CN111918958A - 培养基材、培养基材的制造方法、干细胞的培养方法及培养装置 - Google Patents

培养基材、培养基材的制造方法、干细胞的培养方法及培养装置 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种培养基材,其为培养干细胞的培养基材,所述培养基材具备:具有沿相互交叉的多个方向排列延伸的软质区域、以及由上述软质区域划分出的多个硬质区域的表面部分;在上述表面部分,上述硬质区域具有朝上述软质区域突出的锐角部,上述干细胞能够变形为可容纳在上述硬质区域的区域内的形状。

Description

培养基材、培养基材的制造方法、干细胞的培养方法及培养 装置
技术领域
本发明涉及培养基材、培养基材的制造方法、干细胞的培养方法及培养装置。
背景技术
干细胞的分化谱系的决定过程受各种因素影响。例如,已知:培养中的基材上的干细胞的扩散会影响分化谱系的决定(例如非专利文献1);因培养中干细胞所受到的外部刺激(细胞因培养基材表面的化学特性及力学特性等的差异而受到的刺激)而受到影响等。在培养皿上培养干细胞的情况下,干细胞会持续受到来自培养皿的恒定的抵抗力,因此有时会根据该刺激的强度来决定分化谱系。
近年来,正在研究用于以未分化的状态培养干细胞的基材及培养方法。例如,专利文献1中公开了一种诱导多能干细胞的培养方法,其特征在于,该培养方法使用在弹性可变凝胶的表面固定细胞粘附蛋白而成的细胞培养基材来培养诱导多能干细胞,弹性可变凝胶具有大于1kPa且小于100MPa的弹性模量。
此外,正在研究在设有条纹图案的培养基材上培养干细胞的方法,所述条纹图案具有硬质区域和软质区域。期待通过干细胞在基材上以纵贯硬质区域和软质区域的方式自行移动来改变干细胞从基材受到的刺激、妨碍分化谱系的决定(例如非专利文献2等)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本特开2015-163052号公报
非专利文献
非专利文献1:Rowena McBeath,et al.,“Cell Shape,Cytoskeletal Tension,and RhoA Regulate Stem Cell Lineage Commitment”,Development Cell,2004,6,p.483-495
非专利文献2:Satoru Kidoaki,Shuhei Jinnouchi,“FrustratedDifferentiation of Mesenchymal Stem Cell Cultured on Microelastically-Patterned Photocurable Gelatinous Gels”,Biophysical Journal,2012,102,p.716a
非专利文献3:Satoru Kidoaki,et al.,“Measurement of the InteractionForces between Proteins and Iniferter-Based Graft-Polymerized Surfaces withan Atomic Force Microscope in Aqueous Media”,Langmuir 2001,17,p.1080-1087
非专利文献4:Alimjan Idiris,Satoru Kidoaki,et al.,“Force Measurementfor Antigen-Antibody Interaction by Atomic Force Microscopy Using aPhotograft-Polymer Spacer”,Biomacromolecules,2005,6,p.2776-2784
发明内容
发明要解决的问题
然而,即使在如上所述的设有条纹图案的培养基材上培养干细胞的情况下,干细胞的运动中也会出现如干细胞在基材上在硬质区域或软质区域的一方的区域上移动等的、偏差。由于该运动的偏差,有时难以在充分维持干细胞的未分化状态的状态下进行培养。如果有以培养中的干细胞重复进行在不同的区域间的移动的方式使细胞在基材上各向同性地移动的培养基材,则认为其是有用的。
本发明的目的在于提供可以使干细胞在基材表面的运动方向为各向同性的培养基材、培养基材的制造方法及干细胞的培养方法。
用于解决问题的方案
本发明的一个方面提供一种培养基材,其为培养干细胞的培养基材,所述培养基材具备表面部分,该表面部分具有:沿相互交叉的多个方向排列延伸的软质区域、以及由上述软质区域划分出的多个硬质区域;在上述表面部分,上述硬质区域具有朝上述软质区域突出的锐角部,上述干细胞能够变形为可容纳在上述硬质区域的区域内的形状。
根据发明人等的研究判明,在使用在基材的表面上以条纹状形成有硬质区域和软质区域这2种区域的现有的培养基材的情况下,在培养的过程中,干细胞沿硬质区域移动的比例高。推测这与细胞具有优选在硬质区域上移动的细胞趋性(正的趋硬性(Durotaxis))有关。即,新发现了,在使用现有的培养基材的情况下,存在干细胞在软质区域上和硬质区域上往返的移动少、干细胞所受到的外部刺激趋于单一的倾向。
上述培养基材通过在表面具有软质区域和硬质区域、上述硬质区域由上述软质区域划分,能够在培养的过程中抑制干细胞仅选择硬质区域进行移动。此外,通过在培养基材的表面上硬质区域具有朝软质区域突出的锐角部,能够在该部分引出细胞从硬质区域向软质区域移动的负的Durotaxis。通过这些作用,可以抑制在培养基材的表面上的干细胞的移动的偏差(干细胞优选在硬质区域上移动这一情况)。通过使干细胞在硬质区域及软质区域上移动,能够使干细胞所感受到的机械刺激在培养期间以高频率变化。
本发明在一个方面,提供一种培养基材,其为培养干细胞的培养基材,所述培养基材具备表面部分,该表面部分具有:沿相互交叉的多个方向排列延伸的软质区域、以及由上述软质区域划分出的具有比上述软质区域高的压缩弹性模量的多个硬质区域;在上述表面部分,上述硬质区域具有朝上述软质区域突出的锐角部,上述干细胞能够变形为可容纳在上述硬质区域的区域内的形状。
上述培养基材由于具备具有压缩弹性模量不同的区域的表面,且压缩弹性模量高的硬质区域由软质区域划分,因此能够抑制所培养的细胞仅选择硬质区域进行移动。此外,通过在培养基材的表面上硬质区域具有朝软质区域突出的锐角部,能够在该部分引出细胞从硬质区域向软质区域移动的负的Durotaxis。通过这些作用,可以抑制在培养基材的表面上的干细胞的移动的偏差(干细胞优选在硬质区域上移动这一情况),通过使干细胞在硬质区域及软质区域上移动,能够使干细胞所感受到的机械刺激在培养期间以高频率变化。因此,通过使用上述培养基材培养干细胞,能够抑制培养历程在干细胞中积累,可以在充分维持未分化状态的状态下培养干细胞。
可以是上述锐角部呈倒角形状、其曲率半径为50μm以下。通过使锐角部的曲率半径在上述范围内,能够进一步促进干细胞从硬质区域向软质区域的移动,能够使干细胞在培养基材上的移动更为各向同性。
上述多个硬质区域中的至少一个可以为三角形状。通过使硬质区域中的至少一个为三角形状,能够使硬质区域所具有的锐角部(相当于三角形的顶点附近)的干细胞从硬质区域向软质区域的移动的频率与硬质区域的平坦部(相当于三角形的边附近)的干细胞从软质区域向硬质区域的移动频率同等。
上述硬质区域的各自的面积可以为5000~13000μm2。通过使硬质区域的面积在上述范围内,能够制备与各种干细胞的尺寸对应的培养基材。通过使硬质区域的面积在上述范围内,能够更进一步减小在硬质区域上的干细胞的运动比例与在软质区域上的干细胞的运动比例的偏差。
上述硬质区域的压缩弹性模量可以为上述软质区域的压缩弹性模量的10倍以上。通过使硬质区域的压缩弹性模量在上述范围内,使得干细胞容易认识到来自硬质区域的刺激与来自软质区域的刺激的差异,能够制成可以进一步妨碍分化谱系的决定(以下有时也称为分化偏向)的培养基材。
上述硬质区域的压缩弹性模量可以为30kPa以上。有时会由干细胞所受到的来自基材的刺激引起参与干细胞的分化谱系的决定的转录辅激活因子向细胞核内的移动。通过使硬质区域的压缩弹性模量为上述范围,能够在硬质区域上进一步促进各种转录辅激活因子向细胞核内的暂时性的移动。在软质区域上不会促进上述转录辅激活因子向细胞核内的移动,因此在上述硬质区域上与上述软质区域上,在干细胞内的反应,即由转录辅激活因子促进的细胞核内基因代谢反应在质和量上是不同的。通过使硬质区域的压缩弹性模量为上述范围,能够调节分别来自硬质区域及软质区域的对干细胞的刺激,能够明确地使伴随该刺激的细胞内的生物学反应为不同的性质。即,通过使硬质区域的压缩弹性模量为上述范围,可以更充分地阻止干细胞朝特定方向的分化偏向。
上述软质区域可以包含光聚合性化合物,此外,上述光聚合性化合物可以包含光固化性苯乙烯化明胶。
本发明在一个方面,提供一种培养基材,其为培养干细胞的培养基材,所述培养基材具备表面部分,该表面部分具有:沿相互交叉的多个方向排列延伸的软质区域、以及由上述软质区域划分出的具有比上述软质区域高的粘度系数的多个硬质区域;在上述表面部分,上述硬质区域具有朝上述软质区域突出的锐角部,上述干细胞能够变形为可容纳在上述硬质区域的区域内的形状。
上述培养基材由于具备具有粘度系数不同的区域的表面,且粘度系数高的硬质区域由软质区域划分,因此能够抑制所培养的细胞仅选择硬质区域进行移动。此外,通过在培养基材的表面上硬质区域具有朝软质区域突出的锐角部,能够在该部分引出细胞从硬质区域向软质区域移动的负的Durotaxis。通过这些作用,可以抑制在培养基材的表面上的干细胞的移动的偏差(干细胞优选在硬质区域上移动这一情况),通过使干细胞在硬质区域及软质区域上移动,能够使干细胞所感受到的机械刺激在培养期间以高频率变化。因此,通过使用上述培养基材培养干细胞,能够抑制培养历程在干细胞中积累,可以在充分维持未分化状态的状态下培养干细胞。
可以是上述锐角部呈倒角形状、其曲率半径为50μm以下。通过使锐角部的曲率半径在上述范围内,能够进一步促进干细胞从硬质区域向软质区域的移动,能够使干细胞在培养基材上的移动更为各向同性。
上述多个硬质区域中的至少一个可以为三角形状。通过使硬质区域中的至少一个为三角形状,能够使硬质区域所具有的锐角部(相当于三角形的顶点附近)的干细胞从硬质区域向软质区域的移动的频率、与硬质区域的平坦部(相当于三角形的边附近)的干细胞从软质区域向硬质区域的移动的频率同等。
上述硬质区域的各自的面积可以为5000~13000μm2。通过使硬质区域的面积在上述范围内,能够制备与各种干细胞的尺寸对应的培养基材。通过使硬质区域的面积在上述范围内,能够更进一步减小在硬质区域上的干细胞的运动比例与在软质区域上的干细胞的运动比例的偏差。
本发明在一个方面,提供一种培养基材的制造方法,该方法具有下述工序:在支撑体上形成包含光聚合性化合物和光聚合引发剂的组合物层的工序;以及对上述组合物层以图案状照射光、得到上述培养基材的工序。
上述培养基材的制造方法通过对组合物层以图案状照射光,从而在培养基材的表面形成压缩弹性模量不同的区域。此时,通过以压缩弹性模量高的硬质区域由软质区域划分的方式、并且以在培养基材的表面上硬质区域具有朝软质区域突出的锐角部的方式控制光照射区域,能够制造上述培养基材。所制造的培养基材具备上述培养基材的特征,通过其作用,可以在培养基材的表面上抑制干细胞的移动的偏差(干细胞优选在硬质区域上移动这一情况)。因此,上述培养基材的制造方法能够提供可以抑制培养历程在干细胞中积累、在充分维持未分化的状态的状态下培养干细胞的基材。
上述光聚合性化合物可以包含光固化性苯乙烯化明胶。
本发明在一个方面,提供一种干细胞的培养方法,该方法包括在上述培养基材上培养干细胞的工序。
上述干细胞的培养方法通过使用上述培养基材,即使不使用由动物血清等制备、供给的未知/未定义的分化抑制因子,也可以在充分维持未分化的状态的状态下培养干细胞。在为间充质干细胞的情况下,尚未确立有效抑制分化的分化抑制因子、以及参与维持未分化性及多能性的分化增殖因子。一直以来,在使用通常的细胞培养皿和标准的培养基的干细胞的培养中,在每次培养时选择并添加认为对干细胞的维持有效的因子。在上述干细胞的培养方法中,无需选择使用来源于动物血清等的成分,进而还可以避免来自基材的刺激逐渐积累于培养中的干细胞。因此,能够提高所得到的增殖的干细胞的质量及安全性等。通过本实施方式的干细胞的培养方法所培养的干细胞可以在维持未分化状态的同时使质量稳定,因此可以用作研究用及再生医疗用的干细胞。
本发明的一个方面提供一种培养装置,该培养装置具有干细胞和培养干细胞的培养基材,上述培养基材具备表面部分,该表面部分具有:沿相互交叉的多个方向排列延伸的软质区域、以及由上述软质区域划分出的多个硬质区域;在上述表面部分,上述硬质区域具有朝上述软质区域突出的锐角部,上述干细胞能够变形为可容纳在上述硬质区域的区域内的形状。
上述培养基材通过在表面具有软质区域和硬质区域、上述硬质区域由上述软质区域划分,能够在培养的过程中抑制干细胞仅选择硬质区域进行移动。此外,通过在培养基材的表面上硬质区域具有朝软质区域突出的锐角部,能够在该部分引出细胞从硬质区域向软质区域移动的负的Durotaxis。通过这些作用,可以抑制在培养基材的表面上的干细胞的移动的偏差(干细胞优选在硬质区域上移动这一情况)。通过使干细胞在硬质区域及软质区域上移动,能够使干细胞所感受到的机械刺激在培养期间以高频率变化。
上述硬质区域可以具有比上述软质区域高的压缩弹性模量。通过使硬质区域与软质区域的压缩弹性模量为如上所述的关系,可以使干细胞更容易认识到来自硬质区域的刺激与来自软质区域的刺激的差异。
上述硬质区域可以具有比上述软质区域高的粘度系数。通过使硬质区域与软质区域的粘度系数为如上所述的关系,可以使干细胞更容易认识到来自硬质区域的刺激与来自软质区域的刺激的差异。
发明的效果
根据本发明,能够提供可以使干细胞在基材表面的运动方向为各向同性的培养基材、培养基材的制造方法及干细胞的培养方法。
现有的基材在于表面具有软质区域和硬质区域的(也称为具有非均匀的软硬质分区)情况下,使所培养的干细胞的运动的方向产生了偏差。与此相对,根据本发明,能够提供具有非均匀的软硬质分区、可以使在该表面上培养的干细胞的运动为各向同性的培养基材、培养基材的制造方法及干细胞的培养方法。
附图说明
图1是示出培养基材的一个实施方式的一部分的示意图。
图2是实施例1中使用的光掩模的示意图。
图3是示出实施例1中的培养性能的评价状况的一部分的图。
图4是示出培养中的干细胞的运动趋势的图表。
图5是示出培养中干细胞停留在硬质区域及软质区域上的时间的图表。
图6是示出培养中干细胞停留在硬质区域及软质区域上的平均时间的图表。
图7是比较例1中使用的光掩模的示意图。
图8是示出培养中的干细胞的运动趋势的图表。
图9是示出培养中干细胞停留在硬质区域及软质区域上的时间的图表。
图10是示出培养中干细胞停留在硬质区域及软质区域上的平均时间的图表。
图11是示出培养基材上的干细胞内部的YAP的局部存在的荧光显微镜照片的图。
图12是示出对培养基材上的干细胞内部的YAP的局部存在进行评价的结果的图表。
图13是示出对培养基材上的干细胞实施分化诱导的结果的图。
图14是示出对培养后所回收的干细胞实施分化诱导的结果的图。
图15是示出对培养后所回收的干细胞实施分化诱导的结果的图表。
图16是示出在培养后所回收的干细胞中被激活的基因的位置的图。
图17是示出培养时间与培养基材上的干细胞的细胞密度的关系的图。
图18是示出培养时间与培养基材上的干细胞的细胞密度的关系的图表。
图19是示出培养中的干细胞的运动速度的分布的图表。
具体实施方式
以下,根据情况参照附图对本发明的实施方式进行说明。不过,以下的实施方式是用于说明本发明的例示,并非旨在将本发明限定于以下内容。上下左右等位置关系在没有特别声明的情况下,以附图所示的位置关系为准。各要素的尺寸比率并不限于附图所图示的比率。
<培养基材>
培养基材的一个实施方式为培养干细胞的培养基材,其具备表面部分,该表面部分具有:沿相互交叉的多个方向排列延伸的软质区域、以及由上述软质区域划分出的多个硬质区域。在上述表面部分,上述硬质区域具有朝上述软质区域突出的锐角部,上述干细胞能够变形为可容纳在上述硬质区域的区域内的形状。
图1是示出培养基材的一个实施方式的一部分的示意图。图1所示的培养基材100具备表面50,该表面50具有沿相互交叉的多个方向排列延伸的软质区域10、以及由软质区域10划分出的多个硬质区域20。在表面50,硬质区域20具有朝软质区域10突出的锐角部22。在图1中示出干细胞C可容纳在硬质区域20的区域内的状态。即,示出硬质区域20的面积为能够容纳干细胞C的面积的情况。
硬质区域20可以具有比软质区域10高的压缩弹性模量。通过使培养基材100的表面50具备压缩弹性模量不同的多个区域,可以使所培养的细胞在上述多个区域间移动时所受到的刺激发生变化。即,能够使在培养基材100上培养的细胞所感受到的机械刺激在培养期间以高频率变化。硬质区域20的压缩弹性模量可以为软质区域10的压缩弹性模量的10倍以上、12倍以上或15倍以上。硬质区域20的压缩弹性模量可以为软质区域10的压缩弹性模量的30倍以下或20倍以下。通过使硬质区域20的压缩弹性模量在上述范围内,可以使干细胞更容易认识到来自硬质区域20的刺激与来自软质区域10的刺激的差异。通过使干细胞所受到的刺激在培养期间以高频率变化,可以更充分地维持干细胞的未分化状态。
硬质区域20及软质区域10的压缩弹性模量例如可以如下确定。例如,设想人间充质干细胞(hMSC)的培养来进行说明。在为hMSC的情况下,利用因hMSC从基材受到的刺激而影响YAP向细胞核的移动这一情况,可以确定硬质区域20及软质区域10的各自的合适的压缩弹性模量。即,用于培养hMSC的培养基材中的硬质区域20及软质区域10的各自的合适的压缩弹性模量可以通过观测已知会参与hMSC的分化谱系的决定的转录激活辅助因子YAP的细胞内行为来确定。首先,准备压缩弹性模量不同的多个培养基材,在各个培养基材上进行hMSC的培养,确定在细胞内YAP局部存在的部位。通过进行这种观测来确定与YAP是向细胞核移动还是停留在细胞质内相关的、基材的压缩弹性模量的阈值。然后,可以以跨过所确定的阈值的方式确定硬质区域20的压缩弹性模量及软质区域10的压缩弹性模量。上述例子中,以YAP的细胞内行为作为依据来确定硬质区域20及软质区域10的压缩弹性模量,而根据作为对象的干细胞等,也可以着眼于其他因子。作为其他因子,可以采用已知向细胞核的移动会受到与基材的硬度对应的影响的蛋白质等,例如可列举出TAZ及RUNX2等。
硬质区域20的压缩弹性模量可以根据作为培养对象的干细胞的种类及分化的阶段等进行调节。硬质区域20的压缩弹性模量例如可以为30kPa以上、40kPa以上或50kPa以上,可以为100kPa以下。软质区域10的压缩弹性模量例如可以为小于30kPa、20kPa以下或10kPa以下,可以为5kPa以上。在本说明书中,压缩弹性模量是指使用原子力显微镜(AFM)测得的基材表面的压缩弹性模量,是在将AFM的悬臂按入基材表面、将基材压缩时测得的压缩弹性模量。
硬质区域20在培养基材100的表面50上由软质区域10划分成多个区域。硬质区域20具有朝软质区域10突出的锐角部22。硬质区域20的锐角部22可以呈倒角形状。呈倒角形状的锐角部22的曲率半径例如可以为50μm以下、45μm以下或40μm以下。硬质区域20的形状例如可以为三角形、平行四边形、菱形及星形等,被划分成多个的硬质区域20中的至少一个可以为三角形状。
硬质区域20的一边的长度例如可以为100μm以上、130μm以上或150μm以上,可以为300μm以下或250μm以下。在相邻的硬质区域20中,锐角部22彼此之间的距离(例如在三角形状的情况下,为相对的2个三角形状区域的顶点间的距离)例如可以为200μm以下、150μm以下或120μm以下,可以为80μm以上或100μm以上。
干细胞C的形状并非是恒定的,是可以变形的。在干细胞例如不容纳在硬质区域的区域内而为横跨多个硬质区域及软质区域的形状的情况下,会将来自基材的硬质区域及软质区域的干细胞所受到的刺激平均化,变得与受恒定的刺激的情况同样。因此,在干细胞不能变形为容纳在硬质区域的区域内的形状的情况下,难以使干细胞所受到的刺激在培养期间以高频率变化。上述培养基材100用于培养能够变形为可容纳在硬质区域20的区域内的大小的干细胞。换言之,上述培养基材100中的硬质区域20的面积可以根据作为进行培养的对象的干细胞C的尺寸进行调节,可以以干细胞C变形的过程中的至少一个形态容纳在硬质区域20的面积内的方式进行调节。干细胞C的形状(面积)例如为13000μm2以下的范围内,可以通过使用光学显微镜观察等的观察来确认。
硬质区域20的面积可以为5000~13000μm2,也可以为5000~10000μm2。通过使硬质区域20的面积在上述范围内,能够制备与各种干细胞的尺寸对应的培养基材。硬质区域20的面积可以通过使用光学显微镜观察等的观察来确认。
培养基材100的表面50例如可以包含含有高分子化合物的组合物或其加工物(例如固化物),也可以包含高分子化合物或其加工物。作为高分子化合物,例如可列举出天然来源的高分子、及合成高分子等。高分子化合物可以将多种高分子组合使用。作为高分子化合物或其加工物的形态,可列举出:高分子凝胶、高分子浓溶液溶胶、弹性体、纳米超细纤维及无纺布等。培养基材100的表面50可以将多种形态的高分子化合物等组合使用。此外,培养基材100可以由含有上述高分子化合物的组合物或其加工物(例如固化物)构成。
作为天然来源的高分子,例如可列举出:胶原蛋白、明胶、甲壳素、壳聚糖、藻酸及透明质酸等生物来源的生物高分子等。合成高分子可以是均聚物,也可以是共聚物。作为共聚物,例如可列举出:无规共聚物、交替共聚物、嵌段共聚物及接枝共聚物等。作为合成高分子,具体可列举出:聚丙烯酰胺、聚乙二醇二丙烯酸酯、聚二甲基硅氧烷、多嵌段聚氨酯、含氟多嵌段聚氨酯、聚二甲基硅氧烷、聚二甲基硅氧烷-聚碳酸酯嵌段共聚物、完全皂化聚乙烯醇性含水橡胶、异戊二烯橡胶、丁二烯橡胶、乙丙橡胶、丁苯橡胶、丁腈橡胶、及苯乙烯-丁二烯-苯乙烯嵌段共聚物等合成高分子等。作为高分子化合物,例如可以是在上述天然来源的高分子及合成高分子中进一步导入交联性官能团(例如光聚合性官能团)而得的改性体。通过使用具有交联性官能团的改性体,能够更容易地控制交联密度、调节压缩弹性模量。在合成高分子为接枝共聚物的情况下,通过调节接枝部的结构及分子量等,能够更容易地调节培养基材表面的粘度系数。上述高分子可以使用单独1种,也可以将2种以上组合使用。
作为培养基材的一个例子,可列举出一种培养基材,其特征在于,具备表面部分,该表面部分具有沿相互交叉的多个方向排列延伸的软质区域、以及由软质区域划分出的具有比软质区域高的压缩弹性模量的多个硬质区域,以在表面进行培养的细胞在硬质区域与软质区域间各向同性地移动的方式配置硬质区域和软质区域。
<培养基材的制造方法>
培养基材的制造方法的一个实施方式具有下述工序:在支撑体上形成包含光聚合性化合物和光聚合引发剂的组合物层的工序;以及对上述组合物层以图案状照射光、得到上述培养基材的工序。在本制造方法中,根据需要,可以具有将支撑体剥离的工序。
在上述制造方法中,在对上述组合物层以图案状照射光时,在培养基材的表面形成压缩弹性模量不同的区域。此时,通过以压缩弹性模量高的硬质区域由软质区域划分的方式、并且以在培养基材的表面上硬质区域具有朝软质区域突出的锐角部的方式控制光照射区域,能够制造上述培养基材100。
上述的制造方法首先在支撑体上形成组合物层。作为组合物层的形成方法,例如可列举出涂布包含光聚合性化合物及光聚合引发剂的组合物的方法等。可以通过将上述组合物溶解于溶剂(例如水等)来制备溶液(例如水溶液等)或分散液、将该溶液等涂布在支撑体上而形成组合物层,然后,可以通过根据需要进一步去除溶剂而形成组合物层。组合物层的厚度例如可以为10~50μm。
作为支撑体,例如可以使用玻璃基材及塑料基材等。上述支撑体例如可以是实施过脱模处理及涂布处理等表面处理的。涂布处理例如可列举出在支撑体上设置由温度响应性高分子形成的涂层的处理等。作为温度响应性高分子,例如可列举出聚(N-异丙基丙烯酰胺)(pNIPAAm)等。通过涂布温度响应性高分子,容易将支撑体从所形成的培养基材剥离。
上述组合物层由包含光聚合性化合物和光聚合引发剂的组合物形成。光聚合性化合物是具有光聚合性的官能团的化合物,例如可列举出:在胶原蛋白、明胶、甲壳素、壳聚糖、藻酸及透明质酸等生物来源的生物高分子中导入光聚合性官能团而得的化合物,丙烯酰胺及乙二醇二丙烯酸酯等丙烯酸类单体,乙烯、丙烯、丁二烯、异戊二烯、苯乙烯、乙酸乙烯酯等乙烯基类单体,以及二甲基硅氧烷等硅烷化合物等。上述丙烯酸类单体、乙烯基类单体及硅烷化合物只要具有光聚合性的官能团,则可以将其聚合物作为光聚合性化合物用使用。上述光聚合性化合物可以使用单独1种,也可以将2种以上组合使用。
作为在生物高分子中导入的光聚合性官能团,例如可列举出:乙烯基、烯丙基、苯乙烯基及(甲基)丙烯酰基等烯属不饱和基团等。在生物高分子中导入的光聚合性官能团可以是多个,也不限于1种,可以是多种官能团。关于光聚合性官能团的导入率,例如相对于生物高分子所具有的反应性官能团(例如在明胶的情况下为氨基等)总量,可以为80~100%。通过使光聚合性官能团的导入率在上述范围内,能够使培养基材的压缩弹性模量的控制更容易。
光聚合性化合物优选包含导入有光聚合性官能团的明胶(光固化性明胶)。光固化性明胶例如可列举出对明胶所具有的各种氨基酸残基的官能团导入光聚合性官能团而得的明胶等。作为这种光固化性明胶,例如可列举出导入有苯乙烯基的明胶(也称为光固化性苯乙烯化明胶)等。
上述光固化性明胶可以通过在作为缩合剂的碳二亚胺类的存在下使明胶与具有光聚合性官能团的化合物(例如4-乙烯基苯甲酸等)反应来制备。明胶与具有光聚合性官能团的化合物的反应可以使用缩合剂。作为缩合剂,例如可以使用碳二亚胺类。作为碳二亚胺类,例如可列举出:二环己基碳二亚胺(DCC)、二乙基碳二亚胺、二异丙基碳二亚胺(DIC)、乙基环己基碳二亚胺、二苯基碳二亚胺、1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)及1-环己基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐等。上述缩合剂可以使用单独1种,也可以将2种以上组合使用。
在光聚合性化合物为上述生物高分子或聚合物的情况下,光聚合性化合物的重均分子量例如可以为95000~105000。通过使光聚合性化合物的重均分子量在上述范围内,能够使培养基材的压缩弹性模量的控制更容易。需要说明的是,在本说明书中,重均分子量是利用凝胶渗透色谱测得的值,表示为聚苯乙烯换算值。
作为光聚合引发剂,例如可列举出:樟脑醌、苯乙酮、二苯甲酮、二甲氧基苯基苯乙酮等羰基化合物及它们的衍生物;二硫代氨基甲酸酯、黄原酸盐、苯硫酚等硫化合物及它们的衍生物;过氧化苯甲酰、丁基过氧化物等过氧化物及它们的衍生物;偶氮二异丁腈、偶氮二异丁酸酯等偶氮双化合物及它们的衍生物;溴丙烷、氯甲基萘等卤素化合物及它们的衍生物;苯叠氮化物等叠氮化物化合物及它们的衍生物;罗丹明、赤藓酮、荧光素、四溴荧光素等呫吨类色素及它们的衍生物;核黄素及它们的衍生物等。光聚合引发剂可以单独使用1种,或者可以将2种以上组合使用。从生物安全性优异的角度来看,这些光聚合引发剂优选包含樟脑醌,更优选包含磺酰基樟脑醌。以光聚合性化合物的总质量作为基准,光聚合引发剂例如可以为0.01~10质量%或0.1~3质量%。
上述光聚合性化合物及光聚合引发剂可以溶解于水溶液来使用。作为水溶液,可以使用干细胞可生存的水溶液,例如可列举出:林格氏液、乐氏液等生理盐类溶液,磷酸缓冲溶液、台氏液、汉克斯液、Earle氏液、HEPES等平衡盐类溶液等。在使用水溶液的情况下,以水溶液的总质量作为基准,光聚合性化合物的浓度可以为20~50质量%、或25~30质量%。
在上述水溶液中可以添加所培养的干细胞增殖所需的营养成分。作为营养成分,例如可列举出:钠(Na)、钾(K)、钙(Ca)、镁(Mg)、磷(P)及氯(Cl)等矿物质,氨基酸、维他命、糖、脂肪以及生长因子等。这些营养成分可以根据干细胞的种类等而适当选择及组合来使用。
接着,对上述组合物层以图案状照射光,得到上述培养基材。通过对上述组合物层照射光,例如受到光照射的部分的上述组合物层固化,形成压缩弹性模量高的硬质区域。未照射光的部分的上述组合物层不进行固化反应,形成压缩弹性模量低的软质区域。对组合物层的光照射可以经由负掩模图案或正掩模图案进行,由此可以以图案状对组合物层照射光。通过掩模图案的选择,能够调节基材表面的软质区域及硬质区域的形状。
在上述培养基材的制造方法中,根据高分子化合物的种类等,也可以将光照射分多次进行。例如,可以进行对上述组合物层的整面照射光的第一光照射工序、以及对在第一光照射工序中受到光照射的上述组合物层以图案状照射光来得到上述培养基材的第二光照射工序。对于上述组合物层,作为第一阶段,对整面以短时间照射均匀的光来构筑基底凝胶层后,作为第二阶段,以图案状照射光,得到上述培养基材。通过对上述组合物层实施该第二阶段的光照射,在受到第二阶段的光照射的部分处,与未受到第二阶段的光照射的部分(未照射部分)相比,上述组合物层进一步进行固化,形成压缩弹性模量高的硬质区域。未受到第二阶段的光照射的部分的上述组合物层不进行追加的固化反应,形成压缩弹性模量低的软质区域。
作为光照射中使用的光源,例如可列举出:卤素灯、氙灯、白热灯、汞灯、准分子激光及氩离子激光等。照射光的波长例如可以为300~800nm。光照射的曝光量例如可以为10~300mW/cm2或10~100mW/cm2。光照射的时间例如可以为0.5~10分钟左右。光的波长、曝光量及照射时间等条件可以根据光聚合性化合物及光聚合引发剂的种类、以及硬质区域的压缩弹性模量的设定值等来适当调节。
在作为溶液(例如水溶液)或分散液的涂膜形成组合物层的情况下,伴随组合物层的固化的进行所形成的高分子的网络结构裹入周围的溶剂而发生溶胀,由此形成凝胶。上述光固化性明胶伴随固化的进行,明胶的交联密度增加,并且所形成的凝胶的溶胀度减小。由此,所形成的硬质区域的压缩弹性模量上升。
培养基材的另一实施方式为培养干细胞的培养基材,具备表面部分,该表面部分具有沿相互交叉的多个方向排列延伸的软质区域、以及由上述软质区域划分出的具有比上述软质区域高的粘度系数的多个硬质区域。在上述表面部分,上述硬质区域具有朝上述软质区域突出的锐角部,上述干细胞能够变形为可容纳在上述硬质区域的区域内的形状。
本说明书中的“粘度系数”是指针对粘弹性体通常所定义的粘度系数,是用在使用任意的平板沿水平方向对该粘弹性体负载剪切流的情况下得到的剪切应力除以剪切速率梯度而得的数值。本说明书中的“粘度系数”可以通过针对构成设置于培养基材的表面部分的物质层使用原子力显微镜(AFM)的水平摩擦力测定法进行测定。使AFM的悬臂沿水平方向对上述物质层进行扫描,根据悬臂的水平方向的扭曲来测定作为物质层所显示的剪切应力的摩擦力。然后,悬臂的扫描速度、即剪切速度采用设定值,可以根据所得剪切应力和剪切速率梯度算出粘度系数。
硬质区域可以具有比软质区域高的粘度系数。通过使培养基材的表面具备粘度系数不同的多个区域,可以在所培养的细胞在上述多个区域间移动时使细胞从基材表面受到的刺激发生变化。即,可以使在培养基材上培养的细胞所感受到的机械刺激在培养期间以高频率变化。硬质区域的粘度系数可以为软质区域的粘度系数的10倍以上、100倍以上或1000倍以上。软质区域的粘度系数可以为硬质区域的粘度系数的10000倍以下或5000倍以下。通过使硬质区域的粘度系数在上述范围内,可以使干细胞更容易认识到来自硬质区域的刺激与来自软质区域的刺激的差异。通过使干细胞所受到的刺激在培养期间以高频率变化,可以更充分地维持干细胞的未分化状态。
硬质区域的粘度系数可以根据作为培养对象的干细胞的种类及分化的阶段等进行调节。
硬质区域及软质区域的粘度系数例如可以如下确定。例如,设想人间充质干细胞(hMSC)的培养来进行说明。在为hMSC的情况下,利用因hMSC从基材受到的刺激而影响YAP向细胞核的移动这一情况,可以确定硬质区域及软质区域的各自的合适的粘度系数。即,用于培养hMSC的培养基材中的硬质区域及软质区域的各自的合适的粘度系数可以通过观测已知会参与hMSC的分化谱系的决定的转录激活辅助因子YAP的细胞内行为来确定。首先,准备粘度系数不同的多个培养基材,在各个培养基材上进行hMSC的培养,确定在细胞内YAP局部存在的部位。通过进行这种观测来确定与YAP是向细胞核移动还是停留在细胞质内相关的、基材的粘度系数的阈值。然后,可以以跨过所确定的阈值的方式确定硬质区域的粘度系数及软质区域的粘度系数。上述例子中,以YAP的细胞内行为作为依据来确定硬质区域及软质区域的粘度系数,而根据作为对象的干细胞等,也可以着眼于其他因子。作为其他因子,可以采用已知向细胞核的移动会受到与来自基材的刺激对应的影响的蛋白质等,例如可列举出TAZ及RUNX2等。
<培养基材的制造方法>
培养基材的制造方法的一个实施方式具有下述工序:在支撑体上对光反应性自由基聚合引发剂进行表面固定的工序;以及、在上述支撑体上设置含有具有光聚合性官能团的化合物的层、对上述层以图案状照射光的工序。上述层例如可以为包含含有具有乙烯基的化合物的溶液的层。照射光的工序例如可以是如下工序:通过隔着光掩模的光照射,使光照射部的上述具有光聚合成官能团的化合物以上述光反应性自由基聚合引发剂作为起点进行接枝聚合,得到接枝聚合层。通过上述照射光的工序,例如能够形成在支撑体表面形成有接枝聚合物的部分(光聚合层形成部)和支撑体表面的部分(非光聚合形成部),能够形成硬质区域和软质区域。光照射可以分多次进行。这种情况下,首先通过第一次的光照射在支撑体表面上均匀地形成接枝聚合物,然后使第二次的光照射为隔着光掩模的光照射,由此能够形成接枝链的长度不同的部分。即,通过使用多次的光照射,能够形成具有接枝层的厚度不同的多个区域的接枝聚合层。
在上述制造方法中,为了非均匀地对硬质区域、软质区域进行图案化,可以使用遵循光刻法的方式的表面光接枝聚合法。例如,通过使用光引发转移终止剂,可以进行接枝聚合层的图案化(例如上述非专利文献3、4等)。使用光引发转移终止剂的表面接枝聚合中,依赖于光照射的时间及光照射时的光强度,接枝聚合物的分子链长基本成线性生长。因此,通过调节使用光掩模照射光时的光照射时间及光强度,能够对接枝聚合层的厚度不同的分区进行图案化。需要说明的是,表面接枝聚合所常用的表面引发的原子转移自由基聚合法无法进行本发明的具有硬质区域、软质区域的非均匀图案化表面修饰。
作为可用于光引发转移终止剂聚合的可进行表面固定的聚合引发剂,例如可列举出N,N-二乙基二硫代氨基甲酸酯三盐酸盐及N-二硫代羧基肌氨酸等。作为具有光聚合性官能团的化合物,例如可列举出乙烯基单体等。作为乙烯基单体,例如可列举出N-异丙基丙烯酰胺及二甲基丙烯酰胺等。要想设置具有含有光聚合性官能团的化合物的层,可以使用将上述具有光聚合性官能团的化合物溶解于合适的溶剂而得的溶液。
通过调节接枝聚合层的厚度,可以调节其表面部分的粘度系数。表面的粘度系数会对干细胞的粘附伸展面积产生显著影响、参与分化谱系偏向。因此,通过调节光照射时间及光强度、调节接枝聚合层的厚度,能够将硬质区域、及软质区域的粘度系数制备成合适的值。
<培养装置>
培养装置的一个实施方式为具有干细胞和培养干细胞的培养基材的培养装置,上述培养基材具备表面部分,该表面部分具有:沿相互交叉的多个方向排列延伸的软质区域、以及由上述软质区域划分出的具有比上述软质区域高的压缩弹性模量的多个硬质区域。在上述表面部分,上述硬质区域具有朝上述软质区域突出的锐角部,上述干细胞能够变形为可容纳在上述硬质区域的区域内的形状。
培养装置的另一实施方式为具有干细胞和培养干细胞的培养基材的培养装置,上述培养基材具备表面部分,该表面部分具有沿相互交叉的多个方向排列延伸的软质区域、以及由上述软质区域划分出的具有比上述软质区域高的粘度系数的多个硬质区域。在上述表面部分,上述硬质区域具有朝上述软质区域突出的锐角部,上述干细胞能够变形为可容纳在上述硬质区域的区域内的形状。
<培养方法>
干细胞的培养方法的一个实施方式包括在上述培养基材上培养干细胞的工序。上述干细胞的培养方法可以为包括在使上述培养基材与干细胞接触的状态下培养上述干细胞的工序的方式。通过使用上述培养基材作为干细胞的培养基材,能够在抑制干细胞的分化的同时使其增殖。换言之,可以说本实施方式的干细胞的培养方法提供大量的未分化细胞的制造方法。
上述干细胞的培养方法通过使用上述培养基材,即使不使用由动物血清等制备、供给的未知/未定义的分化抑制因子,也可以在充分维持未分化的状态的状态下培养干细胞。在为间充质干细胞的情况下,尚未确立有效抑制分化的分化抑制因子、以及参与维持未分化性及多能性的分化增殖因子。一直以来,在使用通常的细胞培养皿和标准的培养基的干细胞的培养中,在每次培养时选择并添加认为对干细胞的维持有效的因子。在上述干细胞的培养方法中,无需选择使用来源于动物血清等的成分,进而还可以避免来自基材的刺激逐渐积累于培养中的干细胞。因此,能够进一步提高所得到的增殖的干细胞的质量及安全性等。通过本实施方式的干细胞的培养方法所培养的干细胞可以在维持未分化状态的同时使质量稳定,因此可以用作研究用及再生医疗用的干细胞。
上述干细胞的培养方法使用上述培养基材,可以应用关于上述培养基材及培养基材的制造方法的说明内容。也可以反过来将本实施方式的干细胞的培养方法的说明应用于上述培养基材及培养基材的制造方法。
干细胞是未分化的细胞,是指具有多能性及自我复制能力的细胞。作为干细胞,例如可列举出诱导多能干细胞(iPS细胞)及胚胎干细胞(ES细胞)等。iPS细胞及ES细胞是具有分化成外胚层、中胚层及内胚层的三胚层、以及三胚层分化形成的所有种类的细胞的能力的多能干细胞。上述干细胞的培养方法也可以用于多能干细胞进行数阶段分化而得的成体干细胞的培养。
作为成体干细胞,可列举出:造血干细胞、神经干细胞、肝干细胞、血管内皮干细胞及间充质干细胞(MSC)等。间充质干细胞是分化成例如中胚层来源的基质细胞(骨髓)、成骨细胞(骨细胞)、成软骨细胞(软骨细胞)、脂肪细胞、肌肉细胞、成纤维细胞(肌腱、韧带)及血管内皮细胞等的干细胞。
干细胞的培养条件可以选择与所培养的细胞种类对应的条件,可以应用在现有的基质胶(BD MatrigelTM Basement Membrane Matrix:BD 354234)等培养基上进行的传代培养中使用的培养条件。
在使用本发明的培养基材的干细胞的培养中,培养中的干细胞的分化受到抑制。例如,在使用本发明的培养基材的干细胞的培养中,在包含诱导干细胞的骨分化的生长因子等的培养液(例如R&D Systems,Inc.制造、商品名:Osteogenic Supplement等)中进行培养的情况下,出现针对分化的阻力,并且在之后回到通常的培养基材进行同样的分化诱导的情况下,正常显示出骨分化能力。即,在使用本发明的培养基材的培养中,干细胞不表现分化刺激响应性,保持避免了分化的偏差的状态地维持正常的分化能力,能够保持高的未分化性。因此,使用本发明的培养基材的干细胞的培养方法及培养装置对于未分化状态的干细胞的培养是有用的。
使用本发明的培养基材所培养的干细胞与使用现有的培养基材所培养的干细胞相比,可以发挥出更优异的分化能力。本发明人等推定,使用本发明的培养基材的培养恢复了作为培养对象的干细胞本来所具有的干细胞性。例如,通过使用本发明的培养基材来培养原本骨分化诱导效率并不高的干细胞群,能够增加显示终末分化效率的钙生成量。因此,使用本发明的培养基材的干细胞的培养方法及培养装置适合于干细胞的培养。此外,认为使用本发明的培养基材的干细胞的培养方法及培养装置对于制备作为判定干细胞的品质的基准的干细胞群也是有用的。
使用本发明的培养基材所培养的干细胞的增殖性可以比使用现有的培养基材所培养的干细胞更优异。例如,在制备移植到生物体内使用的干细胞的情况下,通过能够更迅速地制备规定数量的干细胞,可以缩短开始对患者给药的时间。因此,使用本发明的培养基材的干细胞的培养方法及培养装置是有用的。
使用本发明的培养基材所培养的干细胞的运动性可以比使用现有的培养基材所培养的干细胞更优异。认为例如在移植到生物体内使用的情况下,通过使干细胞如上所述具有优异的运动性,该细胞容易到达期望的部位(例如疾病部位等)。因此,使用本发明的培养基材的干细胞的培养方法及培养装置是有用的。
使用本发明的培养基材所培养的干细胞可以提高染色体在带边界区域的基因的表达强度。基因的表达强度可以根据针对上述干细胞的综合基因分析的结果以及可从基因数据库(例如UNIVERSITY of CALIFORNIA、SANTA CRUZ、Genomics Institute等)取得的染色体图谱进行确认。获得如上所述的效果的理由尚不确定,本发明人等推定这是由于干细胞从培养基材表面受到的机械刺激的高频率下的变化也会传达至干细胞的核,并且由于该机械刺激的变化在染色体带的边界引发了应力集中。认为染色体带的边界位置也是染色体的刚性在其前后发生改变的部分,因此会发生如上所述的应力集中。发生应力集中的染色体带区域由于其高阶结构的摇动增大,会增强位于此处的基因组与各种转录因子、转录调节因子的相互作用。因此,使用本发明的培养基材的干细胞的培养方法及培养装置还可以应用作用于提高在染色体带的边界附近的基因的表达强度的方法。
以上,对本发明的若干实施方式进行了说明,但本发明不受上述实施方式的任何限定。此外,关于上述实施方式的说明内容可以相互应用。
实施例
以下,参照实施例及比较例对本发明的内容进行更详细的说明。不过,本发明并不限定于下述的实施例。
(实施例1)
<培养基材的制造>
通过将苯乙烯化明胶(StG)水溶液与作为光聚合引发剂的磺酰基樟脑醌(Sulfonyl Camphorquinone:SCQ)的水溶液混合,制备溶液A(StG最终浓度:30质量%、SCQ最终浓度:1.5质量%)。接着,准备2块直径1.8cm的圆玻璃[作为牺牲层具备由聚(N-异丙基丙烯酰胺)(pNIPAAm)形成的表面涂层的圆玻璃(直径:1.8cm)以及经乙烯基修饰的圆玻璃(直径:1.8cm)这2块],用上述2块圆玻璃夹入20μL的溶液A,将约60mW/cm2的连续光照射300秒(第一光照射),由此制作低压缩弹性模量的基础凝胶(基底凝胶层)。
接着,对于上述得到的基础凝胶,隔着光掩模以图案状将约200mW/cm2的光照射90秒(第二光照射),然后在磷酸缓冲生理盐水(PBS)内振荡洗涤过夜,由此制备图案化的培养基材(图案化凝胶基材)。在此,光掩模使用图2所示的光掩模200。光掩模200具有遮光部202和以一边150μm的方式形成的多个三角形状的开口部204。在光掩模200中,各三角形状的开口部204的顶点206间距离为120μm。对于所得图案化凝胶基材,使用原子力显微镜(AFM、JPKInstruments AG制造)测定压缩弹性模量。压缩弹性模量的测定通过在100μm×100μm的区域内进行16×16点测定并算出其平均值来进行。在图案化凝胶基材中,硬质区域的压缩弹性模量为30kPa,软质区域的压缩弹性模量为2kPa。
<培养性能的评价>
通过使用人间充质干细胞(hMSC)进行在上述得到的图案化凝胶基材上的培养,进行培养性能的评价。需要说明的是,人间充质干细胞的尺寸为1000~13000μm2。将实施例1中的培养性能的评价状况的一部分示于图3。对上述得到的图案化凝胶基材进行基于乙醇的灭菌处理及洗涤。在洗涤后的图案化凝胶基材上接种1500个细胞/cm2的hMSC,加入杜氏改良Eagle培养基(DMEM培养基、包含10%的胎牛血清(FBS)),在此基础上,为了促进细胞对基材的粘附,在环境调节为5%CO2的培养箱内培养一整晚。然后,使用荧光显微镜(基恩士公司制造、BZ-X-700),每15分钟进行一次延时观察。从所得延时数据中随机抽出20个细胞,使用Image J软件对24小时的运动轨迹进行分析。将结果示于图4~图6。
图4是示出培养中的干细胞的运动趋势的图表,以上述20个细胞各自的运动轨迹的起点作为原点汇总了20个细胞的运动轨迹。图5是示出培养中干细胞停留在硬质区域及软质区域上的时间的图表。图6是示出培养中干细胞停留在硬质区域及软质区域上的平均时间的图表。根据图4所示的结果确认到,干细胞在基材表面上没有朝一个方向偏向地移动。此外,根据图5及图6所示的结果,干细胞在硬质区域上和软质区域上以相同程度的时间停留,结合图4所示的结果成功确认到,能够使干细胞所受到的刺激在培养期间以高频率变化。
(比较例1)
<培养基材的制造>
代替实施例1中使用的掩模图案,使用如图7所示的光掩模300,除此之外与实施例1同样地制备培养基材,进行培养性能的评价。需要说明的是,在所得培养基材中,硬质区域的压缩弹性模量为30kPa,软质区域的压缩弹性模量为2kPa。图7所示的光掩模300具有遮光部302和多个锯齿形状的开口部304。锯齿形状的开口部304为一边的长度150μm、每150μm以90°的角度弯折的图案。此外,线宽采用100μm。将评价结果示于图8~图10。
图8是示出培养中的干细胞的运动趋势的图表。图9是记载了培养中干细胞停留在硬质区域及软质区域上的时间的图表。图10是示出培养中干细胞停留在硬质区域及软质区域上的平均时间的图表。根据图8所示的结果确认到,干细胞的运动轨迹偏向于培养基材上的硬质区域或软质区域的延伸方向。此外,根据图9及10所示的结果确认到,干细胞以较多的时间停留在硬质区域上。根据该结果确认到,有可能在培养中干细胞由于自硬质区域受到的刺激的积累而影响分化决定过程。
(比较例2)
不使用光掩模,对低压缩弹性模量的基础凝胶整面照射光,除此之外与实施例1同样地制备培养基材。所得培养基材不具有图案,且培养基材的压缩弹性模量为30kPa。
(比较例3)
制备在实施例1所示的培养基材的制造的中间得到的低压缩弹性模量的基础凝胶(基底凝胶层),将其作为比较例3的培养基材。所得培养基材不具有图案,培养基材的压缩弹性模量为2kPa。
(参考例)
为了参考,准备了市售的细胞培养用塑料培养皿(Techno Plastic Products AG制造Tissue Culture Polystyrene Dish)。
<培养性能的评价:YAP的细胞内行为的观察>
使用实施例1、比较例2及比较例3中得到的培养基材,评价干细胞培养中的转录激活辅助因子YAP的细胞内行为。YAP的细胞内行为的评价通过对YAP进行荧光免疫染色后用荧光显微镜观察来进行。将结果示于图11及图12。
图11是示出显示培养基材上的干细胞内部的YAP的局部存在的荧光显微镜照片的图。图12是示出对培养基材上的干细胞内部的YAP的局部存在进行评价的结果的图表。图12所示的图表是根据图11所示的荧光显微镜照片观测YAP的局部存在位置,将干细胞分类为YAP主要存在于细胞核的组(图12中用“细胞核”(Nuclear)表示)、YAP主要存在于核外的细胞质的组(图12中用“细胞质”(Cytoplasma)表示)、及YAP在细胞内扩散未发生局部存在的组(图12中用“细胞核+细胞质”(Nuclear+Cytoplasma)表示)这3个组,并示出其比例。
根据图11及图12所示的结果确认到,在使用比较例2的培养基材(硬质的基材)的情况下,属于YAP向核内移动的组的干细胞占整体的70%以上,在使用比较例3的培养基材(软质的基材)的情况下,属于YAP局部存在于细胞质的组的干细胞占整体的70%以上。此外,在使用实施例1的图案化凝胶基材的情况下,观察到分别属于YAP局部存在于核内的组、YAP局部存在于细胞质的组、及YAP未出现局部存在的组的干细胞,其存在量也彼此相近。推测在实施例1的图案化凝胶基材上培养的干细胞由于在硬质区域与软质区域间移动,因而自基材受到的刺激以高频率变化,随之,干细胞在上述3个组间移动。根据该结果确认到,通过使用实施例1这种培养基材,避免了对干细胞的分化偏向刺激。
<培养中及培养后的干细胞的分化能力的评价>
使用实施例1、比较例2及比较例3中得到的培养基材及参考例的细胞培养用塑料培养皿,进行人间充质干细胞(hMSC)的培养,针对评价培养中及培养后的hMSC的骨分化诱导行为。hMSC的骨分化诱导通过在包含诱导骨分化的生长因子等的培养液(R&D Systems,Inc.制造、商品名:Osteogenic Supplement)中将hMSC培养2周至3周来进行。将结果示于图13、图14、及图15。
<使用各种培养基材的培养中的干细胞的分化能力的评价>
图13是示出对培养基材上的干细胞实施骨分化诱导的结果的图。为了评价终末骨分化能力,进行使用茜素红S的染色。如图13所示,能够确认到,与在比较例2及比较例3的培养基材上培养中的hMSC相比,在实施例1的图案化凝胶基材(培养基材)上培养中的hMSC的茜素染色强度较低,几乎未被染色。由此成功确认到,在实施例1的培养基材上培养中的hMSC未发生终末骨分化。另一方面能够确认到,在参考例的细胞培养用塑料培养皿上培养中的hMSC的茜素染色强度高,被强烈染色。由此确认到,在参考例的细胞培养塑料培养皿上培养中的hMSC发生了正常的骨分化诱导。如上所述确认到,在使用实施例1的培养基材的培养中,确实抑制了hMSC的分化。
<使用各种培养基材的培养后的干细胞的分化能力的评价>
图14是示出对培养后所回收的干细胞实施分化诱导的结果的图。图15是示出对培养后所回收的干细胞实施分化诱导的结果的图表。需要说明的是,图14及图15中,用“对象+”表示对培养所用的hMSC进行了骨分化诱导的hMSC,用“对象-”表示培养所用的hMSC(未进行骨分化诱导的hMSC)本身。图15是以图14所示的样品作为对象测定茜素染色强度(相当于骨分化诱导强度)而制作的图表。如图14及图15所示,确认到,在实施例1的图案化凝胶基材上培养并回收的hMSC对于骨分化诱导表现出最强的分化能力。如上所述确认到,在实施例1的图案化凝胶基材上的hMSC的培养中,hMSC在培养期间显示出对分化诱导的抵抗性,培养后,经回收后发挥强的分化能力。
<使用各种培养基材的培养后的干细胞的基因表达的特征>
使用实施例1中得到的图案化凝胶基材,培养人间充质干细胞(hMSC),以培养后所回收的hMSC作为对象进行综合基因表达分析。将hMSC在上述图案化凝胶基材上培养4天后,用Affymetrix GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0 Array对mRNA表达进行综合性测定。根据其结果,表达增强的基因中,对于从表达最为增强的基因数到表达的更新的程度为第20位的基因为止的20个基因,使用基因数据库(UNIVERSITY of CALIFORNIA、SANTACRUZ、Genomics Institute),研究上述20个基因各自的染色体上的位置。将结果示于图16。
图16是示出在培养后所回收的干细胞中被激活的基因的位置的图。图16是在综合基因表达解析的结果中,确定与培养前的hMSC相比表达得到强化的基因,加入竖线示出该基因存在于基因图谱上的哪个位置。基因图谱从基因数据库取得。在图16中,特别是如标出的圆圈标记所示,综合基因解析的结果确认到,确认到表达增强的基因多数位于染色体带的边界的附近。
<培养性能的评价:干细胞密度的观察>
使用实施例1、比较例2及比较例3中得到的培养基材及参考例的细胞培养用塑料培养皿,进行hMSC的培养,对培养时间与培养基材上的干细胞的细胞密度的关系进行评价。在培养基材或细胞培养用塑料培养皿上接种hMSC,以接种后经过1天后的细胞密度:3000个细胞/cm2作为基准,测定2天后、3天后、4天后及5天后的细胞密度,算出增加比例。干细胞的细胞密度通过用光学显微镜观察来进行。将结果示于图17及图18。
图17是示出培养时间与培养基材上的干细胞的细胞密度的关系的图。图17是用光学显微镜对观察中的培养基材的一部分区域进行拍照而得的。图17的示出实施例1的结果的照片在初期能够目视观察到在培养基材上形成的图案(三角形状的硬质区域)。
图18是示出培养时间与培养基材上的干细胞的细胞密度的关系的图表。如图18所示确认到,与使用比较例2及比较例3中得到的培养基材以及参考例的细胞培养用塑料培养皿的培养中的hMSC的增加率相比,使用实施例1的图案化凝胶基材的培养中的hMSC的增加率较大。
<培养中的细胞的运动性评价>
使用实施例1、比较例2及比较例3中得到的培养基材培养hMSC,对培养基材上的hMSC的运动性进行评价。使用相位差显微镜以15分钟的间隔对对各个培养中的细胞群进行经时拍照。拍照持续24小时。根据所得照片追踪各个hMSC的坐标,测量移动距离,由此算出运动速度。将结果示于图19。
图19是示出培养中的干细胞的运动速度的分布的图表。图表上的各个点是与作为测定对象的hMSC对应的速度,图表示出其分布。此外,散射图中的直线表示分布的平均。确认到,与基材表面的压缩弹性模量没有变化的比较例2及3的培养基材上的hMSC的运动速度相比,实施例1的图案化凝胶基材上的hMSC的运动速度增快。
产业上的可利用性
根据本发明,能够提供可以使干细胞在基材表面的运动方向为各向同性的培养基材、培养基材的制造方法及干细胞的培养方法。
附图标记说明
10…软质区域、20…硬质区域、22…锐角部、50…表面、100…培养基材、200,300…光掩模、202,302…遮光部、204,304…开口部、206…顶点。

Claims (19)

1.一种培养基材,其为培养干细胞的培养基材,所述培养基材具备表面部分,
所述表面部分具有:沿相互交叉的多个方向排列延伸的软质区域、以及
由所述软质区域划分出的多个硬质区域,
在所述表面部分,所述硬质区域具有朝所述软质区域突出的锐角部,
所述干细胞能够变形为可容纳在所述硬质区域的区域内的形状。
2.根据权利要求1所述的培养基材,其中,所述硬质区域具有比所述软质区域高的压缩弹性模量。
3.根据权利要求1或2所述的培养基材,其中,所述锐角部呈倒角形状,其曲率半径为50μm以下。
4.根据权利要求1~3中的任一项所述的培养基材,其中,所述多个硬质区域中的至少一个为三角形状。
5.根据权利要求1~4中的任一项所述的培养基材,其中,所述硬质区域的各自的面积为5000~13000μm2
6.根据权利要求1~5中的任一项所述的培养基材,其中,所述硬质区域的压缩弹性模量为所述软质区域的压缩弹性模量的10倍以上。
7.根据权利要求1~6中的任一项所述的培养基材,其中,所述硬质区域的压缩弹性模量为30kPa以上。
8.根据权利要求1~7中的任一项所述的培养基材,其中,所述软质区域包含光聚合性化合物。
9.根据权利要求8所述的培养基材,其中,所述光聚合性化合物包含光固化性苯乙烯化明胶。
10.根据权利要求1所述的培养基材,其中,所述硬质区域具有比所述软质区域高的粘度系数。
11.根据权利要求10所述的培养基材,其中,所述锐角部呈倒角形状,其曲率半径为50μm以下。
12.根据权利要求10或11所述的培养基材,其中,所述多个硬质区域中的至少一个为三角形状。
13.根据权利要求1~12中的任一项所述的培养基材,其中,所述硬质区域的各自的面积为5000~13000μm2
14.一种培养基材的制造方法,该方法具有下述工序:在支撑体上形成包含光聚合性化合物和光聚合引发剂的组合物层的工序;以及
对所述组合物层以图案状照射光、得到权利要求1~9中的任一项所述的培养基材的工序。
15.根据权利要求14所述的培养基材的制造方法,其中,所述光聚合性化合物包含光固化性苯乙烯化明胶。
16.一种干细胞的培养方法,其包括在权利要求1~13中的任一项所述的培养基材上培养干细胞的工序。
17.一种培养装置,该培养装置具有干细胞和培养干细胞的培养基材,
所述培养基材具备表面部分,
所述表面部分具有:沿相互交叉的多个方向排列延伸的软质区域、以及由所述软质区域划分出的多个硬质区域,
在所述表面部分,所述硬质区域具有朝所述软质区域突出的锐角部,
所述干细胞能够变形为可容纳在所述硬质区域的区域内的形状。
18.根据权利要求17所述的培养装置,其中,所述硬质区域具有比所述软质区域高的压缩弹性模量。
19.根据权利要求17所述的培养装置,其中,所述硬质区域具有比所述软质区域高的粘度系数。
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