JP6560199B2 - 培養方法及び細胞塊 - Google Patents

Description

本発明は、幹細胞を培養して細胞塊を得る培養方法に関する。ここで幹細胞は、例えば人工多能性幹細胞や胚性幹細胞等の未分化細胞である。本発明はまた、かかる方法により得られる細胞塊に関する。

近年、人為的に分化させた多能性幹細胞を創薬スクリーニングや再生医療に利用する試みが行われている（例えば、非特許文献１）。ここで多能性幹細胞とは様々な機能細胞へ分化する能力を持つ細胞である。多能性幹細胞は創薬スクリーニングや再生医療の目的に応じて、特定の臓器又は特定の細胞種に特有の機能を持つ細胞に分化させられる。かかる多能性幹細胞として例えばｉＰＳ細胞が用いられる。しかし、人為的に分化させた多能性幹細胞はin vivoにおける生体機能の一部を再現できているに過ぎないことが多い。このため、人為的に分化させた多能性幹細胞の機能は生体内の細胞の機能に比べて格段に低いことが多い。

細胞を用いた創薬スクリーニング試験においては、当該細胞が薬剤感受性を示し、かつ毒性反応を呈する。かかる薬剤感受性及び毒性反応の水準は、生体内での試験、いわゆるin vivo試験と同様のものであることが要求される。このような用途で、人為的に分化させた多能性幹細胞を利用するには、上述した先行技術は不十分である。このため、より成熟化した細胞にまで多能性幹細胞を分化させることが求められている。ここで成熟化した細胞とは、生体内の細胞がもつ機能に匹敵するレベルの機能が発現している細胞のことを指す。

従来の医療分野では臓器移植や人工臓器移植が行われている。これらの移植では、ドナー不足や拒絶反応といった問題が存在する。例えば、重篤な臓器不全に対して、臨床現場においては臓器移植による治療や人工臓器によって臓器を置き換える治療が行われている。しかし、臓器移植や人工臓器移植には根本的な未解決課題が残されている。臓器移植は拒絶反応の課題やドナー数の絶対的な不足の課題を有する。また人工臓器は臓器の機能の一部のみを限られた期間代替できるにすぎない（例えば、特許文献１，２）。

これに対して再生医療分野では、ヒト組織の人為的創出を行う。かかる創出のために、終末分化した細胞を担体すなわち足場材料へ播種する方法が知られる。さらに近年では、組織及び臓器の作製方法（特許文献３）及び未分化細胞を誘導して膵島細胞を作製する方法（特許文献４）が開示されている。

特許文献３では間葉系細胞、臓器細胞及び血管内皮細胞を共培養することで器官芽と呼ばれる細胞塊を製造する方法が開示されている。かかる器官芽は臓器の元となり、また生体内に移植可能である。この方法で製造された器官芽は非常に有望な移植材料である。一方で、器官芽が移植された際に器官芽の中の細胞が移植の目的外の臓器の細胞に分化するリスクもある（非特許文献２）。ここで移植の目的外の臓器の細胞とは、器官芽がその臓器の元になるべき臓器以外の細胞である。かかる細胞としては例えば繊維性細胞又は骨細胞が挙げられる。このため、器官芽の中の細胞が移植の目的外の臓器の細胞に分化するリスクを最小限にすることが求められている。

特開平９−５６８１４号公報 特開２００４−１６６７１７号公報 国際公開第２０１３／０４７６３９号 国際公開第２００７／０５８１０５号

Maya Schuldiner、他著、"Effects of eight growth factors on the differentiation of cells derived from human embryonic stem cells"、PNAS, 97 vol21、２０００年１０月１０日（Published online）、pp.11307−11312 Xue K.、他著、"A Two-Step Method of Constructing Mature Cartilage Using Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells"、Cells Tissues Organs 2013;197、２０１３年６月、pp.484-495

特許文献３に関連する技術を、再生医療又は医薬品の評価に使用するため、器官芽の一単位当たりの機能の向上が求められている。さらに再生医療の現場においては、安全性の高い人工組織の開発が求められている。かかる人工組織は自身が移植の目的外の臓器の組織に分化しないことが求められている。

それに加えて器官芽の大量培養に要するコストの削減も求められている。ここでコスト削減を図るための培養方法の開発が課題となっている。かかる培養方法では器官芽の１単位の機能を向上させることで、移植に必要な各種材料となる細胞の数を低減する必要がある。また器官芽の１単位の機能を向上させることで、器官芽の数を減らす必要がある。また所望の器官芽に分化させるまでに要する時間や培地を減らす必要がある。

さらに、上記間葉系細胞に含まれている間葉系幹細胞は様々な組織に分化する。このため、器官芽を骨、繊維組織へ移植すると、その部位で上記間葉系幹細胞の分化が進行する可能性がある（非特許文献２）。上記培養方法の課題として、このような想定外の分化のリスクを軽減させることが挙げられる。

上述したように、より生体組織に近い機能を有する細胞塊を、効率よく得る方法が望まれていた。かかる細胞塊はさらに安全性の高いことが望まれており、とりわけ移植の目的外の臓器の組織に分化しないことが望まれている。

発明者らは、細胞塊を得る方法を発明するに至った。かかる細胞塊は過去に類をみない細胞塊である。かかる細胞塊はより生体に近い機能を有するだけでなく、高い安全性を有する。かかる方法では細胞塊を得るために細胞を培養する際に、間葉系細胞の割合を従来の割合よりも減らす。これは間葉系細胞が移植の目的外の臓器の組織を形成する可能性の高いことによる。発明者らは、かかる方法における間葉系細胞の最適な密度を見出した。

本発明の一実施形態に係る培養方法は、幹細胞由来細胞と、間葉系細胞と、を含む二以上の細胞からなる集団を、所定の領域内で培養する培養方法である。幹細胞由来細胞とはいずれも未分化の内胚葉細胞、外胚葉細胞及び中胚葉細胞からなる群から選択される一種以上の細胞である。

前記集団は血管細胞、自律的に血管細胞から分泌される因子、並びに血管細胞及び間葉系細胞の両方が存在することによって血管細胞から分泌される因子、のうちの少なくともいずれか一つとともに、前記領域内で培養されることが好ましい。

前記領域は細胞が移動可能な空間からなる。前記空間の体積をＶ ｍｍ^３とする。前記空間に播種される前記間葉系細胞の細胞数をＮとする。このとき、前記Ｖは４００以下である。さらにＮ／Ｖは３５以上３０００以下である。本培養方法は前記集団から細胞塊を得るのに適する。

発明者らは、培養中の細胞（培養する細胞）の移動可能な空間の体積を、所定の範囲内に制限した。また、当該移動可能な空間に含める間葉系細胞の細胞数を所定の範囲に制限した。これらにより、上記細胞から、従来の細胞塊よりも生体に近い機能を有する細胞塊を得られることを見出した。さらに、かかる細胞塊は移植の目的外の臓器の組織に分化しないことを見出した。

上記により、安全性の高い細胞塊を得ることを可能にする培養方法を実現することができる。加えて、かかる培養方法は、複雑な手法を用いない。このため、細胞の作製コストを削減することができる。

培養に供する細胞の総数に対する前記間葉系細胞の数の割合は、０．５％以上５％未満であることが好ましい。前記集団は細胞数Ｘの前記幹細胞由来細胞と細胞数Ｙの前記間葉系細胞とからなることが好ましい。前記Ｘ：Ｙは２０：１から１００：１の範囲内にあることが好ましい。ここで、幹細胞由来細胞の細胞数（Ｘ）は、幹細胞に由来する、内胚葉細胞、外胚葉細胞及び中胚葉細胞のうちのいずれか、またはこれらの組合せからなる細胞の合計の細胞数である。

前記領域はマイクロ容器で形成されていることが好ましい。前記Ｎ／Ｖは１００以上３００以下であることが好ましい。前記Ｘ：Ｙは２０：１から５０：１の範囲内にあることが好ましい。前記Ｖは１以下であることが好ましい。前記マイクロ容器の相当直径をＥとし、前記マイクロ容器の深さをＤとしたとき、Ｅ：Ｄは１：０．５から１：２の範囲内であることが好ましい。

間葉系細胞は目的組織に近い細胞塊を得るために必要であることから、少なければ少ないほど良い。しかし、Ｎ／Ｖ比が１００以下の場合には、分化誘導までに時間を要する、または細胞塊１個単位の機能が低くなる。一方Ｎ／Ｖ比が３００以上の場合、目的組織に分化する能力を有する幹細胞由来細胞の割合が低くなり、細胞塊１個単位の機能が低下する。このため、Ｎ／Ｖ比は１００以上３００以下が好ましい。

また、間葉系細胞の割合が培養に供する細胞の総数に対し０．５％を下回ると分化誘導までに時間を要する、または細胞塊１個単位の機能が低くなる。一方、間葉系細胞の割合が培養に供する細胞の総数に対し５％以上の場合には、目的組織に分化する能力を有する幹細胞由来細胞の割合が低くなり、細胞塊１個単位の機能が低下する。このため、比率Ｘ：Ｙは、５０：１から２０：１の範囲が好ましい。

さらに、移動可能な空間が大きく１ｍｍ^３を超える場合には、細胞の移動距離が長くなり、細胞塊が形成されるまでに時間を要する。このため、移動可能な空間が１ｍｍ^３以下であることが好ましい。

さらに加えて、目的組織の機能をもつ細胞塊を得るためには、培養中の栄養分や分化誘導に有効な因子を効率よく細胞塊に供給する必要がある。従って、マイクロ容器の深さは浅いほどよいが、浅すぎると細胞塊が隣り合うマイクロ空間に移動し細胞塊同士が結合する。このため、相当直径と深さは、相当直径：深さが１：０．５以上の比率であることが好ましい。さらに、培地中の栄養分や分化を促進する物質を細胞塊に供給するためには、相当直径：深さが１：２以下であることが好ましい。

前記三次元培養によって得られる細胞塊は器官芽であることが好ましい。前記三次元培養によって得られる細胞塊はスフェロイド形状であり、前記スフェロイド形状の細胞塊の直径は２０μｍから２ｍｍであることが好ましい。前記幹細胞由来細胞は胎生幹細胞又は人工多能性幹細胞に由来することが好ましい。前記幹細胞由来細胞は人工多能性幹細胞に由来することが好ましい。前記幹細胞由来細胞は内胚葉細胞であることが好ましい。

前記領域はマイクロ容器で形成されていることが好ましい。前記マイクロ容器の相当直径は２０μｍ以上２．５ｍｍ以下であることが好ましい。前記マイクロ容器の深さは２０μｍ以上１０００μｍ以下であることが好ましい。

前記マイクロ容器は底部及びホーン部を備えることが好ましい。前記ホーン部は壁を有することが好ましい。前記壁は１度以上２０度以下のテーパ角を有することが好ましい。前記底部は半球形状又は円錐台形状の空間を有することが好ましい。

前記マイクロ容器は、細胞と接触する培養面を有することが好ましい。前記培養面は、リン脂質、リン脂質・高分子複合体、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（ＰＨＥＭＡ）、ポリビニルアルコール、アガロース、キトサン、ポリエチレングリコール、及びアルブミン、のグループから選択される一つ又はこれらの組合せからなるポリマーでコートされていることが好ましい。

本発明の一実施形態に係る細胞塊は、幹細胞由来細胞と、間葉系細胞と、を含む二以上の細胞からなる集団を、所定の領域内で培養して得られる細胞塊である。幹細胞由来細胞は、幹細胞をin-vitroで分化させて得られた細胞であって、内胚葉細胞、外胚葉細胞及び中胚葉細胞からなる群から選択される一種以上の細胞である。

前記集団は、血管細胞、血管細胞から分泌される因子、並びに血管細胞及び間葉系細胞の両方が存在することによって間葉系細胞から分泌される因子、のうちの少なくとも一つとともに培養される。

前記領域は細胞が移動可能な空間からなる。前記空間の体積をＶ ｍｍ^３とする。前記空間に播種される前記間葉系細胞の細胞数をＮとする。このとき、前記Ｖは４００以下である。さらにＮ／Ｖは３５以上３０００以下である。

前記集団は細胞数Ｘの前記幹細胞由来細胞と細胞数Ｙの前記間葉系細胞とからなることが好ましい。前記Ｘ：Ｙは２０：１から１００：１の範囲内にあることが好ましい。

一実施形態によれば、より生体組織に近い機能を有する細胞塊を効率よく培養する方法を提供することができる。かかる細胞塊はさらに安全性が高いことを特徴とし、とりわけ移植の目的外の臓器の組織に分化しないことを特徴とする。

一実施形態の培養容器の一例を示す図である。 一実施形態の凹みを横から見た形状例を示す断面図である。 一実施形態の凹みを上から見た形状例を示す図である。 培養容器の他の形状例を示す図である。 図４に示す培養容器のＶ−Ｖ線断面図である。 培養容器のさらに他の形状例を示す図である。 図４，５に示す培養容器を用いて細胞を培養する状態の一例を示す図である。 培養容器の他の例を示す図である。 培養容器のさらに他の例を示す図である。 ハンギングドロップ法の一例を示す図である。 実施例で用いた培養容器を表す図である。 実施例１の試験結果を撮影した写真である。 実施例２の細胞塊形成数の測定結果を表すグラフである。 実施例２のＡＦＰ発現量の測定結果を表すグラフである。 実施例２のＨＮＦ４ａ発現量の測定結果を表すグラフである。 実施例２のＡＬＢ発現量の測定結果を表すグラフである。 実施例２のＴＴＲ発現量の測定結果を表すグラフである。 実施例２のＡＳＧＲ１発現量を示すグラフである。

以下、実施形態について、図面を参照しながら説明する。説明の明確化のため、以下の記載及び図面は、適宜、省略、及び簡略化がなされている。各図面において同一の構成又は機能を有する構成要素および相当部分には、同一の符号を付し、その説明は省略する。

一実施形態に係る培養方法は、所定の微小な空間（以降適宜、「培養空間」と記載する）で細胞塊を作製する方法に関する。かかる培養方法は、幹細胞由来細胞、及び間葉系細胞からなる少なくとも２種類の細胞を有する集団を、培養して細胞塊を形成させる培養方法である。幹細胞由来細胞は幹細胞由来の、内胚葉細胞、外胚葉細胞又は中胚葉細胞から選択される少なくとも１つの細胞である。上記細胞は、血管細胞、血管細胞から分泌される因子、又は、血管細胞と間葉系細胞の両方が存在することによって分泌される因子から選択される少なくとも１つの細胞及び／又は因子とともに培養される。

加えて、かかる培養方法では、細胞が移動可能な空間（培養空間）の体積が４００ｍｍ^３以下である。さらに加えて、細胞が移動可能な空間の体積をＶｍｍ^３、細胞が移動可能な空間の中に入れる間葉系細胞の細胞数をＮとしたとき、Ｎ／Ｖ比が３５以上３０００以下である。

言い換えると、上記培養方法は、複数の細胞を共培養して細胞塊を得る方法である。また、以下の条件を満たす；

細胞懸濁液中に含まれる複数の細胞が以下の（Ａ）乃至（Ｃ）を含むこと、
培養空間が４００ｍｍ^３以下の大きさであること、及び、
培養空間の体積をＶｍｍ^３、細胞が移動可能な空間の中に存在する間葉系細胞の細胞数をＮとしたとき、Ｎ／Ｖ比が３５以上３０００以下であること；

（Ａ）内胚葉細胞、外胚葉細胞及び中胚葉細胞からなる群より選択される少なくとも１つの細胞であって、幹細胞由来である細胞、すなわち幹細胞由来細胞（以下適宜、「幹細胞由来三胚葉細胞」と記載する）、

（Ｂ）間葉系細胞、及び

（Ｃ）血管細胞、血管細胞から分泌される因子、及び、血管細胞と間葉系細胞の両方が存在することによって分泌される因子からなる群より選択される少なくとも１つの細胞及び／又は因子（以下適宜、「血管細胞又は分泌因子」と記載する）。

なお、以降の説明では、「幹細胞由来細胞」と「幹細胞由来三胚葉細胞」とは特に区別しないで同様の意味で用いる。

培養空間は、当該空間内で培養される細胞が自在に移動することが可能な空間である。言い換えれば、培養空間とは当該領域内で細胞が三次元で移動可能な領域である。また、培養空間の体積が４００ｍｍ^３以下であることから、培養中の細胞は、この体積で特定される（制限される）空間内を移動する。

各細胞は移動することで互いに凝集する。凝集した細胞はさらに増殖と分化も行う。増殖又は分化した細胞は細胞塊を形成する。凝集とは、細胞同士が結合する状態を表す。かかる状態の細胞は分化又は増殖を開始する前の段階にある。ただし増殖能や分化能が高い細胞は、増殖又は分化と、凝集とを並行して起こす場合もある。細胞が凝集した状態では、培地を緩やかに攪拌するなど物理的に弱いせん断応力を加えただけで細胞同士が分散する。培養空間の大きさの特定については、図７等を参照して後述する。

加えて、培養空間の大きさは、目的とする細胞塊の大きさを考慮して決定されることが好ましい。これは以下の発見に依拠する。

発明者らの発見によれば、より生体に近い機能を有する細胞塊であって、移植の目的外の臓器の組織に分化しない細胞塊を作製するために重要なことは次の通りである；
培養空間の培地中に存在する間葉系細胞の割合、及び
間葉系細胞の移動距離可能な領域を制限すること。

＊細胞塊の説明

一実施形態の細胞塊は、幹細胞由来三胚葉細胞と、間葉系細胞と、血管細胞又は分泌因子とを共培養して得られる細胞群である。ここでいう、「幹細胞由来三胚葉細胞」及び「血管細胞又は分泌因子」は、上述した細胞懸濁液に含まれる。また「幹細胞由来三胚葉細胞」及び「血管細胞又は分泌因子」は、それぞれ上記（Ａ）及び（Ｃ）に記載の通りである。

加えて、細胞塊は、目的とする組織のもつ複数の機能を有することを前提とする。しかしながら、細胞塊が、生体組織の水準まで分化しているか否かは限定されない。また細胞塊が、成熟した細胞により構成されているかは限定されない。

一方で、細胞塊における複数の機能の発現について、以下のように示される。細胞塊の有する複数の機能は、胎児から採取された細胞又は胎児から採取された生体組織の有する機能に近いことが好ましい。これらの機能は例えば遺伝子発現パターンとして特定することができる。

細胞塊の有する複数の機能は、また成体から採取された細胞又は成体から採取された生体組織の有する機能に近いことが好ましい。細胞塊の有する複数の機能は、幹細胞又は幹細胞由来三胚葉細胞の有する複数の機能よりも、上記に近い複数の機能であることが好ましい。

少なくとも二種類、（好ましくは三種類）の細胞を共培養する。これにより、細胞を凝集させる。さらに、凝集した細胞に分化又は増殖を行わせる。又はこれらを並行的におこなせて細胞塊を形成する。

加えて、本明細書では、細胞塊は、スフェロイド形状であるか否かを問わない。本明細書では、細胞塊は、複数の細胞が塊を形成してなるものであればよい。

「スフェロイド」とは、細胞が多数凝集して球状の細胞塊を形成したものである。スフェロイドは、細胞が３次元状態で互いに凝集している。

本明細書では以下の用語を用いる。

「生体組織（biological tissue）」とは、何種類かの決まった細胞が一定のパターンで集合した構造の単位のことである。生体組織は、全体としてひとつのまとまった役割をもつ。例えば、生体内の各器官（臓器）は、何種類かの生体組織が決まったパターンで集まって構成されている。本明細書では、分化した細胞により構成され、かつ任意の機能を有する細胞の集まり（細胞群）を組織という。

「幹細胞由来の内胚葉、外胚葉又は中胚葉細胞」（以下“幹細胞由来三胚葉細胞“と称す）、について以下に説明する。

幹細胞とは胎生幹細胞、胚性幹細胞（ES細胞）及び人工多能性幹細胞（iPS細胞）から選択される細胞を含む。幹細胞は、無限増殖性を有している。本明細書ではさらに幹細胞が、内胚葉、中胚葉、外胚葉の全ての器官に分化可能な細胞を指す場合がある。

内胚葉細胞とは、肝臓、膵臓、腸管、肺、甲状腺、副甲状腺、尿路などの内胚葉性器官に分化可能な細胞をいう。

外胚葉細胞とは、脳、脊髄、副腎髄質、表皮、毛髪・爪・皮膚腺、感覚器、末梢神経、水晶体などの外胚葉系器官に分化可能な細胞のことをいう。

中胚葉細胞とは、腎臓、尿管、心臓、血液、生殖腺、副腎皮質、筋肉、骨格、真皮、結合組織、中皮などの中胚葉系器官に分化可能な細胞のことをいう。

すなわち、幹細胞由来三胚葉細胞とは、ES細胞及びiPS細胞から選択された細胞に由来する細胞であって、内胚葉性器官、外胚葉性器官又は中胚葉性器官の性質を有する細胞をいう。

ある細胞が内胚葉性器官、外胚葉性器官又は中胚葉性器官に分化可能な細胞であるかどうかは、マーカーとなるタンパク質の発現を調べることにより確認できる。例えば細胞に一又は複数の所定のマーカータンパク質が発現していれば、その細胞は内胚葉性器官に分化可能であると判断される。

例えば、肝臓に分化可能な細胞は、HHEX、SOX2、HNF4A、AFP、ALBなどをマーカーとして判別することができる。また膵臓に分化可能な細胞に対しては、PDX1、SOX17、SOX9などがマーカーになる。腸管に分化可能な細胞に対しては、CDX2、SOX9などがマーカーになる。腎臓に分化可能な細胞に対しては、SIX2、SALL1などがマーカーになる。心臓に分化可能な細胞では、NKX2-5 MYH6、ACTN2、MYL7、HPPAなどがマーカーになる。血球に分化可能な細胞では、C-KIT、SCA1、TER119、HOXB4などがマーカーになる。脳や脊髄に分化可能な細胞では、HNK1、AP2、NESTINなどがマーカーになる。

「間葉系細胞」とは、主として中胚葉に由来する結合織に存在する細胞である。生体組織内で機能している細胞を支持する構造を形成するための細胞である。かかる細胞は結合織細胞である。

未分化の間葉系細胞には、間葉系細胞への分化運命が決定しているが、まだ間葉系細胞へ分化していない細胞が含まれる。本発明において用いる間葉系細胞は、分化したものであっても、未分化なものであってもよい。未分化間葉系細胞は間葉系幹細胞ともいう。

ある細胞が未分化間葉系幹細胞であるかどうかは、細胞がマーカータンパク質を発現しているかどうかを調べることにより確認できる。マーカータンパク質は例えばStro-1、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD133、CD271、Nestinである。

細胞にこれらのマーカータンパク質のいずれか一つあるいは複数が発現していれば未分化間葉系細胞であると判断できる。また、前項のマーカーのいずれも発現していない間葉系細胞は分化済みの間葉系細胞と判断できる。

当業者間で使用されている用語のうち、mesenchymal stem cells、mesenchymal progenitor cells、mesenchymal cells（R. Peters, et al. PLoS One. 30;5(12):e15689.(2010)）などは本発明における間葉系細胞に含まれる。

本発明では、主としてヒト由来の間葉系細胞を用いる。本発明では、ヒト以外の動物、例えば、マウス、ラット、イヌ、ブタ、サルなどの動物由来の未分化間葉系細胞を用いてもよい。

「血管細胞」とは、血管内皮を構成する細胞、又はそのような細胞に分化することのできる細胞をいう。ここでいう「血管細胞」は、上述した（Ｃ）に含まれる血管細胞である。血管細胞は血管細胞等から分泌された因子以外のものである。「血管細胞」の用語は血管細胞のみを意味する。

ある細胞が血管細胞であるかどうかは、細胞がマーカータンパク質を発現しているかどうかを調べることにより確認できる。マーカータンパク質は例えば、TIE2、VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、CD41である。細胞にこれらのマーカータンパク質のいずれか一つあるいは複数が発現していれば血管細胞であると判断できる。

本発明において用いる血管細胞は、分化した血管細胞であっても、未分化な血管細胞であってもよい。血管細胞が、分化した細胞であるかどうかはマーカータンパク質CD31、CD144により、確認することができる。

当業者間で使用されている用語のうち、endothelial cells、umbilical vein endothelial cells、endothelial progenitor cells、endothelial precursor cells、vasculogenic progenitors、hemangioblast（HJ. joo, et al. Blood. 25;118(8):2094-104.(2011)）などは本発明における血管細胞に含まれる。

本発明で血管細胞を用いるときは、主としてヒト由来の血管細胞を用いる。本発明では、ヒト以外の動物、例えば、マウス、ラット、イヌ、ブタ、サルなどの動物由来の血管細胞を用いてもよい。

「器官芽」とは、成熟することで器官に分化することができる構造体である。器官芽は三種類の細胞を含む構造体である。三種類の細胞はそれぞれ幹細胞由来三胚葉細胞、血管細胞、及び未分化間葉系細胞又はそれから分化した細胞である。

ある構造体が器官芽であるかどうかは、例えば、以下の方法のうち少なくともいずれか一つを行うことで確認できる。方法の一つは、その構造体を生体へ移植し、目的の器官に分化できるかどうかを調べることである。ここで構造体が目的の器官へ分化すれば器官芽であると判断できる。方法の一つは構造体が上述した三種類の細胞をすべて含んでいるかどうかを調べることである。構造体が三種類の細胞をすべて含んでいれば器官芽であると判断できる。

器官芽は、例えば、腎臓、心臓、肺臓、脾臓、食道、胃、甲状腺、副甲状腺、胸腺、生殖腺、脳、脊髄などの器官に分化する器官芽などであってもよい。器官芽は内胚葉性器官に分化する器官芽であることが好ましい。かかる器官芽の例は、肝臓に分化する器官芽（肝芽）、膵臓に分化する器官芽（膵芽）、及び腸管に分化する器官芽である。

ある構造体が内胚葉性器官に分化する器官芽であるかどうかは、構造体においてマーカーとなるタンパク質の発現を調べることにより確認できる。後述するマーカータンパク質のいずれか一つあるいは複数が構造体において発現していれば構造体は内胚葉性器官に分化する器官芽であると判断できる。

例えば、肝芽に対しては、HHEX、SOX2、HNF4A、AFP、 ALBなどがマーカーになる。膵芽に対しては、PDX1、SOX17、SOX9などがマーカーになる。腸管に分化する器官芽に対しては、CDX2、SOX9などがマーカーになる。

当業者間で使用されている用語のうち、liver bud、liver diverticula、liver organoid、pancreatic (dorsal or ventral) buds、pancreatic diverticula、pancreatic organoid、intestinal bud、intestinal diverticula、intestinal organoid（K. Matsumoto, et al. Science.19;294(5542):559-63.(2001)）などは本発明における器官芽に含まれる。

胎児とは受精卵から生じた仔である。かかる仔は何らかの形で母親の体との連絡を持つ。かかる仔は母体から栄養などの供給を受けて成長する。かかる仔は十分に発育した後に母体から生まれてくる。「胎児から採取された細胞」とは、かかる仔か採取された細胞である。胎児から採取された細胞には、胎児の肝臓の生体組織や市販されている胎児肝細胞を含む。

「成体から採取された細胞」とは、十分に成長して、生殖が可能となった生物体から採取した細胞である。成体から採取された細胞は、例えば、市販されているヒト初代肝細胞やバイオプシーした生体組織を含む。

「成体から採取された、細胞又は生体組織」は、各社からヒトや動物に由来する細胞が販売されている。肝細胞は、チャールズリバー社、KAC社から購入することができる。

上記細胞又は生体組織は動物から採取することも可能である。例えば、ラットやマウスから肝細胞を採取する方法には、２段階コラゲナーゼ灌流法により肝細胞を分離する方法がある。例えばラットにおいて利用できる方法は以下の通りである。ます門脈よりカニューレを入れる。次に３７度に加温したリン酸緩衝液（前還流液）で門脈から脱血する。次に３７度に加温したコラゲナーゼ溶液で組織のコラーゲンを分解する。かかる方法により細胞のみを回収できる。

「胎児から採取された、細胞又は生体組織」は、市販されているものがある。かかる細胞又は組織はセルバンク等から入手可能である。例えば、これらは株式会社ベリタスから入手することができる。

＊複数の機能の説明

複数の機能とは、細胞塊が備え得る機能である。これを言い換えると、細胞塊の成熟段階に応じて検出可能な機能である。一実施形態では、遺伝子発現量、タンパク質量によって測定できる機能を、上記複数の機能として用いることができる。本明細書では、細胞塊が複数の機能を備えるか否かを問わない。このため、複数の機能に関する説明を省略する。

「共培養」とは、一般には、２種あるいはそれ以上の異なる種類の細胞を混合した後、これらの細胞を一緒に培養することをいう。

また、一実施形態の共培養は、上記細胞から細胞塊を形成させる工程、細胞塊をさらに培養して増殖と分化を行う工程、及びさらに細胞塊を培養し細胞塊を成熟化させる工程を含む。

例えば、上記細胞に細胞塊の一形態である器官芽を形成させた後、さらに器官芽の培養を行うことで器官芽を成熟化させる。ここでは説明を容易にするため、細胞に細胞塊を形成させた後、細胞塊に器官芽を形成させ、そして器官芽を成熟化させる場合を一例として説明する。しかしながら、上述したように、分化した細胞は、器官芽に限られることがない。分化した細胞は、細胞塊を分化させて形成される細胞や組織を含む。

以下で説明する共培養は、（１）細胞に細胞塊を形成させる工程、（２）細胞塊に器官芽を形成させる工程、（３）器官芽の培養を行い、器官芽を成熟化させる工程、を含む。

以下、各工程について説明する。

（１）細胞に細胞塊を形成させる工程（細胞塊形成工程）

三種類の細胞、幹細胞由来三胚葉細胞、間葉系細胞、及び血管細胞又は分泌因子を共培養する。これによりこれらの細胞に細胞塊を形成させる（数時間〜１日間）。

（２）細胞塊に器官芽を形成させる工程（器官芽形成工程）

上記細胞塊をさらに培養する。細胞塊の細胞を増殖及び分化させる。これにより細胞塊に器官芽を形成させる。

（３）成熟化させる工程（成熟化工程）

上記器官芽は、細胞の増殖速度が低下する又は細胞が増殖しない状態を呈する。この状態では所定期間、細胞の増殖速度が低下する、又は細胞が増殖しない状態が維持される。かかる期間、さらに培養を継続して行う。

幹細胞由来三胚葉細胞は、どのような細胞・組織に由来するものであっても良い。幹細胞由来三胚葉細胞は、リプログラミング技術を用いて作製した人工多能性幹細胞や胚に由来する胎生幹細胞を用いて得られることが好ましい。

細胞塊の形成方法としては、様々な方法が知られている。例えば液滴中に細胞塊を形成させる方法がある。かかる方法はハンギングドロップ法として知られている。また培養容器底面にナノオーダのピラーやメッシュ構造の凹凸を有する容器を用いる方法がある。また培地中に細胞を浮遊させた状態でローラーボトルを攪拌して細胞塊を形成させる方法がある。またアガロースやマトリゲルなどのゲル上で培養する方法がある。さらには、細胞非接着処理が施された培養容器を用いて静置して細胞塊を形成させる方法がある。これらいずれの方法を用いて細胞塊を形成しても良い。さらにこれら方法を組合せて細胞塊を形成してもよい。具体的な手法が様々な文献で紹介されている。例えば、以下の文献に記載されている。

Francesco Pampaloni、他著、"The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue"、Nature reviews molecular cell biology volume 8、2007年10月、pp. 839-845

Markus Rimann、他著、"Synthetic 3D multicellular systems for drug development" Current Opinion in Biotechnology 2012 23、 2012年、pp. 1-7

細胞塊形成工程では内胚葉細胞、外胚葉細胞及び中胚葉細胞からなる群を用いる。内胚葉細胞、外胚葉細胞及び中胚葉細胞は幹細胞に由来する。かかる内胚葉細胞、外胚葉細胞又は中胚葉細胞は、胎生幹細胞及び人工多能性幹細胞由来の細胞から選択される細胞を含むことが好ましい。

加えて、上記内胚葉細胞、外胚葉細胞及び中胚葉細胞からなる群は、人工多能性幹細胞由来の細胞であって、内胚葉系列の細胞に分化可能な細胞を含むことが好ましい。これは、倫理面のハードルが低いことによる。また人工多能性幹細胞由来の細胞を用いることで標準株の確立による均質性の担保が可能であることから人工多能性幹細胞由来の細胞を用いることが好ましい。

共培養における三種類の細胞の数の比は、器官芽が形成できる範囲内であれば特に限定されない。好適な細胞の数の比は、幹細胞由来三胚葉細胞：血管細胞：間葉系細胞＝１０：１０〜５：０．１〜１である。

血管細胞から分泌される因子、間葉系細胞から分泌される因子、及び血管細胞と間葉系細胞の両方が存在することによって分泌される因子として、次の物質が例示される。かかる物質はFGF2、FGF5、BMF4、BMP6、CTGFなどである。上記因子はこれらに限定されることはない。

これらの物質の添加量は次の通りである。ＦＧＦ２の添加量は、細胞１ｘ１０^６個当たり、１０〜１００ｎｇ／ｍｌが適当である。さらに２０ｎｇ／ｍｌ程度が好ましい。ＢＭＦ４の添加量は、細胞１ｘ１０^６個当たり、１０〜１００ｎｇ／ｍｌが適当である。さらに２０ｎｇ／ｍｌ程度が好ましい。

培養の際に使用する培地は、所定の複数の機能を有する細胞塊が形成されるものであればどのようなものでもよい。所定の複数の機能とは生体の細胞又は生体組織の有する複数の機能に近い複数の機能である。ここで上記生体の細胞は胎児又は生体から採取された細胞である。また上記生体組織は胎児又は生体から採取された生体組織である。細胞塊の複数の機能が生体組織等の複数の機能に近いことは遺伝子発現パターンで確認してもよい。

培養用の培地を使用することが好ましい。幹細胞培養用の培地を使用することが好ましい。幹細胞培養用の培地はES細胞やiPS細胞の培養用培地が好ましい。前記２つの培地を混合したものなどを使用することが好ましい。

血管細胞培養用の培地はどのようなものを使用してもよい。hEGF（組換えヒト上皮細胞成長因子）、VEGF（血管内皮細胞成長因子）、ヒドロコルチゾン、bFGF、アスコルビン酸、IGF1、FBS、Antibiotics(例えば、ゲンタマイシン、アンフォテリシンBなど)、Heparin、L-Glutamine、Phenolred、BBEの少なくとも１種を含む培地を使用するのが好ましい。

血管細胞培養用の培地としては、EGM-2 BulletKit（Lonza社製）、EGM BulletKit（Lonza社製）、VascuLife EnGS Comp Kit（LCT社製）、Human Endothelial-SFM Basal Growth Medium（Invitrogen社製）、ヒト微小血管内皮細胞増殖培地（TOYOBO社製）などを用いることができる。

幹細胞由来三胚葉細胞培養用の培地はどのようなものを使用してもよい。目的とする人工組織が肝臓組織である場合、肝細胞培養用の培地を用いることが好ましい。ascorbic acid、BSA- FAF、insulin、hydrocortisone、GA-1000の少なくとも１種を含む培地が好ましい。肝細胞培養用の培地として市販されているHCM BulletKit（Lonza社製）からhEGF（組換えヒト上皮細胞成長因子）を除いた培地が好ましい。RPMI1640（Sigma-Aldrich社製）に1% B27 Supplements (GIBCO社製) と 10ng/mL hHGF (Sigma-Aldrich社製)を添加した培地が好ましい。

より好ましくはGM BulletKit（Lonza社製）とHCM BulletKit（Lonza社製）よりhEGF（組換えヒト上皮細胞成長因子）を除いたものとを１：１で混ぜたものに、Dexamethasone、Oncostatin M、HGFを添加した培地を用いる。

培養時の温度は特に限定されないが、３０〜４０℃とするのが好ましく、３７℃とするのが更に好ましい。

培養期間は特に限定されないが、３〜５０日とするのが好ましく、１５日とするのが更に好ましい。

細胞塊形成工程と成熟化工程とでは異なる培養容器を用いてもよい。細胞塊形成工程は核となる細胞塊を形成させる工程である。成熟化工程は所定の複数の機能を有する細胞塊になるまでかかる細胞塊を成熟化させる工程である。所定の複数の機能とは、胎児から採取された細胞又は胎児から採取された生体組織の有する複数の機能に近い、複数の機能である。あるいは所定の複数の機能とは、成体から採取された細胞又は成体から採取された生体組織の有する複数の機能に近い、複数の機能である。

すべての工程において培養容器を用いてもよい。また、細胞塊形成工程、成熟化工程において、ハンギングドロップ法を用いてもよい。かかる場合には、培養容器にかえて液滴で細胞を培養してもよい。

細胞塊形成工程及び成熟化工程において、細胞同士が結合して凝集していることが好ましい。また細胞塊形成工程及び成熟化工程で形成される細胞塊は、細胞同士が結合してスフェロイド形状の塊となっていることが好ましい。

さらに加えて、細胞同士が形成する細胞塊の直径が２０μｍ〜２ｍｍであることが好ましく、５０μｍ〜２ｍｍであることがより好ましい。細胞塊の大きさは５０μｍ〜２００μｍであることがより好ましい。かかる場合、細胞塊の中心部まで培地中に含まれる栄養分（ビタミン・アミノ酸等）及び酸素を供給させることができる。このため細胞塊の中心部の細胞の壊死を防ぐことのできる（Efrem Curcio et al.,"Mass transfer and metabolic reactions in hepatocyte spheroids cultured in rotating wall gas-permeable membrane system", Biomaterials 28 (2007) 5487-5497)。

＊培養容器について

培養容器は例えば次の構成を有するものを用いる。

図１は、一実施形態の培養容器の一例を示す図である。図１では、複数の培養容器１を有する培養プレート３の一部分を示す。図１の上段には、培養容器１の底に形成される複数の凹み１０の一部分を、培養プレート３の上からみた図を示す。培養容器１は、複数の凹み１０が配置される。複数の凹み１０は、培養容器１の製造や細胞培養の効率の観点から、規則的に配置されることが好ましい。培養容器１は例えば複数のウェルを有するウェルプレートの一つのウェルに相当する。言い換えると、ウェルプレートの各ウェルに複数の凹み１０が配置されることになる。

ウェルプレートは、多数のくぼみ（穴又はウェル）のついた平板からなる実験・検査器具である。ウェルプレートでは各ウェルを試験管あるいはシャーレとして利用する。ウェルの数には例えば、６、２４、９６、３８４などがある。ウェルの数はそれ以上の場合もある。

ウェルの底は平らでもよく、丸くてもよい。またウェルプレートにはディープウェルプレートが含まれる。ディープウェルプレートは細長いマイクロチューブを多数組み合わせた形式のウェルプレートである。

図２、３は、実施形態１の凹みの形状例を示す図である。図２では、一つの凹み１０を横から見たときの断面図を示し、図３は、一つの凹み１０を上から見たときの図を示す。

各凹み１０は、底部１１と開口部１２とから構成される。開口部１２はホーン形状を有するホーン部である。開口部１２の上端は開口を有する。底部１１は、培養容器１の底になる部分であり、開口部１２は、底部１１の上部に配置される部分である。底部１１と開口部１２とが接する部分を境界と記載する。図２では、符号Ｒの矢印で示す長さの部分が境界の位置に対応する。また、図３では、境界の位置を２点破線で示している。ただし、底部１１と開口部１２とは連続した面で構成され、一体として製造される。

図２，３では、培養容器１に形成される複数の凹み１０に関して、相当直径Ｒ、深さ（高さ）Ｈ、を示す。

相当直径Ｒは、凹み１０の底部１１に内接する内接円の直径をいう。ここでは、底部１１と開口部１２との境界において内接する内接円の直径をいう。より詳しくは、相当直径Ｒは、境界における、凹み１０の高さＨの方向と垂直になる面の形状の内接円の直径をいう。

深さＨは、底部１１の内側の底から凹み１０の上端までの長さである。凹みの１０の上端は、開口部１２の端部（上端）と同じである。深さＨは、凹み１０が形成する空間の深さである。言い換えると、底部１１が形成する空間の底から開口部１２が形成する空間の上端までの深さである。図２では凹み１０の深さＨに加え、底部１１の深さＨ１及び開口部１２の深さＨ２を示している。

底部１１は、細胞を培養する空間（第１空間）を形成する。底部１１は、例えば、半球状の形状を有する。例えば、相当直径Ｒを直径とする球形を半分にした形状を用いることができる。底部１１の形状について半球状に限定されるものではない。

開口部１２は、細胞の培養及び回収を補助するように働く空間（第２空間）を形成する。開口部１２は、底部１１との境界から凹み１０の端部（先端）までを囲むテーパ角が１度以上２０度以下の壁で構成される。開口部１２を構成する壁のテーパ角が５度以上１５度以下であることが好ましく、１０度がより好ましい。その理由は、テーパ角が小さすぎると回収する際に細胞が凹みから培地に移行できないからである。またテーパ角が、逆に大きすぎると培地交換中に細胞が離脱することも、その理由である。

図２ではテーパ角を符号θ１、θ２で示す。図２，３に示す凹み１０の形状例では、テーパ角θ１、θ２は略同じ場合を示している。

底部１１と開口部１２との境界は、相当直径Ｒが５０μｍ以上１ｍｍ以下となるように形成される。細胞塊の中心部まで栄養を供給したい場合は相当直径５０μｍ以上５００μｍ以下が好ましく、より好ましくは１００μｍ以上５００μｍ以下である。

加えて、底部の底から端部までの深さＨが相当直径Ｒの０．５倍以上３倍以下となるように形成される。好ましくは、深さＨが相当直径Ｒの０．７倍以上１．２倍以下であり、より好ましくは、０．８〜１倍である。

また、培養容器は、隣り合う二つの凹み１０の間が平坦であることが好ましい。例えば、二つの凹み１０の距離が５μｍから５０μｍの範囲であることが好ましい。その理由は、細胞が壁の上に載ることを防ぐためである。かかる構成は、壁の上で細胞が接着し増殖、細胞塊形成を阻害することを回避する効果がある。ただし、壁が薄い場合は、細胞播種時や培地交換時の振動により容易に亀裂が生じる可能性がある。そのため壁の厚さは５μｍ以上であることが好ましい。このような観点から壁の厚さは５〜２０μｍが好ましい。

上述した形状に加え、培養容器１は以下のように製造されることが好ましい。

培養容器１が、アクリル系樹脂、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、スチレン系樹脂、アクリル・スチレン系共重合樹脂、ポリカーボネート系樹脂、ポリエステル系樹脂、ポリビニルアルコール系樹脂、エチレン・ビニルアルコール系共重合樹脂、熱可塑性エラストマー、塩化ビニル系樹脂、及びシリコン樹脂のうちの１つ又はこれらの組み合わせからなる樹脂の成形品であることが好ましい。

培養容器１が有する各凹み１０における水接触角が４５度以下になるように、各凹み１０に対して処理を行うことが好ましい。かかる処理は表面改質処理方法により官能基を形成させる処理が好ましい。表面改質処理方法はプラズマ処理、ガラスコート、コロナ放電、ＵＶオゾン処理のいいずれか又はこれら組み合わせからなることが好ましい。

加えて、各凹み１０へ、細胞接着を阻害する親水性のポリマー鎖が固定化されていることが好ましい。親水性のポリマー鎖は、上述した水接触角が４５度以下になるように処理された各凹み１０へ固定化されることがより好ましい。

さらに加えて、各凹み１０へ、リン脂質、又は、リン脂質・高分子複合体が固定化されていることが好ましい。この固定化の処理は、上述した水接触角が４５度以下になるように処理された各凹み１０に対して実施されることがより好ましい。また固定化の処理は親水性のポリマー鎖が固定化された各凹み１０に対して実施されることがより好ましい。また固定化の処理は、上記処理及び固定化の組み合わせが実施された各凹み１０に対して実施されることがより好ましい。

各凹み１０は、水接触角を４５度以下になるように処理した表面に対して、ポリマーを固定化させることで得られる細胞非接着表面を有することが好ましい。水接触角を４５度以下とするため各凹み１０に対して官能基を形成することが好ましい。官能基は表面改質処理方法によって形成することが好ましい。かかる表面改質処理方法はプラズマ処理、ガラスコート、コロナ放電、ＵＶオゾン処理のいいずれか又はこれら組み合わせからなることが好ましい。ポリマーは細胞接着を阻害する親水性のポリマー鎖、及び、リン脂質、又は、リン脂質・高分子複合体のうちのいずれか一つのポリマーが好ましい。この処理は、上述した各処理、又は各処理を組合せた処理とともに実施されることがより好ましい。

また、上述した親水性のポリマー鎖はポリヒドロキシエチルメタクリレートであることが好ましい。さらに、ポリヒドロキシエチルメタクリレートの平均分子量が１０万以上であることがより好ましい。

培養容器１は、上述した図１−３に示すものに加え、図４，５に示すマイクロパターンを形成した培養容器を用いてもよい。

図４に、一実施形態で用いる培養容器の他の形状例を示す。図５は、図４に示す培養容器のＶ−Ｖ線断面図である。

培養容器３０は、培養空間３１と、壁３２と、底部３３とを有する。

培養空間３１は、壁３２と底部３３とで仕切られた領域である。培養空間３１は、細胞を培養する三次元の空間領域（培養領域）となる。培養空間３１は、単に「空間」、又は「マイクロ空間」とも称する。

壁３２は、培養空間３１を仕切る隔壁であり、培養容器３０に凹凸パターンを形成する凸部ともいえる。

底部３３は、培養容器３０の基板として機能する。また底部３３の表面であって、培養空間３１が配置される側の表面は、培養領域（培養表面）の一部となる。底部３３は、例えば、図１の培養プレートに形成された各ウェルの底部と同じ領域である。これら、各ウェルの底部が底部３３として用いられる。底部３３は、培養空間３１の底を形成する。底部３３の表面のうち、培養空間３１を形成する面の一部分であり、かつ、培養領域となる底部の表面を、「底部培養面３４」とも称する。

図４，５では、培養容器３０に形成される培養空間３１に関して、相当直径Ｄ、高さ（深さ）Ｈ、壁３２の幅（厚さ）Ｗ、及び、底部３３の厚さＴを示す。図４，５では、底部３３は、壁３２と一体として作製された場合を示している。

相当直径Ｄは、図２の相当直径Ｒと同様である。相当直径Ｄは、培養空間３１に内接する内接円の直径をいう。より詳しくは、相当直径Ｄは、培養空間３１の底部３３と平行する面の形状（正面の形状）をいう。これを言い換えると、相当直径Ｄは、培養空間３１の高さＨの方向と垂直になる面の形状の内接円の直径をいう。ここで培養空間３１を正面視したときの形状が、高さＨに応じて異なる場合がある。この場合、株化肝細胞を培養する空間領域の幅の最大値を相当直径とする。

高さＨは、培養空間３１の底（底部培養面３４）から壁３２の上面までの長さである。高さＨは、培養空間３１の深さでもあるともいえる。また、底部培養面３４が平面の場合、高さＨは、壁３２の高さと同じである。

壁３２の幅Ｗは、壁３２の厚さであるとともに、隣接する培養空間３１間を隔てる距離であるともいえる。

培養容器３０内（言い換えると、各ウェル内）において、複数の培養空間３１は、図４に示すようにアレイ状に配置される。培養容器３０に含まれる培養空間３１の数又は大きさは、培養プレートに作製されるウェルの数（ウェルの大きさ）と培養空間３１及び壁３２の大きさに依存するものである。図４，５では、９個の培養空間３１を示している。これは説明のために示したものであり、実際の培養容器３０（各ウェル）に含まれる培養空間３１の数に対応するものではない。

さらに、培養容器に図６に示す凹み２０Ｄを用いてもよい。図６は、底部が線状、言い換えると底部が空間を形成しない凹み２０Ｄの形状例を示す。図６では、上段に凹み２０Ｄを上から見た正面図、下段に断面図を示す。凹み２０Ｄは、開口部１２から構成される。

図７に、図４，５に示す培養容器を用いて細胞を培養する状態の一例を示す。図７では、ウェルプレートの一つのウェルに相当する、一つの培養容器３０を表している。また図７では、培養容器３０に形成される複数の培養空間３１のうち、３つの培養空間３１を示している。図７では、他の複数の培養空間３１が省略されている。培養容器３０には、複数の培養空間３１を覆うように培地８が注入される。各培養空間３１には細胞塊９が形成されている状態を示す。

本実施形態では、細胞が移動可能な空間は、培養空間３１の体積（Ｖｍｍ^３）である。具体的には、図４，５に示す培養空間３１の体積は、底部培養面３４の面積と高さＨとの積である。なお、培養中の細胞は、培養空間３１の壁３２を越えて移動しないことを前提とする。

本実施形態では、培養空間の体積Ｖｍｍ^３が４００ｍｍ^３以下である。加えて、培養空間の中に入れられる間葉系細胞の細胞数をＮとしたとき、Ｎ／Ｖ比が３５以上３０００以下となるように、細胞数Ｎを調整する。培養空間の体積を限定すると、細胞が移動できる範囲を制限することになる。また、培養空間の体積に対する間葉系細胞の細胞数を特定すると、培養空間における間葉系細胞の密度を特定することになる。発明者らは、これら二つの要素にかかる条件を満たす場合において、間葉系細胞の細胞数を削減しても、培養される細胞から細胞塊が形成されることを発見した。加えて、発明者らは、形成された細胞塊がより生体に近い機能を有することを見出した。さらに発明者らは、かかる細胞塊は、移植の目的外の臓器の組織に分化しない、安全性の高い細胞塊であることを見出した。

発明者らは、特に、細胞が移動可能な空間に存在する間葉系細胞の数の割合が、培養に供する細胞の総数に対し０．５％以上５％未満であることが好ましいことを発見した。ここで、培養に供する細胞の総数は、幹由来細胞、間葉系細胞、血管細胞、及びその他細胞の総数であり、因子は細胞数としてカウントしない。

さらに加えて、上記細胞を混合し共培養するにあたり、幹細胞由来の内胚葉細胞、外胚葉細胞および中胚葉細胞の合計の細胞数（Ｘ）と間葉系細胞の細胞数（Ｙ）との比率Ｘ：Ｙが、２０：１から１００：１の範囲内にあることが好ましいことを発見した。

発明者らは、細胞が移動可能な空間に存在する間葉系細胞の数の割合が、培養に供する細胞の総数に対し０．５％以上であるとき、細胞塊が好適に形成されることを発見した。また、上記細胞を混合し共培養するにあたり、幹細胞由来細胞（幹細胞由来三胚葉細胞）の細胞数（Ｘ）と間葉系細胞の細胞数（Ｙ）との比率Ｘ：Ｙが、２０：１から１００：１の範囲内にあるとき、器官芽が好適に形成される。

幹細胞由来細胞（幹細胞由来三胚葉細胞）の細胞数（Ｘ）とは、幹細胞に由来する、内胚葉細胞、外胚葉細胞及び中胚葉細胞のうちのいずれか、又はこれらの組合せからなる細胞の数の合計である。言い換えると、細胞数（Ｘ）とは、内胚葉細胞、外胚葉細胞及び中胚葉細胞のうちから、幹細胞由来細胞として用いる細胞の数を合計したものである。

なお、図７の培養容器３０では、複数の培養空間３１（複数の移動可能な空間）は、培地８によって繋がっている。従って、各培養空間３１では、培地８等の条件を同一にし易くなる。

ここで、培養空間３１（培養空間３１の範囲）について、図２，６，図８から図１０を参照して説明する。図７では、培養空間３１と細胞が移動可能な空間とが一致する場合を例示した。しかしながら、培養空間と細胞が可能な空間とが一致するとは限らない。

例えば、図８に示す培養容器４０Ａでは、培養空間４１Ａを形成する壁４２Ａの高さＨが相当直径Ｄより大きい（Ｈ＞Ｄ）。この場合には、培養空間４１Ａのうち、底部培養面４４Ａから高さが相当直径Ｄの大きさまでの空間を、細胞が移動可能な空間として利用する。言い換えると、細胞が移動可能な空間の高さＨは、相当直径Ｄ以下に限定される。

また、図２に示す培養容器１０では、高さＨ１までが、細胞が移動可能な空間となる。図２では、開口部１２を培養空間から除き、底部１１が培養空間として利用される。

一方、図６の凹み２０Ｄ（培養容器）の開口部１２のように、傾斜が一様である場合には、培養空間の高さを、培養空間の体積が４００ｍｍ^３以下になる高さとする。またかかる高さより低い位置にある空間を、細胞が移動可能な空間として利用する。

加えて、図９に示す培養容器４０Ｂは、図２のように、底部１１と開口部１２との境界を有しない。このため、底部４１Ｂと開口部４２Ｂとが一様の傾斜を有する壁面で形成されている。かかる場合には、培養空間の高さを、培養空間の体積が４００ｍｍ^３以下になる高さとする（例えば、Ｌ）。またかかる高さより低い位置にある空間を、細胞が移動可能な空間として利用する。

さらに加えて、細胞が移動可能な空間（培養空間）は、必ずしも周囲が培養容器により囲まれているとは限らない。例えば、ハンギングドロップ法を用いる場合（例えば、図１０）がある。この場合、培養液により形成される液滴８１によって、培養空間が限定されることになる。従って、細胞が移動可能な空間の体積は、液滴８１の体積に等しい。

細胞塊を形成するための各細胞は、上述した培養容器１の各凹み１０内や培養容器３０の培養空間内で共培養される。凹み（凹みの底部）によって形成される空間は、培養空間と同様に細胞が移動可能な空間である。凹み及び培養空間を形成する容器（例えば、培養容器３０では、底部培養面３４と壁３２とからなる容器）は、マイクロ容器とも記載する。

マイクロ容器は、次のように構成されることが好ましい。

マイクロ容器の相当直径が２０μｍ以上２．５ｍｍ以下であることが好ましい。マイクロ容器の深さが２０μｍ以上２．５ｍｍ以下であることが好ましい。細胞塊の中心部まで栄養を供給したい場合は、上記相当直径は、５０μｍ以上５００μｍ以下が好ましく、より好ましくは１００μｍ以上５００μｍ以下である。

細胞塊を、細胞非接着表面を有するマイクロ容器を用いて培養することが好ましい。

細胞塊を形成させるためには培養表面に細胞を接着させず細胞同士の接着を促進することが好ましい。培養容器は細胞と接触する培養面を有する。このため、細胞非接着性を有するポリマーが培養面にコートされていることが好ましい。かかるポリマーは、リン脂質、リン脂質・高分子複合体、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（ＰＨＥＭＡ）、ポリビニルアルコール、アガロース、キトサン、ポリエチレングリコール、及びアルブミン、のグループから選択される一つ又はこれらの組合せからなるポリマーが好ましい。

培養容器は、細胞の培養及び回収を補助する機能、細胞塊を保持する機能、並びに培地交換時に細胞の離脱を防ぐ機能を有することが好ましい。このため、凹み１０は底部１１と開口部１２とで構成されていることが好ましい。

開口部１２は底部１１との境界から開口部１２の上端部までの高さに位置する壁であって、テーパ角１度以上２０度以下の壁を有することが好ましい。開口部１２の有する空間はかかる壁に囲まれていることが好ましい。

各細胞を底部１１の一箇所に自重により集合させるために、底部１１の有する空間が、半球形状又は円錐台形状を有することがより好ましい。かかる態様により細胞塊の形成を促進させることができる。

以上のようにして作製した細胞塊は、創薬スクリーニングや再生医療などに使用することができる。

未分化細胞を分化させ、生体に近い機能を有する細胞を得るには、未分化細胞を培養して三次元の細胞塊を形成する必要がある。また、細胞を凝集させ器官芽に分化させるためには所定の量の間葉系細胞を必要としていた（例えば、特許文献３）。一方で、間葉系幹細胞が未分化細胞の分化に影響を及ぼす問題が生じていた。例えば、線維性細胞又は骨細胞が、移植の目的外の臓器の細胞である場合であっても、未分化細胞がこれらの細胞へ分化するという問題が生じていた（非特許文献２）。従って、未分化細胞を培養する技術では、間葉系細胞を削減することが課題とされていた。しかしながら、細胞塊を作成するためには、所定量の間葉系細胞とともに、幹細胞由来三胚葉細胞を培養する必要があった。

未分化細胞を分化させるには、細胞塊を形成させる必要がある。このため、間葉系細胞の数を削減することは極めて困難であると考えられていた。しかしながら発明者らは、間葉系細胞の数を削減しても細胞塊を作製できる手法を見出した。言い換えると、発明者らは、上記で説明したような、細胞塊を作製する手法を見出した。かかる手法では細胞が移動可能な空間を制限するとともに、間葉系細胞の密度を特定する。このため間葉系細胞の数を従来よりも削減しても細胞塊を作製できる。従来よりも間葉系細胞の数を削減した状態で細胞塊を作製することにより、生体に近い機能を有し、かつ、移植の目的外の臓器の組織に分化しない細胞を培養することができる。加えて、一実施形態の培養方法では、複雑な処理を必要としない。これにより、安全性の高い細胞塊を、効率よく得ることができる。その結果、細胞塊を得るのに要する時間とコストを削減することが可能となる。

例えば、特許文献３に記載の器官芽を形成する技術に基づいて、人工組織に関する技術が開発されている。かかる技術によって様々な高機能な移植材料を提供できる。かかる技術では目的とする臓器の機能を包括的に捉える。かかる技術では人工組織によってそれらの機能を再現することを目的とする。上述した実施形態に係る方法は、これらの技術への応用が期待できる。加えて、このような複数の細胞機能を同時に発揮する移植材料を実現するには、より生体内に近い機能を有する程度まで成熟した人工組織が必要とされている。また、そのような人工組織を得るために細胞の分化効率を高める方法が必要とされている。またリスクの少ない人工組織が必要とされている。かかるリスクとは例えば繊維性細胞又は骨細胞が移植の目的外の臓器の細胞であるにも拘らず、移植された人工組織の細胞がこれらの細胞に分化するというリスクである。一実施形態の培養方法は、これらの課題を解決する手段の一つとして採用されることが期待できる。

以下に本発明の培養方法の一態様を実施した試験結果の一例を示す。

［実施例１及び比較例１］

実施例１と比較例１とを比較した。比較例１では、細胞が移動可能な空間が４００ｍｍ^３より大きいことが実施例１と異なる。

（１）幹細胞由来三胚葉細胞の作製

ヒトiPS細胞（ヒト皮膚由来TkDA3 hiPSCクローン（Koji Eto氏及び Hiromitsu Nakauchi氏より譲渡））を無血清培地にアクチビンを添加して培養した。これにより、CXCR4及びE-cadherin両陽性の内胚葉系細胞を誘導した。得られた内胚葉系細胞をBMP４、FGF２を添加して２日間培養した。これにより、CXCR4陰性、HNF4α陽性の肝臓内胚葉集団（肝臓内胚葉細胞）を得た。CXCR4及びHNF4αの発現は、以下の文献の記載に従い、免疫染色及び遺伝子発現解析により確認した。

Karim Si-Tayeb、他著、“Highly Efficient Generation of Human Hepatocyte-Like Cells from Induced Pluripotent Stem Cells”、Hepatology、Vol 51、No.1、２０１０年、pp. 297-305

（２）細胞懸濁液の調整及び培養

細胞懸濁液は、得られた肝臓内胚葉細胞、血管内皮細胞（ヒト臍帯血由来静脈内皮細胞）（Lonza、Basel、Switzerland）及び未分化間葉系細胞（ヒト間葉系幹細胞、以下、MSC（mesenchymal stem cell）と表記することがある）（Lonza、Basel、Switzerland）を用いて調整した。

細胞播種割合は、肝臓内胚葉細胞：血管内皮細胞：未分化間葉系細胞を２０：１４：２とし、各細胞をこの割合で混合し、細胞懸濁液（細胞溶液）を作製した。培養液は、内皮細胞培地キット−２：EGM-2 BulletKit（製品コード CC-3162：Lonza）を用いた。培養は２０日間行い、２回／週の頻度で培地を交換した。

（３）培養容器

実施例１では、細胞が移動可能な空間の相当直径が５００μｍ、深さが４００μｍである凹み（空間、マイクロ空間）を用いた。この凹みを１ウェルに６００個有する２４ウェルプレートの培養容器を使用した。図１１に実施例で用いた培養容器（凹み１０）を示す。凹み１０は、相当直径５００μｍ半球からなる底部１１と開口部１２とから構成される。この培養容器の細胞が移動可能な空間の体積Ｖは０．０６８ｍｍ^３であった。細胞接着性を抑制するため細胞が接触する培養表面にｐ−ＨＥＭＡをコートした。

比較例１では底面積が２ｃｍ^２（２００ｍｍ^２）の２４ウェルプレートに培地が培養面から高さ３ｍｍになるようにして培養した。このときの細胞が移動可能な空間の体積は６００ｍｍ^３であった。細胞接着性を抑制するため細胞が接触する培養表面にｐ−ＨＥＭＡをコートした。

（４）細胞播種数

２４ウェルの１ウェルに、肝臓内胚葉細胞が２.０×１０^５個、血管内皮細胞が１．４×１０^５個、未分化間葉系細胞が２.０×１０^４個となるように細胞を播種した。実施例のＮ／Ｖ比は、２.０×１０^４÷６００÷０．０６８＝４９０及び比較例のＮ／Ｖ比の値は２.０×１０^４÷６００＝３３であった。

上述したように、Ｎ／Ｖ比は、細胞が移動可能な空間の体積Ｖ（ｍｍ^３）と、間葉系細胞の細胞数Ｎとの比である。ここでは、未分化間葉系細胞の数がＮの値となる。

（５）分析

培養２０日目に、各ウェルの細胞を、倒立顕微鏡を用い、１０倍に拡大しすべての視野を観察した。

（６）結果

比較例１では細胞塊がほとんど形成されなかった。一方、実施例１では図１２に示すように細胞塊が形成された。また６００個の空間のうち５００個の空間で細胞塊が形成された。

［実施例２及び比較例２］

実施例２と比較例２とを比較した。比較例２では、細胞が移動可能な空間が４００ｍｍ^３以下でＮ／Ｖ比が３１未満であることが実施例２と異なる。

（１）幹細胞由来三胚葉細胞の作製

ヒトiPS細胞（ヒト皮膚由来TkDA3 hiPSCクローン（Koji Eto氏及び Hiromitsu Nakauchi氏より譲渡））を無血清培地にアクチビンを添加して培養した。これにより、CXCR4及びE-cadherin両陽性の内胚葉系細胞を誘導した。得られた内胚葉系細胞をBMP４、FGF２を添加して２日間培養した。これにより、CXCR4陰性、HNF4α陽性の肝臓内胚葉集団（肝臓内胚葉細胞）を得た。CXCR4及びHNF4αの発現は、実施例1と同様の方法で、免疫染色及び遺伝子発現解析により確認した。

（２）培養容器

実施例２及び比較例２では、細胞が移動可能な空間の相当直径が５００μｍ、深さが４００μｍである凹み（空間）を用いた。この凹みを６００個有する２４ウェルプレートの培養容器を使用した。培養容器の概観は実施例１で説明した図１１と同様である。この培養容器の細胞が移動可能な空間の体積Ｖは０．０６８ｍｍ^３であった。細胞接着性を抑制するため細胞が接触する培養表面にｐ−ＨＥＭＡをコートした。

（３）細胞懸濁液の調整及び培養

細胞懸濁液は、得られた肝臓内胚葉細胞、血管内皮細胞（ヒト臍帯血由来静脈内皮細胞）（Lonza、Basel、Switzerland）及び未分化間葉系細胞（ヒト間葉系幹細胞）（Lonza、Basel、Switzerland）を用いて調整した。

細胞播種割合は、表１の数になるように各細胞懸濁液を調整し、細胞懸濁液を培養液に播種した。培養液は、内皮細胞培地キット−２：EGM-2 BulletKit（製品コード CC-3162：Lonza）を用いた。培養は２０日間行い、２回／週の頻度で培地を交換した。

（４）分析

培養２０日目に、各ウェルの細胞を、倒立顕微鏡を用い、１０倍に拡大し観察した。１ウェル全体に存在する６００個のスポットすべてを観察した。その中で存在する細胞が１０個以上集合した細胞塊が形成されているスポットの数を目視でカウントした。

未分化マーカーとしてＡＦＰを肝分化マーカーとしてＨＮＦ４ａの２種類の遺伝子を選択した。それらについてリアルタイムＰＣＲ法で分析した。さらに、より詳細に機能を解析するため、肝分化マーカーとして、ＡＬＢ（アルブミン）トランスサイレチン（ＴＴＲ）ＡＳＧＲ１（parenchymal hepatocytes）を選択した。これらについても同様にリアルタイムＰＣＲ法で分析した。

（５）結果

・細胞塊形成効率

図１３に細胞塊形成数の測定結果を表すグラフを示す。横軸はＭＳＣの比率であり、縦軸は、測定した細胞塊形成数を示す。実施例ではＭＳＣの比率が１／８０〜１／１０であった。またＮ／Ｖ比の値が６１．３〜４９０．２であった。実施例では６００個のスポットのうち８０％以上のスポットで細胞塊が形成された。ＭＳＣの比率が１／１６０以下になり、かつＮ／Ｖ比の値で３０．６以下になると、細胞塊の形成率が８０％を下回った。特にＮ／Ｖ比の値が３０を下回ったとき細胞塊の形成率が大幅に低下した。

・細胞機能評価（遺伝子発現解析）

図１４にＡＦＰ発現量の測定結果を、図１５にＨＮＦ４ａ発現量の測定結果を表すグラフを示す。図１４、１５の横軸は、図１３と同様に、ＭＳＣの比率を示す。縦軸は、ＡＦＰ又はＨＮＦ４ａの発現量（relative expression）を示す。ＡＦＰは、幼若な細胞に特徴的に発現する遺伝子である。ＨＮＦ４ａは成熟細胞に特徴的に発現する遺伝子である。

実施例においてＭＳＣの比率は１／８０〜１／１０である。この条件下では８０％以上のスポットに細胞塊が形成された。さらに細胞塊においてＨＮＦ４ａが発現していた。実施例においてＭＳＣの比率が１／８０〜１／２０である場合、８０％以上のスポットに細胞塊が形成され、かつＨＮＦ４ａの発現量が高く、かつＡＦＰの発現量が低い（ほぼゼロ）。この範囲内にあるＭＳＣの比率がより好ましい条件を表している。

さらに、ＭＳＣの比率を１／８０と１／１０の間で変化させて、複数のマーカーについて細胞塊を検証した。成熟肝組織が有する３つの機能に関連する、ＡＬＢ（アルブミン）、ＡＳＧＲ１（parenchymal hepatocytes）、ＴＴＲ（トランスサイレチン）の遺伝子発現量を分析した。

図１６はＡＬＢ発現量の測定結果を示すグラフである。図１７はＴＴＲ発現量の測定結果を示すグラフである。図１８はＡＳＧＲ１発現量の測定結果を示すグラフである。図１６乃至１８の横軸は、図１３と同様にＭＳＣの比率を示す。縦軸は、ＡＬＢ、ＴＴＲ又はＡＳＧＲ１の発現量（relative expression）を示す。

また、表２にＭＳＣの比率１／８０〜１／１０の各条件で得られた値の中で、最も小さい値を”＋”で表した。表には（＋）と表記した。最も小さい値に対して、１倍から２倍未満の大きさの値は”＋＋”で表した。最も小さい値に対して、２倍から４倍の大きさの値は”＋＋＋”で表した。最も小さい値に対して、４倍より大きい値は”＋＋＋＋”で表した。

図１６乃至１８、表２に示すように、ＭＳＣの比率が１／２０と１／４０の時、全ての分化マーカーの遺伝子発現量は、有意に高値を示した。

この出願は、２０１４年５月３０日に出願された日本出願特願２０１４−１１２９５９を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。

１、３０、４０Ａ、４０Ｂ 培養容器
３ 培養プレート
８ 培地
９ 細胞塊
１０、２０Ｄ 凹み
１１、４１Ｂ 底部
１２、４２Ｂ 開口部
３１、４１Ａ 培養空間
３２、４２Ａ 壁
３３ 底部
３４、４４Ａ 底部培養面
８１ 液滴

Claims (12)

1. いずれも未分化の内胚葉細胞、外胚葉細胞及び中胚葉細胞からなる群から選択される一種以上の細胞である幹細胞由来細胞と、
   血管内皮細胞と、
   未分化の間葉系細胞と、
   を含む三以上の細胞からなる集団を、所定の領域内で三次元培養する、
   培養方法であって、
   前記領域は細胞が移動可能な空間からなり、
   前記空間の体積をＶ ｍｍ^３とし、前記空間に播種される前記間葉系細胞の細胞数をＮとしたとき、前記Ｖは１以下であり、かつＮ／Ｖは３５以上３０００以下であり、
   前記集団は細胞数Ｘの前記幹細胞由来細胞と細胞数Ｙの前記間葉系細胞とからなり、
   Ｘ：Ｙは２０：１から１００：１の範囲内にある、
   ことを特徴とする培養方法。
2. 培養に供する細胞の総数に対する前記間葉系細胞の数の割合は、０．５％以上５％未満である、
   ことを特徴とする請求項１に記載の培養方法。
3. いずれも未分化の内胚葉細胞、外胚葉細胞及び中胚葉細胞からなる群から選択される一種以上の細胞である幹細胞由来細胞と、
   血管内皮細胞と、
   未分化の間葉系細胞と、
   を含む三以上の細胞からなる集団を、所定の領域内で三次元培養する、
   培養方法であって、
   前記領域は細胞が移動可能な空間からなり、
   前記空間の体積をＶ ｍｍ^３とし、前記空間に播種される前記間葉系細胞の細胞数をＮとしたとき、前記Ｖは１以下であり、かつＮ／Ｖは３５以上３０００以下であり、
   培養に供する細胞の総数に対する前記間葉系細胞の数の割合は、０．５％以上２．９％未満である、
   ことを特徴とする培養方法。
4. 前記集団は細胞数Ｘの前記幹細胞由来細胞と細胞数Ｙの前記間葉系細胞とからなり、
   Ｘ：Ｙは２０：１から１００：１の範囲内にある、
   ことを特徴とする請求項３に記載の培養方法。
5. 前記領域はマイクロ容器で形成されており、
   前記Ｎ／Ｖは１００以上３００以下であり、
   前記Ｘ：Ｙは２０：１から５０：１の範囲内にあり、
   前記マイクロ容器の相当直径をＥとし、前記マイクロ容器の深さをＤとしたとき、Ｅ：Ｄは１：０．５から１：２の範囲内である、
   ことを特徴とする請求項１、２及び４のいずれか一項に記載の培養方法。
6. 前記三次元培養によって得られる細胞塊は器官芽である、
   ことを特徴とする請求項１乃至５のいずれか一項に記載の培養方法。
7. 前記三次元培養によって得られる細胞塊はスフェロイド形状であり、
   前記スフェロイド形状の細胞塊の直径は２０μｍから２ｍｍである、
   ことを特徴とする請求項１乃至６のいずれか一項に記載の培養方法。
8. 前記幹細胞由来細胞は胎生幹細胞又は人工多能性幹細胞に由来する、
   ことを特徴とする請求項１乃至７のいずれか一項に記載の培養方法。
9. 前記幹細胞由来細胞は人工多能性幹細胞に由来し、
   前記幹細胞由来細胞は内胚葉細胞である、
   ことを特徴とする請求項１乃至８のいずれか一項に記載の培養方法。
10. 前記領域はマイクロ容器で形成されており、
    前記マイクロ容器の相当直径は２０μｍ以上２．５ｍｍ以下であり、
    前記マイクロ容器の深さは２０μｍ以上１０００μｍ以下である、
    ことを特徴とする請求項１乃至９のいずれか一項に記載の培養方法。
11. 前記マイクロ容器は底部、及びホーン部を備え、
    前記ホーン部は壁を有し、
    前記壁は１度以上２０度以下のテーパ角を有し、
    前記底部は半球形状又は円錐台形状の空間を有する、
    ことを特徴とする請求項１０に記載の培養方法。
12. 前記マイクロ容器は、細胞と接触する培養面を有し、
    前記培養面は、リン脂質、リン脂質・高分子複合体、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（ＰＨＥＭＡ）、ポリビニルアルコール、アガロース、キトサン、ポリエチレングリコール、及びアルブミン、のグループから選択される一つ又はこれらの組合せからなるポリマーでコートされている、
    ことを特徴とする請求項１０又は１１に記載の培養方法。

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