CN106103700A - 未分化性维持培养材料 - Google Patents

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Abstract

本发明提供不使用对成体干细胞的分化功能带来影响那样的DMSO等化学试剂等，代替以往所实施的冷冻保存方法，分化功能、细胞功能的劣化、对生存率的影响极其低的成体干细胞的培养方法(保存方法)。本发明提供以含有天然物来源的多糖类为特征的成体干细胞的未分化性维持培养材料以及分散该未分化性维持材料而成的培养液，成体干细胞漂浮于该培养液中而成的含有成体干细胞的培养液，使用该天然物来源的多糖类的间充质干细胞的培养方法。

Description

未分化性维持培养材料
技术领域
本发明涉及维持成体干细胞的未分化性同时培养该细胞的材料，详细地说，涉及含有天然物来源的多糖类的培养材料，其可以将间充质干细胞等成体干细胞在体外在例如治疗所需要的一定期间抑制其分化，保持使成体干细胞的增殖、分化活动停止了的状态(休眠状态)。
背景技术
间充质干细胞(MSC)是成骨细胞、脂肪细胞、肌细胞、软骨细胞、神经细胞、肝细胞等，被认为具有向属于间充质的细胞的分化能力的成体干细胞(也称为生体干细胞、组织干细胞)的一种，除了在进行组织的再构建、修复的再生医疗中的应用，例如，炎症、免疫抑制、组织修复、通过血管新生进行的血流的改善、抗老化(anti-aging)等治疗以外，期待着在以往没有治疗方法的疾病中的应用。
分化多能性的间充质干细胞不仅可以由患者本身的骨髓、脂肪组织、滑膜、牙槽骨、牙根膜等组织分离，而且可以由胎盘、脐带血、脐带的各种细胞等分离，因此间充质干细胞的利用在生命伦理方面的障碍低。此外，间充质干细胞被认为与ES细胞、iPS细胞相比癌化风险低，期待早期的临床应用。
在将间充质干细胞作为细胞组织药品、细胞组织医疗设备用于临床用途时，例如如果假定自体移植，则经过将细胞由患者的体内取出，在体外进行培养使其增殖，向患者进行自体移植这样的工序。此时，在培养期间、培养后的保存期间中，不变化为具有目标以外的特征的细胞，而确保返回至患者的细胞的有效性和安全性变得重要。然而，间充质干细胞易于发生分化、细胞老化，因此可举出其品质控制难的问题，细胞的品质管理存在大的课题。
在将间充质干细胞在体外进行培养时，关于其扩增促进，研究了各种扩增肽(专利文献1和专利文献2)。此外，报告了通过将特定的生长因子群与脂肪酸复合物添加至基础培养基，从而即使在无血清条件下也导致与血清培养基的情况同等以上的细胞增殖(专利文献3)。另一方面，已知间充质干细胞的分裂次数有限，依存于分裂次数而细胞的老化进展。对于间充质干细胞的有效性，即临床应用中的品质直到经过了何种程度的分裂增殖的细胞为止得到保证，现在还没有得到确定的认识。
因此，强烈要求由患者采集的间充质干细胞首先不使其品质劣化，在直至用于治疗的期间，高品质地保存。不限于间充质干细胞，作为细胞的保存方法，一般而言使用了在液氮温度下进行冷冻保存的方法。冷冻和解冻导致细胞的活性和功能损失，因此以在冷冻和解冻工艺中保护细胞的目的，将二甲亚砜(DMSO)等化学试剂添加至冷冻介质中。DMSO具有高的膜透过性，在细胞被冷冻的过程中使冰晶的形成降低，将膜损伤、细胞器的脱水等最小化(专利文献4)。
作为间充质干细胞的冷冻法以外的用于保存的途径，还考虑了不使其冷冻而进行通常的培养同时进行保存的方法。然而，这里成为问题的是，根据培养环境而可能产生的间充质干细胞的性质、特征的变化。
一般而言，已知在体内构成细胞的周围环境的细胞外基质对结缔组织细胞的分化状态带来化学影响和物理影响，报告了对间充质干细胞的分化的谱系决定也带来影响。
研究了例如通过在以类似体内的生物环境的方式控制了弹性的水凝胶上培养间充质干细胞而进行的向神经性、肌原性、骨原性的细胞的分化诱导(非专利文献1)。该认识意味着仅通过将间充质干细胞在具有1kPa以上的弹性模量的水凝胶基材上进行培养，就分化成依存于培养环境的弹性特性等的谱系，即未分化状态崩溃，品质劣化。
与此相对，提出了下述方法：通过将间充质干细胞在具有250Pa的弹性的通过I型胶原和纤连蛋白被涂布的丙烯酰胺凝胶上进行培养，从而将干细胞的细胞周期诱导或维持于静止状态，使生物活性持续的方法(非专利文献2、专利文献5)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2008/026634号小册子
专利文献2：国际公开第2011/040500号小册子
专利文献3：日本特许第4385076号说明书
专利文献4：日本特表2012-517823号公报
专利文献5：日本特表2010-532167号公报
非专利文献
非专利文献1：Cell 126，677，2006
非专利文献2：Tissu Eng PartA 15，147，2009，
非专利文献3：REGENERATIVE MEDICINE AND TISSUE ENGINEERING-CELLS ANDBIOMATERIALS，Daniel Eberli，2011InTech
非专利文献4：Biochem.Biophys.Res.Commun.，322(3)，759～765(2004)
发明内容
发明所要解决的课题
关于上述冷冻介质使用了DMSO等化学试剂的冷冻保存法，报告了在融化过程中对细胞带来显著的破坏(非专利文献3)，对间充质干细胞的分化带来影响的可能性(非专利文献4)。
此外，在使用了水凝胶作为上述细胞外基质的分化诱导时，进行了研究的培养基材的弹性处于高数值范围，因此未发现细胞成为静止状态、细胞的保存性能。
进一步，对于构成作为培养基材而被提出的丙烯酰胺凝胶的丙烯酰胺单体，指出了具有神经毒性、肝毒性。一般而言，构成显示生物适应性的水溶性聚合物、水凝胶的聚合性单体大多显示细胞毒性，可以说从由这些单体获得的高分子凝胶完全除去未反应单体事实上是困难的，采用这样的高分子凝胶作为要求生物安全性的细胞培养基材等时残存问题。
这样，迄今为止还提出了用于在维持间充质干细胞的多能性的状态下谋求保存时的生存率改善的各种方案，但仍未提出代替使用了DMSO等化学试剂的冷冻保存方法，而满足所期望的细胞的保存性，而且没有细胞毒性担忧的间充质干细胞的保存方法。
本发明是鉴于这样的现有技术的状况而提出的，其课题在于提供一种成体干细胞的培养方法(保存方法)，其不使用对成体干细胞的分化功能带来影响那样的DMSO等化学试剂，代替以往实施的冷冻保存方法，分化功能、细胞功能的劣化、对生存率的影响极其低。
用于解决课题的方法
本发明人等为了解决上述课题而反复进行了深入研究，结果发现，在培养成体干细胞的培养液中使具有作为增粘剂或胶凝剂的功能的天然物来源的多糖类，例如增粘性多糖类、纳米纤维状多糖类溶解或分散，结果该多糖类参与干细胞的分化所有关的谱系决定而成为能够进行几乎非活性的休眠状态下的干细胞的培养的支架材料。即，通过使间充质干细胞在溶解或分散天然物来源的多糖类而成的细胞培养液中以漂浮于液体中的方式溶解或分散，可以不使培养液冷冻，而在培养条件下抑制间充质干细胞的分化，而且在期望的一定期间，维持初始状态并保存(作为休眠状态进行培养)。这里所谓初始状态，是指间充质干细胞还未开始向任一分化谱系分化的、未分化的状态。而且，发现通过使用上述增粘性多糖类、处于纳米纤维的形态的多糖类这样的天然物来源的多糖类，从而能够通过使用蛋白酶等的一般细胞回收方法来从培养液回收间充质干细胞，能够进行间充质干细胞的再利用，由此完成本发明。
即，本发明属于使用了天然物来源的多糖类的细胞培养法，特别是基于该培养体系能够进行间充质干细胞的未分化性维持培养的独特发现。通过发现能够进行这样的培养的该多糖类的结构以及该溶解液或分散液的最佳条件，从而完成了本发明。
本发明中的间充质干细胞的未分化性维持培养的原理在于：通过使间充质干细胞的细胞周期停止于静止期，实现休眠状态下的培养，从而不仅抑制伴随细胞分裂和增殖的细胞寿命的缩短以及老化的进行，而且排除伴随向不期望表型分化的细胞变化的可能性。这样的培养状态是，间充质干细胞与在生物体中置于被称为干细胞巢(niche)的天然细胞外环境时的生存状况接近的状态，依照本发明的培养法是通过生物体模仿手段来解决课题的。
进一步，本发明包括：通过休眠培养进行的间充质干细胞的品质劣化的避免，解除休眠状态而使用时的回收方法的确立，以及回收的间充质干细胞的品质保持的确认。为了保存并有效地利用高品质的间充质干细胞所必须的品质保持和回收，使用天然物来源的多糖类，从而解决这些课题。
具体而言，本发明中，作为第1观点，涉及一种成体干细胞的未分化性维持培养材料，其含有天然物来源的多糖类。
作为第2观点，涉及第1观点所述的未分化性维持培养材料，上述多糖类为纳米纤维形状的多糖类。
作为第3观点，涉及第1观点所述的未分化性维持培养材料，上述多糖类为增粘性多糖类。
作为第4观点，涉及第3观点所述的未分化性维持培养材料，上述增粘性多糖类为甲基纤维素或迪特胶。
作为第5观点，涉及第1观点～第4观点的任一项所述的未分化性维持培养材料，上述成体干细胞为间充质干细胞。
作为第6观点，涉及第1观点～第5观点的任一项所述的未分化性维持培养材料，在37℃、5体积％二氧化碳气氛的培养条件下使用时，能够使1天～30天培养后的成体干细胞以与该干细胞刚采集后同等的活性度保持未分化性和多分化能力。
作为第7观点，涉及第1观点～第6观点的任一项所述的未分化性维持培养材料，在上述培养条件下进行成体干细胞的培养时，能够通过酶处理进行成体干细胞的回收。
作为第8观点，涉及第2观点和第5观点～第7观点的任一项所述的未分化性维持培养材料，上述多糖类处于具有1nm～100nm的平均纤维直径(D)的纳米纤维的形态。
作为第9观点，涉及第2观点和第5观点～第8观点的任一项所述的未分化性维持培养材料，上述多糖类处于具有0.01μm～10μm的平均粒径(d)的纳米纤维的形态。
作为第10观点，涉及第8观点所述的未分化性维持培养材料，上述多糖类处于平均纤维长度(L)相对于平均纤维直径(D)之比(L/D)为2～500的纳米纤维的形态。
作为第11观点，涉及第2观点和第5观点～第10观点的任一项所述的未分化性维持培养材料，上述未分化性维持培养材料为纤维素来源的天然物纳米纤维。
作为第12观点，涉及一种培养液，其是第1观点～第11观点的任一项所述的未分化性维持培养材料溶解或分散于液体中而成的。
作为第13观点，涉及第12观点所述的培养液，其是上述未分化性维持培养材料相对于上述培养液的总体积量以0.0001％(w/v)～2％(w/v)的浓度溶解或分散而成的。
作为第14观点，涉及一种含有成体干细胞的培养液，其是成体干细胞漂浮于第12观点或第13观点所述的培养液的液体中而成的。
作为第15观点，涉及第14观点所述的含有成体干细胞的培养液，其是上述未分化性维持培养材料相对于每单位体积(1mL)包含1.0×103～1.0×106的干细胞的上述含有成体干细胞的培养液的总体积量，以0.0001％(w/v)～2％(w/v)的浓度漂浮于培养液中而成的。
作为第16观点，涉及第14观点或第15观点所述的含有成体干细胞的培养液，其进一步包含血清。
作为第17观点，涉及第16观点所述的含有成体干细胞的培养液，上述血清选自胎牛血清、人血清、马血清和鸡血清。
作为第18观点，涉及第16观点或第17观点所述的含有成体干细胞的培养液，以相对于上述含有成体干细胞的培养液的总体积为0.1体积％～50体积％的浓度包含上述血清。
作为第19观点，涉及第14观点～第18观点的任一项所述的含有成体干细胞的培养液，其进一步包含细胞功能调节因子。
作为第20观点，涉及一种间充质干细胞的培养方法，其特征在于，在天然物来源的多糖类的存在下，将间充质干细胞在体外进行培养，从而使1天～30天培养后的该间充质干细胞以与该干细胞刚采集后同等的活性度保持未分化性和多分化能力。
发明的效果
根据本发明的未分化性维持培养材料，能够在不需要向培养基中添加化学试剂、蛋白、调整因子等，不需要除去生长因子的条件下，将在再生医疗中有用性特别高的间充质干细胞维持未分化的状态(休眠状态)而长期保存。
此外，通过使用本发明的未分化性维持培养材料，从而能够将由生物体采集，挑选，然后纯化了的间充质干细胞以高品质保持直至实际的用于治疗的时刻。这里所谓“以高品质保持”，是指维持成为定义干细胞方面的性质的未分化性和多分化能力。此外，根据本发明的间充质干细胞的培养方法，在一定期间的间充质干细胞的保存培养后，不需要特殊的操作，通过在细胞培养的技术领域中一般使用的方法，例如使胰蛋白酶等蛋白酶作用的方法，可以实现高的细胞回收率。
这样，本发明的未分化性维持培养材料具有间充质干细胞以高品质保存培养、和利用时的回收和调制容易这样的两个主要效果。
附图说明
图1为显示实施例1和实施例2的hMSC培养中的由钙黄绿素-AM/PI法得到的生死判定结果的图。
图2为显示实施例3～实施例7的hMSC培养中的由钙黄绿素-AM/PI法得到的生死判定结果的图。
图3为显示实施例1～实施例3的hMSC的4周培养后的阳性标记染色结果的图。
图4为显示实施例1～实施例3的hMSC的4周培养后的阴性标记染色结果的图。
图5为显示对照试验的hMSC培养(1周)中的由钙黄绿素-AM/PI法得到的生死判定结果的图。
图6为显示实施例12的hMSC的4周培养后的阳性标记染色结果的图。
图7为显示实施例12的hMSC的4周培养后的阴性标记染色结果的图。
图8为显示实施例8中培养的hMSC的脂肪细胞分化诱导试验后的利用抗FABP4抗体的免疫染色试验的结果的图。
图9为显示实施例8中培养的hMSC的脂肪细胞分化诱导试验后油红O染色的结果的图。
图10为显示实施例8中培养的hMSC的骨细胞分化诱导试验后的茜素红S染色试验的结果的图。
图11为显示实施例8中培养的hMSC的3周的软骨细胞分化诱导试验后的利用抗聚集蛋白聚糖抗体的细胞的免疫染色试验的结果的图。
图12为显示实施例8中培养的hMSC的4周的软骨细胞分化诱导试验后的利用抗聚集蛋白聚糖抗体的细胞的免疫染色试验的结果的图。
具体实施方式
以下，对本发明的未分化性维持培养材料进行详细地说明。
另外，本说明书中所谓“休眠培养”，是指在体外培养条件下也实现作为干细胞存在于体内时的特征的、维持在干细胞的细胞周期处于静止期的状态，仍未分化而待机的状态，即，将干细胞维持在未分化的状态(初始状态)(使细胞为休眠状态)的培养。
＜未分化性维持培养材料＞
本发明的未分化性维持培养材料含有天然物来源的多糖类，上述多糖类优选为纳米纤维形状的多糖类(以下，简称为“纳米纤维”)、或增粘性多糖类。
[纳米纤维(纤维素)原料]
作为本发明的未分化性维持培养材料所使用的天然物来源的纳米纤维，可举出微细化了的纤维素纳米纤维。
上述纤维素纳米纤维的原料可以使用例如，木材、竹、麻、黄麻、洋麻、棉、农作物或食物残渣等植物来源的纤维素、或细菌纤维素、刚毛藻(Cladophora)、灰藻(Glaucocystis)、法囊藻、海鞘纤维素等微生物产生或动物产生的纤维素。
上述植物来源的纤维素是被称为微原纤的非常细的纤维进一步成束，与原纤维、薄片(lamellar)、纤维细胞逐步形成高级结构的纤维素，细菌纤维素是由含菌细胞分泌的纤维素的微原纤以其原粗细形成微细网状结构的纤维素。
作为本发明的未分化性维持培养材料所使用的纤维素纳米纤维的原料，优选可举出将上述农作物或食物残渣等植物来源的纤维素、或微生物产生或动物产生的纤维素用牛皮纸浆粕法或亚硫酸盐浆粕法进行了处理的纤维素，以及将它们用高压均化器、磨机等进行了粉碎的粉末纤维素。进一步优选可举出将非结晶部分通过酸水解处理来除去后，通过粉碎和筛分而获得的结晶纤维素。
[纤维素原料的微细化(粉碎)方法]
在本发明中，如上述那样优选使用将这些纤维素原料粉碎而得的微细化了的纤维素纳米纤维。纤维素原料的粉碎方法不受限定，为了微细化直至符合本发明的目的的后述纤维直径和纤维长度，优选为高压均化器、研磨机(石臼)、或珠磨机等介质搅拌磨机这样的可获得强剪切力的方法。
在这些粉碎方法中，特别优选使用高压均化器进行微细化，期望例如使用日本特开2005-270891号公报、日本特许第5232976号说明书所公开那样的湿式粉碎法进行微细化(粉碎化)。具体而言，通过使分散有纤维素原料的分散液(水分散液)从一对喷嘴以高压分别喷射使其碰撞，从而将纤维素原料进行粉碎，例如可以通过使用スターバースト(注册商标)系统((株)スギノマシン制的高压粉碎装置)、ナノヴェイタ(注册商标)(吉田机械兴业(株)的高压粉碎装置)来实施。
使用上述高压均化器将纤维素原料进行微细化(粉碎化)时，微细化、均质化的程度取决于向高压均化器的超高压室压送的压力、通过超高压室的次数(处理次数)以及水分散液中的纤维素浓度。
压送压力(处理压力)通常为50～250MPa，优选为150～245MPa。在压送压力小于50MPa的情况下，纤维素的微细化变得不充分，通过微细化得不到期待的效果。
此外，微细化处理时的水分散液中的纤维素浓度为0.1质量％～30质量％，优选为1质量％～10质量％。如果水分散液中的纤维素浓度小于0.1质量％，则生产性显著低，如果为高于30质量％的浓度，则粉碎效率低，得不到所期望的纤维素纳米纤维。
微细化(粉碎化)的处理次数不受特别限定，与上述水分散液中的纤维素浓度有关，例如，在纤维素浓度为0.1～1质量％的情况下，处理次数为1～100次左右，在1～10质量％时为1～1000次，优选为10～200次。此外，在分散液的纤维素浓度为超过30质量％的高浓度的情况下，微细化需要数千次以上的处理次数，分散液的高粘度化进行直至导致操作障碍的程度，因此从工业观点出发是不现实的。
本发明所使用的纤维素纳米纤维的平均粒径(d)为0.01μm～10μm，优选为0.05μm～5μm。另外，在本发明中，所谓纤维素纳米纤维的“平均粒径”，表示在稀薄条件下分散在水中的处于无规线团状态的纤维素纳米纤维的流体力学直径的径。如果平均粒径小于0.01μm，则由于纤维素纳米纤维过于微细而得不到添加效果，即，包含该纤维素纳米纤维的未分化性维持培养材料的细胞悬浮作用和细胞回收率降低。此外，如果平均纤维直径大于10μm，则未分化性维持培养材料的透明性、细胞分散效果丧失，细胞彼此形成凝集块，或未分化维持培养材料与细胞一起沉降，从而得不到期待的效果。
本发明所使用的纤维素纳米纤维的平均纤维直径(D)为1nm～100nm，优选为5nm～70nm，更优选为10nm～50nm。如果平均纤维直径小于1nm，则由于纤维素纳米纤维过于微细而得不到添加效果，即，从包含该纤维素纳米纤维的未分化性维持培养材料的细胞回收率降低。此外，如果平均纤维直径大于100nm，则未分化性维持培养材料的细胞分散效果丧失，细胞彼此形成凝集块，从而得不到期待的效果。
此外，本发明所使用的纤维素纳米纤维的平均纤维长度(L)为0.01μm～100μm，优选为0.05μm～10μm。
本发明所使用的纤维素纳米纤维的纵横比(L/D)是由平均纤维长度/平均纤维直径获得的，通常为2～500，优选为3～300，更优选为4～250。在纵横比小于2的情况下，作为未分化性维持培养材料未充分地获得液体中的分散性稳定性，未保持细胞的分散性。此外，在纵横比超过500的情况下，意味着纤维长度变得极其大，因此诱发培养液的粘度增大等，诱发操作性的显著降低。
另外，在本发明中，纤维素纳米纤维的平均粒径(d)、平均纤维直径(D)和平均纤维长度(L)如下求出。
·平均粒径(d)：将后述制造例中制作的纤维素分散液以成为0.01～0.1质量％的方式用超纯水进行稀释，用超声波洗涤机使其分散30分钟，使用大塚电子(株)制动态光散射测定仪(FDLS-3000，累积量法)、或マルバーン社制激光衍射式粒度分布测定装置(マスターサイザー2000，累积体积50％通过径(D50))来测定平均粒径(d)。
另外，平均粒径(d)使用下述爱因斯坦-斯托克斯方程(Einstein-Stokesequation)，由扩散系数D作为流体力学直径而求出。
d＝kT/3πη0D
d：粒径(流体力学直径)，k：波尔兹曼常数，T：绝对温度，η0：溶剂的粘度
·平均纤维直径(D)：对应研商事(株)制火棉胶支持膜用日本电子(株)制离子净化器(JIC-410)实施3分钟亲水化处理。在该支持膜上滴加数滴后述制造例中制作的纤维素分散液(用超纯水稀释)，在室温干燥，制成试样。将该试样用(株)日立制作所制透射型电子显微镜(TEM，H-8000)(10,000倍)以加速电压200kV进行观察。使用所得的图像，对样本数：200～250根的纤维素纳米纤维计测各自的纤维直径，将其数均值作为平均纤维直径(D)。
·平均纤维长度(L)：将后述制造例中制作的纤维素分散液以纤维素浓度成为0.001质量％的方式用二甲亚砜(DMSO)进行稀释，使纤维素分散。将其浇注于预先使用浓硫酸对表面进行了亲水化处理的硅晶片上，在110℃干燥1小时而制成试样。使用所得的试样的用日本电子(株)制扫描型电子显微镜(SEM，JSM-7400F)(2,000倍)观察到的图像，对样本数：150～250根的纤维素纳米纤维计测各自的纤维长度，将其数均值作为平均纤维长度(L)。
[增粘性多糖类]
天然物来源的甲基纤维素、迪特胶等增粘性多糖类在高浓度区域作为增粘剂起作用。另一方面，在1％以下这样的低浓度区域，对于细胞等作为分散剂起作用。而且已知，如果将这些增粘性多糖类以这样的低浓度用于细胞培养，则可以不对培养操作等处理带来大的影响，而使细胞增殖稳定化。这是因为下述作用：通过以低粘度(可谓作为分散剂)添加增粘性多糖类，从而抑制由细胞对培养容器的粘附、细胞彼此互相粘附所引起的细胞块形成等。而且通过该作用，可以抑制由细胞粘附引起的细胞功能丧失、增殖抑制、以及由细胞块中心部的营养不足、缺氧所引起的坏死。
作为本发明的未分化性维持培养材料所使用的天然物来源的增粘性多糖类，可举出例如透明质酸、结冷胶、脱酰基化结冷胶、中性树胶(Rhamsan gum)、迪特胶(Diutangum)、黄原酸胶、角叉菜聚糖、汉生胶、已糖醛酸、岩藻依聚糖、果胶、果胶酸、果胶酯酸、硫酸乙酰肝素、肝素、硫酸类肝素、硫酸角质、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸鼠李聚糖及它们的盐、藻酸钠、藻酸丙二醇酯等藻酸衍生物、甲基纤维素、乙基纤维素、羟基乙基纤维素、羟基丙基纤维素、羧基甲基纤维素及其钠等的盐、甲基羟基丙基纤维素、纤维素硫酸钠、二烷基二甲基铵硫酸纤维素等纤维素衍生物、脱乙酰壳多糖、聚季铵盐-10(Polyquaternium-10)等阳离子化纤维素、阳离子化葡聚糖和瓜耳胶羟基丙基三甲基氯化铵等阳离子化多糖等作为优选的增粘性多糖类。
其中，作为本发明的未分化性维持培养材料，可以适合使用甲基纤维素或迪特胶。
＜成体干细胞＞
[间充质干细胞]
成为本发明的未分化性维持培养材料的培养对象的成体干细胞中有间充质干细胞(MSC)、造血干细胞(HSC)、脐带血干细胞、神经干细胞等，特别是将间充质干细胞(MSC)作为对象。
能够分化成各种型的细胞且可以有效地用于治疗的间充质干细胞通常使用由成体采集，挑选，然后纯化了的间充质干细胞。作为可以应用本发明的未分化性维持培养材料的间充质干细胞，不仅可举出由患者直接采集的临床用的初代人间充质干细胞，还可举出可以由能够用于试验研究用的细胞库获得的间充质干细胞、无限增殖化的间充质干细胞株。
如本领域技术人员已知的那样，如果从临床上适用的观点出发捕获这些间充质干细胞，则可以为自家源来源、同种异体源来源或异种间源来源的任一细胞。此外，采集源可以为提供者骨髓、组织活检、胚胎性源、出生后源等任一采集源。具体而言，可举出髂嵴的骨髓、大腿胫骨、脊椎、肋骨或其它骨髓腔来源、或包含胚胎性卵黄囊、胎盘、脐带、骨膜、胎儿和青年期的皮肤和血液的组织活检来源等采集源。
＜培养液＞
本发明还涉及上述未分化性维持培养材料分散于液体中而成的培养液。
上述培养液包含缓冲液和/或液体培养基。
作为上述液体培养基，可以适合使用天然培养基、半合成培养基、合成培养基等中的动物细胞的培养所使用的培养基。作为这样的培养基，可举出例如William培养基E(William’s E培养基)、Ham F10培养基(Ham’s Nutrient Mixture F10)、Ham F12培养基(Ham’s Nutrient Mixture F12)、RPMI1640培养基、Eagles MEM培养基(Eagles’s MinimumEssential Medium；EMEM)、Dulbecco改良Eagles培养基(Dulbecco’s Modified Eagles’sMedium；DMEM)、α-改良Eagles培养基(α-Modified Eagles’s Medium；α-MEM)等。
此外，该液体培养基可以包含钠、钾、钙、镁、磷、氯、氨基酸、维生素、细胞因子、激素、抗生素、血清、脂肪酸、糖等。此外，液体培养基中根据目的还可以组合一种以上其它化学成分或生物体成分并添加，可以添加例如胎牛血清、人血清、马血清、鸡血清胰岛素、运铁蛋白、乳铁蛋白、胆固醇、乙醇胺、亚硒酸钠、单硫代甘油、2-巯基乙醇、牛血清白蛋白、丙酮酸钠、聚乙二醇、各种维生素、各种氨基酸、琼脂、琼脂糖、胶原、甲基纤维素、各种细胞因子、各种生长因子、细胞功能调节因子等。
期望上述培养液是上述未分化性维持培养材料相对于该培养液的总体积量以0.0001％(w/v)～2％(w/v)的浓度、优选为0.0005％(w/v)～1％(w/v)的浓度分散而成的。
＜含有成体干细胞的培养液＞
进一步，本发明还涉及成体干细胞漂浮于上述培养液的浴中而成的含有成体干细胞的培养液。
期望上述含有成体干细胞的培养液是上述未分化性维持培养材料相对于每单位体积(1mL)包含1.0×103～1.0×106的干细胞的上述含有成体干细胞的培养液的总体积量，以0.0001％(w/v)～2％(w/v)的浓度、优选为0.0005％(w/v)～1％(w/v)的浓度漂浮于培养液中而成的。
该含有成体干细胞的培养液中可以添加上述液体培养基中能够添加的其它化学成分或生物体成分，即钠、钾、钙、镁、磷、氯、氨基酸、维生素、细胞因子、激素、抗生素、血清、脂肪酸、糖等。可以进一步添加例如胎牛血清、人血清、马血清、鸡血清胰岛素、运铁蛋白、乳铁蛋白、胆固醇、乙醇胺、亚硒酸钠、单硫代甘油、2-巯基乙醇、牛血清白蛋白、丙酮酸钠、聚乙二醇、各种维生素、各种氨基酸、琼脂、琼脂糖、胶原、甲基纤维素、以及各种细胞功能调节因子、成纤维细胞生长因子、上皮生长因子、血管内皮生长因子、血小板源生长因子、肝细胞生长因子等。
例如在胎牛血清、人血清、马血清、鸡血清等血清的情况下，期望以相对于含有成体干细胞的培养液的总体积为0.1体积％～50体积％、优选为0.5体积％～20体积％的浓度进行添加。
[培养方法]
以下记载使用了本发明的未分化性维持培养材料的成体干细胞的培养方法(休眠培养)的一例。
首先，将上述本发明的未分化性维持培养材料添加至上述培养液(缓冲液和/或上述液体培养基、另外在这些培养基中添加有胎牛血清、人血清等的液体培养基)，使该未分化性维持培养材料溶解或分散于培养液中，形成溶解液或分散液的状态。
在动物细胞的培养一般所使用的培养器：培养皿、烧瓶、孔板、塑料袋、テフロン(注册商标)袋等适当的容器中准备这样准备的包含本发明的未分化性维持培养材料的培养液，在其中接种悬浮于适当的缓冲液等的间充质干细胞以使每单位体积(1mL)的培养基中干细胞数成为1.0×103～1.0×106。此时，可以将血清、细胞功能调节因子等进一步添加至培养液中。
在未分化性维持培养材料的分散培养液中接种的间充质干细胞通常可以在10℃～40℃，优选为35℃～38℃，例如37℃，在0体积～10体积％，优选为3体积～7体积％，例如5体积％的二氧化碳气氛中，在细胞培养用培养箱内进行培养。
细胞培养中根据需要还可以更换培养液，将培养环境保持新鲜。在培养液更换时，例如在使用纳米纤维作为未分化性维持培养材料的情况下，可以通过在规定的离心力条件下进行离心分离，将分散于细胞培养液中的纳米纤维与细胞这两者进行沉降回收，再分散于新鲜的培养液来进行。
例如利用上述步骤，在37℃、5体积％二氧化碳气氛的培养条件下，使用本发明的未分化性维持材料培养间充质干细胞等成体干细胞，从而可以将1天～30天培养后的成体干细胞的未分化性和多分化能力以与该干细胞刚采集后同等的活性度保持。
[回收方法]
在使用了本发明的未分化性维持材料的培养条件下进行成体干细胞的培养时，能够通过胰蛋白酶处理进行成体干细胞的回收。
通过使用本发明的未分化性维持培养材料，即使休眠培养实施后经过了2周以上，例如经过了30天之后也可以维持间充质干细胞等成体干细胞的未分化性，保持分化能力，并且抑制细胞老化。
实施例
以下举出实施例来更具体地说明本发明的特征。以下实施例所示的材料、使用量、比例、处理内容和处理步骤只要不超出本发明的宗旨，就可以适当变更。因此，本发明的范围不应被以下所示的具体例限定地解释。
[平均粒径d的测定]
按照上述第11页倒数第11行～第12页第14行所记载的步骤，由动态光散射测定求出下述制造例1～制造例3中获得的纤维素纳米纤维的平均粒径d。
[平均纤维直径D和平均纤维长度L的测定]
按照上述第11页倒数第11行～第12页第14行所记载的步骤，由TEM图像和SEM图像求出下述制造例1～制造例3中获得的纤维素纳米纤维的平均纤维直径D和平均纤维长度L，由它们的值求出纵横比L/D。
[制造例1：微晶纤维素来源纤维素纳米纤维(MC1)的制造]
在市售的微晶纤维素(フナコシ(株)制柱色谱用フナセル粉末II)1.5质量份中添加纯水1,000质量份使其分散后，使用(株)スギノマシン制高压粉碎装置(Starburst系统)，以245MPa进行50次粉碎处理，获得了微晶纤维素来源的纤维素纳米纤维的水分散液(MC1)。
[制造例2：微晶纤维素来源纤维素纳米纤维(MC2)的制造]
在市售的微晶纤维素(フナコシ(株)制柱色谱用フナセル粉末II)15质量份中添加纯水1,000质量份使其分散后，使用(株)スギノマシン制高压粉碎装置(Starburst系统)，以245MPa进行150次粉碎处理，获得了微晶纤维素来源的纤维素纳米纤维的水分散液(MC2)。
[制造例3：微晶纤维素来源纤维素纳米纤维(MC3)的制造]
在市售的微晶纤维素(フナコシ(株)制柱色谱用フナセル粉末II)15质量份中添加纯水1,000质量份使其分散后，使用(株)スギノマシン制高压粉碎装置(Starburst系统)，以245MPa进行300次粉碎处理，获得了微晶纤维素来源的纤维素纳米纤维的水分散液(MC3)。
[制造例4：浆粕来源纤维素纳米纤维(PC)的制造]
在市售的牛皮纸浆粕(国际纸パルプ商事(株)制LBKP D-8，固体成分46质量％)22质量份中添加纯水978质量份使其分散后，使用(株)スギノマシン制高压粉碎装置(Starburst系统)，以245MPa进行200次粉碎处理，获得了浆粕来源纤维素纳米纤维的水分散液。将所得的分散液量取至培养皿中，在110℃进行1小时干燥，除去水分而测定残渣的量，测定浓度。其结果是水中的纤维素浓度(固体成分浓度)为1.0质量％。将该分散液用纯水稀释以成为10质量倍，获得了0.1质量％水分散液(PC)。
[制造例5：细菌纤维素来源纤维素纳米纤维(BC)的制造]
将市售的细菌纤维素(UTAMA社制PT.NIRAMAS，乙酸水溶液中纤维素固体成分约0.5质量％)200质量份用家庭用混合机粉碎5分钟。将所得的浆料进行过滤，使其分散于纯水后测定pH，重复进行同样的水洗直至pH成为中性(6～7)。添加纯水使总量成为1000质量份，然后使用(株)スギノマシン制高压粉碎装置(Starburst系统)，以200MPa进行300次粉碎处理，获得了细菌纤维素来源的纤维素纳米纤维的水分散液(BC)。
对于由制造例1～制造例5获得的纤维素纳米纤维，按照上述步骤测定平均粒径d、平均纤维直径D和平均纤维长度L。示出所得的结果以及由平均纤维直径D和平均纤维长度L求出的纵横比(L/D)。
[表1]
[实施例1：使用了MC1的hMSC培养]
[培养液的调制]
在由制造例1获得的纤维素纳米纤维(MC1)的0.1质量％水分散液100mL中，添加市售的能够高压蒸气灭菌的粉末培养基(日水制药(株)制Dulbecco改良Eagles培养基2)100mL份儿。将其以电磁搅拌器搅拌30分钟左右，使该粉末培养基溶解于水分散液后，在121℃进行15分钟高压蒸气灭菌。将该溶液冷却至室温后，在该溶液中添加市售的L-谷氨酰胺溶液(和光纯药工业(株)制200mmol/L L-谷氨酰胺溶液(×100))以使终浓度成为2mM，进一步添加进行了灭菌的10质量％碳酸氢钠水溶液1mL。由溶液取出少量，使用pH试纸确认溶液的pH为大约pH7.0～8.0。使用前在该溶液中以成为10体积％的方式添加胎牛血清(以下本说明书中记载为FBS)，制成0.1％(w/v)MC1培养液。此外，根据目的将包含10体积％的FBS的DMEM培养基(Gibco(注册商标)DMEM，粉末，低葡萄糖，丙酮酸盐31600-034)追加混合于MC1培养液中，从而调节培养液中的纤维素纳米纤维浓度(参照表2和图1～图4中的NF浓度)。
[间充质干细胞MSC的接种]
在未进行亲水性处理的作为聚苯乙烯培养皿的直径10cm的低粘附性ASNOL(アズノール)灭菌培养皿(アズワン(株)制GD90-15)中，加入作为培养基的0.025～0.1％(w/v)MC1培养液10mL，以5.0×105个/皿接种人间充质干细胞(Lonza PT-2501；以下本说明书中记载为hMSC)。将该接种了的细胞在5体积％二氧化碳中，在37℃培养1天后，为了除去粘附于培养皿的细胞，将培养液转移至新的ASNOL灭菌培养皿，进一步继续4周培养。中途，每隔1周为了更换培养基而将培养液回收至离心管，在10℃以300g离心分离5分钟，除去上清液后使其再悬浮于包含10体积％FBS的新的DMEM培养基10mL，转移至新的ASNOL灭菌培养皿。
在培养后1～4周的各时刻回收培养液，按照以下步骤，进行了利用钙黄绿素-AM/PI法的细胞的生死判定、利用胰蛋白酶处理的细胞的回收、利用未分化标记的免疫染色。
＜利用钙黄绿素-AM/PI法的生死判定＞
由1～4周的培养后回收的各培养液取出0.5mL，在10℃以300g离心分离5分钟而除去上清液，将纳米纤维(以下，称为NF)沉淀物用1mL的磷酸缓冲液(以下，称为PBS)进行了洗涤。重复2次洗涤后在NF沉淀物中添加钙黄绿素-AM/PI液0.5mL进行混合，在5体积％二氧化碳中，在37℃孵育30分钟。接下来，进行2次PBS洗涤，在NF沉淀物中添加0.5mL的DMEM培养基使其悬浮，将该悬浮液转移至24孔板，在相位差显微镜观察和荧光显微镜下确认绿荧光(活细胞)、红荧光(死细胞)。将所得的结果示于图1和图2中。
＜利用胰蛋白酶处理的细胞的回收＞
将由1～4周的培养后回收的各培养液1皿份儿转移至离心管，在10℃以300g离心分离5分钟而分成上清液和沉淀物。将沉淀物用10mL的PBS洗涤2次，该上清液也回收，将全部上清液在10℃以430g离心3分钟，获得了沉淀物。将所得的全部沉淀物归集为一个，在其中添加与沉淀物大约等量的胰蛋白酶液(和光纯约工业(株)制，0.25％(w/v)胰蛋白酶-1mmol/l EDTA·4Na溶液含酚红(0.25％(w/v)Trypsin-1mmol/l EDTA·4Na Solutionwith Phenol Red))，在37℃孵育5分钟。然后，添加胰蛋白酶液的加倍量的包含10体积％FBS的DMEM培养基，混合后在10℃以300g离心5分钟而分成上清液和沉淀物。将上清液进一步在10℃以430g离心分离3分钟，然后除去上清液。使所得的沉淀物与先前分出的沉淀物一同悬浮于新的包含10体积％FBS的DMEM培养基10mL中，再接种于直径10cm的进行了亲水处理的细胞培养用聚苯乙烯皿(组织培养聚苯乙烯(Tissue culture polystyrene)，以下本说明书中记载为TCPS)。将该再接种了的细胞在5体积％二氧化碳中，在37℃孵育一晚，结果确认了皿中存活的细胞。将该存活的细胞用与上述相同的胰蛋白酶液进行处理，在37℃孵育5分钟后，添加胰蛋白酶液的加倍量以上～最大再10mL左右的包含10体积％FBS的DMEM培养基，混合，在10℃以430g离心分离3分钟，然后使所得的沉淀细胞悬浮于新的包含10体积％FBS的数mL的DMEM培养基中。使用血球计来计测该悬浮物。
此外在细胞接种时，作为比较对象，在直径10cm的TCPS中在包含10体积％FBS的DMEM培养基中以5.0×105个/皿接种hMSC，接种次日回收和计数细胞。将此时的细胞数设为回收率100％，算出供于上述培养的细胞的回收率。将所得的结果示于下述表2中。这里关于细胞对未分化性维持材料的附着率，通过在用纳米纤维分散液进行了培养的次日的时刻，从比较对象的细胞数中减去通过上述胰蛋白酶处理进行回收而计测的细胞数，来求出未对分散纳米纤维附着而沉降附着于培养皿的细胞数。这是因为直接计测悬浮的细胞的数的困难性。
[休眠性的确认]
对于是否进行维持了间充质干细胞的性质的休眠状态下的培养，观察对间充质干细胞赋予特征的各种标记蛋白质的表达状态，进行了评价。
1～4周的培养后，将通过胰蛋白酶处理从实施例1的MC1回收的细胞在24孔板上以5.0×103个/cm2(9.5×103个/孔)进行接种，将接种的细胞在5体积％二氧化碳中，在37℃孵育一晚。
对该细胞，使用人间充质干细胞的标记抗体(阳性标记：6种，阴性标记：5种)进行免疫荧光染色，评价细胞的休眠性。免疫荧光染色通过以下方法进行。将细胞用PBS进行洗涤后，用4％低聚甲醛、磷酸缓冲液进行固定，洗涤后用包含1％(w/v)牛血清白蛋白和10体积％驴血清的PBS(封闭缓冲液)进行了封闭处理。使该处理后的细胞与稀释至适当浓度的小鼠单克隆抗体在4℃反应一晚，将1次抗体洗涤除去后，使其与异硫氰酸荧光素(FITC)标记抗小鼠抗体在室温下反应1小时。洗涤后，确认被标记了的细胞在荧光显微镜下是否发出绿荧光(阳性和表达强度)。将4周培养后的免疫染色结果示于图3和图4中。
另外，作为对照试验，将与实施例1～实施例3中使用的同等的传代数6的hMSC在与实施例中进行的同样的接种条件下进行培养，进行了对标记抗体的免疫荧光染色。
[实施例2：使用了MC2的hMSC培养]
使用由制造例2获得的纤维素纳米纤维(MC2)的0.1质量％水分散液，通过与实施例1同样的方法进行培养基调制，调制出0.1％(w/v)MC2培养液。使用该培养液通过与实施例1同样的方法进行hMSC的接种和培养，1～4周的培养之后，进行利用钙黄绿素-AM/PI法的生死判定、利用胰蛋白酶的细胞的回收和休眠性的确认。
[实施例3：使用了MC3的hMSC培养]
使用由制造例3获得的纤维素纳米纤维(MC3)的0.1质量％水分散液，通过与实施例1同样的方法进行培养基调制，调制出0.1％(w/v)MC3培养液。使用该培养液通过与实施例1同样的方法进行hMSC的长期培养、利用钙黄绿素-AM/PI法的生死判定、细胞的回收和休眠性的确认。
[实施例4：使用了PC的hMSC培养]
使用由制造例4获得的纤维素纳米纤维(PC)的0.1质量％水分散液，通过与实施例1同样的方法进行培养基调制，调制出0.1％(w/v)PC培养液。另外，hMSC的培养使用TCPS，进行细胞的生死判定、和利用胰蛋白酶的细胞的回收。此外本实施例中，对于培养次日的时刻也进行了细胞的回收。
[实施例5：使用了BC的hMSC培养]
使用由制造例5获得的纤维素纳米纤维(BC)的0.1质量％水分散液，通过与实施例1同样的方法进行培养基调制，调制出0.1％(w/v)BC培养液。另外，hMSC的培养使用TCPS，进行细胞的生死判定、和利用胰蛋白酶的细胞的回收。
[实施例6：使用了甲基纤维素的hMSC培养]
使用甲基纤维素(M0387，Aldrich社制：ME)调制1.0质量％水分散液，使用该培养液通过与实施例1同样的方法进行培养基调制，调制出1.0％(w/v)甲基纤维素培养液。另外，hMSC的培养使用ASNOL灭菌培养皿，进行细胞的生死判定、和利用胰蛋白酶的细胞的回收。此外本实施例中，对于培养3天后的时刻也进行了细胞的回收。
[实施例7：使用了迪特胶的hMSC培养]
使用迪特胶(KELCO CRETE DG-F，三晶株式会社制：DU)的1.0质量％水分散液，通过与实施例1同样的方法进行培养基调制，调制出1.0％(w/v)迪特胶培养液。另外，hMSC的培养使用ASNOL灭菌培养皿，进行生死判定、和利用胰蛋白酶的细胞的回收。此外本实施例中，对于培养3天后的时刻也进行了细胞的回收。
[结果：细胞生死判定]
如图1和图2所示，在实施例1～实施例3的任一体系中，在4周后都观察到显示活细胞(绿荧光)的钙黄绿素-AM染色图像，与此相对，显示死细胞(红荧光)的PI染色细胞限于极低频率的观察。即，由该观察结果显示，通过MC1～MC3的纳米纤维分散培养液，能够将hMSC培养4周以上。此外，在实施例4和实施例5中，也在1周后观察到钙黄绿素-AM染色图像，显示出通过PC和BC的纳米纤维分散培养液也能够培养hMSC。
此外在实施例1和实施例2中，培养中细胞彼此几个～十个左右凝集的情况显著，但在实施例3中4周后的活细胞的分散状态好，因此可以理解MC3的纳米纤维分散培养液对各个干细胞提供特别均质的培养环境。
[结果：细胞的回收率]
如表2所示，在实施例1～实施例5的任一实施例中，都可以确认到接种次日未分化性维持培养材料附着于细胞，特别是在实施例1～实施例3和实施例5中可以确认到超过80％的细胞附着率。另外，实施例6(甲基纤维素)和实施例7(迪特胶)中，都如后述那样可以在一定的培养期间后回收细胞，因此在这些实施例中都可以说接种次日未分化性维持培养材料附着于细胞。
此外，在实施例1～实施例3中，获得了4周后可以回收约40～60％的细胞的结果。特别是在实施例1的使用了MC1的培养中，获得了最高的回收率，在4周的长期培养后可以回收61.2％的细胞。
此外实施例4、实施例6和实施例7中，都确认到一定的培养期间后可以回收细胞。
由这些结果可以理解，纳米纤维分散培养液和增粘性多糖类分散培养液都对hMSC的回收、再接种的再存活是有效的。可以理解特别是在使用了相同微晶纤维素来源纳米纤维的水分散液(MC1～MC3)的实施例1～实施例3中，在使用的纳米纤维的长度长的条件下细胞回收率上升，尤其是在微晶纤维素来源纳米纤维的纳米纤维分散溶液时，对hMSC的回收、再接种后的再存活是有效的。
[表2]
※ 培养液中的纤维素纳米纤维或增粘性多糖类的浓度(％(w/v))
※1 对未分化性维持材料的细胞附着率(％)
※2 hMSC的培养使用TCPS(细胞培养用聚苯乙烯皿)
※3 回收后的细胞存活、伸展不良，还包含死细胞。
[结果：休眠性确认]
如图3所示，在使用了纳米纤维分散培养液的培养后4周的时刻，对于作为阳性标记的STRO-1、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105，实施例1-3的任一细胞均显示出与对照试验同等程度的正常表达。
此外，如图4所示，关于作为阴性标记的CD11b、CD14、CD19、CD34、CD45，显示与对照试验同等程度的免疫染色荧光强度，可以确认4周培养后也基本上正常地保持hMSC的性质。
[实施例8～实施例10：使用了MC1的细胞无粘附培养培养皿上的MSC培养]
[培养液的调整]
按照与实施例1同样的条件和步骤调制出培养液。
[间充质干细胞MSC的接种]
在直径10cm的细胞无粘附培养培养皿(グライナー制CellStar664970)上，加入作为培养基的0.02质量％、0.017质量％、0.0125质量％的MC1培养液10mL，将hMSC以5.0×105个/皿进行了接种。每隔1周为了更换培养基而将培养液回收至离心管，在10℃以300g离心分离5分钟，除去上清液后使沉淀物再悬浮于包含10质量％FBS的新的DMEM培养基10mL，返回到原先的细胞无粘附培养培养皿。在培养后1～4周的各时刻回收培养液，按照第19页第9行～第21页第7行所记载的步骤，进行了利用钙黄绿素-AM/PI法的细胞的生死判定、利用胰蛋白酶处理的细胞的回收和利用未分化标记的细胞的免疫染色。
[多分化能力保持的确认]
对于回收的细胞，为了确认是否进行了保持多分化能力的休眠状态下的培养，使用市售的分化诱导培养基(R&D Systems制人间充质干细胞分化诱导试剂盒sc006)分别进行了向脂肪细胞、骨细胞和软骨细胞的分化诱导。使用标记抗体将该分化了的细胞进行免疫染色，确认这些细胞是否具有向各个细胞系的分化能力。
〈MC1培养基中的培养和细胞的回收〉
将hMSC用0.02％MC1培养液培养2周，然后与第19页倒数第11行～第20页倒数第12行所记载的步骤同样地通过胰蛋白酶处理进行了回收。
〈向脂肪细胞的分化诱导〉
将从MC1培养基回收的hMSC再悬浮于在αMEM(life technologies制MEMα12560-056)中添加有10％FBS、青霉素/链霉素、谷氨酰胺的基本培养基中，在放有灭菌后的盖玻片的24孔板上以2.1×104个/cm2进行了再接种。进行培养直至成为100％汇合，然后将培养基更换成在基本培养基中添加有脂肪细胞的分化诱导剂的培养基。每隔3、4天将加有分化诱导剂的培养基更换成新鲜的，连续培养3周。在第1～3周取出盖玻片，进行了培养后的hMSC的油红O染色和采用抗FABP4抗体的免疫染色。
〈向骨细胞的分化诱导〉
为了防止向骨细胞的分化诱导中的细胞的剥落，将1μg/mL的纤连蛋白溶液加入到放有灭菌后的盖玻片的24孔板中，在37度处理3～30小时。将从MC1培养基回收的hMSC再悬浮于在αMEM(life technologies制MEMα12560-056)中添加有10％FBS、青霉素/链霉素和谷氨酰胺的基本培养基中，然后在准备好的24孔板中以4.2×103个/cm2进行再接种。培养一晚后，将培养基更换成在基本培养基中添加有骨细胞的分化诱导剂的培养基。每隔3、4天将加有分化诱导剂的培养基更换成新鲜的，连续进行4周培养。在第2～4周取出盖玻片，进行了培养细胞的茜素红S染色。
〈向软骨细胞的分化诱导〉
将从MC1培养基回收的hMSC用DMEM(FBS-)调整成1.0×106个/mL，为了形成细胞凝集块，将其每次10μL(10,000个)注入至适量加于TCPS的3％甲基纤维素/DMEM中。培养一晚后，用火焰灭菌后的药匙舀出细胞块，用PBS冲洗，1个1个转移至腔室玻片系统(CHAMBERSLIDE系统)(Nunc制LAB-TEK CHAMBER SLIDE SYSTEM 178599JP(LAB-TEK腔室玻片系统178599JP))的各孔。将在DMEM/F-12(Life Technologies制DMEM/F-12 11320-033)中添加有ITS添加剂(sc006附属品)、青霉素/链霉素和谷氨酰胺的基本培养基中进一步添加有软骨分化诱导剂的培养基各100μL加入至各孔。每隔2～3天进行培养基更换，连续进行4周培养。在第3、4周进行了利用抗聚集蛋白聚糖抗体的细胞的免疫染色。
[制造例6：微晶纤维素来源纤维素纳米纤维(MC4)的制造]
在市售的微晶纤维素(セオラス，PH-101，旭化成ケミカルズ社制))1.5质量份中添加纯水1,000质量份使其分散后，使用(株)スギノマシン制高压粉碎装置(Starburst系统)，以220MPa进行50次粉碎处理，获得了微晶纤维素来源的纤维素纳米纤维的水分散液(MC4)。
[制造例7：微晶纤维素来源纤维素纳米纤维(MC5)的制造]
在市售的微晶纤维素(セオラス，PH-101，旭化成ケミカルズ社制))1.5质量份中添加纯水1,000质量份使其分散后，使用(株)スギノマシン制高压粉碎装置(Starburst系统)，以220MPa进行100次粉碎处理，获得了微晶纤维素来源的纤维素纳米纤维的水分散液(MC5)。
[制造例8：微晶纤维素来源纤维素纳米纤维(MC6)的制造]
在市售的微晶纤维素(セオラス，PH-101，旭化成ケミカルズ社制))1.5质量份中添加纯水1,000质量份使其分散后，使用(株)スギノマシン制高压粉碎装置(Starburst系统)，以220MPa进行150次粉碎处理，获得了微晶纤维素来源的纤维素纳米纤维的水分散液(MC6)。
对于由制造例6～制造例8获得的纤维素纳米纤维，按照上述步骤测定出平均纤维直径D和平均纤维长度L。示出所得的结果以及由平均纤维直径D和平均纤维长度L求出的纵横比(L/D)。
[表3]
[2倍浓度DMEM培养液的调制]
向超纯水50mL中添加市售的能够高压蒸气灭菌的粉末培养基(日水制药(株)制Dulbecco改良Eagles培养基2)100mL份儿。将其使用电磁搅拌器搅拌30分钟左右使该粉末培养基溶解于水分散液，然后在121℃高压蒸气灭菌15分钟。将该溶液冷却至室温后，在该溶液中以成为终浓度4mM的方式添加市售的L-谷氨酰胺溶液(和光纯药工业(株)制200mmol/L L-谷氨酰胺溶液(×100))，进一步添加灭菌后的10质量％碳酸氢钠水溶液1mL，调制出2倍浓度DMEM。从该溶液取出少量，使用pH试纸确认到溶液的pH为大约pH7.0～8.0。
[实施例11：使用了MC4的hMSC的培养]
在由制造例6获得的纤维素纳米纤维(MC4)的蒸气灭菌结束的0.1质量％水分散液中，将灭菌结束的2倍浓度DMEM(青霉素/链霉素也是2倍浓度)等量混合来调整0.05％的培养液。在该培养液中以成为10％FBS的方式添加FBS，通过与实施例1同样的方法在低粘附性ASNOL皿(アズワン社制)中进行hMSC的接种，进行培养，将细胞进行回收，然后进行了利用未分化标记的细胞的免疫染色。
[实施例12：使用了MC5的hMSC的培养]
在由制造例7获得的纤维素纳米纤维(MC5)的蒸气灭菌结束的0.1质量％水分散液中，将灭菌结束的2倍浓度DMEM(青霉素/链霉素也是2倍浓度)等量混合来调整0.05％的培养液。在该培养液中以成为10％FBS的方式添加FBS，通过与实施例1同样的方法在低粘附性ASNOL皿中接种hMSC并进行培养，将细胞进行回收，然后进行了利用未分化标记的细胞的免疫染色。
[实施例13：使用了MC6的hMSC的培养]
在由制造例8获得的纤维素纳米纤维(MC6)的蒸气灭菌结束的0.1质量％水分散液中，将灭菌结束的2倍浓度DMEM(青霉素/链霉素也是2倍浓度)等量混合来调整0.05％的培养液。在该培养液中以成为10％FBS的方式添加FBS，通过与实施例1同样的方法在低粘附性ASNOL皿中接种hMSC并进行培养，将细胞进行回收，然后进行了利用未分化标记的细胞的免疫染色。
[对照试验：使用了DMEM的hMSC培养]
作为对照试验，将hMSC用DMEM(包含10％FBS)在低粘附性ASNOL皿中接种后进行培养，进行了细胞的生死判定、利用培养基的离心分离的细胞的回收。
[结果：细胞的回收率]
表4显示实施例8～实施例13和使用了DMEM(无NF)的hMSC培养(对照试验)的细胞附着率和细胞回收率。
如表4所示，实施例8的使用了0.02质量％的MC1的培养中，在使用了细胞无粘附培养皿的情况下，获得了4周后可以回收83.4％的细胞的结果。实施例9和实施例10中，在使MC1的浓度分别为0.017％和0.0125％的稀薄条件下进行了培养，但都获得了高达60～80％的细胞回收率。
另一方面，工业级品MC4～MC6的系列中，实施例11的使用了MC4的培养和实施例13的使用了MC6的培养中，直至2周后的细胞回收率限于40％左右，但实施例12的使用了MC5的培养中，获得了这些系列中最高的细胞回收率，2周后可以回收72％的细胞，4周后可以回收53％的细胞。
由这些结果可以理解，实施例1～实施例3和实施例8～实施例13的微晶纤维素来源的纳米纤维分散溶液特别是对hMSC的回收和再接种的再存活是有效的。
[表4]
[结果：休眠性确认]
如图6所示，实施例12的使用了工业级MC5的分散培养后，在4周的时刻作为阳性标记的STRO-1、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105显示出与对照试验同等程度的正常表达。
此外，如图7所示，关于作为阴性标记的CD11b、CD14、CD19、CD34、CD45，也显示与对照试验同等程度的免疫染色荧光强度，可以确认4周培养后基本上正常地保持hMSC的性质。
[结果：分化诱导能力的确认]
对于显示出最高的细胞回收率的实施例8，为了弄清楚分散培养后回收的hMSC是否保持多分化能力，与第25页第4行～第26页第4行所记载的方法同样地，分别研究了被认为是MSC的干细胞性保持的基准的脂肪细胞、骨细胞和软骨细胞的3方向性分化能力的有无。
显示实施例8中培养的hMSC的脂肪细胞分化试验后，利用抗FABP4抗体的hMSC的免疫染色试验的结果(参照图8)和油红O染色的结果(参照图9)。
其结果是，如图8所示，对于回收后，进行了脂肪分化诱导的hMSC，显示FABP4的显著表达，并且如图9所示，确认到脂肪滴的蓄积(油红O染色)。可以确认到由它们分散培养的hMSC的脂肪细胞分化能力的保持。
此外，显示实施例8中培养的hMSC的骨细胞分化试验后的茜素红S染色试验的结果(参照图10)。
如图10所示，进行了骨细胞分化诱导的hMSC被茜素红强烈地染色，因此可以确认到分散培养了的hMSC的骨细胞分化诱导能力的保持。
进一步，进行了实施例8中培养的hMSC的骨细胞分化试验3周后和4周后的利用抗聚集蛋白聚糖抗体的免疫染色(参照图11和图12)。
如图11、12所示，对于进行了3周和4周的软骨细胞分化诱导的hMSC，观察到聚集蛋白聚糖的显著表达，可以确认到软骨细胞分化能力的保持。
由以上可以确认到实施例8中回收的hMSC保持脂肪细胞、骨细胞和软骨细胞的三方向性分化能力。

Claims (20)

1.一种成体干细胞的未分化性维持培养材料，其含有天然物来源的多糖类。
2.根据权利要求1所述的未分化性维持培养材料，所述多糖类为纳米纤维形状的多糖类。
3.根据权利要求1所述的未分化性维持培养材料，所述多糖类为增粘性多糖类。
4.根据权利要求3所述的未分化性维持培养材料，所述增粘性多糖类为甲基纤维素或迪特胶。
5.根据权利要求1～4的任一项所述的未分化性维持培养材料，所述成体干细胞为间充质干细胞。
6.根据权利要求1～5的任一项所述的未分化性维持培养材料，在37℃、5体积％二氧化碳气氛的培养条件下使用时，能够使1天～30天培养后的成体干细胞以与该干细胞刚采集后同等的活性度保持未分化性和多分化能力。
7.根据权利要求1～6的任一项所述的未分化性维持培养材料，在所述培养条件下进行成体干细胞的培养时，能够通过酶处理进行成体干细胞的回收。
8.根据权利要求2和权利要求5～7的任一项所述的未分化性维持培养材料，所述多糖类处于具有1nm～100nm的平均纤维直径D的纳米纤维的形态。
9.根据权利要求2和权利要求5～8的任一项所述的未分化性维持培养材料，所述多糖类处于具有0.01μm～10μm的平均粒径d的纳米纤维的形态。
10.根据权利要求8所述的未分化性维持培养材料，所述多糖类处于平均纤维长度L相对于平均纤维直径D之比L/D为2～500的纳米纤维的形态。
11.根据权利要求2和权利要求5～10的任一项所述的未分化性维持培养材料，所述未分化性维持培养材料为纤维素来源的天然物纳米纤维。
12.一种培养液，其是权利要求1～11的任一项所述的未分化性维持培养材料溶解或分散于液体中而成的。
13.根据权利要求12所述的培养液，其是所述未分化性维持培养材料相对于所述培养液的总体积量以0.0001％(w/v)～2％(w/v)的浓度溶解或分散而成的。
14.一种含有成体干细胞的培养液，其是成体干细胞漂浮于权利要求12或13所述的培养液的液体中而成的。
15.根据权利要求14所述的含有成体干细胞的培养液，其是所述未分化性维持培养材料相对于每单位体积1mL包含1.0×103～1.0×106的干细胞的所述含有成体干细胞的培养液的总体积量，以0.0001％(w/v)～2％(w/v)的浓度漂浮于培养液中而成的。
16.根据权利要求14或15所述的含有成体干细胞的培养液，其进一步包含血清。
17.根据权利要求16所述的含有成体干细胞的培养液，所述血清选自胎牛血清、人血清、马血清和鸡血清。
18.根据权利要求16或17所述的含有成体干细胞的培养液，以相对于所述含有成体干细胞的培养液的总体积为0.1体积％～50体积％的浓度包含所述血清。
19.根据权利要求14～18的任一项所述的含有成体干细胞的培养液，其进一步包含细胞功能调节因子。
20.一种间充质干细胞的培养方法，其特征在于，在天然物来源的多糖类的存在下，将间充质干细胞在体外进行培养，从而使1天～30天培养后的该间充质干细胞以与该干细胞刚采集后同等的活性度保持未分化性和多分化能力。
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