CN106459925A - 培养方法和细胞团 - Google Patents

培养方法和细胞团 Download PDF

Info

Publication number
CN106459925A
CN106459925A CN201580029061.3A CN201580029061A CN106459925A CN 106459925 A CN106459925 A CN 106459925A CN 201580029061 A CN201580029061 A CN 201580029061A CN 106459925 A CN106459925 A CN 106459925A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
culture
space
mesenchymal
cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201580029061.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106459925B (zh
Inventor
江尻洋子
谷口英树
武部贵则
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Corning Co., Ltd
Yokohama City University
Original Assignee
PUBLIC UNIVERSITY CORP YOKOHAM
Kuraray Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by PUBLIC UNIVERSITY CORP YOKOHAM, Kuraray Co Ltd filed Critical PUBLIC UNIVERSITY CORP YOKOHAM
Publication of CN106459925A publication Critical patent/CN106459925A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106459925B publication Critical patent/CN106459925B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/067—Hepatocytes
    • C12N5/0671—Three-dimensional culture, tissue culture or organ culture; Encapsulated cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0062—General methods for three-dimensional culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/069—Vascular Endothelial cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0697—Artificial constructs associating cells of different lineages, e.g. tissue equivalents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/13—Coculture with; Conditioned medium produced by connective tissue cells; generic mesenchyme cells, e.g. so-called "embryonic fibroblasts"
    • C12N2502/1352—Mesenchymal stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2513/00—3D culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2531/00—Microcarriers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/30—Synthetic polymers

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

本发明是在凹陷(10)内对包含两种以上细胞的群体进行培养的培养方法所述两种以上细胞含有源自干细胞的细胞和间充质细胞。源自干细胞的细胞是指在体外(in‑vitro)使干细胞分化而得到的细胞。所述细胞是选自由内胚层细胞、外胚层细胞和中胚层细胞组成的组中的一种以上细胞。群体与血管细胞或分泌因子一同在凹陷(10)内进行培养。凹陷(10)具有细胞可移动的空间。将空间的体积设为Vmm3。将接种在空间的间充质细胞的细胞数设为N。此时，V为400以下。进而N/V为35以上且3000以下。

Description

培养方法和细胞团
技术领域
本发明涉及培养干细胞而得到细胞团的培养方法。在此，干细胞是例如诱导多能干细胞、胚胎干细胞等未分化细胞。本发明还涉及根据所述方法而得到的细胞团。
背景技术
近些年，进行了对人为分化的多能干细胞进行药物筛选、应用于再生医疗的尝试(例如，非专利文献1)。此处多能干细胞是指具有分化为各种功能细胞的能力的细胞。根据药物筛选、再生医疗的目的而使多能干细胞分化为具有特定的脏器或特定的细胞种类所特有的功能的细胞。作为所述多能干细胞使用例如iPS细胞。然而，人为分化的多能干细胞多数仅能够再现体内(in vivo)中的一部分生物体功能。因此，与生物体内的细胞的功能相比，人为分化的多能干细胞的功能明显降低的情况较多。
在使用了细胞的药物筛选试验中，该细胞显示药物敏感性，且呈现毒性反应。所述药物敏感性和毒性反应的水平，要求与在生物体内的试验、所谓的in vivo试验具有相同的水平。这样的用途中利用人为分化的多能干细胞时，上述现有技术是不充分的。因此，要求使多能干细胞分化直至更成熟的细胞。此处，成熟化的细胞是指表现出与生物体内的细胞所具有的功能相匹敌水平的功能的细胞。
在以往的医疗领域中进行了脏器移植、人工脏器移植。在这些移植中存在供体不足、排斥反应这样的问题。例如，针对严重的脏器功能障碍，在临床现场进行了基于脏器移植的治疗、利用人工脏器来置换脏器的治疗。然而，脏器移植、人工脏器移植中遗留了尚未解决的根本性问题。存在脏器移植存在排斥反应的问题、供体数量绝对不足的课题。另外，人工脏器仅能够对脏器的一部分功能进行有限期间的替代(例如，专利文献1、2)。
对此，在再生医疗领域中进行人组织的人为创立。已知的是：为了所述创立而将结束分化的细胞接种至载体即支架材料的方法。进而近些年，公开了组织和脏器的制作方法(专利文献3)和诱导未分化细胞来制作胰岛细胞的方法(专利文献4)。
专利文献3中公开了：通过对间充质细胞、脏器细胞和血管内皮细胞进行共培养来制造被称为器官芽的细胞团的方法。所述器官芽为脏器的起源，另外可以移植到生物体内。通过该方法制造的器官芽是非常有希望的移植材料。另一方面，在移植器官芽时也存在器官芽中的细胞分化为除了移植目标以外的脏器的细胞的风险(非专利文献2)。此处，除了移植目标以外的脏器的细胞是指，器官芽应成为该脏器的起源的脏器以外的细胞。作为所述细胞例如可列举出纤维状细胞或骨细胞。因此，要求将器官芽中的细胞分化为除了移植目标以外的脏器的细胞的风险控制在最小限度。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开平9-56814号公报
专利文献2：日本特开2004-166717号公报
专利文献3：国际公开第2013/047639号
专利文献4：国际公开第2007/058105号
非专利文献
非专利文献1：Maya Schuldiner等著、"Effects of eight growth factors onthe differentiation of cells derived from human embryonic stem cells"、PNAS,97vol21、2000年10月10日(Published online)、pp.11307-11312
非专利文献2：Xue K.等著、"A Two-Step Method of Constructing MatureCartilage Using Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells"、Cells TissuesOrgans 2013；197，2013年6月，pp.484-495
发明内容
发明要解决的问题
为了将与专利文献3相关的技术用于再生医疗或医药品的评价中，要求提高器官芽每一单位的功能。进而要求开发在再生医疗的现场安全性高的人工组织。要求所述人工组织本身不会分化为除了移植目标以外的脏器的组织。
除此以外，也要求缩减大量培养器官芽所需的成本。此处为了试图缩减成本的培养方法的开发成为课题。所述培养方法中需要通过提高器官芽的1单位的功能，从而减少作为移植所需的各种材料的细胞的数量。另外，需要通过提高器官芽的1单位的功能，从而减少器官芽的数量。另外，需要减少直至分化为所期望的器官芽为止所需的时间、培养基。
进而，包含在上述间充质细胞中的间充质干细胞分化为各种各样的组织。因此，将器官芽移植到骨、纤维组织时，有可能在该部位进行上述间充质干细胞的分化(非专利文献2)。作为上述培养方法的课题，可列举出使这种预料不到的分化的风险减轻。
如上所述，期待有效地得到具有更接近生物组织的功能的细胞团的方法。期待所述细胞团的安全性更高，尤其期待不会分化为除了移植目标以外的脏器的组织。
用于解决问题的方案
发明人等发明了得到细胞团的方法。所述细胞团是过去从未有过的细胞团。所述细胞团不仅具有更接近生物体的功能，而且具有高的安全性。所述方法中为了得到细胞团而对细胞进行培养时，将间充质细胞的比例减少到比以往的比例还少。这是由于间充质细胞形成除了移植目标以外的脏器的组织的可能性高所致。发明人等发现了所述方法中的间充质细胞的最适合的密度。
本发明的一个实施方式的培养方法是在规定的区域内对包含两种以上细胞的群体进行培养的培养方法，所述两种以上细胞含有源自干细胞的细胞和间充质细胞。源自干细胞的细胞是指选自由均未分化的内胚层细胞、外胚层细胞和中胚层细胞组成的组中的一种以上细胞。
前述群体优选与血管细胞、由血管细胞自发地分泌的因子、以及由于血管细胞和间充质细胞这两者存在而由血管细胞分泌的因子中的至少任一者一同在前述区域内进行培养。
前述区域包括细胞可移动的空间。将前述空间的体积设为Vmm3。将接种在前述空间的前述间充质细胞的细胞数设为N。此时，前述V为400以下。进而N/V为35以上且3000以下。本培养方法适用于由前述群体得到细胞团。
发明人等将培养中的细胞(进行培养的细胞)的可移动的空间的体积限制在规定的范围内。另外，将该可移动的空间中所含的间充质细胞的细胞数限制在规定的范围内。由此，发现了由上述细胞能够得到与以往的细胞团相比具有更接近生物体的功能的细胞团。进而，发现了所述细胞团不会分化为除了移植目标以外的脏器的组织。
综上所述，能够实现可得到安全性高的细胞团的培养方法。此外，所述培养方法不使用复杂的方法。因此，能够缩减细胞的制作成本。
前述间充质细胞的数量相对于供于培养的细胞总数的比率优选为0.5％以上且低于5％。前述群体优选包含细胞数X的前述源自干细胞的细胞和细胞数Y的前述间充质细胞。前述X：Y优选处于20：1至100：1的范围内。在此，源自干细胞的细胞的细胞数(X)是包括源自干细胞的内胚层细胞、外胚层细胞和中胚层细胞中的任一者或它们的组合的细胞的总细胞数。
前述区域优选在微容器中形成。前述N/V优选为100以上且300以下。前述X：Y优选处于20：1至50：1的范围内。前述V优选为1以下。将前述微容器的当量直径设为E、前述微容器的深度设为D时，E：D优选在1：0.5至1：2的范围内。
由于为了得到接近目标组织的细胞团而间充质细胞是必须的，因而间充质细胞越少越好。然而，N/V比为100以下时，直至分化诱导需要时间、或细胞团1个单位的功能降低。另一方面，N/V比为300以上时，具有分化为目标组织的能力的源自干细胞的细胞的比例降低，细胞团1个单位的功能降低。因此，N/V比优选为100以上且300以下。
另外，相对于供于培养的细胞总数，间充质细胞的比率低于0.5％时，直至分化诱导需要时间、或细胞团1个单位的功能降低。另一方面，相对于供于培养的细胞总数，间充质细胞的比率为5％以上时，具有分化为目标组织的能力的源自干细胞的细胞的比率降低，细胞团1个单位的功能降低。因此，比率X：Y优选为50：1至20：1的范围。
进而，可移动的空间大且超过1mm3时，细胞的移动距离变长，直至形成细胞团为止需要时间。因此，可移动的空间优选为1mm3以下。
此外，为了得到具有目标组织功能的细胞团，需要有效地向细胞团供给培养中的营养成分、对分化诱导有效的因子。因此，微容器的深度越浅越好，但若过浅则细胞团移动至相邻的微空间而细胞团彼此结合。因此，当量直径和深度优选当量直径：深度为1：0.5以上的比率。进而，为了向细胞团供给培养基中的营养成分、促进分化的物质，而优选当量直径：深度为1：2以下。
利用前述三维培养而得到的细胞团优选为器官芽。利用前述三维培养而得到的细胞团优选为球状体形状，前述球状体形状的细胞团的直径优选为20μm至2mm。前述源自干细胞的细胞优选源自胎儿干细胞或诱导多能干细胞。前述源自干细胞的细胞优选源自诱导多能干细胞。前述源自干细胞的细胞优选为内胚层细胞。
前述区域优选在微容器中形成。前述微容器的当量直径优选为20μm以上且2.5mm以下。前述微容器的深度优选为20μm以上且1000μm以下。
前述微容器优选具备底部和喇叭部。前述喇叭部优选具有壁。前述壁优选具有1度以上且20度以下的锥角。前述底部优选具有半球形状或圆锥台形状的空间。
前述微容器优选具有与细胞接触的培养面。前述培养面优选用聚合物进行涂布，所述聚合物包含选自磷脂、磷脂/高分子复合物、聚(甲基丙烯酸-2-羟基乙酯)(PHEMA)、聚乙烯醇、琼脂糖、壳聚糖、聚乙二醇和白蛋白的组中的一个或它们的组合。
本发明的一个实施方式的细胞团是在规定的区域内对包含两种以上细胞的群体进行培养而得到的细胞团，所述两种以上细胞含有源自干细胞的细胞和间充质细胞。源自干细胞的细胞是使干细胞在体外(in-vitro)分化而得到的细胞，是选自由内胚层细胞、外胚层细胞和中胚层细胞组成的组中的一种以上细胞。
前述群体与血管细胞、由血管细胞分泌的因子、以及由于血管细胞和间充质细胞这两者存在而由间充质细胞分泌的因子中的至少一个一同进行培养。
前述区域包括细胞可移动的空间。将前述空间的体积设为Vmm3。将接种在前述空间的前述间充质细胞的细胞数设为N。此时，前述V为400以下。进而N/V为35以上且3000以下。
前述群体优选包含细胞数X的前述源自干细胞的细胞和细胞数Y的前述间充质细胞。前述X：Y优选处于20：1至100：1的范围内。
发明的效果
根据一个实施方式，能够提供有效地培养具有更接近生物组织功能的细胞团的方法。所述细胞团的特征在于：安全性更高，尤其是不会分化为除了移植目标以外的脏器的组织。
附图说明
图1是示出一个实施方式的培养容器的一个例子的图。
图2是示出从侧面观察一个实施方式的凹陷的形状例的截面图。
图3是示出从上面观察一个实施方式的凹陷的形状例的图。
图4是示出培养容器的其它形状例的图。
图5是图4所示的培养容器的V-V线截面图。
图6是示出培养容器的另一个形状例的图。
图7是示出使用图4、图5所示的培养容器培养细胞的状态的一个例子的图。
图8是示出培养容器的其它例子的图。
图9是示出培养容器的另一个例子的图。
图10是示出悬滴法的一个例子的图。
图11是示出在实施例中使用的培养容器的图。
图12是对实施例1的试验结果进行拍摄的照片。
图13是示出实施例2的细胞团形成数量的测定结果的图。
图14是示出实施例2的AFP表达量的测定结果的图。
图15是示出实施例2的HNF4a表达量的测定结果的图。
图16是示出实施例2的ALB表达量的测定结果的图。
图17是示出实施例2的TTR表达量的测定结果的图。
图18是示出实施例2的ASGR1表达量的图。
具体实施方式
以下，一边参照附图一边对实施方式进行说明。为了明确地说明，对以下的记载和附图进行了适当省略和简化。各附图中对具有相同构成或功能的构成要素和相当部分标注相同的符号并省略其说明。
一个实施方式的培养方法涉及在规定的微小空间(以下适当记为“培养空间”)制作细胞团的方法。所述培养方法是对具有包含源自干细胞的细胞和间充质细胞的至少2种细胞的群体进行培养而形成细胞团的培养方法。源自干细胞的细胞是选自源自干细胞的、内胚层细胞、外胚层细胞或中胚层细胞中的至少1种细胞。上述细胞与选自血管细胞、由血管细胞分泌的因子、或由于血管细胞和间充质细胞这两者存在而分泌的因子中的至少1种细胞和/或因子一同进行培养。
此外，所述培养方法中，细胞可移动的空间(培养空间)的体积为400mm3以下。进而，将细胞可移动的空间的体积设为Vmm3、将进入细胞可移动的空间中的间充质细胞的细胞数设为N时，N/V比为35以上且3000以下。
换言之，上述培养方法是对多个细胞进行共培养来得到细胞团的方法。另外，满足以下的条件：
细胞悬浮液中所含的多个细胞包含以下(A)至(C)，
培养空间是400mm3以下的大小，和
将培养空间的体积设为Vmm3、将存在于细胞可移动的空间中的间充质细胞的细胞数设为N时，N/V比为35以上且3000以下；
(A)是选自由内胚层细胞、外胚层细胞和中胚层细胞组成的组中的至少1种细胞，源自干细胞的细胞、即干细胞来源细胞(以下适当记为“源自干细胞的三胚层细胞”)，
(B)间充质细胞，和
(C)选自由血管细胞、由血管细胞分泌的因子和由于血管细胞和间充质细胞这两者存在而分泌的因子组成的组中的至少1种细胞和/或因子(以下适当记为“血管细胞或分泌因子”)。
需要说明的是，在以下的说明中“源自干细胞的细胞”与“源自干细胞的三胚层细胞”没有特别区分，表示相同的含义。
培养空间是在该空间内培养的细胞可以自由地移动的空间。换言之，培养空间是指在该区域内细胞可以三维移动的区域。另外，由于培养空间的体积为400mm3以下，所以培养中的细胞以该体积在固定的(所限制的)空间内移动。
各细胞因移动而相互聚集。聚集了的细胞进而也进行增殖和分化。增殖或分化了的细胞形成细胞团。聚集表示细胞彼此结合的状态。所述状态的细胞处于开始进行分化或增殖之前的阶段。但是，增殖能力、分化能力高的细胞也存在同时发生增殖或分化与聚集的情况。在细胞聚集的状态下，仅通过施加如缓慢地搅拌培养基等物理上弱的剪切应力就使细胞彼此分散。参照图7等对培养空间的大小的规定进行说明。
此外，培养空间的大小优选考虑目标细胞团的大小来确定。其以下述的发现为依据。
根据发明人等的发现，为了制作具有更接近生物体的功能的细胞团、且不会分化为除了移植目标以外的脏器的组织的细胞团，重要的是如下：
存在于培养空间的培养基中的间充质细胞的比例、和
对间充质细胞可移动距离的区域进行限制。
*细胞团的说明
一个实施方式的细胞团是对源自干细胞的三胚层细胞、间充质细胞和血管细胞或分泌因子进行共培养而得到的细胞群。此处所谓的“源自干细胞的三胚层细胞”和“血管细胞或分泌因子”包含在上述的细胞悬浮液中。另外“源自干细胞的三胚层细胞”和“血管细胞或分泌因子”分别如上述(A)和(C)所述。
此外，细胞团以具有目标组织的多个功能为前提。然而，不限定细胞团是否分化为生物组织的水平。而且不限定细胞团是否由成熟的细胞构成。
另一方面，对于细胞团中的多个功能的表达，如下所示。细胞团所具有的多个功能优选为接近采自胎儿的细胞或采自胎儿的生物组织所具有的功能。这些功能能够作为例如基因表达模式进行确定。
细胞团所具有的多个功能还优选为接近采自成人的细胞或采自成人的生物组织所具有的功能。细胞团所具有的多个功能优选为与干细胞或源自干细胞的三胚层细胞所具有的多个功能相比更接近上述的多个功能。
对至少两种(优选为三种)细胞进行共培养。由此而使细胞聚集。进而，对聚集的细胞进行分化或增殖。或使它们同时进行而形成细胞团。
此外，本说明书中，细胞团是否为球状体形状没有要求。本说明书中，细胞团只要是由多个细胞形成团块而成的物质即可。
“球状体”是指多个细胞聚集而形成球状的细胞团的物质。球状体是细胞在三维状态下进行相互聚集。
本说明书中使用以下的术语。
“生物组织(biological tissue)”是指几种已确定的细胞以一定的模式聚集而成的结构单元。生物组织作为整体具有统一的作用。例如，生物体内的各器官(脏器)以几种生物组织已确定的模式聚集而构成。本说明书中，将由分化了的细胞构成、且具有任意功能的细胞的集合(细胞群)称为组织。
以下针对“源自干细胞的内胚层、外胚层或中胚层细胞”(以下称为“源自干细胞的三胚层细胞“)进行说明。
干细胞是指包含选自胎儿干细胞、胚胎干细胞(ES细胞)和诱导多能干细胞(iPS细胞)的细胞。干细胞具有无限增殖性。本说明书中还有干细胞是指能够分化为内胚层、中胚层、外胚层所有器官的细胞的情况。
内胚层细胞是指能够分化为肝脏、胰脏、肠道、肺、甲状腺、甲状旁腺、尿路等内胚层性器官的细胞。
外胚层细胞是指能够分化为脑、脊髓、肾上腺髓质、表皮、毛发/指甲/皮腺、感觉器官、周围神经、晶状体等外胚层系器官的细胞。
中胚层细胞是指能够分化为肾脏、尿管、心脏、血液、性腺、肾上腺皮质、肌肉、骨胳、真皮、结缔组织、中皮等中胚层系器官的细胞。
即，源自干细胞的三胚层细胞是指选自ES细胞和iPS细胞的细胞来源的细胞，是指具有内胚层性器官、外胚层性器官或中胚层性器官的性质的细胞。
某细胞是否为能够分化为内胚层性器官、外胚层性器官或中胚层性器官的细胞，可以通过对作为标记物的蛋白的表达进行调查来确定。例如若细胞中表达了一个或多个规定的标记物蛋白，则可以判断该细胞能够分化为内胚层性器官。
例如，能够分化为肝脏的细胞可以将HHEX、SOX2、HNF4A、AFP、ALB等作为标记物进行判断。另外对于能够分化为胰脏的细胞，PDX1、SOX17、SOX9等为标记物。对于能够分化为肠道的细胞，CDX2、SOX9等为标记物。对于能够分化为肾脏的细胞，SIX2、SALL1等为标记物。能够分化为心脏的细胞中，NKX2-5MYH6、ACTN2、MYL7、HPPA等为标记物。能够分化为血细胞的细胞中，C-KIT、SCA1、TER119、HOXB4等为标记物。能够分化为脑、脊髓的细胞中，HNK1、AP2、NESTIN等为标记物。
“间充质细胞”是指主要存在于源自中胚层的结缔组织中的细胞。是在生物组织内用于形成支撑发挥功能的细胞的结构的细胞。所述细胞为结缔组织细胞。
未分化的间充质细胞中包括虽然确定了分化为间充质细胞的命运但还尚未分化为间充质细胞的细胞。本发明中使用的间充质细胞既可为分化了的细胞，也可为未分化的细胞。未分化间充质细胞也称为间充质干细胞。
某细胞是否为未分化间充质干细胞可以通过对细胞是否表达标记物蛋白进行调查来确定。标记物蛋白例如为Stro-1、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD133、CD271、巢蛋白(Nestin)。
只要细胞中表达了这些标记物蛋白的任一者或者多个就可以判断为未分化间充质细胞。另外，未表达前述任意标记物的间充质细胞可以判断为已经分化的间充质细胞。
在本领域技术人员所使用的术语中，间充质干细胞(mesenchymal stem cells))、间充质祖细胞(mesenchymal progenitor cells)、间充质细胞(mesenchymal cells)(R.Peters,et al.PLoS One.30；5(12)：e15689.(2010))等包含在本发明的间充质细胞中。
本发明中，主要使用源自人的间充质细胞。本发明中，也可以使用源自除了人以外的动物例如小鼠、大鼠、犬、猪、猴等动物的未分化间充质细胞。
“血管细胞”是指能够构成血管内皮的细胞、或能够分化为这种细胞的细胞。此处所谓的“血管细胞”是包含在上述(C)中的血管细胞。血管细胞是除了由血管细胞等分泌的因子以外的物质。“血管细胞”这一术语仅表示血管细胞的意思。
某细胞是否为血管细胞可以通过对细胞是否表达标记物蛋白进行调查来确定。标记物蛋白例如为TIE2、VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、CD41。只要细胞中表达了这些标记物蛋白的任一者或者多个就可以判断为血管细胞。
本发明中使用的血管细胞既可为分化了的血管细胞，也可为未分化的血管细胞。血管细胞是否为分化了的细胞可以通过标记物蛋白CD31、CD144进行确定。
在本领域技术人员所使用的术语中，内皮细胞(endothelial cells)、脐静脉内皮细胞(umbilical vein endothelial cells)、内皮祖细胞(endothelial progenitorcells)、内皮前体细胞(endothelial precursor cells)、血管祖细胞(vasculogenicprogenitors)、成血管细胞(hemangioblast)(HJ.joo,et al.Blood.25；118(8)：2094-104.(2011))等包含在本发明的血管细胞中。
本发明中使用血管细胞时，主要使用源自人的血管细胞。本发明中，也可以使用源自除了人以外的动物例如小鼠、大鼠、犬、猪、猴等动物的血管细胞。
“器官芽”是指通过成熟而能够分化为器官的结构体。器官芽是含有三种细胞的结构体。三种细胞分别是源自干细胞的三胚层细胞、血管细胞和未分化间充质细胞或由其分化的细胞。
某结构体是否为器官芽，例如可以通过进行下述方法中的至少任一者来确定。方法之一是将该结构体移植到生物体内，对于是否能够分化为目标器官进行调查。此处只要结构体分化为目标器官就可以判断为器官芽。方法之一是对结构体是否含有所有上述三种细胞进行调查。只要结构体含有所有三种细胞就可以判断为器官芽。
器官芽也可为例如分化为肾脏、心脏、肺脏、脾脏、食道、胃、甲状腺、甲状旁腺、胸腺、性腺、脑、脊髓等器官的器官芽等。器官芽优选为分化为内胚层性器官的器官芽。所述器官芽的例子是分化为肝脏的器官芽(肝芽)、分化为胰脏的器官芽(胰芽)和分化为肠道的器官芽。
某结构体是否为分化为内胚层性器官的器官芽，可以通过对结构体中作为标记物的蛋白的表达进行调查来确定。只要结构体中表达了下述标记物蛋白的任一者或者多个，就可以判断结构体为分化为内胚层性器官的器官芽。
例如，对于肝芽，HHEX、SOX2、HNF4A、AFP、ALB等为标记物。对于胰芽，PDX1、SOX17、SOX9等为标记物。对于分化为肠道的器官芽，CDX2、SOX9等为标记物。
在本领域技术人员所使用的术语中，肝芽(liver bud)、肝憩室(liverdiverticula)、肝类器官(liver organoid)、胰腺(背部或腹部)芽(pancreatic(dorsal orventral)buds)、pancreatic diverticula(胰盲囊)、胰腺类器官(pancreatic organoid)、肠芽(intestinal bud)、肠憩室(intestinal diverticula)、肠道类器官(intestinalorganoid)(K.Matsumoto,et al.Science.19；294(5542)：559-63.(2001))等包含在本发明中的器官芽中。
胎儿是指由受精卵生成的子代。所述子代以某种形式与母亲的身体保持联系。所述子代得到由母体供给的营养等而生长。所述子代充分发育后从母体中诞生出来。“采自胎儿的细胞”是指所述从子代中采取的细胞。采自胎儿的细胞包括胎儿的肝脏的生物组织、市场销售的胎儿肝细胞。
“采自成人的细胞”是指从充分生长而能够生殖的生物体中采取的细胞。采自成人的细胞包括例如市场销售的人原代肝细胞、进行了活检的生物组织。
“采自成人的细胞或生物组织”由各公司销售有源自人、动物的细胞。肝细胞可以从Charles River Company、KAC公司购买。
上述细胞或生物组织也可以从动物中采集。例如在从大鼠、小鼠中采集肝细胞的方法中，有通过两步胶原酶灌注法来分离肝细胞的方法。例如大鼠中能够利用的方法如下。首先，由门静脉插入插管。接着，用加热至37度的磷酸盐缓冲液(前回流液)由门静脉进行除血。接着，用加热至37度的胶原酶溶液对组织的胶原蛋白进行分解。通过所述方法能够仅回收细胞。
“采自胎儿的细胞或生物组织”有市售品。所述细胞或组织可以从细胞库等得到。例如它们可以从株式VERITAS Company得到。
*多个功能的说明
多个功能是指可以具备细胞团的功能。对此换言之，是能够根据细胞团的成熟阶段而进行检测的功能。一个实施方式中，可以将能够根据基因表达量、蛋白量进行测定的功能作为上述多个功能使用。本说明书中，细胞团是否具备多个功能没有要求。因此，省略关于多个功能的说明。
“共培养”通常是指对2种或者2种以上不同种类的细胞进行混合后，将这些细胞一起培养。
另外，一个实施方式的共培养包括如下工序：由上述细胞形成细胞团的工序；进而培养细胞团并进行增殖和分化的工序；和进而培养细胞团并使细胞团成熟化的工序。
例如，使上述细胞形成细胞团的一个方式的器官芽后，进而通过进行器官芽的培养从而使器官芽成熟化。在此为了便于说明，将使细胞形成细胞团后使细胞团形成器官芽、然后使器官芽成熟化的情况作为一个例子进行说明。然而，如上所述，分化了的细胞不限定于器官芽。分化了的细胞含有使细胞团分化而形成的细胞、组织。
以下说明的共培养包括如下工序：(1)使细胞形成细胞团的工序，(2)使细胞团形成器官芽的工序，(3)进行器官芽的培养、使器官芽成熟化的工序。
以下针对各工序进行说明。
(1)使细胞形成细胞团的工序(细胞团形成工序)
对三种细胞，即源自干细胞的三胚层细胞、间充质细胞和血管细胞或分泌因子进行共培养。由此使这些细胞形成细胞团(几小时～1天)。
(2)使细胞团形成器官芽的工序(器官芽形成工序)
进而对上述细胞团进行培养。使细胞团的细胞增殖和分化。由此使细胞团形成器官芽。
(3)使其成熟化的工序(成熟化工序)
上述器官芽呈现出细胞的增殖速度降低或细胞不增殖的状态。在该状态下规定期间，细胞的增殖速度降低、或细胞维持不增殖的状态。所述期间，进而继续进行培养。
源自干细胞的三胚层细胞为源自何种细胞/组织的细胞均可。源自干细胞的三胚层细胞优选使用利用重编程(reprogramming)技术而制作的诱导多能干细胞、源自胚胎的胎儿干细胞而得到。
作为细胞团的形成方法已知各种各样的方法。例如有在液滴中形成细胞团的方法。所述方法已知为悬滴法。另外有使用在培养容器底面具有纳米级的支柱(Pillar)、网状结构的凹凸的容器的方法。另外有使细胞漂浮在培养基中的状态下搅拌滚瓶来形成细胞团的方法。另外有在琼脂糖、基质胶(matrigel)等凝胶上进行培养的方法。进而，有使用实施了细胞非粘接处理的培养容器进行静置来形成细胞团的方法。也可以使用这些中的任意方法形成细胞团。进而也可以组合这些方法来形成细胞团。各种文献中介绍了具体的方法。例如，记载于以下的文献中。
Francesco Pampaloni等著，"The third dimension bridges the gap betweencell culture and live tissue"，Nature reviews molecular cell biology volume 8，2007年10月，pp.839-845
Markus Rimann等著，"Synthetic 3D multicellular systems for drugdevelopment"Current Opinion in Biotechnology 2012 23，2012年，pp.1-7
形成细胞团的工序中使用包括内胚层细胞、外胚层细胞和中胚层细胞的组。内胚层细胞、外胚层细胞和中胚层细胞源自干细胞。所述内胚层细胞、外胚层细胞或中胚层细胞优选含有选自源自胎儿干细胞和诱导多能干细胞的细胞的细胞。
此外，上述包括内胚层细胞、外胚层细胞和中胚层细胞的组是源自诱导多能干细胞的细胞，优选含有能够分化为内胚层系列的细胞的细胞。其原因在于理论上的障碍低。另外通过使用源自诱导多能干细胞的细胞而能够确保基于确立标准株的均质性，因而优选使用源自诱导多能干细胞的细胞。
培养中的三种细胞的数量之比只要在能够形成器官芽的范围内就没有特别限定。适合的细胞数量之比为源自干细胞的三胚层细胞：血管细胞：间充质细胞＝10：10～5：0.1～1。
作为由血管细胞分泌的因子、由间充质细胞分泌的因子和由于血管细胞和间充质细胞这两者存在而分泌的因子，示例出如下物质。所述物质为FGF2、FGF5、BMF4、BMP6、CTGF等。上述因子不限定于这些。
这些物质的添加量如下。FGF2的添加量为每1x106个细胞添加10～100ng/ml是适合的。进而优选为20ng/ml左右。BMF4的添加量为每1x106个细胞添加10～100ng/ml是适合的。进而优选为20ng/ml左右。
培养时使用的培养基只要形成具有规定的多个功能的细胞团，则任何培养基均可。规定的多个功能是指与生物体的细胞或生物组织所具有的多个功能接近的多个功能。此处上述生物体的细胞是采自胎儿或生物体的细胞。另外上述生物组织是采自胎儿或生物体的生物组织。也可以通过基因表达模式来确认细胞团的多个功能接近生物组织等多个功能。
优选使用培养用的培养基。优选使用干细胞培养用的培养基。干细胞培养用的培养基优选为ES细胞、iPS细胞的培养用培养基。优选使用混合了前述2个培养基的物质等。
血管细胞培养用的培养基也可以使用任何培养基。优选使用含有hEGF(重组人上皮细胞生长因子)、VEGF(血管内皮细胞生长因子)、氢化可的松、bFGF、抗坏血酸、IGF1、FBS、抗生素(Antibiotics)(例如，庆大霉素、两性霉素B等)、肝素、L-谷氨酰胺、酚红、BBE中至少1种的培养基。
作为血管细胞培养用的培养基，可以使用EGM-2BulletKit(Lonza公司制造)、EGMBulletKit(Lonza公司制造)、VascuLife EnGS Comp Kit(LCT公司制造)、HumanEndothelial-SFM Basal Growth Medium(Invitrogen公司制造)、人微小血管内皮细胞增殖培养基(TOYOBO公司制造)等。
源自干细胞的三胚层细胞培养用的培养基也可以使用任何培养基。在作为目标的人工组织为肝脏组织时，优选使用肝细胞培养用的培养基。优选含有抗坏血酸(ascorbicacid)、BSA-FAF、胰岛素(insulin)、氢化可的松(hydrocortisone)、GA-1000中至少1种的培养基。作为肝细胞培养用的培养基优选为从市场销售的HCM BulletKit(Lonza公司制造)中去除了hEGF(重组人上皮细胞生长因子)的培养基。优选为在RPMI1640(Sigma-Aldrich公司制造)中添加了1％B27Supplements(GIBCO公司制造)和10ng/mL hHGF(Sigma-Aldrich公司制造)的培养基。
更优选使用在将GM BulletKit(Lonza公司制造)和从HCM BulletKit(Lonza公司制造)中去除了hEGF(重组人上皮细胞生长因子)的培养基以1：1进行混合的物质中添加了地塞米松(Dexamethasone)、制瘤素M(Oncostatin M.)、HGF的培养基。
培养时的温度没有特别限定，优选设为30～40℃、更优选设为37℃。
培养期间没有特别限定，优选设为3～50天、更优选设为15天。
也可以使用与细胞团形成工序和成熟化工序不同的培养容器。细胞团形成工序是形成作为核心的细胞团的工序。成熟化工序是使所述细胞团成熟化至形成具有规定的多个功能的细胞团的工序。规定的多个功能是指与采自胎儿的细胞或采自胎儿的生物组织所具有的多个功能接近的多个功能。或者规定的多个功能是指与采自成人的细胞或采自成人的生物组织所具有的多个功能接近的多个功能。
也可以在所有工序中使用培养容器。另外，在细胞团形成工序、成熟化工序中也可以使用悬滴法。在所述情况下，除了培养容器之外也可使用液滴培养细胞。
在细胞团形成工序和成熟化工序中，优选细胞彼此结合而聚集。另外在细胞团形成工序和成熟化工序中形成的细胞团优选细胞彼此结合而成为球状体形状的群体。
进而，细胞彼此形成的细胞团的直径优选为20μm～2mm、更优选为50μm～2mm。细胞团的大小更优选为50μm～200μm。在此情况下，能够将包含在培养基中的营养成分(维生素/氨基酸等)和氧气供给至细胞团的中心部。因此能够防止细胞团的中心部的细胞坏死(Efrem Curcio et al.,"Mass transfer and metabolic reactions in hepatocytespheroids cultured in rotating wall gas-permeable membrane system",Biomaterials 28(2007)5487-5497)。
*关于培养容器
培养容器使用例如具有如下构成的容器。
图1是示出一个实施方式的培养容器的一个例子的图。图1中示出具有多个培养容器1的培养板3的一部分。图1的上半部分表示从培养板3的上方观察在培养容器1的底部形成的多个凹陷10的一部分的图。培养容器1配置有多个凹陷10。从培养容器1的制造、细胞培养的效率的观点出发，优选规则地配置多个凹陷10。培养容器1例如相当于具有多个孔的孔板的一个孔。换言之，在孔板的各孔中配置有多个凹陷10。
孔板是由带有多个凹陷(洞或孔)的平板形成的实验/检查仪器。孔板中将各孔作为试管或者培养皿利用。孔的数量例如有6、24、96、384等。孔的数量也有更多的情况。
孔的底部既可以是平的，也可以是圆的。另外孔板中包括深孔板。深孔板是组合了多个细长的微型管的形式的孔板。
图2、图3是表示实施方式1的凹陷的形状例的图。图2表示从侧面观察一个凹陷10时的截面图，图3表示从上方观察一个凹陷10时的图。
各凹陷10由底部11和开口部12构成。开口部12是具有喇叭形状的喇叭部。开口部12的上端具有开口。底部11是成为培养容器1的底部的部分，开口部12是配置在底部11的上部的部分。将底部11与开口部12接触的部分记为边界。图2中，用符号R的箭头表示的长度部分对应于边界的位置。另外，图3中，边界的位置用双点划线表示。其中，底部11与开口部12由连续的面构成，作为整体而被制造。
在图2、图3中，关于在培养容器1中形成的多个凹陷10，示出当量直径R、深度(高度)H。
当量直径R是指与凹陷10的底部11内切的圆的直径。在此，是指在底部11与开口部12的边界内切的圆的直径。更具体而言，当量直径R是指边界中的与凹陷10的高度H的方向垂直的面的形状的内切圆的直径。
深度H是从底部11的内侧的底部至凹陷10的上端为止的长度。凹陷10的上端与开口部12的端部(上端)相同。深度H是凹陷10所形成的空间的深度。换言之，是从底部11所形成的空间的底部至开口部12所形成的空间的上端为止的深度。除了凹陷10的深度H以外，图2中示出了底部11的深度H1和开口部12的深度H2。
底部11形成培养细胞的空间(第一空间)。底部11具有例如半球状的形状。例如可以使用将当量直径R作为直径的球形等分的形状。底部11的形状不限定于半球状。
开口部12形成为了辅助细胞培养和回收的作业空间(第二空间)。开口部12由包围从与底部11的边界至凹陷10的端部(顶端)为止的锥角为1度以上且20度以下的壁构成。构成开口部12的壁的锥角优选为5度以上且15度以下，更优选为10度。其理由在于：若锥角过小则在进行回收时细胞无法从凹陷移至培养基中。另外其理由在于：相反若锥角过大则在更换培养基时细胞会脱离。
图2中用符号θ1、θ2表示锥角。在图2、图3所示的凹陷10的形状例中，锥角θ1、θ2表示大致相同的情况。
以当量直径R为50μm以上且1mm以下的方式形成底部11与开口部12的边界。希望将营养供给至细胞团的中心部时，当量直径优选为50μm以上且500μm以下、更优选为100μm以上且500μm以下。
此外，以从底部的底至端部为止的深度H为当量直径R的0.5倍以上且3倍以下的方式形成。深度H优选为当量直径R的0.7倍以上且1.2倍以下、更优选为0.8～1倍。
另外，培养容器优选相邻的两个凹陷10之间是平坦的。例如，两个凹陷10的距离优选为5μm至50μm的范围。其理由在于：为了防止细胞存在于壁的上面。所述构成具有避免阻碍细胞在壁的上面粘接而增殖、形成细胞团的效果。其中，在壁薄时，有可能因在细胞接种时、培养基更换时的振动而容易产生龟裂。因此壁的厚度优选为5μm以上。从这样的观点出发壁的厚度优选为5～20μm。
除了上述形状之外，优选按如下方式制造培养容器1。
培养容器1优选为树脂的成形品，所述树脂包含丙烯酸系树脂、聚乳酸、聚乙醇酸、苯乙烯系树脂、丙烯酸/苯乙烯系共聚树脂、聚碳酸酯系树脂、聚酯系树脂、聚乙烯醇系树脂、乙烯/乙烯醇系共聚树脂、热塑性弹性体、氯乙烯系树脂和有机硅树脂中的1个或它们的组合。
优选为以培养容器1具有的各凹陷10中的水接触角为45度以下的方式对各凹陷10进行处理。所述处理优选为通过表面改性处理方法而形成官能团的处理。表面改性处理方法优选包括等离子处理、玻璃涂布、电晕放电、UV臭氧处理中的任一种或它们的组合。
此外，优选将抑制细胞粘接的亲水性的聚合物链固定于各凹陷10。更优选为使亲水性的聚合物链固定化于以上述的水接触角成为45度以下的方式处理的各凹陷10。
进而，优选为使磷脂或磷脂/高分子复合物固定化于各凹陷10。该固定化的处理更优选针对将上述的水接触角处理为45度以下的各凹陷10来实施。另外固定化的处理更优选针对固定化有亲水性的聚合物链的各凹陷10来实施。另外固定化的处理更优选针对实施了上述处理和固定化组合的各凹陷10来实施。
相对于将水接触角处理为45度以下的表面，各凹陷10优选具有通过固定化聚合物而得到的细胞非粘接表面。为了使水接触角为45度以下而优选对各凹陷10形成官能团。官能团优选通过表面改性处理方法而形成。所述表面改性处理方法优选包括等离子处理、玻璃涂布、电晕放电、UV臭氧处理中的任一种或它们的组合。聚合物优选为抑制细胞粘接的亲水性的聚合物链、和磷脂或磷脂/高分子复合物中的任一种聚合物。该处理更优选与上述各处理、或组合各处理的处理一同来实施。
另外，上述的亲水性的聚合物链优选为聚甲基丙烯酸羟乙基酯。进而，聚甲基丙烯酸羟乙酯的平均分子量更优选为10万以上。
除了上述图1-3所示的容器以外，培养容器1也可以使用形成图4、图5所示的微单元(micro pattern)的培养容器。
图4中示出在一个实施方式中使用的培养容器的其它形状例。图5是图4所示的培养容器的V-V线截面图。
培养容器30具有培养空间31、壁32和底部33。
培养空间31是由壁32和底部33隔开的区域。培养空间31是对细胞进行培养的三维的空间区域(培养区域)。培养空间31也简称为“空间”或“微空间”。
壁32是隔开培养空间31的分隔壁，也可称为在培养容器30中形成凹凸模式的凸部。
底部33作为培养容器30的基板发挥作用。另外作为底部33的表面，配置有培养空间31的一侧的表面为培养区域(培养表面)的一部分。底部33例如是与在图1的培养板上形成的各孔的底部相同的区域。作为底部33使用这些各孔的底部。底部33形成培养空间31的底部。也将底部33的表面中形成培养空间31的面的一部分、且作为培养区域的底部的表面称为“底部培养面34”。
关于在培养容器30中形成的培养空间31，图4、图5中示出当量直径D、高度(深度)H、壁32的宽度(厚度)W和底部33的厚度T。图4、图5中示出底部33与壁32作为一体而制作的情况。
当量直径D与图2的当量直径R相同。当量直径D是指内切于培养空间31的内切圆的直径。更具体而言，当量直径D是指与培养空间31的底部33平行的面的形状(正面的形状)。对其换言之，当量直径D是指与培养空间31的高度H方向垂直的面的形状的内切圆的直径。在此正面观察培养空间31时的形状，有时会因高度H不同而不同。在此情况下，将培养肝细胞株的空间区域的宽度最大值作为当量直径。
高度H是从培养空间31的底(底部培养面34)起至壁32的上面为止的长度。也可以说高度H为培养空间31的深度。另外，底部培养面34为平面时，高度H与壁32的高度相同。
也可以说壁32的宽度W为壁32的厚度，并且是与相邻的培养空间31之间隔开的距离。
如图4所示那样，在培养容器30内(换言之，各孔内)阵列状地配置有多个培养空间31。包含在培养容器30中的培养空间31的数量或大小依赖于在培养板中制作的孔的数量(孔的大小)和培养空间31和壁32的大小。图4、图5中示出了9个培养空间31。这是用于说明而示例的数量，并不对应于实际的培养容器30(各孔)中包含的培养空间31的数量。
进而，培养容器也可以使用图6所示的凹陷20D。图6示出底部为线状换言之底部未形成空间的凹陷20D的形状例。图6的上半部分是从上方观察凹陷20D的主视图，下半部分示出截面图。凹陷20D由开口部12构成。
图7中示出使用图4、图5所示的培养容器来培养细胞的状态的一个例子。图7中示出相当于孔板的一个孔的一个培养容器30。另外图7中示出在培养容器30中形成的多个培养空间31中的3个培养空间31。图7中省略了其它多个培养空间31。以覆盖多个培养空间31的方式向培养容器30中注入培养基8。示出在各培养空间31中形成有细胞团9的状态。
本实施方式中，细胞可移动的空间是培养空间31的体积(Vmm3)。具体而言，图4、图5所示的培养空间31的体积是底部培养面34的面积与高度H的乘积。需要说明的是，前提是培养中的细胞不会越过培养空间31的壁32并移动。
本实施方式中，培养空间的体积Vmm3为400mm3以下。此外，将能够进入培养空间中的间充质细胞的细胞数设为N时，以N/V比成为35以上且3000以下的方式调整细胞数N。若限定培养空间的体积，则限制了细胞能够移动的范围。另外，若规定相对于培养空间的体积的间充质细胞的细胞数，则规定了培养空间中的间充质细胞的密度。发明人等发现：在满足这二个要素的条件时，即使缩减间充质细胞的细胞数，也能够由培养的细胞形成细胞团。此外，发明人等发现：所形成的细胞团具有更接近生物体的功能。进而发明人等发现：所述细胞团不会分化为除了移植目标以外的脏器的组织，是安全性高的细胞团。
发明人等发现：存在于细胞可移动的空间的间充质细胞的数量相对于供于培养的细胞总数的比率特别优选为0.5％以上且低于5％。在此，供于培养的细胞总数是源自干细胞的细胞、间充质细胞、血管细胞和其它细胞的总数，因子不作为细胞数进行计数。
除此之外还发现：在混合上述细胞进行共培养时，源自干细胞的内胚层细胞、外胚层细胞和中胚层细胞的总细胞数(X)与间充质细胞的细胞数(Y)的比率X：Y优选处于20：1至100：1的范围内。
发明人等发现：存在于细胞可移动的空间的间充质细胞的数量相对于供于培养的细胞总数的比率为0.5％以上时，适合形成细胞团。另外，在混合上述细胞进行共培养时，源自干细胞的细胞(源自干细胞的三胚层细胞)的细胞数(X)与间充质细胞的细胞数(Y)的比率X：Y处于20：1至100：1的范围内时，适合形成器官芽。
源自干细胞的细胞(源自干细胞的三胚层细胞)的细胞数(X)是指包括源自干细胞的内胚层细胞、外胚层细胞和中胚层细胞中的任一者或它们的组合的细胞的总数。换言之，细胞数(X)是指内胚层细胞、外胚层细胞和中胚层细胞中作为源自干细胞的细胞使用的细胞的总数。
需要说明的是，在图7的培养容器30中，多个培养空间31(多个可移动的空间)通过培养基8而连接。因此，在各培养空间31中，变得容易使培养基8等的条件相同。
在此，参照图2、图6、图8至图10对培养空间31(培养空间31的范围)进行说明。图7中示例了培养空间31与细胞可移动的空间一致的情况。然而，不限定于培养空间与细胞可移动的空间一致。
例如，在图8所示的培养容器40A中，形成培养空间41A的壁42A的高度H大于当量直径D(H＞D)。在此情况下，在培养空间41A中，将从底部培养面44A起至高度为当量直径D的大小为止的空间作为细胞可移动的空间来利用。换言之，将细胞可移动的空间的高度H限定在当量直径D以下。
另外，在图2所示的培养容器10中，至高度H1为止是细胞可移动的空间。图2中，从培养空间中排除开口部12，利用底部11作为培养空间。
另一方面，如图6的凹陷20D(培养容器)的开口部12所示，在倾斜相同时，将培养空间的高度设为培养空间的体积成为400mm3以下的高度。另外将处于低于所述高度的位置的空间作为细胞可移动的空间来利用。
此外，如图2所示，图9所示的培养容器40B不具有底部11与开口部12的边界。因此，由底部41B与开口部42B具有相同倾斜的壁面形成。在所述情况下，将培养空间的高度设为培养空间的体积成为400mm3以下的高度(例如，L)。另外将处于低于所述高度的位置的空间作为细胞可移动的空间来利用。
进而，细胞可移动的空间(培养空间)的周围不必限定于被培养容器所包围。例如，存在使用悬滴法的情况(例如，图10)。在此情况下，通过由培养液所形成液滴81而限定了培养空间。因此，细胞可移动的空间的体积与液滴81的体积相等。
用于形成细胞团的各细胞在上述培养容器1的各凹陷10内、培养容器30的培养空间内进行共培养。由凹陷(凹陷的底部)形成的空间与培养空间同样地是细胞可移动的空间。形成凹陷和培养空间的容器(例如，在培养容器30中包括底部培养面34和壁32的容器)也记为微容器。
优选如下构成微容器。
微容器的当量直径优选为20μm以上且2.5mm以下。微容器的深度优选为20μm以上且2.5mm以下。在希望将营养供给至细胞团的中心部时，上述当量直径优选为50μm以上且500μm以下、更优选为100μm以上且500μm以下。
细胞团优选使用具有细胞非粘接表面的微容器进行培养。
为了形成细胞团而优选不使细胞粘接于培养表面地促进细胞彼此的粘接。培养容器具有与细胞接触的培养面。因此，优选为在培养面涂布具有细胞非粘接性的聚合物。所述聚合物优选为包括选自磷脂、磷脂/高分子复合物、聚(甲基丙烯酸-2-羟基乙酯)(PHEMA)、聚乙烯醇、琼脂糖、壳聚糖、聚乙二醇和白蛋白的组中的一者或它们的组合的聚合物。
培养容器优选具有辅助细胞的培养和回收的功能、保持细胞团的功能、以及在更换培养基时防止细胞脱离的功能。因此，凹陷10优选由底部11和开口部12构成。
开口部12是处于从与底部11的边界起至开口部12的上端部为止的高度的壁，优选具有锥角1度以上且20度以下的壁。开口部12所具有的空间优选被所述壁包围。
为了使各细胞通过自身重量而聚集在底部11的一处，而更优选具有底部11的空间具有半球形状或圆锥台形状。通过所述方式能够促进细胞团的形成。
按以上那样操作而制作的细胞团能够用于药物筛选、再生医疗等。
为了使未分化细胞分化、得到具有接近生物体的功能的细胞，需要对未分化细胞进行培养并形成三维的细胞团。另外，为了使细胞聚集、分化为器官芽，就需要规定量的间充质细胞(例如，专利文献3)。另一方面，产生了间充质干细胞影响未分化细胞的分化的问题。例如，即使在纤维状细胞或骨细胞是除了移植目标以外的脏器的细胞的情况下，也会产生未分化细胞分化为这些细胞的问题(非专利文献2)。因此，在培养未分化细胞的技术中，将缩减间充质细胞视为课题。然而，为了制作细胞团而需要与规定量的间充质细胞一同来培养源自干细胞的三胚层细胞。
为了使未分化细胞分化而需要形成细胞团。因此，可认为缩减间充质细胞的数量是极其困难的。然而，发明人等发现了即使缩减间充质细胞的数量也能够制作细胞团的方法。换言之，发明人等发现了如上述说明那样来制作细胞团的方法。所述方法中限制细胞可移动的空间、且限定间充质细胞的密度。因此，即使与以往相比缩减间充质细胞的数量也能够制作细胞团。通过在与以往相比缩减了间充质细胞的数量的状态下制作细胞团，从而能够培养具有接近生物体的功能、且不会分化为除了移植目标以外的脏器的组织的细胞。此外，在一个实施方式的培养方法中不需要复杂的处理。由此，能够有效地得到安全性高的细胞团。其结果是能够缩减得到细胞团所需的时间和成本。
例如，基于专利文献3所述的形成器官芽的技术，开发了有关人工组织的技术。利用所述技术能够提供各种各样高功能的移植材料。所述技术中全面性捕捉作为目标脏器的功能。所述技术以利用人工组织来再现它们的功能为目的。上述的实施方式的方法可以期待应用在这些技术中。此外，为了实现同时发挥这样的多种细胞功能的移植材料，需要成熟至具有更接近生物体内的功能的程度的人工组织。另外，为了得到这样的人工组织而需要提高细胞的分化效率的方法。还需要风险小的人工组织。所述风险是指，例如无论纤维状细胞或骨细胞是否为除了移植目标以外的脏器的细胞，移植的人工组织的细胞都分化为这些细胞的风险。可以期待采用一个实施方式的培养方法作为解决这些课题的方法之一。
以下示出实施了本发明的培养方法的一个方式的试验结果的一个例子。
[实施例1和比较例1]
对实施例1和比较例1进行了比较。在比较例1中，细胞可移动的空间大于400mm3而与实施例1不同。
(1)源自干细胞的三胚层细胞的制作
在无血清培养基中添加激活素并对人iPS细胞(源自人皮肤的TkDA3hiPSC克隆(由Koji Eto氏和Hiromitsu Nakauchi氏转让))进行培养。由此，诱导了CXCR4和E-cadherin两阳性的内胚层系细胞。向得到的内胚层系细胞中添加BMP4、FGF2并培养了2天。由此，得到CXCR4阴性、HNF4α阳性的肝脏内胚层群体(肝脏内胚层细胞)。CXCR4和HNF4α的表达根据以下文献的记载，通过免疫染色和基因表达解析进行了确认。
Karim Si-Tayeb等著，“Highly Efficient Generation of Human Hepatocyte-Like Cells from Induced Pluripotent Stem Cells”，Hepatology，Vol51、No.1、2010年、pp.297-305
(2)细胞悬浮液的制备和培养
细胞悬浮液使用得到的肝脏内胚层细胞、血管内皮细胞(源自人脐带血的静脉内皮细胞)(Lonza、Basel、Switzerland)和未分化间充质细胞(人间充质干细胞、以下有时记为MSC(mesenchymal stem cell))(Lonza、Basel、Switzerland)进行制备。
对于细胞接种比例，使肝脏内胚层细胞：血管内皮细胞：未分化间充质细胞为20：14：2，以该比例混合各细胞，制作了细胞悬浮液(细胞溶液)。培养液使用内皮细胞培养基试剂盒-2：EGM-2BulletKit(产品编号CC-3162：Lonza)。培养进行20天，以2次/周的频率更换培养基。
(3)培养容器
实施例1中使用细胞可移动的空间的当量直径为500μm、深度为400μm的凹陷(空间、微空间)。使用了在1孔中具有600个该凹陷的24孔板的培养容器。图11中示出实施例中使用的培养容器(凹陷10)。凹陷10由包括当量直径500μm半球的底部11和开口部12构成。该培养容器的细胞可移动的空间的体积V为0.068mm3。为了抑制细胞粘接性而在细胞接触的培养表面涂布了p-HEMA。
比较例1中，在底面积为2cm2(200mm2)的24孔板中使培养基为自培养面起高度为3mm地进行了培养。此时的细胞可移动的空间的体积为600mm3。为了抑制细胞粘接性而在细胞接触的培养表面涂布了p-HEMA。
(4)细胞接种数
在24孔的1孔中以肝脏内胚层细胞为2.0×105个、血管内皮细胞为1.4×105个、未分化间充质细胞为2.0×104个的方式接种了细胞。实施例的N/V比是2.0×104÷600÷0.068＝490以及比较例的N/V比的值为2.0×104÷600＝33。
如上所述，N/V比是细胞可移动的空间的体积V(mm3)与间充质细胞的细胞数N之比。在此，未分化间充质细胞的数量为N的值。
(5)分析
在培养第20天时，使用倒置显微镜对各孔的细胞放大10倍观察了全部视野。
(6)结果
比较例1中几乎未形成细胞团。另一方面，实施例1中如图12所示那样形成了细胞团。另外在600个空间中的500个空间中形成了细胞团。
[实施例2和比较例2]
对实施例2和比较例2进行了比较。比较例2中，细胞可移动的空间为400mm3以下、N/V比低于31而与实施例2不同。
(1)源自干细胞的三胚层细胞的制作
在无血清培养基中添加激活素来培养人iPS细胞(源自人皮肤TkDA3hiPSC克隆(由Koji Eto氏和Hiromitsu Nakauchi氏转让))。由此，诱导了CXCR4和E-cadherin两阳性的内胚层系细胞。向得到的内胚层系细胞中添加BMP4、FGF2并培养了2天。由此，得到CXCR4阴性、HNF4α阳性的肝脏内胚层群体(肝脏内胚层细胞)。CXCR4和HNF4α的表达通过与实施例1相同的方法利用免疫染色和基因表达解析进行了确认。
(2)培养容器
实施例2和比较例2中使用细胞可移动的空间的当量直径为500μm、深度为400μm的凹陷(空间)。使用了具有600个该凹陷的24孔板的培养容器。培养容器的概观与实施例1中说明的图11相同。该培养容器的细胞可移动的空间的体积V为0.068mm3。为了抑制细胞粘接性而在细胞接触的培养表面涂布了p-HEMA。
(3)细胞悬浮液的制备和培养
细胞悬浮液使用得到的肝脏内胚层细胞、血管内皮细胞(源自人脐带血的静脉内皮细胞)(Lonza、Basel、Switzerland)和未分化间充质细胞(人间充质干细胞)(Lonza、Basel、Switzerland)来进行制备。
关于细胞接种比例，按照表1的数量制备各细胞悬浮液，将细胞悬浮液接种在培养液中。培养液使用内皮细胞培养基试剂盒-2：EGM-2BulletKit(产品编号CC-3162：Lonza)。培养进行20天，以2次/周的频率更换了培养基。
[表1]
(4)分析
在培养第20天使用倒置显微镜放大10倍观察了各孔的细胞。观察存在于1个孔整体中的所有600个斑点。通过目视对其中存在的形成了10个以上细胞聚集而成的细胞团的斑点的数量进行计数。
作为未分化标记物选择了AFP、作为肝分化标记物选择了HNF4a这2种基因。针对他们利用实时PCR法进行了分析。进而，为了更详细地分析功能，作为肝分化标记物选择了ALB(白蛋白)转甲状腺素蛋白(TTR)ASGR1(parenchymal hepatocytes)。针对他们也同样地利用实时PCR法进行了分析。
(5)结果
·细胞团形成效率
图13中示出表示细胞团形成数量的测定结果的图。横轴是MSC的比率，纵轴表示测定的细胞团形成数量。实施例中MSC的比率为1/80～1/10。另外，N/V比的值为61.3～490.2。实施例中600个斑点中的80％以上的斑点中形成细胞团。在MSC的比率变为1/160以下、且N/V比的值变为30.6以下时，细胞团的形成率低于80％。特别是N/V比的值低于30时，细胞团的形成率大幅降低。
·细胞功能评价(基因表达解析)
图14中示出表示AFP表达量的测定结果的图，图15中示出表示HNF4a表达量的测定结果的图。图14、图15的横轴与图13同样地表示MSC的比率。纵轴表示AFP或HNF4a的表达量(相对表达量：relative expression)。AFP是幼稚的细胞中特征性表达的基因。HNF4a是成熟细胞中特征性表达的基因。
实施例中MSC的比率为1/80～1/10。该条件下在80％以上的斑点中形成有细胞团。进而细胞团中表达了HNF4a。实施例中MSC的比率为1/80～1/20时，在80％以上的斑点中形成有细胞团、且HNF4a的表达量高、且AFP的表达量低(几乎为零)。在该范围内的MSC的比率表示更优选的条件。
进而，使MSC的比率在1/80与1/10之间变化，针对多个标记物验证了细胞团。针对与成熟肝组织所具有的3个功能相关的ALB(白蛋白)、ASGR1(肝实质细胞：parenchymalhepatocytes)、TTR(转甲状腺素蛋白)的基因表达量进行了分析。
图16是示出ALB表达量的测定结果的图。图17是示出TTR表达量的测定结果的图。图18是示出ASGR1表达量的测定结果的图。图16至18的横轴与图13同样地表示MSC的比率。纵轴表示ALB、TTR或ASGR1的表达量(相对表达量：relative expression)。
另外，表2中将在MSC的比率1/80～1/10的各条件下得到的数值中最小的值用“+”表示。表中记为(+)。相对于最小的值，1倍至低于2倍大小的值用“++”表示。相对于最小的值，2倍至4倍大小的值用“+++”表示。相对于最小的值，大于4倍的值用“++++”表示。
[表2]
MSC 1/10 MSC 1/20 MSC 1/40 MSC 1/80
HNF4a (+) +++ ++ ++
ALB ++++ ++++ ++++ (+)
TTR ++ ++ ++ (+)
ASGR1 (+) ++ ++ ++
如图16至18、表2所示，MSC的比率为1/20和1/40时，所有的分化标记物的基因表达量显示出显著的高值。
该申请主张了以2014年5月30日提出的日本申请特愿2014-112959为基础的优先权，将其公开的所有内容并入本说明书中。
附图标记说明
1、30、40A、40B 培养容器
3 培养板
8 培养基
9 细胞团
10、20D 凹陷
11、41B 底部
12、42B 开口部
31、41A 培养空间
32、42A 壁
33 底部
34、44A 底部培养面
81 液滴

Claims (14)

1.一种培养方法，其特征在于，其为在规定的区域内对包含两种以上细胞的群体进行三维培养的培养方法，所述两种以上细胞含有源自干细胞的细胞和间充质细胞，
所述源自干细胞的细胞为选自由均未分化的内胚层细胞、外胚层细胞和中胚层细胞组成的组中的一种以上细胞，
所述区域包括细胞可移动的空间，
将所述空间的体积设为Vmm3、将接种在所述空间的所述间充质细胞的细胞数设为N时，所述V为400以下，且N/V为35以上且3000以下。
2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，与血管细胞、自发地由血管细胞分泌的因子、以及由于血管细胞和间充质细胞这两者存在而由血管细胞分泌的因子中的至少任一者一同对所述群体进行所述三维培养。
3.根据权利要求1或2所述的培养方法，其特征在于，所述间充质细胞的数量相对于供于培养的细胞总数的比率为0.5％以上且低于5％。
4.根据权利要求1或2所述的培养方法，其特征在于，所述群体包含细胞数X的所述源自干细胞的细胞和细胞数Y的所述间充质细胞，所述X：Y在20：1至100：1的范围内。
5.根据权利要求4所述的培养方法，其特征在于，所述区域在微容器中形成，所述N/V为100以上且300以下，所述X：Y在20：1至50：1的范围内，所述V为1以下，将所述微容器的当量直径设为E、所述微容器的深度设为D时，E：D在1：0.5至1：2的范围内。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的培养方法，其特征在于，通过所述三维培养而得到的细胞团为器官芽。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的培养方法，其特征在于，通过所述三维培养而得到的细胞团为球状体形状，所述球状体形状的细胞团的直径为20μm至2mm。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的培养方法，其特征在于，所述源自干细胞的细胞源自胎儿干细胞或诱导多能干细胞。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的培养方法，其特征在于，所述源自干细胞的细胞源自诱导多能干细胞，所述源自干细胞的细胞为内胚层细胞。
10.根据权利要求1～9中任一项所述的培养方法，其特征在于，所述区域由微容器形成，所述微容器的当量直径为20μm以上且2.5mm以下，所述微容器的深度为20μm以上且1000μm以下。
11.根据权利要求10所述的培养方法，其特征在于，所述微容器具备底部和喇叭部，所述喇叭部具有壁，所述壁具有1度以上且20度以下的锥角，所述底部具有半球形状或圆锥台形状的空间。
12.根据权利要求10或11所述的培养方法，其特征在于，所述微容器具有与细胞接触的培养面，所述培养面用聚合物进行涂布，所述聚合物包含选自磷脂、磷脂/高分子复合物、聚(甲基丙烯酸-2-羟基乙酯)(PHEMA)、聚乙烯醇、琼脂糖、壳聚糖、聚乙二醇和白蛋白的组中的一个或它们的组合。
13.一种细胞团，其特征在于，其为在规定的区域内将血管细胞、由血管细胞分泌的因子、以及由于血管细胞和间充质细胞这两者存在而由间充质细胞分泌的因子中的至少任一者与群体一同进行三维培养而得到的细胞团，
所述群体包含两种以上细胞，所述两种以上细胞含有源自干细胞的细胞和间充质细胞，所述源自干细胞的细胞是在体外使干细胞分化而得到的、选自由内胚层细胞、外胚层细胞和中胚层细胞组成的组中的一种以上细胞，
所述区域包括细胞可移动的空间，将所述空间的体积设为Vmm3、将接种在所述空间的所述间充质细胞的细胞数为N时，所述V为400以下，且N/V为35以上且3000以下。
14.根据权利要求13所述的细胞团，其特征在于，所述群体包含细胞数X的所述源自干细胞的细胞和细胞数Y的所述间充质细胞，所述X：Y在20：1至100：1的范围内。
CN201580029061.3A 2014-05-30 2015-05-29 培养方法和细胞团 Active CN106459925B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2014112959 2014-05-30
JP2014-112959 2014-05-30
PCT/JP2015/002738 WO2015182159A1 (ja) 2014-05-30 2015-05-29 培養方法及び細胞塊

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106459925A true CN106459925A (zh) 2017-02-22
CN106459925B CN106459925B (zh) 2019-12-27

Family

ID=54698503

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201580029061.3A Active CN106459925B (zh) 2014-05-30 2015-05-29 培养方法和细胞团

Country Status (9)

Country Link
US (1) US10752879B2 (zh)
EP (1) EP3150704B1 (zh)
JP (2) JP6560199B2 (zh)
KR (1) KR102298147B1 (zh)
CN (1) CN106459925B (zh)
CA (1) CA2950559C (zh)
PL (1) PL3150704T3 (zh)
SG (1) SG11201609916RA (zh)
WO (1) WO2015182159A1 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111918958A (zh) * 2018-03-12 2020-11-10 国立大学法人九州大学 培养基材、培养基材的制造方法、干细胞的培养方法及培养装置
CN114423858A (zh) * 2020-06-25 2022-04-29 株式会社下一代生物 标准型类器官的生产方法

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL3150704T3 (pl) * 2014-05-30 2023-01-23 Corning Incorporated Sposób hodowli i masa komórkowa
USD851276S1 (en) * 2015-06-11 2019-06-11 Yamaha Hatsudoki Kabushiki Kaisha Placement and cluster sifting cell plate
KR102062465B1 (ko) 2017-09-25 2020-01-03 아주대학교산학협력단 나노섬유 기반 장기간 초대 간세포 3차원 배양시스템 및 배양방법
JP7228269B2 (ja) 2018-03-28 2023-02-24 公立大学法人横浜市立大学 細胞塊融合法
KR102237426B1 (ko) * 2018-12-26 2021-04-08 주식회사 넥스트앤바이오 표준형 오가노이드 제조방법
WO2020262554A1 (ja) * 2019-06-28 2020-12-30 京セラ株式会社 培養容器、培養容器を使用した再生毛包原基の製造方法
CN114556171A (zh) 2019-10-24 2022-05-27 住友电气工业株式会社 光纤和光缆
CN110904044B (zh) * 2019-12-17 2022-07-19 陕西师范大学 一种肿瘤干细胞的三维培养方法
EP4174173A4 (en) * 2020-06-25 2024-03-27 Next & Bio Inc. METHOD FOR MANUFACTURING BRAIN ORGANOIDS
EP4174172A4 (en) * 2020-06-25 2024-03-27 Next & Bio Inc. METHOD FOR PREPARING AN INDUCED PLURIPOTENT STEM CELL WITHOUT USING HYDROGEL
JP2023538207A (ja) * 2020-06-25 2023-09-07 ネクストアンドバイオ インコーポレイテッド ハイドロゲルを用いない幹細胞の大量増殖方法
JPWO2022114074A1 (zh) * 2020-11-26 2022-06-02
JP2024529939A (ja) * 2021-07-23 2024-08-14 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 候補薬剤の治療特性を評価するための方法及びモデルシステム、並びに関連するコンピュータ可読媒体及びシステム

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001509272A (ja) * 1997-01-17 2001-07-10 コーニング インコーポレイテッド マルチウェルプレート
WO2008130025A1 (ja) * 2007-04-18 2008-10-30 Public University Corporation Yokohama City University 肝細胞培養容器及び肝細胞培養方法
WO2013042360A1 (ja) * 2011-09-20 2013-03-28 株式会社クラレ 接着性細胞の培養方法
WO2013047639A1 (ja) * 2011-09-27 2013-04-04 公立大学法人横浜市立大学 組織及び臓器の作製方法

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3452161B2 (ja) 1995-08-24 2003-09-29 株式会社ジェイ・エム・エス 中空糸型人工肝臓
JP3553858B2 (ja) 1999-08-25 2004-08-11 東洋紡績株式会社 血管網類似構造体を有する細胞培養用モジュール
JP3725147B2 (ja) 1999-08-25 2005-12-07 東洋紡績株式会社 血管網類似構造体を有する細胞培養用モジュール
JP2005027598A (ja) 2003-07-09 2005-02-03 Kitakyushu Foundation For The Advancement Of Industry Science & Technology 細胞培養チップ及び培養器、それらを用いた細胞培養方法、球状細胞組織体を担持させた細胞担持モジュール、球状細胞組織体
WO2007058105A1 (ja) 2005-11-15 2007-05-24 Japan Science And Technology Agency Ｅｓ細胞からすい臓を生産する方法
US20110086375A1 (en) * 2007-03-02 2011-04-14 Mark Ungrin Devices and methods for production of cell aggregates
DK2173853T3 (da) * 2007-06-29 2011-07-04 Unisense Fertilitech As Indretning, system og fremgangsmåde til at overvåge og/eller dyrke mikroskopiske objekter
JP5578779B2 (ja) 2008-10-08 2014-08-27 国立大学法人東北大学 スフェロイド培養方法及びスフェロイド培養容器
US9127255B2 (en) 2010-06-11 2015-09-08 Takara Bio Europe Ab 3-dimensional scaffolds for improved differentiation of pluripotent stem cells to hepatocytes
SG188505A1 (en) 2010-09-14 2013-05-31 Asahi Glass Co Ltd Culture substrate
GB2507744A (en) * 2012-11-07 2014-05-14 Universitaetsklinikum Freiburg Matrix for generating and cultivating uniform cell aggregations
WO2014196204A1 (ja) 2013-06-07 2014-12-11 株式会社クラレ 培養容器及び培養方法
CN105283545B (zh) * 2013-06-10 2019-12-10 株式会社可乐丽 组织结构体及其制作方法
JP5811216B2 (ja) 2014-03-11 2015-11-11 セイコーエプソン株式会社 振動片、振動子、発振器
PL3150704T3 (pl) * 2014-05-30 2023-01-23 Corning Incorporated Sposób hodowli i masa komórkowa

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001509272A (ja) * 1997-01-17 2001-07-10 コーニング インコーポレイテッド マルチウェルプレート
WO2008130025A1 (ja) * 2007-04-18 2008-10-30 Public University Corporation Yokohama City University 肝細胞培養容器及び肝細胞培養方法
WO2013042360A1 (ja) * 2011-09-20 2013-03-28 株式会社クラレ 接着性細胞の培養方法
WO2013047639A1 (ja) * 2011-09-27 2013-04-04 公立大学法人横浜市立大学 組織及び臓器の作製方法

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111918958A (zh) * 2018-03-12 2020-11-10 国立大学法人九州大学 培养基材、培养基材的制造方法、干细胞的培养方法及培养装置
CN111918958B (zh) * 2018-03-12 2023-06-30 国立大学法人九州大学 培养基材、培养基材的制造方法、干细胞的培养方法及培养装置
CN114423858A (zh) * 2020-06-25 2022-04-29 株式会社下一代生物 标准型类器官的生产方法

Also Published As

Publication number Publication date
US20170183621A1 (en) 2017-06-29
US10752879B2 (en) 2020-08-25
KR20170010857A (ko) 2017-02-01
PL3150704T3 (pl) 2023-01-23
EP3150704A1 (en) 2017-04-05
CA2950559A1 (en) 2015-12-03
CA2950559C (en) 2023-09-19
EP3150704A4 (en) 2018-01-17
EP3150704B1 (en) 2022-10-12
SG11201609916RA (en) 2016-12-29
JPWO2015182159A1 (ja) 2017-04-20
WO2015182159A1 (ja) 2015-12-03
JP7125717B2 (ja) 2022-08-25
KR102298147B1 (ko) 2021-09-06
JP2019193666A (ja) 2019-11-07
JP6560199B2 (ja) 2019-08-14
CN106459925B (zh) 2019-12-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106459925A (zh) 培养方法和细胞团
Holloway et al. Biologically inspired approaches to enhance human organoid complexity
CN105283545B (zh) 组织结构体及其制作方法
KR102338698B1 (ko) 자기 조직화용 세포 집합체의 제작 방법
US20240336898A1 (en) Formation of three-dimensional organ from pluripotent stem cells, method for generating cell condensate for self-organization
Strobel et al. Vascularized tissue organoids
Sahara Recent advances in generation of in vitro cardiac organoids
Ajmal et al. Organ regeneration through stem cells and tissue engineering
JP7046160B2 (ja) ３次元細胞培養のための培養容器およびこれを利用した３次元細胞共培養方法
Ferro et al. Three-dimensional (3D) cell culture conditions, present and future improvements
Werschler et al. Engineering next generation vascularized organoid constructs
JP2024513007A (ja) 細胞集合体の培養のための微細流体の懸滴培養デバイス
KR102718235B1 (ko) 세포괴, 세포구조체 및 입체조직체
Monterossi The Microwell-mesh platform: A multifaceted microtissue technology to link cell culture, animal models and patients
Xu Stem Cell Instruction via Appropriate Geometry and Local Curvature of Microstructured Polymeric Substrates
CN118546874A (zh) 一种脂肪类器官血管化的制备方法
CN117120593A (zh) 用于培养细胞聚集体的微流控悬滴培养装置
CN116836911A (zh) 一种血管化类器官的构建方法与应用
Farouz Designing biomaterials for controlled cardiac stem cell differentiation and enhanced cell therapy in the treatment of congestive heart failure

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20211111

Address after: USA New York

Patentee after: Corning Co., Ltd

Patentee after: Yokohama City University

Address before: Okayama County, Japan

Patentee before: Kelaoli Co., Ltd

Patentee before: Yokohama City University

TR01 Transfer of patent right