CN102149811A - 用于细胞培养的材料和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于提高细胞生长包括提高干细胞分化的纳米图案化表面。所述图案化表面可以包含生物活性基团场区的阵列，并且可以通过包括场区间间距和场区尺寸在内的参数控制所述图案化表面。可以利用蘸笔纳米光刻印刷、微接触印刷和纳米压印光刻进行纳米图案化。

Description

用于细胞培养的材料和方法
相关申请
本申请要求(i)以优利弗事业有限公司(ULive Enterprises Limited)为申请人在2008年7月12日提交的申请号为0812789.6、名称为“用于细胞培养的材料和方法”的英国临时专利申请，和(ii)2008年9月22日提交的美国临时申请61/099,182的优先权，这些临时申请通过引用使包括附图、实施例和工作实施例、权利要求书和其它支持实施方式在内的整体并入本文。
背景技术
生物细胞的研究和使用引起许多临床和研究应用的极大兴趣。在这些应用中，一些应用期望能够以可选择的方式影响细胞行为。这可包括影响细胞粘附、细胞生长、细胞结构(包括影响细胞内部结构和细胞外部结构的形成)和影响细胞分化。
现有技术已经描述了可以影响细胞行为的多种手段，可以根据所要实现的目的从这些手段中选择合适的手段。最常使用的方法之一是向细胞培养物中补充生长因子或其它可溶的生物活性试剂。这些方法可以有效地影响细胞行为，但也存在许多已知的缺点。许多细胞培养补充物，尤其是生长因子需要复杂的纯化和/或表达过程以产生生物活性剂，因此价格昂贵。此外，许多生长因子和补充物都具有多效性，并因此可能产生许多不清楚的影响，而这取决于所使用的浓度和提供这些生长因子的细胞。
最近已经证明，细胞培养基材(substrate)上提供的官能团可用于影响细胞行为。然而，该方法还具有显著的缺点。具体而言，已经证明以这种方式使用的官能团对细胞产生的生物学影响难以控制。因此，与甚至一种生物活性官能团接触培养的细胞群都易于形成相当大水平的异质性。这是期望产生基本上纯的细胞群的情况(不论是用于临床目的还是研究目的)下的难题。
参见，Curran等，Biomaterials，27(2006)，4783-4793；Curran等，Biomaterials 26(2005)，7057-7067。
发明概述
本发明某些方面和实施方式的目的是至少消除或减轻与现有技术相关的一些问题。
本发明涉及细胞培养材料(cell growth material)。本发明还涉及影响细胞的生物活性的方法；产生细胞培养材料的方法；和此材料的医学应用。
本发明第一方面提供了细胞培养材料，其包含结合有多个生物活性官能团场区(field)的基材，所述生物活性官能团场区被基本不含所述生物活性官能团的基材区(region)彼此分隔，其中场区和区限定了域(domain)，在所述域中所述生物活性官能团场区间间距基本是恒定的。
本发明第二方面提供了影响生物细胞活性的方法，所述方法包括使生物细胞与本发明第一方面的材料接触。
本发明的发明人发现，本发明第一方面的材料能够影响与该材料接触的生物细胞。虽然生物活性官能团影响生物细胞活性的能力之前已有文献报道，但该能力倾向于具有相当大的可变性，这可能与可重复性水平低有关。这与在现有技术的材料上培养的细胞产生多为异质性的细胞群的缺点有关。
在许多研究和临床应用中都期望使用基本同质的(homogeneous)细胞群。与异质细胞群相比，这种同质细胞群可以被更全面地表征，并且可以提供可重复性更高的生物学响应。这对于去除异质性则科学结果的可重复性更高的科学应用是非常重要的，并且对于临床应用，例如基于细胞的治疗尤其重要。
本发明的发明人发现，包含能够影响生物细胞分化的生物活性官能团的现有技术材料产生的细胞群的异质性(heterogeneity)水平可高达40％(即所产生的主要细胞群仅占总细胞群的60％之少)。本发明的发明人认为，本发明的细胞培养材料和利用该材料的方法能够产生异质性水平大幅降低的细胞群。因此，本发明的材料和方法非常有益于临床应用和科研应用。
基于细胞的治疗代表了目前在临床上具有显著意义的领域。这种治疗通常利用离体培养的生物细胞在向患者施用时的增大或替代患病或受损组织的能力。细胞治疗可以使用基本分化的细胞(终末分化的细胞或接近终末分化的细胞)替代损失的或受损的组织，在这种情况下所施用的细胞通常与期望替代的细胞为同一类型。或者，细胞治疗可以使用能够分化产生所需类型的细胞的基本不分化的细胞(例如干细胞和祖细胞)。在这种情况下，所使用的细胞应当能够分化产生获得所需临床结果所需要的一种或多种细胞类型。
干细胞或祖细胞代表用于基于细胞的治疗的特别有用的候选物。全能干细胞或多能干细胞或多能祖细胞可都能够产生治疗有用的细胞群。干细胞在响应向离体或体内干细胞提供的外部信号中可被诱导分化并产生治疗有用的细胞。由于这种类型的干细胞能够产生体内的所有或几乎所有的细胞类型，因此只要能够在提供合适的分化信号之前将该类型的干细胞维持在基本不分化的状态就可有望提供合适的替代细胞。分化信号可以以离体的方式提供以产生随后可施用于患者的细胞群，或者可能以体内方式提供，在这种情况下天然存在的或外因增加的干细胞可被局部环境或合成试剂(例如本发明的细胞培养材料)诱导分化。
在祖细胞的情况下，这些细胞已经经历了某种量的分化，并且这将限制祖细胞可以形成的潜在细胞谱系。因此，能够产生和选择能够产生所需类型的替代细胞的祖细胞至关重要。本发明的材料和方法可用于形成基本同质的合适祖细胞群，并且还可以确保祖细胞沿着感兴趣的通路(例如当本发明的材料植入受损或患病组织部位时)继续分化。
由以上可以看出，由于异质性限制了细胞的治疗潜能，因此可引起整个细胞群中的某些亚群部分或完全分化的细胞群异质性是非常不利的。确实，细胞群内的异质性可导致易于产生没有任何治疗益处的无用或者甚至有害细胞类型的细胞的产生。
本发明的发明人发现，本发明的细胞培养材料可以克服现有技术中的这些诸多不足。所述生物材料使用了在被无官能团区分隔的离散场区中提供的生物活性官能团。为了帮助读者可视化，在具体的实施方式(图1和图1a所示)中，这可以表示为在未覆盖的基材(未覆盖的面积(area)产生场区间的“区”)上的官能团“点”(“场区”)。这些材料能够以产生与现有技术相比可重复性更高的结果和更同质的细胞群的方式影响细胞的生物活性，这是一个非常令人惊奇的发现。这似乎与通过官能团在细胞可能与之接触的表面上的不均匀分布可以使生物活性官能团对细胞群的作用更均匀地发挥这一直觉相违背。
如上所述，本发明的材料离体或在体内产生治疗有用的细胞类型的能力也具有显著的益处。因此，本发明还提供了本发明第一方面的细胞培养材料和本发明随后方面的细胞培养材料用作药物的应用。这种药物可以为可植入材料的形式。本发明的可植入的细胞培养材料可用于产生通过其可诱导治疗有益的细胞类型生长和迁移的“导管”。本发明的可植入细胞培养材料还可通过提供可在其上或其中诱导形成治疗有用的细胞类型的材料而用于“引导”受损组织的替代或再生。本发明的医药用途、材料和方法将在本说明书的其它部分作更详细的描述。
本发明的细胞培养材料通常用于控制特定表型定义的细胞与所述材料的结合。正面影响细胞粘附的材料可用于促进细胞结合，还可用于进一步影响所粘附的细胞的行为，包括此类细胞的分化、表型或功能。细胞粘附的不同性质，例如促进细胞团粘附的能力或者促进单细胞粘附的能力可能对于确定生物细胞的分化通路至关重要。例如，细胞团可被看作是具有软骨原细胞分化的潜能的标志，而高粘附的长细胞(尤其是包含诸如应力纤维的多种细胞骨架成分的细胞)可被看作是具有神经原细胞或肌原细胞分化的潜能的标志。灶性接触(focal contact)的存在与否是可促进细胞成团的性质之一。
影响细胞分化的能力代表了本发明材料和方法的尤其有益的性质。应该理解，期望影响细胞分化的方式可以根据情况而不同。在一些情况下，可能期望通过降低粘附至本发明材料上的细胞群发生的分化水平而影响细胞分化。这将有效地维持或扩增细胞群而不改变其分化状态。在希望维持或扩增未分化或基本未分化的细胞(例如全能干细胞或多能干细胞)群的情况下，这可能尤其有利。由于干细胞在成人组织中相对缺乏，因此产生大量干细胞是有益的。扩增干细胞数量以产生更大的未分化或基本未分化细胞群的能力将是干细胞的治疗性应用的显著优点。
由于人干细胞或源自人干细胞的细胞群的潜在治疗效用，因此本发明的材料或方法在人干细胞培养中的应用通常代表了本发明此方面的优选实施方式。然而，根据这些优选的实施方式，可以优选使用除人胚胎干细胞外的人干细胞。
在其它情况下，可能期望通过促进产生感兴趣的细胞谱系的分化来影响细胞分化。以这种方式影响细胞分化还有益于多种临床应用和研究应用。
影响细胞分化产生期望细胞类型的能力的特别益处在于产生了可用于治疗其中的细胞类型(一种或多种)由于损伤或疾病而缺乏的组织或器官的替代细胞。本发明的发明人认为，本发明的材料和方法可用于诱导沿包括以下的多种细胞谱系的分化：骨原细胞谱系(osteogenic lineage)、软骨原细胞谱系(chondrogenic lineage)、神经原细胞谱系(neurogenic lineage)、脂肪原细胞谱系(adipogenic lineage)和肌原细胞谱系(myogenic lineage)。本发明的材料和方法可用于由基本未分化的细胞诱导所述细胞谱系，或者用于进一步促进由已倾向于一种或多种目标谱系的细胞产生这些细胞谱系。
应该理解，骨原细胞谱系的产生对于骨疾病或骨损伤的治疗至关重要。因此，能够产生骨原细胞谱系的本发明材料或方法将在骨损伤或骨疾病的治疗中具有特别的应用。
软骨原细胞谱系的产生将对于基于细胞的软骨疾病或软骨损伤治疗的开发具有特别的益处。因此，能够产生软骨原细胞谱系的本发明材料和方法将特别有益于这种类型的疾病或损伤的治疗性应用。
在期望产生细胞以增加或替代神经细胞的情况下，促进产生神经原细胞谱系的分化将是有益的。因此，能够产生神经原细胞谱系的本发明材料和方法可有益于神经组织受损的损伤或疾病的治疗。
当期望生成能够产生肌肉细胞(肌细胞)的细胞时，利用本发明的材料或方法产生肌原细胞谱系是有益的。因此，能够产生肌原细胞谱系的本发明材料或方法将特别用于影响肌肉的损伤或疾病的治疗中。
利用本发明的材料或方法产生脂肪原细胞谱系可以产生可具有多种治疗性应用的脂肪细胞。例如，可以在外伤或疾病引起的结构缺失的重建中使用脂肪细胞。可以受益于此的情况包括在乳房增大或重建中使用的组织替代，和与皮肤移植方法(例如烧伤或类似损伤)联合使用的皮下脂肪层的产生。利用本发明材料或方法产生的脂肪细胞还可以用于先天性缺陷，例如不能产生天然脂肪组织的Poland综合征的治疗。
附图说明
以下将参考附图对本发明作进一步描述，其中：
图1是本发明的细胞培养材料的示意图；
图2是本发明的细胞培养材料的横截面的高度放大的示意图；
图3是本发明的试验材料的侧向力显微图像；
图4例示了在包含生物活性官能团的现有技术材料上培养的细胞群中多种细胞组分的荧光标记结果；和
图5例示了在本发明的细胞培养材料上培养的细胞群中多种细胞组分的荧光标记结果。
发明详述
介绍
以下将对本申请中用于描述本发明的各术语进行解释。适当地以及上下文需要时，以下提供的定义和指导可扩展到本说明书的其它部分。
本文所引用的所有文献都通过引用并入。
细胞、细胞培养、细胞分化和干细胞是本领域通常已知的。参见，例如Essentials of Stem Cell Biology，(Ed.R.Lanza)，2006；Cell Biology，2nd Ed.，Pollard and Earnshaw，2008；Gilbert，Developmental Biology，5th ed.，1997；Cell Lineage Specification and Patterning of the Embryo，(ed.Etkin，Jeon)，2001。
“细胞培养材料”
出于本发明的目的，细胞培养材料可以包含可在其上或其中培养生物细胞的任何材料。细胞培养材料可以经改造从而能够支持此类培养。细胞培养材料可用于细胞的体外培养，例如与细胞或组织培养有关；或者用于体内细胞培养，例如在将本发明的细胞培养材料植入至患者体内的治疗性应用中。
细胞培养材料能够支持细胞培养。在这种情况下，细胞培养应包括细胞个体的生长(细胞个体通过分化、扩展或扩张过程而生长)和/或细胞数量的扩增(细胞群通过细胞复制而增加)。优选的细胞培养材料可能能够同时促进细胞群的扩增和此群内细胞个体的生长。
通常可以优选不向细胞培养材料中引入细胞毒性试剂或对细胞存活产生不利影响的任何其它试剂，原因是认为这些试剂可能破坏与其接触的细胞的生长。
本发明的细胞培养材料可以包含，例如组织培养皿或组织培养珠。细胞培养材料可以是无菌的，以避免细胞培养被污染的风险，或者避免植入所述材料的部位被感染。在一些情况下，可以优选本发明的细胞培养材料是“可湿的(wettable)”，即经过改造使其具有对细胞或组织培养基的易接受性。本发明的材料或方法中使用的官能团可影响可湿性。根据多个现有文献的公开，细胞培养材料的可湿性可影响细胞粘附和功能性。应该理解，可湿性对细胞粘附和功能性的影响可用于提高本发明材料的固有性质，或者通过允许固有性质的受控减小而用于“调节(temper)”固有性质。
“基材”
基材是结合有官能团的本发明材料的组件。在本发明的细胞培养材料的情况下，基材可提供细胞可生长于其上的表面，和/或细胞可经由其或在其上生长的基质或骨架(例如固体或胶样基质)。为便于说明，这些实施方式可被分别称为“二维”基材，或者“三维基材”。在所述基材提供了细胞可在其上生长的表面的情况下，仅需要在与细胞接触的表面上提供官能团场区和互补区。在细胞可经由其或在其内生长的基材的情况下，场区和区必须限定在基材基质内，并任选在所述基质表面上。
本发明的发明人已经鉴定了可用于本发明材料中的一些基材，包括(但不限于)选自由以下组成的组的基材：金；硅石(silica)；玻璃；硝化纤维素；聚己己酸内酯(PCL)；聚乳酸(PLLA)；聚乙醇酸(PGA)；聚氨酯(Poly(urethane))；羟基磷灰石；磷酸三钙；钛及其合金；形状记忆合金和不锈钢。
可参考所述材料的预期目的选择合适的基材。计划用于细胞或组织培养的本发明材料通常可以利用这些领域中的常规二维基材。此类基材可以是相对不可弯曲的，并且可以包括金、硅石、玻璃或塑料。计划用于这些应用的本发明材料可以采取适合用于分散培养的培养皿(例如烧瓶、板、盘)或者珠子的形式。
计划用于医疗应用的本发明材料(例如可植入药物等)可以使用以上所列的种类的二维基材或三维基材。通常，优选计划用于医疗目的本发明材料(并且尤其是计划被植入的本发明材料)利用在体内具有良好耐受性，且不产生慢性炎症反应的基材。适合用于这种类型的材料中的基材可以为可生物再吸收的(即所述基材和/或材料经过一段时间可被身体分解)，并且最终被身体自身的组织代替。
通常可以优选使用包含在再生医学中使用的三维基材的材料。这种基材可作为用于产生替代组织(例如骨、软骨、脂肪、肌肉和神经组织)的骨架。
在用于产生替代骨的本发明材料或方法(例如，用于产生骨原细胞的材料或方法)的情况下，可以优选使用具有糙化表面的基材。已经证明糙化表面对于骨接触应用以及由功能性成骨细胞、祖细胞和干细胞对骨原细胞分化标记物的表达更有效。
可以根据现有技术已经证明的影响细胞粘附和功能的多个参数选择二维或三维基材。这些参数包括多孔性和孔径；表面化学和表面能量；相容性；杨氏系数；孔径；和在含纤维基材的情况下纤维的方向、纤维尺寸和内部连接。
“场区”
出于本发明的目的，官能团“场区”应该包括提供有一种或多种生物活性官能团的材料的任何面积或体积，所述面积或体积被基本不含所述官能团的至少一个区隔开。本发明材料的边缘可提供场区的一个或多个边界。场区可以包含仅一种生物活性官能团或可以包含多种官能团。在场区包含多种官能团的情况下，可以根据说明书其它部分的讨论控制所述场区的尺寸和形状以及场区内官能团的密度。
令人惊奇地，包含仅一种官能团的场区能够比场区本身大得多地影响细胞的粘附、分化和其它生物性质。可以预期，包含一种官能团的场区可代表太低而没有生物学意义的浓度。然而，不期望受任何假说的束缚，本发明的发明人认为包含单个生物活性官能团的场区足以影响整合素的模式，其又仅能进一步对细胞产生进一步的影响。
通常可以优选根据该定义的任何给定场区基本仅包含一个种类的官能团。例如，可以优选生物活性官能团场区由至少95％的单个种类官能团构成，优选至少96％的单个种类官能团构成，更优选至少97％的单个种类官能团构成，甚至更优选至少98％的单个种类官能团构成，或者最优选至少99％-100％的单个种类官能团构成。
可以期望在本发明的场区中使用两组或更多组场区，每组场区包含不同的官能团种类或者官能团种类的混合物。因此，本发明的材料可以包含由第一种官能团(或官能团种类的第一混合物)构成的第一组场区和由第二种官能团(或官能团种类的第二混合物)构成的第二组场区。如果需要，本发明的材料或方法可以利用第三组场区或其它组场区。
应该理解，官能团场区可以包含两种或更多种不同的官能团。在这种情况下，可以根据说明书其它部分各单个种类官能团所属的性质选择官能团种类的组合。可以优选沉积组合在同一场区内的不同种类的生物活性官能团作为能够自组装的墨组分(ink constituent)(如其它部分的描述)的一部分，由此促进形成引入不同种类官能团的一致性场区。
本发明的场区可以为任何形状，包括(但不限于)选自由以下组成的组的形状：点状、逗点状、线状、三角状、正方形、月牙形和星形。本发明的发明人认为，不同形状的场区可以为本发明材料或方法的多个潜在应用提供益处。
例如，本发明的发明人认为圆形场区可有益于控制细胞骨架的成分，并由此影响与提供有此场区的材料接触的细胞的分化。本发明的发明人认为，成列或成排形状的的场区将能够影响单个细胞的形状，还可以影响细胞群。采用成列或成排形状的场区的材料或方法的使用对于神经和肌原细胞谱系的产生可能是有用的。在说明书的其它部分讨论了可在此细胞谱系的生产中使用的有利官能团，并且可以尤其优选使用包含证明促进神经或肌原细胞谱系发育的官能团的这些形状的场区。成列或成排形状的场区还可以影响细胞外基质的产生，并由此可能有益于能够产生腱或韧带的细胞的产生。
本发明的材料或方法可以使用仅具有单个形状的场区，或者可以采用具有多个形状的混合的场区。
生物活性官能团的场区通常经过制作从而使其的至少一个维度(在基本为平面材料上的场区的情况下，所述维度为宽或长；在其中或其上细胞可以生长的材料的场区的情况下，所述维度为宽、长或深)小于本发明的材料可与之接触的细胞的尺寸。
通常可以优选任何给定场区的至少一个维度小于100nm。例如，任何给定场区的至少一个维度可小于90nm，小于80nm，小于70nm，小于60nm或者甚至小于50nm。在一些实施方式中，所述场区的至少一个维度可以小于40nm、30nm、20nm或10nm。本发明的发明人发现，利用直径为约65nm-75nm(最优选)，约70nm的点形场区的本发明材料或方法非常适合获得说明书其它部分描述的生物作用结果。平均维度(包括点的平均直径)还可以为，例如小于100nm，或小于90nm，或小于80nm，或小于70nm，或小于60nm，或小于50nm，或小于40nm，或小于30nm，或小于20nm，或小于10nm，或者例如65nm-75nm，或者约70nm。
本发明的发明人认为，使用维度小于100nm的场区有利于由细胞产生的生物作用，并且这样可以缩短本发明材料的制造时间。缩短制造时间是有利的，不仅是因为这样可以在给定时间内产生更多的材料，而且还因为这样可减少否则可导致生物活性官能团沉积在场区间面积的失控性扩散的发生。
在成列或成排形状的场区的情况下，应该理解这些场区可以包括比100nm长得多且可比与所述材料接触的细胞长的至少一个维度。
“基本不含官能团的基材区”
出于本发明的目的，“基本不含官能团的基材区”(出于简洁的目的，还被称为“区”)可以是基本不含构成本发明材料中存在的一个或多个场区的官能团的任意区。在优选实施方式中，此区可以基本不含任何官能团或生物活性官能团。或者，所述区可以包含一种或多种官能团，只要这些官能团不是所述材料的场区中存在的官能团(即，只要所述区基本不含构成以上定义的各个场区的任何官能团)。
如果至少95％的区不含给定官能团，优选至少96％的区不含所述官能团，更优选至少97％的区不含所述官能团，甚至更优选至少98％的区不含所述官能团，最优选至少99％和高至100％的区不含所述官能团，则可以认为此区基本不含所述官能团。
可以根据期望建立的官能团场区之间的“间距”选择本发明材料或方法中可以使用的根据该定义的区的合适尺寸。下文进一步描述计算场区间间距的方法以及本发明材料或方法中使用的优选间距。
“生物活性官能团”
出于本发明公开的目的，可以认为“官能团”包含赋予含有所述官能团的化合物或分子可重复的化学功能性的任何原子或原子团。
本发明的生物活性官能团是能够影响与之接触的生物细胞的活性的官能团。生物活性官能团可能能够通过提高或降低细胞粘附水平而影响生物细胞的粘附。生物活性官能团可能能够通过提高或降低发生的分化水平而影响生物细胞的分化。不期望受任何假说的束缚，本发明的发明人认为在本发明材料中发现的生物活性官能团影响细胞分化的能力可以作为这些官能团影响诸如粘附、灶性粘附的形成、细胞分布和细胞骨架特征的排列、数量和分布的因素的能力的结果而发生。
可以参考所考虑的活性在对照细胞群(例如在不存在所考虑的官能团的情况下，并且尤其是在不存在包含所考虑的官能团的本发明材料下生长的细胞群)中存在的程度评价本发明的材料或生物活性官能团提高或降低活性(例如生物细胞的分化)的能力。
本发明的发明人鉴定的适合用在本发明材料或方法中的生物活性官能团的实例包括选自由以下组成的组的官能团：甲基基团；异丙基基团；环己基基团；芳基基团；烯丙基基团；炔基基团；羟基(醇)基团；醚基团；吗啉代基团(morpholino group)；亚乙基糖基(ethylene glycosylated group)；聚亚乙基糖基(polyethylene glycosylated group)；单糖，例如葡萄糖、核糖、heparose或甘露糖；羧酸酯基团(carboxylate group)；硫酸酯基团(sulphate group)；磷酸酯基团(phosphate group)；苯氧基(phenoxide group)；氨基基团；二烷基氨基基团；烷基氨基基团；膦基团(phosphine group)；和氨基酸。
分离的适合用在本发明材料或方法中的生物活性官能团可选自由以下基团组成的组：甲基基团、异丙基基团、环己基基团、芳基基团、烯丙基基团、炔基基团、羟基(醇)基团、醚基团、吗啉代基团、亚乙基糖基、聚亚乙基糖基、羧酸酯基团、硫酸酯基团、磷酸酯基团、苯氧基基团、氨基基团、二烷基氨基基团、烷基氨基基团和膦基团。
在本发明的材料或方法中可以优选使用疏水性官能团。合适的生物活性疏水性官能团的实例可选自由以下组成的组的基团：甲基基团、异丙基基团、环己基基团、芳基基团、烯丙基基团和炔基基团。
在本发明的某些实施方式中，可以优选使用亲水性官能团。适合用在本发明材料或方法中的合适的生物活性亲水性官能团的实例可选自由以下基团组成的组：羟基(醇)基团；醚基团；吗啉代基团；亚乙基糖基；聚亚乙基糖基；和单糖，例如葡萄糖、核糖、heparose或甘露糖。
在本发明的材料或方法中可以优选使用带负电荷的官能团。可以用于本发明材料或方法中的带负电荷的生物活性官能团的实例包括选自由以下基团组成的组的基团：羧酸酯基团、硫酸酯基团、磷酸酯基团和苯氧基。
可选择地，或者额外地，可优选使用带正电荷的官能团。可以用于本发明材料或方法中的带正电荷的生物活性官能团的实例包括选自由以下基团组成的组的基团：氨基基团、二烷基氨基基团、烷基氨基基团、膦基团和氨基酸。
可以利用使与材料接触的细胞能够获取合适的官能团的任何合适的化学化合物将生物活性官能团沉积在本发明材料中的基材上。仅作为实例，可以通过使基材接触巯基棕榈酸(MHA)而沉积羧基基团，可以通过使基材接触十六烷硫醇(HDT)而沉积甲基基团，可以使基材接触11-氨基-1-十一烷硫醇(AUT)而沉积氨基基团，可以使基材接触11-巯基-1-十一醇(MUOH)而沉积羟基基团。
“分离的生物活性官能团”
通常可以优选在本发明的材料或方法中使用的生物活性官能团是分离的生物活性官能团。出于本发明公开的目的，“分离的生物活性官能团”是以从其它官能团“分离”的形式提供的生物活性官能团。这使细胞不受“相冲突”的刺激从而产生了显著的益处，否则当提供多种不同种类的生物活性官能团时可能产生“相冲突”的刺激。因此，使用分离的生物活性官能团的本发明材料或方法在产生同质细胞群中特别有用。使用这种分离的生物活性官能团提供的额外益处将在下文阐述。
根据该定义，分离的生物活性官能团可以是包含由原子、原子团、分子或化合物提供的仅一种生物活性官能团的任何生物活性官能团。因此，分离的生物活性官能团可以是以其自身提供的生物活性官能团(即，不作为较大分子或化合物的一部分)。或者，也可以将作为较大分子或化合物的一部分的生物活性官能团考虑作分离的生物活性官能团，如果该生物活性官能团是较大分子或化合物提供给细胞的唯一官能团(应该理解，该定义还可以包括作为分子或化合物上的多种生物活性官能团之一提供的生物活性官能团，只要所有官能团都是同一种类)。
出于本发明的目的，作为存在于分子(例如氨基酸)或高分子(例如肽或核酸)上的生物活性官能团混合物的一部分的生物活性官能团不应被认为是“分离的”。在这些情况下，所述分子、高分子或化合物提供的生物活性官能团混合物向细胞提供了多种可能冲突的生物学刺激，并且这可能导致产生包含高水平异质性的细胞群。
本发明的发明人认为，在本发明的材料或方法中使用分离的官能团除以上所述的那些之外还带来了多种益处。使用分离的官能团的益处之一是，与氨基酸或肽等上提供的生物活性官能团相比，由于这种分离的基团可能小于诸如氨基酸和蛋白的分子或高分子，所以这种官能团在场区内的密度和场区间间距可更易于控制且控制更精确。这种尺寸差异可能提供进一步的益处，即与分离的官能团相比，结合于基材的氨基酸或肽中存在的官能团可能从基材进一步伸出，因此，与非分离对应物相比，分离的官能团可更好地促进细胞结合。
由于可用的官能团范围不限于氨基酸或肽等中天然存在的官能团，因此分离的官能团的使用还可以增加所使用的官能团种类的范围。
由于可以以与所发现的作为较大生物分子的一部分的官能团相比更不易于降解的形式提供分离的官能团，因此使用分离的官能团的另一个益处是提高了引入这些基团的材料的寿命。这些分离的官能团可以包括稳定性高于生物分子或高分子的自身提供的分离的官能团(即不作为较大分子的一部分)或者作为较大分子的一部分提供的分离的官能团。
与在较大分子(例如氨基酸、肽或核酸链)中存在的官能团相反，在本发明的材料中使用的分离官能团还具有进一步的益处，即分离官能团较不易于与细胞培养基的组分非特异结合。典型地，可以包含官能团的氨基酸或肽常常与诸如在胎牛血清(经常使用的培养添加物)中发现的组分的培养基组分结合。这种非特异结合可显著降低诸如氨基酸或肽的分子的功效，因为生物活性官能团对于其期望影响的细胞变得“隐蔽”了。发生非特异结合的程度是不可预测的，因此在这些情况下可能发生的官能团隐蔽程度也可大幅变化。这意味着难以准确控制细胞可用的氨基酸量或肽量，并且这可能导致与所述官能团接触的细胞群的不同应答。本发明的发明人发现，分离的官能团的非特异结合较少，并因此能够更好地以可控且可预测的方式影响生物细胞，由此产生异质性较低的细胞群。
与在天然存在的分子或高分子中存在的官能团相反，使用分离的官能团还可以带来进一步的益处，即分离的官能团可更好地粘附至结合有分离官能团的基材上。
能够促进官能团与本发明材料的基材结合的官能团或具有官能团的分子或化合物的修饰将在本说明书其它部分讨论。
“间距”
用于本发明材料上的官能团场区的排列的参数之一是所述场区的间距，即描述材料上的场区间距离或者材料上同一官能团的场区间距离的计算值。本发明的发明人发现，利用多种间距可以获得本发明材料产生的令人惊奇的益处。
通常，用在本发明材料或方法中的间距可以小于生物细胞的尺寸。用于本发明材料或方法的生物活性官能团场区之间的优选间距可以为75nm-2000nm。优选场区间间距可以为约100nm-1500nm，最优选140nm-1000nm。如本说明书其它部分所详细描述的，本发明的发明人发现在本发明材料中使用诸如140nm、280nm或1000nm的间距产生了优于现有技术的多种显著的益处。已经发现，在本发明的细胞培养材料或方法中使用280nm的场区间间距尤其有用。这种间距似乎与目前所研究的所有生物活性官能团中有利的细胞粘附活性有关。不期望受任何假说的束缚，本发明的发明人认为由于所获得的官能团分布的“不均衡性”在与此材料接触的细胞群中产生了非常均一的应答，使用间距为280nm范围内(例如约250nm-350nm)的场区间间距可能尤其有效。相反，较小的间距或较大的间距所产生的来自生物细胞的应答可能降低(为产生相当强的应答，场区被太紧或太稀地堆积在一起)。
可以由具有相同生物活性官能团组成的相邻场区的中心点间的距离计算间距。在包含两组或更多组场区的材料的情况下(其中每组场区具有不同的生物活性官能团组成)，不同组的场区间间距可以彼此相同，或者可以彼此不同。
可以利用诸如原子力显微镜(AFM)和X-射线光电子显微镜(XPS)的技术测定间距。
“域”
本发明的材料包含其中的生物活性官能团场区的间距基本恒定的一个或多个域。各个所述域将包含多个场区，优选4、5、10或更多个场区。域可以基本延伸穿过本发明的整个材料，或者给定材料可以包含多个不同的域。在后一种情况下，各个域内的间距可以基本恒定，而不同域可以具有相同的间距或者具有不同的间距。
出于本发明公开的目的，如果所述面积内的场区彼此的区别不超过15％，则可以认为细胞培养材料的面积(例如域)包含具有恒定间距的场区。优选地，此面积内的间距的彼此区别将不高于10％，更优选不高于5％，更优选不高于4％，更优选不高于3％，更优选不高于2％，最优选不高于1％或更低。
制备方法
上文描述了在本发明材料的制造中可能考虑的多个因素的详细内容。本发明第三方面提供了制造细胞培养材料的方法，所述方法包括在基材上沉积多种生物活性官能团以产生多个生物活性官能团场区，其中排列所述生物活性官能团场区使其被基本不含所述生物活性官能团的基材区彼此分隔。
可以利用任何合适的技术(例如通过以上本发明第三方面的方法)生产本发明的材料，所述技术能够将官能团沉积在基材上，足以准确地产生所需场区和区。由于官能团场区间的优选间距通常为75nm-2000nm，并且所述场区通常具有100nm以下的最小尺寸，因此可以优选使用纳米级技术用于生产本发明的材料。
可以用于生产本发明材料的优选方法是蘸笔纳米光刻术(DPN)。DPN是其中使用原子力显微镜的针尖(tip)将分子(例如本发明的生物活性官能团)转移至基材的扫描探针光刻技术。原子力显微镜的针尖的功能是有效地作为“笔”将“墨”(例如所选的官能团)沉积在“纸”(在这种情况下为细胞培养基材)上。该技术的主要益处是可以在DPN装置中引入大量“笔”头(在1D或2D阵列中)，由此可以进行基材的相对大面积的纳米级图案化。
在优选的实施方式中，所述墨可以包含作为较大分子(“墨组分”)的一部分的官能团，该较大分子用于将所述官能团结合于基材，从而使与本发明材料接触的生物细胞可以获取该官能团。可以将这种类型的墨称为“官能团提供墨”。可以根据向生物细胞有效提供官能团的能力以及用作可准确、受控且可重复的将官能团沉积在基材上的墨的能力选择官能团提供墨。
促成墨被准确且可重复地沉积的能力的性质包括粘度、挥发性和蒸汽压。这些性质对于将墨施于DPN笔的能力和笔将墨准确沉积至基材上的能力都至关重要。通常利用蒸发或类似技术将墨组分涂层施用于DPN笔，以提供合适的均一覆盖层。这样产生了可以在本发明材料的生产过程中沉积至基材上的墨储库(和由此包含生物活性官能团的墨组分)。
通过在两个组件的接触点处形成的水弯月面使墨由笔沉积至基材上。重要的是，这种沉积以可控的方式发生，并且将来自弯月面的不利扩散保持至最小。这可以通过选择具有合适性质的墨和墨组分而实现。下文更详细地讨论不利的性质和能够赋予此性质的墨组分的特点。
可以选择优选的墨，从而可以在相对低的温度(大约22℃的室温附近)和相对低的湿度下进行沉积。低温和低湿度通常可以在笔-基材界面处产生小的水弯月面，并且这促进了墨组分(和由此的生物活性官能团)在清楚确定的小的受控场区中的沉积。这些条件，并且尤其是低温还降低了不受控制的空气传播发生的扩散，否则可从笔扩散至基材。
当在参考以上的低温和湿度条件下利用巯基棕榈酸墨组分进行DPN时，发现墨扩散系数为0.041μm2/s。本发明的发明人认为，扩散系数在该范围内的墨是有益的，原因是其允许生物活性官能团场区的准确且可重复的沉积，并且降低了不受控制的扩散的趋势(其否则可能降低准确性)。应该理解，这些益处是期望的，其与所沉积的生物活性官能团无关。
还可以根据在相对短的“停留时间(dwell time)”(该时间是笔与基材面积接触以使所需量的墨沉积所花费的时间)内墨沉积在基材上的能力，选择适合用在本发明材料的生产中的优选墨。由于短的停留时间降低了发生不利扩散的机会，并且还可以更快速地制造本发明的材料，因此使用短的停留时间是有益的。短的停留时间的这种益处可适用于以间断接触模式进行的DPN和以接触模式进行的DPN。
可以通过向墨组分中引入聚乙二醇基团而提高墨组分与笔和基材间形成的弯月面的相互作用。本发明的发明人发现，这有利于此墨组分从笔高效且持续地沉积至基材(尤其对于否则将从针尖缓慢转移的墨)。这还可以有利地提高墨组分的挥发性。这可有益于笔涂层在DPN中的应用和墨(和由此的官能团)以受控且可重复的方式向基材上的沉积。
还可以通过改变墨组分中存在的碳-碳键数量(例如官能团由此被绑在基材上的碳链)影响本发明材料的制造中使用的墨组分的挥发性。通常，增加碳-碳键的数量使挥发性降低，而降低碳-碳键的数量使挥发性提高。本发明的发明人发现，包含10-20个碳-碳键的碳链的墨组分通常非常适合利用DPN生产本发明的材料。已经发现，包含16-18个碳-碳键的碳链的墨组分非常有益于烷基官能团的沉积，而优选在用于沉积氨基或羟基官能团的墨中具有约12个碳-碳键的组分(原因是这些基团本身可以降低它们所加入的墨组分的挥发性)。
在各个场区包含多种官能团的情况下，在本发明材料的制造中使用的优选墨可能能够自组装，以产生结合至基材上的稳定的墨组分(和由此的生物活性官能团)单层。以这种方式自组装促进了生物活性官能团和由此引入其的材料的稳定性。墨组分中存在的链和基团间的相互作用(例如烷基链的相互作用并且酸性基团可能在酸性墨中相互作用)有利于自组装。酸性墨和包含羟基基团的墨间的混合物还可以通过氢键相互作用，虽然这仅在烷基链的长度相似时才发生。因此，在期望产生包含高度稳定的场区的本发明材料的情况下，可以优选使用具有碳-碳键数量在上述范围上限的碳链的墨组分。
由以上应该认识到，制造本发明材料中使用的墨成分的选择是在有利于产生能够自组装的墨成分的因素和以有助于以明确确定且可重复的方式来沉积的方式调节墨的挥发性和粘性的因素之间所进行的平衡。
应该理解，以上讨论的在DPN中使用的组分的上下文中的许多标准还可能与可制造本发明的材料的其它方法有关。
虽然DPN代表了用于制造本发明材料的优选技术，但也可以采用能够以产生合适的场区和区所需的方式沉积官能团的任何纳米光刻方法。仅作为实例，可采用的其它合适的技术包括纳米压印光刻、电子束直写光刻和直接的原子力显微镜(AFM)。
其它实施方式
虽然本发明的材料和方法可在多种临床应用、治疗性应用或研究应用中使用，但作为其以比采用现有技术所获得的可重复性和控制性更高的方式影响细胞活性(例如分化)的能力的结果，本发明的发明人确定了本发明材料和方法的多个尤其优选的应用，并且这些应用将在下文进行更详细的讨论。
在尤其优选的实施方式中，本发明的细胞培养材料和方法可能能够允许干细胞或祖细胞的扩增，并且可以基本仅扩增而不诱导细胞分化(或者在祖细胞的情况下的进一步分化)。扩增干细胞或祖细胞而不诱导分化是非常有益的，原因是这样可以由少量初始细胞产生大量的治疗有用的细胞。然而，虽然有益，但现在已经证明利用现有技术的方法难以实现该目的。向干细胞培养物提供的维持细胞生存的许多生长因子或补充物也都使细胞经受谱系定型(lineage commitment)和分化。目前已经鉴定的允许细胞群扩增而不引起分化的那些细胞培养条件通常使用非常昂贵的细胞因子(例如FGF2)或者甚至是细胞因子“混合物”(由此进一步提高了相关费用)。
本发明的发明人发现，以约280nm的间距使用甲基(-CH3)官能团场区的本发明材料对于维持干细胞或祖细胞的未分化状态尤其有用。还可以扩增以该方式维持的细胞群以增加细胞数。该实施方式的本发明材料的生产(由于这些条件不涉及相关生长因子的复杂表达和重折叠或纯化)远远比之前公开的条件廉价，并且由于基材和分离的官能团比复杂的生物分子(例如细胞因子)对降解的抗性更高而具有延长的“寿命”。本发明的发明人在该方面的发现是如此有利，其产生了本发明的其它方面。
本发明第四方面提供了用于扩增干细胞群或祖细胞群的细胞培养材料，所述材料包括结合有多个包含甲基官能团的场区的基材，其中，所述甲基官能团场区被基本不含甲基官能团的基材区彼此分隔，并且其中场区间间距为约200nm-750nm。所述间距可以优选为约280nm。
本发明第五方面提供了扩增干细胞群或祖细胞群的方法，该方法包括使干细胞或祖细胞与本发明第四方面的细胞培养材料接触，并培养所述细胞直至产生扩增的细胞群。
由于本发明的发明人的发现表明这些基材对干细胞群或祖细胞群的扩增具有有益作用，因此本发明的发明人认为本发明第四或第五方面的材料或方法可以有利地使用PCL基材。
本发明的发明人发现，本发明的细胞培养材料可以用来影响生物细胞的分化，从而产生软骨原细胞(chondrogenic cell)。可以利用具有产生软骨原细胞谱系潜能的干细胞或祖细胞实现该目的。应该理解，产生软骨原细胞的能力可用于多种研究性应用或治疗性应用(例如，用于与软骨受损相关的损伤或疾病的研究和治疗)，而该能力也产生了本发明的其它方面。
本发明第六方面提供了用于产生软骨原细胞的细胞培养材料，所述材料包括结合有选自由羧基基团、甲基基团和羟基基团组成的组的多个生物活性官能团场区的基材，其中所述生物活性官能团场区被基本不含所述生物活性官能团的基材区彼此分隔。
在此材料的优选实施方式中，各个单个场区可以基本由或者完全由仅一种所述官能团组成。然而，在这些材料的有用实施方式中还可以采用包含两种或更多种所述官能团的场区。
在使用完全由或基本由羧基基团组成的场区的这些材料的实施方式中，可以优选场区间间距为约280nm。在使用完全由或基本由羟基基团组成的场区的这些材料的实施方式中，可以优选场区间间距为约140nm-约1000nm。
本发明第七方面还提供了产生软骨原细胞的方法，所述方法包括使干细胞或祖细胞与本发明第六方面的细胞培养材料接触。所述方法可任选包括培养所述细胞直至产生软骨原细胞。
本发明材料和方法可用于影响生物细胞(尤其是干细胞或祖细胞)分化产生骨原细胞(osteogenic cell)。该能力还具有显著的临床和研究效用(例如与骨受损相关的损伤或疾病的研究或治疗)，并且影响细胞分化以产生骨原细胞的能力产生了本发明的其它方面。
本发明第八方面提供了用于产生骨原细胞的细胞培养材料，所述材料包括结合有选自由氨基基团和羧基基团组成的组的多个生物活性官能团场区的基材，其中所述生物活性官能团场区被基本不含所述生物活性官能团的基材区彼此分隔。
在本发明第八方面的材料的优选实施方式中，各个单个场区可以基本由或者完全由仅一种所指官能团组成。然而，在这些材料的有用实施方式中还可以采用包含两种或更多种所指官能团的场区。
可以优选本发明第八方面的材料使用的生物活性官能团场区间的间距为约140nm-约1000nm。
本发明第九方面提供了产生骨原细胞的方法，所述方法包括使干细胞或祖细胞与本发明第八方面的细胞培养材料接触。所述方法可任选包括培养所述细胞直至产生骨原细胞。
还发现本发明材料或方法能够影响生物细胞的分化从而产生神经原细胞(neurogenic cell)。可以利用具有产生神经原细胞谱系潜能的干细胞或祖细胞实现该目的。应该理解，产生神经原细胞的能力可用于多种研究性应用或治疗性应用(例如，用于与神经受损相关的损伤或疾病的研究和治疗)，而该能力也产生了本发明的其它方面。
本发明第十方面提供了用于产生神经原细胞的细胞培养材料，所述材料包括结合有选自由氨基基团和羟基基团组成的组的多个生物活性官能团场区的基材，其中所述生物活性官能团场区被基本不含所述生物活性官能团的基材区彼此分隔。
在本发明第十方面的材料的优选实施方式中，本发明可以与上述第八方面描述的优选实施方式一致。
本发明第十一方面提供了产生神经原细胞的方法，所述方法包括使干细胞或祖细胞与本发明第十方面的细胞培养材料接触。所述方法可任选包括培养所述细胞直至产生神经原细胞。
本发明的发明人发现，本发明的材料和方法能够以产生肌原细胞(myogenic cell)的方式影响生物细胞的分化。在使用所述材料或方法培养能够产生肌原细胞谱系的干细胞或祖细胞时，可实现该作用。产生肌原细胞的能力将有益于肌细胞受损的多种研究性应用或治疗性应用。本发明的材料和方法产生肌原细胞的能力也产生了本发明的如下其它方面。
本发明第十二方面提供了用于产生肌原细胞的细胞培养材料，所述材料包括结合有多个氨基基团场区的基材，其中所述氨基基团场区被基本不含氨基基团的基材区彼此分隔。
在第十二方面的优选实施方式中，氨基基团场区仅由或基本仅由氨基基团组成。然而，本发明该方面的其它实施方式可以使用包含氨基基团和其它官能团的场区。
可以优选本发明第十二方面的材料使用的氨基基团场区间的间距为约140nm-约1000nm。
本发明还提供了第十三方面，即产生肌原细胞的方法，所述方法包括使干细胞或祖细胞与本发明第十二方面的细胞培养材料接触。所述方法可任选包括培养所述细胞直至产生肌原细胞。
本发明第十五方面提供了用于产生脂肪原细胞(adipogenic cell)的细胞培养材料，所述材料包括结合有多个羟基基团场区的基材，其中所述羟基基团场区被基本不含羟基基团的基材区彼此分隔。
可以优选本发明第十五方面的材料使用的羟基基团场区间的间距为约140nm-约1000nm。
本发明还提供了第十六方面，即产生脂肪原细胞的方法，所述方法包括使干细胞或祖细胞与本发明第十五方面的细胞培养材料接触。所述方法可任选包括培养所述细胞直至产生脂肪原细胞。
利用本发明第十五或十六方面的材料或方法产生脂肪原细胞谱系的能力本身产生了多种治疗性应用。利用这些材料或方法产生的脂肪细胞可用于重建由于损伤或疾病而损失的结构，或者用于治疗用于不能生产天然脂肪组织的先天性缺陷的治疗。这种应用的进一步实例可见于本说明书的其它部分。
本发明的发明人认为，包含聚乙二醇(PEG)基团的本发明材料还可有益于多种应用。可以利用多种墨组分，例如6-PEG-酸、3-PEG-酸或6-PEG-OH沉积PEG基团。本发明的发明人认为，各“PEG”上的“末端”官能团(例如羟基或酸)在影响细胞行为中发挥作用。PEG基团的存在还可以促进产生局部更水合区。
本发明的发明人发现，当某些生物活性官能团在官能团场区以特定间距排列的材料中提供时，其能够抑制生物细胞粘附至材料上。这些发现可用于开发可用于抑制细胞粘附以及细胞生长和定殖的材料。确实，该发现如此有用从而产生了本发明的第十六方面，在该方面提供了用于抑制生物细胞粘附的材料，所述材料包括结合有多个生物活性官能团场区的基材，其中所述生物活性官能团场区被基本不含所述生物活性官能团的基材区彼此分隔。本发明第十六方面的材料可用于“掩蔽”期望防止细胞粘附和生长的场区。
本发明的发明人发现，可以利用间距为约200nm或以下或者间距为约350nm或以上的羧基或甲基基团场区产生本发明第十六方面的材料。
本发明还提供了第十七方面，即提供了抑制生物细胞粘附的方法，所述方法包括使生物细胞与本发明第十六方面的材料接触。
可以利用以上描述的与细胞培养材料的制造相关的技术(例如蘸笔纳米光刻、纳米压印光刻或电子束直写光刻)生产本发明第十六方面的材料和/或适合用在本发明第十七方面的应用的材料。
如以上其它部分的描述，本发明第十六方面的材料还可以包括场区和区限定的域，在所述域中所述生物活性官能团场区的间距基本是恒定的。
附图说明
图1显示了细胞培养皿形式的细胞培养材料1。所述细胞培养材料1包含四个域2。这些域中之一的一部分放大视图显示于图1a中。
在此可以看出，域2由多个生物活性官能团场区3组成。这些场区3被基本不包含所述生物活性官能团的基材区4彼此分隔。域2内场区3的间距基本恒定。
图2显示了本发明优选实施方式的培养材料1的横截面的高度放大的示意图。所述材料包括结合有多个墨组分6的基材5。各墨组分6包含官能团7和使官能团7结合至基材5的碳链8。相邻墨组分6的碳链8彼此相互作用(点划线9表示的相互作用)，并因此自组装为单层。所述单层自组装从而使官能团7提供至引入至细胞培养材料1上的面积10的生物细胞。
图3显示了本发明的三种材料，其包括利用墨组分MHA沉积的羧基官能团场区。各部分显示了本发明材料的5μm×5μm区。场区的平均直径为约65nm-70nm，并且间距为140nm、280nm和1000nm(分别为图3a、3b和3c)。所述图是利用侧向力显微镜(LFM)获得的。
以下提供了97个另外的实施方式：
实施方式1：包含结合有多个生物活性官能团场区的基材的细胞培养材料，其中，所述生物活性官能团场区被基本不含所述生物活性官能团的基材区彼此分隔，其中场区和区限定了域，在所述域中所述生物活性官能团场区的间距基本是恒定的。
实施方式2：根据实施方式1所述的材料，其中所述生物活性官能团选自由以下组成的组的基团：甲基基团；异丙基基团；环己基基团；芳基基团；烯丙基基团；炔基基团；羟基(醇)基团；醚基团；吗啉代基团；亚乙基糖基；聚亚乙基糖基；单糖，例如葡萄糖、核糖、heparose或甘露糖；羧酸酯基团；硫酸酯基团；磷酸酯基团；苯氧基基团；氨基基团；二烷基氨基基团；烷基氨基基团；膦基团；和氨基酸。
实施方式3：如实施方式1所述的材料，其中，所述生物活性官能团场区间的间距为约75nm-2000nm。
实施方式4：如实施方式3所述的材料，其中，所述生物活性官能团场区间的间距为约140nm-1000nm。
实施方式5：根据实施方式1所述的材料，其中所述基材选自由以下组成的组：硅石、玻璃、硝化纤维素、聚己酸内酯(PCL)、聚乳酸(PLLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚氨酯、羟基磷灰石、磷酸三钙、钛、钛合金、形状记忆合金和不锈钢。
实施方式6：用于抑制生物细胞粘附的材料，其中，所述材料包含结合有多个生物活性官能团场区的基材，其中所述生物活性官能团场区被基本不含所述生物活性官能团的基材区彼此分隔。
实施方式7：如实施方式1-6中任一实施方式所述的材料，其用作药物。
实施方式8：用于扩增干细胞群或祖细胞群的细胞培养材料，其中，所述材料包含结合有多个包含甲基官能团的场区的基材，其中所述甲基官能团场区被基本不含甲基官能团的基材区彼此分隔，并且其中场区间间距为约200nm-750nm。
实施方式9：如实施方式8所述的细胞培养材料，其中，所述场区间间距为约280nm。
实施方式10：用于生产软骨原细胞的细胞培养材料，其中，所述材料包含结合有选自由羧基基团、甲基基团和羟基基团组成的组的多个生物活性官能团场区的基材，其中所述生物活性官能团场区被基本不含所述生物活性官能团的基材区彼此分隔。
实施方式11：用于生产骨原细胞的细胞培养材料，其中，所述材料包含结合有选自由氨基基团和羧基基团组成的组的多个生物活性官能团场区的基材，其中所述生物活性官能团场区被基本不含所述生物活性官能团的基材区彼此分隔。
实施方式12：用于生产神经原细胞的细胞培养材料，其中，所述材料包含结合有选自由氨基基团和羟基基团组成的组的多个生物活性官能团场区的基材，其中所述生物活性官能团场区被基本不含所述生物活性官能团的基材区彼此分隔。
实施方式13：用于生产肌原细胞的细胞培养材料，其中，所述材料包含结合有多个氨基基团场区的基材，其中所述氨基基团场区被基本不含氨基基团的基材区彼此分隔。
实施方式14：用于生产脂肪原细胞的细胞培养材料，其中，所述材料包含结合有多个羟基基团场区的基材，其中所述羟基基团场区被基本不含羟基基团的基材区彼此分隔。
实施方式15：如实施方式6-14中任一实施方式所述的材料，其中，场区和区限定了域，在所述域中所述生物活性官能团场区间间距基本是恒定的。
实施方式16：如实施方式1-15中任一实施方式所述的细胞培养材料，其中，所述生物活性官能团是分离的官能团。
实施方式17：实施方式1-16中任一实施方式所述的材料的制造方法，其中，所述方法包括在基材上沉积多个生物活性官能团以产生多个所述生物活性官能团场区，其中所述生物活性官能团场区经排列使其被基本不含所述生物活性官能团的基材区彼此分隔。
实施方式18：如实施方式17所述的方法，其中，所沉积的场区和区限定了域，在所述域中所述生物活性官能团场区间间距基本是恒定的。
实施方式19：如实施方式17或18所述的方法，其中，利用纳米光刻技术沉积所述生物活性官能团。
实施方式20：如实施方式19所述的方法，其中，所述纳米光刻技术选自由以下技术组成的组：蘸笔纳米光刻、纳米压印光刻、直接的原子力显微镜(AFM)、蚀刻掠射角沉积(etching glancing angle deposition)、激光切除、激光沉积、x-射线光刻母板的再铸模、微接触印刷和蚀刻电子束直写光刻。
实施方式21：如实施方式20所述的方法，其中，所述纳米光刻技术包括蘸笔纳米光刻。
实施方式22：如实施方式21所述的方法，所述生物活性官能团以墨组分的形式沉积。
实施方式23：扩增干细胞群或祖细胞群的方法，所述方法包括使干细胞或祖细胞与实施方式8所述的细胞培养材料接触，并培养所述细胞直至产生扩增的细胞群。
实施方式24：产生软骨原细胞的方法，所述方法包括使干细胞或祖细胞与实施方式10所述的细胞培养材料接触，并培养所述细胞直至产生软骨原细胞。
实施方式25：产生骨原细胞的方法，所述方法包括使干细胞或祖细胞与实施方式11所述的细胞培养材料接触，并培养所述细胞直至产生骨原细胞。
实施方式26：产生神经原细胞的方法，所述方法包括使干细胞或祖细胞与实施方式12所述的细胞培养材料接触，并培养所述细胞直至产生神经原细胞。
实施方式27：产生肌原细胞的方法，所述方法包括使干细胞或祖细胞与实施方式13所述的细胞培养材料接触，并培养所述细胞直至产生肌原细胞。
实施方式28：产生脂肪原细胞的方法，其中，所述方法包括使干细胞或祖细胞与实施方式14所述的细胞培养材料接触，并培养所述细胞直至产生脂肪原细胞。
实施方式29：方法，所述方法包括蘸笔纳米光刻印刷基材，然后提高所述基材上的至少一种细胞的生长。
实施方式30：如实施方式29所述的方法，其中，所述细胞是干细胞，所述提高是提高了干细胞分化或提高了干细胞群或祖细胞群的扩增。
实施方式31：方法，所述方法包括：
利用针尖将至少一种生物活性化合物沉积在基材上以在所述基材上形成多个离散的生物活性化合物场区，
在包含多个离散场区的基材上培养至少一种细胞直至产生扩增的细胞群，
其中与在没有所述离散场区的基材上的培养相比，所述离散场区提高了所述细胞群的同质性(homogeneity)或增殖性(reproducibility)。
实施方式32：如实施方式31所述的方法，其中，没有所述离散场区的所述基材包含含有至少一种生物活性化合物的基本同质的表面。
实施方式33：如实施方式31所述的方法，其中，所述离散场区提高了所述细胞群的同质性。
实施方式34：如实施方式31所述的方法，其中，所述培养是体内培养。
实施方式35：如实施方式31所述的方法，其中，所述培养是体外培养。
实施方式36：如实施方式31所述的方法，其中，所述培养诱导所述细胞的分化。
实施方式37：如实施方式31所述的方法，其中，所述培养不诱导所述细胞的分化。
实施方式38：如实施方式31所述的方法，其中，所述细胞是干细胞或祖细胞。
实施方式39：如实施方式31所述的方法，其中，所述细胞是干细胞。
实施方式40：如实施方式31所述的方法，其中，所述细胞是间充质干细胞。
实施方式41：如实施方式31所述的方法，其中，包含所述多个离散场区的基材包括75nm-2000nm的场区间间距。
实施方式42：如实施方式31所述的方法，其中，包含所述多个离散场区的基材包括140nm-1000nm的间距。
实施方式43：如实施方式31所述的方法，其中，包含所述多个离散场区的基材包括250nm-350nm的间距。
实施方式44：如实施方式31所述的方法，其中，所述基材包含形成域的多个离散场区，并且所述域包括基本恒定的间距。
实施方式45：如实施方式31所述的方法，其中，所述离散场区的至少一个维度小于100nm。
实施方式46：如实施方式31所述的方法，其中，所述离散场区的至少一个维度小于75nm。
实施方式47：如实施方式31所述的方法，其中，所述离散场区是平均直径小于100nm的点。
实施方式48：如实施方式31所述的方法，其中，所述离散场区是平均直径为65nm-75nm的点。
实施方式49：如实施方式31所述的方法，其中，所述离散场区是平均直径至少为65nm的点。
实施方式50：如实施方式31所述的方法，其中，所述培养包括单细胞的培养。
实施方式51：如实施方式31所述的方法，其中，所述培养包括细胞数量的扩增。
实施方式52：如实施方式31所述的方法，其中，所述基材是二维或三维基材。
实施方式53：如实施方式31所述的方法，其中，所述基材是三维基材。
实施方式54：如实施方式31所述的方法，其中，所述基材是硅石、玻璃、硝化纤维素、聚己酸内酯(PCL)、聚乳酸(PLLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚氨酯、羟基磷灰石、磷酸三钙、钛、钛合金、形状记忆合金或不锈钢基材。
实施方式55：如实施方式31所述的方法，其中，所述基材包含糙化的表面。
实施方式56：如实施方式31所述的方法，其中，所述离散场区的至少95％包含单个生物活性化合物。
实施方式57：如实施方式31所述的方法，其中，所述离散场区是点形状。
实施方式58：如实施方式31所述的方法，其中，所述离散场区被基本不含所述生物活性化合物的基材区彼此分隔。
实施方式59：如实施方式31所述的方法，其中，所述离散场区被基本不含任何官能团的基材区彼此分隔。
实施方式60：如实施方式31所述的方法，其中，所述离散场区被基本不含于所述生物活性化合物中存在的任何官能团的基材区彼此分隔。
实施方式61：如实施方式31所述的方法，其中，所述生物活性化合物包含至少一种疏水性基团、亲水性基团、带负电荷的基团或带正电荷的基团。
实施方式62：如实施方式31所述的方法，其中，所述生物活性化合物包含至少一种以下官能团：甲基基团；异丙基基团；环己基基团；芳基基团；烯丙基基团；炔基基团；羟基(醇)基团；醚基团；吗啉代基团；亚乙基糖基；聚亚乙基糖基；单糖，葡萄糖、核糖、heparose或甘露糖；羧酸酯基团；硫酸酯基团；磷酸酯基团；苯氧基基团；氨基基团；二烷基氨基基团；烷基氨基基团；膦基团；或氨基酸。
实施方式63：如实施方式31所述的方法，其中，所述生物活性化合物包含至少一种分离的生物活性基团。
实施方式64：如实施方式31所述的方法，其中，所述针尖是扫描探针针尖。
实施方式65：如实施方式31所述的方法，其中，所述针尖是原子力显微镜针尖。
实施方式66：如实施方式31所述的方法，其中，所述培养产生至少一种软骨原细胞。
实施方式67：如实施方式31所述的方法，其中，所述培养产生至少一种骨原细胞。
实施方式68：如实施方式31所述的方法，其中，所述培养产生至少一种神经原细胞。
实施方式69：如实施方式31所述的方法，其中，所述培养产生至少一种肌原细胞。
实施方式70：如实施方式31所述的方法，其中，所述培养产生至少一种脂肪原细胞。
实施方式71：如实施方式31所述的方法，其中，所述培养产生基本同质的骨原细胞群。
实施方式72：如实施方式31所述的方法，其中，所述培养产生基本同质的神经原细胞群。
实施方式73：如实施方式31所述的方法，其中，所述培养产生基本同质的肌原细胞群。
实施方式74：如实施方式31所述的方法，其中，所述培养产生基本同质的脂肪原细胞群。
实施方式75：如实施方式31所述的方法，其中，所述基材的至少部分包含抑制细胞粘附的物质。
实施方式76：如实施方式31所述的方法，其中，利用纳米光刻进行所述沉积步骤。
实施方式77：如实施方式31所述的方法，其中，利用蘸笔纳米光刻进行沉积步骤。
实施方式78：如实施方式31所述的方法，其中，同质性被提高从而使所扩增的细胞群的异质性水平为40％或更小。
实施方式79：如实施方式31所述的方法，其中，在至少24小时的培养测试中测定同质性或增殖性。
实施方式80：如实施方式31所述的方法，其中，在至少28天的培养测试中测定同质性或增殖性。
实施方式81：方法，所述方法包括：
在基材上提供多个离散的生物活性化合物场区，
在包含多个离散场区的所述基材上培养至少一种细胞直至产生扩增的细胞群，
其中与在没有所述离散场区的基材上的培养相比，所述离散场区提高了所述细胞群的同质性或增殖性。
实施方式82：如实施方式81所述的方法，其中利用纳米光刻进行所述提供步骤。
实施方式83：如实施方式81所述的方法，其中，所述提供步骤包括蘸笔纳米光刻。
实施方式84：如实施方式81所述的方法，其中，所述提供步骤包括纳米压印光刻。
实施方式85：如实施方式81所述的方法，其中，所述提供步骤包括微接触印刷。
实施方式86：如实施方式81所述的方法，其中，所述提供步骤包括电子束光刻。
实施方式87：如实施方式81所述的方法，其中，所述提供步骤包括扫描探针设备的使用。
实施方式88：如实施方式81所述的方法，其中，所述提供步骤包括原子力显微镜的使用。
实施方式89：如实施方式81所述的方法，其中，所述离散场区以基本恒定的间距分隔。
实施方式
实施方式90：如实施方式81所述的方法，其中，利用包含所述生物活性化合物的墨组合物进行所述提供步骤。
实施方式91：方法，所述方法包括：
利用针尖将至少一种生物活性化合物沉积在基材上以在所述基材上形成多个离散的生物活性化合物场区，
在包含多个离散场区的基材上培养至少一种细胞直至产生分化的细胞群，
其中与在没有所述离散场区的基材上的培养相比，所述离散场区提高了所述细胞群的同质性或增殖性。
实施方式92：用于培养细胞的器件，其包括：
基材，
在所述基材上的多个生物活性分子场区，
所述场区间的不含所述生物活性分子的区，
其中，与在没有场区生物活性分子的表面上培养的细胞群相比，在所述器件上培养的细胞群更同质或增殖性更高。
实施方式93：如实施方式92所述的器件，其中，与生物活性分子场区的接触诱导了所述细胞群的分化。
实施方式94：如实施方式92所述的器件，其中，与生物活性分子场区的接触不诱导所述细胞群的分化。
实施方式95：如实施方式92所述的器件，其中，与所述场区的接触诱导分化成终末分化的骨原细胞、神经原细胞、脂肪原细胞、软骨原细胞或肌原细胞。
实施方式96：包含实施方式92的器件的试剂盒。
实施方式97：如实施方式96的试剂盒，其中所述试剂盒包含所述器件的使用说明。
本申请的该部分包含97个实施方式。
在以下实验方案和结果部分将对本发明材料的制造和使用作进一步描述。
实验方案和结果
1.研究1
以下研究比较了本发明材料对生物细胞的影响和现有技术材料对生物细胞的影响。结果表明，在本发明的细胞培养材料上培养的细胞群的同质性水平远大于在现有技术的材料上培养的细胞群的同质性(并由此具有较小的异质性)。
方案
制备现有技术的细胞培养材料
利用之前公开的方法制备了包含羧基、氨基或羟基官能团的现有技术材料。
简而言之，将盖玻片浸渍在5％NaOH溶液中1小时，然后浸渍在浓HNO3中1小时。然后在超纯水和100％乙醇中洗涤盖玻片，干燥并在结合所需的生物活性官能团之前在真空下储存。
通过将清洁的盖玻片浸渍在二甲基二氯硅烷中15秒后用甲苯和随后的乙醇洗涤来制备包含甲基基团的现有技术材料。然后干燥所洗涤的盖玻片并在真空下储存直至使用。
通过将清洁的盖玻片浸渍在0.5％3-氨基丙基三甲氧基硅烷异丙基醇溶液中，然后浸渍在水中并回流30分钟制备包含氨基基团的现有技术材料。然后利用水洗涤盖玻片，随后用乙醇洗涤，干燥并在真空下储存直至使用。
通过首先利用上文描述的方法用乙烯基三甲氧基-乙烯基硅烷涂覆盖玻片而制备包含羟基基团的现有技术材料。然后用1M硼烷-四氢呋喃溶液在氮气中处理乙烯基表面2小时。然后在用0.4％NaOH/30％H2O2溶液处理3分钟前在无水四氢呋喃中洗涤盖玻片。然后用超纯水洗涤盖玻片，随后用乙醇洗涤，干燥并在真空下储存直至使用。
制备本发明的材料
使用金基材和以下所述的官能团制备本发明的材料，即实验性细胞培养材料和能够抑制细胞生长的材料(所用试剂的详情列于附件1中)。
实验性细胞培养材料
通过羧基基团场区在间距为280nm的场区中的沉积，制备能够诱导软骨原细胞生长的实验性细胞培养材料。使羧基基团作为通过使用停留时间为0.1秒的蘸笔纳米光刻(DPN)技术施用的墨组分巯基棕榈酸(MHA)的一部分而沉积。各个场区均包含提供末端羧基基团的分子的直径为约65nm的“点”形的自组装面积。
通过甲基官能团在间距为280nm的场区内的沉积，制备能够支持干细胞和祖细胞生长而不诱导分化的本发明实验性细胞培养材料。使甲基官能团作为通过使用停留时间为0.1秒的DPN技术施用的墨组分十六烷硫醇(HDT)的一部分而沉积。各个场区均包含提供甲基(烷基链)基团的自组装分子的直径为约75nm的“点”形面积。
制备了包含以三种不同间距提供的氨基基团场区的本发明细胞培养材料。这样产生了间距分别为1000nm、280nm和140nm的三种材料。使氨基基团作为通过使用停留时间为0.2秒的DPN技术施用的墨组分11-氨基-1-十一烷基硫醇(AUT)的一部分而沉积。各个场区均包含提供末端氨基基团的自组装分子的直径为约65nm的“点”形面积。
还产生了不同间距的场区中包含羟基基团的细胞培养材料。制备了间距分别为1000nm、280nm和140nm的三种材料。使氨基基团作为通过使用停留时间为0.2秒的DPN技术施用的墨组分11-巯基-1-十一醇(MUOH)的一部分而沉积。各个场区均包含提供末端羟基基团的自组装分子的直径为约65nm的“点”形面积
通过使用停留时间为0.2秒的DPN技术沉积1-(巯基十一-11-基)六甘醇(6-PEG-OH)而产生间距不同的场区内包含聚亚乙基糖基的细胞培养材料。制备了间距分别为1000nm、280nm和140nm的三种材料。各个场区均包含提供羟基末端化的聚乙二醇基团分子的直径为约65nm的“点”形自组装面积。
用于抑制细胞生长的实验性材料
通过将羧基基团(作为通过DPN施用的墨组分MHA的一部分提供)沉积在间距为1000nm或140nm的场区内制备能够抑制细胞生长的材料。各个场区均包含提供羧基基团的分子的直径为约65nm的“点”形自组装面积。
通过将甲基官能团沉积在间距为1000nm或140nm的场区内制备能够抑制细胞生长的其它实验性材料。通过利用DPN施用墨组分HDT沉积甲基基团。各个场区均包含提供甲基为末端的烷基链分子的直径为约75nm的“点”形自组装面积。
细胞培养
利用FACS分析来表征可商购的源自骨髓的成人间充质干细胞。该表征表明，所述干细胞是CD90、CD173、CD29、CD44、STRO-1和CD105阳性的，CD34、CD24、CD14、CD19和CD3阴性的。然后以5x104细胞/ml(总)的接种密度将所表征的干细胞群接种在上述的本发明实验性材料上。在商业性确定的基础培养基存在下将所述细胞在所述材料上培养24小时。然后分析所培养细胞的细胞粘附、灶性接触形成、细胞骨架组分的形成和整体形态学。
细胞组分的可视化
通过荧光显微镜使在以上列出的方案中的现有技术材料上培养的细胞组分可视化。利用绿色荧光团标记细胞骨架的主要组分F-肌动蛋白，利用蓝色的细胞核染料赫斯特(Hoechst)使细胞核可视化，利用红色荧光团标记与表型相关的蛋白。对于所选择的用于研究的与表型相关的蛋白，在包含甲基基团的现有技术材料上培养的细胞中是STRO1(干细胞标记物)或者核干细胞因子(干细胞增殖的标记物)，在包含氨基基团的现有技术材料上培养的细胞中是CBFA1(骨原细胞分化的标记物)，在包含羟基基团的现有技术材料上培养的细胞中是II型胶原(软骨原细胞分化或活性软骨细胞的标记物)。
还通过荧光显微镜使在以上列出的方案中的本发明材料上培养的细胞组分可视化。对于在各实验性细胞培养材料上培养的细胞使用相同的标记物和荧光标记，即利用红色荧光团标记粘着斑蛋白(灶性粘附的主要成分)，利用绿色荧光团标记F-肌动蛋白(细胞骨架的主要成分)，利用蓝色细胞核染料赫斯特使细胞核可视化。
结果
这些研究的结果示于图4和5中，这些图为例示以上列出的各种细胞成分的共定位的代表图，并且在下文将对其作更详细的描述。图4例示了在现有技术材料上培养的细胞，而图5例示了在本发明细胞培养材料上培养的细胞。
在包括羧基基团的本发明培养材料上培养的细胞中的标记
粘附在包含羧基基团的细胞培养材料表面的细胞为小的细胞团的形式。这些细胞团包含明确确定的单个细胞，具有在单个细胞内排列的单个应力纤维的证据。所粘附的细胞在所述材料表面上铺开，并显示细胞至细胞的排列。灶性接触在整个细胞体都是明显的。这些灶性接触与应力纤维和应力纤维末端一致排列，其中细胞体的最远突出与所述细胞培养材料的表面接触。
单细胞内的肌动蛋白具有“环/晕轮”形成，并且细胞间具有肌动蛋白排列的证据。
这些结果表明，包含羧基基团的细胞培养材料将促进干细胞的软骨原细胞分化，而不需要外源的生物刺激。
在包含甲基基团的现有技术材料上培养的细胞中的标记
在包含甲基基团的现有技术材料上培养的细胞群的干细胞标记物STRO1或干细胞增殖标记物核干细胞因子(nucleostemmin)均为异质的。这些结果表明，在这些材料上培养的一部分干细胞分化(并由此丢失了其干细胞状态)和/或丧失了增殖能力。
在包含甲基基团的本发明细胞培养材料上培养的细胞中的标记
粘附于包含甲基基团的本发明细胞培养材料上的细胞为细胞团的形式，其中的单个细胞显示完整的细胞骨架网络和良好的灶性接触形成。
细胞团内的每个细胞都是有核的，并且在细胞团与本发明材料相互作用的各个点，灶性接触存在于整个细胞团。这些灶性接触看起来负责细胞团与材料表面的结合。细胞团内单个细胞的形状表明各个细胞与下面的表面很好的结合。
纤维性细胞骨架网络遍及整个细胞，并且单个应力纤维在各个单个细胞中被清楚确定。
在包含氨基的现有技术材料上培养的细胞中的染色
发现在包含氨基的现有技术材料上培养的细胞显示的骨原细胞标记物CBFA1的表达不一致。总细胞数的10％-20％对于该标记物是阴性的。这说明在现有技术材料上培养的干细胞被不完全地诱导沿着骨原细胞谱系分化，并且这种培养后形成的细胞群异质性程度高。
在包含氨基基团的本发明细胞培养材料上培养的细胞中的标记
与所产生的各个实验性细胞培养材料(包含以140nm、180nm或1000nm的间距提供的氨基基团)结合的细胞显示形成的灶性接触大量增加，并且存在排布非常好的遍及细胞体的应力纤维。粘附至这些材料上的细胞不成团，并且细胞核的分布证明单独的细胞被很好的分布并结合在所述材料表面。这些材料显示了影响细胞定向并由此影响骨原细胞、神经原细胞和肌原细胞分化的潜能。为了有利于这些通路之一并增强总分化反应的动力学，可以对场区的间距进行控制。
对于所有间距，细胞都作为与下面表面直接接触的单个细胞而被结合。对于所结合的每个细胞，一个细胞核是明显的，并且铺展的细胞具有清楚确定的遍及细胞体的单应力纤维。与单应力纤维紧密结合的全部细胞体和在细胞的最远突出与表面的相互作用点的细胞体的外围，灶性接触很丰富。间距为280nm的细胞显示向优先方向排列的迹象，但整体形态学仍与所有NH2修饰的描述相同。
在包含羟基基团的现有技术材料上培养的细胞中的标记
在包含羟基的现有技术材料上培养的干细胞产生的细胞群中多数细胞都为软骨原细胞标记物II型胶原阳性，但高达40％的细胞不显示该标记物。因此，可以看出包含羟基基团的现有技术材料在促进软骨原细胞分化中的功效非常低，并且产生了高度异质的细胞群。
在包含羟基基团的本发明细胞培养材料上培养的细胞中的标记
对以所有间距结合至包含羟基基团的本发明细胞培养材料的细胞进行了研究。所粘附的细胞显示的灶性接触形成的证据最少，但在整个细胞体具有形成良好细胞骨架的证据。这些结果表明，具有形成的灶性接触最少的细胞结合可能主要由本发明材料中存在的羟基基团介导，并且场区的间距的变化进一步控制了细胞的整体形态学/定向。包含羟基基团的本发明材料将支持细胞粘附，将影响分化并在没有外源性生物刺激的情况下诱导软骨原细胞、脂肪原细胞、骨原细胞或神经原细胞分化。这些反应的效率可以由场区的间距控制。
在所有间距形成灶性接触的证据都最少，但在所有间距全部细胞体都很好地形成了F-肌动蛋白细胞骨架组分。粘附至140nm或1000nm间距的材料上的细胞显示细胞体的某些部分内F-肌动蛋白组分的浓度和“出芽(budding)”清楚证据。出芽表示为在细胞外围形成了晕环样结构的应力纤维和在整个细胞体内平行分布的清楚确定的应力纤维的丧失。所述细胞是单个的、被结合的且没有形成之前在HDT表面上所描述的团状形态学。在间距为280nm的包含该官能团的材料上的细胞数最多。在这些表面上培养的细胞没有显示之前所述的“出芽”现象的任何迹象。
在包含PEG的本发明细胞培养材料上培养的细胞中的标记
在这些表面形成灶性接触的证据非常小，但多于OH表面。良好平行的肌动蛋白应力纤维在280nm和1μm间距上是明显的。形成的应力纤维主要定位于140nm间距的细胞体的外围，但应力纤维在这些区仍然是纤维。在所有间距上，细胞都不成团但都粘附。在280nm和1μm间距上(在某点结合的2个单个细胞)利用单个应力纤维的灶性接触更明显。
抑制细胞生长的本发明材料
在本发明的用于抑制细胞生长的实验性材料上没有细胞粘附或生长(结果未显示)。
2.研究2
将商购的源自骨髓的人间充质干细胞和主要源自人血液和牙髓的干细胞培养在本发明的细胞培养材料上。所述细胞培养材料以不同的间距包含多种不同的生物活性官能团。
将细胞在基础培养基中体外培养最高达28天的不同时间，并分析多种标记物的表达。所研究的标记物选自以下组：I型胶原、II型胶原、X型胶原、骨钙素CBFA1、STRO-1、核干细胞因子(nucleostemin)、微管蛋白β-III、MAP-2、神经丝蛋白CD90、突触素和平滑肌肌动蛋白。除了这些标记物外，研究了用来自以下组的色泽染色剂(tinctural stain)染色的细胞群：von-Kossa(钙化的细胞外基质)、油红O(脂肪组织)和氨基聚糖(glycosammino-glycan)(GAG软骨源性细胞外基质)。
所选择的标记物和染色剂可以评价和分析在所述多种细胞培养材料上培养的细胞的分化能力。
利用蛋白印记、ELISA和实时PCR进一步证明和量化了与干细胞的分化能力直接相关的蛋白的产生。可以从以上列出的标记物中选择用于实时PCR的标记物组，还包括骨桥蛋白、Sox-9、骨连接蛋白、CHOP(同源蛋白)、脂联素和PPAR-γ。
此外，通过培养源自牙髓的干细胞和商购的源自骨髓的人间充质干细胞并用OCT4、SOX2(与胚胎干细胞的可塑性相关但与成人无关的标记物，牙髓源表达)和STRO-1(由成人和胚胎干细胞表达)进行横切片，而进一步验证基础条件下经过28天的体外测试期本发明细胞培养材料诱导/维持干细胞表型的能力。对本发明的细胞培养材料对这些标记物的表达的影响进行监测，这将提供关于不同组合的官能团和间距诱导干细胞表型、维持所选择可塑性水平的能力的信息，还提供关于任何分化反应发生的效率和同质性质的信息。转染的细胞可以是GFP标记，从而使其被给定时间点的蛋白产物的特异标记物复染色。
附件1
DPN材料的技术数据：
烷基功能性：
HDT 1-十六烷硫醇674514-500MG[2917-26-2](ODT的更易挥发的变体)CH3(CH2)15SH
折射指标
n20/D 1.462(lit.)
bp：
184-191℃/7mmHg(lit.)
mp：
18-20℃(lit.)，20-24℃
密度
0.84g/mL，25℃(lit.)
ODT 1-十八硫醇01858-10OML[2885-00-9]
CH3(CH2)17SH
试验
98％
bp
204-210℃/11mmHg(lit.)
mp
30-33℃(lit.)
密度
0.847g/mL，25℃(lit.)
OH功能性：
OH 1-巯基-1-十一醇674249-250MG[73768-94-2]
HS(CH2)11OH
试验
99％
mp
33-37℃(lit.)
氨基功能性：
NH 3 ：11-氨基-1-十一烷硫醇HCl盐674367[143339-58-6]
性质
试验
99％
mp
120-170℃
酸性功能性：
MHA：16-巯基棕榈酸674435[69839-68-5]
试验
99％
mp
65-69℃
PEG功能性：
PEG-P：(PEG passifier)1-(巯基十一-11-基)六甘醇675105[130727-44-5
折射指标
n20/D 1.474
Figure BPA00001329244800381
密度
1.0154g/mL，25℃
PEG-SC：(用于干细胞的PEG-点)(11-巯基十一烷基)三(甘醇)673110[130727-41-2]
试验
95％
折射指标
Figure BPA00001329244800382
n20/D 1.476
密度
0 995g/mL，25℃
此外，还使用数个其它专用分子，例如硫辛酸外，PEG修饰的可变链/PEG长度。

Claims (53)

1.细胞培养材料，其包含结合有多个生物活性官能团场区的基材，其中所述生物活性官能团场区被基本不含所述生物活性官能团的基材区彼此分隔，其中所述场区和所述基材区限定了域，在所述域中所述生物活性官能团场区的间距基本是恒定的。
2.如权利要求1所述的材料，其中所述生物活性官能团选自由以下组成的组：甲基基团；异丙基基团；环己基基团；芳基基团；烯丙基基团；炔基基团；羟基(醇)基团；醚基团；吗啉代基团；亚乙基糖基；聚亚乙基糖基；单糖，例如葡萄糖、核糖、heparose或甘露糖；羧酸酯基团；硫酸酯基团；磷酸酯基团；苯氧基基团；氨基基团；二烷基氨基基团；烷基氨基基团；膦基团；和氨基酸。
3.如权利要求1所述的材料，其中所述生物活性官能团场区间的间距为约75nm-2000nm。
4.如权利要求3所述的材料，其中所述生物活性官能团场区间的间距为约140nm-1000nm。
5.如权利要求1所述的材料，其中所述基材选自由以下组成的组：硅石；玻璃；硝化纤维素；聚己酸内酯(PCL)；聚乳酸(PLLA)；聚乙醇酸(PGA)；聚氨酯；羟基磷灰石；磷酸三钙；钛；钛合金；形状记忆合金和不锈钢。
6.用于抑制生物细胞粘附的材料，其中所述材料包含结合有多个生物活性官能团场区的基材，其中所述生物活性官能团场区被基本不含所述生物活性官能团的基材区彼此分隔。
7.如权利要求1-6中任一项所述的材料，其用作药物。
8.用于扩增干细胞群或祖细胞群的细胞培养材料，其中所述材料包含结合有多个包含甲基官能团的场区的基材，其中所述甲基官能团场区被基本不含甲基官能团的基材区彼此分隔，并且其中场区间的间距为约200nm-750nm。
9.如权利要求8所述的细胞培养材料，其中所述场区间间距为约280nm。
10.用于生产软骨原细胞的细胞培养材料，其中所述材料包含结合有多个生物活性官能团场区的基材，所述生物活性官能团选自由羧基基团、甲基基团和羟基基团组成的组，其中所述生物活性官能团场区被基本不含所述生物活性官能团的基材区彼此分隔。
11.用于生产骨原细胞的细胞培养材料，其中所述材料包含结合有多个生物活性官能团场区的基材，所述生物活性官能团选自由氨基基团和羧基基团组成的组，其中所述生物活性官能团场区被基本不含所述生物活性官能团的基材区彼此分隔。
12.用于生产神经原细胞的细胞培养材料，其中所述材料包含结合有多个生物活性官能团场区的基材，所述生物活性官能团选自由氨基基团和羟基基团组成的组，其中所述生物活性官能团场区被基本不含所述生物活性官能团的基材区彼此分隔。
13.用于生产肌原细胞的细胞培养材料，其中所述材料包含结合有多个氨基基团场区的基材，其中所述氨基基团场区被基本不含氨基基团的基材区彼此分隔。
14.用于生产脂肪原细胞的细胞培养材料，其中所述材料包含结合有多个羟基基团场区的基材，其中所述羟基基团场区被基本不含羟基基团的基材区彼此分隔。
15.如权利要求6-14中任一项所述的材料，其中场区和基材区限定了域，在所述域中所述生物活性官能团场区的间距基本是恒定的。
16.如权利要求1-15中任一项所述的细胞培养材料，其中所述生物活性官能团是分离的官能团。
17.权利要求1-16中任一项所述的材料的制造方法，所述方法包括在基材上沉积多个生物活性官能团以产生多个生物活性官能团场区，其中所述生物活性官能团场区经排列使其被基本不含所述生物活性官能团的基材区彼此分隔。
18.如权利要求17所述的方法，其中所沉积的场区和基材区限定了域，在所述域中所述生物活性官能团场区的间距基本是恒定的。
19.如权利要求17或18所述的方法，其中利用纳米光刻技术沉积所述生物活性官能团。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述纳米光刻技术选自由以下组成的组：蘸笔纳米光刻、纳米压印光刻、直接的原子力显微镜、蚀刻掠射角沉积、激光切除、激光沉积、x-射线光刻母板的再铸模、微接触印刷和蚀刻电子束直写光刻。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述纳米光刻技术包括蘸笔纳米光刻。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述生物活性官能团以墨组分的形式被沉积。
23.扩增干细胞群或祖细胞群的方法，所述方法包括使干细胞或祖细胞与权利要求8所述的细胞培养材料接触，并培养所述细胞直至产生扩增的细胞群。
24.产生软骨原细胞的方法，所述方法包括使干细胞或祖细胞与权利要求10所述的细胞培养材料接触，并培养所述细胞直至产生软骨原细胞。
25.产生骨原细胞的方法，所述方法包括使干细胞或祖细胞与权利要求11所述的细胞培养材料接触，并培养所述细胞直至产生骨原细胞。
26.产生神经原细胞的方法，所述方法包括使干细胞或祖细胞与权利要求12所述的细胞培养材料接触，并培养所述细胞直至产生神经原细胞。
27.产生肌原细胞的方法，所述方法包括使干细胞或祖细胞与权利要求13所述的细胞培养材料接触，并培养所述细胞直至产生肌原细胞。
28.产生脂肪原细胞的方法，所述方法包括使干细胞或祖细胞与权利要求14所述的细胞培养材料接触，并培养所述细胞直至产生脂肪原细胞。
29.方法，包括蘸笔纳米光刻印刷基材，然后提高所述基材上的至少一种细胞的生长。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述细胞是干细胞，所述提高是提高干细胞分化或提高干细胞群或祖细胞群的扩增。
31.方法，包括：
利用针尖将至少一种生物活性化合物沉积在基材上以在所述基材上形成多个离散的生物活性化合物场区，
在包含所述多个离散场区的基材上培养至少一种细胞直至产生扩增的细胞群，
其中与在没有所述离散场区的基材上的培养相比，所述离散场区提高了所述细胞群的同质性或增殖性。
32.如权利要求31所述的方法，其中没有所述离散场区的所述基材包含含有至少一种所述生物活性化合物的基本同质的表面。
33.如权利要求31所述的方法，其中所述离散场区提高了所述细胞群的同质性。
34.如权利要求31所述的方法，其中所述培养是体内或体外培养。
35.如权利要求31所述的方法，其中所述培养诱导所述细胞的分化。
36.如权利要求31所述的方法，其中所述培养不诱导所述细胞的分化。
37.如权利要求31所述的方法，其中所述细胞是干细胞或祖细胞。
38.如权利要求31所述的方法，其中包含所述多个离散场区的基材包括75nm-2000nm的场区间间距。
39.如权利要求31所述的方法，其中包含所述多个离散场区的基材包括140nm-1000nm的间距。
40.如权利要求31所述的方法，其中所述基材包含形成域的多个离散场区，并且所述域包含基本恒定的间距。
41.如权利要求31所述的方法，其中所述离散场区的至少一个维度小于100nm，并且其中所述离散场区是平均直径小于100nm的点。
42.如权利要求31所述的方法，其中所述基材是二维或三维基材。
43.如权利要求31所述的方法，其中所述离散场区具有点的形状。
44.如权利要求31所述的方法，其中所述生物活性化合物包含至少一个分离的生物活性基团。
45.如权利要求31所述的方法，其中所述针尖是扫描探针针尖。
46.如权利要求31所述的方法，其中所述沉积步骤是利用纳米光刻进行的。
47.如权利要求31所述的方法，其中所述沉积步骤利用蘸笔纳米光刻进行。
48.如权利要求31所述的方法，其中提高同质性，使得所扩增的细胞群的异质性水平为40％或更小。
49.如权利要求31所述的方法，其中在至少24小时的培养测试中测定同质性或增殖性，或者其中在至少28天的培养测试中测定同质性或增殖性。
50.方法，包括：
在基材上提供多个离散的生物活性化合物场区，
在包含所述多个离散场区的所述基材上培养至少一种细胞直至产生扩增的细胞群，
其中与在没有所述离散场区的基材上的培养相比，所述离散场区提高了所述细胞群的同质性或增殖性。
51.方法，包括：
利用针尖在基材上沉积至少一种生物活性化合物，以在所述基材上形成多个离散的生物活性化合物场区，
在包含所述多个离散场区的所述基材上培养至少一种细胞直至产生分化的细胞群，
其中与在没有所述离散场区的基材上的培养相比，所述离散场区提高了所述细胞群的同质性或增殖性。
52.用于培养细胞的器件，其包括：
基材，
在所述基材上的多个生物活性分子场区，
在所述场区间不含所述生物活性分子的区，
其中与在没有场区生物活性分子的表面上培养的细胞群相比，在所述器件上培养的细胞群更同质或增殖性更高。
53.试剂盒，其包含权利要求52所述的器件。
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