯酸酯的甲基的氢原子被卤素取代而成的衍生物、甲基丙烯酸酯的甲基被低级烷基取代而成的衍生物、二甲氨基的甲基的氢原子被卤素取代而成的衍生物、二甲氨基的甲基被低级烷基取代而成的衍生物。
关于上述(C2)，Tris优选为纯度99.9％以上的纯物质，或者将Tris水溶液通过添加碱性物质等在使用时制成中性或碱性。在使用以盐酸盐的状态销售的Tris的情况下，由于Tris水溶液的pH降低，因此组合物的浊点会上升至70℃左右。因此，不优选Tris盐酸盐。
在上述(C3)中列举的阴离子型物质中，对于核酸而言，可举出DNA、RNA、其它单链、双链、寡核酸、发夹结构(hair bin)等的人工核酸等。
此外，上述(C3)中列举的阴离子型物质优选具有一定程度的尺寸例如具有1～5000kDa的分子量(M)。
如果分子量为上述范围，则阴离子型物质能够起到与阳离子型物质发生离子键合而长期捕捉阳离子型物质的作用，从而形成稳定的离子复合体微粒子。此外，能够缓和阳离子型物质通常具有的因对细胞的细胞膜表面的静电相互作用而造成的细胞伤害性。
除了在上述(C3)中列举的阴离子型物质之外，还能使用下述的实质上作为阴离子型物质发挥功能的聚合物衍生物，该聚合物衍生物通过例如使作为阳离子型聚合物的聚(4-氨基苯乙烯)的4-位的氨基与草酸等二羧酸进行脱水缩合从而导入了阴离子型官能团。
另外，也可以包含两种以上在上述(C3)中列举的阴离子型物质。
在此，优选使用(C2)2-氨基-2-羟甲基-1,3-丙二醇(Tris)相对于(C1)2-N,N-二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯(DMAEMA)和/或其衍生物的聚合物的比例((C2)/(C1))为1.0以下的混合型温度响应性聚合物组合物。
需要说明的是，比例((C2)/(C1))是质量比例。
在使用上述比例的混合型温度响应性聚合物组合物的情况下，能够在后述的培养工序中易于形成细胞结构体。
如果为该组合物，则能够使上述组合物的亲水性和疏水性的平衡更合适。而且，推测该合适的平衡将细胞与培养面的粘附性调节得合适从而使细胞的迁移、取向处于活性化状态。
此外，优选上述比例((C2)/(C1))为0.1以上。
通过将上述比例设为0.1以上，从而易于得到使浊点降低的这样的上述效果。此外，易于得到容易形成细胞结构体的这样的上述效果。
基于与上述同样的理由，进一步优选上述比例((C2)/(C1))为0.1～0.5。
在此，优选混合型温度响应性聚合物组合物中的C/A比(正电荷/负电荷)为0.5～16。
需要说明的是，在本申请说明书中，C/A比是指组合物中包含的物质具有的正电荷相对于组合物中包含的物质具有的负电荷的比例。具体而言，将(C1)DMAEMA和/或其衍生物的聚合物的摩尔数设为N1、将(C3)阴离子型物质的摩尔数设为N3时，C/A比用{(每分子聚合物的正电荷)×N1}/{(每分子阴离子型物质的负电荷)×N3}这样的式子表示。
此外，在本申请说明书中，在将阴离子型物质设为DNA的情况下，每分子阴离子型物质的负电荷数用DNA的碱基对的数目(bp数目)×2来计算，分子量(Da)用bp数目×660(AT对以及CG对的平均分子量)来计算。
通过将C/A比设为0.5～16，从而易于得到使管状细胞结构体易于形成的这样的上述效果。
据推测，能够合适地设定上述组合物中的正电荷与负电荷之间的平衡，抑制因正电荷造成的细胞伤害性。此外，据推测，能够进一步合适地设定上述组合物的亲水性与疏水性之间的平衡，易于发生细胞的迁移、取向。
基于与上述同样的理由，上述C/A比进一步优选为2～10，特别最优选C/A比为8附近。
(准备工序)
在一个例子的制造方法中，接着，用上述温度响应性聚合物和/或上述温度响应性聚合物组合物包覆培养面的一部分，准备包覆培养面(准备工序)(参考图1(i)～(iii))。
在此，除包覆培养面以外的培养面可以设为细胞粘附性、也可以设为细胞非粘附性，从易于得到期望的形状的细胞块的观点出发，优选设为细胞非粘附性。细胞非粘附性的培养面的制备方法没有特别限定，可以使用例如具有细胞非粘附性的培养面的细胞培养器、例如SUMILON公司制造的Prime Surface(注册商标)、大肠杆菌培养用的细胞培养器等未实施用于细胞粘附的表面处理的培养器等，也可以使用细胞非粘附性的片、内底等。
在此，如图1所示，从抑制与细胞壁的接触、调控细胞块的形状的观点出发，优选包覆培养面设置成被非包覆培养面所包围(参考图1(ii)、(iii))。
包覆培养面的形状可以对应于期望的软骨细胞块的形状而适当调整，以平面图看，可举出圆形、矩形、甜甜圈形(环形)等。
上述准备工序可以为例如以下的工序(准备工序I)：将温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物溶解于溶剂而制成温度响应性聚合物溶液，然后涂敷在细胞培养器的培养面上并使其干燥，由此准备包覆细胞培养器；此外，还可以为以下工序(准备工序II)：将包含温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物的水溶液(温度响应性聚合物水溶液)冷却到温度响应性聚合物的浊点以下，使经冷却的温度响应性聚合物水溶液流延在细胞培养器的培养面上，加热至超过浊点的温度，由此准备包覆细胞培养器。
作为上述准备工序I的温度响应性聚合物溶液中的溶剂，可举出例如：水；生理盐水；缓冲溶液；甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、1-丁醇、异丁醇、2-丁醇、叔丁醇、1-戊醇、2-戊醇、3-戊醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇、2-甲基-2-丁醇、3-甲基-2-丁醇、2,2-二甲基-1-丙醇、1-戊醇、2-戊醇、3-戊醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇、2-甲基-2-丁醇、3-甲基-2-丁醇、2,2-二甲基-1-丙醇、1-己醇、2-甲基-2-戊醇、烯丙醇、苯甲醇、水杨醇等醇；丙酮、甲乙酮、二乙酮、甲基丙基酮、甲基异丁基酮、甲基乙烯基酮、环己酮、2-甲基环戊酮、苯乙酮、二苯甲酮、异佛尔酮等酮；醋酸甲酯、醋酸乙酯、醋酸丙酯、醋酸异丙酯、醋酸正丁酯、醋酸异丁酯、醋酸仲丁酯、醋酸叔丁酯、醋酸乙烯酯、甲酸甲酯、甲酸乙酯、甲酸丙酯、上述醇与磷酸的酯、上述醇与碳酸的酯等酯；氯仿；苯；甲苯；二乙醚；二氯甲烷等。
在这些中，从易于均匀地包覆于培养面、此外温度响应性聚合物的溶解性优异的观点出发，优选甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、2-丁醇、叔丁醇、烯丙醇等醇；丙酮、甲乙酮、二乙酮、甲基乙烯基酮等酮；醋酸甲酯、醋酸乙酯、醋酸异丙酯、醋酸叔丁酯、醋酸乙烯酯等酯；氯仿；苯；甲苯；二乙醚；二氯甲烷。此外，从能够在短时间干燥且更容易均匀地涂敷于培养面的观点出发，进一步优选沸点低的有机溶剂(例如，选自碳原子数为1～4的低级醇、碳原子数为3～5的低级酮以及具有碳原子数为1～4的烷基的醋酸烷基酯中的至少1种，特别是比水沸点低的、选自碳原子数为1～4的低级醇、碳原子数为3～5的低级酮以及具有碳原子数为1～4的烷基的醋酸烷基酯中的至少1种)，从成本、操作性也优异的观点出发，特别优选甲醇、乙醇。
上述溶剂可以单独使用1种，也可以并用2种以上。
由于温度响应性聚合物在溶剂中的溶解性优异，因此即使在浊点以上的温度(例如，室温、37℃等)温度响应性聚合物也不易不溶化而沉积。因此，在涂敷温度响应性聚合物时省去了对温度响应性聚合物溶液进行温度管理的时间和精力，从而能够简单地准备包覆细胞培养器。
在上述准备工序I中，从细胞易于自凝聚的观点出发，优选在温度响应性聚合物溶液中包含亲水性分子。作为亲水性分子，为对温度响应性聚合物的C/A比没有影响的非离子性且亲水性的亲水性分子，可举出例如聚乙二醇(PEG)、二甲基丙烯酰胺(DMAA)、甘油、TritonX、聚丙二醇等。
在上述准备工序I中，从温度响应性聚合物易于均匀地包覆于培养面的观点出发，温度响应性聚合物溶液中的温度响应性聚合物的含量相对于温度响应性聚合物溶液(100重量％)优选为0.00075～0.015重量％，更优选为0.001～0.01重量％。
在上述准备工序I中，从细胞易于自凝聚的观点出发，温度响应性聚合物溶液中的亲水性分子的含量相对于温度响应性聚合物(100重量％)优选为0.00001～0.00015重量％，更优选为0.00003～0.0001重量％。
在上述准备工序I中，从温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物易于均匀地包覆于培养面的观点出发，温度响应性聚合物溶液优选不包含水，更优选温度响应性聚合物溶液(100重量％)中的水的重量比例为0.5重量％以下，进一步优选为0.1重量％以下。
另外，水的重量比例能够使用气相色谱法、卡尔费休法等本领域技术人员公知的方法来测定。
在上述准备工序I中，温度响应性聚合物溶液可以涂敷于培养面的整个表面，也可以涂敷于培养面的一部分。其中，从可简单地得到细胞结构体的观点出发，优选涂敷于培养面的整个表面。
在上述准备工序I中，从温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物均匀地包覆于培养面的观点出发，作为使涂敷的温度响应性聚合物溶液干燥的条件，优选在大气压下、温度10～70℃、时间1～3000分钟。通过使涂敷的温度响应性聚合物溶液快速地干燥，从而温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物没有偏差地均匀地包覆于培养面上。
涂敷的温度响应性聚合物溶液可以通过例如将细胞培养器静置在37℃的培育箱中而干燥。
在上述准备工序II中，作为溶解温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物的溶剂，可举出例如：水；生理盐水；磷酸缓冲液、磷酸缓冲生理盐水(PBS)、Tris缓冲液等缓冲溶液等。
在上述准备工序II中，作为冷却温度响应性聚合物水溶液的方法，可举出例如将温度响应性聚合物水溶液放入约4℃的冰箱冷却至浊点以下的温度的方法等。
在上述准备工序II中，作为使温度响应性聚合物水溶液流延到培养面上的方法，可举出例如：通过倾斜细胞培养器的培养面而将具有浊点以下温度的温度响应性聚合物水溶液摊开的方法；使用抹刀铺展温度响应性聚合物水溶液的方法等。
在上述准备工序II中，作为将流延的温度响应性聚合物水溶液加热至超过浊点的方法，可举出例如：将流延工序后的细胞培养器静置在37℃的培育箱中的方法等。
在图1所示的一个例子的软骨细胞块的制造方法中，通过如下方式来进行准备工序：在细胞培养器(参考图1(i))的培养面的中央部分描绘期望的形状，然后涂敷上述温度响应性聚合物和/或上述温度响应性聚合物组合物(参考图1(ii))并干燥涂敷部分(参考图1(iii))。
此外，本实施方式(I)的准备工序也可以通过以下方式来进行：在细胞培养器的培养面铺上具有期望形状的孔(中空)的掩片(未图示)，然后从片的上方配置上述温度响应性聚合物和/或温度响应性聚合物组合物，然后去掉片。
作为该掩片的材料，能够使用本领域技术人员公知的材料，例如接触角为70°以下的材料，具体而言，可举出用亲水性基团修饰的聚对苯二甲酸乙二酯、聚苯乙烯、聚碳酸酯、玻璃、聚丙烯等，特别是从为了用于细胞培养而减少溶出物的观点出发，优选例如通过放射线接枝聚合而导入并固定有N,N-二甲基丙烯酰胺的聚苯乙烯等。
片的形状、尺寸、厚度等没有特别限定，优选厚度为0.05～2.0mm。
包覆培养面的面积没有特别限定，例如在使用的细胞培养器来制造外径1～20mm、内径0.1～19mm尺寸的甜甜圈形的软骨细胞块的情况下，可以设为0.5～300mm2。
包覆培养面每单位面积具有的温度响应性聚合物和温度响应性聚合物组合物的量优选为0.1～3.0μg/cm2，更优选为0.5～2.5μg/cm2。
作为包覆培养面的Zeta电位，优选为0～50mV，更优选为0～35mV，进一步优选为10～25mV。通过使Zeta电位为0mV以上，从而带负电的细胞易于粘附。此外，通过使Zeta电位为50mV以下，从而能够减轻细胞毒性。
此外，通过将Zeta电位设为上述范围，从而不仅能够在合适的培养条件下培养细胞，而且还能够更简单地制造具有块状(颗粒状)的结构的细胞结构体。该现象可推测是由于以下原因：通过将Zeta电位设为上述范围，从而能够对包覆培养面的表面赋予不会引起细胞毒性的微弱的正电荷，此外还能够确保种植的细胞快速粘附、促进细胞活性的提高和细胞外基质的分泌，进而还能够适当地抑制细胞迁移而增强细胞间的结合。
需要说明的是，Zeta电位是指将用羟丙基纤维素包覆聚苯乙烯胶乳而成的粒子(Zeta电位：-5～+5mV)作为标准探测粒子，使用Zeta电位仪(例如，型号“ELSZ”、大塚电子公司制造等)进行测定，用Smoluchowski公式算出的值。
从提高本发明(I)的效果的观点出发，作为水与包覆培养面的表面的接触角，优选为50～90°，更优选为60～80°，进一步优选为62～78°。
需要说明的是，水与包覆培养面的接触角是指在包覆培养面内的任意几个点上，按照JIS R3257测定的接触角的平均值。
图3表示准备工序的变形例及随后的种植培养工序的概略。
图3(a)表示准备工序的第一变形例。
在准备工序的第一变形例中，具有收容于细胞培养器的培养面内的俯视形状，具有规定程度的厚度，使用中央部分被挖成期望的俯视形状的细胞非粘附性的内底(pad)(参考图3(a)(i))。
需要说明的是，细胞非粘附性是指细胞不粘附或难以粘附。
而且，在该第一变形例的准备工序中，首先，在细胞培养器的整个培养面配置上述温度响应性聚合物和/或上述温度响应性聚合物组合物，接着，在聚合物和/或聚合物组合物上铺上上述细胞非粘附性的片。由此，用壁包围包覆培养面、即，包覆培养面设置在凹部的底面。
根据该第一变形例，能够在后述的种植培养工序中三维地控制细胞块的形状，能够更精密地制造具有期望形状的软骨细胞块。
作为能够在第一变形例中使用的细胞非粘附性的内底的材料，能够使用本领域技术人员公知的材料，例如接触角为70°以下的材料，具体而言，可举出用亲水性基团修饰的聚对苯二甲酸乙二酯、聚苯乙烯、聚碳酸酯、玻璃、聚丙烯等，特别是从为了用于细胞培养而减少溶出物的观点出发，优选例如通过辐射接枝聚合而导入并固定有N,N-二甲基丙烯酰胺的聚苯乙烯等。
内底的形状、尺寸、厚度等没有特别限定，例如在使用的细胞培养器的情况下，优选直径(最大直径)为0.1～10mm。
另外，在上述第一变形例中，可以使用具有收容于细胞培养器的培养面内的尺寸、在中央部分具有期望的俯视形状的凹部的细胞非粘附性的内底(未图示)。
在该情况下的准备工序中，仅内底的凹部的底面配置上述温度响应性聚合物和/或上述温度响应性聚合物组合物，凹部的底面以外的面即凹部的壁面和凹部以外的内底的表面均不配置上述聚合物和/或上述聚合物组合物(未图示)。
根据该例，能够在后述的种植培养工序中在凹部更精密地制造具有期望形状的软骨细胞块。
此外，在本实施方式(I)中，可以使用不同尺寸的细胞非粘附性的内底，例如也能够将经过种植培养工序而使尺寸扩大了的软骨细胞块转移到更大尺寸的细胞非粘附性的内底的凹部，进行其后的种植培养工序。
根据该方法，能够将各种植培养工序中的包覆培养面的尺寸相对于软骨细胞块的尺寸保持在一定程度，能够使软骨细胞块的形状更接近于期望的形状。
图3(b)表示准备工序的第二变形例。
在准备工序的第二变形例中，在细胞培养器的培养面雕刻期望的俯视形状的凹部(参考图3(b))。
而且，在该第二变形例的准备工序中，仅雕刻的凹部的底面配置温度响应性聚合物和/或上述温度响应性聚合物组合物，凹部的底面以外的面即凹部的壁面和凹部以外的片的表面均不配置上述聚合物和/或上述聚合物组合物(参考图3(b)(i))。
根据该第二变形例，能够在后述的种植培养工序中三维地控制细胞块的形状，能够更精密地制造具有期望形状的软骨细胞块。
另外，在上述的准备工序的第一变形例和第二变形例中，从抑制种植的细胞和凹部的壁面的粘附、调控得到细胞块的形状的观点出发，特别优选将凹部的壁面设为细胞非粘附性。
(种植培养工序)
在本实施方式(I)的一个例子的制造方法中，接着在包覆培养面，在细胞块的存在下种植能够分化成软骨细胞的细胞，对细胞块和能够分化成软骨细胞的细胞进行共培养，由此制备软骨细胞块(种植培养工序)。
另外，如图1所示，在本实施方式(I)的一个例子的制造方法中，在上述的准备工序后、后述的种植培养工序前，在上述的准备工序中准备的包覆培养面种植能够分化成软骨细胞的细胞并对其进行培养，由此制备后述的种植培养工序中使用的细胞块(参考图1(iv)～(viii))。
然而，本实施方式(I)的制造方法并不限定于此，也可以另外(例如使用另外的细胞培养器)制备在种植培养工序中使用的细胞块(未图示)。
在图1所示的例子中，通过以下方式进行种植培养工序：在使细胞块存在于包覆培养面上的状态下，在细胞培养器中加入细胞和细胞培养用培养基(参考图2(i))，然后将该细胞培养器放入通常的37℃的细胞培育箱(参考图2(ii))，通过更换培养基加入新的细胞培养用培养基(参考图2(iii))，进一步将细胞培养器放入细胞培育箱(参考图2(iv)、(v))。另外，图2(iv)中的括号内表示结构物的剖面图。
在该工序中，如图2(i)所示那样，从调控软骨细胞块的整体形状的观点出发，优选使细胞块存在于包覆培养面的中央部分。
更换培养基前使用的细胞培养用培养基和更换培养基后使用的细胞培养用培养基可以根据目的、用途适当选择，例如可以将之前的培养基作为增殖用培养基，将之后的培养基作为分化用培养基、再分化用培养基。
作为能够分化成软骨细胞的细胞，可举出来自于软骨细胞、脂肪、滑膜、筋膜、骨膜、牙周膜、牙髓、骨髓的间充质细胞以及iPS细胞。
上述能够分化成软骨细胞的细胞可以单独使用1种，也可以并用2种以上。
在种植培养工序中种植细胞时的细胞密度为0.3×104个/cm2以上，优选为0.3×105个/cm2以上，更优选为0.5×105个/cm2以上，此外，为了不易产生由于培养中的细胞彼此接触而导致的停止增殖等关于细胞周期的问题，优选设为10.0×105个/cm2以下，更优选设为4.5×105个/cm2以下。
本领域技术人员能够基于使用的细胞种类、实验目的适当地设定培养条件，例如，可以设为37℃、5％CO2气氛等。
在此，参考图2，将在种植培养工序中产生的现象记载如下。
在该工序中，首先，种植的细胞沉积在细胞块存在于中央部分的包覆培养面上以及非包覆培养面上。这时，沉积在包覆培养面上的细胞粘附于包覆培养面上而存活，另一方面，沉积在非包覆培养面上的细胞不粘附于非包覆培养面上而存在(参考图2(ii))，通过种植后第1次的更换培养基而抽吸除去未粘附的细胞(参考图2(iii))。另外，从抑制随着细胞凋亡而产生的热休克蛋白、炎性细胞因子等有害成分的释放的观点出发，优选迅速地进行该细胞的除去。
而且，当对粘附于包覆培养面的细胞进一步培养时，位于包覆培养面和非包覆培养面的界限附近的细胞随着与该细胞相比位于包覆培养面的中央部分侧的细胞一起，以包埋处于中央部分的细胞块的方式，从包覆培养面开始凝聚(参考图2(iv))。换言之，粘附的细胞以远离培养面的方式向包覆培养面的中央部分剥离，作为片状的全部细胞在其周围边缘翻卷。
最终，预先配置的细胞块和种植的细胞一体化而在剖面视中呈层叠结构(参考图2(v))。
在本发明(I)的种植培养工序中使用的能够分化成软骨的细胞经过上述凝聚过程而分化成软骨细胞并成熟，如本领域技术人员公知的那样，软骨细胞为具有成熟时允许低氧状态的特殊的性质的细胞。因此，经过凝聚过程而得到的细胞块中的软骨细胞能够在低氧状态存活，即使在接下来的种植培养工序中包埋入新的能够分化成软骨的细胞中而置于低氧状态，也能够持续存活。
另外，种植的细胞除包覆培养面以外也会沉积在细胞块自身上，但在细胞凝聚时，会合并而一体化。
而且，在本实施方式(I)的一个例子的制造方法中，进行多次上述的种植培养工序(参考图2(vi))。
通过进行多次种植培养工序，从而能够得到尺寸大的软骨细胞块，此外，也能够将该尺寸调整成与目的、用途相对应的尺寸。
根据该方式，能够在由之前的种植培养工序中形成的成熟的细胞所构成的细胞块的周围，预先依次配置之后的种植培养工序中未成熟的细胞，能够兼顾能够分化成软骨的细胞的成熟和细胞块的生长。
另外，在此，未成熟的细胞(增殖但软骨的性质不充分的细胞)和成熟的细胞(不增殖但已经获得软骨细胞的性质的细胞；具有能够允许低氧环境、具有高弹性的柔软性等特性)的控制能够通过合适地选择培养基来进行。例如，如果在使用的培养基中混合TGF-β1等分化诱导因子，则能够促进细胞的分化。
从在之前的种植培养工序中在包覆培养面的中央部分形成细胞块起、至接下来的种植培养工序中种植细胞为止的时间没有特别限定，本领域技术人员可以考虑使形成的细胞块成熟为软骨细胞块、以及抑制软骨细胞块的活性的降低，此外综合考虑使用的再分化培养基的种类、浓度等来适当地设定。
(软骨细胞块)
本实施方式(I)的软骨细胞块是通过本实施方式(I)的软骨细胞块的制造方法而制造的。
作为软骨细胞块的尺寸，没有特别限定，直径(最大直径)可以设为1～100mm，特别是在为甜甜圈形的软骨细胞块的情况下，外径可以设为3～50mm，内径可以设为0.3～49mm。
(移植材料的制造方法)
本实施方式(I)的移植材料的制造方法包含以下工序：在通过本实施方式(I)的软骨细胞块的制造方法而制造的软骨细胞块的存在下，种植间充质细胞，对软骨细胞块和间充质细胞进行共培养，由此制备移植材料。
图4表示本实施方式(I)的移植材料的制造方法的概要。
本实施方式(I)的移植材料的制造方法中的上述工序除了将使用的细胞设为间充质细胞以外，可以与上述的本实施方式(I)的软骨细胞块的制造方法中的种植培养工序同样地进行。
在此，作为间充质细胞，可举出软骨细胞、成纤维细胞、ADSC等。
(移植材料)
本实施方式(I)的移植材料是通过本实施方式(I)的移植材料的制造方法而制造的。
本实施方式(I)的移植材料由于在软骨细胞块的最外侧配置有间充质细胞、特别是成纤维细胞，因此在移植到生物体时，有易于与移植部位的周围组织牢固地粘附的倾向。因此，能够提高移植部位的治愈效果，得到更良好的效果。
图5表示本实施方式(I)的另外一个例子的软骨细胞块的制造方法的概要。
本实施方式(I)的另外一个例子的软骨细胞块的制造方法包含上述准备工序的第一变形例。
具体而言，另外一个例子的制造方法使用了如下的细胞非粘附性的内底(例如，厚度1mm)，该内底在中央部分设置有俯视为甜甜圈形(例如，外径8mm、内径4mm、宽2mm)的中空设计。
在此，包覆培养面的外轮廓线和包覆培养面的外轮廓线成为同心圆意味着调控成软骨细胞块的甜甜圈形状，因此优选。
本实施方式(I)的另外一个例子的软骨细胞块的制造方法中的各工序的详细过程可以与上述的本实施方式(I)的一个例子的软骨细胞块的制造方法中的各工序相同(参考图5(i)～(ix))。
在另外一个例子的制造方法中，例如，在使用板作为细胞培养器的情况下，从得到进一步调控了形状的甜甜圈形(环形)的软骨细胞块的观点出发，优选包覆培养面的宽度设为3mm以下，更优选设为2.5mm以下，优选壁的高设为3mm以下，更优选设为2.5mm以下。
(复合材料的制造方法)
本实施方式(I)的复合材料的制造方法包含以下工序：复合体制备工序，通过使本实施方式(I)的软骨细胞块中特别是甜甜圈形的软骨细胞块套入管状结构体，从而制备复合体；培养工序，对复合体进行培养而制备复合材料。
优选本实施方式(I)的复合材料的制造方法包含以下工序：准备管状结构体和芯材(参考图6(i))、并且将芯材从管状结构体的中空部的一端向另一端插入(参考图6(ii))的工序；通过使本实施方式(I)的甜甜圈形的软骨细胞块套入上述管状结构体，从而制备复合体的复合体制备工序(参考图6(iii))；对复合体进行培养而制备复合材料(参考图6(iv))的培养工序；以及从上述复合材料取出芯材(参考图6(v))的工序。
图6(i)～(v)表示本实施方式(I)的一个例子的复合材料的制造方法的概要。
以下，记载了本实施方式(I)的一个例子的软骨细胞块的制造方法的各工序的详细过程。
作为管状结构体，可以为具有中空部的管状结构体，也可以为生物管(人造血管)，胶原蛋白制管，弹性蛋白制管，聚葡萄糖酸制管，聚乳酸制管等。
生物管可以为将胶原蛋白作为主成分的管，可使用例如日本特开2004-261260号公报的实施例所记载的方法来制作。
作为管状结构体的外径，可以与本实施方式(I)的甜甜圈形的细胞结构体的内径相同，可以设为例如1～100mm，作为管状结构体的内径，没有特别限定，可以设为例如0.1～50mm。作为管状结构体的长度，可以根据目的、用途来适当地确定，没有特别限定，可以设为例如1～300mm。
作为芯材，能够使用实心体或多空体，具体而言，可以设为硅制的棒状结构物、丙烯酸制的棒状结构物、金属制的棒状结构体物、素陶器、金属网状压缩结构体等，当使用多孔体时，也能够使培养基、氧从复合体的内腔侧扩散。
作为芯材的外径，可以与上述管状结构体的内径相同，可以设为例如0.1～50mm。
作为芯材的长度，可以与管状结构体的长度相同，也可以与管状结构体的长度相比仅长例如0.1～10mm或仅短例如0.1～10mm。
在上述复合体制备工序中，能够通过例如使用镊子固定本实施方式(I)的甜甜圈形的软骨细胞块，并且将上述工序中制备的(内部设置有芯材)管状结构体通过软骨细胞块的环孔从而进行。
相对于1个管状结构体所使用的甜甜圈形的软骨细胞块的数目可以根据目的、用途来适当地确定，没有特别限定，可以设为例如1～1000个。
此外，作为在使用多个软骨细胞块的情况下的相邻的2个软骨细胞块之间的距离，可以根据目的、用途来适当地确定，没有特别限定，在该工序后、后述的培养工序前，可以设为例如0.1～100mm。
作为从上述的复合体制备工序中管状结构体的套入终止起、至后述的培养工序中复合体的培养开始为止的时间，从维持细胞的活性的观点出发，优选设为1～180分钟，更优选设为1～120分钟。
上述培养工序能够通过例如将上述复合体制备工序中制备的复合体在合适的条件(例如，37℃、5％CO2气氛等)下，放置规定时间(例如，12小时～150日)来进行。
另外，上述培养工序也能够在生物体内进行，能够通过例如如下方式进行：将上述复合体埋入生物体内并放置规定时间、使以包围复合体外表面的方式形成的生物体组织和复合体一体化。
从复合材料取出芯材能够使用镊子等适当进行。
另外，上述工序中的各操作可以手动进行，也可以使用机械、装置来进行，没有特别限定。
(复合材料)
本实施方式(I)的复合材料为本实施方式(I)的软骨细胞块中特别是甜甜圈形的软骨细胞块设置于管状结构体的外表面的复合材料(参考图6(v))。
管状结构体的材料、外径、内径、长度等；相对于1个管状结构体所使用的甜甜圈形的软骨细胞块的数目等可以与关于本实施方式(I)的复合材料的制造方法中所述的相同。
此外，作为在使用多个软骨细胞块的情况下的相邻的2个软骨细胞块(软骨组织)之间的距离，可以根据目的、用途来适当确定，没有特别限定，可以设为例如0.1～100mm，相邻的2个软骨细胞块(软骨组织)也可以重合(即，距离为0mm)。
在本实施方式(I)的复合材料中，可以在管状结构体的内部设置芯材(参考图6(v))。
芯材的材料、外径、长度等可以与关于本实施方式(I)的复合材料的制造方法中所述的相同。
本实施方式(I)的复合材料可以是通过本实施方式的复合材料的制造方法而制造的复合材料。
本实施方式(I)的软骨细胞块、移植材料、复合材料在治疗关节、气管、鼻等的治疗中是有用的，更具体而言，能够优选用于半月板、气管软骨、鼻软骨、耳软骨、椎间盘、关节软骨、韧带、跟腱等的治疗。
根据本实施方式(I)的软骨细胞块、移植材料、复合材料的制造方法，能够例如将患者患部的CT图像进行CAD图形化，按照该图调控软骨细胞块和移植材料的形状，因此本实施方式的软骨细胞块、移植材料、复合材料的制造方法有可能对量身定制医疗的实现发挥极大的贡献。
[[发明(II)]]
上皮细胞难以与细胞培养器粘附，当与培养器的粘附不充分时存在增殖后的细胞的形态会变得不稳定等问题，在现有的方法中难以进行稳定的细胞培养。此外，由于上皮细胞的肌动蛋白丝不发达，细胞间的结合弱，因此当与细胞培养器的粘附弱时容易从细胞培养面剥离。此外，由上皮细胞形成的球形也难以与细胞培养器粘附，而易于在细胞培养器中悬浮，因此在培养基更换时，误抽吸风险非常大。
关于发明(II)，本发明人等发现，用温度响应性聚合物包覆的细胞培养器与上皮细胞的粘附性极其优异，特别是，除上皮细胞以外的细胞大多以适度的力度与用温度响应性聚合物包覆的细胞培养器粘附，当密度达到一定以上时具有自凝聚的性质，但当组合上皮细胞和用温度响应性聚合物包覆的细胞培养器时，与其它细胞不同，会与培养器牢固地粘附。而且，还发现通过使用用温度响应性聚合物包覆的细胞培养器，从而上皮细胞的培养变得容易，增殖中的细胞的形态也优异。此外，还发现细胞结构体变得不易从包覆细胞培养器剥离，不易在培养基更换时误抽吸，能够高效地形成上皮细胞的细胞结构体。
[上皮细胞的培养方法]
本发明(II)的上皮细胞的培养方法包含以下工序：制备工序，制备温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物；培养器准备工序，用上述温度响应性聚合物或上述温度响应性聚合物组合物包覆细胞培养器的培养面的至少一部分而形成包覆区域A，准备具有包覆区域A的包覆细胞培养器；种植工序，将上皮细胞种植于上述包覆细胞培养器；培养工序，对粘附于上述包覆区域A的上述上皮细胞进行培养，上述包覆区域A中的上述温度响应性聚合物或上述温度响应性聚合物组合物的浓度为0.3pg/mm2以上。
根据本发明(II)的上皮细胞的培养方法，不易引起培养中的上皮细胞的不期望的剥离，能够容易地培养上皮细胞。
关于上述包覆细胞培养器，可以是整个培养面均为包覆区域A，也可以是培养面的一部分为包覆区域A。此外，在培养面可以具有1个包覆区域A，也可以具有多个包覆区域A。
(制备工序)
作为实施方式(II)中的制备工序，可举出与上述发明(I)中的制备工序同样的工序，作为优选例也可以举出同样的例子。
另外，在本实施方式(II)中，从使上皮细胞的粘附性更加优异的观点出发，作为培养方法中使用的温度响应性聚合物和温度响应性聚合物组合物，优选(A)。
此外，在本实施方式(II)中，有时将制备包含2-N,N-二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯(DMAEMA)的混合物的制备工序称为混合物制备工序。
(培养器准备工序)
在本发明(II)的实施方式(以下，称为“本实施方式(II)”。)的培养方法中，上述培养器准备工序为用上述温度响应性聚合物或上述温度响应性聚合物组合物包覆细胞培养器的培养面的至少一部分而形成包覆区域A，准备具有包覆区域A的包覆细胞培养器的工序。
上述培养器准备工序可以为例如以下的工序(培养器准备工序I)：将温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物溶解于溶剂而制成温度响应性聚合物溶液，然后涂敷在细胞培养器的培养面上并使其干燥，由此准备包覆细胞培养器；此外，还可以为以下工序(培养器准备工序II)：将包含温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物的水溶液(温度响应性聚合物水溶液)冷却到温度响应性聚合物的浊点以下，使经冷却的温度响应性聚合物水溶液流延在细胞培养器的培养面上，加热至超过浊点的温度，由此准备包覆细胞培养器。
在此，有时将形成包覆区域A时使用的温度响应性聚合物溶液称为温度响应性聚合物溶液A、将形成包覆区域A时使用的温度响应性聚合物水溶液称为温度响应性聚合物水溶液A。
作为上述培养器准备工序I的温度响应性聚合物溶液中的溶剂，可举出例如：水；生理盐水；缓冲溶液；甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、1-丁醇、异丁醇、2-丁醇、叔丁醇、1-戊醇、2-戊醇、3-戊醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇、2-甲基-2-丁醇、3-甲基-2-丁醇、2,2-二甲基-1-丙醇、1-戊醇、2-戊醇、3-戊醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇、2-甲基-2-丁醇、3-甲基-2-丁醇、2,2-二甲基-1-丙醇、1-己醇、2-甲基-2-戊醇、烯丙醇、苯甲醇、水杨醇等醇；丙酮、甲乙酮、二乙酮、甲基丙基酮、甲基异丁基酮、甲基乙烯基酮、环己酮、2-甲基环戊酮、苯乙酮、二苯甲酮、异佛尔酮等酮；醋酸甲酯、醋酸乙酯、醋酸丙酯、醋酸异丙酯、醋酸正丁酯、醋酸异丁酯、醋酸仲丁酯、醋酸叔丁酯、醋酸乙烯酯、甲酸甲酯、甲酸乙酯、甲酸丙酯、上述醇与磷酸的酯、上述醇与碳酸的酯等酯；氯仿；苯；甲苯；二乙醚；二氯甲烷等。
在这些中，从易于均匀地包覆于培养面、此外温度响应性聚合物的溶解性优异的观点出发，优选水、甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、2-丁醇、叔丁醇、烯丙醇等醇；丙酮、甲乙酮、二乙酮、甲基乙烯基酮等酮；醋酸甲酯、醋酸乙酯、醋酸异丙酯、醋酸叔丁酯、醋酸乙烯酯等酯；氯仿；苯；甲苯；二乙醚；二氯甲烷。此外，从能够在短时间干燥且更容易均匀地涂敷于培养面的观点出发，进一步优选沸点低的有机溶剂(例如，选自碳原子数为1～4的低级醇、碳原子数为3～5的低级酮以及具有碳原子数为1～4的烷基的醋酸烷基酯中的至少1种，特别是比水沸点低的、选自碳原子数为1～4的低级醇、碳原子数为3～5的低级酮以及具有碳原子数为1～4的烷基的醋酸烷基酯中的至少1种)，从成本、操作性也优异的观点出发，特别优选甲醇、乙醇。
上述溶剂可以单独使用1种，也可以并用2种以上。
由于温度响应性聚合物在溶剂中的溶解性优异，因此即使在浊点以上的温度(例如，室温、37℃等)温度响应性聚合物也不易不溶化而沉积。因此，在涂敷温度响应性聚合物时省去了对温度响应性聚合物溶液进行温度管理的时间和精力，从而能够简单地准备包覆细胞培养器。
在上述培养器准备工序I中，为了调节上皮细胞的粘附性，可以在温度响应性聚合物溶液中适当地加入亲水性分子。作为亲水性分子，为对温度响应性聚合物的C/A比没有影响的非离子性且亲水性的亲水性分子，可举出例如聚乙二醇(PEG)、二甲基丙烯酰胺(DMAA)、甘油、TritonX、聚丙二醇等。
在上述培养器准备工序I中，从温度响应性聚合物易于均匀地包覆于培养面的观点出发，温度响应性聚合物溶液A中的温度响应性聚合物的含量相对于温度响应性聚合物溶液(100质量％)优选为0.00000009～0.01质量％，更优选为0.0000009～0.01质量％。
在上述培养器准备工序I中，从细胞易于自凝聚的观点出发，温度响应性聚合物溶液A中的亲水性分子的含量相对于温度响应性聚合物(100质量％)优选为0.00001～0.00015质量％，更优选为0.00003～0.0001质量％。
在上述培养器准备工序I中，温度响应性聚合物溶液A可以涂敷于培养面的整个表面，也可以涂敷于培养面的一部分。
在培养面的一部分涂敷温度响应性聚合物溶液的情况下，培养面上可以设置1个包覆区域，也可以设置多个包覆区域。另外，在培养面的一部分涂敷温度响应性聚合物溶液的情况下，优选使用培养面为细胞非粘附性的细胞培养器。
此外，温度响应性聚合物溶液可以在整个包覆区域A涂敷成均匀的浓度，也可以在一部分涂敷的较浓，在其它部分涂敷的较稀薄。
另外，“细胞非粘附性”是指粘附系细胞(例如，成纤维细胞、心肌细胞、血管内皮细胞等)在通常的培养条件下，不粘附或难以粘附的性质，也包含所谓的“低粘附性”的情况。
在上述培养器准备工序I中，从在培养面均匀地包覆温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物的观点出发，作为使涂敷的温度响应性聚合物溶液干燥的条件，优选在大气压下，温度10～70℃、时间1～3000分钟。通过使涂敷的温度响应性聚合物溶液快速地干燥，从而温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物无偏差地均匀地包覆在培养面上。
涂敷的温度响应性聚合物溶液可以通过例如将细胞培养器静置在37℃的培育箱中而使其干燥。
在上述培养器准备工序II中，作为溶解温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物的溶剂，可举出例如水；生理盐水；磷酸缓冲液、磷酸缓冲生理盐水(PBS)、Tris缓冲液等缓冲溶液等。
在上述培养器准备工序II中，作为冷却温度响应性聚合物水溶液的方法，可举出例如将温度响应性聚合物水溶液放入约4℃的冰箱冷却至浊点以下的温度的方法等。
在上述培养器准备工序II中，作为使温度响应性聚合物水溶液流延到培养面上的方法，可举出例如：通过倾斜细胞培养器的培养面而将具有浊点以下温度的温度响应性聚合物水溶液摊开的方法；使用抹刀铺展温度响应性聚合物水溶液的方法等。
在上述培养器准备工序II中，作为将流延的温度响应性聚合物水溶液加热至超过浊点的方法，可举出例如：将流延工序后的细胞培养器静置在37℃的培育箱中的方法等。
作为上述细胞培养器，可举出市售的多孔板、培养皿、烧瓶等。作为上述细胞培养器的材质，可举出聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二酯(PET)、聚丙烯、聚丁烯、聚乙烯、聚碳酸酯、玻璃等。其中，从容易精密的成型加工、能够应用于各种灭菌法、且由于具有透明性而适用于显微镜观察的观点出发，优选聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二酯(PET)。
上述细胞培养器可以是对培养面表面实施了细胞粘附处理等处理的细胞培养器，也可以是表面无处理的细胞培养器。为了调节细胞的粘附性，可以对上述培养面表面实施涂敷处理、加工处理等。
上述培养面的俯视形状没有特别限定，可举出例如大致四边形等大致多边形、大致圆形等形状。其中，从易于得到更均匀的细胞结构体的观点出发，优选大致圆形。
上述培养面的底形状(底面的剖面形状)没有特别限定，可举出平底、圆底(U底)、V底、凹凸状底等。特别地在上皮细胞的培养方法和后述的细胞结构体的培养工序中，上皮细胞为球状的细胞结构体。
在上述培养面的至少一部分可以具有凹陷部。在该情况下，优选在上述包覆区域A内设置凹陷部。其中，优选凹陷部设置在包覆区域A的中央部。
上述凹陷部的深度优选为例如0.001～10.0mm，更优选为0.01～1mm。
此外，上述凹陷部的俯视面积优选为例如0.01～10.0mm2，更优选为0.1～1mm2。
上述细胞培养器的培养面的面积优选为150cm2以下，更优选为21cm2以下，进一步优选为200mm2以下。另外，上述细胞培养器的培养面的面积的下限值只要是市售尺寸即可使用，没有特别限定。
包覆区域A的面积优选为150cm2以下，更优选为21cm2以下，进一步优选为200mm2以下。
此外，包覆区域A相对于细胞培养器的培养面的总面积(100％)优选为50～100％，更优选为80～100％。
上述包覆区域A中的每单位面积具有的温度响应性聚合物的量为0.3pg/mm2以上，优选为3.0pg/mm2以上，更优选为30pg/mm2以上，此外，优选为200ng/mm2以下。如果为上述范围，则上皮细胞粘附于培养面，更加容易培养。
作为上述包覆细胞培养器中的包覆区域A的Zeta电位，优选为0～50mV，更优选为0～35mV，进一步优选为10～25mV。通过使Zeta电位为0mV以上，从而带负电的细胞易于粘附。此外，通过使Zeta电位为50mV以下，从而能够减轻细胞毒性。
此外，通过将Zeta电位设为上述范围，从而更加提高上皮细胞和包覆区域A的粘附性。该现象推测是由于以下的原因：通过将表面Zeta电位设为上述范围，从而能够对包覆区域A赋予不会引起细胞毒性的微弱的正电荷，此外还能够确保种植的细胞快速粘附、促进细胞活性的提高和细胞外基质的分泌，进而还能够适当地抑制细胞迁移而增强细胞间的结合。
需要说明的是，Zeta电位是指将用羟丙基纤维素包覆聚苯乙烯胶乳而成的粒子(Zeta电位：-5～+5mV)作为标准探测粒子，使用Zeta电位仪(例如，型号“ELSZ”、大塚电子公司制造等)进行测定，用Smoluchowski公式算出的值。
从提高本发明(II)的效果的观点出发，作为水与上述包覆区域A的接触角，优选为50～90°，更优选为60～80°，进一步优选为62～78°。需要说明的是，水与包覆区域A的接触角是指在包覆区域A内的任意几个点上，按照JIS R3257测定的接触角的平均值。
(种植工序)
上述种植工序为将上皮细胞种植于上述包覆细胞培养器的工序。细胞可以分成多次进行种植。
作为上皮细胞，可举出例如：创新药物试验中多使用的HepG2、HepaRG、HepaRA等来自肝癌的培养细胞；肝细胞；BxPC-3等来自胰腺癌的细胞；从生物体采取的它们的原代培养细胞等。其中，细胞具有的固有性质的全部平均的、本领域技术人员公知的HepaRG、HepaRA细胞等来自肝癌的培养细胞优选用于创新药物试验中，原代细胞适合用于抗癌剂开发、临床检查。
上述上皮细胞可以单独使用1种，也可以并用2种以上。
在上述种植工序中，除了上述上皮细胞以外，也可以包含间充质干细胞、间质细胞等其它细胞。
在上述种植工序中，种植后的上述上皮细胞的包覆区域A上的密度只要不是过于稀薄而使上皮细胞死亡的程度的密度则没有特别限定，例如相对于上述包覆区域A的表面积，优选为5～100％汇合，更优选为50～100％汇合，进一步优选为80～100％汇合。当种植的细胞密度为上述范围时，能够更容易地培养上皮细胞。
作为种植后的细胞的包覆区域A上的密度，只要不是过于稀薄而使上皮细胞死亡的程度的密度则没有特别限定，例如优选为20～15000个/mm2，更优选为50～1500个/mm2。例如，在培养面的面积为8.4mm2的384孔细胞培养板中加入25μL的细胞液进行种植的情况下，优选细胞液中的细胞数目为7～5040个/μL。另外，种植的细胞为活细胞。
细胞的种植能够例如将预先静置于37℃的培养箱中的包覆细胞培养器取出放在室温的净化台上来进行。
另外，细胞优选在培养基中稀释而种植。作为稀释的培养基，只要是能够培养上皮细胞的培养基则没有特别限定。
(培养工序)
上述培养工序为对粘附于上述包覆区域A的上述上皮细胞进行培养的工序。
上皮细胞的培养能够使用例如通常的37℃的细胞培育箱而进行。
培养的上皮细胞能够用PBS等清洗后，使用胰酵素、胰酵素-EDTA、市售的细胞剥离溶液等剥离、稀释后，进行继代培养。
[上皮间质转化诱导剂]
发明人等发现，上述的本发明(II)的实施方式的培养方法中所使用的温度响应性聚合物和温度响应性聚合物组合物具有诱导上皮细胞向间充质细胞的转化(上皮间质转化(EMT))的效果。
即，本发明(II)涉及上皮间质转化诱导剂，该上皮间质转化诱导剂包含上述的本发明(II)的实施方式的培养方法中所使用的温度响应性聚合物和温度响应性聚合物组合物，优选由温度响应性聚合物和温度响应性聚合物组合物构成。
作为诱发上皮间质转化的现有的技术，公知的有使用TGF(Transforming GrowthFactor)-β、EGF(Epidermal Growth Factor)等增殖因子诱发EMT的技术、通过在IV型胶原蛋白上培养上皮癌细胞而诱发EMT的技术。
然而，在上述的现有技术中，在使用来自天然产物的因子作为TGF-β、EGF等增殖因子的情况下，不能否定增殖因子中有可能包含未知物质、病原性物质，此外，还有可能由于批次间的偏差等而导致对实验的再现性产生不良影响。此外，在使用通过遗传重组技术而制备的因子作为增殖因子的情况下，存在增殖因子中混入来自大肠杆菌的内毒素的问题、还存在得到的蛋白质受到宿主大肠杆菌特有的糖链修饰而成为与来自天然产物的增殖因子在结构和性质上不同的物质的问题。
根据本发明(II)的上皮间质转化诱导剂，虽然机制不清楚但不需要增殖因子，仅通过在涂敷有基于100％化学合成的温度响应性聚合物和温度响应性聚合物组合物的培养面上培养上皮细胞，就能够诱发上皮间质转化。因此，减少了可对转化产生不良影响的物质混入的风险以及批次间的偏差，也不需要在使用增殖因子的情况下所需的严密的温度管理，还能够对节约动物资源作出贡献。根据本发明(II)的上皮间质转化诱导剂，能够廉价且简便地实现上皮间质转化。
作为本实施方式(II)的温度响应性聚合物和温度响应性聚合物组合物，可举出：本实施方式(II)中所述的(A)包含2-N,N-二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯(DMAEMA)单元和阴离子型单体单元的温度响应性聚合物、(B)包含N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)单元、阳离子型单体单元以及阴离子型单体单元的温度响应性聚合物、(C)包含2-N,N-二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯(DMAEMA)和/或其衍生物的聚合物、2-氨基-2-羟甲基-1,3-丙二醇(Tris)、以及选自核酸、肝素、透明质酸、硫酸葡聚糖、聚苯乙烯磺酸、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚磷酸、硫酸化多糖、凝胶多糖及聚海藻酸以及它们的碱金属盐中的1种以上阴离子型物质的温度响应性聚合物组合物等，其中，从上皮细胞的粘附性更加优异的观点出发，优选(A)。
在此，作为上述(A)，可举出例如(A-1)通过在水的存在下将DMAEMA聚合的方法而得到的温度响应性聚合物、(A-2)含有主要包含DMAEMA的聚合物嵌段(聚合链α末端)、以及主要包含DMAEMA和阴离子型单体的共聚物嵌段(聚合链ω末端)的温度响应性聚合物，其中，从提高上皮间质转化的诱发的观点出发，优选(A-1)。
关于(A)～(C)的温度响应性聚合物和温度响应性聚合物组合物的详细信息如上所述。
在本实施方式(II)中，用温度响应性聚合物或上述温度响应性聚合物组合物包覆细胞培养器的培养面的至少一部分而形成包覆区域A，准备具有包覆区域A的包覆细胞培养器；接着，将上皮细胞种植于上述包覆细胞培养器，然后对粘附于上述包覆区域A的上述上皮细胞进行培养，由此能够得到作为上皮间质转化诱导剂的上皮间质转化的效果。
关于培养器的准备、细胞的种植、细胞的培养的详细过程没有特别限定，可以与本实施方式(II)的上皮细胞的培养方法、本实施方式(II)的细胞结构体的制造方法的情况相同。
[细胞结构体的制造方法]
本发明(II)的细胞结构体的制造方法包含以下工序：制备工序，制备温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物；培养器准备工序，用上述温度响应性聚合物或上述温度响应性聚合物组合物包覆细胞培养器的培养面的至少一部分而形成包覆区域A，准备具有包覆区域A的包覆细胞培养器；种植工序，将上皮细胞种植于上述包覆细胞培养器；培养工序，由上述上皮细胞形成块状的细胞结构体，得到粘附于上述包覆区域A的细胞结构体，上述包覆区域A中的上述温度响应性聚合物或上述温度响应性聚合物组合物的浓度为0.3pg/mm2以上。
(制备工序)
作为本实施方式(II)的细胞结构体制造方法中的制备工序，可举出与上述的本实施方式(II)的上皮细胞的培养方法中的制备工序同样的工序。
(培养器准备工序)
作为本实施方式(II)的细胞结构体制造方法中的制备工序，可举出与上述的本实施方式(II)的上皮细胞的培养方法中的制备工序同样的工序。
在本实施方式(II)的细胞结构体制造方法中的制备工序的上述培养器准备工序I中，从易于将温度响应性聚合物均匀地包覆于培养面的观点出发，温度响应性聚合物溶液A中的温度响应性聚合物的含量相对于温度响应性聚合物溶液(100质量％)，优选为0.00000009～0.0001质量％，更优选为0.00000009～0.0000009质量％。
关于本实施方式(II)的细胞结构体制造方法中的制备工序的上述细胞培养器的培养面的面积，从更加容易地制造包含上皮细胞的细胞结构体的观点出发，优选为200mm2以下，更优选为50mm2以下，进一步优选为10mm2以下。另外，上述细胞培养器的培养面的面积的下限值只要是市售尺寸即可使用，没有特别限定。
关于本实施方式(II)的细胞结构体制造方法中的制备工序的包覆区域A的面积，从包含上皮细胞的细胞结构体与包覆区域A更牢固地粘附、细胞结构体不易由于移液等操作而剥离的观点出发，优选为10mm2以下，更优选为1.0mm2以下，进一步优选为0.1mm2以下。
此外，包覆区域A的面积相对于本实施方式(II)的细胞结构体制造方法中的制备工序的细胞培养器的培养面的总面积(100％)优选为0.1～50％，更优选为0.1～10％。
进而，从易于形成细胞结构体的观点出发，优选包覆区域A不仅达到细胞培养器的底部还达到侧面。
本实施方式(II)的细胞结构体制造方法中的制备工序的上述包覆区域A中的、每单位面积具有的温度响应性聚合物的量为0.3pg/mm2以上，优选为0.3～200pg/mm2，更优选为0.3～150pg/mm2，进一步优选为0.3～9pg/mm2。如果为上述范围，则细胞结构体与包覆区域A更牢固地粘附。
在本实施方式(II)的细胞结构体制造方法中的制备工序中，从得到丰富地分泌细胞外基质且细胞活性高的细胞结构体的观点出发，优选在整个培养面涂敷温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物。
在使用人工难以进行更换培养基等操作的384孔板、1536孔板培养细胞的情况下、在使用大量的孔(well)培养细胞的情况下，大多使用自动培养器进行细胞培养的操作。然而，在使用自动培养器的操作中，难以针对每个孔调节抽吸培养基的抽吸口的位置以避免误抽吸悬浮的细胞结构体，因此容易误抽吸悬浮的细胞结构体，细胞结构体的培养效率差。特别地由于上皮细胞的细胞结构体难以与培养面粘附，因此易于引起误抽吸。
当培养面的底部(例如，包覆区域A)的温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物的浓度高、侧面的温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物的浓度低或为0时，在侧面处上皮细胞暂时附着，但由于重力的影响而易于剥离，在底面处从侧面剥落的上皮细胞聚集而形成的细胞结构体牢固地粘附，因此容易制作，并且能够形成在更换培养基时不易误抽吸的上皮细胞的细胞结构体。此外，当侧面的温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物的浓度低时，通过上皮细胞曾经粘附于侧面并分泌细胞基质后剥离而落到底部，从而能够得到包含细胞活性高的上皮细胞的细胞结构体。
作为培养面的底部的温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物的浓度高、侧面的温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物的浓度低的细胞培养器，可举出例如培养面的至少一部分具有包覆区域A、培养面的至少一部分中与包覆区域A不同的位置具有包覆区域B的细胞培养器。
包覆区域B优选以包围包覆区域A的周围的方式形成。例如，在圆底的培养面中，在其中央部(最深部)设置包覆区域A，其以外的部分设置包覆区域B，由此包覆区域B上的上皮细胞由于重力的影响而落下，汇集在中央部的包覆区域A中，更容易形成细胞结构体。此外，形成的细胞结构体在包覆区域A牢固地粘附，因此通过移液等操作也难以剥离。
包覆区域B中的上述温度响应性聚合物或上述温度响应性聚合物组合物的浓度优选比包覆区域A低，更优选小于200pg/mm2，更优选小于100pg/mm2，进一步优选为50pg/mm2以下。
此外，包覆区域B的温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物的浓度相对于包覆区域A的温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物的浓度优选为5～90％的浓度，更优选为10～50％的浓度。
包覆区域B中的上述温度响应性聚合物或上述温度响应性聚合物组合物的浓度可以在全部区域中为均匀的浓度，也可以在一部分中浓、在其它部分中稀薄。此外，在包覆区域B中，可以存在没有上述温度响应性聚合物或上述温度响应性聚合物组合物的部分。
在本实施方式(II)的细胞结构体制造方法中的制备工序中，从上皮细胞汇集于培养面的最深部而易于形成细胞结构体的观点出发，培养面的底形状(底面的剖面形状)优选为圆底(U底)、V底、凹状底，从易于形成球状的细胞结构体的观点出发，特别优选为圆底(U底、纺锤底)。
关于具有圆底(U底、纺锤底)的细胞培养器，
沿细胞培养器的深度方向的剖面中的培养面底部轮廓线的曲率半径R以整个圆底(U底、纺锤底)的平均计，优选为50mm以下，更优选为10mm以下，进一步优选为5mm以下，特别优选为2mm以下，此外，优选为0.1mm以上，更优选为0.2mm以上，进一步优选为0.4mm以上，特别优选为0.8mm以上。
细胞培养器的最大宽度L优选为100mm以下，更优选为50mm以下，进一步优选为20mm以下，特别优选为10mm以下，此外，优选为1mm以上，更优选为2mm以上，进一步优选为3mm以上，特别优选为4mm以上。
圆底(U底、纺锤底)的最深部并不限定于图15所示的形状，可以是具有规定宽度的平面。
作为使包覆区域A中的温度响应性聚合物和温度响应性聚合物组合物的浓度高、使包覆区域B中的温度响应性聚合物和温度响应性聚合物组合物的浓度比包覆区域A低的方法，可举出例如使用在培养面的底部设置有凹部状的凹陷部(参考图16(i))的培养器，添加温度响应性聚合物溶液，在凹陷部的温度响应性聚合物溶液多、侧面的温度响应性聚合物溶液少的状态下进行干燥的方法等。
另外，作为凹陷部的形状，可举出上述的形状。
(种植工序)
作为本实施方式(II)的细胞结构体制造方法中的种植工序，可举出与上述的本实施方式(II)的上皮细胞培养方法中的种植工序同样的工序。
在本实施方式(II)的细胞结构体制造方法中的种植工序中，种植后的上述上皮细胞的包覆区域A上的密度只要不是过于稀薄而使上皮细胞死亡的程度的密度则没有特别限定，例如，相对于上述包覆区域A的表面积，优选5～100％汇合，更优选50～100％汇合，进一步优选80～100％汇合。当种植的细胞密度为上述范围时，能够更加容易地制备上皮细胞的细胞结构体。
在该种植工序中，作为种植的细胞数目，从更加易于形成细胞结构体的观点出发，优选为20个/mm2以上，更优选为50个/mm2以上，进一步优选为100个/mm2以上，特别优选为500个/mm2以上，优选为15000个/mm2以下、10000个/mm2以下、5000个/mm2以下、1500个/mm2以下。例如，在培养面的面积为8.4mm2的384孔细胞培养板中加入25μL的细胞液进行种植的情况下，优选细胞液中的细胞数目为7～5040个/μL。另外，种植的细胞为活细胞。
(培养工序)
上述培养工序是由上述上皮细胞形成块状的细胞结构体，从而得到与上述包覆区域A粘附的细胞结构体的工序。
种植的细胞优选进行静置。将种植的细胞进行静置的温度没有特别限定，例如优选为30℃以上，更优选为35～38℃，进一步优选为37℃。
将种植的细胞进行静置的时间没有特别限定，例如优选培养1～240小时，更优选培养10～96小时。
以下使用图15、图16对本实施方式(II)的细胞结构体的制造方法的例子进行说明。
图15为包含上皮细胞的细胞结构体的制造方法的一个例子。
在具有圆底的培养面的细胞培养器(例如，384孔板、1536孔板等)中，涂敷温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物而进行包覆，准备具有包覆区域A的包覆细胞培养器(参考图15(i)(ii))。然后，在包覆细胞培养器中加入用培养基稀释了的、包含上皮细胞的细胞液(参考图15(iii))。种植的上皮细胞粘附于包覆区域A的整个表面(参考图15(iv))。另外，在该例子中，上皮细胞的密度为100％汇合(参考图15(iv))。上皮细胞通过曾经粘附于包覆区域A，从而能够分泌细胞外基质成分，高度地保持细胞活性。粘附于包覆区域A的侧面的上皮细胞受到重力的影响从包覆区域A剥离，汇集于培养面底面。汇集于底面的上皮细胞进行粘附而形成细胞结构体(参考图15(v))。形成的细胞结构体在培养面底面与包覆细胞培养器粘附(参考图15(v))。
另外，在该例子中，就包覆区域A中的温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物的浓度而言，粘附于侧面的上皮细胞由于重力的影响而剥离，但粘附于底部的上皮细胞即使通过移液等操作也难以剥离程度地牢固地粘附。
图16为包含上皮细胞的细胞结构体的制造方法的一个例子。
在底面具有凹陷部(凹部)的圆底的培养面的细胞培养器(例如，384孔板、1536孔板)中，添加包含温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物的溶液。在此，溶液汇集于底面的凹陷部，在凹陷部形成温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物的浓度高的包覆区域A。另一方面，由于侧面的溶液比凹陷部的量少，因此在侧面形成温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物的浓度比包覆区域A低的包覆区域B。然后，准备具有包覆区域A和包覆区域B的包覆细胞培养器(参考图16(i)(ii))。在侧面的包覆区域B中，上皮细胞暂时粘附，但由于重力的影响而易于剥离，在底面的包覆区域A中，从侧面剥落的上皮细胞聚集而形成的细胞结构体牢固地粘附。由此，能够抑制更换培养基时的误抽吸(参考图16(ii))。在包覆细胞培养器中加入用培养基稀释了的、包含上皮细胞的细胞液(参考图16(iii))。种植的上皮细胞与包覆区域A和包覆区域B粘附(参考图16(iv))。另外，在该例子中，上皮细胞的密度为100％汇合(参考图16(iv))。上皮细胞通过曾经粘附于包覆区域A和包覆区域B，从而能够分泌细胞外基质成分，高度地保持细胞活性。粘附于包覆区域B的侧面的上皮细胞受到重力的影响从包覆区域B剥离，汇集于培养面底面。汇集于底面的上皮细胞进行粘附而形成细胞结构体(参考图16(v))。形成的细胞结构体在包覆区域A与包覆细胞培养器粘附(参考图16(v))。
[上皮细胞用细胞培养器]
本发明(II)的上皮细胞用细胞培养器在培养面的至少一部分具有用温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物包覆的包覆区域A，上述包覆区域A中的上述温度响应性聚合物或上述温度响应性聚合物组合物的浓度为0.3pg/mm2以上。
根据本发明(II)的上皮细胞用细胞培养器，在培养中上皮细胞难以剥离，能够容易地培养上皮细胞。此外，能够容易地制造包含上皮细胞的细胞结构体。
作为本实施方式(II)的上皮细胞用细胞培养器中的温度响应性聚合物和温度响应性聚合物组合物，可举出与上述同样的那些。
作为本实施方式(II)的上皮细胞用细胞培养器，可举出上述的包覆细胞培养器。
本实施方式(II)的上皮细胞用细胞培养器能够通过例如上述的制备工序、培养器准备工序来制造。
[[发明(III)]]
[立体组织体的制作装置]
本实施方式(III)的立体组织体的制作装置为包含具有至少1个通孔的培养面和穿过上述通孔的轴的立体组织体的制作装置，在上述培养面包含至少1个用温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物包覆的包覆培养面，在1个上述包覆培养面的内侧具有至少1个上述通孔，上述培养面在上述轴的延伸方向可移动。
另外，在本发明(III)中，聚合物的“浊点”并不是严格意义上的“在小于规定的温度溶解但在规定温度以上不溶化而沉积的该温度”，而是指“不溶化而沉积的聚合物在小于规定的温度的条件下溶解时，溶解所需要的时间为10分钟以上的该温度”。
本实施方式(III)的立体组织体的制作装置比较容易用作构成零件少的医疗用品，感染的风险少。此外，能够设置于密封的塑料容器内，卫生地、无菌地制作立体组织体。此外，由于构成零件少且小型，因此能够减少作为医疗用品废弃时的废弃物的量。
(轴)
上述轴只要能够确保得到的立体组织体的尺寸稳定性则没有特别限定，具体而言，作为上述轴的材质，可举出例如聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二酯(PET)、聚丙烯、聚丁烯、聚乙烯、丙烯酸树脂、聚氨酯、尿素树脂、聚碳酸酯等塑料；硅橡胶、氯丁橡胶(Neoprene(注册商标)等)、SBR等橡胶弹性体；陶瓷；玻璃；不锈钢、钛、镍钛诺(注册商标)等金属、无机材料等。其中，从能够应用各种灭菌法、溶出物少而具有作为医疗材料的功能的观点出发，优选聚苯乙烯、聚氨酯、丙烯酸树脂、聚碳酸脂等塑料、不锈钢、镍钛诺(注册商标)等金属。
上述轴的表面可以为细胞粘附性，也可以为细胞非粘附性。其中，从易于保持缠绕在轴上的立体组织体的构造的观点出发，优选轴的表面为细胞非粘附性。此外，从容易地将包含由细胞分泌的物质的立体组织体从轴剥离(易于拔出)的观点出发，优选轴的表面不包含蛋白质。
轴的表面的细胞粘附性能够通过将细胞粘附性物质涂敷于轴的表面的方法，用细胞粘附性物质的膜包覆轴的表面的方法，进行放射线、等离子体放电等而将细胞粘附性分子团导入轴的表面的方法等来进行调节。
作为上述细胞粘附性物质，可举出层粘附蛋白、胶原蛋白、纤连蛋白、肽、阳离子型聚合物、聚苯乙烯等。作为上述肽，可举出具有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列的肽、具有8个以上连续的精氨酸残基的序列的肽等。作为上述阳离子型聚合物，可举出氨基苯乙烯等。在这些中，优选细胞粘附性高的层粘附蛋白、胶原蛋白、纤连蛋白。此外，也能够优选使用包含上述列举的细胞粘附性物质的试剂，作为该试剂，可举出血清等。
缠绕于轴周围的环状的立体组织体由于被自身分泌的细胞外基质覆盖，因此即使不对轴的表面进行细胞粘附性的处理，也能够缠绕于轴周围。
另外，“细胞粘附性”是指粘附系细胞(例如，血管内皮细胞、血管细胞、软骨细胞、成纤维细胞等)在通常的培养条件下粘附的性质，也包含所谓的“低粘附性”的情况。
另外，以缠绕于轴周围的方式而形成的环状或管腔状等立体组织体，即使在轴的表面为细胞粘附性的情况下，也能够从轴表面剥离。此外，在轴表面为铁氟龙(注册商标)、硅橡胶、亲水性涂层等细胞非粘附性的情况下，能够通过例如用胶原蛋白管包覆轴表面，从而将环状或管腔状等立体组织体与胶原蛋白管一起拔出。
作为垂直于上述轴的延伸方向(长度方向)的面的剖面形状，可举出例如大致圆形、大致多边形、半月形、月牙形、弦形、泪珠形等。其中，从得到与软骨环、血管、气管等形状接近的立体组织体的观点出发，优选大致圆形。即，上述轴优选大致圆柱状。
另外，垂直于上述轴的延伸方向的面的剖面形状可以在延伸方向上为相同形状，也可以为不同形状。
此外，轴的延伸方向的形状可以为直线状(参考图18～20)，也可以为C字状、U字状、螺旋状等曲线状。
上述轴的尺寸没有特别限定，例如优选长度为0.1～600mm，更优选为1～300mm。此外，在与轴的延伸方向垂直的面的剖面形状为大致圆形的情况下，其最大直径优选为0.01～150mm，更优选为0.1～50mm。
上述轴的表面可以为平滑，也可以为凹凸。此外，表面可以有孔，可以为网眼状、设置有多个细孔的多孔质状等。
此外，上述轴的内部可以为空心。
其中，从能够稳定地向缠绕于轴周围的立体组织体中包含的全部细胞供给培养基成分、氧而高度地维持细胞的活性的观点出发、以及从能够快速地排出细胞的代谢产物的观点出发，优选上述轴的内部为空心且轴的表面为多孔质状。
在轴是由海绵这样的连续泡沫体形成的多孔质体的情况下，细胞浸润于轴内部，到达深部的细胞有可能坏死、形成的立体组织体与轴顽固地粘附而有可能变得难以剥离，因此优选轴表面的最大孔径为200μm以下。在轴由金属纤维的纺织布这样的纤维聚集体形成的情况下，细胞易于与轴表面粘附，此外有可能影响细胞的分化，因此优选为10μm以上。
另外，在使用多根轴的情况下，各轴的材质、尺寸、形状等可以相同也可以不同。此外，轴间的距离没有特别限定，例如多根轴可以相接。
(培养面)
上述培养面在至少一部分的表面上具有至少一个用温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物包覆的包覆培养面。在上述培养面中，可以设置1个包覆培养面，也可以设置多个包覆培养面。
在设置1个包覆培养面的情况下，上述培养面可以整个表面均为包覆培养面(参考图18、20)，也可以一部分为包覆培养面(参考图19)。其中，从容易制造的观点出发，优选培养面的整个表面为包覆培养面。
此外，在培养面为具有板状、圆盘状等2个表面的形状的情况下，可以仅在单面具有包覆培养面，也可以在两面具有包覆培养面。
作为上述培养面的材质，可举出聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二酯(PET)、聚丙烯、聚丁烯、聚乙烯、聚碳酸酯、玻璃、有机硅树脂、丙烯酸树脂、聚氨酯树脂等。其中，从容易精密的成型加工、能够应用于各种灭菌法的观点出发，优选聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二酯、玻璃、有机硅树脂、丙烯酸树脂。
上述培养面可以是对表面实施了细胞粘附处理等处理的培养面，也可以是表面无处理的培养面。为了调节细胞的粘附性，可以对上述培养面表面实施涂敷处理、加工处理等。
上述培养面的俯视形状没有特别限定，可举出例如大致四边形等大致多边形(具有通孔的大致多边形)、大致圆形(环状等具有通孔的大致圆形)等形状。
从能够更加容易地制造环状或管腔状等立体组织体的观点出发，上述培养面的面积优选为0.1mm2～150cm2，更优选为8.4mm2～21cm2。
上述培养面的底形状(底面的剖面形状)没有特别限定，可举出平底、圆底、凹凸状底等。其中，从易于得到环状或管腔状等立体组织体的观点出发，优选平底。
从能够同时形成多个立体组织体、能够在更短时间高效地形成管腔状的立体组织体的观点出发，可以设置多个(例如，2个以上、5个以上、10个以上等)上述培养面。另外，培养面的上限数目没有特别限定，只要是在能够进行细胞的种植、培养等、能够制作立体组织体的范围即可。
在设置多个培养面的情况下，优选1根上述轴穿过至少2个上述培养面的上述通孔，更优选1根上述轴穿过全部上述培养面的上述通孔。
另外，作为本实施方式(III)的立体组织体的制作装置，可以具有1个、也可以具有多个例如下述构件，该构件为1根轴穿过的多个培养面(培养面在轴的延伸方向上配置成货架状的、包含轴和多个培养面的构件)。
在设置多个培养面的情况下，上述轴的延伸方向上的各培养面间的距离可以相同，也可以不同。从容易地连接各培养面中制作的环状或管腔状的立体组织体的观点出发，上述轴的延伸方向上的各培养面间的距离例如相对于使用的细胞的轴的延伸方向的长度优选为10倍以上，更优选为7.5倍以下。具体而言，上述轴的延伸方向上的各培养面间的距离优选为0.1～10mm，更优选为0.2～2.0mm。
另外，在各培养面制作的环状或管腔状的立体组织体的连接是指下述情况，即，除了包含构成在各培养面制作的环状或管腔状的各立体组织体的细胞彼此粘附的情况以外，还包含各培养面制作的环状或管腔状的立体组织体经由构成在各培养面制作的环状或管腔状的各立体组织体的由细胞分泌的蛋白质(例如，构成细胞外基质的蛋白质等)而连接的情况。
作为上述包覆培养面的温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物，可举出在后述的制备工序中记载的温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物。
在上述包覆培养面中，作为每单位面积包含的温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物的含量，从更容易地得到环状或管腔状等立体组织体的观点出发，优选为5～50ng/mm2，更优选为15～40ng/mm2。
另外，在设置多个包覆培养面的情况下，各包覆培养面的每单位面积包含的温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物的含量可以相同也可以不同。
上述包覆培养面的俯视形状没有特别限定，可举出例如大致四边形等大致多边形(具有通孔的大致多边形)、大致圆形(环状等具有通孔的大致圆形)等形状。其中，从易于得到细胞分布更均匀的立体组织体的观点出发，优选大致圆形。
另外，在设置多个包覆培养面的情况下，各包覆培养面的俯视形状可以相同也可以不同。
从易于得到细胞分布更均匀的立体组织体的观点出发，作为上述包覆培养面的表面积，优选为0.1mm2～150cm2，更优选为8.4mm2～21cm2。在设置多个包覆培养面的情况下，各包覆培养面的表面积可以相同也可以不同。
此外，当包覆培养面的面积小时，缠绕于轴的细胞数减少，易于形成以细胞基质作为主成分的立体组织体。作为形成以细胞基质作为主成分的立体组织体时的包覆培养面的面积，可举出例如0.1～50mm2。
另外，包覆培养面的表面积能够通过显微镜照相的图像解析等本领域技术人员公知的方法来测定。
作为上述包覆培养面表面的Zeta电位，优选为0～50mV，更优选为0～35mV，进一步优选为10～25mV。通过使Zeta电位为0mV以上，从而带负电的细胞易于粘附。此外，通过使Zeta电位为50mV以下，从而能够减轻细胞毒性。
此外，通过将Zeta电位设为上述范围，从而仅通过在合适的培养条件培养细胞，就能够使种植的细胞成为缠绕于轴周围的环状的立体组织体。该现象推测是由于以下的原因：通过将表面Zeta电位设为上述范围，从而能够对包覆培养面表面赋予不会引起细胞毒性的微弱的正电荷，此外还能够确保种植的细胞快速粘附、促进细胞活性的提高和细胞外基质的分泌，进而还能够适当地抑制细胞迁移而增强细胞间的结合。
在设置多个包覆培养面的情况下，各包覆培养面的Zeta电位可以相同也可以不同。
需要说明的是，Zeta电位是指将用羟丙基纤维素包覆聚苯乙烯胶乳而成的粒子(Zeta电位：-5～+5mV)作为标准探测粒子，使用Zeta电位仪(例如，型号“ELSZ”、大塚电子公司制造等)进行测定，用Smoluchowski公式算出的值。
从提高本发明(III)的效果的观点出发，作为水与上述包覆培养面的接触角，优选为50～90°，更优选为60～80°，进一步优选为62～78°。在设置多个包覆培养面的情况下，水与各包覆培养面的接触角可以相同也可以不同。
需要说明的是，水与包覆培养面的接触角是指在包覆培养面内的任意几个点上，按照JIS R3257测定的接触角的平均值。
上述培养面具有至少1个通孔。在上述通孔为1个的情况下，优选位于培养面的中央部。通过将上述轴穿过上述通孔，从而成为上述培养面和上述轴为一体的立体组织体的制作装置。
上述通孔的俯视形状没有特别限定，可举出例如大致多边形、大致圆形等形状，从易于得到细胞更均匀分布的立体组织体的观点出发，优选为与上述轴的垂直于延伸方向的面的剖面形状相同的形状。其中，上述轴的垂直于延伸方向的面的剖面形状、以及上述通孔的俯视形状优选均为大致圆形(参考图18～20)。
另外，通孔只要是穿过轴的形状，则可以为与轴的垂直于延伸方向的面的剖面形状相同的形状，也可以为不同的形状。此外，在设置多个通孔的情况下，各通孔的俯视形状可以相同也可以不同。
在上述包覆培养面的内侧至少设置1个上述通孔，优选设置1个上述通孔。
上述通孔设置于上述包覆培养面的内侧，优选1个通孔设置于上述包覆培养面的中央部，更优选设置于包含上述包覆培养面的重心的部分。在上述包覆培养面为大致圆形的情况下，优选在自包覆培养面的中心起0.75r以内(r为包覆培养面的半径)的区域中设置通孔。当上述通孔设置于包覆培养面的中央部时，能够使细胞凝聚的方向向中央部集中，能够制作细胞的分布更均匀的立体组织体。另外，通过将通孔设置为偏离包覆培养面的中央部，从而能够制作环的环边的粗细不均匀的立体组织体。
从易于得到尺寸形状好的立体组织体的观点出发，优选在1个上述包覆培养面的内侧设置1个上述通孔。
另外，在本实施方式(III)的制作装置设置多个包覆培养面的情况下，只要在全部包覆培养面中的至少1个包覆培养面处，在包覆培养面的内侧设置有至少1个通孔即可，也可以是包覆培养面的数目和通孔的数目相同、在各包覆培养面的内侧设置有1个通孔。例如，本实施方式(III)的制作装置可以为在培养面设置5个包覆培养面、在其中1个包覆培养面的内侧设置1个通孔的具有5个包覆培养面和1个通孔的制作装置，也可以是在培养面设置5个包覆培养面、在各包覆培养面的内侧分别设置1个通孔的具有5个包覆培养面和5个通孔的制作装置等。
作为上述通孔的表面积，优选为0.1mm2～150cm2，更优选为8.4mm2～21cm2。此外，在通孔为大致圆形的情况下，优选最大直径为0.01～150mm。另外，在设置多个通孔的情况下，各通孔的表面积可以相同也可以不同。
在包覆培养面的内侧设置有1个通孔的包覆培养面中，上述通孔的表面积相对于上述包覆培养面的表面积(100％)的比例优选为0.1～50％，更优选为1～30％。通过使比例为上述范围，从而能够更容易地得到缠绕于轴周围的立体组织体。
(轴与培养面的位置关系)
上述轴只要穿过上述通孔即可，轴和培养面可以相接(参考图18、19)，轴和培养面之间也可以有缝隙(参考图20)。作为轴和培养面之间的缝隙，优选凝聚的细胞能够越过缝隙而缠绕于轴、和/或使培养面在轴的延伸方向上移动时缠绕于轴周围的立体组织体不会剥离的距离，更优选为5.0mm以内，进一步优选为0.5mm以内。
在设置多个上述培养面的情况下，从细胞易于均匀地分布于各培养面、在各培养面制作的环状或管腔状的立体组织体能够容易地连接的观点出发，优选轴和培养面之间有缝隙。
上述培养面在轴的延伸方向上是可移动的，其中，从减少由于移动培养面时产生的培养基的流动而对缠绕于轴周围的立体组织体给予物理应力的风险、更容易得到环状或管腔状等立体组织体的观点出发，优选在由包覆培养面向培养面的方向上是可移动的。此外，上述培养面和轴的延伸方向所成的角度没有特别限定，优选为垂直。
在设置多个通孔的情况下，可以在全部的通孔中穿过轴，也可以在一部分的通孔中穿过轴。其中，从种植的细胞不易落到培养面的下侧、并且能够使种植的细胞与包覆培养面粘附的观点出发，优选在全部的通孔中穿过轴。
以下，对本实施方式(III)的立体组织体的制作装置的一个例子使用图18～21、26进行说明。从比较容易用作构成零件少的医疗用品，感染的风险少的观点出发、以及容易制作生物管的观点出发，优选图18～21、26的制作装置。其中，从更容易地得到环状或管腔状等立体组织体的观点出发，优选图20、26的立体组织体的制作装置。
图18为本实施方式(III)的一个例子的立体组织体的制造装置的概略图。
在该例子中，在圆盘状的培养面的一面的整个表面设置有用温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物包覆的包覆培养面。在包覆培养面的中央部有通孔，圆柱状的轴穿过通孔。包覆培养面和轴之间没有缝隙，包覆培养面和轴相接。培养面相对于轴的延伸方向为垂直，在轴的延伸方向上是可移动的。另外，图18～21的培养面在图的上方向(由培养面向包覆培养面的方向)、图的下方向(由包覆培养面向培养面的方向)均是可移动的。培养面移动的方向、移动的距离和/或移动的时机可以使用例如计算机等控制而自动地进行。
图19为本实施方式(III)的一个例子的立体组织体的制造装置的概略图。
在该例子中，在圆盘状的培养面的一面的一部分设置有用温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物包覆的包覆培养面。
图20为本实施方式(III)的一个例子的立体组织体的制造装置的概略图。
在该例子中，在圆盘状的培养面的一面的整个表面设置有用温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物包覆的包覆培养面。包覆培养面和轴之间有缝隙。即，相对于通孔的孔径，轴的直径小。
图21为本实施方式(III)的一个例子的立体组织体的制作装置的照片。
在该例子中，在圆盘状的塑料制培养面的一面的整个表面设置有用温度响应性聚合物包覆的包覆培养面。在包覆培养面的中央部有通孔，圆柱状的轴穿过通孔。轴的内部为空心，轴的表面为网眼状，金属棒通过轴的内部而固定制作装置。包覆培养面和轴之间有缝隙。培养面相对于轴的延伸方向为垂直，在轴的延伸方向上是可移动的。
本实施方式(III)的立体组织体的制作装置放入到比培养面的外径稍大的内径的容器中。由此，从图21的上部种植的细胞不易落到培养面的下侧，能够使种植的细胞与包覆培养面粘附。
图26为本实施方式(III)的一个例子的立体组织体的制造装置的概略图。
在该例子中，设置有2个培养面，上述培养面在圆盘状的培养面的一面的整个表面设置有用温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物包覆的包覆培养面。1根轴穿过2个培养面的通孔，能够在2个培养面同时形成环状或管腔状的立体组织体。包覆培养面和轴之间有缝隙。通过调节2个培养面之间的距离，从而在2个培养面制作的环状或管腔状的各立体组织体能够通过各立体组织体中包含的细胞彼此粘附、或经由各立体组织体中包含的细胞分泌的蛋白质而容易地连接。
(立体组织体的制作装置的制造方法)
作为本实施方式(III)的立体组织体的制作装置的制造方法，可举出例如包含以下工序的方法等：
制备工序，制备温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物，以及
包覆培养面准备工序，用上述温度响应性聚合物或上述温度响应性聚合物组合物包覆上述培养面而准备包覆培养面。
-制备工序-
作为实施方式(III)中的制备工序，可举出与上述发明(I)中的制备工序同样的工序，作为优选例也可举出同样的例子。
另外，在本实施方式(III)中，作为在培养方法中使用的温度响应性聚合物和温度响应性聚合物组合物，从更容易得到环状或管腔状等立体组织体的观点出发，优选(A)。
此外，在本实施方式(III)中，有时将制备包含2-N,N-二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯(DMAEMA)的混合物的制备工序称为混合物制备工序。
此外，在本实施方式(III)中，基于(A-1)的温度响应性聚合物，能够如后述那样通过在合适的培养条件培养细胞，从而形成环状或管腔状等立体组织体。
此外，在本实施方式(III)中，基于(A-2)的温度响应性聚合物，能够如后述那样通过在合适的培养条件培养细胞，从而形成环状或管腔状等立体组织体。
此外，在本实施方式(III)中，基于(B)的温度响应性聚合物，能够如后述那样通过在合适的培养条件培养细胞，从而形成环状或管腔状等立体组织体。
此外，在本实施方式(III)中，在使用上述比例的混合型温度响应性聚合物组合物的情况下，能够在后述的培养工序中易于形成立体组织体。
此外，在本实施方式(III)中，通过将C/A比设为0.5～16，从而易于得到容易形成环状或管腔状等立体组织体这样的上述效果。
-包覆培养面准备工序-
上述包覆培养面准备工序为用上述温度响应性聚合物或上述温度响应性聚合物组合物包覆培养面而准备包覆培养面的工序。
上述包覆培养面准备工序可以为例如以下的工序(包覆培养面准备工序I)：将温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物溶解于溶剂制成温度响应性聚合物溶液，然后涂敷在培养面上并使其干燥，由此准备包覆培养面；此外，还可以为以下工序(包覆培养面准备工序II)：将包含温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物的水溶液(温度响应性聚合物水溶液)冷却到温度响应性聚合物的浊点以下，使经冷却的温度响应性聚合物水溶液流延在培养面上，加热至超过浊点的温度，由此准备包覆培养面。
作为上述包覆培养面准备工序I的温度响应性聚合物溶液中的溶剂，可举出例如：水；生理盐水；缓冲溶液；甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、1-丁醇、异丁醇、2-丁醇、叔丁醇、1-戊醇、2-戊醇、3-戊醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇、2-甲基-2-丁醇、3-甲基-2-丁醇、2,2-二甲基-1-丙醇、1-戊醇、2-戊醇、3-戊醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇、2-甲基-2-丁醇、3-甲基-2-丁醇、2,2-二甲基-1-丙醇、1-己醇、2-甲基-2-戊醇、烯丙醇、苯甲醇、水杨醇等醇；丙酮、甲乙酮、二乙酮、甲基丙基酮、甲基异丁基酮、甲基乙烯基酮、环己酮、2-甲基环戊酮、苯乙酮、二苯甲酮、异佛尔酮等酮；醋酸甲酯、醋酸乙酯、醋酸丙酯、醋酸异丙酯、醋酸正丁酯、醋酸异丁酯、醋酸仲丁酯、醋酸叔丁酯、醋酸乙烯酯、甲酸甲酯、甲酸乙酯、甲酸丙酯、上述醇与磷酸的酯、上述醇与碳酸的酯等酯；氯仿；苯；甲苯；二乙醚；二氯甲烷等。
在这些中，从易于均匀地包覆于培养面、此外温度响应性聚合物的溶解性优异的观点出发，优选水、甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、2-丁醇、叔丁醇、烯丙醇等醇；丙酮、甲乙酮、二乙酮、甲基乙烯基酮等酮；醋酸甲酯、醋酸乙酯、醋酸异丙酯、醋酸叔丁酯、醋酸乙烯酯等酯；氯仿；苯；甲苯；二乙醚；二氯甲烷。此外，从能够在短时间干燥且更容易均匀地涂敷于培养面的观点出发，进一步优选沸点低的有机溶剂(例如，选自碳原子数为1～4的低级醇、碳原子数为3～5的低级酮以及具有碳原子数为1～4的烷基的醋酸烷基酯中的至少1种，特别是比水沸点低的、选自碳原子数为1～4的低级醇、碳原子数为3～5的低级酮以及具有碳原子数为1～4的烷基的醋酸烷基酯中的至少1种)，从成本、操作性也优异的观点出发，特别优选甲醇、乙醇。
上述溶剂可以单独使用1种，也可以并用2种以上。
由于温度响应性聚合物在溶剂中的溶解性优异，因此即使在浊点以上的温度(例如，室温、37℃等)温度响应性聚合物也不易不溶化而沉积。因此，在涂敷温度响应性聚合物时省去了对温度响应性聚合物溶液进行温度管理的时间和精力，从而能够简单地准备包覆培养面。
在上述包覆培养面准备工序I中，根据使用的细胞种类例如在为粘附性强的间充质细胞、凝聚力弱的癌细胞的情况下，从细胞易于自凝聚的观点出发，有时优选在温度响应性聚合物溶液中包含亲水性分子。作为亲水性分子，为对温度响应性聚合物的C/A比没有影响的非离子性且亲水性的亲水性分子，可举出例如聚乙二醇(PEG)、二甲基丙烯酰胺(DMAA)、甘油、TritonX、聚丙二醇等。
在上述包覆培养面准备工序I中，从易于将温度响应性聚合物均匀地包覆于培养面的观点出发，温度响应性聚合物溶液中的温度响应性聚合物的含量相对于温度响应性聚合物溶液(100质量％)，优选为0.0010～3.0质量％，更优选为0.0012～2.5质量％。
在上述包覆培养面准备工序I中，从细胞易于自凝聚的观点出发，温度响应性聚合物溶液中的亲水性分子的含量相对于温度响应性聚合物(100质量％)，优选为0.00001～0.00015质量％，更优选为0.00003～0.0001质量％。
在上述包覆培养面准备工序I中，温度响应性聚合物溶液可以涂敷在培养面的整个表面，也可以涂敷在培养面的一部分。在培养面的一部分涂敷温度响应性聚合物溶液的情况下，可以在培养面上设置1个包覆培养面，也可以设置多个包覆培养面。另外，在培养面的一部分涂敷温度响应性聚合物溶液的情况下，优选使用培养面为细胞非粘附性的细胞培养器。
在上述包覆培养面准备工序I中，从在培养面均匀地包覆温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物的观点出发，作为使涂敷的温度响应性聚合物溶液干燥的条件，优选在大气压下，温度10～70℃、时间1～3000分钟。通过使涂敷的温度响应性聚合物溶液快速地干燥，从而温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物无偏差地均匀地包覆在培养面上。
涂敷的温度响应性聚合物溶液可以通过例如将细胞培养器静置在37℃或40℃的培育箱中而使其干燥。
在上述包覆培养面准备工序II中，作为溶解温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物的溶剂，可举出例如水；生理盐水；磷酸缓冲液、磷酸缓冲生理盐水(PBS)、Tris缓冲液等缓冲溶液等。
在上述包覆培养面准备工序II中，作为冷却温度响应性聚合物水溶液的方法，可举出例如将温度响应性聚合物水溶液放入约4℃的冰箱冷却至浊点以下的温度的方法等。
在上述包覆培养面准备工序II中，作为使温度响应性聚合物水溶液流延到培养面上的方法，可举出例如：通过倾斜培养面而将具有浊点以下温度的温度响应性聚合物水溶液摊开的方法；使用抹刀铺展温度响应性聚合物水溶液的方法等。
在上述包覆培养面准备工序II中，作为将流延的温度响应性聚合物水溶液加热至超过浊点的方法，可举出例如：将流延工序后的培养面静置在37℃的培育箱中的方法等。
[立体组织体的制作方法]
在本实施方式(III)的立体组织体的制作方法中，使用上述的本实施方式(III)的立体组织体的制作装置。
本实施方式(III)的立体组织体的制作方法包含以下工序：种植工序(在本发明(III)中有时也称为“第1次的种植工序”)，在上述包覆培养面上种植至少1种细胞；培养工序(在本发明(III)中有时也称为“第1次的培养工序”)，对种植的上述细胞进行培养，得到缠绕于上述轴周围的环状的立体组织体。
另外，在本发明(III)中，有时将1次种植、培养工序中得到的、缠绕于轴周围的立体组织体称为“环状的立体组织体”、将多个环状的立体组织体重叠而成的立体组织体称为“管腔状的立体组织体”。
另外，从不通过人手操作而能够更无菌、更卫生地进行操作的观点出发，第1次的种植工序、第1次的培养工序的操作可以使用计算机等控制自动地进行。
(第1次的种植工序)
作为在上述种植工序中种植的细胞，可举出例如：血管内皮细胞、血管平滑肌细胞等血管细胞；心肌细胞；软骨细胞；神经细胞；脂肪细胞；脂肪干细胞；肝细胞；成纤维细胞；肾细胞；平滑肌细胞；iPS细胞；ES细胞等。在制造以细胞外基质作为主成分的立体组织体的情况下，优选：血管内皮细胞、血管平滑肌细胞等血管细胞；心肌细胞；软骨细胞；神经细胞；脂肪细胞；脂肪干细胞；肝细胞；成纤维细胞；肾细胞；平滑肌细胞，更优选成纤维细胞、间充质细胞。上述细胞可以单独使用1种，也可以并用2种以上。
特别是通过使用血管内皮细胞、平滑肌细胞，从而能够得到人工血管。此外，通过使用软骨细胞、成纤维细胞，从而能够得到人工气管。此外，在制造包含由构成细胞外基质的物质等的由细胞分泌的物质的立体组织体的情况下，可以使用导入了表达载体的表达LargeT抗原的传代细胞(established cell)(例如，COS细胞)，该表达载体导入有遗传基因，该遗传基因具有SV40启动子等启动子且表达构成弹性蛋白、胶原蛋白等细胞外基质的蛋白质。当使用COS细胞等上述传代细胞时，能够支持导入的基因的复制，能够通过大量的基因表达而高效地制造以细胞外基质作为主成分的立体组织体。
在上述种植工序中，种植后的全部细胞在包覆培养面上的密度相对于上述包覆培养面的表面积，优选为90～100％汇合，更优选为95～100％汇合，进一步优选为99～100％汇合。种植的细胞有时在进行增殖时性质会发生变化。当种植的细胞密度为上述范围时，种植的细胞不易增殖，能够在细胞增殖前形成缠绕于轴周围的环状的立体组织体，因此能够形成包含与种植时同样性质的细胞的立体组织体。
根据细胞的种类，作为种植后的全部细胞在包覆培养面上的密度，优选为20～15000个/mm2。另外，种植的细胞为活细胞。
在上述种植工序中，从不使种植的细胞分散于培养面的下侧、细胞易于与包覆培养面粘附的观点出发，可以在培养面的外侧端部设置壁面。此外，可以将本实施方式(III)的立体组织体的制作装置放入到具有比培养面的外径稍大的内径的容器中(参考图21)。由此，种植的细胞不易落到培养面的下侧，能够使种植的细胞与包覆培养面粘附。另外，关于培养面的外径与上述容器的内径的差，从种植的细胞不易从缝隙落下且不妨碍培养基的扩散的观点出发，优选15.0mm以下。
细胞的种植能够例如将预先静置于37℃的培养箱中的立体组织体的制作装置取出放在室温的净化台上来进行。
另外，细胞优选在培养基中稀释而种植。作为稀释的培养基，只要是能够培养细胞的培养基则没有特别限定。
(第1次的培养工序)
作为对种植的细胞进行培养的条件，能够使用例如通常的37℃的细胞培育箱而进行。细胞的培养优选连续进行直到得到缠绕于轴周围的环状的立体组织体，具体而言，优选培养10～96小时，更优选培养15～48小时。
在上述包覆培养面粘附、培养的细胞朝向包覆培养面的内侧进行自凝聚，以环状的形态缠绕于轴周围。就缠绕于轴周围的环状的立体组织体而言，在该立体组织体内具有存活的细胞。
作为缠绕于轴周围的环状的立体组织体，可举出以细胞作为主成分的立体组织体，也可以是由细胞构成的立体组织体。此外，缠绕于轴周围的环状的立体组织体可以为如下的立体组织体：分泌构成细胞外基质的蛋白质等而构建细胞外基质、从而成为以细胞外基质作为主成分的立体组织体。此外，缠绕于轴周围的环状的立体组织体还可以为包含由细胞分泌的物质(例如，构成细胞外基质的蛋白质等蛋白质等)的立体组织体，优选为以由细胞分泌的物质作为主成分的立体组织体，也可以为仅由细胞分泌的物质构成的立体组织体。作为上述由细胞分泌的物质，可举出例如蛋白质、糖、脂质等，优选蛋白质。
在此，“作为主成分”是指相对于立体组织体的质量(100质量％)超过50质量％，优选60质量％以上，更优选70质量％以上。
优选在全部的包覆培养面种植细胞，对种植的细胞进行培养而得到立体组织体。
(培养面移动工序)
本实施方式(III)的立体组织体的制作方法优选进一步包含以下工序的反复操作：培养面移动工序，在得到缠绕于轴周围的环状的上述立体组织体后，使上述培养面在上述轴的延伸方向移动；种植工序(在本发明(III)中，有时称为“第2次以后的种植工序”)，在上述移动后的上述包覆培养面上种植至少1种细胞；培养工序(在本发明(III)中，有时称为“第2次以后的培养工序”)，对种植的上述细胞进行培养，得到与缠绕于轴周围的环状的上述立体组合体邻接的、缠绕于轴周围的环状的立体组织体。即，经过第1次的种植工序、第1次的培养工序而得到环状的立体组织体后，可以包含培养面移动工序、第2次以后的种植工序以及第2次以后的培养工序的重复操作。
另外，从不通过人手操作而能够更无菌地、卫生地进行操作的观点出发，培养面移动工序、第2次以后的种植工序、第2次以后的培养工序的操作可以使用计算机等控制自动地进行。
培养面移动工序为设置于在上次的种植工序中得到缠绕于轴周围的环状的上述立体组织体后的工序。培养面移动工序可以设置于在上次的培养工序中刚刚得到缠绕于轴周围的环状的上述立体组织体后，也可以空出间隔(例如，1分钟～96小时的间隔等)而设置。
在上述培养面移动工序中，作为使培养面在轴的延伸方向移动的距离，优选为0.01～50mm，更优选为0.1～10mm。
另外，经过第1次的种植工序、第1次的培养工序而得到的环状的立体组织体、和经过第2次的种植工序、第2次的培养工序而得到的环状的立体组织体之间可以细胞彼此粘附，也可以分离。作为分离的2个环状的立体组织体之间的距离，可举出使培养面在轴的延伸方向移动的上述距离。能够通过下述的方法而容易地将分离的2个环状的立体组织体连接：通过环状的立体组织体内的细胞进行伸缩、迁移等，2个环状的立体组织体内的细胞彼此粘附，由此2个环状的立体组织体连接；2个环状的立体组织体经由2个环状的立体组织体内的细胞分泌的物质(例如，蛋白质等)而连接；在2个环状的立体组织体之间加入另外制作的蛋白质、细胞等而使2个环状的立体组织体连接；通过上述方法的组合而使2个环状的立体组织体连接等。另外，在培养面的移动时，可以固定培养面而移动轴，也可以固定轴而移动培养面，也可以移动培养面和轴。
另外，从控制立体组织体的厚度的观点出发，能够通过例如不设置培养面移动工序，而设置第2次以后的种植工序和第2次以后的培养工序、或设置第2次以后的种植工序和第2次以后的培养工序的重复操作，从而在上次种植工序中得到的缠绕于轴周围的环状的上述立体组织体的周围，进一步缠绕其它环状的立体组织体，将立体组织体的一部分加厚。
此外，在缠绕于轴周围的环状的上述立体组织体的周围进一步缠绕其它环状的立体组织体后，能够通过设置培养面移动工序，继续同样的操作，从而加厚整个立体组织体。通过改变形成缠绕于轴周围的环状的立体组织体的细胞以及形成缠绕于其周围的环状的立体组织体的细胞的种类，从而能够得到具有不同细胞的层的立体组织体。
(第2次以后的种植工序)
作为上述第2次以后的种植工序，可举出与第1次的种植工序同样的工序。
在上述第2次以后的种植工序中使用的细胞的种类、浓度等可以与第1次的种植工序相同，也可以不同。此外，在第2次以后的种植工序中使用的细胞的种类、浓度等可以与第2次以后的各次的种植工序相同，也可以不同。
(第2次以后的培养工序)
作为对种植的细胞进行培养的条件，可举出与上述的第1次的培养工序同样的条件。
上述第2次以后的培养工序的条件等可以与第1次的培养工序相同，也可以不同。此外，第2次以后的培养工序的条件等可以与第2次以后的各次的培养工序相同，也可以不同。
通过第2次以后的培养工序，从而可形成与上次的培养工序中得到的缠绕于轴周围的环状的上述立体组织体(上次的环状的立体组织体)邻接的、缠绕于新的轴周围的环状的立体组织体(新的环状的立体组织体)。上次的环状的立体组织体和新的环状的立体组织体通过例如在37℃培养1小时～30日而互相粘附，得到管腔状的立体组织体。
上述培养面移动工序、上述第2次以后的种植工序、上述第2次以后的培养工序的重复操作次数能够通过管腔状的立体组织体的厚度、长度来适当地选择，优选例如重复1～20次，更优选重复1～10次。
在制造在包含细胞外基质的立体组织体等的包含由种植工序中种植的细胞分泌的物质(特别是蛋白质)的立体组织体的情况下，可以设置例如在培养工序后除去立体组织体中包含的细胞的工序。作为除去立体组织体中包含的细胞的方法，可举出例如高压处理、醇处理、表面活性剂处理等处理、在细胞难以生存的条件进行培养等使细胞死亡的方法等。通过设置除去立体组织体中包含的细胞的工序，从而能够除去立体组织体中的至少一部分的细胞。
此外，也可以使用多种细胞制造立体组织体而仅除去特定的细胞(例如，从包含软骨细胞、以及掺入有表达构成细胞外基质的蛋白质的基因的COS细胞的立体组织体中仅除去COS细胞)。作为仅除去特定的细胞的方法，可举出例如以下方法：增大细胞对抗生物质的敏感性而在包含抗生物质的培养基中进行培养、仅对想要残留在得到的立体组织体中的细胞赋予对抗生物质的耐性而在包含抗生物质的培养基中进行培养等在仅特定的细胞在能够存活或难以存活的条件下进行培养等方法。
本实施方式(III)的立体组织体的制作方法中得到立体组织体可以为环状的立体组织体、也可以为管腔状的立体组织体。立体组织体的内径优选为0.01～100mm，更优选为0.1～50mm。此外，立体组织体的外径优选为0.1～120mm，更优选为0.2～70mm。管腔状的立体组织体的长度优选为0.1～300mm，更优选为1～250mm。
本实施方式(III)的立体组织体的制作方法中得到的立体组织体可以是以细胞作为主成分的立体组织体，也可以是以细胞外基质作为主成分的立体组织体等的包含由细胞分泌的物质的立体组织体。
作为制作以细胞外基质作为主成分的立体组织体的优选的条件，可举出例如以下条件：i)使用胶原蛋白、层粘附蛋白、纤连蛋白等细胞基质的产生能力高的细胞(例如，成纤维细胞、间充质细胞)；ii)在培养基中添加促成细胞外基质产生的抗坏血酸；iii)降低细胞的种植密度、提高细胞外基质相对于细胞的比率；iv)通过增加对缠绕于轴周围的环状或管腔状等立体组织体进行培养的时间(例如，上述第1次的培养工序和/或上述第2次的培养工序中培养24～350小时(优选48～170小时))从而增加细胞外基质的产生(分泌)量、使细胞外基质的结合(例如，胶原蛋白纤维的结合)成熟；v)通过使用表面具有孔的轴，从而向细胞稳定地供给营养和氧，且通过使细胞的代谢产物易于向培养基中扩散，从而促进细胞外基质的产生；vi)通过增大培养面移动工序中的培养面的移动距离，从而降低轴的延伸方向的细胞密度等。
作为得到的以细胞外基质作为主成分的立体组织体，可举出例如能够用于人工血管、人工气管等的胶原蛋白性的管腔状生物管。
本实施方式(III)的立体组织体可举出例如能够用于人工血管、人工气管的，包含在种植工序中种植的细胞的立体组织体；以由细胞分泌的蛋白质作为主成分的立体组织体、包含细胞外基质的立体组织体、以细胞外基质作为主成分的立体组织体等包含由细胞分泌的物质的立体组织体等。
作为能够用于人工血管的立体组织体，可举出例如使用以下的方法得到立体组织体。
在第1次的种植工序、第1次的培养工序中，在轴周围得到血管内皮细胞的环状的立体组织体(可以通过例如继续2～3次血管内皮细胞的种植工序、培养工序而制成厚的血管内皮细胞的环状的立体组织体)后，在第2次的种植工序、第2次的培养工序中，在上述血管内皮细胞的环状的立体组织体的周围，缠绕平滑肌细胞的环状的立体组织体(可以通过例如继续3～30次平滑肌细胞的种植工序、培养工序而制成厚的平滑肌细胞的立体组织体)，制成具有轴周围的血管内皮细胞层和血管内皮细胞层的外侧的平滑肌细胞层的2层结构的环状的立体组织体。进而，通过设置培养面移动工序，进行同样的操作，从而能够得到在内壁具有血管内皮细胞层、在其外周围具有平滑肌细胞层的、具有与生物体中的血管类似结构的2层结构的环状或管腔状的立体组织体。
此外，在上述立体组织体中，从形成各层的细胞不易混杂在一起的观点出发，以及调节血管的强度、柔软性的观点出发，能够通过例如在形成血管内皮细胞层的工序和形成平滑肌细胞层的工序之间设置对间充质细胞、成纤维细胞等分泌胶原蛋白、弹性蛋白的细胞进行种植、培养的工序；用胶原蛋白的管、弹性蛋白的管(例如，本实施方式(III)的立体组织体的制造方法中制造的包含由细胞分泌的蛋白质的立体组织体等)包覆血管内皮细胞层等的方法，从而在血管内皮细胞层和平滑肌细胞层之间，配置以胶原蛋白、弹性蛋白等作为主成分的(特别是以弹性蛋白作为主成分)、使血管内皮细胞和平滑肌细胞不易混杂在一起的具有屏障功能的层。通过配置像生物体血管中存在的内弹性板那样的具有屏障功能的上述层，从而可防止具有迁移性的细胞在形成立体组织体后在各层间移动，得到具有更接近于生物体血管的结构的立体组织体。
作为能够用于人工气管的立体组织体，可举出例如使用以下的方法得到立体组织体。
通过第1种植工序、第1培养工序而得到软骨细胞的环状的立体组织体(a)后，设置培养面移动工序，通过第2种植工序、第2培养工序，形成与软骨细胞的环状的立体组织体邻接的、新的成纤维细胞的环状的立体组织体(b)。通过适当地重复上述工序，从而能够得到例如在轴的延伸方向上，按照a-b-b-a-b-b等的顺序环状的立体组织体重叠了的管腔状的立体组织体。另外，在环状的立体组织体之间，可以设置以细胞外基质作为主成分的环状的立体组织体、包含由细胞分泌的物质的立体组织体、包含分泌构成细胞外基质的成分等物质的细胞的环状的立体组织体等。此外，从调节强度的观点出发，可以用胶原蛋白的管、弹性蛋白的管(例如，本实施方式(III)的立体组织体的制造方法中制造的包含由细胞分泌的蛋白质的立体组织体等)包覆得到的管腔状的立体组织体。
另外，在仅使用软骨细胞的环状的立体组织体的情况下，能够使用由软骨细胞分泌的细胞外基质连接软骨细胞的环状的各立体组织体，形成人工气管。从人工气管的强度的观点出发、以及移植后血管易于爬入的观点出发，人工气管优选包含软骨细胞的环状的立体组织体和成纤维细胞的环状的立体组织体。
作为包含由细胞分泌的物质的立体组织体，可举出例如包含使用以下方法得到蛋白质(例如，构成细胞外基质的蛋白质)等物质的立体组织体。
使用COS细胞而形成环状或管腔状的立体组织体，使COS细胞分泌蛋白质等，上述COS细胞导入了表达载体，该表达载体导入有遗传基因，该遗传基因具有SV40启动子序列，且表达构成弹性蛋白、胶原蛋白等细胞外基质的蛋白质。在培养工序后，通过高压处理、醇处理、表面活性剂处理等处理、在难以存活的条件(例如，增大COS细胞对抗生物质的敏感性而在包含抗生物质的培养基中培养COS细胞等)下培养COS细胞等使其死亡等方法，从而使COS细胞死亡并除去。另外，本实施方式(III)的立体组织体也可以是并未完全除去细胞而包含死亡的细胞、存活的细胞等的立体组织体。
得到的包含构成细胞外基质的蛋白质的立体组织体，能够用于例如增强本实施方式(III)的制造方法中得到立体组织体的强度的包覆材料、人工血管、心肌修补材料、缺陷修补填充材料等。
以下，对本实施方式(III)的立体组织体的制作方法的一个例子使用图22、图23、图27进行说明。
图22为本实施方式(III)的一个例子的立体组织体的制造方法的概略图。
在轴穿过培养面的通孔的立体组织体的制作装置(参考图22(i))的培养面，涂敷温度响应性聚合物并包覆，准备包覆培养面(参考图22(ii))。另外，在该例子中，培养面与轴相接。然后，将立体组织体的制作装置放入具有比培养面的外径稍大的内径的容器中，浸渍于培养基，种植细胞(第1次的种植工序、参考图22(iii))。种植的细胞与包覆培养面粘附(参考图22(iv))。另外，在该例子中，细胞的密度为100％汇合。然后，与包覆培养面粘附的细胞开始向包覆培养面中央部凝聚，端部远离包覆培养面并开始翻卷，成为端部翻卷的细胞结构体(参考图22(v))。然后，进一步继续凝聚成为环状，得到缠绕于轴周围的环状的立体组织体(参考图22(vi))。在此，由于缠绕于轴周围的环状的立体组织体是以不从轴上脱落的程度缠绕于轴，因此即使在轴不具有细胞粘附性的情况下，在立体组织体的制作中缠绕的位置也不会有大的变化。然后，使培养面向轴的延伸方向下侧移动，设置形成与得到的环状的立体组织体的下侧邻接的其它环状的立体组织体的间隙(培养面移动工序，参考图22(vii))。然后，通过再次种植细胞(第2次的种植工序、参考图22(viii))并进行培养，从而得到层叠了环状的立体组织体的管腔状的立体组织体。通过重复进行培养面移动工序、第2次以后的种植工序、第2次以后的培养工序，从而可得到长的管腔状的立体组织体(参考图22(ix))。
另外，在上述例子中，也能够通过例如减少种植的细胞数、或在得到缠绕于轴周围的环状的立体组织体后静置，等待构成细胞外基质的蛋白质的分泌等，从而得到以细胞外基质作为主成分的立体组织体。另外，上述的全部工序或一部分的工序可以使用计算机等控制而自动地进行。
图23为使用了培养面和轴之间有间隙的立体组织体的制作装置的、本实施方式(III)的一个例子的立体组织体的制作方法的概略图。
在轴穿过培养面的通孔的立体组织体的制作装置(参考图23(i))的培养面，涂敷温度响应性聚合物并包覆，准备包覆培养面(参考图23(ii))。另外，在该例子中，轴的直径比通孔的孔径小，培养面和轴之间有间隙。然后，将立体组织体的制作装置放入具有比培养面的外径稍大的内径的容器中，浸渍于培养基，种植细胞(第1次的种植工序、参考图23(iii))。种植的细胞与包覆培养面粘附(参考图23(iv))。另外，在该例子中，细胞的密度为100％汇合。然后，与包覆培养面粘附的细胞开始向包覆培养面中央部凝聚，端部远离包覆培养面并开始翻卷，成为端部翻卷的细胞结构体(参考图23(v))。然后，进一步继续凝聚而成为环状，凝聚的细胞结构体以越过培养面和轴之间的间隙的方式缠绕于轴周围，形成环状的立体组织体(参考图23(vi))。然后，使培养面向轴的延伸方向上侧移动，设置形成与得到的环状的立体组织体的上侧邻接的其它环状的立体组织体的间隙(培养面移动工序，参考图23(vii))。然后，通过再次种植细胞(第2次的种植工序、参考图23(viii))并进行培养，从而得到层叠了环状的立体组织体的管腔状的立体组织体。通过重复进行培养面移动工序、第2次以后的种植工序、第2次以后的培养工序，从而可得到长的管腔状的立体组织体(参考图23(ix))。
另外，上述的全部工序或一部分的工序可以使用计算机等控制而自动地进行。
图27为使用了具有多个培养面且培养面和轴之间有间隙的立体组织体的制作装置的、本实施方式(III)的一个例子的立体组织体的制作方法的概略图。
在1根轴穿过2个培养面的通孔的立体组织体的制作装置(参考图27(i))的2个培养面，涂敷温度响应性聚合物并包覆，准备包覆培养面(参考图27(ii))。另外，在该例子中，轴的直径比通孔的孔径小，培养面和轴之间有间隙。然后，将立体组织体的制作装置放入具有比培养面的外径大的内径的容器中，浸渍于培养基，种植细胞(第1次的种植工序、参考图27(iii))。种植的细胞与包覆培养面粘附(参考图27(iv))。另外，在该例子中，细胞的密度为100％汇合。然后，与包覆培养面粘附的细胞开始向包覆培养面中央部凝聚，端部远离包覆培养面并开始翻卷，成为端部翻卷的细胞结构体(参考图27(v))。然后，进一步继续凝聚而成为环状，凝聚的细胞结构体以越过培养面和轴之间的间隙的方式缠绕于轴周围，形成环状的立体组织体(参考图27(vi))。然后，通过进行培养，从而2个环状的立体组织体连接，得到管腔状的立体组织体(参考图27(vii))。
另外，在图27(vii)中，由于易于看见管腔状的立体组织体，因此省略了培养面的图示。在图27中，由于培养面和轴之间有间隙，因此即使在有培养面的状态、或即使除去了培养面的状态，2个环状的立体组织体也能连接，得到管腔状的立体组织体。
此外，通过增加培养面的数目、设置培养面移动工序、第2次以后的种植工序、第2次以后的培养工序等方法，从而也能够得到更长的管腔状的立体组织体。
另外，上述的全部工序或一部分的工序可以使用计算机等控制而自动地进行。
[[发明(IV)]]
(细胞结构体的制造方法)
本发明(IV)的实施方式的细胞结构体的制造方法(以下，也称为“本实施方式(IV)的制造方法”。)为在培养面制备用温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物包覆的包覆区域，在该包覆区域中形成细胞悬浮液的液滴，在该液滴中进行细胞培养的方法。
更具体而言，在本实施方式(IV)的制造方法的一个例子中，如图32所示，首先，准备培养面(参考图32(i))，在培养面上配置温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物(参考图32(ii))，用温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物包覆培养面而制备包覆区域(参考图32(iii))，在包覆区域形成细胞悬浮液的液滴(参考图32(iv))，在液滴中进行细胞培养(参考图32(v))，形成细胞结构体(参考图32(vi))。
在此，在本实施方式(IV)的制造方法中，如后述那样，从得到自发形成细胞结构体的效果的观点出发，重要的是将在培养面制备的包覆区域的表面Zeta电位设为0～50mV。
以下，对本实施反式(IV)的制造方法中的作用效果进行记载。
在作为细胞结构体的制造方法而公知的悬滴法中，在管状构件的前端制备细胞悬浮液的液滴，利用液滴的表面张力保持液滴的形状呈球状，并且将液滴保持规定时间(例如，2周左右)，由此在液滴中制造球状的细胞结构体。然而，用于保持液滴的操作复杂，难以简便地制造球状的细胞结构体。
另一方面，根据本实施方式(IV)的制造方法，由于能够将液滴以载置于培养面的状态进行保持，因此能够简便地制造球状的细胞结构体。
此外，可考虑例如使用被划分为培养面、壁面的具有1个或多个孔的细胞培养器，在有孔的培养面制备包覆区域和不是包覆区域的非包覆区域，在孔中加入细胞悬浮液，但相对于该方法，本实施方式(IV)的制造方法具有下述这样的效果。
在上述方法中，以包覆区域、非包覆区域均被细胞悬浮液浸湿的方式对细胞培养器加入细胞培养液，因此在非包覆区域中种植的细胞有可能粘附。这时，非包覆区域的细胞会阻碍包覆区域中的调控了形状的球状的细胞结构体的形成。因此，在使用具有壁面的细胞培养器的情况下，有必要对培养面的全部或一部分实施赋予细胞非粘附性的处理。而且，这时由于该处理有时会导致细胞中具有毒性的物质在培养基中溶出。
另一方面，根据本实施方式(IV)的制造方法，由于包覆区域中的细胞悬浮液的液滴与非包覆区域隔离，因此不需要进行上述的赋予细胞非粘附性的这样的处理，而且，对细胞的生长产生不良影响的可能性也降低。
此外，在上述的方法中，在孔中加入细胞悬浮液后，在包覆区域细胞粘附，而在实施了赋予细胞非粘附性的这样的处理的非包覆区域细胞不会粘附。非包覆区域中的未粘附的细胞有可能产生细胞凋亡或产生热休克蛋白，对包覆区域中已粘附的细胞的生长产生不良影响。因此，在该方法中，有时也需要通过更换培养基等操作而从孔中除去非包覆区域的细胞。
另一方面，根据本实施方式(IV)的制造方法，在通过用温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物包覆而具有细胞粘附性的包覆区域中，以与非包覆区域隔离的状态形成细胞悬浮液的液滴，因此，除去非包覆区域的细胞的必要性小，因此能够降低使用的细胞的量，此外，进行更换培养基的操作的必要性小，因此能够降低使用的培养基的量。综上所述，根据本实施方式(IV)的制造方法，能够降低制造成本。
在本实施方式(IV)的制造方法中，能够直接利用在384孔细胞培养板等中使用的自动培养装置(例如，在使用16道喷嘴向多孔板注入细胞悬浮液的过程中，能够在涂敷有温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物的培养面吐出细胞悬浮液的液滴)，此外，细胞培养板的分析仪器也能够利用在该技术领域中通常使用的那些。因此，根据本实施方式(IV)的制造方法，能够抑制细胞结构体的制造成本，并且在扩大上述装置、机器的用途的意义上来说能够产生经济效果。
在本发明(IV)的实施方式的细胞结构体的制造方法中，如上所述，重要的是将包覆区域的表面Zeta电位设为0～50mV。如果将表面Zeta电位设为0mV以上，则能够使带负电的细胞粘附，此外，如果设为50mV以下，则能够减轻细胞毒性。
根据与上述同样的理由，表面Zeta电位优选为0～35mV，更优选为10～25mV。
表面Zeta电位能够通过调节温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物中的C/A比从而进行调节。
根据具有上述特定范围的表面Zeta电位的培养面，仅通过在合适的培养条件培养细胞，就能够简便地形成具有块状(颗粒状)的构造的细胞结构体(球形)。
该现象可推测是：通过设为上述特定范围的表面Zeta电位，从而能够对培养面赋予不会引起细胞毒性的微弱的正电荷，此外还能够确保种植的细胞快速粘附、促进细胞活性的提高和细胞外基质的分泌，进而还能够适当地抑制细胞迁移而增强细胞间的结合。
在具有上述特定范围的表面Zeta电位的培养面中形成细胞结构体的现象的再现性极大地提高，能够制作均匀的细胞结构体。
使用现有的细胞培养器而制作的细胞的块，只不过是不能与细胞非粘附性的培养面粘附的细胞聚集的产物，因此，存在构成细胞的块的细胞的生物能力低的问题。
另一方面，使用本实施方式(IV)的制造方法而制造的细胞结构体(球形)由于是在经过在培养面上快速地粘附、增殖并且伸展这样的过程的基础上而形成的，因此细胞之间产生的细胞外基质丰富地存在。因此，细胞结构体自身的生物能力(活性)极其高。
而且，在本实施方式(IV)的制造方法中，关于细胞结构体的尺寸，实验者能够根据目的来适当确定，能够使尺寸具有一定分布，也能够使尺寸均匀。
细胞结构体的尺寸能够设为微小尺寸(例如，数百μm以下的尺寸)，可以设为50～1500μm直径，优选设为50～200μm直径。
此外，在本实施方式(IV)的制造方法中，由于能够在平板的培养面中制作细胞结构体，因此在对使用细胞培养器而制作的细胞结构体进行测定的情况下，能够直接使用显微镜观察该培养器。
进而，根据本实施方式(IV)的制造方法，细胞能够不与作为细胞培养器的培养面和壁的界限的培养面的外边缘粘附，能够长时间维持尺寸的均匀性。
以下，对本发明(IV)的实施方式的细胞培养器的制造方法中的各工序进行了详细记载。
在本实施方式(IV)的制造方法的一个例子中，首先，准备培养面(参考图32(i))。
在此，作为培养面，可以为细胞培养器的培养面，也可以为除细胞培养器以外的构件的培养面，可举出例如市售的板、皿、烧瓶、玻璃板、硅片等。
培养面可以为细胞粘附性也可以为细胞非粘附性。
另外，“细胞非粘附性”是指附着细胞(例如，成纤维细胞、肝细胞、血管内皮细胞等)在通常的培养条件下，不粘附或难以粘附的性质。
作为培养面的材质，可举出聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二酯(PET)、聚丙烯、聚丁烯、聚乙烯、聚碳酸酯等，从容易精密的成型加工、能够应用于各种灭菌法、且由于具有透明性而适用于显微镜观察的观点出发，优选聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二酯(PET)。
另外，通常的细胞培养用板由聚苯乙烯等塑料制成，但实施了表面处理(例如，等离子体处理)，细胞变得易于与培养面粘附。
另外，在本发明(IV)的细胞结构体的制造方法中，只要准备培养面即可，可以不使用细胞培养器。
接着，在培养面上配置温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物(参考图32(ii))。
以下，对在本发明(IV)的实施方式的制造方法中配置于培养面的温度响应性聚合物和温度响应性聚合物组合物进行详细描述。
作为实施方式(IV)中的温度响应性聚合物和温度响应性聚合物组合物，可举出与上述发明(I)中的温度响应性聚合物和温度响应性聚合物组合物同样的组合物，作为优选例也可举出与上述同样的优选例。
另外，在本实施方式(IV)中，(A-1)的温度响应性聚合物的制造方法并不限定于具有以下特征的方法，也可以为其它方法，该特征在于包含以下工序：制备工序，制备包含2-N,N-二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯(DMAEMA)的混合物；照射工序，对混合物照射紫外线，其中，在制备工序中，混合物还包含阻聚剂和水，在照射工序中，在非活性气氛下照射紫外线。
此外，在本实施方式(IV)中，基于(A-1)的温度响应性聚合物，通过如后述那样在合适的培养条件培养细胞，从而能够形成具有管腔状(管状)、以及块状(颗粒状)的结构的细胞结构体。
此外，在本实施方式(IV)中，(A-2)的温度响应性聚合物的制造方法并不限定于具有以下特征的方法，也可以为其它方法，该特征在于包含以下工序：第一聚合工序，对包含2-N,N-二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯(DMAEMA)的第一混合物照射紫外线；添加工序，在第一聚合工序中的聚合物的数均分子量达到规定值以上的时刻，在第一混合物中添加阴离子单体而制备第二混合物；第二聚合工序，对第二混合物照射紫外线。
此外，在本实施方式(IV)中，(C)的温度响应性聚合物组合物可以如上那样地包含2-N,N-二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯和/或其衍生物的聚合物，2-氨基-2-羟甲基-1,3-丙二醇，以及选自核酸、肝素、透明质酸、硫酸葡聚糖、聚苯乙烯磺酸、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚磷酸、硫酸化多糖、凝胶多糖和聚海藻酸及它们的碱金属盐中的一种以上阴离子型物质。
此外，在本实施方式(IV)中，作为上述(C3)中列举的阴离子型物质中的DNA，优选能够将iPS细胞、ES细胞、间充质干细胞等干细胞诱导分化成分化细胞、特别是诱导分化成心肌细胞、肝细胞、神经细胞、血管内皮细胞的DNA。
在此，在本实施方式(IV)的制造方法的一个例子中，可以在整个培养面制备包覆区域(参考图33(i)、(ii))，也可以在培养面制备多个包覆区域(参考图33(iii))。
在整个培养面制备包覆区域的情况下，可以使温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物流延到培养面。
在培养面制备多个包覆区域的情况下，作为温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物的配置(点样)方法，可举出利用8道微型移液管的技术、定量喷出溶液的点样印刷法(Spotter printing method)、旋转筛辊筒(Screen drum)印刷法等。
特别是在培养面制备多个包覆区域的情况下，
包覆区域的面积优选为0.1～30mm2。如果为上述范围，则易于得到目标的微小尺寸的球形。
包覆区域之间的距离优选为0.1～10mm。另外，“包覆区域之间的距离”是指包覆区域之间在培养面上的最短距离。如果设为0.1mm以上，则能够抑制邻接的包覆区域之间各自区域中种植的细胞彼此粘附。如果设为10mm以下，则能够高效地制作大量的细胞结构体(球形等)。
特别是在培养面制备多个包覆区域的情况下，包覆区域的数目可以根据实验者的目的来适当确定，可以设为2个以上，可以设为10个以上，也可以设为1000个以上。
特别是在培养面制备多个包覆区域的情况下，包覆区域的俯视形状优选为圆形、椭圆形、外轮廓线的内侧具有曲率中心的形状。
作为曲率半径，优选为0.1～50mm，进一步优选为1～10mm。
作为圆形的包覆区域的直径，优选为10μm～10mm，进一步优选为30μm～1500μm。
这些形状可以单独使用1种，也可以组合2种以上使用。
在本实施方式(IV)的制造方法的一个例子中，培养面的包覆区域的每单位面积具有的温度响应性聚合物的量优选为5.0～50ng/mm2，进一步优选为15～40ng/mm2。如果为上述范围，则易于得到易于形成细胞结构体的这样的效果。
在本实施方式(IV)的制造方法的一个例子中，温度响应性聚合物可以通过以下方法而包覆于细胞培养器的培养面，即，从水溶液状态沉积；溶液的涂敷以及溶剂的干燥；使用了放射线照射、低温等离子体照射、电晕放电、辉光放电、紫外线、自由基引发剂的接枝聚合等方法。
关于用温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物包覆培养面的方法、以及在成为包覆区域的多个培养面上的位置上配置温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物的方法，如后所述。
本实施方式(IV)的制造方法中的培养面，可以将细胞培养用板(例如，35mm皿)作为基底进行制作，能够优选用于再生医疗的领域中。
另一方面，培养面可以将微板(例如，96孔板等)作为基底进行制作，能够优选用于例如创新药的领域(特别是药剂筛选)中。
上述温度响应性聚合物或上述温度响应性聚合物组合物可以通过加热干燥、冷冻干燥、减压蒸馏等出去水分而溶解于甲醇、乙醇等醇、酮、酯等有机溶剂。在这些中，从表面张力和沸点低、且能够快速的干燥，能够更均匀地包覆温度响应性聚合物的观点出发，优选使其溶解于甲醇。此外，在溶解于有机溶剂的情况下，还可以添加聚乙二醇(PEG)、二甲基丙烯酰胺(DMAA)、甘油、TritonX、聚丙二醇等非离子性且亲水性的亲水性分子。
这样，在该制造方法的一个例子中，用温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物包覆培养面而制备包覆区域(参考图32(iii))。
在本实施方式(IV)的制造方法中，如上所述，重要的是将包覆区域的表面Zeta电位设为0～50mV，优选为0～35mV，进一步优选为10～25mV。
此外，在本实施方式(IV)的制造方法中，从提高本发明(IV)的效果的观点出发，水与培养面的包覆区域的接触角优选为50～90°，进一步优选为60～80°，特别优选为62～78°。
需要说明的是，水与包覆区域的接触角是指在包覆区域内的任意几个点上，按照JIS R3257测定的接触角的平均值。
如上所述，从提高与细胞表面之间的相互作用，从而提高细胞对包覆区域的粘附性的观点出发，优选包覆区域为具有规定程度以上的疏水性的区域。
水与培养面的包覆区域的接触角能够通过调节温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物中的疏水性基团的结构、量从而调节。
在本实施方式(IV)的制造方法的一个例子中，优选在各包覆区域中，使液滴的底面积比包覆区域的面积小。
在包覆培养面的工序中，在包覆区域的端部边缘与包覆区域的中央部分相比，相对于每单位面积的温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物的量多，有时包覆区域的端部边缘相对于中央部分凸起。在该情况下，与包覆区域粘附的细胞所成的细胞结构体的形状有难以调控的倾向。如果使液滴的底面积比包覆区域的面积小，则在包覆区域中，能够使细胞不粘附于温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物的量有可能变得不均匀的区域，因此易于制备调控了形状的细胞结构体。
根据与上述同样的理由，具体而言，在各包覆区域中，可以将液滴的底面积相对于包覆区域的面积的比例的上限设为99％以下，上限也优选为97％、95％、90％、80％、70％、60％、50％。
此外，可以将上述比例的下限设为10％以上，下限也优选为20％、30％。如果将上述比例设为10％以上，则能够高效地制备足够尺寸的细胞结构体。
在使用了本发明(IV)的实施方式的细胞培养器的细胞培养方法的一个例子中，在包覆区域形成细胞悬浮液的液滴(参考图32(iv))。
本实施方式(IV)的制造方法能够特别优选应用于：要求制造的细胞结构体的直径具有极其高的均匀性的细胞(例如，可用于创新药物试验的细胞、多能干细胞等)；为了精密控制分化状态而培养成本变得昂贵的细胞(具体而言，iPS细胞、ES细胞、间充质细胞、癌干细胞等干细胞、以及它们的分化诱导细胞；血管内皮细胞、脂肪细胞、脂肪干细胞、成纤维细胞、心肌细胞、成肌细胞等间充质细胞；HepaRA、HepaRG、HepG2、BxPC-3等上皮细胞等)。在原代细胞的情况下，只要选择形成群落的粘附性细胞即可，本领域技术人员能够适当选择。
在该制造方法的一个例子中，在包覆区域形成细胞悬浮液的液滴时，优选以底面的形状优选成为圆形的方式滴加细胞悬浮液。根据该方法，易于得到调控了形状的球状的细胞结构体。
在本实施方式(IV)的制造方法的一个例子中，优选液滴中包含的细胞的数目为3.0×105个/mL以下。
在种植细胞的工序中，在细胞密度过高的情况下，细胞以重叠的状态沉积，产生不与温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物接触的细胞。在该情况下，这样的与聚合物或聚合物组合物不接触的细胞可能会带来例如由于与其它细胞融合而导致其性质改变等这样的有害的影响。如果将液滴中包含的细胞的数目设为3.0×105个/mL以下，则能够使细胞在包覆区域以大致以单层进行沉积，能够在优选的条件下培养细胞。
此外，从制备足够尺寸的细胞结构体的观点出发，液滴中包含的细胞的数目优选设为1.0×104个/mL以上。
根据与上述同样的理由，液滴中包含的细胞的数量进一步优选为1.0×105个～3.0×105个/mL，特别优选为2.0×105个～3.0×105个/mL，本领域技术人员能够考虑种植的细胞的形态、尺寸等来适当调节。另外，上述细胞的数量表示活细胞的数量。
在该制造方法的一个例子中，优选将液滴的直径设为1μm～8mm。
当液滴的直径小于1μm时，培养基的量变得过少，因此可能会成为引起干燥等在细胞培养中不合适的环境。
当液滴的直径超过8mm时，细胞在液滴内沉积在聚合物或聚合物组合物上时，聚合物上所配置的细胞的细胞密度产生偏差，在多个地方产生球形(成为细胞凝聚的核的应力发生点为多个地方)，球形有可能难以成为正球状。
根据与上述同样的理由，液滴的直径进一步优选为100μm～4mm，特别优选为300μm～3mm。
在本实施方式(IV)的制造方法的一个例子中，从易于制备调控了形状的细胞结构体的观点出发，优选将液滴的量设为0.5～50μL，进一步优选设为1.0～40μL，特别优选设为5.0～25μL。
此外，在该制造方法的一个例子中，1个包覆区域可以形成1个液滴，也可以形成多个液滴。
特别是在1个包覆区域形成多个液滴的情况下，作为液滴之间的间隔(液滴之间的最接近距离)，优选为1～500μm。
当比1μm少时，液滴彼此有可能结合。当超过500μm时，有可能无法实现高效地大量生产球形这样的目的。
根据与上述同样的理由，液滴之间的间隔进一步优选为2～250μm，特别优选为5～100μm。
在该制造方法的一个例子中，在液滴中进行细胞培养(参考图32(v))的培养条件可以根据使用的细胞来适当确定，例如可以设为37℃、5％CO2气氛等。
在培养细胞时,可以使用通过水雾喷雾等而积极地将培养器内加湿的方法、通过使用磷脂，高级羧酸，液体石蜡等低比重且非活性油性成分的覆膜覆盖细胞悬浮液的液滴表面而抑制液滴中的水分挥发的方法。该方法特别是在细胞悬浮液的液滴的量小于10μL的情况下用于维持液滴特别有效。
然后，在该制造方法的一个例子中，通过进一步继续培养，从而形成细胞结构体(参考图32(vi))。
培养条件可以根据使用的细胞来适当确定，可以设为例如37℃、5％CO2气氛等。
这时，在具有特定特性的包覆区域中，能够简便地形成具有块状(颗粒状)的结构的细胞结构体。
以下，记载了本发明(IV)的实施方式的细胞结构体的制造方法中使用的优选的培养面。
优选的培养面包含玻璃制的培养面、以及从培养面开始的上述的本发明(IV)的实施方式的细胞结构体的制造方法中使用的温度响应性聚合物。
利用优选的培养面，由于玻璃自身具有对有机溶剂的耐性，因此能够使用有机溶剂清洗培养面，能够更加降低细胞毒性物质。
此外，该培养面能够不使用现有使用的伴随着照射放射线的接枝聚合的方法而制造(后述)，因此还能够降低因照射放射线而产生的聚合物的分解产物的量，能够对细胞的生长提供良好的环境。
作为玻璃制的培养面，可以为玻璃制的细胞培养器的培养面、玻璃板的表面等。
作为温度响应性聚合物，可举出上述的(A)包含2-N,N-二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯(DMAEMA)单元和阴离子型单体单元的温度响应性聚合物；(B)包含N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)单元、阳离子型单体单元以及阴离子型单体单元的温度响应性聚合物等。
更具体而言，作为该优选的细胞培养器的制造方法，可举出例如以下方法：(a)使用具有乙烯基的硅烷偶联剂对玻璃制的培养面进行处理，在经处理的培养面上，在水的存在下，照射紫外线并且使2-N,N-二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯(DMAEMA)聚合；
(b)使用具有卤化烷基的硅烷偶联剂对玻璃制的培养面进行处理，此外，通过卤化烷基和N,N-二烷基取代二硫代氨基甲酸的取代反应，将N,N-二烷基取代二硫代氨基甲酰基导入培养面，在该培养面上，将N,N-二烷基取代二硫代氨基甲酰基作为自由基聚合引发点，在水的存在下，照射紫外线并且使2-N,N-二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯(DMAEMA)进行引发转移终止剂聚合。
关于上述(a)方法，作为具有乙烯基的硅烷偶联剂，可举出如下的具有乙烯基的硅烷偶联剂：作为具有与有机物反应、相互作用的功能的反应性官能团(Y)而具有选自乙烯基、苯乙烯基、甲基丙烯酰基、丙烯酰基中的至少1种；且作为具有与玻璃反应、相互作用的功能的反应性官能团(X)而具有选自烷氧基、卤素中的至少1种。
具体而言，可举出乙烯基三甲氧基硅烷、对苯乙烯三甲氧基硅烷、3-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷、3-丙烯酰氧基丙基三乙氧基硅烷等。
使用硅烷偶联剂的处理条件可以如通常的方法那样。
作为在经处理的培养面上的DMAEMA的聚合方法，可以如关于(A)包含2-N,N-二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯(DMAEMA)单元和阴离子型单体单元的温度响应性聚合物所记载的那样。
特别地在上述(a)的方法中优选设为下述条件。
·作为紫外线照射中的紫外线的波长，从降低聚合物的分解产物的量的观点出发，优选为近紫外线的波长，进一步优选为330～400nm，特别优选为350～390nm。
·当从经处理的培养面的背面照射光(以透过玻璃的方式照射光)时，由于能够屏蔽光源中包含的短波长的紫外线，选择性地照射近紫外线区域的波长的光线，且能够从具有乙烯基的硅烷偶联剂侧向DMAEMA侧照射光，使聚合反应优先于单体的分解等，因此优选。
关于上述(b)方法，作为具有卤化烷基的硅烷偶联剂，可举出如下的具有乙烯基的硅烷偶联剂：具有卤化烷基、更具体而言具有选自对氯甲基苄基、3-氯丙基、对溴甲基苄基、3-溴丙基中的至少1种作为具有与有机物反应、相互作用的功能的反应性官能团(Y)；且具有选自烷氧基、卤素中的至少1种作为具有与玻璃反应、相互作用的功能的反应性官能团(X)。
具体而言，可举出3-氯丙基三甲氧基硅烷、对氯甲基苄基三氯硅烷、3-氯丙基三氯硅烷等。
使用硅烷偶联剂的处理条件可以如通常的方法那样。
将被导入到玻璃表面(培养面)的N,N-二烷基取代二硫代氨基甲酰基作为自由基聚合引发点的、2-N,N-二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯(DMAEMA)的引发转移终止剂聚合的反应条件，可以如通常的方法那样。
特别地在上述(b)的方法中优选设为下述条件。
·作为紫外线照射中的紫外线的波长，从降低聚合物的分解产物的量的观点出发，优选为近紫外线的波长，进一步优选为330～400nm，特别优选为350～390nm。
·当从经处理的培养面的背面照射光(以透过玻璃的方式照射光)时，由于能够屏蔽光源中包含的短波长的紫外线，选择性地照射近紫外线区域的波长的光线，且能够从硅烷偶联剂侧向DMAEMA侧照射光，使聚合反应优先于单体的分解等，因此优选。
以上，参考附图对本发明(IV)的细胞结构体的制造方法的实施方式进行了示例说明，但本发明(IV)的细胞结构体的制造方法并不限定于上述的例子，能够在上述实施方式(IV)加以适当变更。
[[发明(V)]]
以下，参考附图对本发明(V)的细胞结构体的制造方法、本发明(V)的细胞结构体、本发明(V)的细胞培养器的实施方式进行详细地示例说明。
本发明(V)的实施方式(以下，称为“本实施方式(V)”)的细胞结构体的制造方法包含以下工序：
准备工序，在细胞培养器的培养面准备用温度响应性聚合物和/或温度响应性聚合物组合物包覆的第一包覆区域、以及设置于上述第一包覆区域的端部的用细胞粘附性物质包覆的多个第二包覆区域；
种植培养工序，在上述第一包覆区域和上述第二包覆区域种植细胞，对上述细胞进行培养。
本实施方式(V)中的一个例子的制造方法包含制备温度响应性聚合物和/或温度响应性聚合物组合物的制备工序、上述的准备工序以及上述的种植培养工序。
在图35(i)～(viii)中，对本实施方式(V)中的一个例子的细胞结构体的制造方法的概要进行了示例。
以下，记载了本实施方式(V)中的一个例子的细胞结构体的制造方法中的各工序的详细过程。
(制备工序)
作为实施方式(V)中的制备工序，可举出与上述发明(I)中的制备工序同样的工序，作为优选例也可举出同样的优选例。
(准备工序)
在一个例子的制造方法中，接着，在细胞培养器的培养面准备用温度响应性聚合物和/或温度响应性聚合物组合物包覆的第一包覆区域、以及设置于上述第一包覆区域的端部的用细胞粘附性物质包覆的多个第二包覆区域(准备工序)(参考图35(i)～(iii))。
在此，除第一包覆区域和第二包覆区域以外的培养面可以为细胞粘附性，也可以为细胞非粘附性，从易于得到期望形状的细胞结构体的观点出发，优选为细胞非粘附性。
细胞非粘附性的培养面的制备方法没有特别限定，可以使用例如具有细胞非粘附性的培养面的细胞培养器；可以使用例如SUMILON公司制造的Prime Surface(注册商标)；可以使用细胞非粘附性的片、内底等；可以使用未处理的具有聚苯乙烯制的培养面的细胞培养器。
在此，如图35所示，从抑制细胞培养器和壁的接触、调控细胞结构体的形状的观点出发，优选第一包覆区域和第二包覆区域设置成被非包覆区域(培养面没有特地进行包覆的区域)包围(参考图35(ii)、(iii))。
第一包覆区域的面积没有特别限定，例如在使用的细胞培养器的培养面来制造1～30mm尺寸的细胞结构体的情况下，可以设为1～750mm2，优选为10～700mm2。
第一包覆区域的形状没有特别限定，俯视看可以设为圆形(圆、椭圆等)、矩形(正方形、长方形、三角形等)、线形，矩形的角也可以为圆角。
其中，从控制细胞的凝聚样式的观点出发，上述形状优选在规定方向上延伸的形状，更具体而言，优选存在长轴方向和短轴方向的形状、外轮廓线上的任意2点之间的距离存在最大和最小的形状，进一步优选长方形。
在第一包覆区域的形状为矩形的情况下，作为其长宽比(长边长：短边长)，可以设为1～50，优选为5～50，更优选为10～50。
在第一包覆区域的形状为长方形的情况下，从控制细胞结构体的形状的观点出发，其宽度优选为0.1～50mm，更优选为0.1～30mm，其长优选为0.1～150mm，更优选为0.1～100mm。
作为第一包覆区域表面的Zeta电位，优选为0～50mV，更优选为0～35mV，进一步优选为10～25mV。通过使Zeta电位为0mV以上，从而带负电的细胞易于粘附。此外，通过使Zeta电位为50mV以下，从而能够减轻细胞毒性。
此外，通过将Zeta电位设为上述范围，从而仅通过在合适的培养条件下培养细胞，就能够更加简便地制作具有块状(颗粒状)的结构的细胞结构体。该现象可推测是由于以下原因：通过将表面Zeta电位设为上述范围，从而能够对第一包覆区域表面赋予不会引起细胞毒性的微弱的正电荷，此外还能够确保种植的细胞快速粘附、促进细胞活性的提高和细胞外基质的分泌，进而还能够适当地抑制细胞迁移而增强细胞间的结合。
需要说明的是，Zeta电位是指将用羟丙基纤维素包覆聚苯乙烯胶乳而成的粒子(Zeta电位：-5～+5mV)作为标准探测粒子，使用Zeta电位仪(例如，型号“ELSZ”、大塚电子公司制造等)进行测定，用Smoluchowski公式算出的值。
从提高本发明(V)的效果的观点出发，作为水与第一包覆区域表面的接触角，优选为50～90°，更优选为60～80°，进一步优选为62～78°。
需要说明的是，水与第一包覆区域的接触角是指在包覆区域内的任意几个点上，按照JIS R3257测定的接触角的平均值。
作为第二包覆区域中包覆的细胞粘附性物质，可举出层粘附蛋白、胶原蛋白、纤连蛋白、肽、阳离子型聚合物、聚苯乙烯等。作为上述肽，可举出具有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列的肽、具有8个以上连续的精氨酸残基的序列的肽等。作为上述阳离子型聚合物，可举出氨基苯乙烯等。在这些中，优选细胞粘附性高的层粘附蛋白、胶原蛋白、纤连蛋白。
此外，也能够优选使用包含上述列举的细胞粘附性物质的试剂，作为该试剂，可举出血清等。
上述细胞粘附性物质可以单独使用1种，也可以并用多种。
第二包覆区域的面积没有特别限定，例如在使用的细胞培养器的培养面来制造1～30mm尺寸的细胞结构体的情况下，可以设为0.1～75mm2，优选为0.1～10mm2。
第二包覆区域的形状没有特别限定，俯视时可以设为圆形(圆、椭圆等)、矩形(正方形、长方形、三角形等)，矩形的角也可以为圆角。
其中，从缓和细胞凝聚时对与第二包覆区域粘附的细胞施加的力的观点出发，上述形状优选圆形。
在第二包覆区域的形状为圆形的情况下，从控制细胞结构体的形状的观点出发，该直径优选为0.1～50mm，更优选为0.1～10mm。
上述第二包覆区域的面积(S2)相对于上述第一包覆区域的面积(S1)的比例(S2/S1)没有特别限定，从易于控制细胞的凝聚样式的观点出发，优选为0.001～1.0，更优选为0.01～0.5。
在本实施方式(V)中，第一包覆区域和第二包覆区域可以互相重叠，也可以彼此的外轮廓线相接，还可以彼此的最短距离仅为0.1～10mm地分离。
另外，第一包覆区域在培养面中的位置、以及第二包覆区域在培养面中的位置可以为各自的重心的位置。
在本实施方式(V)中，第二包覆区域只要设置于第一包覆区域的端部即可，在此，端部是指自第一包覆区域的外轮廓线起向内侧0.01～1mm的区域。
在本实施方式(V)中，设置于第一包覆区域的端部的第二包覆区域的数目只要是多个则没有特别限定，可以设为3个以上，4个以上等。另外，在多个第二包覆区域之间，包覆的细胞粘附性物质可以相同，也可以不同。
在图36(a)～(c)中，示出了本实施方式(V)中的第一包覆区域和第二包覆区域的配置方式。
在图36(a)(i)和图35(i)～(viii)中所示的例子中，将第一包覆区域配置成俯视为圆形，将第二包覆区域配置在圆形的第一包覆区域的两端部，并与第一包覆区域重叠。
在本实施方式(V)中，可以在圆形的第一包覆区域的端部，在3个位置配置第二包覆区域并与第一包覆区域重叠(参考图36(a)(ii))，也可以在4个位置配置第二包覆区域(参考图36(a)(iii))。
此外，在本实施方式(V)中，如图36(b)所示，在角为圆形的长方形的第一包覆区域的两端部，可以配置第二包覆区域，并与第一包覆区域重叠。
进而，在本实施方式(V)中，如图36(c)所示，可以在期望形状的第一包覆区域的多个(在图中为5个位置)端部配置第二包覆区域，并与第一包覆区域重叠。
另外，在图35所示的一个例子的细胞结构体的制造方法中，准备工序如下所述：在细胞培养器(参考图35(i))的培养面的中央部分，一边描绘俯视为圆形的形状一边涂敷上述温度响应性聚合物和/或上述温度响应性聚合物组合物(参考图35(ii))，干燥涂敷部分(参考图35(iii))，由此设置第一包覆区域；然后在位于通过该圆形的第一包覆区域的中心的直线上、且位于第一包覆区域的端部的2个位置，一边描绘俯视为圆形的形状一边涂敷细胞粘附性物质(参考图35(ii))，干燥涂敷部分(参考图35(iii))，由此设置第二包覆区域。
上述准备工序可以为例如以下的工序(准备工序I)：将温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物溶解于溶剂而制成包含温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物的溶液(温度响应性聚合物溶液)，然后涂敷在细胞培养器的培养面上并使其干燥，由此准备包覆细胞培养器；此外，还可以为以下工序(准备工序II)：将包含温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物的水溶液(温度响应性聚合物水溶液)冷却到温度响应性聚合物的浊点以下，使经冷却的温度响应性聚合物水溶液流延在培养面上，加热至超过浊点的温度，由此准备包覆细胞培养器。
作为上述准备工序I的温度响应性聚合物溶液中的溶剂，可举出例如：水；生理盐水；缓冲溶液；甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、1-丁醇、异丁醇、2-丁醇、叔丁醇、1-戊醇、2-戊醇、3-戊醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇、2-甲基-2-丁醇、3-甲基-2-丁醇、2,2-二甲基-1-丙醇、1-戊醇、2-戊醇、3-戊醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇、2-甲基-2-丁醇、3-甲基-2-丁醇、2,2-二甲基-1-丙醇、1-己醇、2-甲基-2-戊醇、烯丙醇、苯甲醇、水杨醇等醇；丙酮、甲乙酮、二乙酮、甲基丙基酮、甲基异丁基酮、甲基乙烯基酮、环己酮、2-甲基环戊酮、苯乙酮、二苯甲酮、异佛尔酮等酮；醋酸甲酯、醋酸乙酯、醋酸丙酯、醋酸异丙酯、醋酸正丁酯、醋酸异丁酯、醋酸仲丁酯、醋酸叔丁酯、醋酸乙烯酯、甲酸甲酯、甲酸乙酯、甲酸丙酯、上述醇与磷酸的酯、上述醇与碳酸的酯等酯；氯仿；苯；甲苯；二乙醚；二氯甲烷等。
其中，从易于均匀地包覆于培养面、此外温度响应性聚合物的溶解性优异的观点出发，优选甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、2-丁醇、叔丁醇、烯丙醇等醇；丙酮、甲乙酮、二乙酮、甲基乙烯基酮等酮；醋酸甲酯、醋酸乙酯、醋酸异丙酯、醋酸叔丁酯、醋酸乙烯酯等酯；氯仿；苯；甲苯；二乙醚；二氯甲烷。此外，从能够在短时间干燥且更容易均匀地涂敷于培养面的观点出发，进一步优选沸点低的有机溶剂(例如，选自碳原子数为1～4的低级醇、碳原子数为3～5的低级酮以及具有碳原子数为1～4的烷基的醋酸烷基酯中的至少1种，特别是比水沸点低的、选自碳原子数为1～4的低级醇、碳原子数为3～5的低级酮以及具有碳原子数为1～4的烷基的醋酸烷基酯中的至少1种)，从成本、操作性也优异的观点出发，特别优选甲醇、乙醇。
上述溶剂可以单独使用1种，也可以并用2种以上。
由于温度响应性聚合物在溶剂中的溶解性优异，因此即使在浊点以上的温度(例如，室温、37℃等)温度响应性聚合物也不易不溶化而沉积。因此，在涂敷温度响应性聚合物时省去了对温度响应性聚合物溶液进行温度管理的时间和精力，从而能够简单地准备包覆细胞培养器。
在上述准备工序I中，从细胞易于自凝聚的观点出发，优选在温度响应性聚合物溶液中包含亲水性分子。作为亲水性分子，为对温度响应性聚合物的C/A比没有影响的非离子性且亲水性的亲水性分子，可举出例如聚乙二醇(PEG)、二甲基丙烯酰胺(DMAA)、甘油、TritonX、聚丙二醇等。
在上述准备工序I中，从易于将温度响应性聚合物均匀地包覆于培养面的观点出发，温度响应性聚合物溶液中的温度响应性聚合物的含量相对于温度响应性聚合物溶液(100重量％)，优选为0.00075～0.015重量％，更优选为0.001～0.01重量％。
在上述准备工序I中，从细胞易于自凝聚的观点出发，温度响应性聚合物溶液中的亲水性分子的含量相对于温度响应性聚合物(100重量％)，优选为0.00001～0.00015重量％，更优选为0.00003～0.0001重量％。
在上述准备工序I中，从易于将温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物均匀地包覆于培养面的观点出发，优选温度响应性聚合物溶液不包含水，更优选温度响应性聚合物溶液(100重量％)中的水的重量比例为0.5重量％以下，进一步优选为0.1重量％以下。
另外，水的重量比例能够使用气相色谱法、卡尔费休法等本领域技术人员公知的方法来测定。
在上述准备工序I中，温度响应性聚合物溶液可以涂敷于培养面的整个表面，也可以涂敷于培养面的一部分。其中，从可简单地得到细胞结构体的观点出发，优选涂敷于培养面的整个表面。
在上述准备工序I中，从温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物均匀地包覆于培养面的观点出发，作为使涂敷的温度响应性聚合物溶液干燥的条件，优选在大气压下、温度10～70℃、时间1～3000分钟。通过使涂敷的温度响应性聚合物溶液快速地干燥，从而温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物无偏差地均匀地包覆在培养面上。
涂敷的温度响应性聚合物溶液可以通过例如将细胞培养器静置在37℃的培育箱中而使其干燥。
在上述准备工序II中，作为溶解温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物的溶剂，可举出例如：水；生理盐水；磷酸缓冲液、磷酸缓冲生理盐水(PBS)、Tris缓冲液等缓冲溶液等。
在上述准备工序II中，作为冷却温度响应性聚合物水溶液的方法，可举出例如将温度响应性聚合物水溶液放入约4℃的冰箱冷却至浊点以下的温度的方法等。
在上述准备工序II中，作为使温度响应性聚合物水溶液流延到培养面上的方法，可举出例如：通过倾斜细胞培养器的培养面而将具有浊点以下温度的温度响应性聚合物水溶液摊开的方法；使用抹刀铺展温度响应性聚合物水溶液的方法等。
在上述准备工序II中，作为将流延的温度响应性聚合物水溶液加热至超过浊点的方法，可举出例如：将流延工序后的细胞培养器静置在37℃的培育箱中的方法等。
在本实施方式(V)的细胞培养方法中，在准备工序中，优选使用细胞非粘附性的壁包围第一包覆区域和第二包覆区域所占的区域，更具体而言，可举出下述的变形例。
需要说明的是，细胞非粘附性是指附着的细胞不粘附或难以粘附。
根据该方式，能够在后述的种植培养工序中抑制种植的细胞与凹部的壁面的粘附，容易地控制细胞的凝聚样式，更精密地制造具有期望的取向性的细胞结构体。
图37表示准备工序的变形例及随后的种植培养工序的概略。
在准备工序的变形例中，在细胞培养器的培养面，雕刻了成为图35中的第一包覆区域和第二包覆区域的形状的俯视形状(大尺寸的圆以及配置于其端部2个位置的小尺寸的圆)的凹部(参考图37)。
然后，在该变形例的准备工序中，仅雕刻的凹部的底面配置温度响应性聚合物和/或上述温度响应性聚合物组合物、以及细胞粘附性物质，凹部的底面以外的面即凹部的壁面的表面不配置上述聚合物和/或上述聚合物组合物、以及细胞粘附性物质(参考图37(i))。
根据该变形例，能够更精密地制造具有期望的取向性的细胞结构体(参考图37(ii))。
(种植培养工序)
在本实施方式(V)的一个例子的制造方法中，接着，通过在第一包覆区域和第二包覆区域种植细胞并培养细胞，从而制备细胞结构体(种植培养工序)。
在图35所示的例子中，通过以下方式进行种植培养工序：在细胞培养器中加入细胞和细胞培养用培养基(参考图35(iv))，然后将该细胞培养器放入通常的37℃的细胞培育箱(参考图35(v))，通过更换培养基加入新的细胞培养用培养基(参考图35(vi))，进一步将细胞培养器放入细胞培育箱(参考图35(vii)、(viii))。
作为能够用于本实施方式(V)的细胞培养方法的细胞，可举出ADSC、心肌细胞、心肌成纤维细胞、神经细胞、神经芽细胞、成纤维细胞、软骨细胞、血管内皮细胞、血管间质细胞、平滑肌细胞等。
上述细胞可以单独使用1种，也可以并用2种以上。
在种植培养工序中种植细胞时的细胞密度优选为0.3×104个/cm2以上，更优选为1.0×104个/cm2以上，此外，为了不易产生由于培养中的细胞彼此接触而导致的停止增殖等关于细胞周期的问题，优选设为5.0×104个/cm2以下，更优选设为4.5×104个/cm2以下。
在种植后的第一包覆区域中，优选90～100％汇合，更优选95～100％汇合，进一步优选99～100％汇合。
当为上述范围时，各细胞能够不各自形成群落地维持均匀分散的状态进行凝聚，从而形成细胞结构体。此外，当细胞的密度高时，种植的细胞不易增殖，能够在细胞增殖前形成块状的细胞结构体。此外，种植的细胞有时增殖时的性质会发生变化，当细胞不易增殖时，能够形成包含与种植时同样性质的细胞的细胞结构体。
本领域技术人员能够基于使用的细胞种类、实验目的适当地设定培养条件，例如，可以设为37℃、5％CO2气氛等。
在此，参考图35，将在种植培养工序中产生的现象记载如下。
在该工序中，首先，种植的细胞沉积第一包覆区域和第二包覆区域上。这时，沉积在第一包覆区域和第二包覆区域上的细胞粘附于包覆区域上而存活，另一方面，沉积在非包覆区域上的细胞不粘附于非包覆区域上而死亡(参考图35(v))。
接着，通过更换培养基从细胞培养器除去未与培养面粘附的细胞(参考35(vi))。
然后，当对粘附于第一包覆区域和第二包覆区域的细胞进一步培养时，位于第一包覆区域和非包覆区域的界限附近的细胞随着与该细胞相比位于第一包覆区域的中央部分侧的细胞一起，开始向中央部分凝聚(参考图35(vii))。换言之，粘附的细胞以远离第一包覆区域的方式剥离，朝向第一包覆区域的中央部分翻卷。
另一方面，与第二包覆区域粘附的细胞不会从第二包覆区域剥离，继续粘附在起初的位置(参考图35(vii))。
最终，与第一包覆区域粘附的细胞以连接继续粘附于第二包覆区域的2个细胞集团之间的方式，形成在第一包覆区域的中央部分具有直线状的结构的细胞结构体(参考图35(viii))。
在此，在种植培养工序中得到的细胞结构体中，在通过与第一包覆区域粘附的细胞而形成的部分中，细胞成为沿直线状结构延伸方向被拉伸的形状，并具有向沿着连接2个第二包覆区域的线的方向的方向的取向性。
使用多个这样得到的细胞结构体，适当编入而使其连接，由此能够制作期望形状的细胞结构体。
此外，从生物能力的观点出发，优选得到的细胞结构体尽可能在刚形成后即刻用于实验等，进一步优选在24小时以内使用。
根据本实施方式(V)的细胞结构体的制造方法，由于充分地供给营养和氧的单层结构的细胞在短时间内凝聚而形成细胞结构体，因此不易产生该细胞结构体的内部的细胞因缺氧而坏死等之类的现有技术中的问题。特别是在对由供氧的必要性特别高的心肌细胞形成的细胞结构体的培养中是非常有用的。
在试管内得到生物体内的环境的细胞结构体从实验技术的观点出发具有极其重要的意义，而根据本实施方式(V)的细胞结构体的制造方法，能够使细胞的取向性与生物体内一致(例如，在为心肌细胞的情况下，为向规定方向的纺锤形态)。
例如，在关于心肌细胞的创新药物试验中，为了检出有无引起心律不齐等的心脏毒性，对培养心肌细胞的心电波图进行评价，在此，从提高测定精度(SN比)的观点出发，期望尽可能增大由细胞发出的电信号。
根据本实施方式(V)的细胞结构体的制造方法，如上所述，由于能够以具有天生的取向性的状态得到大尺寸的细胞结构体，因此能够得到模拟了生物体内生存的心肌细胞的检测体。因此，能够提高关于心肌细胞的创新药物试验的精度。
[[发明(VI)]]
[细胞结构体的制造方法]
本发明(VI)的细胞结构体的制造方法，依次包含以下工序：制备工序，制备温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物；培养器准备工序，用上述温度响应性聚合物或上述温度响应性聚合物组合物包覆细胞培养器的培养面，准备包覆细胞培养器；种植工序，在上述包覆细胞培养器中种植心肌细胞和相对于上述100个心肌细胞为200～300个比例的成纤维细胞；培养工序，对种植的细胞进行培养而得到块状的细胞结构体。
另外，在本说明书中，有时将细胞培养器的培养面中的用上述温度响应性聚合物或上述温度响应性聚合物组合物包覆的部分称为“包覆培养面”。此外，包覆细胞培养器是指具有包覆培养面的细胞培养器。包覆细胞培养器可以是整个培养面为包覆培养面，也可以是培养面的一部分为包覆培养面。此外，在培养面中可以具有1个包覆培养面，也可以具有多个包覆培养面。
包含心肌细胞和成纤维细胞的细胞结构体能够使用公知的U底低粘附性培养皿、悬滴法历经1～2周的长时间而形成球形，但存在由于制作时花费时间因此难以维持在低氧状态极弱的心肌细胞的问题；难以对增殖速度不同的细胞彼此进行共培养的问题。
本发明人等发现，令人惊讶的是，通过在用温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物包覆细胞培养器的培养面而成的包覆细胞培养器中种植心肌细胞和成纤维细胞，从而能够容易地形成模拟了发生了心力衰竭的心脏病组织的细胞结构体。
根据本实施方式(VI)的细胞结构体的制造方法，能够使心肌细胞和成纤维细胞维持均匀分散的状态而凝聚，能够再现包含心肌细胞和成纤维细胞的、接近于生物体内存在的状态的、发生了心力衰竭的组织。
根据本实施方式(VI)的细胞结构体的制造方法，当种植的混合细胞与包覆培养面粘附而进一步进行培养时，混合细胞进行自凝聚而收缩，以展开成片状的细胞的端部远离包覆培养面而翻卷的方式进行凝聚，形成块状的细胞结构体。
特别在本实施方式(VI)的细胞结构体的制造方法中，用温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物包覆培养面，使包覆培养面和细胞的粘附力为合适的范围，因此即使为包含具有难以凝聚的性质的心肌细胞的混合细胞，也能够形成块状的细胞结构体。此外，通过与易于凝聚的成纤维细胞组合，从而能够容易地形成块状的细胞结构体。
由于心肌细胞和成纤维细胞的增殖速度不同，因此在现有的进行长时间培养而形成细胞结构体的方法中，无法形成大量包含心肌细胞的细胞结构体。根据本实施方式(VI)的细胞结构体的制造方法，由于能够不使心肌细胞和成纤维细胞增殖而形成细胞结构体，因此能够得到由与种植时的心肌细胞和成纤维细胞的细胞比大致相同的比率的细胞所构成的细胞结构体。因此，能够容易地调节构成细胞结构体的细胞的混合比率。此外，根据本实施方式(VI)的细胞结构体的制造方法，由于使用了包覆培养面和细胞的粘附力为合适的范围的包覆细胞培养器，因此不需要细胞的增殖，例如在在种植后24小时以内等的短时间，心肌细胞和成纤维细胞的混合细胞凝聚而成团，因此能够容易地形成由增殖速度不同的2种以上细胞组成的、以存活的状态包含心肌细胞且跳动的块状的细胞结构体。
(制备工序)
作为在实施方式(VI)的细胞培养器中使用的制备温度响应性聚合物和温度响应性聚合物组合物的制备工序，可举出与上述发明(I)中的制备工序同样的工序，优选例也可举出同样的优选例。
另外，在本实施方式(VI)中，作为在制造方法中使用的温度响应性聚合物和温度响应性聚合物组合物，从更易于得到包含心肌细胞和成纤维细胞的、块状的细胞结构体的观点出发，优选(A)。
此外，在本实施方式(VI)中，有时将制备包含2-N,N-二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯(DMAEMA)的混合物的制备工序称为混合物制备工序。
(培养器准备工序)
在本发明(VI)的实施方式的制造方法中，上述培养器准备工序为用上述温度响应性聚合物或上述温度响应性聚合物组合物包覆细胞培养器的培养面而准备包覆细胞培养器的工序。
上述培养器准备工序可以为例如以下的工序(培养器准备工序I)：将温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物溶解于溶剂而制成温度响应性聚合物溶液，然后涂敷在细胞培养器的培养面上并使其干燥，由此准备包覆细胞培养器；此外，还可以为以下工序(培养器准备工序II)：将包含温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物的水溶液(温度响应性聚合物水溶液)冷却到温度响应性聚合物的浊点以下，使经冷却的温度响应性聚合物水溶液流延在细胞培养器的培养面上，加热至超过浊点的温度，由此准备包覆细胞培养器。
作为上述培养器准备工序I的温度响应性聚合物溶液中的溶剂，可举出例如：水；生理盐水；缓冲溶液；甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、1-丁醇、异丁醇、2-丁醇、叔丁醇、1-戊醇、2-戊醇、3-戊醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇、2-甲基-2-丁醇、3-甲基-2-丁醇、2,2-二甲基-1-丙醇、1-戊醇、2-戊醇、3-戊醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇、2-甲基-2-丁醇、3-甲基-2-丁醇、2,2-二甲基-1-丙醇、1-己醇、2-甲基-2-戊醇、烯丙醇、苯甲醇、水杨醇等醇；丙酮、甲乙酮、二乙酮、甲基丙基酮、甲基异丁基酮、甲基乙烯基酮、环己酮、2-甲基环戊酮、苯乙酮、二苯甲酮、异佛尔酮等酮；醋酸甲酯、醋酸乙酯、醋酸丙酯、醋酸异丙酯、醋酸正丁酯、醋酸异丁酯、醋酸仲丁酯、醋酸叔丁酯、醋酸乙烯酯、甲酸甲酯、甲酸乙酯、甲酸丙酯、上述醇与磷酸的酯、上述醇与碳酸的酯等酯；氯仿；苯；甲苯；二乙醚；二氯甲烷等。
其中，从易于均匀地包覆于培养面、此外温度响应性聚合物的溶解性优异的观点出发，优选水、甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、2-丁醇、叔丁醇、烯丙醇等醇；丙酮、甲乙酮、二乙酮、甲基乙烯基酮等酮；醋酸甲酯、醋酸乙酯、醋酸异丙酯、醋酸叔丁酯、醋酸乙烯酯等酯；氯仿；苯；甲苯；二乙醚；二氯甲烷。此外，从能够在短时间干燥且更容易均匀地涂敷于培养面的观点出发，进一步优选沸点低的有机溶剂(例如，选自碳原子数为1～4的低级醇、碳原子数为3～5的低级酮以及具有碳原子数为1～4的烷基的醋酸烷基酯中的至少1种，特别是比水沸点低的、选自碳原子数为1～4的低级醇、碳原子数为3～5的低级酮以及具有碳原子数为1～4的烷基的醋酸烷基酯中的至少1种)，从成本、操作性也优异的观点出发，特别优选甲醇、乙醇。
上述溶剂可以单独使用1种，也可以并用2种以上。
由于温度响应性聚合物在溶剂中的溶解性优异，因此即使在浊点以上的温度(例如，室温、37℃等)温度响应性聚合物也不易不溶化而沉积。因此，在涂敷温度响应性聚合物时省去了对温度响应性聚合物溶液进行温度管理的时间和精力，从而能够简单地准备包覆细胞培养器。
在上述培养器准备工序I中，从细胞易于自凝聚的观点出发，优选在温度响应性聚合物溶液中包含亲水性分子。作为亲水性分子，为对温度响应性聚合物的C/A比没有影响的非离子性且亲水性的亲水性分子，可举出例如聚乙二醇(PEG)、二甲基丙烯酰胺(DMAA)、甘油、TritonX、聚丙二醇等。
在上述培养器准备工序I中，从易于将温度响应性聚合物均匀地包覆于培养面的观点出发，温度响应性聚合物溶液中的温度响应性聚合物的含量相对于温度响应性聚合物溶液(100质量％)，优选为0.05～2.0质量％，更优选为0.1～1.5质量％。
在上述培养器准备工序I中，从细胞易于自凝聚的观点出发，温度响应性聚合物溶液中的亲水性分子的含量相对于温度响应性聚合物(100质量％)，优选为0.00001～0.00015质量％，更优选为0.00003～0.0001质量％。
在上述培养器准备工序I中，从易于将温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物均匀地包覆于培养面的观点出发，优选温度响应性聚合物溶液不包含水，更优选温度响应性聚合物溶液(100质量％)中的水的质量比例为0.5质量％以下，进一步优选为0.1质量％以下。
另外，水的质量比例能够使用气相色谱法、卡尔费休法等本领域技术人员公知的方法来测定。
在上述培养器准备工序I中，温度响应性聚合物溶液可以涂敷于培养面的整个表面，也可以涂敷于培养面的一部分。在培养面的一部分涂敷温度响应性聚合物溶液的情况下，可以在培养面上设置1个包覆培养面，也可以设置多个包覆培养面。另外，在培养面的一部分涂敷温度响应性聚合物溶液的情况下，优选使用培养面为细胞非粘附性的细胞培养器。
另外，“细胞非粘附性”是指附着细胞(例如，成纤维细胞、心肌细胞、血管内皮细胞等)在通常的培养条件下，不粘附或难以粘附的性质。
在上述培养器准备工序I中，从在培养面均匀地涂敷温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物的观点出发，作为使涂敷的温度响应性聚合物溶液干燥的条件，优选在大气压下，温度10～70℃、时间1～3000分钟。通过使涂敷的温度响应性聚合物溶液快速地干燥，从而温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物无偏差地均匀地包覆在培养面上。
涂敷的温度响应性聚合物溶液可以通过例如将细胞培养器静置在37℃的培育箱中而使其干燥。
在上述培养器准备工序II中，作为溶解温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物的溶剂，可举出例如水；生理盐水；磷酸缓冲液、磷酸缓冲生理盐水(PBS)、Tris缓冲液等缓冲溶液等。
在上述培养器准备工序II中，作为冷却温度响应性聚合物水溶液的方法，可举出例如将温度响应性聚合物水溶液放入约4℃的冰箱冷却至浊点以下的温度的方法等。
在上述培养器准备工序II中，作为使温度响应性聚合物水溶液流延到培养面上的方法，可举出例如：通过倾斜细胞培养器的培养面而将具有浊点以下温度的温度响应性聚合物水溶液摊开的方法；使用抹刀铺展温度响应性聚合物水溶液的方法等。
在上述培养器准备工序II中，作为将流延的温度响应性聚合物水溶液加热至超过浊点的方法，可举出例如：将流延工序后的细胞培养器静置在37℃的培育箱中的方法等。
作为上述细胞培养器，可举出市售的多孔板、培养皿、烧瓶等。作为上述细胞培养器的材质，可举出聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二酯(PET)、聚丙烯、聚丁烯、聚乙烯、聚碳酸酯、玻璃等。其中，从容易精密的成型加工、能够应用于各种灭菌法、且由于具有透明性而适用于显微镜观察的观点出发，优选聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二酯(PET)。
上述细胞培养器可以是对培养面表面实施了细胞粘附处理等处理的细胞培养器，也可以是表面无处理的细胞培养器。为了调节细胞的粘附性，可以对上述培养面表面实施涂敷处理、加工处理等。
上述培养面的俯视形状没有特别限定，可举出例如大致四边形等大致多边形、大致圆形等形状。其中，从易于得到更均匀的细胞结构体的观点出发，优选大致圆形。
上述培养面的底形状(底面的剖面形状)没有特别限定，可举出平底、圆底、凹凸状底等。其中，从易于得到更均匀的球状的细胞结构体的观点出发，优选平底或带有若干R的凹面底。
从向心肌细胞供氧的观点出发，上述细胞培养器的培养面的面积优选为200mm2以下，更优选为75mm2以下，进一步优选为32mm2以下。另外，上述细胞培养器的培养面的面积的下限值只要是市售尺寸即可使用，没有特别限定。
从向心肌细胞供氧的观点出发，上述包覆培养面的各面积(用温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物包覆的部分的各面积)优选为200mm2以下，更优选为75mm2以下，进一步优选为32mm2以下。
上述包覆细胞培养器的包覆培养面每单位面积具有的温度响应性聚合物的量优选为0.1～10.0ng/mm2，进一步优选为0.5～5.0ng/mm2。如果为上述范围，则易于得到易于形成块状的细胞结构体的这样的效果。
作为上述包覆细胞培养器中的包覆培养面的Zeta电位，优选为0～50mV，更优选为0～35mV，进一步优选为10～25mV。通过使Zeta电位为0mV以上，从而带负电的细胞易于粘附。此外，通过使Zeta电位为50mV以下，从而能够减轻细胞毒性。
此外，通过将Zeta电位设为上述范围，从而仅在合适的培养条件下培养细胞，就能够更加容易地制作块状(颗粒状)的细胞结构体。该现象推测是由于以下的原因：通过将表面Zeta电位设为上述范围，从而能够对包覆培养面赋予不会引起细胞毒性的微弱的正电荷，此外还能够确保种植的细胞快速粘附、促进细胞活性的提高和细胞外基质的分泌，进而还能够适当地抑制细胞迁移而增强细胞间的结合。
需要说明的是，Zeta电位是指将用羟丙基纤维素包覆聚苯乙烯胶乳而成的粒子(Zeta电位：-5～+5mV)作为标准探测粒子，使用Zeta电位仪(例如，型号“ELSZ”、大塚电子公司制造等)进行测定，用Smoluchowski公式算出的值。
从提高本发明(VI)的效果的观点出发，作为水与上述包覆培养面的接触角，优选为50～90°，更优选为60～80°，进一步优选为62～78°。需要说明的是，水与包覆培养面的接触角是指在包覆培养面内的任意几个点上，按照JIS R3257测定的接触角的平均值。
(种植工序)
上述种植工序为在上述包覆细胞培养器中种植心肌细胞和相对于上述100个心肌细胞为200～300个比例的成纤维细胞的工序。细胞的种植可以混合全部细胞一次性种植，也可以分成多次进行种植。此外，各细胞液可以一次性种植，也可以分成多次进行种植。
在上述包覆细胞培养器的上述包覆培养面种植的细胞至少包含心肌细胞、成纤维细胞。
从易于得到心肌细胞和成纤维细胞更加均匀分散的细胞结构体的观点出发，作为上述心肌细胞，优选心肌细胞、心肌干细胞以及分化诱导阶段的iPS细胞、ES细胞等。
上述心肌细胞可以单独使用1种，也可以并用2种以上。
作为上述成纤维细胞，可举出来自心肌成纤维细胞、皮下脂肪、筋膜、滑膜、骨膜的间充质干细胞等。其中，从易于得到心肌细胞和成纤维细胞更加均匀分散的细胞结构体的观点出发，优选来自心肌成纤维细胞、皮下脂肪的间充质干细胞。
上述成纤维细胞可以单独使用1种，也可以并用2种以上。
在上述种植工序中，还可以种植血管内皮细胞、血管间质细胞。它们可以单独使用1种，也可以并用2种以上。
在上述种植工序中，还可以种植免疫细胞。作为上述免疫细胞，可举出例如巨噬细胞、CD4阳性T细胞等T细胞、单核细胞等。其中，从得到更加接近于发生了心力衰歇等心脏病的组织的细胞结构体的观点出发，优选包含巨噬细胞和/或T细胞。
上述免疫细胞可以单独使用1种，也可以并用2种以上。
在上述种植工序中，成纤维细胞相对于100个心肌细胞的比例为200～300个，优选为200～250个，更优选为200～230个。通过将成纤维细胞的比例相对于100个心肌细胞设为200个以上，从而混合细胞成团而易于形成块状的细胞结构体。此外，通过设为300个以下，则能够得到更接近于发生了心力衰竭等心脏病的组织的细胞结构体。
在上述种植工序中，从得到更接近于发生了心力衰竭等心脏病的组织的细胞结构体的观点出发，心肌细胞在种植的全部细胞中的比例相对于总细胞数(100％)优选为25～50％，更优选为25～30％。
在上述种植工序中，从得到更接近于发生了心力衰竭等心脏病的组织的细胞结构体的观点出发，血管内皮细胞相对于100个心肌细胞的比例优选为5～50个，更优选为10～30个。
在上述种植工序中，从得到更接近于发生了心力衰竭等心脏病的组织的细胞结构体的观点出发，免疫细胞相对于100个心肌细胞的比例优选为5～50个，更优选为10～30个。
在上述种植工序中，种植后的全部细胞在包覆培养面上的密度相对于上述包覆培养面的表面积，优选为90～100％汇合，更优选为95～100％汇合，进一步优选为99～100％汇合。当种植的细胞密度为上述范围时，各细胞能够不各自形成群落地维持均匀分散的状态进行凝聚，从而形成细胞结构体。此外，当细胞密度高时，种植的细胞不易增殖，能够在细胞增殖前形成块状的细胞结构体，因此，能够形成种植的细胞和细胞数的比例形态的细胞结构体。此外，也不易受到由于细胞的增殖速度的不同而带来的影响。此外，种植的细胞有时增殖时的性质会发生变化，当细胞不易增殖时，能够形成包含与种植时同样性质的细胞的细胞结构体。
根据细胞的种类，作为种植后的全部细胞在包覆培养面上的密度，优选为20～15000个/mm2。例如，在包覆培养面的面积为200mm2的24孔细胞培养板中加入1.0mL的细胞液进行种植的情况下，优选4×104～30×104个/mL。另外，种植的细胞为活细胞。
细胞的种植能够例如将预先静置于37℃的培养箱中的包覆细胞培养器取出放在室温的净化台上来进行。
另外，细胞优选在培养基中稀释而种植。作为稀释的培养基，只要是能够培养细胞的培养基则没有特别限定。
(培养工序)
上述培养工序为对种植的细胞进行培养而得到块状的细胞结构体的工序。
在发生了心肌炎的组织中，已知心肌细胞坏死，代替坏死的心肌细胞成纤维细胞过量增殖，除此以外，炎性的免疫细胞也大量地浸润。关于在试管内再现免疫细胞浸润了的心肌炎组织，期望制作除了心肌细胞、成纤维细胞以外，还使作为悬浮细胞的免疫细胞浸润的细胞结构体。然而，在细胞结构体的制造需要1～2周的现有的悬滴法、低粘附性培养皿中，这些是很困难的。
在本实施方式(VI)的制造方法中，在上述培养工序中，还可以将免疫细胞添加于包覆细胞培养器。作为添加免疫细胞的时机，优选为上述种植工序以后(与细胞的种植同时以后)，且得到细胞结构体之前，更优选在种植的细胞附着于包覆培养面而形成片状的细胞结构体(参考图40(iii))以后，且片状的细胞结构体开始向包覆培养面中央部凝聚、端部远离包覆培养面开始翻卷、形成端部翻卷的细胞结构体之前。即，免疫细胞的添加可以在种植工序时种植，也可以在种植工序后添加。
具体而言，优选在细胞的种植同时以后、细胞(例如，最后种植的细胞)种植后48小时以内添加免疫细胞。
通过在上述时机添加免疫细胞，从而作为悬浮细胞的免疫细胞由于重力的作用而沉积，在与包覆培养面粘附的细胞聚集成钱包状时免疫细胞进入内部，由此能够形成内部包含免疫细胞的细胞结构体，能够得到更接近于发生了心肌炎、心力衰歇等心脏病模型的组织的细胞结构体(参考图40)。
作为培养种植的细胞的条件，能够使用例如通常的37℃的细胞培育箱而进行。细胞的培养优选连续进行直到形成块状的细胞结构体，具体而言，优选培养10～96小时，更优选培养15～50小时。
另外，在本实施方式(VI)的细胞结构体的制造方法中，令人惊讶的是，即使在混合粘附细胞(例如，心肌细胞等)和悬浮细胞(例如，免疫细胞等)并进行种植、培养的情况下，也不需准备特殊的培养基，只要使用适于使用的粘附细胞的培养基或适于使用的悬浮细胞的培养基(优选适于粘附细胞的培养基)，将粘附细胞和悬浮细胞同时地进行种植、培养，就能够得到细胞结构体。
在上述包覆培养面粘附、培养的、包含上述心肌细胞和上述成纤维细胞的混合细胞进行自凝聚，形成块状的细胞结构体。得到的细胞结构体在其块状的结构体内具有存活的细胞。
从内部包含活的心肌细胞、得到跳动的细胞结构体的观点出发，上述细胞结构体的尺寸例如优选外径为30～200μm，更优选为40～150μm，进一步优选为50～100μm。
通过本实施方式(VI)的细胞结构体的制造方法而得到的细胞结构体是再现了发生心力衰歇等心脏病的组织的心脏病模型，能够用于例如心肌梗塞、心力衰歇、心肌炎等心脏病的研究、心脏病的药剂开发、心脏病的治疗方法开发的用途。
以下，对本实施方式(VI)的细胞结构体的制作方法的一个例子使用图39、40进行说明。
图39为包含心肌细胞和成纤维细胞的细胞结构体的制造方法的一个例子。
在细胞培养器的培养面涂敷温度响应性聚合物进行包覆，准备具有包覆培养面的包覆细胞培养器(参考图39(i)(ii))。然后，在包覆培养面加入用培养基稀释了的心肌细胞和成纤维细胞的混合细胞，种植混合细胞(参考图39(ii))。种植的混合细胞与整个包覆培养面的表面粘附(参考图39(iii))。另外，在该例子中，混合细胞的密度为100％汇合(参考图39(iii))。然后，与包覆培养面粘附的细胞开始向包覆培养面中央部凝聚，端部远离包覆培养面并开始翻卷，成为端部翻卷的细胞结构体(参考图39(iv))。然后，进一步继续凝聚成为块状的细胞结构体，从包覆培养面悬浮(参考图39(v))。
图40为包含心肌细胞、成纤维细胞、巨噬细胞等免疫细胞(悬浮细胞)的细胞结构体的制造方法的一个例子。
在细胞培养器的培养面涂敷温度响应性聚合物进行包覆，准备具有包覆培养面的包覆细胞培养器(参考图40(i)(ii))。然后，在包覆培养面加入用培养基稀释了的心肌细胞和成纤维细胞的混合细胞，种植混合细胞(参考图40(ii))。种植的混合细胞与整个包覆培养面的表面粘附，形成片状的细胞结构体(单层)(参考图40(iii))。另外，在该例子中，混合细胞的密度为100％汇合(参考图40(iii))。
形成心肌细胞和成纤维细胞为片状的细胞结构体后，添加巨噬细胞等免疫细胞(图40(iv))。然后，与包覆培养面粘附的混合细胞开始向包覆培养面中央部凝聚，端部远离包覆培养面并开始翻卷，成为端部翻卷的细胞结构体(参考图40(v))。此时，将附着于片状的细胞结构体的、或在培养皿中悬浮的免疫细胞包入。然后，进一步继续凝聚，成为包含心肌细胞、成纤维细胞以及免疫细胞的块状的细胞结构体，从包覆培养面悬浮(参考图40(vi))。
[[发明(VII)]]
[细胞结构体的制造方法]
本发明(VII)的细胞结构体的制造方法，依次包含以下工序：制备工序，制备温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物；培养器准备工序，用上述温度响应性聚合物或上述温度响应性聚合物组合物包覆细胞培养器的培养面，准备包覆细胞培养器；种植工序，在上述包覆细胞培养器中种植肝细胞和相对于上述100个肝细胞为10～50个比例的成纤维细胞；培养工序，对种植的细胞进行培养而得到块状的细胞结构体。
另外,在本说明书中,有时将细胞培养器的培养面中的用上述温度响应性聚合物或上述温度响应性聚合物组合物包覆的部分称为“包覆培养面”。此外，包覆细胞培养器是指具有包覆培养面的细胞培养器。包覆细胞培养器可以是整个培养面为包覆培养面，也可以是培养面的一部分为包覆培养面。此外，在培养面中可以具有1个包覆培养面，也可以具有多个包覆培养面。
包含肝细胞和成纤维细胞的细胞结构体能够使用公知的U底低粘附性培养皿、悬滴法历经1～2周的长时间而形成球形，但存在由于制作时花费时间，因此存在难以对增殖速度、与培养面的粘附性、优选的培养条件不同的细胞彼此进行共培养的问题。
本发明人等发现，令人惊讶的是，通过在用温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物包覆细胞培养器的培养面而成的包覆细胞培养器中种植肝细胞和成纤维细胞，从而能够容易地形成模拟了发生了肝功能衰竭的组织的细胞结构体。
根据本实施方式(VII)的细胞结构体的制造方法，能够使肝细胞和成纤维细胞维持均匀分散的状态而凝聚，能够再现包含肝细胞和成纤维细胞的、接近于生物体内存在的状态的、发生了肝功能衰竭的组织。
由于肝细胞和成纤维细胞的增殖速度、与培养面的粘附性以及培养条件不同，因此在现有的进行长时间培养而形成细胞结构体的方法中，形成包含肝细胞和成纤维细胞的细胞结构体是极其困难的。根据本实施方式(VII)的细胞结构体的制造方法，由于使用了包覆培养面和细胞的粘附力为合适的范围的包覆细胞培养器，因此不需要细胞的增殖，例如在种植后24小时以内等的短时间，肝细胞和成纤维细胞凝聚而成团，因此能够容易地形成包含肝细胞和成纤维细胞的块状的细胞结构体。
(制备工序)
作为在实施方式(VII)的细胞培养器中使用的制备温度响应性聚合物和温度响应性聚合物组合物的制备工序，可举出与上述发明(I)中的制备工序同样的工序，优选例也可举出同样的优选例。
另外，在本实施方式(VII)中，作为在制造方法中使用的温度响应性聚合物和温度响应性聚合物组合物，从更易于得到包含肝细胞和成纤维细胞的、块状的细胞结构体的观点出发，优选(A)。
此外，在本实施方式(VII)中，有时将制备包含2-N,N-二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯(DMAEMA)的混合物的制备工序称为混合物制备工序。
(培养器准备工序)
在本发明(VII)的实施方式的制造方法中，上述培养器准备工序准备工序为用上述温度响应性聚合物或上述温度响应性聚合物组合物包覆细胞培养器的培养面而准备包覆细胞培养器的工序。
上述培养器准备工序可以为例如以下的工序(培养器准备工序I)：将温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物溶解于溶剂而制成温度响应性聚合物溶液，然后涂敷在细胞培养器的培养面上并使其干燥，由此准备包覆细胞培养器；此外，还可以为以下工序(培养器准备工序II)：将包含温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物的水溶液(温度响应性聚合物水溶液)冷却到温度响应性聚合物的浊点以下，使经冷却的温度响应性聚合物水溶液流延在细胞培养器的培养面上，加热至超过浊点的温度，由此准备包覆细胞培养器。
作为上述培养器准备工序I的温度响应性聚合物溶液中的溶剂，可举出例如：水；生理盐水；缓冲溶液；甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、1-丁醇、异丁醇、2-丁醇、叔丁醇、1-戊醇、2-戊醇、3-戊醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇、2-甲基-2-丁醇、3-甲基-2-丁醇、2,2-二甲基-1-丙醇、1-戊醇、2-戊醇、3-戊醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇、2-甲基-2-丁醇、3-甲基-2-丁醇、2,2-二甲基-1-丙醇、1-己醇、2-甲基-2-戊醇、烯丙醇、苯甲醇、水杨醇等醇；丙酮、甲乙酮、二乙酮、甲基丙基酮、甲基异丁基酮、甲基乙烯基酮、环己酮、2-甲基环戊酮、苯乙酮、二苯甲酮、异佛尔酮等酮；醋酸甲酯、醋酸乙酯、醋酸丙酯、醋酸异丙酯、醋酸正丁酯、醋酸异丁酯、醋酸仲丁酯、醋酸叔丁酯、醋酸乙烯酯、甲酸甲酯、甲酸乙酯、甲酸丙酯、上述醇与磷酸的酯、上述醇与碳酸的酯等酯；氯仿；苯；甲苯；二乙醚；二氯甲烷等。
其中，从易于均匀地包覆于培养面、此外温度响应性聚合物的溶解性优异的观点出发，优选水、甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、2-丁醇、叔丁醇、烯丙醇等醇；丙酮、甲乙酮、二乙酮、甲基乙烯基酮等酮；醋酸甲酯、醋酸乙酯、醋酸异丙酯、醋酸叔丁酯、醋酸乙烯酯等酯；氯仿；苯；甲苯；二乙醚；二氯甲烷。此外，从能够在短时间干燥且更容易均匀地涂敷于培养面的观点出发，进一步优选沸点低的有机溶剂(例如，选自碳原子数为1～4的低级醇、碳原子数为3～5的低级酮以及具有碳原子数为1～4的烷基的醋酸烷基酯中的至少1种，特别是比水沸点低的、选自碳原子数为1～4的低级醇、碳原子数为3～5的低级酮以及具有碳原子数为1～4的烷基的醋酸烷基酯中的至少1种)，从成本、操作性也优异的观点出发，特别优选甲醇、乙醇。
上述溶剂可以单独使用1种，也可以并用2种以上。
由于温度响应性聚合物在溶剂中的溶解性优异，因此即使在浊点以上的温度(例如，室温、37℃等)温度响应性聚合物也不易不溶化而沉积。因此，在涂敷温度响应性聚合物时省去了对温度响应性聚合物溶液进行温度管理的时间和精力，从而能够简单地准备包覆细胞培养器。
在上述培养器准备工序I中，从细胞易于自凝聚的观点出发，优选在温度响应性聚合物溶液中包含亲水性分子。作为亲水性分子，为对温度响应性聚合物的C/A比没有影响的非离子性且亲水性的亲水性分子，可举出例如聚乙二醇(PEG)、二甲基丙烯酰胺(DMAA)、甘油、TritonX、聚丙二醇等。
在上述培养器准备工序I中，从易于将温度响应性聚合物均匀地包覆于培养面的观点出发，温度响应性聚合物溶液中的温度响应性聚合物的含量相对于温度响应性聚合物溶液(100质量％)，优选为0.01～3.0质量％，更优选为0.25～2.5质量％。
在上述培养器准备工序I中，从细胞易于自凝聚的观点出发，温度响应性聚合物溶液中的亲水性分子的含量相对于温度响应性聚合物(100质量％)，优选为0.00001～0.00015质量％，更优选为0.00003～0.0001质量％。
在上述培养器准备工序I中，从易于将温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物均匀地包覆于培养面的观点出发，优选温度响应性聚合物溶液不包含水，更优选温度响应性聚合物溶液(100质量％)中的水的质量比例为0.5质量％以下，进一步优选为0.1质量％以下。
另外，水的质量比例能够使用气相色谱法、卡尔费休法等本领域技术人员公知的方法来测定。
在上述培养器准备工序I中，温度响应性聚合物溶液可以涂敷于培养面的整个表面，也可以涂敷于培养面的一部分。在培养面的一部分涂敷温度响应性聚合物溶液的情况下，可以在培养面上设置1个包覆培养面，也可以设置多个包覆培养面。另外，在培养面的一部分涂敷温度响应性聚合物溶液的情况下，优选使用培养面为细胞非粘附性的细胞培养器。
另外，“细胞非粘附性”是指附着细胞(例如，成纤维细胞、肝细胞、血管内皮细胞等)在通常的培养条件下，不粘附或难以粘附的性质。
在上述培养器准备工序I中，从在培养面均匀地包覆温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物的观点出发，作为使涂敷的温度响应性聚合物溶液干燥的条件，优选在大气压下，温度10～70℃、时间1～3000分钟。通过使涂敷的温度响应性聚合物溶液快速地干燥，从而温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物无偏差地均匀地包覆在培养面上。
涂敷的温度响应性聚合物溶液可以通过例如将细胞培养器静置在37℃的培育箱中而使其干燥。
在上述培养器准备工序II中，作为溶解温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物的溶剂，可举出例如水；生理盐水；磷酸缓冲液、磷酸缓冲生理盐水(PBS)、Tris缓冲液等缓冲溶液等。
在上述培养器准备工序II中，作为冷却温度响应性聚合物水溶液的方法，可举出例如将温度响应性聚合物水溶液放入约4℃的冰箱冷却至浊点以下的温度的方法等。
在上述培养器准备工序II中，作为使温度响应性聚合物水溶液流延到培养面上的方法，可举出例如：通过倾斜细胞培养器的培养面而将具有浊点以下温度的温度响应性聚合物水溶液摊开的方法；使用抹刀铺展温度响应性聚合物水溶液的方法等。
在上述培养器准备工序II中，作为将流延的温度响应性聚合物水溶液加热至超过浊点的方法，可举出例如：将流延工序后的细胞培养器静置在37℃的培育箱中的方法等。
作为上述细胞培养器，可举出市售的多孔板、培养皿、烧瓶等。作为上述细胞培养器的材质，可举出聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二酯(PET)、聚丙烯、聚丁烯、聚乙烯、聚碳酸酯、玻璃等。其中，从容易精密的成型加工、能够应用于各种灭菌法、且由于具有透明性而适用于显微镜观察的观点出发，优选聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二酯(PET)。
上述细胞培养器可以是对培养面表面实施了细胞粘附处理等处理的细胞培养器，也可以是表面无处理的细胞培养器。为了调节细胞的粘附性，可以对上述培养面表面实施涂敷处理、加工处理等。
上述培养面的俯视形状没有特别限定，可举出例如大致四边形等大致多边形、大致圆形等形状。其中，从易于得到更均匀的细胞结构体的观点出发，优选大致圆形。
上述培养面的底形状(底面的剖面形状)没有特别限定，可举出平底、圆底、凹凸状底等。其中，从易于得到更均匀的球状的细胞结构体的观点出发，优选平底或带有若干的R的凹面底。
从能够更加容易地制造块状的细胞结构体的观点出发，上述细胞培养器的培养面的面积优选为32mm2以下，更优选为10mm2以下，进一步优选为8mm2以下。另外，上述细胞培养器的培养面的面积的下限值只要是市售尺寸即可使用，没有特别限定。
从能够更加容易地制造块状的细胞结构体的观点出发，上述包覆培养面的各面积(用温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物包覆的部分的各面积)优选为32mm2以下，更优选为10mm2以下，进一步优选为8mm2以下。
上述包覆细胞培养器的包覆培养面每单位面积具有的温度响应性聚合物的量优选为0.15～15.0ng/mm2，进一步优选为1.0～5.0ng/mm2。如果为上述范围，则易于得到易于形成块状的细胞结构体的这样的效果。
作为上述包覆细胞培养器中的包覆培养面的Zeta电位，优选为0～50mV，更优选为0～35mV，进一步优选为10～25mV。通过使Zeta电位为0mV以上，从而带负电的细胞易于粘附。此外，通过使Zeta电位为50mV以下，从而能够减轻细胞毒性。
此外，通过将Zeta电位设为上述范围，从而仅在合适的培养条件下培养细胞，就能够更加容易地制作块状(颗粒状)的细胞结构体。该现象推测是由于以下的原因：通过将表面Zeta电位设为上述范围，从而能够对包覆培养面赋予不会引起细胞毒性的微弱的正电荷，此外还能够确保种植的细胞快速粘附、促进细胞活性的提高和细胞外基质的分泌，进而还能够适当地抑制细胞迁移而增强细胞间的结合。
需要说明的是，Zeta电位是指将用羟丙基纤维素包覆聚苯乙烯胶乳而成的粒子(Zeta电位：-5～+5mV)作为标准探测粒子，使用Zeta电位仪(例如，型号“ELSZ”、大塚电子公司制造等)进行测定，用Smoluchowski公式算出的值。
从提高本发明(VII)的效果的观点出发，作为水与上述包覆培养面的接触角，优选为50～90°，更优选为60～80°，进一步优选为62～78°。需要说明的是，水与包覆培养面的接触角是指在包覆培养面内的任意几个点上，按照JIS R3257测定的接触角的平均值。
(种植工序)
上述种植工序为在上述包覆细胞培养器中种植肝细胞和相对于上述100个肝细胞为10～50个比例的成纤维细胞的工序。细胞的种植可以混合全部细胞而一次性种植，也可以分成多次进行种植。此外，各细胞可以一次性种植，也可以分成多次进行种植。
在上述包覆细胞培养器的上述包覆培养面种植的细胞至少包含肝细胞、成纤维细胞。
作为上述肝细胞，能够使用例如从生物体采取的原代细胞；从iPS细胞、ES细胞诱导的肝细胞；HepG2细胞、HepRA细胞等肝癌细胞等，其中，从均衡转运蛋白、代谢活性、白蛋白产生等肝细胞功能、易于得到与成纤维细胞均匀分散的细胞结构体的观点出发，优选HepG2细胞、HepRA细胞。
上述肝细胞可以单独使用1种，也可以并用2种以上。
作为上述成纤维细胞，可举出来自皮下组织的成纤维细胞、滑膜、牙髓、骨髓、来自皮下脂肪份间充质干细胞等。其中，从易于得到免疫耐受、对共培养的细胞的影响小、且粘附性强、肝细胞与成纤维细胞更均匀的分散的细胞结构体的观点出发，优选来自皮下脂肪的间充质干细胞。
上述成纤维细胞可以单独使用1种，也可以并用2种以上。
在上述种植工序中，还可以种血管内皮细胞。
上述血管内皮细胞可以单独使用1种，也可以并用2种以上。
在上述种植工序中，还可以种脂肪细胞。作为上述脂肪细胞，可举出例如来自脂肪组织的粘附性脂肪细胞等。
上述脂肪细胞可以单独使用1种，也可以并用2种以上。
在上述种植工序中，还可以种植免疫细胞。从得到更接近于发生了肝功能衰竭的组织的细胞结构体的观点出发，作为上述免疫细胞，优选包含选自单核细胞、粒细胞、淋巴细胞以及巨噬细胞中的至少1种。
上述免疫细胞可以单独使用1种，也可以并用2种以上。
在上述种植工序中，成纤维细胞相对于100个肝细胞的比例为10～50个，优选为10～45个。通过将成纤维细胞的比例相对于100个肝细胞设为10个以上，从而混合细胞成团而易于形成块状的细胞结构体。此外，通过设为50个以下，则能够得到更接近于发生了肝功能衰竭的组织的细胞结构体。
在上述种植工序中，从得到更接近于发生了肝功能衰竭的组织的细胞结构体的观点出发，肝细胞在种植的全部细胞中的比例相对于总细胞数(100％)优选为50～95％。
在上述种植工序中，从得到更接近于发生了肝功能衰竭的组织的细胞结构体的观点出发，血管内皮细胞相对于100个肝细胞的比例优选为10～100个。
在上述种植工序中，从得到更接近于发生了肝功能衰竭的组织的细胞结构体的观点出发，脂肪细胞相对于100个肝细胞的比例优选为10～100个，更优选为50个。
此外，从得到更接近于发生了肝功能衰竭的组织的细胞结构体的观点出发，脂肪细胞相对于100个成纤维细胞的比例优选为100～500个。
其中，优选以相对于100个肝细胞为50个的比例包含脂肪细胞，且以相对于100个成纤维细胞为100～500个的比例包含脂肪细胞。
在上述种植工序中，从得到更接近于发生了肝功能衰竭的组织的细胞结构体的观点出发，免疫细胞相对于100个肝细胞的比例优选为10～100个。
在上述种植工序中，种植后的细胞在包覆培养面上的密度相对于上述包覆培养面的表面积，优选为90～100％汇合，更优选为95～100％汇合，进一步优选为99～100％汇合。当种植的细胞密度为上述范围时，各细胞能够不各自形成群落地维持均匀分散的状态进行凝聚，从而形成细胞结构体。此外，当细胞密度高时，种植的混合细胞不易增殖，能够在细胞增殖前形成块状的细胞结构体，因此，能够形成种植的混合细胞和细胞数的比例形态的细胞结构体。此外，也不易受到由于细胞的增殖速度的不同而带来的影响。此外，种植的细胞有时增殖时的性质会发生变化，当细胞不易增殖时，能够形成包含与种植时同样性质的细胞的细胞结构体。
根据细胞的种类，作为种植后的细胞在包覆培养面上的密度，优选为20～15000个/mm2。例如，在包覆培养面的面积为200mm2的24孔细胞培养板中加入1.0mL的细胞液进行种植的情况下，优选4×104～30×104个/mL。另外，种植的细胞为活细胞。
细胞的种植能够例如将预先静置于37℃的培养箱中的包覆细胞培养器取出放在室温的净化台上来进行。
另外，细胞优选在培养基中稀释而种植。作为稀释的培养基，只要是能够培养细胞的培养基则没有特别限定。
(培养工序)
上述培养工序为对种植的细胞进行培养而得到块状的细胞结构体的工序。
在发生了肝功能衰竭的组织中，已知有不仅成纤维细胞过量增殖、而且炎性的免疫细胞大量存在的情况。就在试管内再现包含免疫细胞的肝功能衰竭组织而言，期望制作除了肝细胞、成纤维细胞以外，还加入了作为悬浮细胞的免疫细胞的细胞结构体。然而，在细胞结构体的制造需要1～2周的现有的悬滴法、低粘附性培养皿中，这些是很困难的。其理由可举出例如：除了增殖速度不同、最合适的培养基的组织不同以外，混合的巨噬细胞在长的培养期间中向成纤维细胞分化的可能性高。
在本实施方式(VII)的制造方法中，在上述培养工序中，还可以将免疫细胞添加于包覆细胞培养器。作为添加免疫细胞的时机，优选为上述种植工序以后(在细胞的种植同时以后)，且得到细胞结构体之前，更优选在种植的细胞附着于包覆培养面而形成片状的细胞结构体(参考图42(iii))以后，且片状的细胞结构体开始向包覆培养面中央部凝聚、端部远离包覆培养面开始翻卷从而形成端部翻卷的细胞结构体之前。即，免疫细胞可以在种植工序时种植，也可以在种植工序后添加。
具体而言，优选在细胞的种植同时以后、细胞(例如，最后种植的细胞)种植后48小时以内添加免疫细胞。
通过在上述时机添加免疫细胞，从而作为悬浮细胞的免疫细胞由于重力的作用而沉积，在与包覆培养面粘附的细胞聚集成钱包状时免疫细胞进入内部，由此能够形成内部包含免疫细胞的细胞结构体，能够得到更接近于肝功能衰竭模型的组织的细胞结构体(参考图42)。
作为培养种植的混合细胞的条件，能够使用例如通常的37℃的细胞培育箱而进行。细胞的培养优选连续进行直到形成块状的细胞结构体，具体而言，优选培养5～96小时，更优选培养9～50小时。
另外，在本实施方式(VII)的细胞结构体的制造方法中，令人惊讶的是，即使在混合粘附细胞(例如，肝细胞等)和悬浮细胞(例如，免疫细胞等)并进行种植、培养的情况下，也不需准备特殊的培养基，只要使用适于使用的粘附细胞的培养基或适于使用的悬浮细胞的培养基(优选适于粘附细胞的培养基)，将粘附细胞和悬浮细胞同时地进行种植、培养，就能够得到细胞结构体。
在上述包覆培养面粘附、培养的、包含上述肝细胞和上述成纤维细胞的混合细胞进行自凝聚，形成块状的细胞结构体。得到的细胞结构体在其块状的结构体内具有存活的细胞。
从得到肝细胞和成纤维细胞均匀分布的细胞结构体的观点出发，上述细胞结构体的尺寸例如优选外径为50～2500μm，更优选为50～500μm，进一步优选为50～150μm。
通过本实施方式(VII)的细胞结构体的制造方法而得到的细胞结构体是再现了发生了肝功能衰竭的组织的肝功能衰竭模型，能够用于例如肝功能衰竭、肝脏再生的研究、肝功能衰竭的药剂开发、肝功能衰竭的治疗方法开发的用途。
以下，对本实施方式(VII)的细胞结构体的制作方法的一个例子使用图41、42进行说明。
图41为包含肝细胞和成纤维细胞的细胞结构体的制造方法的一个例子。
在细胞培养器的培养面涂敷温度响应性聚合物进行包覆，准备具有包覆培养面的包覆细胞培养器(参考图41(i)(ii))。然后，在包覆培养面加入用培养基稀释了的肝细胞和成纤维细胞的混合细胞，种植混合细胞(参考图41(ii))。种植的混合细胞与整个包覆培养面的表面粘附(参考图41(iii))。另外，在该例子中，混合细胞的密度为100％汇合(参考图41(iii))。然后，与包覆培养面粘附的细胞开始向包覆培养面中央部凝聚，端部远离包覆培养面并开始翻卷，成为端部翻卷的细胞结构体(参考图41(iv))。然后，进一步继续凝聚成为块状的细胞结构体，从包覆培养面悬浮(参考图41(v))。
图42为包含肝细胞、成纤维细胞、巨噬细胞等免疫细胞(悬浮细胞)的细胞结构体的制造方法的一个例子。
在细胞培养器的培养面涂敷温度响应性聚合物进行包覆，准备具有包覆培养面的包覆细胞培养器(参考图42(i)(ii))。然后，在包覆培养面加入用培养基稀释了的肝细胞和成纤维细胞的混合细胞，种植混合细胞(参考图42(ii))。种植的混合细胞与整个包覆培养面的表面粘附，形成片状的细胞结构体(单层)(参考图42(iii))。另外，在该例子中，混合细胞的密度为100％汇合(参考图42(iii))。
形成肝细胞和成纤维细胞为片状的细胞结构体后，添加巨噬细胞等免疫细胞(图42(iv))。然后，与包覆培养面粘附的混合细胞开始向包覆培养面中央部凝聚，端部远离包覆培养面并开始翻卷，成为端部翻卷的细胞结构体(参考图42(v))。这时，包入附着于片状的细胞结构体的、或在培养皿中悬浮的免疫细胞。然后，进一步继续凝聚，成为包含肝细胞、成纤维细胞以及免疫细胞的块状的细胞结构体，从包覆培养面悬浮(参考图42(vi))。
实施例
以下，根据实施例对本发明进行更详细说明，但是本发明并不限定于下述的实施例。
[[发明(I)的实施例]]
在下述的试验中，只要没有特别限定，市售的试剂不进行进一步纯化而使用。
(试验I-A)温度响应性聚合物的制备
在容量50mL的软质玻璃制的透明小瓶中加入10.0g的2-N,N-二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯(DMAEMA)和5000μL的水，用磁力搅拌器进行了搅拌。然后，对该混合物(液体)进行10分钟的G1级高纯度(纯度：99.99995％)的氮气清洗(流速：2.0L/分钟)，由此使该混合物脱氧。另外，使用的DMAEMA中包含0.5重量％的作为阻聚剂的甲基对苯二酚(MEHQ)。
然后，使用圆型黑色荧光灯(NEC公司制，型号：FCL20BL，18W)对该反应物进行22小时的紫外线照射，由此使上述反应物聚合。反应物在5小时后带有粘性，在15小时后固化，以反应生成物的形式得到聚合物。使该反应生成物溶解于2-丙醇，并将溶液转移至透析管。然后，进行了72小时的透析，纯化了反应生成物。
将包含反应生成物的溶液使用纤维素混合酯制的0.2μm过滤器(东洋滤纸公司制造，型号：25AS020)过滤，通过使得到的滤液冷冻干燥，从而得到分子内离子复合体型的温度响应性聚合物(产量：6.8g、转化率：68％)。使用GPC(岛津公司制造，型号：LC-10vp系列)以聚乙二醇(Shodex公司制造，TSK系列)为标准物质，测定该聚合物的数均分子量(Mn)，确定为Mn＝100000(Mw/Mn＝10.0)。
(试验I-B)包覆培养面的准备
(试验I-B-1)使用了掩片的包覆培养面的准备
作为细胞培养器，使用了板(Prime Surface(注册商标)、SUMILON公司制造)(细胞低吸附性板)。
准备用亲水性基团修饰的硅制的构件(Tigers Polymer Corporation制造、K-125)(厚1.0mm)，在该片的中央部分设置俯视为甜甜圈形(外径8mm、内径4mm、宽2mm)的中空设计。使用具有该甜甜圈形的洞的片作为掩片。
在上述板的培养面上，铺上上述掩片，在室温条件下，向其中加入22.5μL的上述的试验I-A中制备的聚合物的水溶液(浓度：3ng/μL)，然后，使该水溶液在45℃干燥3小时。干燥后，剥离上述硅制的片。
(试验I-B-2)使用了细胞非粘附性的片的包覆培养面的准备
作为细胞培养器，使用了板(Prime Surface(注册商标)、SUMILON公司制造)(细胞低吸附性板)。
准备用亲水性基团修饰的硅制的构件，在该片的中央部分设置俯视为甜甜圈形(外径8mm、内径4mm或3mm、宽2mm或2.5mm)的中空设计。使用具有该甜甜圈形的洞的片作为内底。
在上述板的培养面上，在室温条件下，加入22.5μL的上述的试验I-A制备的聚合物的水溶液(浓度：3ng/μL)，然后，使该水溶液在45℃干燥3小时。干燥后在包覆的培养面上铺上上述内底。
使用Zeta电位仪(大塚电子公司制，型号：ELSZ)和平板试样用样品池单元测定包覆培养面的表面Zeta电位。在测定中，使用石英样品池作为样品池，作为标准探测粒子，使用用羟丙基纤维素(Mw＝30000)包覆聚苯乙烯胶乳(粒径：约500nm)而成的粒子(Zeta电位：-5～+5mV)。作为溶剂，在pH＝7、37℃的条件下使用10mM的氯化钠水溶液。使用Smoluchowski公式算出了Zeta电位。
结果被温度响应性聚合物包覆的第一包覆区域的表面的Zeta电位为+20mV。另外，如本领域技术人员公知的那样，上述Zeta电位的测定值具有±10％左右的偏差。
按照JIS R3257的标准，使用接触角测量仪(商品名：DMs-400，协和界面科学公司制)测定了水与细胞培养板的第一包覆区域的接触角，结果是70°±10°。
(试验I-C)细胞的种植、培养
(试验I-C-1)(参考例I)
使用上述试验I-B-1中准备的细胞培养器。
使GFP重组大鼠软骨细胞A(Rat Chondrocyte-A(GFP))悬浮于增殖用培养基(RPMI-1640+10％胎牛血清(FBS)+10ng/μL FGF-2；DMEM：Gibco公司制造；FBS：BiologicalIndustries Ltd.制造、批号715929；FGF-2：Peplotec公司制造、目录号400-29)中，制备细胞悬浮液。
在室温条件下，在上述板中加入细胞悬浮液使得细胞密度成为1.0×105个/cm2以上。
然后，在37℃、5％CO2的细胞培养培育箱中培养该细胞。
自开始培养起约15小时后，软骨细胞开始从包覆培养面凝聚，自开始培养起24小时后，形成甜甜圈形(环形)的细胞结构体。
自开始培养起3小时后，用再分化用培养基((达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)+10％胎牛血清(FBS)+10ng/μL重组大鼠TGF-β1(Rat TGF-β1recombinant)+50μg/mL抗坏血酸二磷酸；DMEM：Gibco公司制造、型号11965；FBS：Bio Rad公司制造、批号715929；重组大鼠TGF-β1：Peplotec公司制造、目录号100-21；抗坏血酸二磷酸(和光纯药公司制造、目录号196-01252)))更换培养基。
更换培养基后，进一步继续培养细胞21小时。
如上所述，在试验I-C-1(参考例I)中，在不存在细胞块的情况下，进行1次种植培养。
图7表示使用荧光显微镜观察试验I-C-1(参考例I)中的、自开始培养起24小时后(1天后)、2天后、6天后、10天后的细胞结构体的状态时的照片。特别地，下图为放大表示10天后的细胞结构体的照片的一部分的图。
根据图7所示的照片可知，构成得到的细胞结构体的细胞显示了软骨样的圆形的细胞形态。
图8表示将试验I-C-1(参考例I)中得到的细胞结构体以短轴方向截面切断时的照片。
根据图8所示的照片可知，构成得到的细胞结构体的细胞为团形且具有成茧形房间的独特的软骨小腔结构，在周围没有核的部分，很明显存在软骨素、胶原蛋白等细胞外基质，细胞结构体形成软骨样的组织。
(试验I-C-2)
使用上述试验I-B-2中准备的细胞培养器。
使GFP重组大鼠软骨细胞A(Rat Chondrocyte-A(GFP))悬浮于增殖用培养基(RPMI-1640+10％胎牛血清(FBS)+10ng/μLFGF-2；DMEM：Gibco公司制造；FBS：Bio Rad公司制造、批号715929；FGF-2：Peplotec公司制造、目录号400-29)中，制备细胞悬浮液。
在室温条件下，在上述板中加入细胞悬浮液使得细胞密度成为1.0×105个/cm2以上。
然后，在37℃、5％CO2的细胞培养培育箱中培养该细胞。
自开始培养起15小时后，软骨细胞开始从包覆培养面凝聚，自开始培养起24小时后，形成甜甜圈形(环形)的细胞结构体。细胞结构体在内底的凹部底面的宽度方向中央部分沉积而停留。
自开始培养起3～5小时后，用再分化用培养基(达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)+10％胎牛血清(FBS)+10ng/μL重组大鼠TGF-β1(Rat TGF-β1recombinant)+50μg/mL抗坏血酸二磷酸；DMEM：Gibco公司制造、型号11965；FBS：Bio Rad公司制造、批号715929；重组大鼠TGF-β1：Peplotec公司制造、目录号100-21；抗坏血酸二磷酸(和光纯药公司制造、目录号196-01252))更换培养基。
更换培养基后，进一步继续培养细胞24小时。
将培养基再次恢复成增殖用培养基，并且在细胞结构体的存在下，在室温条件下，加入细胞悬浮液以使得细胞密度成为1.0×105个/cm2以上。
然后，在37℃、5％CO2的细胞培养培育箱中培养该细胞。
自开始培养起15小时后，种植的软骨细胞开始从包覆培养面凝聚，以包入甜甜圈形(环形)的细胞结构体的方式进行凝聚，形成尺寸进一步放大了的甜甜圈形(环形)的细胞结构体。细胞结构体在内底的凹部底面的宽度方向中央部分沉积而停留。自开始培养起27小时后的细胞结构体的状态如图9所示。
重复进行3次在上述细胞结构体的存在下的种植培养。1～3次重复后的细胞结构体的状态如图9所示。
图9表示使用荧光显微镜观察试验I-C-2中的、自开始培养起27小时后、44小时后、70小时后、122小时后的细胞结构体的状态时的照片。上图表示在使用具有宽2mm的甜甜圈形状的中空的内底的情况下的细胞结构体的状态，下图表示在使用具有宽2.5mm的甜甜圈形状的中空的内底的情况下的细胞结构体的状态。
根据图9的照片可知，经过新的细胞的种植和培养，甜甜圈形(环形)的软骨细胞块的尺寸放大。
(试验I-C-3)
使用上述试验I-B-2中准备的细胞培养器。
使来自GFP重组Lewis鼠的脂肪组织的间充质干细胞(ADSC(Adipose-derivedvascular stromal cell))悬浮于增殖用培养基(达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)+10％胎牛血清(FBS)；DMEM：Gibco公司制造、型号11965；FBS：Bio Rad公司制造、批号715929)中，制备细胞悬浮液。
在室温条件下，在上述板中加入细胞悬浮液使得细胞密度成为1.0×105个/cm2以上。
然后，在37℃、5％CO2的细胞培养培育箱中培养该细胞。
自开始培养起6小时后，软骨细胞开始从包覆培养面凝聚，自开始培养起8小时后，形成甜甜圈形(环形)的细胞结构体。细胞结构体在内底的凹部底面的宽度方向中央部分沉积而停留。
自开始培养起1.5小时后，用软骨分化用培养基(达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)+10％胎牛血清(FBS)+1％ITS Premix+50μg/mL抗坏血酸二磷酸+10ng/μL重组大鼠TGF-β1(Rat TGF-β1recombinant)+10M地塞米松；DMEM：Gibco公司制造、型号11965；FBS：Bio Rad公公司制造、批号715929；ITS Premix：BD Biosciences Inc.制造、目录号354341；抗坏血酸二磷酸(和光纯药公司制造、目录号196-01252)；重组大鼠TGF-β1：Peplotec公司制造、目录号100-21；地塞米松：和光纯药公司制造、目录号047-18863)更换培养基。
更换培养基后，进一步继续培养细胞24小时。
将培养基再次恢复成增殖用培养基，并且在细胞结构体的存在下，在室温条件下，加入细胞悬浮液以使得细胞密度成为1.0×105个/cm2以上。
然后，在37℃、5％CO2的细胞培养培育箱中培养该细胞。
自开始培养起6小时后，种植的软骨细胞开始从包覆培养面凝聚，以包裹甜甜圈形(环形)的细胞结构体的方式进行凝聚，形成一次尺寸放大了的甜甜圈形(环形)的细胞结构体。自开始培养起8小时后的细胞结构体的状态如图10所示。
重复进行3次在上述细胞结构体的存在下的种植培养。1～3次重复后的细胞结构体的状态如图10所示。
图10表示使用荧光显微镜观察试验I-C-3中的、自开始培养起8小时后、20小时后、32小时后、42小时后的细胞结构体的状态时的照片。上图表示在使用具有宽2mm的甜甜圈形状的中空的内底的情况下的细胞结构体的状态，下图表示在使用具有宽2.5mm的甜甜圈形状的中空的内底的情况下的细胞结构体的状态。另外，最下图表示使用立体显微镜观察42小时后的细胞结构体的状态时的照片。
根据图10的照片可知，经过新的细胞的种植和培养，甜甜圈形(环形)的软骨细胞块的尺寸放大。
特别地从照片可知，重复3次种植培养后(自开始培养起42小时后)，甜甜圈形(环形)的软骨细胞块向内底的凹部外突出。
另外，能够对试验I-C-2和试验I-C-3中得到的甜甜圈形(环形)的软骨细胞块使用作为间充质细胞的ADSC细胞进一步进行1次种植培养工序，制备移植材料(未图示)。
(试验I-D)复合材料的制备
首先，作为管状结构体，准备以胶原蛋白作为主成分的生物管(例如，参考日本特开2004-261260号公报的实施例记载的方法)(外径：3mm、内径：2mm、长：20mm)。此外，作为芯材，准备硅制的棒状结构物(圆柱状的形状、长：20mm、外径：1.8mm)(参考图6(i))。
接着，从生物管的中空部的一端向另一端插入棒状结构物(参考图6(ii))。
然后，将4个试验I-C-2中制作的甜甜圈形的软骨细胞块间隔约1mm套入上述生物管，制备复合体(参考图6(iii))。
套入终止后3分钟后，在37℃、5％CO2的细胞培养培育箱中开始培养复合体。然后，对复合体进行培养21日。自开始培养起21天后的时刻，生物管与软骨细胞块一体化而制备了复合材料(参考图6(iv))。
图11(a)表示用肉眼观察试验I-D中的自开始培养起6天后的复合材料的状态时的照片。
图11(b)表示用肉眼观察试验I-D中的自开始培养起21天后的复合材料的状态时的照片。
图12放大表示了用肉眼观察试验I-D中的自开始培养起21天后的复合材料的一部分的状态时的照片。
如图12所示那样，在生物管的外表面形成了软骨组织。
另外，制备复合体时约1mm的软骨细胞块之间的间隔为约1mm。
图13表示用肉眼观察对试验I-D中制备的复合材料用镊子进行操作时的状态时的照片。(a)表示无操作时的外周表面的状态，(b)表示无操作时的内腔表面的状态，(c)表示对全体进行挤压时的状态，(d)表示向侧面的一部分进行拉伸时的状态。
如图13(a)～(d)所示可知，复合材料具有可承受上述通常操作的机械强度，软骨组织为牢固地粘附与生物管的状态。
图14表示用显微镜观察将在试验I-D中制备的复合材料供给苏木素伊红染色(HE染色)时的状态时的照片。(a)表示复合材料的外观照片，(b)表示通过沿着(a)的线A-A的面进行切断时的剖面图，(c)和(d)表示将(b)所示的照片部分进行了放大。
图14(c)、(d)中，染成粉色的部分(图中，实心箭头所示)为胶原蛋白，染成蓝紫色的部分为细胞。在此如上所示可知，生物管的胶原蛋白纤维和软骨细胞的细胞外基质进行了一体化。
[[发明(II)的实施例]]
以下，基于实施例对本发明(II)进行更详细说明，但是本发明并不限定于这些实施例。
(温度响应性聚合物的制备)
在容量50mL的软质玻璃制的透明小瓶中加入10.0g的2-N,N-二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯(DMAEMA)和5mL的水，用磁力搅拌器进行了搅拌。然后，对该混合物(液体)进行10分钟的G1级高纯度(纯度：99.99995％)的氮气清洗(流速：2.0L/分钟)，由此使该混合物脱氧。另外，使用的DMAEMA中包含0.5质量％的作为阻聚剂的甲基对苯二酚(MEHQ)。
然后，使用圆型黑色荧光灯(NEC公司制，型号：FCL20BL，18W)对该反应物进行22个小时的紫外线照射，由此使上述反应物聚合。反应物在5小时后带有粘性，在15小时后固化，以反应生成物的形式得到聚合物。使该反应生成物溶解于2-丙醇，并将溶液转移至透析管。然后，进行了72小时的透析，纯化了反应生成物。
将包含反应生成物的溶液使用纤维素混合酯制的0.2μm过滤器(东洋滤纸公司制造，型号：25AS020)过滤，通过使得到的滤液冷冻干燥，从而得到温度响应性(均)聚合物(产量：6.8g、转化率：68％)。使用GPC(岛津公司制造，型号：LC-10vp系列)以聚乙二醇(Shodex公司制造，TSK系列)为标准物质，测定该聚合物的数均分子量(Mn)，确定为Mn＝1.0×105g/mol(Mw/Mn＝10.0)。
用核磁共振装置(Varian公司制造，型号：Gemini300)，以重水(D2O)为标准物质测定上述的温度响应性聚合物的核磁共振光谱(NMR)。在下面示出代表性的峰。
1H-NMR(in D2O)δ0.8-1.2(br,-CH2-C(CH3)-),1.6-2.0(br,-CH2-C(CH3)-),2.2-2.4(br,-N(CH3)2),2.5-2.7(br,-CH2-N(CH3)2),4.0-4.2(br,-O-CH2-)。
在此，根据主链的甲基(δ0.8-1.2)的质子数(在DMAEMA的均聚物的情况下每分子单体中为3个)A和侧链的二甲基氨基(δ2.2-2.4)的甲基质子数(在DMAEMA的均聚物的情况下每分子单体中为6个)B，算出侧链具有的氨基的官能团数量和通过与聚合反应同时进行的侧链的酯键的水解反应而产生的侧链的羧基的官能团数量的比。
其结果，在上述的温度响应性聚合物的情况下是94∶6。将其换算成就包含阳离子型聚合物和阴离子型聚合物的2成分混合体系中的离子复合体而言的C/A比时，C/A比＝15.6。
上述的温度响应性聚合物的浊点按照以下方法进行测定。
制备温度响应性聚合物的3％水溶液，在20℃～40℃之间测定该水溶液在660nm的吸光度。
其结果，在20℃～30℃，水溶液是透明的且吸光度几乎是0，但是从31℃附近开始可在水溶液中观察到白色浑浊，在32℃吸光度急剧上升。由此，确认了温度响应性聚合物具有约为32℃的浊点。
此外，使温度响应性聚合物升温至37℃时，聚合物水溶液有良好的响应性，悬浊，然后水溶液整体固化。将该固化物保持在室温(25℃)，结果在几十小时期间一直保持固化的状态。然后，固化物缓慢溶解，转化成均匀的水溶液。当将固化了的聚合物冷却至4℃时，其迅速溶解。而且，即使重复进行上述升温及降温的操作，响应性也没有产生变化，因此确认了聚合物发生了可逆的相转移。
(包覆细胞培养器的制造)
将上述的温度响应性聚合物溶解于纯水中，制备温度响应性聚合物溶液。各温度响应性聚合物溶液中的温度响应性聚合物的浓度为：温度响应性聚合物a：0.125ng/μL、温度响应性聚合物b：0.25ng/μL、温度响应性聚合物c：0.5ng/μL、温度响应性聚合物d：1.0ng/μL。
在384孔板(Sumitomo Bakelite CO.,Ltd.制造、商品名“Prime Surface”(注册商标)、MS-9384U)的孔中，添加25μL的温度响应性聚合物a～d。
然后，通过在培育箱(40℃)中放置6小时，从而使涂敷的温度响应性聚合物的水溶液干燥，准备具有包覆区域A的包覆细胞培养器a～d。
将上述的温度响应性聚合物溶解于生理盐水中，制备温度响应性聚合物溶液。各温度响应性聚合物溶液中的温度响应性聚合物的浓度为：温度响应性聚合物e：6ng/μL、温度响应性聚合物f：12ng/μL、温度响应性聚合物g：24ng/μL。
在384孔板(Sumitomo Bakelite CO.,Ltd.制造、商品名“Prime Surface”(注册商标)、MS-9384U)的孔中，添加25μL的温度响应性聚合物e～g。另外，在该板的孔中，圆底的曲率半径(平均)R为约1.6mm，最大宽度L为约2.5mm。
然后，在培育箱(37℃)中放置3小时，准备具有包覆区域A的包覆细胞培养器e～g。另外，在包覆细胞培养器e～g中，在孔中添加的温度响应性聚合物溶液不进行干燥。
将上述的温度响应性聚合物溶解于纯水中，制备温度响应性聚合物溶液。各温度响应性聚合物溶液中的温度响应性聚合物的浓度为：温度响应性聚合物h：0.9pg/μL、温度响应性聚合物i：1.8pg/μL、温度响应性聚合物j：7.5pg/μL、温度响应性聚合物k：15pg/μL、温度响应性聚合物l：31pg/μL、温度响应性聚合物m：67pg/μL、温度响应性聚合物n：125pg/μL、温度响应性聚合物o：500pg/μL。
在384孔板(Sumitomo Bakelite CO.,Ltd.制造、商品名“Prime Surface”(注册商标)、MS-9384U)的孔中，添加2.5μL的温度响应性聚合物h～o。
然后，通过在培育箱(40℃)中放置6小时，从而使涂敷的温度响应性聚合物的水溶液干燥，准备具有包覆区域A的包覆细胞培养器h～o。
在384孔板(Sumitomo Bakelite CO.,Ltd.制造、商品名“Prime Surface”(注册商标)、MS-9384U)的孔中，添加25μL的生理盐水。
然后，在培育箱(37℃)中放置3小时，准备细胞培养器p。另外，细胞培养器p为未包覆温度响应性聚合物的细胞培养器。
[上皮细胞的培养方法]
(实施例II-1～II-35)
将人肝癌细胞(COSMO BIO公司、商品号“HepG2-500”)混合于培养基(DMAEM+10％FBS(Gibco公司制造、批号：715929)中，制备0.5×103cells/50μL(细胞溶液I)、1.0×103cells/50μL(细胞溶液II)、2.0×103cells/50μL(细胞溶液III)、4.0×103cells/50μL(细胞溶液IV)、8.0×103cells/50μL(细胞溶液V)的浓度的细胞溶液。
然后，在包覆细胞培养器a～g的各孔中，加入50μL的细胞溶液I～V，种植细胞。各实施例中的包覆细胞培养器、细胞溶液的组合如表1所示。
然后，在细胞培育箱(37℃、5％CO2)中，培养24小时。然后，用显微镜(NikonCorporation制造、ECLIPSE-Ti)进行观察。
(实施例II-36～II-75)
将人肝癌细胞(COSMO BIO公司、商品号“HepG2-500”)混合于培养基(DMAEM+10％FBS(Gibco公司制造、批号：715929)中，制备0.5×103cells/25μL(细胞溶液VI)、1.0×103cells/25μL(细胞溶液VII)、2.0×103cells/25μL(细胞溶液VIII)、4.0×103cells/25μL(细胞溶液IX)、8.0×103cells/25μL(细胞溶液X)的浓度的细胞溶液。
然后，在包覆细胞培养器h～o的各孔中，加入25μL的细胞溶液VI～X，种植细胞。各实施例中的包覆细胞培养器、细胞溶液的组合如表1所示。
然后，在细胞培育箱(37℃、5％CO2)中，培养24小时。然后，用显微镜(NikonCorporation制造、ECLIPSE-Ti)进行观察。
(比较例II-1～II-5)
在细胞培养器p的孔中，加入50μL的细胞溶液I～V，种植细胞。各比较例中的包覆细胞培养器、细胞溶液的组合如表1所示。
然后，在细胞培育箱(37℃、5％CO2)中，培养24小时。然后，用显微镜(NikonCorporation制造、ECLIPSE-Ti)进行观察。
[细胞结构体的制造方法]
(实施例II-76～II-80)
在包覆细胞培养器e的孔中，加入50μL的细胞溶液I～V，种植细胞。各实施例中的包覆细胞培养器、细胞溶液的组合如表2所示。
然后，在细胞培育箱(37℃、5％CO2)中，培养24小时，用显微镜(NikonCorporation制造、ECLIPSE-Ti)进行观察。然后，确认在全部孔的底面形成块状的细胞结构体。此外，对下述的细胞结构体的剥离难度进行评价。其结果如表2所示。
(实施例II-81～II-100)
在包覆细胞培养器h～k的孔中，加入25μL的细胞溶液VI～X，种植细胞。各实施例中的包覆细胞培养器、细胞溶液的组合如表2所示。
然后，在细胞培育箱(37℃、5％CO2)中，培养24小时，用显微镜(NikonCorporation制造、ECLIPSE-Ti)进行观察。然后，确认在全部孔的底面形成块状的细胞结构体。此外，对下述的细胞结构体的剥离难度进行评价。其结果如表2所示。
(比较例II-6～II-10)
在细胞培养器p的孔中，加入50μL的细胞溶液I～V，种植细胞。各比较例中的细胞培养器、细胞溶液的组合如表2所示。
然后，在细胞培育箱(37℃、5％CO2)中，培养24小时，用显微镜(NikonCorporation制造、ECLIPSE-Ti)进行观察。
HepG2不附着于培养皿而在底面凝聚。凝聚的细胞结构体仅摇动板即发生移动，并未附着于底面。此外，在进行吸量(pipetting)时，可能由于细胞外基质的分泌少，因此也可观察到细胞结构体破碎的例子。
[评价]
(细胞向包覆区域的粘附)
用显微镜(Nikon Corporation制造，ECLIPSE-Ti)观察实施例II-1～II-75、比较例II-1～II-5中培养的HepG2。然后，将HepG2与包覆区域粘附、能够培养的情况评价为良好(○)，将未与包覆区域粘附的情况评价为不良(×)。
(细胞结构体的外观)
用显微镜(Nikon Corporation制造，ECLIPSE-Ti)观察实施例II-76～II-100、比较例II-6～II-10中得到的细胞结构体。然后用移液管(Eppendorf公司制造、商品名：“Reference”)进行强烈地吸量，再次观察细胞结构体。然后，按照以下的基准评价细胞结构体的外观。
○(良好)：形成块状的细胞结构体。此外，即使强烈地吸量，细胞结构体也没有破碎。
×(不良)：虽然形成了块状的细胞结构体，但当强烈地吸量时，细胞结构体破碎。
(细胞结构体的剥离难度)
用移液管(Eppendorf公司制造、商品名：“Reference”)手动吸量实施例II-76～II-100、比较例II-6～II-10中得到的细胞结构体，测定直至细胞结构体从培养面剥离为止的次数。
◎(优)：即使超过10次吸量，细胞结构体也没有剥离。
○(良好)：通过2～10次吸量，细胞结构体剥离。
△(普通)：通过1次吸量，细胞结构体剥离。
×(不良)：细胞结构体未与培养面粘附。
[表1-1]
[表1-2]
[表2]
[上皮间质转化诱导剂]
(实施例II-101)
将人肝癌细胞(COSMO BIO公司、商品号“HepG2-500”)混合于培养基(DMAEM+10％FBS(Gibco公司制造、批号：715929)中，制备4.0×103cells/25μL的浓度的细胞溶液。
在24孔板(Sumitomo Bakelite CO.,Ltd.公司制造、商品名“SumilonCelltight”、MS-9024X)的孔的中心部分，使用微型移液管(柴田科学制造、DIGIFIT)以0.5μL的液滴的形式滴加上述的温度响应性聚合物d(1.0ng/μL)。
然后，通过在培育箱(37℃)中放置3小时，从而使涂敷的温度响应性聚合物的水溶液干燥，准备具有包覆区域A的包覆细胞培养器q。
然后，在包覆细胞培养器q的孔中，加入1000μL的细胞溶液I，种植细胞。
然后，在细胞培育箱(37℃、5％CO2)中，培养96小时。然后，用显微镜(NikonCorporation制造、ECLIPSE-Ti)进行观察。
(有无上皮细胞向间质细胞的转化)
用显微镜(Nikon Corporation制造，ECLIPSE-Ti)观察实施例II-101中培养的HepG2。然后，评价与包覆区域粘附的HepG2的粘附的状态，判定有无上皮细胞向间质细胞的转化。
[表3]
图17表示在本发明中使用的温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物上对上皮细胞了进行96小时培养时的状态的照片。图中，虚线包围的部分表示包覆区域A，黑框箭头表示在包覆区域A粘附、生长的细胞，黑色实心箭头表示在非包覆区域粘附、生长的细胞。
如图17所示可知，在培养96小时后，包覆区域A上培养的细胞实现汇合，具有成纤维细胞样的形态，另一方面非包覆区域上培养的细胞散落成铺路石样(岛状)，保持了上皮细胞的特征。
根据该结果，显示了在本发明中使用的温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物具有上皮间质转化的效果。
[[发明(III)的实施例]]
以下，基于实施例对本发明(III)进行更详细说明，但是本发明并不限定于这些实施例。
(实施例III-1)
(立体组织体的制作装置的制造)
使用表面为网眼结构的不锈钢管(FujiFilter制造、)作为轴，使用切取了商品名“Prime Surface”(注册商品)(Sumitomo Bakelite CO.,Ltd.制造、商品号“MS-9024X”)的一部分而设置了通孔(直径约3mm)的物品作为培养面，制造培养面和通孔相接的装置。培养面为大致圆形，其外径为约25mm。另外，装置的形状为图18的形状。
在容量50mL的软质玻璃制的透明小瓶中入10.0g的2-N,N-二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯(DMAEMA)和5mL的水，用磁力搅拌器进行了搅拌。然后，对该混合物(液体)进行10分钟的G1级高纯度(纯度：99.99995％)的氮气清洗(流速：2.0L/分钟)，由此使该混合物脱氧。另外，使用的DMAEMA中包含0.5质量％的作为阻聚剂的甲基对苯二酚(MEHQ)。
然后，使用圆型黑色荧光灯(NEC公司制，型号：FCL20BL，18W)对该反应物进行22个小时的紫外线照射，由此使上述反应物聚合。反应物在5小时后带有粘性，在15小时后固化，以反应生成物的形式得到聚合物。使该反应生成物溶解于2-丙醇，并将溶液转移至透析管。然后，进行了72小时的透析，纯化了反应生成物。
将包含反应生成物的溶液使用纤维素混合酯制的0.2μm过滤器(东洋滤纸公司制造，型号：25AS020)过滤，通过使得到的滤液冷冻干燥，从而得到温度响应性(均)聚合物(产量：6.8g、转化率：68％)。使用GPC(岛津公司制造，型号：LC-10vp系列)以聚乙二醇(Shodex公司制造，TSK系列)为标准物质，测定该聚合物的数均分子量(Mn)，确定为Mn＝1.0×105g/mol(Mw/Mn＝10.0)。
用核磁共振装置(Varian公司制造，型号：Gemini300)，以重水(D2O)为标准物质测定上述的温度响应性聚合物的核磁共振光谱(NMR)。下述结果表示代表性的峰。
1H-NMR(in D2O)δ0.8-1.2(br,-CH2-C(CH3)-),1.6-2.0(br,-CH2-C(CH3)-),2.2-2.4(br,-N(CH3)2),2.5-2.7(br,-CH2-N(CH3)2),4.0-4.2(br,-O-CH2-)
在此，根据主链的甲基(δ0.8-1.2)的质子数(在DMAEMA的均聚物的情况下每分子单体中为3个)A和侧链的二甲基氨基(δ2.2-2.4)的甲基质子数(在DMAEMA的均聚物的情况下每分子单体中为6个)B，算出侧链具有的氨基的官能团数量和通过与聚合反应同时进行的侧链的酯键的水解反应而产生的侧链的羧基的官能团数量的比。
其结果，在上述的温度响应性聚合物的情况下是94∶6。将其换算成就包含阳离子型聚合物和阴离子型聚合物的2成分混合体系中的离子复合体而言的C/A比时，C/A比＝15.6。
上述的温度响应性聚合物的浊点按照以下方法进行测定。
制备温度响应性聚合物的3％水溶液，在20～40℃之间测定该水溶液在660nm的吸光度。
其结果，在20～30℃，水溶液是透明的且吸光度几乎是0，但是从31℃附近开始可在水溶液中观察到白色浑浊，在32℃吸光度急剧上升。由此，确认了温度响应性聚合物具有约为32℃的浊点。
此外，当使温度响应性聚合物升温至37℃时，聚合物水溶液有良好的响应性，悬浊，然后水溶液整体固化。将该固化物保持在室温(25℃)，结果在几十小时期间一直保持固化的状态。然后，固化物缓慢溶解，转化成均匀的水溶液。当将固化了的聚合物冷却至4℃时，其迅速溶解。而且，即使重复进行上述升温及降温的操作，响应性也没有产生变化，因此确认了聚合物发生了可逆的相转移。
将上述的温度响应性聚合物溶解于纯水中，制备温度响应性聚合物溶液(最终浓度15ng/μL)。将该溶液涂敷于上述装置的整个培养面，通过在培育箱(40℃)中放置1小时，从而使涂敷的温度响应性聚合物的水溶液干燥，准备具有包覆培养面的立体组织体的制作装置。
(实施例III-2)
使用表面为网眼结构的不锈钢管(Fuji Filter制造、)作为轴，使用切取了商品名“Prime Surface”(注册商品)(Sumitomo Bakelite CO.,Ltd.制造、商品号“MS-9024X”)的一部分而设置了通孔(直径约3.2mm)的物品作为培养面，制造培养面和通孔之间有空隙的装置。培养面为大致圆形，其外径为约25mm，培养面与通孔之间的间隙为0.2mm。另外，装置的形状为图20的形状。
与实施例III-1同样地进行，用温度响应性聚合物包覆培养面而准备具有包覆培养面的立体组织的制作装置。
(实施例III-3)
(环状的立体组织体的制作)
将实施例III-1中制造的立体组织体的制作装置放入内径30mm的锥形管(IWAKI公司制造、商品代码“2345-050”)中，浸于培养基(DMEM+10％FBS(Biological Industries公司制造、批号：715929)+50μg/mL抗坏血酸二磷酸盐(和光纯药制造、商品号：196-1252))中。然后，将来自GFP重组Lewis鼠脂肪组织的间充质干细胞(ADSC)混合在与浸渍了制作装置的培养基同样的培养基中，制备细胞悬浮液。然后，添加2mL 60×105个/mL的细胞悬浮液，种植细胞。
然后，在细胞培育箱(37℃、5％CO2)中，培养24小时，确认得到缠绕于轴周围的环状的立体组织体。
得到的环状的立体组织体与图24大致相同。得到的环状的立体组织体为以ADSC为主成分的立体组织体。
(实施例III-4)
(环状的立体组织体的制作)
使用实施例III-2中制作的立体组织体的制作装置，除此以外，与实施例III-3同样地制作环状的立体组织体，结果确认凝聚的细胞越过培养面和通孔之间的间隙而得到缠绕于轴周围的环状的立体组织体。
图24表示实施例III-4中得到的环状的立体组织体。得到的环状的立体组织体为以ADSC为主成分的立体组织体。
(实施例III-5)
(管腔状的立体组织体的制作)
将实施例III-1中制造的立体组织体的制作装置放入内径30mm的锥形管(IWAKI公司制造、商品代码“2345-050”)中，浸于培养基(RPMI-1640+10％FBS(BiologicalIndustries公司制造、批号：715929)+10ng/μL rat TGF-β1recombinant(PEPROTECH公司制造、商品号：100-21)+50μg/mL抗坏血酸二磷酸(和光纯药工业株式会社制造、商品号：196-01252))中。然后，将按照规定的方法从GFP重组Lewis鼠膝关节采取的软骨细胞混合在与浸渍了制作装置的培养基同样的培养基中，制备细胞悬浮液。然后，添加2mL 60×105个/mL的细胞悬浮液，种植细胞，在细胞培育箱(37℃、5％CO2)中，培养48小时，确认得到缠绕于轴周围的环状的立体组织体。
然后，使培养面向轴的延伸方向下侧移动0.5mm，进一步添加2mL上述细胞悬浮液，再次种植细胞，在细胞培育箱(37℃、5％CO2)中，培养48小时(第2次的细胞种植、培养)。
同样地继续进行细胞的种植、培养，合计进行9次种植和培养的重复操作。
然后，确认得到9个环状的立体组织体互相连接而粘附的、管腔状的立体组织体。
图25表示实施例III-5中得到的管腔状的立体组织体。另外，图25为抽出作为轴的不锈钢管而调换成硅树脂制的管后拍摄的照片。
(实施例III-6)
(管腔状的立体组织体的制作)
使用III-2中制造的立体组织体的制作装置，使培养面向轴的延伸方向上侧移动0.2mm，除此以外，与实施例III-5同样地制作管腔状的立体组织体，确认得到9个环状的立体组织体互相连接而粘附的、管腔状的立体组织体。
得到的管腔的立体组织体与图25大致相同。
(实施例III-7)
(具有多个培养面的立体组织体的制作装置的制造)
使用表面为网眼结构的不锈钢管(Fuji Filter制造、)作为轴，使用切取了商品名“Prime Surface”(注册商品)(Sumitomo Bakelite CO.,Ltd.制造、商品号“MS-9024X”)的一部分而设置了通孔(直径约3.2mm)的物品作为培养面，制造培养面和通孔之间有空隙的、具有9个培养面的装置。全部的培养面均为大致圆形，其外径为约24mm，培养面与通孔之间的间隙为0.2mm。另外，装置的形状为1个轴贯通9个培养面的通孔的、在图26中具有9个培养面的形状。
与实施例III-1同样地进行，用温度响应性聚合物包覆全部的培养面而准备具有包覆培养面的立体组织的制作装置。
另外，各培养面的间隔为1mm。
(实施例III-8)
(管腔状的立体组织体的制作)
将实施例III-7中制造的立体组织体的制作装置放入内径30mm的锥形管(IWAKI公司制造、商品代码“2345-050”)中，浸于培养基(DMEM+10％FBS(Biological Industries公司制造、批号：715929))中。然后，将来自大鼠皮下脂肪的间充质干细胞(ADSC)混合在与浸渍了制作装置的培养基同样的培养基中，制备细胞悬浮液。然后，添加2mL 60×106个/mL的细胞悬浮液，在各包覆培养面上种植细胞，在细胞培育箱(37℃、5％CO2)中，培养48小时，确认从各包覆培养面得到缠绕于轴周围的环状的立体组织体。
然后，继续进一步培养48小时，结果确认得到从各包覆培养面形成的9个环状的立体组织体互相连接而粘附的、管腔状的立体组织体。
图28A表示实施例III-8中得到的管腔状的立体组织体(3.8％戊二醛固定后的照片)、图28B表示HE染色切片图像。
(实施例III-9)
(人工血管)
将使用细胞连接试剂盒进行了红色荧光标记的来自脐带血的血管内皮细胞混合于培养基(DMEM+10％FBS(Biological Industries公司制造、批号：715929)中，以60×105个/mL的密度一次1mL添加到实施例III-7中制造的立体组织体的制作装置的9个培养面，进行细胞种植。将其放入内径30mm的锥形管(IWAKI公司制造、商品代码“2345-050”)中，浸于培养基(DMEM+10％FBS(Biological Industries公司制造、批号：715929)中，在细胞培育箱(37℃、5％CO2)中培养48小时，确认得到缠绕于轴周围的血管内皮细胞的环状的立体组织体。
然后，将来自GFP敲入大鼠(GFP knock-in rats)皮下脂肪的间充质干细胞混合在与浸渍了制作装置的培养基同样的培养基中，制备间充质干细胞悬浮液。添加10mL 60×105个/mL，种植细胞，在细胞培育箱(37℃、5％CO2)中，培养48小时，确认得到在血管内皮细胞的层的外围具有间充质干细胞的层的、2层结构的9个环状的立体组织体互相连接而粘附的、管腔状的立体组织体(人工血管)。
图29表示实施例III-9中得到的人工血管的荧光显微镜图像。
(实施例III-10)
(人工气管)
将实施例III-1中制造的立体组织体的制作装置放入内径30mm的锥形管(IWAKI公司制造、商品代码“2345-050”)中，浸于培养基(DMEM+10％FBS(Biological Industries公司制造、批号：715929)+50μg/mL抗坏血酸二磷酸盐(和光纯药制造、商品号：196-1252))中。
然后，将来自比格犬膝关节的软骨细胞混合在与浸渍了制作装置的培养基同样的培养基中，制备软骨细胞悬浮液。然后，添加2mL 60×105个/mL的软骨细胞悬浮液，种植细胞，在细胞培育箱(37℃、5％CO2)中，培养48小时，确认得到缠绕于轴周围的软骨细胞的环状的立体组织体。
然后，使培养面向轴的延伸方向下侧移动0.5mm，添加2mL的成纤维细胞悬浮液(60×105个/mL)，再次种植细胞，在细胞培育箱(37℃、5％CO2)中，培养48小时(第2次的细胞种植、培养)，上述成纤维细胞悬浮液是将来自大鼠脂肪组织的间充质干细胞(ADSC)混合在与浸渍了制作装置的培养基同样的培养基中而制备的。
交替使用软骨细胞、间充质干细胞。然后，确认得到6个环状的立体组织体互相连接而粘附的、管腔状的立体组织体(人工气管)。
图30表示实施例III-10中得到的人工血管。另外，图30为抽出作为轴的不锈钢管而调换成硅树脂制管后拍摄的照片。
(实施例III-11)
(以蛋白质作为主成分的立体组织体)
将实施例III-1中制造的立体组织体的制作装置放入内径30mm的锥形管(IWAKI公司制造、商品代码“2345-050”)中，浸于培养基(DMEM+10％FBS(Biological Industries公司制造、批号：715929)+50μg/mL抗坏血酸二磷酸盐(和光纯药制造、商品号：196-1252))中。
然后，将来自大鼠脂肪组织的间充质干细胞(ADSC)细胞混合在与浸渍了制作装置的培养基同样的培养基中，制备细胞悬浮液。然后，添加2mL60×105个/mL的细胞悬浮液，种植细胞，在细胞培育箱(37℃、5％CO2)中，培养48小时，确认得到缠绕于轴周围的环状的立体组织体。
然后，使培养面向轴的延伸方向下侧移动0.5mm，进一步添加2mL上述细胞悬浮液，再次种植细胞，在细胞培育箱(37℃、5％CO2)中，培养48小时(第2次的细胞种植、培养)。
同样地继续进行细胞的种植、培养，合计进行6次种植和培养的重复操作。
然后，确认得到6个环状的立体组织体互相连接而粘附的、管腔状的立体组织体。
然后，使用十二烷基硫酸钠和乙醇对得到的管腔状的立体组织体进行处理后，使用3.8％的戊二醛进行处理，由此使立体组织体中的细胞死亡，确认得到管腔状的以蛋白质作为主成分的立体组织体。
图31表示实施例III-11中得到的以蛋白质作为主成分的立体组织体。
[[发明(IV)的实施例]]
以下，根据实施例对本发明(IV)进行更详细说明，但是本发明并不限定于下述的实施例。
在下述的试验中，只要没有特别限定，市售的试剂不进行进一步纯化而使用。
(实施例IV-A1)
(试验IV-A1)聚合物的制造
在容量50mL的软质玻璃制的透明小瓶中入10.0g的2-N,N-二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯(DMAEMA)和5mL的水，用磁力搅拌器进行了搅拌。然后，对该混合物(液体)进行10分钟的G1级高纯度(纯度：99.99995％)的氮气清洗(流速：2.0L/分钟)，由此使该混合物脱氧。另外，使用的DMAEMA中包含0.5质量％的作为阻聚剂的甲基对苯二酚(MEHQ)。
然后，使用圆型黑色荧光灯(NEC公司制，型号：FCL20BL，18W)对该反应物进行22个小时的紫外线照射，由此使上述反应物聚合。反应物在5小时后带有粘性，在15小时后固化，以反应生成物的形式得到聚合物。使该反应生成物溶解于2-丙醇，并将溶液转移至透析管。然后，进行了72小时的透析，纯化了反应生成物。
将包含反应生成物的溶液使用纤维素混合酯制的0.2μm过滤器(东洋滤纸公司制造，型号：25AS020)过滤，通过使得到的滤液冷冻干燥，从而得到温度响应性(均)聚合物(产量：6.8g、转化率：68％)。使用GPC(岛津公司制造，型号：LC-10vp系列)以聚乙二醇(Shodex公司制造，TSK系列)为标准物质，测定该聚合物的数均分子量(Mn)，确定为Mn＝1.0×105g/mol(Mw/Mn＝10.0)(实施例聚合物1)。
用核磁共振装置(Varian公司制造，型号：Gemini300)，以重水(D2O)为标准物质测定上述的温度响应性聚合物的核磁共振光谱(NMR)。下述结果表示代表性的峰。
1H-NMR(in D2O)δ0.8-1.2(br,-CH2-C(CH3)-),1.6-2.0(br,-CH2-C(CH3)-),2.2-2.4(br,-N(CH3)2),2.5-2.7(br,-CH2-N(CH3)2),4.0-4.2(br,-O-CH2-)。
在此，根据主链的甲基(δ0.8-1.2)的质子数(在DMAEMA的均聚物的情况下每分子单体中为3个)A和侧链的二甲基氨基(δ2.2-2.4)的甲基质子数(在DMAEMA的均聚物的情况下每分子单体中为6个)B，算出侧链具有的氨基的官能团数量和通过与聚合反应同时进行的侧链的酯键的水解反应而产生的侧链的羧基的官能团数量的比。
其结果，在上述的温度响应性聚合物的情况下是94∶6。将其换算成就包含阳离子型聚合物和阴离子型聚合物的2成分混合体系中的离子复合体而言的C/A比时，C/A比＝15.6。
制备实施例聚合物1的3％水溶液，在20℃～40℃之间测定该水溶液在660nm的吸光度。
其结果，在20℃～30℃，水溶液是透明的且吸光度几乎是0，但是从31℃附近开始可在水溶液中观察到白色浑浊，在32℃吸光度急剧上升。由此，确认了上述聚合物具有约为32℃的浊点。
另外，当使实施例聚合物升温至37℃时，聚合物水溶液有良好的响应性，悬浊，然后水溶液整体固化。将该固化物保持在室温(25℃)，结果在几十小时期间一直保持固化的状态。然后，固化物缓慢溶解，转化成均匀的水溶液。当将固化了的聚合物冷却至4℃时，其迅速溶解。而且，即使重复进行上述升温及降温的操作，响应性也没有产生变化，因此确认了聚合物发生了可逆的相转移。
(试验IV-A2)细胞结构体的制造
在实施例IV-A1中，使用通过涂敷、干燥而制备的培养面，进行细胞结构体的制造。
作为细胞培养器，使用聚苯乙烯制的35mm细胞培养板(IWAKI公司制造、型号：3000-035-MYP、每个孔的底面积：9cm2)。
接着，在培养面上，将冷却到浊点以下的40μL的温度响应性聚合物的水溶液(浓度：15μg/mL)涂敷整个表面。
然后，通过放置在净化台上，从而使涂敷的温度响应性聚合物的水溶液干燥。
这样在细胞培养板的培养面设置了用温度响应性聚合物包覆的包覆区域。
(试验IV-A3)Zeta电位的测定
使用Zeta电位仪(大塚电子公司制造，型号：ELSZ)和平板试样用样品池单元，对按照与(试验IV-A2)的步骤同样的步骤在细胞培养板的小片设置的包覆区域的表面Zeta电位进行测定。
具体而言，将小片的试样密接于石英样品池的下表面，并向样品池内部注入探测粒子的悬浮液。在此，作为标准探测粒子，使用的是用羟丙基纤维素(Mw＝30000)包覆聚苯乙烯胶乳(粒径：约500nm)而成的粒子(Zeta电位：-5～+5mV)。此外，作为溶剂，在pH＝7、37℃的条件下使用了10mM的氯化钠水溶液。然后，使用Smoluchowski公式算出了Zeta电位。
非包覆的细胞培养板的小片的表面Zeta电位是-68mV，是本领域技术人员所公知的通常的热塑性树脂的固体表面Zeta电位的值。
另一方面，用温度响应性聚合物包覆过的细胞培养板的小片的表面Zeta电位是+20mV。
另外，如本领域技术人员公知的那样，在以往的技术中，固体表面Zeta电位的测定值具有±10％左右的偏差，此外，在试样的制备工序中涂布操作本身也存在偏差，因此，上述Zeta电位的测定值可具有一定程度的误差。
(试验IV-A4)接触角的测定
按照JIS R3257的标准，使用接触角测量仪(商品名：DMs-400，协和界面科学公司制)测定了水与细胞培养板的包覆区域的接触角，结果是70°±10°。
(试验IV-A5)细胞培养
在此，使标记了GFP的来自大鼠皮下脂肪的间充质脂肪干细胞3.0×105个/mL悬浮在完全培养基(达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)+10％胎牛血清(FBS)溶液；DMEM：Gibco公司制，型号：11995-065；FCS：美国英杰生命技术公司(Invitrogen Corporation)制造，批号：928696)中，制备细胞悬浊液。
使用移液管，适当选择0.5μL、2μL、4μL、20μL量，在100个位置以液滴的形式滴加细胞悬浊液(参考图32(iv))。液滴的形状大致为正圆形，液滴的直径在为0.5μL的情况下为1mm，在为2μL的情况下为2mm，在为4μL的情况下为3mm，在为20μL的情况下为5.5mm。液滴间的间隔不管是哪种液滴之间均设为200μm以上。液滴底面积相对于包覆区域的面积的比例为约75％。
将该种植的来自大鼠皮下脂肪的脂肪干细胞在37℃、5％CO2气氛的细胞培养培育箱中培养8小时。
自开始培养起0小时后(刚刚滴加后)，脂肪干细胞与整个包覆区域表面粘附(参考图32(v))。
自开始培养起2小时后，位于包覆区域外边缘附近的细胞开始主动地剥离。
自开始培养起历经3小时后～6小时后，从包覆区域的外边缘侧向包覆区域的中心侧缓慢地进行细胞的主动剥离。
从开始培养起8小时后，最终根据各包覆区域中的培养，形成了与包覆区域的数量相当的、具有球状结构的细胞结构体(参考图32(vi))。
形成的球状的细胞结构体为均具有对应于液滴的量的期望的尺寸的、大致球形的调控了形状的细胞结构体。
(实施例IV-A2～IV-A5)
关于实施例IV-A2，通过调节聚合物的制造条件，将包覆区域的表面Zeta电位由+20mV变更为+15mV，除此以外与上述实施例IV-A1同样地进行实验，结果与实施例IV-A1同样地得到了具有期望的尺寸的调控了形状的球状结构的细胞结构体。
关于实施例IV-A3，通过调节聚合物的制造条件，将包覆区域的表面Zeta电位由+20mV变更为+35mV，除此以外与上述实施例IV-A1同样地进行实验，结果与实施例IV-A1同样地得到了具有期望的尺寸的调控了形状的球状结构的细胞结构体。
关于实施例IV-A4，通过调节聚合物的制造条件，将水与包覆区域的接触角由70°±10°变更为65°±7°，除此以外与上述实施例IV-A1同样地进行实验，结果与实施例IV-A1同样地得到了具有期望的尺寸的调控了形状的球状结构的细胞结构体。
关于实施例IV-A5，通过调节聚合物的制造条件，将水与包覆区域的接触角由70°±10°变更为75°±5°，除此以外与上述实施例IV-A1同样地进行实验，结果与实施例IV-A1同样地得到了具有期望的尺寸的调控了形状的球状结构的细胞结构体。
(实施例IV-B1)
(试验IV-B1)培养面的制备
用二乙醚清洗松浪硝子制的精密玻璃板：MICRO COVER GLASS(30mm×40mm×0.15mm厚)，并使其干燥。进行清洁的目的是为了清洁玻璃板之间防止粘贴用的油性成分、异物。
(试验IV-B1-1)<在整个培养面的表面包覆聚合物的情况>
将乙烯基三甲氧基硅烷溶解于4％醋酸水溶液，进行调节使得最终浓度为0.5％或2.0％。将该硅烷化合物溶液流延至玻璃的整个表面，排出液体使得溶液厚度成为约0.1μm，在用氯化钾的饱和溶液加湿成为84％的25℃的密闭干燥器中静置72小时。用RO水清洗后，在100℃处理10分钟使水分蒸发，进而用RO水和2-丙醇清洗。通过IR分析，确认来自硅烷偶联剂乙烯基三甲氧基硅烷的乙烯基被固定在玻璃表面。
将混合有10g的2-(N,N-二甲基氨基乙基)甲基丙烯酸酯、5g的RO的溶液用氮气进行鼓泡10分钟。将上述(1)中制作的导入了乙烯基的玻璃板配置于直径100mm的培养皿，加入10mL通过氮气鼓泡而脱氧了的单体水溶液浸渍玻璃板，密闭内部以成为氮气氛。从培养皿的底部照射10小时375nm的黑灯，用RO水、2-丙醇清洗玻璃板并干燥，得到细胞培养器(1)。
对于试验IV-B1-1中制备的细胞培养器(1)，调查液滴的量与液滴的直径的关系。
向固定有共聚物的玻璃板表面上,使用移液管以0.5μL～50μL的液滴形式滴加来自大鼠皮下脂肪的间充质干细胞悬浮液(细胞密度：3.0×105个/mL、完全培养基(达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)+10％胎牛血清(FBS)溶液、DMEM：Gibco公司制造、型号：11995-065、FCS：美国英杰生命技术公司(Invitrogen Corporation公司)制造、批号：928696))，根据底面的投影图像测定液滴的直径。如图34(A)所示，液滴的量和液滴的直径在0.5μL～50μL的液滴容量的整个范围不成线性相关。
另一方面，如图34(B)、(C)所示，当分为0.5μL～5.0μL的范围和5.0μL～50μL的范围时，确认在各自的区域成线性相关，启示了通过液滴容量能够控制液滴的直径。
在图34的(A)～(C)中，表示对在实施例中培养面的液滴的量和液滴的直径的关系进行调查的结果。
(试验IV-B1-2)<在培养面的多个位置包覆聚合物的情况>
将Vinyltrimethoxysilane溶解于4％醋酸水溶液，进行调节使得最终浓度为2.0％。将该硅烷偶联剂的溶液向松浪硝子制的精密玻璃板上，每次0.5μL、从液滴的中心部起算间隔1.2mm～12mm、滴加4列×5行的20滴，在用氯化钾的饱和溶液加湿到84％的25℃的干燥器中静置72小时。使用毛细管抽吸液滴，用水和甲醇清洗后干燥，得到细胞培养器(2)。
与试验IV-B1-1的情况同样地进行接枝聚合。通过IR分析确认仅滴加了硅烷偶联剂Vinyltrimethoxysilane溶液的液滴(dot)上被固定了共聚物。
(试验IV-B2)细胞结构体的制造
在实施例IV-B2中，使用通过接枝聚合而制备的培养皿，进行细胞结构体的制造。
(试验IV-B2-1)
向试验IV-B1-1中制造的固定有共聚物的玻璃板表面上，使用移液管在0.5μL～2.0μL范围以液滴形式滴加4列×5行的20滴的来自大鼠皮下脂肪的间充质干细胞悬浮液(细胞密度：3.0×105个/mL、完全培养基(达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)+10％胎牛血清(FBS)溶液、DMEM：Gibco公司制造、型号：11995-065、FCS：美国英杰生命技术公司(Invitrogen Corporation公司)制造、批号：928696)，在细胞培养培育箱(三洋电机MCO-5C)中，培养24小时(37℃、5％二氧化碳)。
每个液滴中细胞形成单层粘附于玻璃表面上，基本无法确认到细胞向细胞上层积的状态。自液滴滴加起1小时后，全部数量的细胞粘附于玻璃板上并伸展。进而当继续培养时，自约9小时后起从液滴的外部周围开始向中心凝聚，21小时后，全部细胞聚集在一个位置成为块状，在中心部形成球形。
当将玻璃板向0.3％甲基纤维素的PBS溶液中时，能够以球形悬浮液的形式回收全部的球形。
当液滴与液滴之间的距离为30μm以下时，液滴彼此由于引力、相对于空气相的表面张力的关系而互相融合，结果成为悬浮液流延至玻璃板的整个表面的状态，细胞凝聚的现象在各处同时发生。
[[发明(V)的实施例]]
以下，根据实施例对本发明(V)进行更详细说明，但是本发明并不限定于下述的实施例。
在下述的试验中，只要没有特别限定，市售的试剂不进行进一步纯化而使用。
(实施例V-1)
(试验V-A)温度响应性聚合物的制备
在容量50mL的软质玻璃制的透明小瓶中加入10.0g的2-N,N-二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯(DMAEMA)和5000μL的水，用磁力搅拌器进行了搅拌。然后，对该混合物(液体)进行10分钟的G1级高纯度(纯度：99.99995％)的氮气清洗(流速：2.0L/分钟)，由此使该混合物脱氧。另外，使用的DMAEMA中包含0.5重量％的作为阻聚剂的甲基对苯二酚(MEHQ)。
然后，使用圆型黑色荧光灯(NEC公司制，型号：FCL20BL，18W)对该反应物进行22个小时的紫外线照射，由此使上述反应物聚合。反应物在5小时后带有粘性，在15小时后固化，以反应生成物的形式得到聚合物。使该反应生成物溶解于2-丙醇，并将溶液转移至透析管。然后，进行了72小时的透析，纯化了反应生成物。
将包含反应生成物的溶液使用纤维素混合酯制的0.2μm过滤器(东洋滤纸公司制造，型号：25AS020)过滤，通过使得到的滤液冷冻干燥，从而得到分子内离子复合体型的温度响应性聚合物(产量：6.8g、转化率：68％)。使用GPC(岛津公司制造，型号：LC-10vp系列)以聚乙二醇(Shodex公司制造，TSK系列)为标准物质，测定该聚合物的数均分子量(Mn)，确定为Mn＝100000(Mw/Mn＝10.0)。
用核磁共振装置(Varian公司制造，型号：Gemini300)，以重水(D2O)为标准物质测定温度响应性聚合物的核磁共振光谱(NMR)。下述表示与实施例聚合物V-1共同的代表性的峰。
1H-NMR(in D2O)δ0.8-1.2(br,3H,-CH2-C(CH3)-),1.6-2.0(br,2H,-CH2-C(CH3)-),2.2-2.4(br,6H,-N(CH3)2),2.5-2.7(br,1.9H,-CH2-N(CH3)2),4.0-4.2(br,1.9H,-O-CH2-)。
在此，根据与α位结合的甲基(δ0.8-1.2)的质子数(在DMAEMA单元的情况下、甲基丙烯酸单元的情况下，为3个)A、和与侧链的酯键的氧结合的乙基(δ4.0-4.2)的甲基质子数(在DMAEMA单元的情况下为2个，在甲基丙烯酸单元的情况下为0个)B，算出DMAEMA的侧链具有的氨基的官能团数量和甲基丙烯酸的侧链的羧基的官能团数量的比。
其结果是，在得到聚合物V-1的情况下，为94：6。将其换算成就包含阳离子型聚合物和阴离子型聚合物的2成分混合体系中的离子复合体而言的C/A比时，C/A比＝15.6。
进而，制备得到的温度响应性聚合物的3％水溶液，在20℃～40℃之间测定该水溶液在660nm的吸光度，结果为约32℃。
(试验V-B)第一包覆区域和第二包覆区域的准备
作为细胞培养器，使用了盘(Prime Surface(注册商标)、SUMILON公司制造)(细胞低吸附性盘)。
在室温条件下，在上述板的培养面上的6个位置，每次4.0μL对上述的试验V-A中制备的聚合物的水溶液(浓度：15ng/μL)进行点样，然后，使该水溶液在37℃干燥30分钟，准备各自圆形的第一包覆区域(面积4.5mm2)。
干燥后，在6个位置的圆形的第一包覆区域中的一个位置中，在位于通过第一包覆区域的中心的直线上、位于第一包覆区域的端部的2个位置，以与第一包覆区域重合的方式，每次0.2μL对纤连蛋白溶液(来自人血浆)(浓度：200ng/μL)(BD Biosciences Inc.制造、批号3353563)进行点样，然后，使该溶液在37℃干燥5分钟，准备各自圆形的第二包覆区域(面积0.8mm2)(参考图38(a))。
使用Zeta电位仪(大塚电子公司制，型号：ELSZ)和平板试样用样品池单元测定第一包覆区域的表面Zeta电位。在测定中，使用石英样品池作为样品池，作为标准探测粒子，使用用羟丙基纤维素(Mw＝30000)包覆聚苯乙烯胶乳(粒径：约500nm)而成的粒子(Zeta电位：-5～+5mV)。作为溶剂，在pH＝7、37℃的条件下使用10mM的氯化钠水溶液。使用Smoluchowski公式算出了Zeta电位。
结果被温度响应性聚合物包覆的第一包覆区域的表面的Zeta电位为+20mV。另外，如本领域技术人员公知的那样，上述Zeta电位的测定值具有±10％左右的偏差。
按照JIS R3257的标准，使用接触角测量仪(商品名：DMs-400，协和界面科学公司制)测定了水与细胞培养盘的第一包覆区域的接触角，结果是70°±10°。
(试验V-C)细胞的种植、培养
使用上述试验V-B中准备的细胞培养器。
使来自GFP重组Lewis鼠的脂肪组织的间充质干细胞(ADSC(Adipose-derivedvascular stromal cell))悬浮于培养基(达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)+10％胎牛血清(FBS)；DMEM：Gibco公司制造、型号11965；FBS：Biological Industries Ltd.制造、批号715929)中，制备细胞悬浮液。
在室温条件下，在上述板中加入细胞悬浮液使得细胞密度成为2.5×105个/cm2以上(95％汇合)。
然后，在37℃、5％CO2的细胞培养培育箱中培养该细胞2小时。
自开始培养起2小时后，用上述的培养基进行更换培养基，除去死亡的细胞。
图38(a)表示对在试验V-C中、在试验V-B中准备的第一包覆区域和第二包覆区域中对GFP重组Lewis鼠的ADSC进行培养2小时后的状态使用显微镜进行观察时的照片。
然后，在37℃、5％CO2的细胞培养培育箱中进一步培养细胞18小时。
在进一步进行18个小时的培养中，与第一包覆区域粘附的细胞向中央部分凝聚，另一方面，与第二包覆区域粘附的细胞继续粘附于起初的位置。由于种植的细胞的成熟而引起的细胞间的网络结合力超过细胞与第一包覆区域的粘附力，因此产生了细胞的凝聚现象。这时，向长轴方向的凝聚、收缩被限制，另一方面，向短轴方向的凝聚、收缩优先。最终形成了由继续粘附于第二包覆区域的2个细胞集团、和连接这些细胞集团之间的棒状的细胞集团组成的具有直线状的结构的细胞结构体。
图38(b)表示对在试验V-C中、在试验V-B中准备的第一包覆区域和第二包覆区域中对GFP重组Lewis鼠的ADSC进行培养20小时后的状态使用显微镜进行观察时的照片。
另外，图38(c)表示降低倍率观察图38(b)所示的细胞结构体时的照片。
图38(d)表示使用荧光显微镜观察图38(b)的虚线所表示的细胞结构体的状态时的照片。
在试验V-C中得到的细胞结构体中的棒状的细胞集团中，细胞成为沿细胞结构体的延伸方向而拉伸的形状，并具有向沿着将继续粘附于第二包覆区域的2个细胞集团连接的线的方向的方向的取向性。
(实施例V-2)
将使用的细胞粘附性物质由纤连蛋白溶液代替为层粘附蛋白(浓度：50ng/μL)(NIPPI公司制造)，进行与上述的实施例V-1的试验V-B同样的试验。
然后，将使用的细胞由GFP重组Lewis鼠的ADSC代替为心肌细胞(按照规定方法从出生后第1天的新生Lewis系大鼠中分离)，进行与上述的实施例V-1的试验V-C同样的试验。
在该情况下，也得到了具有与上述的图38所示的细胞结构体同样的结构的细胞结构体。
[表4]
[[发明(VI)的实施例]]
以下，基于实施例对本发明(VI)进行更详细说明，但是本发明并不限定于这些实施例。
(实施例VI-1)
在容量50mL的软质玻璃制的透明小瓶中入10.0g的2-N,N-二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯(DMAEMA)和5mL的水，用磁力搅拌器进行了搅拌。然后，对该混合物(液体)进行10分钟的G1级高纯度(纯度：99.99995％)的氮气清洗(流速：2.0L/分钟)，由此使该混合物脱氧。另外，使用的DMAE MA中包含0.5质量％的作为阻聚剂的甲基对苯二酚(MEHQ)。
然后，使用圆型黑色荧光灯(NEC公司制，型号：FCL20BL，18W)对该反应物进行22个小时的紫外线照射，由此使上述反应物聚合。反应物在5小时后带有粘性，在15小时后固化，以反应生成物的形式得到聚合物。使该反应生成物溶解于2-丙醇，并将溶液转移至透析管。然后，进行了72小时的透析，纯化了反应生成物。
将包含反应生成物的溶液使用纤维素混合酯制的0.2μm过滤器(东洋滤纸公司制造，型号：25AS020)过滤，通过使得到的滤液冷冻干燥，从而得到温度响应性(均)聚合物(产量：6.8g、转化率：68％)。使用GPC(岛津公司制造，型号：LC-10vp系列)以聚乙二醇(Shodex公司制造，TSK系列)为标准物质，测定该聚合物的数均分子量(Mn)，确定为Mn＝1.0×105g/mo l(Mw/Mn＝10.0)。
用核磁共振装置(Varian公司制造，型号：Gemini300)，以重水(D2O)为标准物质测定上述的温度响应性聚合物的核磁共振光谱(NMR)。下述结果表示代表性的峰。
1H-NMR(in D2O)δ0.8-1.2(br,-CH2-C(CH3)-),1.6-2.0(br,-CH2-C(CH3)-),2.2-2.4(br,-N(CH3)2),2.5-2.7(br,-CH2-N(CH3)2),4.0-4.2(br,-O-CH2-)。
在此，根据主链的甲基(δ0.8-1.2)的质子数(在DMAEMA的均聚物的情况下每分子单体中为3个)A和侧链的二甲基氨基(δ2.2-2.4)的甲基质子数(在DMAEMA的均聚物的情况下每分子单体中为6个)B，算出侧链具有的氨基的官能团数量和通过与聚合反应同时进行的侧链的酯键的水解反应而产生的侧链的羧基的官能团数量的比。
其结果，在上述的温度响应性聚合物的情况下是94∶6。将其换算成就包含阳离子型聚合物和阴离子型聚合物的2成分混合体系中的离子复合体而言的C/A比时，C/A比＝15.6。
上述的温度响应性聚合物的浊点按照以下方法进行测定。
制备温度响应性聚合物的3％水溶液，在20～40℃之间测定该水溶液在660nm的吸光度。
其结果，在20～30℃，水溶液是透明的且吸光度几乎是0，但是从31℃附近开始可在水溶液中观察到白色浑浊，在32℃吸光度急剧上升。由此，确认了温度响应性聚合物具有约为32℃的浊点。
此外，当使温度响应性聚合物升温至37℃时，聚合物水溶液有良好的响应性，悬浊，然后水溶液整体固化。将该固化物保持在室温(25℃)，结果在几十小时期间一直保持固化的状态。然后，固化物缓慢溶解，转化成均匀的水溶液。当将固化了的聚合物冷却至4℃时，其迅速溶解。而且，即使重复进行上述升温及降温的操作，响应性也没有产生变化，因此确认了聚合物发生了可逆的相转移。
将上述的温度响应性聚合物溶解于纯水中，制备温度响应性聚合物溶液(最终浓度6ng/μL)。在35mm皿(Sumitomo Bakelite CO.,Ltd.制造、商品名“Prime Surface”(注册商标MS-9035))的培养面上的10个位置，圆形状地涂敷0.5μL的温度响应性聚合物溶液。
每一个位置的圆形的包覆培养面的直径为约2000μm，此外，各包覆培养面间的距离为约2000μm。
然后，通过在培育箱(40℃)中放置1小时，从而使涂敷的温度响应性聚合物的水溶液干燥，准备具有多个包覆培养面的包覆细胞培养器。
将以相对于100个新生Lewis系大鼠的心肌细胞、来自GFP重组Lewis大鼠脂肪组织的间充质干细胞(ADSC)为300个的比例混合的混合细胞混合于培养基(SkGM(lonza株式会社、型号：CC-3245)+10％FBS(Gibco公司制造、批号：715929)中，制备7.2×106个/mL的混合细胞溶液，在包覆细胞培养器中，加入5mL上述混合细胞溶液，种植细胞。
然后，在细胞培育箱(37℃、5％CO2)中培养1小时，使用新的培养基更换培养基，进而在细胞培育箱(37℃、5％CO2)中培养48小时，得到块状的细胞结构体。
(实施例VI-2)
除了以相对于100个新生Lewis系大鼠心肌细胞、来自GFP重组Lewis大鼠脂肪组织的间充质干细胞为233个的比例混合以外，与实施例VI-1同样地进行，得到块状的细胞结构体。
(实施例VI-3)
在细胞中，使用作为心肌细胞的新生Lewis系大鼠心肌细胞、作为间充质干细胞的来自GFP重组Lewis大鼠脂肪组织的间充质干细胞(ADSC)、作为免疫细胞的巨噬细胞这3种。作为巨噬细胞，从来自大鼠骨髓的单核细胞分化诱导而使用(COSMO BIO公司制造、骨髓单核细胞培养试剂盒、商品号：BMM01)。
作为第一阶段，将以相对于100个新生Lewis系大鼠心肌细胞、来自GFP重组Lewis大鼠脂肪组织的间充质干细胞为250个的比例混合的细胞与实施例VI-1同样地种植，5小时后，细胞粘附形成单层后，进行更换培养基。以成为相对于100个新生Lewis系大鼠心肌细胞、来自大鼠的巨噬细胞为5个的比例的方式，向该单层上加入包含巨噬细胞的来自大鼠的巨噬细胞悬浮液，继续静置培养，除此以外，与实施例VI-1进行同样的操作。
在由心肌细胞和间充质干细胞形成的单层培养层凝聚成钱包状时，在该单层培养层上沉积的巨噬细胞被卷入到凝聚中，得到1个块状的细胞结构体。在露出的培养面中未确认到有巨噬细胞，因此可确认种植的巨噬细胞的全部数量都被吸收到细胞凝聚块中。
(比较例VI-1)
除了以相对于100个新生Lewis系大鼠心肌细胞、来自GFP重组Lewis大鼠脂肪组织的间充质干细胞为75个的比例混合以外，与实施例VI-1同样地进行，得到块状的细胞结构体。
(比较例VI-2)
不混合来自GFP重组Lewis大鼠脂肪组织的间充质干细胞，制备仅由新生Lewis系大鼠心肌细胞形成的细胞溶液，除此以外，与实施例VI-1同样地进行，得到块状的细胞结构体。
(比较例VI-3)
除了以相对于100个新生Lewis系大鼠心肌细胞、来自GFP重组Lewis大鼠脂肪组织的间充质干细胞为33个的比例混合以外，与实施例VI-1同样地进行，得到块状的细胞结构体。
(比较例VI-4)
除了以相对于100个新生Lewis系大鼠心肌细胞、来自GFP重组Lewis大鼠脂肪组织的间充质干细胞为25个的比例混合以外，与实施例VI-1同样地进行，得到块状的细胞结构体。
(比较例VI-5)
除了以相对于100个新生Lewis系大鼠心肌细胞、来自GFP重组Lewis大鼠脂肪组织的间充质干细胞为100个的比例混合以外，与实施例VI-1同样地进行，得到块状的细胞结构体。
[评价]
(细胞结构体的外观)
用显微镜(Nikon Corporation制造、商品名“ECLIPSE-Ti”)观察实施例、比较例中得到的块状的细胞结构体，按照以下的基准评价细胞的外观。
○(良好)：在全部10个位置的包覆培养面中，均得到球形的块状的细胞结构体。
△(不良)：在10个位置中的任一包覆培养面中观察到与包覆培养面粘附的细胞未凝聚而是维持单层的状态、或者凝聚的部分和未从包覆培养面剥离的粘附部分混合存在的端部翻卷的细胞结构体的例子。
(有无跳动)
用显微镜(Nikon Corporation制造、商品名“ECLIPSE-Ti”)观察实施例、比较例中得到的块状的细胞结构体。然后，历经48小时，进行观察。然后，按照以下的基准评价有无跳动。
○(良好)：在48小时的观察期间中，起初可确认到跳动，但之后变得无法观察到跳动。
×(不良)：在48小时的观察期间中，每次观察都确认到跳动。
[表5]
如表5所示，实施例的细胞结构体在刚刚形成细胞结构体后有跳动，但其后变得观察不到跳动，判断能够用作心脏病模型。另一方面，比较例的细胞结构体在48小时的观察期间可观察到跳动，判断接近于健康的心脏的形态。
[[发明(VII)的实施例]]
以下，基于实施例对本发明(VII)进行更详细说明，但是本发明并不限定于这些实施例。
(实施例VII-1)
在容量50mL的软质玻璃制的透明小瓶中入10.0g的2-N,N-二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯(DMAEMA)和5mL的水，用磁力搅拌器进行了搅拌。然后，对该混合物(液体)进行10分钟的G1级高纯度(纯度：99.99995％)的氮气清洗(流速：2.0L/分钟)，由此使该混合物脱氧。另外，使用的DMAEMA中包含0.5质量％的作为阻聚剂的甲基对苯二酚(MEHQ)。
然后，使用圆型黑色荧光灯(NEC公司制，型号：FCL20BL，18W)对该反应物进行22个小时的紫外线照射，由此使上述反应物聚合。反应物在5小时后带有粘性，在15小时后固化，以反应生成物的形式得到聚合物。使该反应生成物溶解于2-丙醇，并将溶液转移至透析管。然后，进行了72小时的透析，纯化了反应生成物。
将包含反应生成物的溶液使用纤维素混合酯制的0.2μm过滤器(东洋滤纸公司制造，型号：25AS020)过滤，通过使得到的滤液冷冻干燥，从而得到温度响应性(均)聚合物(产量：6.8g、转化率：68％)。使用GPC(岛津公司制造，型号：LC-10vp系列)以聚乙二醇(Shodex公司制造，TSK系列)为标准物质，测定该聚合物的数均分子量(Mn)，确定为Mn＝1.0×105g/mol(Mw/Mn＝10.0)。
用核磁共振装置(Varian公司制造，型号：Gemini300)，以重水(D2O)为标准物质测定上述的温度响应性聚合物的核磁共振光谱(NMR)。下述结果表示代表性的峰。
1H-NMR(in D2O)δ0.8-1.2(br,-CH2-C(CH3)-),1.6-2.0(br,-CH2-C(CH3)-),2.2-2.4(br,-N(CH3)2),2.5-2.7(br,-CH2-N(CH3)2),4.0-4.2(br,-O-CH2-)。
在此，根据主链的甲基(δ0.8-1.2)的质子数(在DMAEMA的均聚物的情况下每分子单体中为3个)A和侧链的二甲基氨基(δ2.2-2.4)的甲基质子数(在DMAEMA的均聚物的情况下每分子单体中为6个)B，算出侧链具有的氨基的官能团数量和通过与聚合反应同时进行的侧链的酯键的水解反应而产生的侧链的羧基的官能团数量的比。
其结果，在上述的温度响应性聚合物的情况下是94∶6。将其换算成就包含阳离子型聚合物和阴离子型聚合物的2成分混合体系中的离子复合体而言的C/A比时，C/A比＝15.6。
上述的温度响应性聚合物的浊点按照以下方法进行测定。
制备温度响应性聚合物的3％水溶液，在20～40℃之间测定该水溶液在660nm的吸光度。
其结果，在20～30℃，水溶液是透明的且吸光度几乎是0，但是从31℃附近开始可在水溶液中观察到白色浑浊，在32℃吸光度急剧上升。由此，确认了温度响应性聚合物具有约为32℃的浊点。
此外，当使温度响应性聚合物升温至37℃时，聚合物水溶液有良好的响应性，悬浊，然后水溶液整体固化。将该固化物保持在室温(25℃)，结果在几十小时期间一直保持固化的状态。然后，固化物缓慢溶解，转化成均匀的水溶液。当将固化了的聚合物冷却至4℃时，其迅速溶解。而且，即使重复进行上述升温及降温的操作，响应性也没有产生变化，因此确认了聚合物发生了可逆的相转移。
将上述的温度响应性聚合物溶解于纯水中，制备温度响应性聚合物溶液(最终浓度15ng/μL)。在35mm皿(Sumitomo Bakelite CO.,Ltd.制造、商品名“Prime Surface”(注册商标))的培养面上的8个位置，圆形状地涂敷0.5μL的温度响应性聚合物溶液。
每一个位置的圆形的包覆培养面的直径为约2000μm，此外，各包覆培养面间的距离为约2,500μm。
然后，通过在培育箱(37℃)中放置30分钟，从而使涂敷的温度响应性聚合物的水溶液干燥，准备具有多个包覆培养面的包覆细胞培养器。
用PKH26Red Fluorescent Cell Linker Kit(Sigma公司制造)，对人肝癌细胞(COSMO BIO公司、商品号“HepG2-500”)进行染色。将以相对于100个经染色的人肝癌细胞、来自GFP重组Lewis大鼠脂肪组织的间充质干细胞(ADSC)为33个的比例混合的混合细胞混合于培养基(DMAEM+10％FBS(Gibco公司制造、批号：715929)中，制备3.2×105个/mL的混合细胞悬浮液，在包覆细胞培养器中，加入25μL上述混合细胞悬浮液，种植细胞。
然后，在细胞培育箱(37℃、5％CO2)中培养2小时，使用新的培养基更换培养基，进而在细胞培育箱(37℃、5％CO2)中培养48小时，得到块状的细胞结构体。
(实施例VII-2)
除了以相对于100个人肝癌细胞、来自GFP重组Lewis大鼠脂肪组织的间充质干细胞为10个的比例混合以外，与实施例VII-1同样地进行，得到块状的细胞结构体。
(实施例VII-3)
除了以相对于100个人肝癌细胞、来自GFP重组Lewis大鼠脂肪组织的间充质干细胞为50个的比例混合以外，与实施例VII-1同样地进行，得到块状的细胞结构体。
(实施例VII-4)
除了以相对于100个人肝癌细胞、来自GFP重组Lewis大鼠脂肪组织的间充质干细胞为33个、来自Lewis大鼠脂肪组织的粘附性脂肪细胞为33个的比例混合以外，与实施例VII-1同样地进行，得到块状的细胞结构体。
(实施例VII-5)
在细胞中，作为肝细胞使用与实施例VII-1同样地进行了染色的人肝癌细胞(HepG2)、作为成纤维细胞使用来自GFP重组Lewis大鼠脂肪组织的间充质干细胞(ADSC)、作为免疫细胞使用巨噬细胞。关于巨噬细胞，从来自大鼠骨髓的单核细胞分化诱导而使用(COSMO BIO公司制造、骨髓单核细胞培养试剂盒、商品号：BMM01)。
作为第一阶段，将以相对于100个人肝癌细胞、来自GFP重组Lewis大鼠脂肪组织的间充质干细胞为25个的比例混合的细胞与实施例VII-1同样地种植，5小时后，细胞粘附形成单层后，进行更换培养基。以成为相对于100个人肝癌细胞、巨噬细胞为5个的比例的方式，向该单层上加入包含巨噬细胞的巨噬细胞悬浮液，继续静置培养，除此以外，与实施例VII-1进行同样的操作。
在由肝癌细胞和间充质干细胞组成的单层培养层凝聚成钱包状时，在该单层培养层上沉积的巨噬细胞被卷入到凝聚中，得到1个块状的细胞结构体。在露出的培养面中未确认到有巨噬细胞，因此可确认种植的巨噬细胞的全部数量都被吸收到细胞凝聚块中。
(比较例VII-1)
除了以相对于100个人肝癌细胞、来自GFP重组Lewis大鼠脂肪组织的间充质干细胞为300个的比例混合以外，与实施例VII-1同样地进行，得到块状的细胞结构体。
(比较例VII-2)
除了以相对于100个人肝癌细胞、来自GFP重组Lewis大鼠脂肪组织的间充质干细胞为100个的比例混合以外，与实施例VII-1同样地进行，得到块状的细胞结构体。
(比较例VII-3)
不混合来自GFP重组Lewis大鼠脂肪组织的间充质干细胞，制备仅由人肝癌细胞形成的细胞溶液，除此以外，与实施例VII-1同样地进行，得到块状的细胞结构体。
(比较例VII-4)
除了以相对于100个人肝癌细胞、来自GFP重组Lewis大鼠脂肪组织的间充质干细胞为5个的比例混合以外，与实施例VII-1同样地进行，得到块状的细胞结构体。
(比较例VII-5)
除了以相对于100个人肝癌细胞、来自GFP重组Lewis大鼠脂肪组织的间充质干细胞为67个的比例混合以外，与实施例VII-1同样地进行，得到块状的细胞结构体。
[评价]
(细胞结构体的外观)
用显微镜(Nikon Corporation制造、商品名“ECLIPSE-Ti”)观察实施例、比较例中得到的块状的细胞结构体(培养48小时后)，按照以下的基准评价细胞的外观。
○(良好)：在全部8个位置的包覆培养面中，均得到球形的块状的细胞结构体。
△(不良)：在8个位置中的任一包覆培养面中，观察到与包覆培养面粘附的细胞未凝聚而是单层的状态的细胞结构体、或凝聚的部分和未从包覆培养面剥离的粘附部分混合存在的端部翻卷的细胞结构体的例子。
(细胞结构体中细胞的形态)
将种植、培养的细胞培养2小时后，用显微镜(Nikon Corporation制造、商品名“ECLIPSE-Ti”)观察的结果，与包覆培养面粘附。粘附的细胞中肝细胞的形态按照以下的基准进行评价。另外，在任一例中，种植的肝细胞(与包覆培养面粘附前的肝细胞)形态均为铺路石状。
○(良好)：大量肝细胞的形态发生变化，成为纺锤形的成纤维细胞样的形态。
×(不良)：肝细胞的形态未观察到变化。
[表6]
如表6所示那样，在以特定的比例混合肝细胞和成纤维细胞的实施例的细胞结构体中，肝细胞的形态由铺路石状变化为成纤维细胞样。因此，实施例的细胞结构体中包含的肝细胞向浸润性更高、恶化性高的癌细胞变化，判断能够用作肝功能衰竭模型。另外，将各实施例的细胞结构体破碎在培养皿中进行再次种植，并观察形态，结果肝细胞成为成纤维细胞样的形态。
另一方面，比较例的细胞结构体中的肝细胞的形态延续铺路石状而未观察到状态的变化。另外，将比较例的细胞结构体破碎在培养皿中进行再次种植，并观察形态，结果肝细胞成为铺路石状的形态。
产业上的可利用性
根据本发明，能够提供一种高效地制造细胞块、细胞结构体或立体组织体的方法。
特别地根据本发明(I)，能够简便地制造用于治疗关节、气管、鼻等的软骨细胞块和移植材料。此外，更加本发明(II)，能够容易地培养上皮细胞，此外能够容易地制造包含上皮细胞的细胞结构体，此外，能够进行上皮细胞的培养和该细胞结构体的制造。此外，根据本发明(III)，能够容易地制作环状或管腔状等立体组织体。此外，能够容易地制作环状或管腔状等立体组织体。此外，根据本发明(IV)，能够简便地制造具有期望的尺寸且调控了形状的球状的细胞结构体。此外，根据本发明(V)，能够控制细胞的凝聚方式从而制造期望形态的细胞结构体。此外，根据本发明(VI)，能够容易地形成用作心脏病模型的、包含心肌细胞和成纤维细胞的细胞结构体。此外，根据本发明(VII)，能够容易地形成用作肝功能衰竭模型的、包含肝细胞和成纤维细胞的细胞结构体。

Claims (55)

1.一种软骨细胞块的制造方法，其特征在于，包含种植培养工序，所述种植培养工序通过在用温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物包覆的包覆培养面，在细胞块的存在下种植能够分化成软骨细胞的细胞，对所述细胞块和所述能够分化成软骨细胞的细胞进行培养，从而制备软骨细胞块。
2.根据权利要求1所述的软骨细胞块的制造方法，其中，通过种植所述能够分化成软骨细胞的细胞并对其进行培养从而制备所述细胞块。
3.根据权利要求1或2所述的软骨细胞块的制造方法，其中，进行多次所述种植培养工序。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的软骨细胞块的制造方法，其中，所述包覆培养面被细胞非粘附性的壁包围。
5.根据权利要求4所述的软骨细胞块的制造方法，其中，将所述包覆培养面的宽度设为3mm以下，将所述壁的高度设为3mm以下。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的软骨细胞块的制造方法，其中，将所述包覆培养面每单位面积具有的所述温度响应性聚合物和温度响应性聚合物组合物的量设为0.1～3.0μg/cm2。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的软骨细胞块的制造方法，其中，在所述种植培养工序中，以0.3×104～10.0×105个/cm2的细胞密度种植所述能够分化成软骨细胞的细胞。
8.一种软骨细胞块，其特征在于，是通过权利要求1～7中任一项所述的软骨细胞块的制造方法而制造的。
9.根据权利要求8所述的软骨细胞块，其为甜甜圈形。
10.一种移植材料的制造方法，其特征在于，包含以下工序：
通过在权利要求8或9所述的软骨细胞块的存在下，种植间充质细胞，对所述软骨细胞块和所述间充质细胞进行培养，从而制备移植材料。
11.一种移植材料，其特征在于，是通过权利要求10所述的移植材料的制造方法而制造的。
12.一种复合材料，其特征在于，权利要求9所述的软骨细胞块设置于管状结构体的外表面。
13.根据权利要求12所述的复合材料，其中，在所述管状结构体的内部设置有芯材。
14.一种上皮细胞的培养方法，其特征在于，包含以下工序：
制备工序，制备温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物；
培养器准备工序，用所述温度响应性聚合物或所述温度响应性聚合物组合物包覆细胞培养器的培养面的至少一部分而形成包覆区域A，准备具有包覆区域A的包覆细胞培养器；
种植工序，将上皮细胞种植于所述包覆细胞培养器；以及
培养工序，对粘附于所述包覆区域A的所述上皮细胞进行培养，
所述包覆区域A中的所述温度响应性聚合物或所述温度响应性聚合物组合物的浓度为0.3pg/mm2以上。
15.根据权利要求14所述的上皮细胞的培养方法，其中，所述细胞培养器的培养面的至少一部分具有凹陷部，所述包覆区域A内具有所述凹陷部。
16.一种细胞结构体的制造方法，其特征在于，包含以下工序：
制备工序，制备温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物；
培养器准备工序，用所述温度响应性聚合物或所述温度响应性聚合物组合物包覆细胞培养器的培养面的至少一部分而形成包覆区域A，准备具有包覆区域A的包覆细胞培养器，；
种植工序，将上皮细胞种植于所述包覆细胞培养器；以及
培养工序，由所述上皮细胞形成块状的细胞结构体，得到粘附于所述包覆区域A的细胞结构体，
所述包覆区域A中的所述温度响应性聚合物或所述温度响应性聚合物组合物的浓度为0.3pg/mm2以上。
17.根据权利要求16所述的细胞结构体的制造方法，其中，在所述培养器准备工序中，用所述温度响应性聚合物或所述温度响应性聚合物组合物在细胞培养器的培养面的至少一部分中与所述包覆区域A不同的位置形成包覆区域B，
所述包覆区域B中的所述温度响应性聚合物或所述温度响应性聚合物组合物的浓度小于200pg/mm2。
18.根据权利要求16或17所述的细胞结构体的制造方法，其中，所述细胞培养器的培养面的至少一部分具有凹陷部，所述包覆区域A内具有所述凹陷部。
19.一种上皮细胞用细胞培养器，其特征在于，在培养面的至少一部分具有用温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物包覆的包覆区域A，
所述包覆区域A中的所述温度响应性聚合物或所述温度响应性聚合物组合物的浓度为0.3pg/mm2以上。
20.根据权利要求19所述的上皮细胞用细胞培养器，其中，在培养面的至少一部分中与所述包覆区域A不同的位置具有用温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物包覆的包覆区域B，
所述包覆区域B中的所述温度响应性聚合物或所述温度响应性聚合物组合物的浓度小于200pg/mm2。
21.根据权利要求19所述的上皮细胞用细胞培养器，其中，所述细胞培养器的培养面的至少一部分具有凹陷部，所述包覆区域A内具有所述凹陷部。
22.一种立体组织体的制作装置，其特征在于，
包含具有至少1个通孔的培养面和穿过所述通孔的轴，
在所述培养面包含至少1个用温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物包覆的包覆培养面，
在1个所述包覆培养面的内侧具有至少1个所述通孔，
所述培养面能够在所述轴的延伸方向上移动。
23.根据权利要求22所述的立体组织体的制作装置，其中，
具有多个所述培养面，
1根所述轴穿过所述多个所述培养面的所述通孔。
24.一种立体组织体的制作方法，其特征在于，使用了权利要求22或23所述的立体组织体的制作装置，
包含以下工序：
种植工序，在所述包覆培养面上种植至少1种细胞；以及
培养工序，对种植的所述细胞进行培养，得到缠绕于所述轴周围的环状的立体组织体。
25.根据权利要求24所述的立体组织体的制作方法，其中，进一步包含以下工序的重复操作：
培养面移动工序，在得到缠绕于轴周围的环状的立体组织体后，使所述培养面在所述轴的延伸方向移动；
种植工序，在移动后的所述包覆培养面上种植至少1种细胞；以及
培养工序，对种植的所述细胞进行培养，得到与缠绕于轴周围的环状的所述立体组织体邻接的、缠绕于轴周围的环状的立体组织体。
26.根据权利要求24或25所述的立体组织体的制作方法，其中，在全部的所述包覆培养面种植所述细胞，对种植的所述细胞进行培养而得到立体组织体。
27.根据权利要求24～26中任一项所述的立体组织体的制作方法，其中，得到包含在所述种植工序中种植的所述细胞的立体组织体。
28.根据权利要求24～26中任一项所述的立体组织体的制作方法，
在所述培养工序后除去所述细胞，
得到包含由所述细胞分泌的物质的立体组织体。
29.根据权利要求28所述的立体组织体的制作方法，其中，所述物质为蛋白质。
30.一种细胞结构体的制造方法，其特征在于，在培养面制备用温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物包覆的包覆区域，在该包覆区域形成细胞悬浮液的液滴，在该液滴中进行细胞培养，
其中，将所述包覆区域的表面Zeta电位设为0～50mV。
31.根据权利要求30所述的细胞结构体的制造方法，其中，将水与所述包覆区域的接触角设为50～90°。
32.根据权利要求30或31所述的细胞结构体的制造方法，其中，在所述培养面制备多个所述包覆区域。
33.根据权利要求30～32中任一项所述的细胞结构体的制造方法，其中，在所述包覆区域形成多个所述液滴。
34.根据权利要求30～33中任一项所述的细胞结构体的制造方法，其中，在各所述包覆区域中，将所述液滴的底面积设为比所述包覆区域的面积小。
35.根据权利要求30～34中任一项所述的细胞结构体的制造方法，其中，将所述液滴中包含的细胞的数目设为3.0×105个/mL以下。
36.根据权利要求30～35中任一项所述的细胞结构体的制造方法，其中，将所述液滴的直径设为1μm～8mm。
37.根据权利要求30～36中任一项所述的细胞结构体的制造方法，其中，将所述液滴的量设为0.5～50μL。
38.一种细胞结构体的制造方法，其特征在于，包含以下工序：
准备工序，在细胞培养器的培养面准备第一包覆区域和多个第二包覆区域，所述第一包覆区域用温度响应性聚合物和/或温度响应性聚合物组合物包覆，所述第二包覆区域设置于所述第一包覆区域的端部，用细胞粘附性物质包覆；以及
种植培养工序，在所述第一包覆区域和所述第二包覆区域种植细胞，对所述细胞进行培养，由此制备细胞结构体。
39.根据权利要求38所述的细胞结构体的制造方法，其中，将所述培养面设为细胞非粘附性。
40.根据权利要求38或39所述的细胞结构体的制造方法，其中，将所述细胞粘附性物质设为选自层粘附蛋白、胶原蛋白、纤连蛋白中的至少1种。
41.根据权利要求38～40中任一项所述的细胞结构体的制造方法，其中，用细胞非粘附性的壁包围所述第一包覆区域和所述第二包覆区域所占的区域。
42.根据权利要求38～41中任一项所述的细胞结构体的制造方法，其中，将所述第一包覆区域设为沿规定方向延伸的形状，将所述第一包覆区域的所述端部设为所述规定方向上的端部。
43.一种细胞结构体，其特征在于，是通过权利要求38～42中任一项所述的细胞结构体的制造方法而制造的。
44.一种细胞培养器，其特征在于，
在培养面具有第一包覆区域和多个第二包覆区域，
所述第一区域用温度响应性聚合物和/或温度响应性聚合物组合物包覆，
所述第二包覆区域设置于所述第一包覆区域的端部，用细胞粘附性物质包覆。
45.一种细胞结构体的制造方法，其特征在于，包含以下工序：
制备工序，制备温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物；
培养器准备工序，用所述温度响应性聚合物或所述温度响应性聚合物组合物包覆细胞培养器的培养面，准备包覆细胞培养器；
种植工序，在所述包覆细胞培养器中种植心肌细胞和相对于100个所述心肌细胞为200～300个的比例的成纤维细胞；以及
培养工序，对种植的细胞进行培养而得到块状的细胞结构体。
46.根据权利要求45所述的细胞结构体的制造方法，其中，在所述种植工序中进一步种植血管内皮细胞。
47.根据权利要求45或46所述的细胞结构体的制造方法，其中，在所述种植工序以后、且得到所述细胞结构体之前，在所述包覆细胞培养器中进一步添加免疫细胞。
48.根据权利要求47所述的细胞结构体的制造方法，其中，所述免疫细胞为巨噬细胞和/或T细胞。
49.根据权利要求45～48中任一项所述的细胞结构体的制造方法，其中，用所述温度响应性聚合物或所述温度响应性聚合物组合物包覆的部分的面积为200mm2以下。
50.一种细胞结构体的制造方法，其特征在于，包含以下工序：
制备工序，制备温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物；
培养器准备工序，用所述温度响应性聚合物或所述温度响应性聚合物组合物包覆细胞培养器的培养面，准备包覆细胞培养器；
种植工序，在所述包覆细胞培养器中种植肝细胞和相对于100个所述肝细胞为10～50个的比例的成纤维细胞；以及
培养工序，对种植的细胞进行培养而得到块状的细胞结构体。
51.根据权利要求50所述的细胞结构体的制造方法，其中，在所述种植工序中进一步种植血管内皮细胞。
52.根据权利要求50或51所述的细胞结构体的制造方法，其中，在所述种植工序中进一步种植脂肪细胞。
53.根据权利要求52所述的细胞结构体的制造方法，在所述种植工序中，以相对于100个所述肝细胞为10～50个的比例、且相对于100个所述成纤维细胞为100～500个的比例种植所述脂肪细胞。
54.根据权利要求50～53中任一项所述的细胞结构体的制造方法，其中，在所述种植工序以后、且得到所述细胞结构体之前，在所述包覆细胞培养器中进一步添加免疫细胞。
55.根据权利要求54所述的细胞结构体的制造方法，其中，所述免疫细胞为选自单核细胞、粒细胞、淋巴细胞、以及巨噬细胞中的至少1种。
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