CN107267387B - 一种可定位操控与电位测量功能化细胞培养基底及制备方法和应用 - Google Patents

一种可定位操控与电位测量功能化细胞培养基底及制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种可定位操控与电位测量功能化细胞培养基底及制备方法和应用，基底表面为多周期性孔型团簇，团簇为微米级周期性孔阵结构，即一级孔阵，团簇中存在纳米级周期性孔阵结构，即二级孔阵，制备该基底的方法采用六光束激光干涉光刻制造；在该基底的每个团簇中滴入表面修饰材料并置于培养液中，细胞将集中在一级孔阵团簇中生长，实现单细胞定位生长；二级孔阵可以控制细胞与基底接触面积，实现基底对粘附性的调控；团簇与二级孔阵间的金膜还可导出细胞的电位。这种由六光束激光干涉光刻制造的可定位操控与电位测量功能化细胞培养基底可用于细胞有序生长、调节粘附力、观测细胞形貌以及药物筛选等。

Description

一种可定位操控与电位测量功能化细胞培养基底及制备方法 和应用
技术领域
本发明属于图案化细胞培养基底制造领域，具体涉及一种可定位操控与电位测量功能化细胞培养基底及制备方法和应用。
背景技术
细胞与材料相互作用是生物材料领域的重大基本科学问题。20世纪70年代，用于生物分子和细胞的图案化技术已开始出现。人们发现基底的形貌和物理性质会对细胞的功能产生很大的影响，例如周期型结构图案可以调节细胞对基底的粘附性。而且大部分高等动物细胞(除血球细胞等少数几种细胞)都是贴壁生长的，这为图案化技术在生物学领域的应用奠定了基础。随着原子力显微镜的发展，人们对细胞操纵的技术越来越成熟，图案化能将细胞精确定位在表面，进行更精准的测量。而且这也在很大程度上促进细胞传感器和分子传感器的发展。
金的单质在室温下为固体，密度高、柔软、光亮、抗腐蚀。常温下金有十分高的电传导性，所以被用作含高电流的电线(虽然以相同容量计算银比金有更高的电传导性，但金有抗侵蚀的优点)。金属状态的金对所有体内的化学反应呈现惰性反应，因此金也是良好的生物相容性材料，细胞可以在金上面生长。金是常用作细胞电信号测量的传导材料，它能准确传输受刺激细胞膜电位的变化并且没有毒性，如应用于微电极阵列，膜片钳等。
目前，制备功能化细胞培养基底方法主要有表面修饰方法、电化学法、自组装法、激光干涉光刻法等。表面修饰方法虽然应用比较广泛，但设备比较昂贵。电化学法和自组装法虽然价格相对有优势，但工艺复杂，不适合工业化生产。
发明内容
本发明的技术解决问题：克服现有技术的不足，提供一种可定位操控与电位测量功能化细胞培养基底及制备方法和应用，具有可定位操控与电位测量功能化细胞培养基底，且工艺简单，价格低廉，灵活性高，制备单个基底的耗时短，利用激光干涉光刻方法制备的基底适合产业化。
本发明技术解决方案：一种可定位操控与电位测量功能化细胞培养基底，所述基底表面是多周期性孔型团簇图案，团簇图案为微米级周期性孔阵结构，即一级孔阵，团簇中存在纳米级周期性孔阵结构，即二级孔阵，该图案结构由六光束激光干涉系统制备获得。一级孔阵和二级孔阵周期性结构之间互不相接；一级孔阵中每个团簇直径为3μm至20μm，根据细胞具体尺寸确定团簇直径，即大于一个待测细胞的直径大小，小于两个待测细胞直径的大小，保证每个团簇中只生长一个细胞。
应用时，可定位操控与电位测量方法为：在一级孔阵中滴入表面修饰材料，并将其置于含有细胞的培养液中，表面修饰材料将引导细胞在一级孔阵中定位生长；二级孔阵中金膜和石英基底的交替结构以及孔阵间的凸起能够改变细胞在该培养基底上的形貌，即改变细胞与基底接触面积，从而实现基底对细胞的粘附性的调控，实现操纵细胞转动、平移；利用AFM(原子力显微镜)探针在该可定位操控与电位测量功能化培养基底上对细胞进行定位操控，全面观察细胞在外界不同刺激时的形貌变化；当可兴奋细胞受到外界刺激时，产生的电位可由团簇及孔阵间连接的金膜作为导电电极导出，实现探测单个可兴奋细胞受不同种刺激时产生的电流大小。
利用六光束激光干涉光刻方法制备该可定位操控与电位测量功能化细胞培养基底时，采用短波长、能量调控的曝光方式对镀过膜后的基底进行直接激光干涉光刻以达到减小二级孔阵中纳米孔的直径目的，保证二级孔阵中纳米孔之间彼此分离，实现二级孔阵对细胞粘附调节的功能。
在绝缘的石英片上镀10nm的钛膜作为粘合层，在钛膜上镀50nm-200nm的金膜，钛膜和金膜同时被打穿，露出石英基底，二级孔阵之间仍然由钛膜上面镀金膜的双层金属膜连接，一级孔阵之间也由钛膜上面镀金膜的双层金属膜连接。
该可定位操控与电位测量功能化培养基底制备工艺如下：
(1)基底清洗与镀膜
将表面积为1cm2的石英片依次置入丙酮、酒精、去离子水中各超声清洗5min，将清洗过的石英片放入等离子体溅射镀膜机中，依次镀钛膜和金膜，并将基底放于热板上热烘坚膜。
(2)激光干涉光刻法制备多周期性孔型团簇图案
利用波长为1064nm的大功率固体激光器作为相干光源，搭建六光束干涉系统。六光束干涉系统由分光系统和光束整形系统组成。六束相干光中三束光为一组，分布在两个互相垂直的入射面内，让这六束光以一定的入射角(四束相同入射角光束的入射角为7°，两束相同入射角光束的入射角为9°)，一定的方位角(两个互相垂直的入射面的空间角分别为0°和90°)同时照射到样品基底上，在样品基底表面的中心重合(制备基底时，六束光在基底表面的中心重合)。两个入射面内的光束偏振角分别为60°和90°。采用短波长即波长在355nm-1064nm范围，能量调控的方式即在激光器控制软件中调整激光器出光能量，并利用偏振片改变干涉光能量，可以改变曝光时的能量阈值，从而调控二级孔阵深度和二级孔阵占空比，进行对基底进行直接干涉光刻。
本发明与现有技术相比优点在于：
(1)本发明的可定位操控与电位测量功能化细胞培养基底可实现细胞沿其表面的周期性孔型团簇图案化生长，且二级孔阵结构能够调节基底对细胞的粘附性，利用AFM(原子力显微镜)探针可在该可定位操控与电位测量功能化培养基底上对细胞进行定位操控，能够全面观察细胞在外界不同刺激时的形貌变化；当可兴奋细胞受到外界刺激时，产生的电位可由团簇及孔阵间连接的金膜作为导电电极导出，实现探测单个可兴奋细胞受不同种刺激时产生的电流大小。
(2)由于金-钛，钛-石英的结合能力大于金-石英结合能力，在金膜与石英基底之间镀一层钛膜作为粘合层会提高金膜与基底的结合能力，使金膜在制备该可定位操控与电位测量功能化细胞培养基底的过程中不易脱落；且10nm的钛膜会随着金膜一起图案化，不会残留在团簇与二级孔阵底部。
(3)调整入射角，方位角可以获得不同团簇周期和二级孔阵周期；调整曝光能量可以控制结构深度。使得该可定位操控与电位测量功能化细胞培养基底从图案尺寸到图案深度皆可调节。采用能量调控的曝光方式可以让团簇中纳米级孔阵直径减小，实现孔阵基底对细胞的粘附调节；两个面内的光束偏振角分别为60°和90°可以使两个团簇间互不相接，实现细胞定位生长。
(4)制备工艺简单，制作一个功能化培养基底的时间短，调整好直接激光干涉光刻方法的曝光参数，可以控制在1s左右即可制备一片有多周期性孔型团簇图案的功能化培养基底，其制备方法具有工艺简单、操作方便、制造单个基底耗时短等优点，适合于规模化生产。
(5)本发明可定位操控与电位测量功能化细胞培养基底在细胞电特性测量、细胞操纵、细胞定位生长等方面有重要应用。
附图说明
图1为本发明中六光束干涉的光路示意图，图中M1-M5为高反射镜，B1-B5为分光镜，H为半波片，P为偏振片，L为样品台，C为半波片与偏振片的中心，O为基底中心即六束光相交位置；
图2为本发明基底中的多周期性孔型团簇图案，图2中A区域，为金膜上孔型团簇形貌；二级孔阵如图2中B位置，为团簇中周期性孔阵结构，孔的中心露出石英基底；
图3为本发明的可定位操控与电位测量功能化细胞培养基底截面示意图；
图4为细胞在本发明的可定位操控与电位测量功能化细胞培养基底上的图案化生长示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步说明本发明。
本发明一种可定位操控与电位测量功能化细胞培养基底，团簇图案为微米级周期性孔阵结构，即一级孔阵，团簇中存在纳米级周期性孔阵结构，即二级孔阵；在一级孔阵团簇中滴入表面修饰材料，并将其置于含有细胞的培养液中，表面修饰材料将引导细胞在一级孔阵中定位生长；二级孔阵中金膜和石英基底的交替结构以及孔阵间的凸起能够改变细胞在该培养基底上的形貌，即改变细胞与基底接触面积，从而实现基底对细胞的粘附性的调控，实现操纵细胞转动、平移。
下面进行详细说明。
(1)基底的清洗与镀膜
将表面积为1cm2的石英片依次置于丙酮、酒精、去离子水中超声清洗各5min，取出并用氮气吹干。将清洗过的石英片放入等离子体溅射镀膜机中，依次镀10nm的钛膜和80nm的金膜(根据需要选择厚度)，后将底膜后的基底置于温度为100℃的热板上，镀膜一面向上，热烘60min坚膜。
(2)直接激光干涉光刻法制备多周期性孔型团簇图案
按照实际需要确定多周期性孔型团簇图案的团簇周期、二级孔阵深度、二级孔阵周期，根据多光束干涉原理设计好光路入射角、空间角，然后进行光路搭建。
如图1所示，六光束干涉系统由分光系统和光束整形系统组成。五个分光镜M1-M5组成分光系统，将波长为1064nm的固体激光器发出的一束光分成六束相干光束，并将其中一束光3以设计好的入射角和空间角直接投射到样品台L的中心；接着用B1-B5五个高反射镜将其余五束相干光以设计好的入射角和空间角投射到样品台中心，使六束光在样品台中心重合如图1中O点。图1中光束2、4、6在同一个入射面内，光束1、3、5在同一个入射面内，两个入射面互相垂直。光束2与光束4有相同的空间角为90°，不同的入射角，光束4和光束6有相同的入射角，空间角相差180°；光束1与光束3有相同的空间角为0°，不同的入射角，光束3和光束5有相同的入射角，空间角相差180°。光束3、光束4、光束5和光束6有相同的入射角为7°；光束1和光束2有相同的入射角为9°。按照上述关系搭好光路后，调整光路准直，将6组组合到一起的半波片H与偏振片P安装到距离样品台相同距离的光路上，光路通过半波片和偏振片的中心，如图1中C点，两个面内的光束偏振角分别为60°和90°即光束1、3、5的偏振角为60°，光束2、4、6的偏振角为90°。搭建好光路后，根据所需结构深度和占空比在激光器软件中调整激光器出光能量、出光脉冲数，采用短波长1064nm，能量调控的方式进行曝光，即在激光器控制软件中调整激光器出光能量并利用偏振片改变干涉光能量可以改变曝光时的能量阈值，从而调控结构深度制备周期性孔阵团簇图案，多周期性孔型团簇图案如图2所示，一级孔阵如图2中A区域，为金膜上周期性孔型团簇形貌；二级孔阵如图2中B位置，为团簇中周期性孔阵结构，孔的中心露出石英基底。制备得到的可定位操控与电位测量功能化细胞培养基底如图3所示。
利用定位系统与位移平台，可将表面修饰材料滴入团簇中，后将该可定位操控与电位测量功能化细胞培养基底置于含有细胞的培养液中。表面修饰材料将引导细胞按照团簇的分布形成周期性图案，如图4所示。多周期性孔型团簇图案如图2所示，一级孔阵如图2中A区域，为金膜上孔型团簇形貌；二级孔阵如图2中B位置，为团簇中周期性孔阵结构，孔的中心露出石英基底，每个团簇内只生长一个细胞，且团簇中的二级孔阵会使细胞与基底接触面积和粘附力可调，更易于探针操纵细胞转动与平移。将表面长有细胞的该可定位操控与电位测量功能化细胞培养基底置于AFM(原子力显微镜)下，给细胞一定刺激，操纵探针可将该定位操控与电位测量功能化细胞培养基底上的细胞转动，并推动至其他位置并且避免细胞膜受损，全面观察细胞受刺激后的形貌变化。当待测细胞为可兴奋细胞时，可以用探针给细胞施予力的刺激或者给细胞添加药物刺激，可兴奋细胞受刺激后产生的电信号将由该可定位操控与电位测量功能化细胞培养基底表面的金膜导出，由探测器接收。
产品特性：产品制造工艺简单，价格低廉，用途广泛。可定位操控与电位测量功能化细胞培养基底由六光束直接激光干涉光刻技术制备一次成型，具有良好的生物相容性。在团簇内滴入表面修饰材料后，细胞可以按照团簇周期性排列，便于实验观察和分区培养不同细胞。二级孔阵能改变细胞在基底上的形貌，改变细胞膜与基底接触面积，实现调节基底对细胞粘附性的调节，易于AFM(原子力显微镜)探针对细胞进行操纵。良导体金膜还可传输可兴奋细胞受外界刺激产生的电信号，因此该可定位操控与电位测量功能化细胞培养基底可用于细胞图案化定位生长、全面形貌观测、电信号的测量、药物筛选与细胞损伤判定等方面。
上述描述的实施例并非限定本发明，任何本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，可做各种更动和润色，因此本发明的保护范围视权利要求范围所界定。

Claims (7)

1.一种可定位操控与电位测量功能化细胞培养基底，其特征在于：所述基底表面是多周期性孔型团簇，团簇为微米级周期性孔阵结构，每个团簇尺寸大于一个待测细胞的直径大小，小于两个待测细胞直径的大小，保证每个团簇中只生长一个细胞，构成一级孔阵，一级孔阵中存在纳米级周期性孔阵结构，构成二级孔阵，孔与孔互不相接；所述基底为石英基底，在石英基底上镀钛膜作为粘合层，在钛膜上镀金膜作为导电电极，钛膜和金膜共同形成双层金属膜，双层金属膜同时被打穿后，会露出石英基底；除二级孔阵的孔内为石英基底，其余部分皆覆盖该双层金属膜。
2.根据权利要求1所述的可定位操控与电位测量功能化细胞培养基底，其特征在于：所述一级孔阵中的每个团簇直径范围为3μm至20μm，根据细胞具体尺寸确定团簇直径，即大于一个待测细胞的直径大小，小于两个待测细胞直径的大小，保证每个团簇中只生长一个细胞。
3.根据权利要求1所述的可定位操控与电位测量功能化细胞培养基底，其特征在于：所述镀钛膜的厚度为10nm，在钛膜上镀金膜的厚度为50nm-200nm。
4.一种制备权利要求1-3任意之一所述的可定位操控与电位测量功能化细胞培养基底的方法，其特征在于步骤如下：
(1)将清洗过的基底放入等离子体溅射镀膜机中，依次镀钛膜和金膜，然后热烘坚膜；
(2)多周期性孔型团簇由六光束激光干涉系统制备获得，调整曝光剂量对基底进行直接激光干涉光刻获得多周期性孔型团簇的结构。
5.根据权利要求4所述的制备可定位操控与电位测量功能化细胞培养基底的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，采用短波长即波长在355nm-1064nm范围，能量调控的曝光方式，对镀过膜后的基底进行直接激光干涉光刻以改变二级孔阵占空比达到减小二级孔阵中纳米孔直径目的，保证二级孔阵中纳米孔之间彼此分离，实现二级孔阵对细胞粘附调节的功能。
6.根据权利要求4所述的制备可定位操控与电位测量功能化细胞培养基底的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，热烘坚膜的工艺为：置于100℃的热板上热烘60min坚膜。
7.一种权利要求1-3任意之一所述的可定位操控与电位测量功能化细胞培养基底的应用方法，其特征在于：所述基底表面的多周期性孔型团簇中，在一级孔阵中滴入表面修饰材料，并将表面修饰材料置于含有细胞的培养液中，表面修饰材料将引导细胞在一级孔阵中图案化定位生长；二级孔阵中金膜和石英基底的交替结构及孔阵间的凸起能够改变细胞在基底上的形貌，即改变细胞与基底接触面积，实现基底对细胞粘附性的调控，完成操纵细胞转动、平移；利用原子力显微镜AFM探针在基底上对细胞进行定位操控，全面观察细胞在外界不同刺激时的形貌变化，当可兴奋细胞受到外界刺激时，产生的电位由团簇及孔阵间连接的金膜作为导电电极导出，实现探测单个兴奋细胞受不同种刺激时产生的电流大小。
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