WO2017199737A1 - 培養細胞の回収方法および培養細胞分散液 - Google Patents

培養細胞の回収方法および培養細胞分散液 Download PDF

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WO2017199737A1
WO2017199737A1 PCT/JP2017/017031 JP2017017031W WO2017199737A1 WO 2017199737 A1 WO2017199737 A1 WO 2017199737A1 JP 2017017031 W JP2017017031 W JP 2017017031W WO 2017199737 A1 WO2017199737 A1 WO 2017199737A1
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cells
cell
cultured
culture
cell dispersion
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PCT/JP2017/017031
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橋本　斉和
晴貴 冨川
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富士フイルム株式会社
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Publication date
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    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/02—Separating microorganisms from their culture media
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/10—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a carbohydrate
    • C12N11/12—Cellulose or derivatives thereof

Definitions

  • the present invention relates to a method for collecting cultured cells and a cultured cell dispersion.
  • nanofibers such as cellulose nanofibers.
  • mesenchymal stem cells are dispersed in a cell culture solution in which a polysaccharide derived from a natural product such as cellulose nanofiber is dispersed so as to float in the solution, thereby freezing the culture solution.
  • a polysaccharide derived from a natural product such as cellulose nanofiber
  • polysaccharides in the form of nanofibers such as cellulose nanofibers
  • Patent Document 2 also describes a cell culture or cell delivery composition comprising plant-derived mechanically disrupted cellulose nanofibers and / or derivatives thereof in the form of hydrogels or membranes, further providing cells
  • a method of culturing cells comprising the steps of contacting the cells with the cell culture or cell delivery composition to form a matrix, and culturing the cells in a three-dimensional or two-dimensional arrangement within the matrix, and Cellulose nanofibers are removed by providing a cell culture medium and a cell-containing material, contacting the cell culture material with a degrading enzyme, centrifuging the material to precipitate cells and cell aggregates, and decantation. From cell culture materials to plant-based cellulose nanofibers and / or How to remove the culture have been described (claims).
  • the present invention suppresses the damage that cultured cells receive during recovery, can achieve both cell growth rate and cell sedimentation rate, and can simplify complicated recovery operations. It is an object of the present invention to provide a method and a cultured cell dispersion used in the recovery method.
  • the present inventor determined that the cellulose nanofiber content, the number of cells, and the spheroid diameter distribution in the cultured cell dispersion after culturing all fall within a predetermined range. It was found that the cultured cells can be prevented from being damaged at the time of recovery to achieve both cell growth rate and recovery rate, and that complicated recovery operations can be simplified, thereby completing the present invention. I let you.
  • a method for recovering cultured cells comprising a sedimentation step of precipitating cells cultured from a cultured cell dispersion in a single culture vessel that has been cultured,
  • the cultured cell dispersion includes the cultured cells, a basal medium component, and cellulose nanofibers having an average diameter of 2.0 nm to 100 nm,
  • the total number of the cultured cells in the cultured cell dispersion is 5.0 ⁇ 10 7 or more
  • the content of the cellulose nanofiber in the cultured cell dispersion is 0.010% by mass or more and 1.0% by mass or less of the cultured cell dispersion
  • a method for recovering cultured cells wherein the spheroid diameter distribution of the cultured cells is 0.10 or more and less than 3.0.
  • the spheroid diameter distribution D dist is expressed by the following equation (1) from the maximum value D max , the minimum value D min, and the arithmetic average value D avg of the spheroid diameters obtained by measuring the diameters of the 20 spheroids. It is the ratio calculated
  • required by. D dist (D max ⁇ D min ) / D avg (1) [2] The method for collecting cultured cells according to [1] above, wherein the spheroid has an average diameter of 50 ⁇ m or more and 800 ⁇ m or less.
  • a seeding process for seeding cells as seed cells Before the sedimentation step, A seeding process for seeding cells as seed cells; A culture step of suspending cells from the seed cells; With In the seeding step, the cell number distribution of a seeded cell dispersion containing seeded cells, basal medium components, and cellulose nanofibers having an average diameter of 2.0 nm to 100 nm is 1.0% to 50%.
  • the method for collecting cultured cells according to [1] or [2] above.
  • the cell number distribution N dist (%) is the maximum value N max (cells) and the minimum value N min (cells) of the number of cells per 1 mL of the seeded cell dispersion measured by sampling 10 locations from the seeded cell dispersion.
  • N dist (%) ⁇ (N max ⁇ N min ) / N avg ⁇ ⁇ 100 (%) (2)
  • N dist (%) ⁇ (N max ⁇ N min ) / N avg ⁇ ⁇ 100 (%) (2)
  • T diff (° C.) T max ⁇ T min (° C.) (3)
  • T diff (° C.) T max ⁇ T min (° C.) (3)
  • the distribution of the diameter of the spheroids is expressed by the following formula (1) from the maximum value D max , the minimum value D min, and the arithmetic average value D avg of the spheroid diameters obtained by measuring the diameters of the 20 spheroids.
  • D dist (D max ⁇ D min ) / D avg (1)
  • the cell dispersion according to [7] wherein the spheroid has an average diameter of 50 ⁇ m or more and 800 ⁇ m or less.
  • the present invention it is possible to suppress damage to cultured cells during collection, to achieve both a cell growth rate and a cell sedimentation rate, and to simplify complicated collection operations.
  • a method and a cultured cell dispersion used in this recovery method can be provided.
  • the advantages and advantages of the present invention over the prior art will be described.
  • the cells were collected by subjecting the cell dispersion obtained by suspension culture to centrifugation, precipitating the cells, and recovering the cells. Therefore, in the conventional method for recovering cultured cells in which the centrifuge treatment is performed, the damage caused by the centrifugal acceleration applied to the cells during the centrifuge treatment is large, and the cell mortality rate before and after the centrifuge treatment is high.
  • the cellulose nanofiber network that gave buoyancy to the cells during suspension culture was disrupted by only applying a light impact or the like, and cultured cells (cell mass ( Spheroids) can be sedimented, so that the cells can be sedimented regardless of the centrifuge treatment, and the cultured cells can be prevented from being damaged during collection, and the complicated collection operation can be simplified. Can do.
  • the cultured cell dispersion is agitated to prevent the cultured cells from settling and maintain suspension culture.
  • the method for recovering cultured cells of the present invention since the cellulose nanofiber network gives buoyancy to the cells during suspension culture, suspension culture can be maintained without stirring the cell dispersion during culture. it can.
  • the spheroid diameter has a predetermined distribution, the oxygen and nutrients necessary for cell growth reach the center of the spheroid sufficiently, and the spheroids with a small diameter advantageous for improving the cell growth rate and cellulose nanofibers Collide with the network to disrupt it and form both large diameter spheroids, which are beneficial for improving cell sedimentation rate, in a single culture vessel, improving cell growth rate and cell sedimentation rate Can be made.
  • cellulose nanofiber may be referred to as CNF (cellulose nanofiber).
  • a range represented by using “to” means a range including both ends before and after “to” in the range.
  • a and b are included in the range of “a to b” (where a and b represent a certain numerical value (real number) and a ⁇ b).
  • the method for recovering cultured cells of the present invention is a method for recovering cultured cells, comprising a sedimentation step for precipitating cells cultured from a cultured cell dispersion in a single culture vessel that has been cultured.
  • the cultured cell dispersion contains cultured cells, basal medium components, and cellulose nanofibers having an average diameter of 2.0 nm to 100 nm.
  • the total number of cultured cells in the cultured cell dispersion is 5.0 ⁇ 10 7 or more, and the content of cellulose nanofibers in the cultured cell dispersion is The spheroid diameter distribution of the cultured cell dispersion is 0.010% by mass or more and 1.0% by mass or less and the cultured cells are 0.10 or more and less than 3.0.
  • the sedimentation process will be described in detail.
  • the cultured cells are sedimented from the cultured cell dispersion in a single culture vessel that has been cultured.
  • a single culture vessel that has been cultured refers to a culture vessel that has been cultured and in which the contents have not been intentionally modified since the end of the culture. Specifically, it refers to a single culture container whose contents have not been changed since the end of culture, and does not refer to a culture container in which the contents of a plurality of culture containers that have been cultured are mixed.
  • a single culture vessel that has been cultured is directly applied to the sedimentation treatment.
  • the cultured cell dispersion includes cultured cells, basal medium components, and cellulose nanofibers having an average diameter of 2.0 nm to 100 nm.
  • the cultured cells contained in the cultured cell dispersion are cells cultured in the culture vessel.
  • the total number of cultured cells contained in the cultured cell dispersion is not particularly limited as long as it is 5.0 ⁇ 10 7 or more, preferably 5.0 ⁇ 10 8 or more and 5.0 ⁇ 10 12 or less. More preferably, it is 5.0 ⁇ 10 9 or more and 5.0 ⁇ 10 12 or less.
  • the total number of cells is less than 5.0 ⁇ 10 7 , it is difficult to achieve a predetermined spheroid diameter distribution, and the cells cultured on the CNF network are caused to have a sufficient defect to settle due to slight impact or the like. The cell sedimentation rate cannot be achieved. Further, when the total number of cells is 5.0 ⁇ 10 12 or less, sufficient oxygen can be supplied to the cells, and the cell growth rate is further improved.
  • the total number of cells in the cultured cell dispersion it is desirable that oxygen be diffused to the inside of the cell dispersion in suspension culture. Since the diffusion of oxygen in the cell dispersion is rate limiting, it is preferable to form a temperature gradient in the cell dispersion and cause slight convection to perform oxygen diffusion. When the cell dispersion is agitated, the CNF network collapses and the cells settle during suspension culture, so that sufficient oxygen is not supplied to the cells and the cell growth rate decreases. For this reason, in the culturing step, it is preferable to impart a temperature distribution to the suspended cell dispersion (referred to as a cell dispersion composed of cells cultured in suspension in the culturing step). In addition, about giving temperature distribution to a suspension cell dispersion liquid, it describes in detail in description of a culture
  • a cell is not specifically limited, A various cell can be included. Although the origin of a cell is not specifically limited, Preferably it is an animal cell, More preferably, it is a human cell.
  • the cell type is not particularly limited, but is preferably a stem cell, more preferably an embryonic stem cell (hereinafter sometimes referred to as “ES cell”: ES, embryonic stem), somatic stem cell, and induced pluripotent stem cell. (Hereinafter, it may be referred to as “iPS cell.”: At least one selected from the group consisting of iPS, induced pluripotent stem).
  • the origin and type of the cells are not particularly limited, but are preferably human stem cells, more preferably human embryonic stem cells (human ES cells), human somatic stem cells, and human induced pluripotent cells (iPS cells). It is at least one selected from the group. This is because stem cells are undifferentiated, so that spheroids are easily formed, and it is easy to achieve both a cell growth rate and a cell sedimentation rate.
  • somatic stem cells examples include hematopoietic stem cells, umbilical cord blood stem cells, satellite cells, intestinal stem cells, hair follicle stem cells, mesenchymal stem cells, neural stem cells, endothelial stem cells, olfactory mucosal stem cells, neural crest stem cells, and testis cells.
  • it is a mesenchymal stem cell.
  • human somatic stem cells include human hematopoietic stem cells, human umbilical cord blood stem cells, human satellite cells, human intestinal stem cells, human hair follicle stem cells, human mesenchymal stem cells, human neural stem cells, human endothelial stem cells, human olfactory mucosa Examples include stem cells, human neural crest stem cells, and human testis cells, with human mesenchymal stem cells being preferred.
  • mesenchymal stem cells that can differentiate into various types of cells and that can be used for treatment usually fall into the collection, selection, and purification from living organisms.
  • the mesenchymal stem cells that can be used in the recovery method of the present invention include not only clinical primary human mesenchymal stem cells directly collected from patients, but also mesenchymal stem cells that can be obtained from a cell bank that can be used for test research, And immortalized mesenchymal stem cell lines.
  • these mesenchymal stem cells can be any cells derived from autologous sources, xenogeneic sources, or xenogeneic sources from the viewpoint of clinical application. Good.
  • the collection source can also be any collection source such as donor bone marrow, tissue biopsy, embryonic source, or postnatal source. Specifically, bone marrow from the iliac crest, femoral neck, spine, ribs, or other bone marrow cavities, or embryonic yolk sac, placenta, umbilical cord, periosteum, fetal or adolescent skin, and tissue life including blood Examples include collection sources such as laboratory tests.
  • iPS cells include, for example, International Publication No. 2015/037535, Japanese Patent No. 5590646, International Publication No. 2011/043405, International Publication No. 2013/0777423, or International Publication No. 2014/136581 ([0050] to [0061]) can be used.
  • cultured cells in the sedimentation process, “seeded cells” in the seeding process described later and “cells” as seed cells, and “cells to be cultured in suspension” in the culture process described later and floating from the seed cells Any of the “cells” to be cultured may be the cells described above.
  • the distribution of the diameter of spheroids composed of cultured cells in the cultured cell dispersion is 0.10 or more and less than 3.0.
  • the distribution of the spheroid diameter is not particularly limited as long as it is 0.10 or more and less than 3.0, but is preferably 0.20 or more and 2.1 or less, more preferably 0.30 or more and 1.0 or less. If the spheroid diameter distribution is less than 0.10, the CNF network cannot be destroyed by a slight impact or the like, and the cell sedimentation rate decreases. In addition, when the spheroid diameter distribution is 3.0 or more, the network is destroyed during culturing and suspension culture cannot be performed, resulting in a decrease in cell proliferation rate. Note that the culture in the single culture container is not a mixture of cultured cell dispersions from a plurality of culture containers after the completion of the cell culture, but the cultured cells in the single culture container at the end of the culture. Means dispersion.
  • both a high cell proliferation rate and a high cell sedimentation rate can be achieved.
  • spheroids having a large diameter are present, the CNF network is easily broken, and the cell sedimentation rate is improved. This is because a spheroid having a large diameter moves due to slight vibration and destroys the CNF network.
  • spheroids with a large diameter are difficult for oxygen to penetrate inside, the cell growth rate is likely to decrease, and the CNF network collapses when several places are destroyed. Good.
  • Spheroids with a small diameter are difficult to improve the cell sedimentation rate, but can also increase the cell growth rate, and therefore need to be present. This is because the surface area of the spheroid is large and oxygen or the like is easily taken up from the culture solution. Therefore, in the present invention, it is necessary that both spheroids having a large diameter and spheroids having a small diameter exist, and the spheroid diameter distribution be within a predetermined range.
  • the average diameter of the spheroid is not particularly limited, but is preferably 50 ⁇ m or more and 800 ⁇ m or less, more preferably 100 ⁇ m or more and 700 ⁇ m or less, and further preferably 150 ⁇ m or more and 600 ⁇ m or less. If the average diameter of the spheroid is within this range, sufficient nutrients and oxygen are supplied to the cells in the center of the spheroid having a large diameter (sometimes referred to as “large spheroid”), and the cell proliferation rate is improved. Large spheroids can easily break the CNF hydrogel network, improving the cell sedimentation rate.
  • the method for adjusting the average diameter of the spheroid is not particularly limited, but can be adjusted by adjusting the carboxy group content of CNF, for example. This is because the carboxy group on the CNF surface facilitates cell aggregation and large spheroid formation. That is, when the carboxy group content of CNF is small, the average diameter of spheroids is small, and when the carboxy group content is large, the average diameter of spheroids is large.
  • the diameter of the spheroid and its distribution are determined by the following method. After seeding the cells in the culture solution, the cells are cultured for 5 days at a temperature of 37 ° C., a humidity of 95% RH, and a carbon dioxide concentration of 5% by volume. 2 mL of the cell dispersion obtained by the culture is sampled and injected into a culture well having a diameter of 20 mm. The central part of the well is observed with an optical microscope at a magnification of 200 times, and 20 spheroid diameters are arbitrarily measured. The diameter is measured by measuring the long side and the short side of each of the 20 spheroids, and let these arithmetic average values be the diameters D 1 , D 2 , D 3 ...
  • D 20 of each spheroid D 20 of each spheroid. From the spheroid diameter thus measured, an arithmetic average value D avg of the diameters of 20 spheroids and a spheroid diameter distribution D dist are calculated by the following formula.
  • D avg (D 1 + D 2 + D 3 +... + D 20 ) / 20
  • D dist (D max ⁇ D min ) / D avg
  • D max is the maximum value of the spheroid diameter
  • D min is the minimum value of the spheroid diameter.
  • a spheroid having a large diameter is, for example, a cell in a seeded cell dispersion (referred to as a cell dispersion consisting of cells seeded and culture in the seeding step) in the seeding step.
  • the number distribution is given and / or, in the culturing step, the content of CNF in the suspended cell dispersion (referred to as a cell dispersion consisting of cells cultured in suspension and the culture in the culturing step) is predetermined. It can be formed by imparting adhesiveness to cells within the range. The provision of the cell number distribution to the seeded cell dispersion will be described when explaining the seeding process.
  • a spheroid having a small diameter (hereinafter sometimes referred to as “small spheroid”) can be formed, for example, by dissociating a large spheroid by imparting a temperature distribution to the suspended cell dispersion in the suspension culture step. .
  • the provision of the temperature distribution to the suspended cell dispersion will be described when explaining the culture process. With the formation of large and small spheroids, a predetermined spheroid diameter distribution can be easily achieved.
  • a culture cell dispersion liquid in a single culture container is mixed by mixing a culture cell dispersion liquid having a large average diameter of spheroids and a culture cell dispersion liquid having a small average diameter of spheroids from a plurality of culture containers. Even if the distribution of the diameter of the spheroids within the predetermined range is used, an excellent cell sedimentation rate cannot be obtained.
  • the present invention exhibits the above-mentioned effect only when the distribution of the diameter of the spheroids in the cultured cell dispersion liquid in the single culture medium after completion of the culture is within a predetermined range.
  • the spheroid diameter distribution be within the above range at the end of the culture. Excellent cell sedimentation rate, i.e. high recovery rate, even when a cultured cell dispersion with a large average spheroid diameter and a cultured cell dispersion with a small average spheroid diameter are mixed in a separate culture vessel.
  • the reason why cannot be obtained can be explained as follows. If the diameter distribution of the spheroids is within the above range from the beginning of the culture, the spheroids with a large diameter and the spheroids with a small diameter are evenly distributed in the container. Since it breaks uniformly, it is easy to sediment cultured cells and the cell sedimentation rate is improved.
  • the basic medium component contained in the cultured cell dispersion means a nutrient component necessary for culturing cells. Since nutrient components are consumed during cell culture, the content of basal medium components is usually different at the start of culture and at the end of culture.
  • the basic medium components at the start of the culture can be appropriately selected depending on the cell type.
  • Examples of the medium containing the basic medium components for culturing human cells include, for example, Eagle's minimal essential medium (EMEM (Eagle's minimal essential medium) ) And / or a modified medium thereof.
  • Examples of the modified medium of EMEM include Dulbecco's modified Eagle's modified Eagle medium (DMEM (Dulbecco's modified Eagle medium)).
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle medium
  • Cellulose nanofiber The cellulose nanofibers contained in the cultured cell dispersion are cellulose nanofibers (hereinafter sometimes referred to as CNF (cellulose nanofiber)) having an average diameter of 2.0 nm to 100 nm.
  • CNF cellulose nanofiber
  • the average diameter of CNF is not particularly limited as long as it is 2.0 nm or more and 100 nm or less, but is preferably 3.0 nm to 50 nm, and more preferably 4.0 to 20 nm.
  • the average diameter of CNF is less than 2.0 nm, the network structure of CNF becomes too weak, and the buoyancy of cells during the culture is lowered and the cell growth rate is lowered in the culture process described later. This is because oxygen and nutrients necessary for cell growth are not sufficiently supplied due to the inability to culture cells in suspension, and cell growth is suppressed.
  • the average diameter of CNF can be adjusted by adjusting the manufacturing conditions. For example, when producing CNF by mechanical crushing, the average diameter of CNF can be reduced as the pressure of the crusher is increased or the number of treatments (passes) of the crusher is increased. That is, the average diameter of CNF can be reduced. The average diameter of CNF can be increased as the pressure of the crusher is lowered or the number of treatments (pass times) of the crusher is decreased. That is, the average diameter of CNF can be increased.
  • chemical modification for example, oxidation (see Japanese Patent No.
  • the average diameter of the CNF can be adjusted by mechanical disintegration after esterification (eg, see WO 2014/185505) and adjusting the disintegrator pressure and / or number of treatments. As in the case of producing CNF by mechanical crushing, the average diameter of CNF can be reduced as the pressure of the crusher is increased or the number of treatments (passes) of the crusher is increased. The average diameter of CNF can be increased as the pressure is decreased or the number of treatments (passes) of the crusher is decreased.
  • the average diameter of CNF was calculated
  • a CNF aqueous dispersion diluted to have a CNF concentration of 0.001% by mass is prepared. This CNF dispersion is thinly spread on a mica sample stage and heated and dried at 50 ° C. to prepare an observation sample. The observation sample is observed using an AFM (Atomic Force Microscope), and the cross-sectional height of the observed shape image is measured at 10 points. The arithmetic average value of 10 measured values is taken as the average diameter of CNF.
  • the average fiber length of CNF is not particularly limited, but is preferably 0.20 ⁇ m or more and 2.0 ⁇ m or less, more preferably 0.30 ⁇ m or more and 1.5 ⁇ m or less, and further preferably 0.40 ⁇ m or more and 1.0 ⁇ m or less. It is. Within this range, it becomes easier to disrupt the CNF network, so that the cell sedimentation rate cells can be further improved.
  • the average fiber length of CNF can be measured according to the method described in JP-T-2013-541956.
  • the average fiber length of CNF can be adjusted by adjusting the production conditions. For example, when producing CNF by mechanical crushing, the average fiber length can be shortened as the temperature of the CNF dispersion during the crushing process is raised, and the average fiber length is lengthened as the temperature of the CNF dispersion is lowered. Can do. In addition, for example, when CNF is produced by chemical cracking, chemical modification (for example, oxidation (see Japanese Patent No. 4998981), carboxymethylation (for example, see WO2015 / 109995), or phosphoric acid The average fiber length can be shortened as the treatment temperature is increased during esterification (for example, see International Publication No. 2014/185505), and the average fiber length can be lengthened as the treatment temperature is lowered.
  • chemical modification for example, oxidation (see Japanese Patent No. 4998981), carboxymethylation (for example, see WO2015 / 109995), or phosphoric acid
  • the average fiber length can be shortened as the treatment temperature is increased during esterification (for example
  • the content of CNF is 0.010% by mass or more and 1.0% by mass or less of the cultured cell dispersion, preferably 0.020% by mass or more and 0.50% by mass or less, more preferably 0.030% by mass or more. It is 0.10 mass% or less.
  • the content of CNF is within the range of 0.010% by mass or more and 1.0% by mass or less of the cultured cell dispersion liquid, it is easy to generate a defect in the network with a slight impact or the like, buoyancy is reduced, and cell sedimentation The rate can be improved. If the content of CNF in the liquid culture cell dispersion is less than 0.10% by mass, a network that gives sufficient buoyancy to cells cultured by CNF cannot be formed, and a good cell growth rate can be achieved.
  • “good cell sedimentation rate” or “cell sedimentation rate is good” means that after culturing, a cultured cell dispersion (the dispersion of cultured cells and culture in the sedimentation step) It means that cells (including spheroids) are settled only by giving a slight impact to them.
  • CNF preferably contains a carboxy group.
  • the carboxy group content of CNF is not particularly limited, but is preferably 0.60 mmol / g or more and 2.0 mmol / g or less, more preferably 0.70 mmol / g or more and 1.9 mmol / g or less, and further preferably Is 0.90 mmol or more and 1.8 mmol / g or less.
  • the carboxy group content of CNF is within this range, the adsorbing power of CNF to the cells becomes appropriate, which promotes aggregation between the cells.
  • a spheroid having a large diameter in the case of “large spheroid”
  • small spheroids the spheroids are easily formed. It becomes easier to make the distribution of diameters within a predetermined range.
  • a method for introducing a carboxy group into CNF is not particularly limited.
  • TEMPO 2,2,6,6-tetramethyl-1-piperidine-N-oxyl; 2,2,6,6-tetra Methyl-1-piperidine-N-oxyl
  • carboxymethylation eg, WO 2014/116 No. 088072 or Japanese Patent No. 4055914.
  • the sedimentation step may include a sedimentation operation in which a slight impact or the like is applied to the culture vessel.
  • a slight impact etc.” is not particularly limited.
  • the culture container is dropped from a slight height (for example, “height of several mm”), or the culture container is tapped.
  • an impact caused by an action More specifically, it is exemplified below as a slight impact or the like. However, it may be a weak mechanical stimulus and is not limited to those exemplified below.
  • the cultured cells can be precipitated by giving a slight impact to the cultured cell dispersion.
  • An impact may be applied to the culture vessel containing the cultured cell dispersion (container impact method), or a ball or the like may be thrown into the cultured cell dispersion and applied (input impact method).
  • the container impact method is carried out, for example, by dropping a culture container containing a cultured cell dispersion from a predetermined height.
  • the throwing impact method is performed, for example, by throwing a weight into a cultured cell dispersion from a predetermined height.
  • the impact is preferably 8.0 gal or less, more preferably 0.20 gal or more and 5.0 gal or less, further preferably 0.40 gal or more and 3.0 gal or less.
  • the cultured cells can be sedimented by gently shaking the cultured cell dispersion. This can be achieved, for example, by shaking the container.
  • the magnitude of the vibration is expressed in “decibel (dB)”.
  • the CNF network is destroyed by giving the cultured cell culture fluid vibrations of preferably 70 dB or less, more preferably 30 dB or more and 65 dB or less, and even more preferably 40 dB or more and 60 dB or less.
  • the cultured cells can be sedimented.
  • the cultured cells can be sedimented by gently rotating the cultured cell dispersion.
  • the whole culture vessel containing the cultured cell dispersion may be rotated, or the cultured cell dispersion may be stirred with a stirring blade and / or a magnetic stirrer.
  • the strength of stirring is expressed as “rpm (revolution per minute). In the method for recovering cultured cells of the present invention, it is preferably 200 rpm or less, more preferably 10 rpm or more and 150 rpm or less, further preferably 20 rpm or more and 100 rpm.
  • the CNF network is destroyed, and the cultured cells can be sedimented.
  • the conventional culture is performed.
  • the centrifuge treatment performed in the cell collection method is common in that the container containing the culture medium containing the cultured cells is rotated.
  • 1000 rpm (335 ⁇ g) or more is used. Therefore, it is necessary to apply a high acceleration to the cells. Therefore, the cultured cells are likely to die.
  • the culturing step may be performed before the sedimentation step.
  • the culture method is not particularly limited.
  • a temperature distribution may be imparted to the suspended cell dispersion (referred to as a cell dispersion composed of cells cultured in suspension and the culture in the culturing step).
  • the temperature distribution given during suspension culture is not particularly limited, but is preferably 0.1 ° C. or higher and 3.0 ° C. or lower, more preferably 0.2 ° C. or higher and 2.0 ° C. or lower, and further preferably 0.3 ° C. or higher and 1 ° C. or higher. It is below 0 ° C.
  • the temperature distribution is within this range, an appropriate temperature gradient is regulated in the cell dispersion, giving a weak stirring effect to the cell dispersion during suspension culture, and the formation of small spheroids due to the disassembly of large spheroids. Promoted to achieve a predetermined spheroid diameter distribution. Moreover, the oxygen diffusion in the cell dispersion with suspension culture is further improved by the agitation effect, and the cell growth rate is further improved because it does not affect the formation of the CNF network and does not hinder the suspension culture of the cells. . As a result, both the cell proliferation rate and the cell recovery rate can be improved.
  • the method for imparting such a temperature distribution to the suspended cell dispersion is not particularly limited. For example, a culture vessel containing the suspended cell dispersion is placed in a thermostatic bath, and a hot plate is placed under the culture vessel. This can be achieved by providing a temperature difference between the two.
  • the temperature distribution is obtained by the following method.
  • the temperature number distribution T diff (° C.) is a temperature difference obtained by the following formula (3) from the maximum value T max (° C.) and the minimum value T min (° C.) of the cell dispersion liquid in suspension culture. .
  • T diff (° C.) T max ⁇ T min (° C.) (3)
  • a seeding step may be performed before the culture step.
  • the seeding step is a step of seeding cells as seed cells.
  • the method of seeding the cells in the culture solution is not particularly limited, and examples thereof include a method in which a suspension prepared by dispersing cells in the culture solution is injected into the culture solution.
  • a cell number distribution may be imparted to the seeded cell dispersion (referred to as a cell dispersion consisting of cells and culture medium seeded in the seeding step).
  • a cell dispersion consisting of cells and culture medium seeded in the seeding step.
  • the cell number distribution applied to the seeded cell dispersion is not particularly limited, but is preferably 1.0% to 50%, more preferably 2.0% to 40%, and even more preferably 3.0% to 30%. It is as follows. Within this range, large spheroids can be formed in the cell dispersion during suspension culture, and a predetermined spheroid diameter distribution can be achieved. As a result, both the cell growth rate and the cell recovery rate can be improved.
  • the cell number distribution is determined by the following method. Immediately after seeding the cells in the culture, 2 mL of the cell dispersion is sampled and injected into a culture well having a diameter of 20 mm. The central part of the well is observed with 10 optical fields at a magnification of 200 using an optical microscope, and the number of cells per 1 mL of the cell dispersion is measured. The arithmetic average value of the number of cells in the first selected 10 visual fields is calculated and set as the average value N 1 (number / mL) of the first sample. Further, N 2 , N 3 ,..., N 10 are obtained by repeating the sampling 10 times.
  • N avg (cells / mL) (N 1 + N 2 + N 3 +... + N 10 ) / 10 (pieces / mL)
  • N dist (%) (N max ⁇ N min ) / N avg ⁇ 100 (%)
  • N max is the maximum value of N 1 to N 10
  • N min is the minimum value of N 1 to N 10 .
  • the method for imparting the cell number distribution is not particularly limited, but preferably includes a method of injecting (or dropping) the cells into the culture solution while varying the time interval when the cells are seeded in the culture solution.
  • the fluctuation of the injection time interval is not particularly limited, but is preferably 0.10 or more and 10 or less, more preferably 0.20 or more and 8.0 or less, and further preferably 0.30 or more and 5.0 or less. If the variation in the injection time interval is within this range, it is easy to achieve a predetermined spheroid diameter distribution.
  • the fluctuation of the entry time interval is a value obtained by the following equation.
  • Variation of injection time interval (difference between maximum and minimum values of injection time interval) / average of all time intervals
  • Cell concentration in the cell dispersion at the time of culturing by assigning cell number distribution at the time of cell seeding Where the time is high (where the time interval was short at the time of seeding) and where the cell concentration is low (where the time interval was long at the time of seeding). That is, a cell number distribution is formed in the cultured cell dispersion. Cells tend to gather where the cell number distribution is high, and large spheroids are easily formed. At this time, since CNF has a carboxy group, it easily interacts with cells (aggregates cells and promotes formation of spheroids), and further promotes the above-described effect.
  • a culture solution preparation step may be performed before the seeding step.
  • the culture solution preparation step is a step of preparing a culture solution for culturing cells.
  • the culture solution preparation step may include preparation of cellulose nanofibers and preparation of the culture solution. When a ready-made product is used as the cellulose nanofiber, the preparation of the cellulose nanofiber can be omitted.
  • ⁇ Preparation of cellulose nanofiber (Method for preparing TEMPO (2,2,6,6-tetramethyl-1-pyridine-N-oxyl; 2,2,6,6-tetramethyl-1-piperidine-N-oxyl)) CNF)
  • the method for preparing the TEMPO-modified CNF is not particularly limited.
  • the cellulosic material is treated with an oxidizing agent (sodium hypochlorite).
  • a TEMPO-modified cellulose nanofiber can be prepared by subjecting the treated cellulose raw material to a wet atomization treatment using an ultra-high pressure homogenizer and defibrating.
  • CM (carboxymethyl) -modified CNF The preparation method of C-converted CNF is not particularly limited. For example, according to the method described in WO2015 / 109995 ([0056]), using a monochloroacetic acid that is a CM agent in the presence of an alkali catalyst.
  • a CMized cellulose nanofiber can be prepared by subjecting the cellulose raw material subjected to the CM treatment to a wet atomization treatment using a high-pressure homogenizer and defibration.
  • JP2015-227517, JP2015-134873, JP2015-4032, JP2014-193580, JP2013-185122, JP3642147, JP40555914, International Publication 13/137140, International Publication 2015 / 107995, International Publication No. 2015/50117, International Publication No. 2014/181560, International Publication No. 2014/181260, International Publication No. 2014/088072, International Publication No. 2014/087767, etc. can be used. .
  • Phosphate treated CNF It can be prepared by introducing a phosphate group into CNF, more preferably by phosphoric acid esterification.
  • a phosphate group For example, the methods described in International Publication No. 2014/185505, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2016-37031, International Publication No. 2016/002689, and International Publication No. 2016/002688 can be used.
  • the method for preparing mechanically crushed CNF is not particularly limited.
  • a cellulosic raw material is subjected to wet atomization using a high-pressure homogenizer.
  • the mechanically pulverized CNF can be prepared by defibrating.
  • the origin of CNF is not particularly limited, and any of pulp-derived CNF, bacterial cellulose (BC) -derived CNF, and nanofibers by electrospinning can be used, but pulp-derived CNF is particularly preferable. is there. This is because the fiber strength is strong and the spheroids are difficult to subdivide during passage.
  • a basal medium suitable for the cells to be used can be prepared by a conventionally known method.
  • a medium described in International Publication No. 2015/111734 ([0029] to [0031]) or a medium described in International Publication No. 2014/136581 ([0062]) may be used.
  • a culture solution is prepared by adding CNF to the basal medium.
  • CNF CNF
  • rapid agitation is performed, whereby the network of the hydrogel is easily disturbed (defects are formed), and the cell sedimentation in the sedimentation process can be facilitated.
  • CNF CNF
  • the rotational speed is not particularly limited, but is preferably 1000 rpm to 100,000 rpm, more preferably 3000 rpm to 50,000 rpm, and further preferably 6000 rpm to 20,000 rpm.
  • the stirring time is not particularly limited, but is preferably 10 seconds or longer and 30 minutes or shorter, more preferably 20 seconds or longer and 15 minutes or shorter, and further preferably 30 seconds or longer and 10 minutes or shorter. When the rotation speed and time are both within this range, both the cell growth rate and the cell sedimentation rate are likely to be improved.
  • the amount of the culture solution is not particularly limited, but is preferably 200 mL or more, more preferably 500 mL or more and 1000 L or less, and further preferably 1000 mL or more and 500 L or less. If the volume of the culture solution is within this range, oxygen can be sufficiently supplied to the suspension cell dispersion in the suspension culture step, so that a large amount of cells can be cultured. It becomes easy to collect.
  • the present invention also provides a cultured cell dispersion used in the above-described method for recovering cultured cells of the present invention.
  • This cultured cell dispersion is as described above.
  • Examples 1 to 4 and Comparative Example 2 described below are examples in which the influence of the seeded cell concentration at the time of seeding on the distribution of spheroid diameters is compared.
  • the seeding cell concentration at the time of seeding was changed from that of Comparative Example 1, and furthermore, when the cells were seeded in the seeding process, the injection time was changed, and the culture process
  • the temperature distribution is given to the suspended cell dispersion (referred to as a cell dispersion consisting of the cells in suspension culture and the culture in the culturing step).
  • ⁇ Culture solution preparation process >> (Preparation of cellulose nanofiber) According to the method described in JP-A-2009-263853 ([0015] to [0030]), a cellulosic material is treated with TEMPO (2,2,6,6-tetramethyl) in the presence of an oxidizing agent (sodium hypochlorite).
  • TEMPO 2,2,6,6-tetramethyl
  • TEMPO-modified cellulose nanofiber (sometimes referred to as TEMPO-modified CNF1) was prepared by atomization treatment and defibration.
  • the average diameter and carboxy group introduction amount of the prepared TEMPO-modified CNF1 were measured according to the following method, the average diameter was 5.0 nm and the carboxy group introduction amount was 1.9 mmol / g.
  • CNF aqueous dispersion diluted to have a cellulose nanofiber concentration of 0.001% by mass
  • This CNF aqueous dispersion is thinly spread on a mica sample stage, heated and dried at 50 ° C. to prepare a sample for observation, and the cross-sectional height of the shape image observed using an atomic force microscope (AFM) 10 points were measured, and the average diameter was calculated.
  • AFM atomic force microscope
  • CNF dispersion a 0.3 mass% aqueous dispersion (hereinafter sometimes referred to as “CNF dispersion”).
  • This CNF dispersion was autoclaved at 121 ° C. for 15 minutes, cooled to room temperature after sterilization. Water is added to a powder medium (Dulbecco Modified Eagle Medium 2, manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) and stirred with a magnetic stirrer for about 30 minutes, and Dulbecco Modified Eagle Medium 2 solution (hereinafter sometimes referred to as “DMEM2 solution”).
  • DMEM2 solution Dulbecco Modified Eagle Medium 2 solution
  • the sterilized CNF dispersion was dropped into the DMEM2 solution cooled to room temperature under aseptic conditions so as to have the concentrations shown in Table 1.
  • the DMEM2 solution to which the CNF dispersion was added was stirred at 10000 rpm for 5 minutes using a homomixer to obtain a CNF-added DMEM2 solution.
  • a filter-sterilized L-glutamine solution (L-glutamine solution ( ⁇ 100), manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd .; 200 mmol / L) is adjusted to a final concentration of 2 mM.
  • a hydrophilic polystyrene-treated culture vessel (floating cell culture flask MS-21800, manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd .; culture area 225 cm 2 ; capacity 800 mL) was prepared.
  • a culture vessel having a culture area (bottom area) in which the height of the culture solution when the culture solution was injected was 4.0 to 5.0 cm was selected.
  • the prepared culture solution was aseptically injected into the prepared culture container in the amount shown in Table 1.
  • a human mesenchymal stem cell (hMSC (human mesenchymal stem cells), manufactured by Lonza; catalog number PT-2501) (hereinafter referred to as “human mesenchymal stem cell PT-2501”) may be contained in the culture container into which the culture solution has been injected. ) Was seeded as seed cells (the seed cells seeded in the culture solution in the culture vessel may be referred to as “seeded cell dispersion” hereinafter). Specifically, a suspension prepared by dispersing human mesenchymal stem cells PT-2501 in a culture solution (hereinafter referred to as “PT-2501 suspension”) was injected into the culture solution. As a result, the cell number distribution calculated according to the following cell number distribution calculation method was as shown in Table 1.
  • N max and N min represent the maximum value and the minimum value from N 1 to N 10 , respectively, and N avg represents the arithmetic average value from N 1 to N 10 .
  • the culture vessel in which the cells were seeded was placed in an incubator set at a temperature of 37 ° C. (Heralall VIOS CO 2 incubator, manufactured by Thermo Fisher Co., Ltd.), and cell culture was started (the cells in suspension culture in the culture process and A cell dispersion composed of a culture solution is referred to as a “floating cell dispersion”).
  • the culture conditions were a carbon dioxide concentration of 5.0% by volume and a humidity of 95% RH.
  • the suspended cell dispersion in the culture container was transferred to a new Aznol sterilization container (Aznol sterilization dish GD90-15, manufactured by Azwan), and further cultured for 4 days. Continuously, spheroids were formed.
  • ⁇ Settling process Total number of cells, average spheroid diameter and diameter distribution, cell growth rate in cultured cell dispersion (referred to as a cell dispersion consisting of cultured cells and culture medium in a culture vessel that has been cultured in the sedimentation step) The cell sedimentation rate and cell mortality were determined according to the methods described below.
  • the cell growth rate was 4.5 times, the cell sedimentation rate was 65%, and the cell death rate was 3.0%.
  • D avg (D 1 + D 2 + D 3 +... + D 20 ) / 20
  • D dist (D max ⁇ D min ) / D avg
  • D max and D min are the maximum value and the minimum value of the diameter of the spheroid, respectively.
  • the cell growth rate was calculated by the following formula, assuming that the total number of cells in the cultured cell dispersion was N and the number of seeded cells was Nf.
  • Cell proliferation rate N / Nf (times) The higher the cell growth rate, the better, and it is particularly desirable that the cell growth rate is 7.3 times or more.
  • N total spheroid count (N) before sedimentation operation: 2 mL of the cultured cell dispersion was sampled and injected into a polystyrene culture well having a diameter of 20 mm maintained at 37 ° C. The central portion of the culture well was observed with 10 optical fields at a magnification of 200 using an optical microscope, and the number of spheroids was measured for each visual field. The average value was N 1. This was repeated with respect to the culture solution of 10 culture wells, and N 2 , N 3 ,..., N 10 were obtained.
  • N the number of spheroids N (cells / mL) per 1 mL of the cultured cell dispersion was calculated. A cell mass having a diameter of 50 ⁇ m or more was treated as a spheroid. 2) Measurement of the number of floating (non-sedimenting) spheroids (n) after the sedimentation operation: After subjecting the culture well to sedimentation, the culture supernatant in the well was gently collected. The collected supernatant was similarly observed using a microscope at 10 magnifications at a magnification of 200 times, and the number of floating spheroids in each visual field was measured. This average value was defined as n1.
  • a suspension prepared by dispersing human mesenchymal stem cells PT-2501 in a culture solution (hereinafter referred to as “PT-2501 suspension”) has a cell concentration (cell concentration at the time of seeding) in the seeded cell dispersion.
  • the point of injection into the culture solution to the value shown in Table 1, and in this case, the injection of PT-2501 suspension into the culture solution was performed 30 times, while changing the injection time interval, Cells were seeded in the same manner as in Comparative Example 1 except that the injection time variation was the value shown in Table 1 and the average injection time interval was 5.0 seconds.
  • the culture vessel in which the cells were seeded was placed on a plate heater (plate heater MPHK type, manufactured by MISUMI Corporation; size 150 ⁇ 150 mm) and the plate heater was set at a temperature of 37 ° C. (Heralall VIOS CO 2 incubator, thermofischer)
  • the cell culture was started (the cell dispersion consisting of the cells in suspension culture and the culture in the culture process is called “floating cell dispersion”), and the output of the plate heater
  • the suspended cell dispersion in the culture vessel was replaced with fresh Azunol.
  • the cell growth rate was 9.2 times, the cell sedimentation rate was 75%, and the cell death rate was 4.0%.
  • Example 2 In the seeding step, the culture solution preparation step, the seeding step, the culture step, and the sedimentation step were performed in the same manner as in Example 1 except that the cell concentration at the time of seeding was changed to the concentration shown in Table 1.
  • the cell growth rate was 9.3 times, the cell sedimentation rate was 80%, and the cell death rate was 3.0%.
  • the cell growth rate was 9.5 times, the cell sedimentation rate was 96%, and the cell death rate was 2.0%.
  • Example 4 In the seeding step, the culture solution preparation step, the seeding step, the culture step, and the sedimentation step were performed in the same manner as in Example 1 except that the cell concentration at the time of seeding was changed to the concentration shown in Table 1.
  • the cell growth rate was 8.6 times, the cell sedimentation rate was 95%, and the cell death rate was 3.0%.
  • the cell growth rate was 7.2 times, the cell sedimentation rate was 95%, and the cell death rate was 4.0%.
  • Examples 1 to 4 by changing the cell concentration at the time of seeding in the seeding process, the distribution of the diameter of spheroids in the cultured cell dispersion in the culture vessel after culturing is changed, which affects the cell proliferation rate and cell sedimentation rate. Gave.
  • the spheroid diameter distribution of Examples 1 to 4 is in the range of 0.10 or more and less than 3.0, and has a high cell proliferation rate (8.6 times or more) and a high cell sedimentation rate (75% or more). Indicated.
  • the diameter distribution of the spheroids of Examples 2 to 4 is in the range of 0.20 or more and 2.1 or less, a high cell growth rate (8.6 times or more), and a higher cell sedimentation rate (80% Above). Furthermore, the diameter distribution of the spheroid of Example 3 is in the range of 0.30 to 1.0, and a higher cell growth rate (9.5 times) and a higher cell sedimentation rate (96%) are obtained. Indicated. Comparative Example 1 is an example in which the spheroid diameter distribution was below the range defined by the present invention.
  • Comparative Example 1 Since the average diameter of the spheroid was 750 ⁇ m and the distribution of the diameter was 0, no spheroid with a larger diameter was formed, and the network of cellulose nanofibers could be destroyed on a large scale by a slight impact. It is considered that the cell sedimentation rate was low. In Comparative Example 1, oxygen and nutrients necessary for cell growth sufficiently reach the center of the spheroid, spheroids having a smaller diameter were not formed, and the cell growth rate was low. Comparative Example 2 is an example in which the spheroid diameter distribution exceeds the range defined by the present invention.
  • the average diameter of spheroids was 770 ⁇ m and the distribution of diameters was 3.0, a large proportion of spheroids with large diameters was formed, and the cellulosic nanofiber network was destroyed during the culture, and the suspension culture The cell proliferation rate was low.
  • Examples 5 to 9 will be described below. Examples 5 to 9 are examples for comparing the influence of the amount of cellulose nanofiber added on the cell growth rate and cell sedimentation rate.
  • TEMPO-modified cellulose nanofibers (hereinafter “TEMPO”) were prepared in the same manner as in Example 1 except that the amount of the oxidizing agent used and the pressure of the ultrahigh-pressure homogenizer were adjusted so that the average diameter and carboxy group content shown in Table 2 were obtained. In some cases, it was referred to as "CNF2").
  • a culture solution was prepared in the same manner as in Example 1 except that the prepared TEMPO-modified CNF2 was used in the addition amount shown in Table 2 instead of TEMPO-modified CNF1.
  • the prepared culture solution was injected into the culture container in the amount shown in Table 2 and used in the subsequent steps.
  • ⁇ Seeding process Instead of human mesenchymal stem cell PT-2501, human embryonic stem cell H9 (WiCell Research Institute, Inc., Madison, Wis., USA) was used so that the cell concentration and injection time variation shown in Table 2 were obtained. Cells were seeded in the same manner as in Example 1 except that they were injected into the culture medium. Thus, the cell number distribution shown in Table 2 was given to the seeded cell dispersion (referred to as a cell dispersion consisting of the seeded cells and the culture solution in the seeding step).
  • ⁇ Settling process (Cell, spheroid) Distribution of the total number of cells, the average diameter of spheroids, and the diameter of spheroids in a cultured cell dispersion (referred to as a cell dispersion consisting of cultured cells and culture in the sedimentation process) in a culture vessel that has been cultured.
  • Cell spheroid
  • the cell growth rate was 8.8 times, the cell sedimentation rate was 92%, and the cell death rate was 4.0%.
  • Example 7 In the culture solution preparation step, the culture solution preparation step, the seeding step, the culture step, and the sedimentation step were performed in the same manner as in Example 5 except that the addition amount of TEMPO-modified CNF2 was changed to the addition amount shown in Table 2. It was.
  • the cell growth rate was 9.5 times, the cell sedimentation rate was 95%, and the cell death rate was 2.0%.
  • the cell growth rate was 9.4 times, the cell sedimentation rate was 85%, and the cell death rate was 3.0%.
  • Example 9 In the culture solution preparation step, the culture solution preparation step, the seeding step, the culture step, and the sedimentation step were performed in the same manner as in Example 5 except that the addition amount of TEMPO-modified CNF2 was changed to the addition amount shown in Table 2. It was.
  • the cell growth rate was 9.5 times, the cell sedimentation rate was 74%, and the cell death rate was 4.0%.
  • Example 5 to 9 the cell proliferation rate and the cell sedimentation rate were affected by changing the content of cellulose nanofibers in the culture medium. Further, the content of the cellulose nanofibers of Examples 5 to 9 is in the range of 0.010% by mass or more and 1.0% by mass or less of the cultured cell dispersion, and has a high cell proliferation rate (8.1 times or more), And high cell sedimentation rate (74% or more) was shown. Furthermore, the content of the cellulose nanofibers of Examples 6 to 8 is in the range of 0.020% by mass or more and 0.50% by mass or less of the cultured cell dispersion, and a higher cell growth rate (8.8 times or more). And a higher cell sedimentation rate (85% or more).
  • the content of the cellulose nanofibers of Example 7 is in the range of 0.03% by mass or more and 0.10% by mass or less of the cultured cell dispersion, and further higher cell growth rate (9.5 times) and higher.
  • the cell sedimentation rate (95%) was shown.
  • the content of the cellulose nanofiber is in the range of 0.010% by mass or more and 1.0% by mass or less of the cultured cell dispersion, a high cell growth rate and a high cell sedimentation rate can be obtained.
  • the cell dispersion is in the range of 0.020% by mass or more and 0.50% by mass or less, a higher cell growth rate and a higher cell sedimentation rate can be obtained.
  • the content is in the range of mass% or more and 0.10 mass% or less, a higher cell growth rate and a higher cell sedimentation rate can be obtained.
  • Examples 10 to 14 will be described below.
  • Examples 10 to 14 refer to a seeded cell dispersion (a cell dispersion composed of seeded cells and a culture medium in a seeding step) by changing the injection (dropping) interval when seeding cells in the culture. This is an example for comparing the influence of the cell number distribution given to) on the spheroid diameter distribution.
  • CM-converted CNF1 CM-modified cellulose nanofibers
  • a culture solution was prepared in the same manner as in Example 1 except that instead of TEMPO-modified CNF1, the prepared CM-modified CNF1 was used in the addition amount shown in Table 3.
  • the prepared culture solution was injected into the culture container in the amount shown in Table 3 and used in the subsequent steps.
  • ⁇ Seeding process >> Using human iPS cell IMR90-1 (WiCell Research Institute, Inc., Madison, Wis., USA) instead of human mesenchymal stem cell PT-2501, the cell concentration and injection time variation shown in Table 3 are obtained. Thus, cells were seeded in the same manner as in Example 1 except that the cells were injected into the culture medium. Thereby, the cell number distribution shown in Table 3 was given to the seeded cell dispersion (referred to as a cell dispersion consisting of the seeded cells and culture medium in the seeding step).
  • ⁇ Settling process (Cell, spheroid) Distribution of the total number of cells, the average diameter of spheroids, and the diameter of spheroids in a cultured cell dispersion (referred to as a cell dispersion consisting of cultured cells and culture in the sedimentation process) in a culture vessel that has been cultured was as shown in Table 3.
  • Example 11 In the seeding process, a culture solution preparation process, a seeding process, a culture process, and a sedimentation process were performed in the same manner as in Example 10 except that the cell number distribution shown in Table 3 was given.
  • the cell growth rate was 9.2 times, the cell sedimentation rate was 83%, and the cell death rate was 5.0%.
  • Example 12 In the seeding process, a culture solution preparation process, a seeding process, a culture process, and a sedimentation process were performed in the same manner as in Example 10 except that the cell number distribution shown in Table 3 was given.
  • the cell growth rate was 9.2 times, the cell sedimentation rate was 93%, and the cell death rate was 2.0%.
  • Example 13 In the seeding process, a culture solution preparation process, a seeding process, a culture process, and a sedimentation process were performed in the same manner as in Example 10 except that the cell number distribution shown in Table 3 was given.
  • the cell growth rate was 8.6 times, the cell sedimentation rate was 95%, and the cell death rate was 3.0%.
  • Example 14 In the seeding process, a culture solution preparation process, a seeding process, a culture process, and a sedimentation process were performed in the same manner as in Example 10 except that the cell number distribution shown in Table 3 was given.
  • the cell growth rate was 8.1 times, the cell sedimentation rate was 94%, and the cell death rate was 4.0%.
  • Examples 10 to 14 the distribution of the spheroid diameter in the cultured cell dispersion liquid in the culture vessel in which the culture has been completed is changed by giving a time variation during injection in the seeding process, and the cell growth rate and the cell sedimentation rate are thereby changed. Influenced.
  • Examples 10 to 14 to which injection time fluctuations of 0.10 to 10 were applied had a total cell number of 8.1 ⁇ 10 9 to 9.0 ⁇ 10 9 , and the spheroid diameter distribution was 0.10 to 2 0.9, indicating a high cell growth rate (8.6 times or more) and a high cell sedimentation rate (73% or more).
  • Examples 11 and 12 which were given an injection time variation of 0.20 to 8.0, had a total cell number of 8.6 ⁇ 10 9 to 9.2 ⁇ 10 9 and a spheroid diameter distribution of 0.20. The higher cell growth rate (9.2 times) and higher cell sedimentation rate (83% or more).
  • Example 12 which gave an injection time variation of 1.0, had a total cell number of 9.2 ⁇ 10 9 cells, a spheroid diameter distribution of 0.80, a high cell proliferation rate (9.2 times), And the higher cell sedimentation rate (93%) was shown. From the above, it can be seen that the smaller the injection time variation, the smaller the spheroid diameter distribution, and the larger the injection time variation, the larger the spheroid diameter distribution.
  • Examples 15 to 19 will be described below. Examples 15 to 19 are examples for comparing the influence of the temperature distribution applied to the suspended cell dispersion (referred to as a cell dispersion consisting of cells in suspension culture and the cultured solution in the culturing process) on the cell growth rate. is there.
  • TEMPO-modified cellulose nanofibers (hereinafter “TEMPO”) were prepared in the same manner as in Example 1 except that the amount of the oxidizing agent used and the pressure of the ultrahigh pressure homogenizer were adjusted so as to obtain the average diameter and carboxy group content shown in Table 4. In some cases, it was referred to as “CNF3”.
  • a culture solution was prepared in the same manner as in Example 1 except that the prepared TEMPO-modified CNF3 was used in the addition amount shown in Table 4 instead of TEMPO-modified CNF1.
  • the prepared culture solution was injected into the culture container in the amount shown in Table 4 and used in the subsequent steps.
  • ⁇ Seeding process Instead of human mesenchymal stem cells PT-2501, human ES cells KhES-1 (Stem Cell Medical Research Center, Institute of Regenerative Medicine, Kyoto University) are used so that the cell concentrations and injection time fluctuations shown in Table 4 are obtained. Cells were seeded in the same manner as in Example 1 except that the cells were injected into the culture medium. Thereby, the cell number distribution shown in Table 4 was given to the seeded cell dispersion (referred to as a cell dispersion consisting of the seeded cells and the culture solution in the seeding step).
  • ⁇ Settling process (Cell, spheroid) Distribution of the total number of cells, the average diameter of spheroids, and the diameter of spheroids in a cultured cell dispersion (referred to as a cell dispersion consisting of cultured cells and culture in the sedimentation process) in a culture vessel that has been cultured.
  • Cell spheroid
  • Example 16 In the culturing step, a culture solution preparation step, a seeding step, a culturing step, and a sedimentation step were performed in the same manner as in Example 15 except that the temperature distribution shown in Table 4 was given.
  • the cell growth rate was 9.0 times, the cell sedimentation rate was 93%, and the cell death rate was 4.0%.
  • Example 17 In the culturing step, a culture solution preparation step, a seeding step, a culturing step, and a sedimentation step were performed in the same manner as in Example 15 except that the temperature distribution shown in Table 4 was given.
  • the cell growth rate was 9.5 times, the cell sedimentation rate was 95%, and the cell death rate was 2.0%.
  • Example 18 In the culturing step, a culture solution preparation step, a seeding step, a culturing step, and a sedimentation step were performed in the same manner as in Example 15 except that the temperature distribution shown in Table 4 was given.
  • the cell growth rate was 9.1 times, the cell sedimentation rate was 93%, and the cell death rate was 3.0%.
  • Example 19 In the culturing step, a culture solution preparation step, a seeding step, a culturing step, and a sedimentation step were performed in the same manner as in Example 15 except that the temperature distribution shown in Table 4 was given.
  • the cell growth rate was 8.0 times, the cell sedimentation rate was 90%, and the cell death rate was 4.0%.
  • Example 15 to 19 the distribution of the spheroid diameter in the cultured cell dispersion in the culture vessel after culturing was changed by changing the temperature distribution applied to the suspension cell culture in the culturing step, and the cell growth rate and The cell sedimentation rate was affected.
  • Example 15 to 19 to which a temperature distribution of 0.1 ° C. or more and 3.0 ° C. or less was given, the total number of cells was 8.1 ⁇ 10 11 to 9.2 ⁇ 10 11 , and the spheroid diameter distribution was It was within the range of 0.10 or more and 2.9 or less, and showed a high cell growth rate (8.0 times or more) and a high cell sedimentation rate (90% or more).
  • Example 16 to 18 to which a temperature distribution of 0.2 ° C. to 2 ° C. was given, the total number of cells was 8.6 ⁇ 10 11 to 9.2 ⁇ 10 11 , and the spheroid diameter distribution was 0.8. It was within the range of 20 or more and 1.8 or less, and showed a higher cell proliferation rate (9.0 times or more) and a higher cell sedimentation rate (93% or more).
  • Example 17 to which a temperature distribution of 0.30 ° C. or higher and 1 ° C. or lower was given, the total number of cells was 9.2 ⁇ 10 11 , the spheroid diameter distribution was 0.50, and higher cell proliferation. Rate (9.5 times or more) and higher cell sedimentation rate (95% or more). From the above, it was found that a high proliferation rate can be ensured even in a situation where the total number of cells is large by imparting a temperature distribution of 0.1 ° C. or more and 3.0 ° C. or less to the suspended cell dispersion.
  • Examples 20 to 22 will be described below. Examples 20 to 22 are examples for comparing the effects of different carboxy group contents and chemical modification methods of cellulose nanofibers on the average spheroid diameter and spheroid diameter distribution.
  • TEMPO-modified cellulose nanofibers (hereinafter “TEMPO”) were prepared in the same manner as in Example 1 except that the amount of the oxidizing agent used and the pressure of the ultrahigh pressure homogenizer were adjusted so as to obtain the average diameter and carboxy group content shown in Table 5. In some cases, it was referred to as “CNF4”.
  • a culture solution was prepared in the same manner as in Example 1 except that the prepared TEMPO-modified CNF4 was used in the addition amount shown in Table 5 instead of TEMPO-modified CNF1.
  • the prepared culture solution was injected into the culture container in the amount shown in Table 5 and used in the subsequent steps.
  • ⁇ Seeding process Instead of human mesenchymal stem cells PT-2501, human embryonic stem cells H9 (WiCell Research Institute, Inc., Madison, Wis., USA) were used so that the cell concentrations and injection time fluctuations shown in Table 5 were obtained. Cells were seeded in the same manner as in Example 1 except that they were injected into the culture medium. Thereby, the cell number distribution shown in Table 5 was given to the seeded cell dispersion (referred to as a cell dispersion consisting of the seeded cells and the culture solution in the seeding step).
  • ⁇ Settling process (Cell, spheroid) Distribution of the total number of cells, the average diameter of spheroids, and the diameter of spheroids in a cultured cell dispersion (referred to as a cell dispersion consisting of cultured cells and culture in the sedimentation process) in a culture vessel that has been cultured.
  • Cell spheroid
  • CM-modified cellulose nanofibers (hereinafter “CM”) were used in the same manner as in Example 10. In some cases, it was referred to as "CNF2").
  • CNF2 CM-modified cellulose nanofibers
  • the seeding step was performed in the same manner as in Example 20 except that the prepared CM solution was used in the addition amount shown in Table 5 to prepare the culture solution. A culture step and a sedimentation step were performed.
  • the cell growth rate was 9.2 times, the cell sedimentation rate was 95%, and the cell death rate was 3.0%.
  • Example 22> According to the method described in International Publication No. 2015/111734 ([0039]), the cellulose-based raw material is subjected to wet atomization treatment using a high-pressure homogenizer and defibrated, whereby mechanically pulverized cellulose nanofibers (hereinafter “ May be referred to as “Mechanical Disintegration CNF1”).
  • Table 5 shows the average diameter and carboxy group introduction amount of the prepared mechanically crushed CNF1. Since the mechanically crushed CNF1 is not subjected to carboxy group introduction treatment such as oxidation treatment, the carboxy group introduction amount is 0 mmol / g.
  • the seeding step was performed in the same manner as in Example 20 except that the culture solution was prepared by using the prepared mechanically crushed CNF1 in the addition amount shown in Table 5 instead of TEMPO-modified CNF4. The culture process and the sedimentation process were performed.
  • the cell growth rate was 8.4 times, the cell sedimentation rate was 84%, and the cell death rate was 5.0%.
  • Example 20 and Example 21 are more preferable than Example 22.
  • Cell growth rate and cell sedimentation rate were high, and cell mortality was low. That is, Example 20 and Example 21 showed an effect superior to Example 23.
  • Example 20 using TEMPO-modified cellulose nanofibers and Example 21 using CM-ized cellulose nanofibers Example 20 has a higher cell growth rate and cell sedimentation rate than Example 21. The cell mortality rate was low. That is, Example 20 showed an effect superior to Example 21.
  • the average diameter of the spheroids was 350 ⁇ m in Examples 20 and 21, whereas it was 50 ⁇ m in Example 22. This is considered to be because cellulose nanofibers contained a carboxy group, which facilitated interaction between cellulose nanofibers and cells, and aggregated cells to promote the formation of spheroids having a large diameter.
  • the spheroid diameter distribution was 0.70 in Example 20, but 0.50 in Example 21. Even when the carboxy group content of the cellulose nanofibers was the same, a difference was observed in the spheroid diameter distribution. Furthermore, looking at the cell growth rate, cell sedimentation rate, and cell mortality rate, excellent results are shown in descending order of spheroid diameter distribution. From the above, it is considered that TEMPO-modified CNF is the most excellent cellulose nanofiber, C-converted CNF is the next best, and mechanically crushed CNF is the next best.
  • Example 23 and Comparative Examples 3 and 4 will be described below.
  • Example 23 and Comparative Examples 3 and 4 are examples in which the effects of cellulose nanofibers and gellan gum were compared.
  • TEMPO-modified cellulose nanofibers (hereinafter “TEMPO”) were prepared in the same manner as in Example 1 except that the amount of the oxidizing agent used and the pressure of the ultrahigh pressure homogenizer were adjusted so as to obtain the average diameter and carboxy group content shown in Table 6. In some cases, it was referred to as “CNF5”.
  • the average fiber length of TEMPO-modified CNF5 was measured according to the method described in JP-T-2013-541956 and found to be 0.50 ⁇ m. In addition, the measurement of the average fiber length of a cellulose nanofiber was specifically performed by the method described below.
  • the dispersion of cellulose nanofibers was diluted with DMSO (dimethyl sulfoxide) so that the concentration of cellulose nanofibers was 0.001% by mass, and the cellulose nanofibers were dispersed. This was cast onto a silicon wafer whose surface was previously hydrophilized using concentrated sulfuric acid, and dried at 110 ° C. for 1 hour to prepare a sample. The obtained sample was observed at a magnification of 2,000 using a scanning electron microscope (JSM-7400F, manufactured by JEOL Ltd.), and each fiber length was measured for cellulose nanofibers having 150 to 200 samples. The arithmetic average value was measured as the average fiber length.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • a culture solution was prepared in the same manner as in Example 1 except that the prepared TEMPO-modified CNF5 was used in the addition amount shown in Table 6 instead of TEMPO-modified CNF1.
  • the prepared culture solution was injected into the culture container in the amount shown in Table 6 and used in the subsequent steps.
  • ⁇ Seeding process Instead of human mesenchymal stem cell PT-2501, human embryonic stem cell H9 (WiCell Research Institute, Inc., Madison, Wis., USA) was used so that the cell concentration and injection time variation shown in Table 6 were obtained. Cells were seeded in the same manner as in Example 1 except that they were injected into the culture medium. Thereby, the cell number distribution shown in Table 6 was given to the seeded cell dispersion (referred to as a cell dispersion consisting of the seeded cells and the culture solution in the seeding step).
  • a cell dispersion consisting of the seeded cells and the culture solution in the seeding step.
  • ⁇ Settling process (Cell, spheroid) Distribution of the total number of cells, the average diameter of spheroids, and the diameter of spheroids in a cultured cell dispersion (referred to as a cell dispersion consisting of cultured cells and culture in the sedimentation process) in a culture vessel that has been cultured.
  • Cell spheroid
  • ⁇ Comparative Example 3> Culture solution preparation process >> A culture solution was prepared in the same manner as in Example 23 except that gellan gum (deacylated gellan gum KELCOGEL CG-LA, manufactured by Sanki Co., Ltd.) was used in the addition amount shown in Table 6 instead of cellulose nanofibers. . The prepared culture solution was injected into the culture container in the amount shown in Table 6 and used in the subsequent steps. Further, in the same manner as in Example 23, the average fiber length of gellan gum was measured according to the method described in JP-T-2013-541956 and found to be 5.0 ⁇ m.
  • gellan gum deacylated gellan gum KELCOGEL CG-LA, manufactured by Sanki Co., Ltd.
  • the prepared culture solution was injected into the culture container in the amount shown in Table 6 and used in the subsequent steps. Further, in the same manner as in Example 23, the average fiber length of gellan gum was measured according to the method described in JP-T-2013-541956 and found to be 5.0 ⁇ m.
  • ⁇ Seeding process Cells were seeded in the same manner as in Example 23. Thereby, the cell number distribution shown in Table 6 was given to the seeded cell dispersion (referred to as a cell dispersion consisting of the seeded cells and the culture solution in the seeding step).
  • ⁇ Settling process (Cell, spheroid) Distribution of the total number of cells, the average diameter of spheroids, and the diameter of spheroids in a cultured cell dispersion (referred to as a cell dispersion consisting of cultured cells and culture in the sedimentation process) in a culture vessel that has been cultured.
  • Cell spheroid
  • ⁇ Culture solution preparation process By treating gellan gum (deacylated gellan gum KELCOGEL CG-LA, manufactured by Sanki Co., Ltd.) five times at a pressure of 12 MPa using an underwater collision type ultrahigh pressure homogenizer (Starburst, manufactured by Sugino Machine Co., Ltd.) Gellan gum having a fiber length of 0.5 ⁇ m was prepared. A culture solution was prepared in the same manner as in Example 23 except that the prepared gellan gum was used in the addition amount shown in Table 6. The prepared culture solution was injected into the culture container in the amount shown in Table 6 and used in the subsequent steps.
  • gellan gum deacylated gellan gum KELCOGEL CG-LA, manufactured by Sanki Co., Ltd.
  • Starburst manufactured by Sugino Machine Co., Ltd.
  • ⁇ Seeding process Cells were seeded in the same manner as in Example 23. Thereby, the cell number distribution shown in Table 6 was given to the seeded cell dispersion (referred to as a cell dispersion consisting of the seeded cells and the culture solution in the seeding step).
  • ⁇ Settling process (Cell, spheroid) Distribution of the total number of cells, the average diameter of spheroids, and the diameter of spheroids in a cultured cell dispersion (referred to as a cell dispersion consisting of cultured cells and culture in the sedimentation process) in a culture vessel that has been cultured.
  • Cell spheroid
  • Example 23 using CNF was able to achieve a cell sedimentation rate as high as 9.5 times and a cell sedimentation rate as high as 90%
  • Comparative Examples 3 and 4 using gellan gum instead of CNF In both cases, a high cell growth rate of 8.9 times was achieved, but only a low cell sedimentation rate of 35% was achieved.
  • gellan gum forms a cross-linked structure, so that the fibers are strongly entangled and the hydrogel is unlikely to collapse.
  • the gel length of gellan gum was different between Comparative Example 3 and Comparative Example 4, but there was no difference in the cell sedimentation rate.
  • Example 24 and Comparative Examples 5 and 6 are examples in which cell death rates due to differences in sedimentation operations were compared.
  • TEMPO-modified cellulose nanofibers (hereinafter “TEMPO”) were prepared in the same manner as in Example 1 except that the amount of the oxidizing agent used and the pressure of the ultrahigh pressure homogenizer were adjusted so as to obtain the average diameter and carboxy group content shown in Table 5. In some cases, it was referred to as “CNF6”.
  • a culture solution was prepared in the same manner as in Example 1 except that the prepared TEMPO-modified CNF6 was used in the addition amount shown in Table 7 instead of TEMPO-modified CNF1.
  • the prepared culture solution was injected into the culture container in the amount shown in Table 7 and used in the subsequent steps.
  • ⁇ Seeding process Cells were seeded in the same manner as in Example 1 except that the cells were injected into the culture solution so that the cell concentration and the injection time varied as shown in Table 7. Thereby, the cell number distribution shown in Table 7 was given to the seeded cell dispersion (referred to as a cell dispersion consisting of the seeded cells and culture medium in the seeding step).
  • Example 7 the suspended cell dispersion (referred to as a cell dispersion consisting of cells in suspension culture and a culture solution in the culturing process) was given the temperature distribution shown in Table 7, and the cells were cultured in suspension. .
  • ⁇ Settling process (Cell, spheroid) Distribution of the total number of cells, the average diameter of spheroids, and the diameter of spheroids in a cultured cell dispersion (referred to as a cell dispersion consisting of cultured cells and culture in the sedimentation process) in a culture vessel that has been cultured.
  • Cell spheroid
  • the amount of the culture solution injected into the culture vessel was set to the amount shown in Table 7, in the seeding step, the cell concentration during seeding was set to the concentration shown in Table 7, and in the sedimentation step, the sedimentation operation was performed.
  • the culture solution preparation step, the seeding step, the culture step, and the sedimentation step were performed in the same manner as in Example 24 except that the step was performed by the centrifuge treatment with the strength shown in Table 7.
  • the cell growth rate was 4.7 times
  • the cell sedimentation rate was 68%
  • the cell death rate was 25%.
  • Example 24 except that in the culture solution preparation step, the amount of the culture solution injected into the culture vessel was changed to the amount shown in Table 7, and in the seeding step, the cell concentration at the time of seeding was changed to the concentration shown in Table 7.
  • a culture solution preparation step, a seeding step, a culture step, and a sedimentation step were performed.
  • it differs from the comparative example 5 only in the point which performed sedimentation operation by the same light stirring as Example 24.
  • the cell growth rate was 4.7 times
  • the cell sedimentation rate was 68%
  • the cell death rate was 12%.
  • Example 24 is an example in which cells were sedimented by light impact, and Comparative Example 5 and Comparative Example 6 were examples in which sedimentation was performed by centrifugation.
  • Example 24 achieved cell mortality as low as 3.0%.
  • Comparative Example 5 and Comparative Example 6 showed high cell mortality rates of 25% and 12%, respectively, but Comparative Example 6 in which the centrifugation operation was performed with the same light agitation (60 rpm) as Example 24 was Compared with Comparative Example 5 in which the sedimentation operation was performed by centrifugation (335 ⁇ g), the cell mortality was 1 ⁇ 2 or less.
  • the difference in cell mortality between Comparative Example 5 and Comparative Example 6 is due to the difference in sedimentation operation. When the cells are sedimented by light agitation, the cells are not compared with the case where the cells are sedimented by centrifugation. The damage done is small, suggesting a significant improvement in cell mortality.

Abstract

培養終了した単一培養容器中の培養細胞分散液から培養された細胞を沈降させる沈降工程を備える、培養細胞の回収方法であって、培養細胞分散液は、培養された細胞と、基礎培地成分と、平均直径２．０ｎｍ以上１００ｎｍ以下のセルロースナノファイバーと、を含み、培養細胞分散液中の培養された細胞の総数が５．０×１０７個以上であり、培養細胞分散液中のセルロースナノファイバーの含有量が培養細胞分散液の０．０１０質量％以上１．０質量％以下であり、かつ、培養された細胞からなるスフェロイドの直径の分布が０．１０以上３．０未満である、培養細胞の回収方法、および培養細胞分散液が提供される。

Description

培養細胞の回収方法および培養細胞分散液
　本発明は、培養細胞の回収方法および培養細胞分散液に関する。
　細胞を培養する際の足場材料として、セルロースナノファイバー等のナノファイバーを用いることが知られている。
　例えば、特許文献１には、間葉系幹細胞をセルロースナノファイバー等の天然物由来の多糖類が分散されてなる細胞培養液の中に液中を漂うように分散させることにより、培養液を凍結させることなく、培養条件下で間葉系幹細胞の分化を抑制し、そして望みの一定期間、初期状態を維持し保存することができること、および、セルロースナノファイバー等のナノファイバーの形態にある多糖類といった天然物由来の多糖類を用いることにより、一般的な細胞回収方法により、培養液からの間葉系幹細胞の回収が可能であり、間葉系幹細胞の再利用が可能となることが記載されている（［００１１］）。
　また、特許文献２には、ヒドロゲルまたは膜の形態の植物由来の機械的に崩壊させたセルロースナノファイバーおよび／またはその誘導体を含む細胞培養または細胞送達組成物が記載され、さらに、細胞を提供する工程、細胞をこの細胞培養または細胞送達組成物と接触させ、マトリックスを形成する工程、およびそのマトリックス内で三次元または二次元の配置で細胞を培養する工程を含む細胞を培養する方法、ならびに、細胞培養培地および細胞を含む材料を提供する工程、細胞培養材料を分解酵素と接触させる工程、細胞および細胞凝集体を沈降させるために材料を遠心する工程、およびデカンテーションによりセルロースナノファイバーを除去する工程を含む、細胞培養材料から植物ベースのセルロースナノファイバーおよび／またはその培養体を除去する方法が記載されている（特許請求の範囲）。
国際公開第２０１５／１１１７３４号 特表２０１３－５４１９５６号公報
　従来の培養細胞の回収方法では、浮遊培養した細胞を遠沈処理にかけ、沈降させた細胞を回収していた（特許文献１、特許文献２）。
　しかし、遠沈処理時に細胞にかかる遠心加速度によって細胞が潰されてダメージを受けるため、細胞増殖率および細胞沈降率を両立できないことが問題となっていた。
　また、遠沈処理を行うために、培養により得られた細胞分散液を希釈する必要があるなど、煩雑な操作を要する工程が増加することによって、培養コストが上昇する等の不利益があった。
　そこで、本発明は、培養した細胞が回収時に受けるダメージを抑制して、細胞増殖率および細胞沈降率を両立することができ、しかも、煩雑な回収操作を簡略化することができる培養細胞の回収方法、および、この回収方法に用いる培養細胞分散液を提供することを課題とする。
　本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、培養を終了した培養細胞分散液中のセルロースナノファイバー含有量、細胞数、およびスフェロイドの直径分布をいずれも所定の範囲にすると、培養した細胞が回収時に受けるダメージを抑制して、細胞の増殖率および回収率を両立することができ、しかも、煩雑な回収操作を簡略化することができることを知得し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は次の［１］～［１０］を提供する。
　［１］培養終了した単一培養容器中の培養細胞分散液から培養された細胞を沈降させる沈降工程を備える、培養細胞の回収方法であって、
　上記培養細胞分散液は、上記培養された細胞と、基礎培地成分と、平均直径２．０ｎｍ以上１００ｎｍ以下のセルロースナノファイバーと、を含み、
　上記培養細胞分散液中の上記培養された細胞の総数が５．０×１０７個以上であり、
　上記培養細胞分散液中の上記セルロースナノファイバーの含有量が上記培養細胞分散液の０．０１０質量％以上１．０質量％以下であり、かつ、
　上記培養された細胞からなるスフェロイドの直径の分布が０．１０以上３．０未満である、培養細胞の回収方法。
　ここで、スフェロイドの直径の分布Ｄｄｉｓｔは、２０個のスフェロイドの直径を測定して求めたスフェロイドの直径の最大値Ｄｍａｘ、最小値Ｄｍｉｎおよび算術平均値Ｄａｖｇから、下記式（１）によって求めた割合である。
　Ｄｄｉｓｔ＝（Ｄｍａｘ－Ｄｍｉｎ）／Ｄａｖｇ　　　　　　（１）
　［２］上記スフェロイドの平均直径が５０μｍ以上８００μｍ以下である、上記［１］に記載の培養細胞の回収方法。
　［３］上記沈降工程の前に、さらに、
　種細胞として細胞を播種する播種工程と、
　上記種細胞から細胞を浮遊培養する培養工程と、
を備え、
　上記播種工程において、播種された細胞と、基礎培地成分と、平均直径２．０ｎｍ以上１００ｎｍ以下のセルロースナノファイバーと、を含む播種細胞分散液の細胞数分布が１．０％以上５０％以下である、上記［１］または［２］に記載の培養細胞の回収方法。
　ここで、細胞数分布Ｎｄｉｓｔ（％）は、上記播種細胞分散液から１０箇所サンプリングして測定した播種細胞分散液１ｍＬあたりの細胞数の最大値Ｎｍａｘ（個）、最小値Ｎｍｉｎ（個）および算術平均値Ｎａｖｇ（個）から、下記式（２）によって求めたパーセンテージである。
　Ｎｄｉｓｔ（％）＝｛（Ｎｍａｘ－Ｎｍｉｎ）／Ｎａｖｇ｝×１００（％）　　　　　（２）
　［４］上記沈降工程の前に、さらに、
　種細胞として細胞を播種する播種工程と、
　上記種細胞から細胞を浮遊培養する培養工程と、
を備え、
　上記培養工程において、浮遊培養される細胞と、基礎培地成分と、平均直径２．０ｎｍ以上１００ｎｍ以下のセルロースナノファイバーとを含む浮遊細胞分散液に０．１℃以上３．０℃以下の温度分布を付与する、上記［１］～［３］のいずれか１つに記載の培養細胞の回収方法。
　ここで、温度数分布Ｔｄｉｆｆ（℃）は、浮遊細胞分散液の液温の最高値Ｔｍａｘ（℃）および最低値Ｔｍｉｎ（℃）から、下記式（３）によって求めた温度差である。
　Ｔｄｉｆｆ（℃）＝Ｔｍａｘ－Ｔｍｉｎ（℃）　　　　　（３）
　［５］上記セルロースナノファイバーがカルボキシ基を０．６０ｍｍｏｌ／ｇ以上２．０ｍｍｏｌ／ｇ以下含む、上記［１］～［４］のいずれか１つに記載の培養細胞の回収方法。
　［６］上記細胞が幹細胞である、上記［１］～［５］のいずれか１つに記載の培養細胞の回収方法。
　［７］培養された細胞と、基礎培地成分と、平均直径２．０ｎｍ以上１００ｎｍ以下のセルロースナノファイバーと、を含む培養細胞分散液であって、
　上記培養細胞分散液中の上記細胞の総数が５．０×１０７個以上であり、
　上記培養細胞分散液中の上記セルロースナノファイバーの含有量が上記培養細胞分散液の０．０１０質量％以上１．０質量％以下であり、かつ、
　上記細胞からなるスフェロイドの直径の分布が０．１０以上３．０未満である、培養細胞分散液。
　ここで、上記スフェロイドの直径の分布は、２０個のスフェロイドの直径を測定して求めたスフェロイドの直径の最大値Ｄｍａｘ、最小値Ｄｍｉｎおよび算術平均値Ｄａｖｇから、下記式（１）によって求めた値Ｄｄｉｓｔである。
　Ｄｄｉｓｔ＝（Ｄｍａｘ－Ｄｍｉｎ）／Ｄａｖｇ　　　　　　（１）
　［８］上記スフェロイドの平均直径が５０μｍ以上８００μｍ以下である、上記［７］に記載の細胞分散液。
　［９］上記セルロースナノファイバーがカルボキシ基を０．６０ｍｍｏｌ／ｇ以上２．０ｍｍｏｌ／ｇ以下含む、上記［７］または［８］に記載の細胞分散液。
　［１０］上記細胞が幹細胞である、上記［７］～［９］のいずれか１つに記載の細胞分散液。
　本発明によれば、培養した細胞が回収時に受けるダメージを抑制して、細胞増殖率および細胞沈降率を両立することができ、しかも、煩雑な回収操作を簡略化することができる培養細胞の回収方法、および、この回収方法に用いる培養細胞分散液を提供することができる。
　まず、本発明の従来技術に対する有利な点および作用効果を奏するメカニズムを説明する。
　従来の培養細胞の回収方法では、浮遊培養により得られた細胞分散液を遠沈処理にかけて培養した細胞を沈降させ、細胞を回収していた。そのため、遠沈処理を行う従来の培養細胞の回収方法では、遠沈処理の際に細胞にかかる遠心加速度によるダメージが大きく、遠沈処理の前後における細胞の死亡率が高かった。
　これに対して、本発明の培養細胞の回収方法では、浮遊培養時に細胞に浮力を与えていたセルロースナノファイバーのネットワークを、軽い衝撃等を与えるだけで崩壊せしめ、培養された細胞（細胞塊（スフェロイド）を含む。）を沈降させることができるので、遠沈処理によらず細胞を沈降させることができ、培養した細胞が回収時に受けるダメージを抑制するとともに、煩雑な回収操作を簡略化することができる。
　従来の培養細胞の回収方法では、培養中の細胞分散液を撹拌することにより、培養された細胞が沈降することを防止し、浮遊培養を維持していた。
　これに対して、本発明の培養細胞の回収方法では、浮遊培養時にセルロースナノファイバーのネットワークが細胞に浮力を与えるため、培養中の細胞分散液を撹拌することなく、浮遊培養を維持することができる。
　また、スフェロイドの直径が所定の分布を持つことにより、スフェロイドの中心部まで細胞増殖に必要な酸素および栄養分が十分に届き、細胞増殖率の向上に有利な直径が小さなスフェロイドと、セルロースナノファイバーのネットワークに衝突して、これを崩壊せしめ、細胞沈降率の向上に有利な直径が大きなスフェロイドと、の両方を単一の培養容器中の形成することができ、細胞増殖率および細胞沈降率を向上させることができる。
　以下では、セルロースナノファイバーをＣＮＦ（cellulose nanofiber）という場合がある。
　なお、本明細書において「～」を用いて表される範囲は、その範囲に「～」の前後に記載された両端を含む範囲を意味する。例えば、「ａ～ｂ」（ここで、ａおよびｂはある数値（実数）を表し、かつ、ａ＜ｂであるとする。）という範囲には、ａおよびｂを含む。
［培養細胞の回収方法］
　以下、本発明の培養細胞の回収方法を詳細に説明する。
　本発明の培養細胞の回収方法は、培養終了した単一培養容器中の培養細胞分散液から培養された細胞を沈降させる沈降工程を備える、培養細胞の回収方法である。
　また、本発明の培養細胞の回収方法においては、培養細胞分散液は、培養された細胞と、基礎培地成分と、平均直径２．０ｎｍ以上１００ｎｍ以下のセルロースナノファイバーと、を含む。
　さらに、本発明の培養細胞の回収方法においては、培養細胞分散液中の培養された細胞の総数が５．０×１０７個以上であり、培養細胞分散液中のセルロースナノファイバーの含有量が培養細胞分散液の０．０１０質量％以上１．０質量％以下であり、かつ培養された細胞からなるスフェロイドの直径の分布が０．１０以上３．０未満である。
〈沈降工程〉
　沈降工程を詳細に説明する。
　沈降工程では、培養終了した単一培養容器中の培養細胞分散液から、培養された細胞を沈降させる。
《培養終了した単一培養容器》
　培養終了した単一培養容器とは、細胞の培養が終了した状態の培養容器であって、培養終了時から内容物に意図的な改変が加えられていない培養容器をいう。具体的には、培養終了時から内容物が変更されていない単一の培養容器をいい、培養が終了した複数の培養容器の内容物を混合した培養容器をいうものではない。
　本発明の培養細胞の回収方法では、培養終了した単一の培養容器をそのまま沈降処理に適用する。
　培養終了した単一培養容器を用いることによって、培養終了時のスフェロイドの直径の分布およびセルロースナノファイバーのネットワークが壊されることがないので、簡単な沈降操作で細胞を沈降させることができ、高い細胞沈降率を達成することができる。
《培養細胞分散液》
　培養細胞分散液は、培養された細胞と、基礎培地成分と、平均直径２．０ｎｍ以上１００ｎｍ以下のセルロースナノファイバーと、を含む。
（培養された細胞）
　培養細胞分散液に含まれる培養された細胞とは、上記培養容器中で培養された細胞である。
　培養細胞分散液に含まれる培養された細胞の総数は５．０×１０７個以上であれば特に限定されないが、好ましくは５．０×１０８個以上５．０×１０１２個以下であり、より好ましくは５．０×１０９個以上５．０×１０１２個以下である。
　細胞の総数が５．０×１０７個未満では、所定のスフェロイドの直径の分布を達成し難く、僅かな衝撃等によってＣＮＦのネットワークに培養した細胞が十分に沈降するだけの欠陥を生じさせることができず、良好な細胞沈降率を達成することができない。また、細胞の総数が５．０×１０１２個以下であると、細胞に十分な酸素を供給することができ、細胞増殖率がより向上する。
　培養細胞分散液中の細胞の総数を５．０×１０７個以上とするには、浮遊培養持に細胞分散液の内部まで酸素を拡散させることが望ましい。酸素の拡散は細胞分散液中の拡散が律速のため、細胞分散液に温度勾配を形成させ、僅かな対流を起こし酸素拡散を行うことが好ましい。細胞分散液を撹拌すると、ＣＮＦのネットワークが崩れ、浮遊培養中に細胞が沈降してしまい、細胞に十分な酸素が供給されず、細胞増殖率が低下する。
　このため、培養工程において、浮遊細胞分散液（培養工程において、浮遊培養している細胞および培養液からなる細胞分散液をいう。）に温度分布を付与することが好ましい。
　なお、浮遊細胞分散液に温度分布を付与することについては、培養工程の説明において詳細を記載する。
　細胞は、特に限定されず、種々の細胞を含み得る。
　細胞の由来は、特に限定されないが、好ましくは動物細胞であり、より好ましくはヒト細胞である。
　細胞の種類は、特に限定されないが、好ましくは幹細胞であり、より好ましくは胚性幹細胞（以下「ＥＳ細胞」という場合がある。：ＥＳ，embryonic stem）、体性幹細胞、および人工多能性幹細胞（以下「ｉＰＳ細胞」という場合がある。：ｉＰＳ，induced pluripotent stem）からなる群から選択される少なくとも１つである。
　細胞の由来および種類は、特に限定されないが、好ましくはヒト幹細胞であり、より好ましくはヒト胚性幹細胞（ヒトＥＳ細胞）、ヒト体性幹細胞、およびヒト人工多能性細胞（ｉＰＳ細胞）からなる群から選択される少なくとも１つである。
　幹細胞は未分化のため、スフェロイドを形成し易く、細胞増殖率と細胞沈降率とを両立しやすいからである。
　体性幹細胞としては、例えば、造血幹細胞、臍帯血幹細胞、衛星細胞、腸管幹細胞、毛包幹細胞、間葉系幹細胞、神経幹細胞、内皮幹細胞、嗅粘膜幹細胞、神経冠幹細胞、および精巣細胞などが挙げられ、好ましくは間葉系幹細胞である。
　また、ヒト体性幹細胞としては、例えば、ヒト造血幹細胞、ヒト臍帯血幹細胞、ヒト衛星細胞、ヒト腸管幹細胞、ヒト毛包幹細胞、ヒト間葉系幹細胞、ヒト神経幹細胞、ヒト内皮幹細胞、ヒト嗅粘膜幹細胞、ヒト神経冠幹細胞、およびヒト精巣細胞などが挙げられ、好ましくはヒト間葉系幹細胞である。
　いろいろな型の細胞分化可能で、治療に活用され得る間葉系幹細胞は、通常、生体から採取し、選別し、そして純化したものを陥る。本発明の回収方法において使用できる間葉系幹細胞としては、患者から直接採取される臨床用の初代ヒト間葉系幹細胞ばかりでなく、試験研究用に用い得る細胞バンクより入手できる間葉系幹細胞、および不死化された間葉系幹細胞株も挙げられる。
　当業者であれば既知のとおり、これらの間葉系幹細胞は、臨床上の適用の観点から捉えると、自家ソース由来、異種異系ソース由来、または異種間ソース由来のいずれの細胞であってもよい。また、採取源は、ドナー骨髄、組織生検、胚性ソース、または出生後ソースなどのいずれの採取源であってもよい。具体的には、腸骨稜の骨髄、大腿頸骨、脊椎、肋骨、もしくはその他の骨髄腔由来、または胚性卵黄嚢、胎盤、臍帯、骨膜、胎児または青年期の皮膚、および血液を含む組織生検由来などの採取源が挙げられる。
　ｉＰＳ細胞としては、例えば、国際公開第２０１５／０３７５３５号、特許第５５９０６４６号公報、国際公開第２０１１／０４３４０５号、国際公開第２０１３／０７７４２３号、または国際公開第２０１４／１３６５８１号（［００５０］～［００６１］）に記載されたｉＰＳ細胞を使用することができる。
　なお、沈降工程における「培養された細胞」、後述する播種工程における「播種された細胞」および種細胞としての「細胞」、ならびに後述する培養工程における「浮遊培養される細胞」および種細胞から浮遊培養する「細胞」は、いずれも、上記した細胞であってよい。
　培養細胞分散液中の培養された細胞からなるスフェロイドの直径の分布は０．１０以上３．０未満である、
　スフェロイドの直径の分布は、０．１０以上３．０未満であれば特に限定されないが、好ましくは０．２０以上２．１以下であり、より好ましくは０．３０以上１．０以下である。
　スフェロイドの直径の分布が０．１０未満では僅かな衝撃等によってはＣＮＦのネットワークを破壊できず細胞沈降率が低下する。また、スフェロイドの直径の分布が３．０以上では培養中にネットワークが破壊され浮遊培養できず細胞増殖率が低下する。なお、培養終了した単一培養容器中とは、細胞の培養を終了した後に複数の培養容器からの培養細胞分散液を混合したものではなく、培養終了時の単一の培養容器内の培養細胞分散液を意味する。
　直径が大きなスフェロイドと、直径が小さなスフェロイドとの両方が存在する（スフェロイド径分布を付与）ことで、高い細胞増殖率および高い細胞沈降率を両立できる。
　直径が大きなスフェロイドが存在すると、ＣＮＦのネットワークを壊し易く、細胞沈降率が向上する。僅かな振動で直径が大きなスフェロイドが動き、ＣＮＦのネットワークを破壊するためである。
　一方、直径が大きなスフェロイドは内部に酸素が浸透し難く、細胞増殖率が低下し易い上、ＣＮＦのネットワークは数か所破壊されれば連鎖的に崩壊するため、直径が大きなスフェロイドは少量あればよい。
　直径が小さなスフェロイドは、細胞沈降率を向上させ難いが、細胞増殖率を高くすることができるため、これも存在させることが必要である。スフェロイドの表面積が大きく、培養液から酸素等を取り込み易いためである。
　したがって、本発明では、直径が大きなスフェロイドと、直径が小さなスフェロイドとが両方存在し、スフェロイドの直径の分布が所定範囲内となることが必要である。
　また、スフェロイドの平均直径は、特に限定されないが、好ましくは５０μｍ以上８００μｍ以下であり、より好ましくは１００μｍ以上７００μｍ以下であり、さらに好ましくは１５０μｍ以上６００μｍ以下である。
　スフェロイドの平均直径がこの範囲内であると、直径の大きなスフェロイド（「大スフェロイド」という場合がある。）の中心部の細胞に十分な栄養および酸素が供給され、細胞増殖率が向上するとともに、大スフェロイドがＣＮＦのハイドロゲルネットワークを容易に破壊することができ、細胞沈降率が向上する。
　また、スフェロイドの平均直径を調節する方法は、特に限定されないが、例えば、ＣＮＦのカルボキシ基含有量を調整することによって調節することができる。ＣＮＦ表面のカルボキシ基により、細胞が集合し易く、大スフェロイドを形成し易いためである。すなわち、ＣＮＦのカルボキシ基含有量が少ないとスフェロイドの平均直径は小さくなり、カルボキシ基含有量が多いとスフェロイドの平均直径は大きくなる。
　なお、スフェロイドの直径およびその分布は、以下の方法により求めたものである。
　培養液に細胞を播種した後、温度　３７℃、湿度　９５％ＲＨ、二酸化炭素濃度　５体積％で５日間培養する。培養により得られた細胞分散液を２ｍＬサンプリングし、これを直径２０ｍｍの培養ウェルに注入する。ウェルの中央部を、光学顕微鏡を用いて、倍率２００倍で観察し、スフェロイドの直径を任意に２０点計測する。直径の計測は、２０点のスフェロイドのそれぞれについて長辺および短辺を測定し、これらの算術平均値を各スフェロイドの直径Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３・・・Ｄ２０とする。こうして測定したスフェロイドの直径から、下記式によって２０点のスフェロイドの直径の算術平均値Ｄａｖｇおよびスフェロイドの直径の分布Ｄｄｉｓｔを算出する。
　Ｄａｖｇ＝（Ｄ１＋Ｄ２＋Ｄ３＋・・・＋Ｄ２０）／２０
　Ｄｄｉｓｔ＝（Ｄｍａｘ－Ｄｍｉｎ）／Ｄａｖｇ
　ただし、Ｄｍａｘはスフェロイドの直径の最大値であり、Ｄｍｉｎはスフェロイドの直径の最小値である。
　直径の大きなスフェロイド（以下「大スフェロイド」という場合がある。）は、例えば、播種工程において、播種細胞分散液（播種工程において、播種した細胞および培養液からなる細胞分散液をいう。）に細胞数分布を付与すること、および／または、培養工程において、浮遊細胞分散液（培養工程において、浮遊培養している細胞および培養液からなる細胞分散液をいう。）中のＣＮＦの含有量を所定範囲内として細胞に接着性を付与することによって、形成することができる。
　なお、播種細胞分散液に細胞数分布を付与することについては、播種工程に関する説明を行う際に説明する。
　直径の小さなスフェロイド（以下「小スフェロイド」という場合がある。）は、例えば、浮遊培養工程において、浮遊細胞分散液に温度分布を付与して、大スフェロイドを解体することによって、形成することができる。
　なお、浮遊細胞分散液に温度分布を付与することについては、培養工程に関する説明を行う際に説明する。
　大スフェロイドおよび小スフェロイドの形成によって、所定のスフェロイドの直径の分布を容易に達成することができる。
　５．０×１０７個以上といった大量の細胞を、セルロースナノファイバーを含む培養液中で培養すると、上記したスフェロイドの直径の分布が発現し易い。
　大スフェロイドの解体による小スフェロイドの形成は、確率的に発生するため、母集団、すなわち、細胞総数が大きいほど発生し易い。スフェロイドどうしの衝突によるものではないため、細胞総数を増加させることが好ましい。
　細胞総数を増加させ、大量培養をするには、浮遊培養時に浮遊細胞分散液に温度分布を付与することが好ましい。温度分布の付与については後述する。
　本発明では、複数の培養容器からの、スフェロイドの平均直径が大きな培養細胞分散液とスフェロイドの平均直径が小さな培養細胞分散液とを混合することによって、単一の培養容器内の培養細胞分散液中のスフェロイドの直径の分布を所定の範囲内としても、優れた細胞沈降率を得ることはできない。培養終了した単一培養基内の培養細胞分散液中のスフェロイドの直径の分布を所定の範囲内とすることによってはじめて、本発明は上記効果を奏する。すなわち、スフェロイドの直径の分布が、培養終了時に上記範囲内となっていることが、本発明の作用効果を奏するために肝要である。
　別々の培養容器で培養して得られた、スフェロイドの平均直径が大きな培養細胞分散液とスフェロイドの平均直径が小さな培養細胞分散液とを混合しても、優れた細胞沈降率、すなわち高い回収率、を得られない理由は次の通り説明できる。
　培養初期からスフェロイドの直径の分布を上記範囲内とすると、直径の大きなスフェロイドおよび直径の小さなスフェロイドが容器内で均一に分布し、培養終了後、軽衝撃等を与えてハイドロゲルのネットワークを崩す際、均一に壊れるため、培養した細胞を沈降させ易く、細胞沈降率が向上する。
　一方、培養終了後に複数の培養細胞分散液を混合すると、直径の大きなスフェロイドおよび直径の小さなスフェロイドが不均一に分散され、ネットワークが均一に壊れず、ハイドロゲルの塊が残るため、培養した細胞を沈降させ難く、細胞沈降率が低下する。
（基礎培地成分）
　培養細胞分散液に含まれる基礎培地成分とは、細胞を培養するために必要な栄養成分を意味する。細胞の培養中に栄養成分が消費されるため、培養開始時と培養終了時とでは、基礎培地成分の含有量は、通常、相違する。
　培養開始時の基礎培地成分は、細胞の種類によって適宜選択することができるが、ヒト細胞を培養するための基礎培地成分を含む培地としては、例えば、イーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ（Eagle's minimal essential medium）と称する場合がある。）および／またはその変法培地などが挙げられる。ＥＭＥＭの変法培地として、例えば、ダルベッコ・フォークト変法イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ（Dulbecco's modified Eagle medium））が挙げられる。また、基礎培地成分を含む培地としては、これらの最小必須培地にビタミン、アミノ酸、およびグルコース等の成分を添加したものも含まれる。
（セルロースナノファイバー）
　培養細胞分散液に含まれるセルロースナノファイバーは、平均直径２．０ｎｍ以上１００ｎｍ以下のセルロースナノファイバー（以下、ＣＮＦ（cellulose nanofiber）という場合がある。）である。
　ＣＮＦの平均直径は、２．０ｎｍ以上１００ｎｍ以下であれば特に限定されないが、好ましくは３．０ｎｍ～５０ｎｍ、より好ましくは４．０～２０ｎｍである。
　ＣＮＦの平均直径が２．０ｎｍ未満では、ＣＮＦのネットワーク構造が弱くなり過ぎ、後述する培養工程において、培養中の細胞の浮遊性が低下し、細胞増殖率が低下する。
　これは、細胞を浮遊培養できなくなることによって、細胞の増殖に必要な酸素および栄養が十分に供給されず、細胞の増殖が抑制されるからである。
　ＣＮＦの平均直径が１００ｎｍ超では、ネットワーク構造が強くなりすぎ、沈降工程において、僅かな衝撃等によってスフェロイドを沈降させ難く、細胞沈降率が低下する。
　これは、僅かな衝撃等がトリガーとなって、直径が大きなスフェロイドがＣＮＦのネットワークに衝突し、ＣＮＦのネットワークを破壊して、浮力を失わせ、細胞を沈降させるためである。
　ＣＮＦの平均直径は、その製造条件を調整することによって、調節することができる。
　例えば、機械解砕でＣＮＦを製造する場合、解砕機の圧力を高くするほど、または解砕機の処理回数（パス回数）を多くするほど、ＣＮＦの平均直径を小さくすることができる。すなわち、ＣＮＦの平均直径を細くすることができる。解砕機の圧力を低くするほど、または解砕機の処理回数（パス回数）を少なくするほど、ＣＮＦの平均直径を大きくすることができる。すなわち、ＣＮＦの平均直径を太くすることができる。
　また、例えば、化学解砕でＣＮＦを製造する場合、化学修飾（例えば、酸化（特許第４９９８９８１号公報を参照）、カルボキシメチル化（例えば、国際公開第２０１５／１０７９９５号を参照）、またはリン酸エステル化（例えば、国際公開第２０１４／１８５５０５号を参照）など）の後に機械解砕し、解砕機の圧力および／または処理回数を調整することによって、ＣＮＦの平均直径を調節することができる。機械解砕でＣＮＦを製造する場合と同様、解砕機の圧力を高くするほど、または解砕機の処理回数（パス回数）を多くするほど、ＣＮＦの平均直径を小さくすることができ、解砕機の圧力を低くするほど、または解砕機の処理回数（パス回数）を少なくするほど、ＣＮＦの平均直径を大きくすることができる。
　なお、ＣＮＦの平均直径は、以下の方法（特許第５５４４０５３号明細書を参照）により求めたものである。
　ＣＮＦ濃度が０．００１質量％となるように希釈したＣＮＦ水分散液を調製する。このＣＮＦ分散液をマイカ製試料台に薄く延ばし、５０℃で加熱乾燥させて観察用試料を作成する。観察用試料をＡＦＭ（Atomic Force Microscope；原子間力顕微鏡）を用いて観察し、観察した形状像の断面高さを１０点計測する。１０点の計測値の算術平均値をＣＮＦの平均直径とする。
　ＣＮＦの平均繊維長は、特に限定されないが、好ましくは０．２０μｍ以上２．０μｍ以下であり、より好ましくは０．３０μｍ以上１．５μｍ以下であり、さらに好ましくは０．４０μｍ以上１．０μｍ以下である。
　この範囲内であると、ＣＮＦのネットワークを崩すことがさらに容易となるため、細胞沈降率細胞をさらに向上させることができる。
　なお、ＣＮＦの平均繊維長は、特表２０１３－５４１９５６号公報に記載された方法に従って測定することができる。
　ＣＮＦの平均繊維長は、その製造条件を調整することによって、調節することができる。
　例えば、機械解砕でＣＮＦを製造する場合、解砕処理時のＣＮＦ分散液の温度を上げるほど平均繊維長を短くすることができ、ＣＮＦ分散液の温度を下げるほど平均繊維長を長くすることができる。
　また、例えば、化学解砕でＣＮＦを製造する場合、化学修飾（例えば、酸化（特許第４９９８９８１号公報を参照）、カルボキシメチル化（例えば、国際公開第２０１５／１０７９９５号を参照）、またはリン酸エステル化（例えば、国際公開第２０１４／１８５５０５号を参照）など）の際の処理温度を上げるほど平均繊維長を短くすることができ、処理温度を下げるほど平均繊維長を長くすることができる。
　ＣＮＦの含有量は、培養細胞分散液の０．０１０質量％以上１．０質量％以下であり、好ましくは０．０２０質量％以上０．５０質量％以下、より好ましくは０．０３０質量％以上０．１０質量％以下である。
　ＣＮＦの含有量を培養細胞分散液の０．０１０質量％以上１．０質量％以下の範囲内とすることで、僅かな衝撃等でネットワークに欠陥を発生させ易く、浮力が低下し、細胞沈降率を向上することができる。液培養細胞分散液中のＣＮＦの含有量が０．１０質量％未満では、ＣＮＦが培養した細胞に十分な浮力を与えるネットワークを形成することができず、良好な細胞増殖率を達成することができない。また、培養細胞分散液中のＣＮＦの含有量が１．０質量％超では、僅かな衝撃等によってＣＮＦのネットワークに培養した細胞が十分に沈降するだけの欠陥を生じさせることができず、良好な細胞沈降率を達成することができない。
　なお、本発明において「良好な細胞沈降率」または「細胞沈降率が良好である」とは、培養終了後、培養細胞分散液（沈降工程における、培養された細胞と培養液からなる分散液をいう。）に僅かな衝撃を与えるだけで細胞（スフェロイドを含む。）が沈降することをいう。
　ＣＮＦは、カルボキシ基を含有することが好ましい。
　ＣＮＦのカルボキシ基含有量は、特に限定されないが、好ましくは０．６０ｍｍｏｌ／ｇ以上２．０ｍｍｏｌ／ｇ以下であり、より好ましくは０．７０ｍｍｏｌ／ｇ以上１．９ｍｍｏｌ／ｇ以下であり、さらに好ましくは０．９０ｍｍｏｌ以上１．８ｍｍｏｌ／ｇ以下である。
　ＣＮＦのカルボキシ基含有量がこの範囲内であると、ＣＮＦの細胞への吸着力が適度なものとなることにより、細胞相互の凝集を促進するため、直径の大きなスフェロイド（「大スフェロイド」という場合がある。）の形成をし易くし、かつ、温度勾配によって大スフェロイドをバラし易くなることにより、直径の小さなスフェロイド（「小スフェロイド」という場合がある。）の形成をし易くするため、スフェロイドの直径の分布を所定範囲内とすることがより容易となる。
　ＣＮＦにカルボキシ基を導入する方法は、特に限定されるものではないが、例えば、ＴＥＭＰＯ（２，２，６，６－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ－１－ｐｙｐｅｒｉｚｉｎｅ－Ｎ－ｏｘｙｌ；２，２，６，６－テトラメチル－１－ピペリジン－Ｎ－オキシル）酸化による方法（例えば、国際公開２０１０／１１６８２６号、または国際公開第２００９／０８４５６６号等を参照）、およびカルボキシメチル化する方法（例えば、国際公開第２０１４／０８８０７２号、または特許第４０５５９１４号公報等を参照）などが挙げられる。酸化処理の際の反応時間、反応温度および／もしくは酸化剤の量、ならびに／またはカルボキシメチル化処理の際の反応時間、反応温度および／もしくはカルボキシメチル化剤の量等を調整することにより、カルボキシ基導入量を調整することができる。
　なお、ＣＮＦのカルボキシ基含有量は、以下の方法（特許第５３５１５８６号明細書を参照）により求めたものである。
　ＣＮＦの０．５質量％スラリーを６０ｍＬ調製し、０．１Ｍ塩酸水溶液を加えてｐＨ２．５とする。このスラリーに０．０５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を滴下してｐＨが１１になるまで電気伝導度を測定する。電気伝導度の変化が緩やかな弱酸の中和段階において消費された水酸化ナトリウム水溶液量Ａ（ｍＬ）から、下記式により算出する。
　カルボキシ基含有量（ｍｍｏｌ／ｇ）＝Ａ（ｍＬ）×０．０５（ｍｏｌ／Ｌ）／ＣＮＦ質量（ｇ）
《沈降操作》
　沈降工程は、培養容器に僅かな衝撃等を加える沈降操作を含んでもよい。
　ここで、「僅かな衝撃等」は特に限定されないが、例えば、培養容器を僅かな高さ（例えば「数ｍｍの高さ」をいう。）から落とす、または、培養容器を軽く叩く、等の行為による衝撃等が挙げられる。
　より具体的には、僅かな衝撃等として、以下に例示される。ただし、弱い機械的な刺激であればよく、以下に例示されるものに限定されない。
・衝撃
　培養細胞分散液に僅かな衝撃を与えることによって、培養した細胞を沈降させることができる。培養細胞分散液が入った培養容器に衝撃を与えてもよいし（容器衝撃法）、培養細胞分散液に球等を投げ入れて衝撃を与えてもよい（投入衝撃法）。容器衝撃法は、例えば、培養細胞分散液の入った培養容器を所定の高さから落とすことによって実施される。投入衝撃法は、例えば、錘を所定の高さから培養細胞分散液に投げ入れることで実施される。衝撃の強度は「ガル（Ｇａｌ）」で表され、１．０ガル＝１．０ｃｍ／ｓ２＝１．０×１０－２ｍ／ｓ２である。本発明の培養細胞の回収方法においては、好ましくは８．０ガル以下、より好ましくは０．２０ガル以上５．０ガル以下、さらに好ましくは０．４０ガル以上３．０ガル以下、の衝撃を培養細胞分散液に与えることにより、ＣＮＦのネットワークが破壊され、培養した細胞を沈降させることができる。
　培養した細胞を沈降させた後は、例えば、デカンテーション、デカントアスピレーション、またはアスピレーションなど、従来公知の手段によって、沈降上清である培養液を除去することができる。
・振動
　培養細胞分散液に軽く振動を与えることによって、培養した細胞を沈降させることができる。これは、たとえば容器を振ることで達成できる。振動の大きさは「デシベル（ｄＢ）」で表される。本発明の培養細胞の回収方法においては、好ましくは７０ｄＢ以下、より好ましくは３０ｄＢ以上６５ｄＢ以下、さらに好ましくは４０ｄＢ以上６０ｄＢ以下、の振動を培養細胞培養液に与えることにより、ＣＮＦのネットワークが破壊され、培養した細胞を沈降させることができる。
・撹拌
　培養細胞分散液に軽く回転を与えることによって、培養した細胞を沈降させることができる。培養細胞分散液が入った培養容器ごと回転させてもよいし、培養細胞分散液に撹拌羽および／またはマクネティックスターラーを入れて撹拌してもよい。撹拌の強度は「回毎分（ｒｐｍ；ｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎ　ｐｅｒ　ｍｉｎｕｔｅ）で表される。本発明の培養細胞の回収方法においては、好ましくは２００ｒｐｍ以下、より好ましくは１０ｒｐｍ以上１５０ｒｐｍ以下、さらに好ましくは２０ｒｐｍ以上１００ｒｐｍ以下、の撹拌を培養細胞分散液に与えることにより、ＣＮＦのネットワークが破壊され、培養した細胞を沈降させることができる。なお、培養細胞分散液が入った培養容器ごと回転させる場合、従来の培養細胞の回収方法において行われていた遠沈処理も培養した細胞を含む培養液が入った容器を回転する点が共通するが、通常の細胞沈降には１０００ｒｐｍ（３３５×ｇ）以上と、本発明の回転数の５倍以上の回転数が必要である。そのため、細胞に高い加速度をかけることとなり、培養した細胞が死亡し易い。
〈培養工程〉
　本発明の培養細胞の回収方法は、沈降工程を行う前に、培養工程を実施してもよい。
　培養方法は、特に限定されないが、例えば、国際公開第２０１５／１１１７３４号（［００３２］～［００３３］）、または国際公開第２０１４／１３６５８１号（［００６３］～［００９５］）に記載された浮遊培養の方法を用いる事ができる。
（温度分布）
　培養工程においては、浮遊細胞分散液（培養工程において、浮遊培養している細胞および培養液からなる細胞分散液をいう。）に温度分布を付与してもよい。
　浮遊培養時に付与する温度分布は、特に限定されないが、好ましくは０．１℃以上３．０℃以下、より好ましくは０．２℃以上２．０℃以下、さらに好ましくは０．３℃以上１．０℃以下である。
　温度分布がこの範囲内であると、細胞分散液中に適度な温度勾配が規制され、浮遊培養時の細胞分散液に弱い撹拌効果を付与することとなり、大スフェロイドの解体による小スフェロイドの形成が促進され、所定のスフェロイドの直径の分布を達成することができる。
　また、撹拌効果により浮遊培養持の細胞分散液中の酸素拡散がより向上するとともに、ＣＮＦのネットワーク形成に影響を与えず、細胞の浮遊培養に支障がないことから、細胞増殖率がより向上する。結果として、細胞増殖率および細胞回収率をともに向上させることができる。
　このような温度分布を浮遊細胞分散液に付与する方法は、特に限定されないが、例えば、浮遊細胞分散液が入った培養容器を恒温槽にいれ、かつ培養容器の下にホットプレートを敷き、両者に温度差を設けることで達成できる。
　ここで、温度分布は、以下の方法により求めたものである。
　温度数分布Ｔｄｉｆｆ（℃）は、浮遊培養中の細胞分散液の液温の最高値Ｔｍａｘ（℃）および最低値Ｔｍｉｎ（℃）から、下記式（３）によって求めた温度差である。
　Ｔｄｉｆｆ（℃）＝Ｔｍａｘ－Ｔｍｉｎ（℃）　　　　　（３）
〈播種工程〉
　本発明の培養細胞の回収方法は、培養工程を行う前に、播種工程を実施してもよい。
　播種工程は、種細胞として細胞を播種する工程である。
　培養液に細胞を播種する方法は、特に限定されないが、例えば、細胞を培養液に分散して調製した懸濁液を培養液に注入する方法が挙げられる。
（細胞数分布）
　播種細胞分散液（播種工程において、播種した細胞および培養液からなる細胞分散液をいう。）に、細胞数分布を付与してもよい。
　播種細胞分散液に細胞数分布を付与することによって、大スフェロイドの形成を促し、浮遊培養終了時に所定のスフェロイドの直径の分布を達成することが容易になる。
　播種細胞分散液に付与する細胞数分布は、特に限定されないが、好ましくは１．０％以上５０％以下、より好ましくは２．０％以上４０％以下、さらに好ましくは３．０％以上３０％以下である。
　この範囲内であると、浮遊培養時の細胞分散液中に大スフェロイドを形成することができ、所定のスフェロイドの直径の分布を達成することができる。その結果として、細胞増殖率および細胞回収率をともに向上させることができる。
　ここで、細胞数分布は、以下の方法により求めたものである。
　培養液に細胞を播種した直後に細胞分散液を２ｍＬサンプリングし、これを直径２０ｍｍの培養ウェルに注入する。ウェルの中央部を、光学顕微鏡を用いて、倍率２００倍で１０視野観察し、細胞分散液１ｍＬあたりの細胞数を計測する。最初に選択した１０視野の細胞数の算術平均値を計算し、１番目のサンプルの平均値Ｎ１（個／ｍＬ）とする。さらにサンプリングから１０回繰り返し、Ｎ２、Ｎ３、・・・、Ｎ１０を求める。Ｎ１～Ｎ１０から、下記式によって１０回のサンプリングによる細胞数の算術平均値Ｎａｖｇ（個／ｍＬ）および細胞数分布Ｎｄｉｓｔ（％）を求める。
　Ｎａｖｇ（個／ｍＬ）＝（Ｎ１＋Ｎ２＋Ｎ３＋・・・＋Ｎ１０）／１０　（個／ｍＬ）
　Ｎｄｉｓｔ（％）＝（Ｎｍａｘ－Ｎｍｉｎ）／Ｎａｖｇ×１００　（％）
　ただし、ＮｍａｘはＮ１～Ｎ１０の最大値であり、ＮｍｉｎはＮ１～Ｎ１０の最小値である。
　細胞数分布を付与する方法は、特に限定されないが、好ましくは培養液に細胞を播種する際に、時間間隔を変動させて培養液に注入（または、滴下）する方法が挙げられる。
　注入時間間隔の変動は、特に限定されないが、好ましくは０．１０以上１０以下、より好ましくは０．２０以上８．０以下、さらに好ましくは０．３０以上～５．０以下である。
　注入時間間隔の変動がこの範囲内であると、所定のスフェロイドの直径の分布を達成しやすい。
　ここで、入時間間隔の変動は、下記式によって求めた値である。
　注入時間間隔の変動＝（注入する時間の間隔の最大値と最小値の差）／全時間間隔の平均値
　細胞播種時に細胞数分布を付与することにより、培養時の細胞分散液中に細胞濃度の高いところ（播種時に時間間隔が短かったところ）と細胞濃度の低いところ（播種時に時間間隔が長かったところ）が形成される。すなわち、培養細胞分散液に細胞数分布が形成される。細胞数分布の高いところで細胞が集まり易く、大スフェロイドを形成し易い。
　このとき、ＣＮＦがカルボキシ基を有することで細胞と相互作用し易く（細胞を凝集させスフェロイドの形成を促し）、上記の効果をさらに促進する。
〈培養液調製工程〉
　本発明の培養細胞の回収方法は、播種工程を行う前に、培養液調製工程を実施してもよい。
　培養液調製工程は、細胞を培養するための培養液を調製する工程である。
　本発明において、培養液調製工程は、セルロースナノファイバーの調製と、培養液の調製とを含み得る。
　セルロースナノファイバーとして既製品を使用する場合は、セルロースナノファイバーの調製を省略することができる。
《セルロースナノファイバーの調製》
（ＴＥＭＰＯ（２，２，６，６－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ－１－ｐｙｐｅｒｉｚｉｎｅ－Ｎ－ｏｘｙｌ；２，２，６，６－テトラメチル－１－ピペリジン－Ｎ－オキシル）化ＣＮＦの調製方法）
　ＴＥＭＰＯ化ＣＮＦの調製方法は、特に限定されないが、例えば、特開２００９－２６３８５３号公報（［００１５］～［００３０］）に記載された方法に従って、セルロース系材料を酸化剤（次亜塩素酸ナトリウム）存在下でＴＥＭＰＯ（２，２，６，６－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ－１－ｐｙｐｅｒｉｚｉｎｅ－Ｎ－ｏｘｙｌ；２，２，６，６－テトラメチル－１－ピペリジン－Ｎ－オキシル）触媒酸化処理を行って酸化処理されたセルロース系原料を、超高圧ホモジナイザーを用いて湿式微粒化処理して解繊することにより、ＴＥＭＰＯ化セルロースナノファイバーを調製することができる。
（ＣＭ（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ；カルボキシメチル）化ＣＮＦの調製方法）
　ＣＭ化ＣＮＦの調製方法は、特に限定されないが、例えば、国際公開第２０１５／１０７９９５号（［００５６］）に記載された方法に従って、アルカリ触媒存在下で、ＣＭ化剤であるモノクロロ酢酸を用いてＣＭ化処理されたセルロース系原料を、高圧ホモジナイザーを用いて湿式微粒化処理して解繊することにより、ＣＭ化セルロースナノファイバーを調製することができる。
　その他、特開２０１５－２２７５１７、特開２０１５－１３４８７３、特開２０１５－４０３２、特開２０１４－１９３５８０、特開２０１３－１８５１２２、特許３６４２１４７、特許４０５５９１４、国際公開第１３／１３７１４０、国際公開第２０１５／１０７９９５、国際公開第２０１５／５０１１７、国際公開第２０１４／１８１５６０、国際公開第２０１４／１８１２６０、国際公開第２０１４／０８８０７２、国際公開第２０１４／０８７７６７等に記載されたＣＭ化ＣＮＦの調製方法を使用できる。
　（リン酸処理ＣＮＦ）
　リン酸基をＣＮＦに導入することにより、より好ましくはリン酸エステル化することにより、調製することができる。
　例えば、国際公開第２０１４／１８５５０５、特開２０１６－３７０３１、国際公開第２０１６／００２６８９、国際公開第２０１６／００２６８８号に記載された方法を使用することができる。
（機械解砕ＣＮＦの調製方法）
　機械解砕ＣＮＦの調製方法は、特に限定されないが、例えば、国際公開第２０１５／１１１７３４号（［００３９］）に記載された方法に従って、セルロース系原料を、高圧ホモジナイザーを用いて湿式微粒化処理して解繊することにより、機械解砕ＣＮＦを調製することができる。
　ＣＮＦの由来は特に限定されず、パルプ由来のＣＮＦ、バクテリアセルロース（ＢＣ；ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）由来のＣＮＦ、およびエレクトロスピニングによるナノファイバーのいずれも使用することができるが、特に好ましくはパルプ由来のＣＮＦである。これは、繊維強度が強く、継代でスフェロイドが細分化し難いからである。
《培養液の調製》
（ＣＮＦ無添加培養液の調製）
　使用する細胞に適した基礎培地を、従来公知の方法によって、調製することができる。
　例えば、国際公開第２０１５／１１１７３４号（［００２９］～［００３１］）に記載された培地、または国際公開第２０１４／１３６５８１号（［００６２］）に記載された培地を使用してもよい。
（ＣＮＦの添加）
　基礎培地にＣＮＦを添加することにより、培養液を調製する。
　ＣＮＦを基礎培地に添加する際、急激な撹拌を行うことで、ハイドロゲルのネットワークを乱し（欠陥を形成させ）崩し易くし、沈降工程における細胞沈降を促すことができる。
　具体的には、ＣＮＦを基礎培地に添加する際、マグネティックスターラー等で撹拌することが好ましく、さらには、添加後、高回転のホモジナイザーで撹拌することが好ましい。
　回転数は、特に限定されないが、好ましくは１０００ｒｐｍ～１０万ｒｐｍであり、より好ましくは３０００ｒｐｍ～５万ｒｐｍであり、さらに好ましくは６０００ｒｐｍ～２万ｒｐｍである。
　撹拌時間は、特に限定されないが、好ましくは１０秒以上３０分以下であり、より好ましくは２０秒以上１５分以下であり、さらに好ましくは３０秒以上１０分以下である。
　回転数および時間がともにこの範囲内であると、細胞増殖率および細胞沈降率がともに向上しやすい。
　培養液の量は、特に限定されないが、好ましくは２００ｍＬ以上であり、より好ましくは５００ｍＬ以上１０００Ｌ以下であり、さらに好ましくは１０００ｍＬ以上５００Ｌ以下である。培養液の体積がこの範囲内であると、浮遊培養工程において、浮遊細胞分散液中に酸素を十分に供給することができるため、大量の細胞を培養でき、その結果、効率的に培養細胞の回収をすることが容易となる。
［培養細胞分散液］
　本発明は、また、上記した本発明の培養細胞の回収方法に用いる培養細胞分散液を提供する。
　この培養細胞分散液は、既に述べたとおりである。
　以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明は以下の記載に限定して解釈されるものではない。
［実施例１～４、比較例１および２］
　以下に説明する比較例１、実施例１～４、および比較例２は、播種時の播種細胞濃度がスフェロイドの直径の分布に与える影響を比較した例である。
　なお、実施例１～４および比較例２は、播種時の播種細胞濃度を比較例１から変更した上、さらに、播種工程において細胞を播種する際に注入時間変動を付与し、かつ、培養工程において浮遊細胞分散液（培養工程における、浮遊培養中の細胞および培養液からなる細胞分散液をいう。）に温度分布を付与した例である。
〈比較例１〉
《培養液調製工程》
（セルロースナノファイバーの調製）
　特開２００９－２６３８５３号公報（［００１５］～［００３０］）に記載された方法に従って、セルロース系材料を酸化剤（次亜塩素酸ナトリウム）存在下でＴＥＭＰＯ（2,2,6,6-tetramethyl-1-pyperizine-N-oxyl；２，２，６，６－テトラメチル－１－ピペリジン－Ｎ－オキシル）触媒酸化処理を行って酸化処理されたセルロース系原料を、超高圧ホモジナイザーを用いて湿式微粒化処理して解繊することにより、ＴＥＭＰＯ化セルロースナノファイバー（ＴＥＭＰＯ化ＣＮＦ１」という場合がある。）を調製した。
　調製したＴＥＭＰＯ化ＣＮＦ１の平均直径およびカルボキシ基導入量を以下の方法に従って測定したところ、平均直径は５．０ｎｍであり、カルボキシ基導入量は１．９ｍｍｏｌ／ｇであった。
・平均直径の測定方法
　セルロースナノファイバーの濃度が０．００１質量％となるように希釈したセルロースナノファイバー水分散液（以下「ＣＮＦ水分散液」という場合がある。）を調製した。このＣＮＦ水分散液をマイカ製試料台に薄く延ばし、５０℃で加熱乾燥して観察用試料を作成し、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ：atomic force microscope）を用いて観察した形状像の断面高さを１０点計測し、平均直径を算出した。
・カルボキシ基導入量の測定方法
　セルロースナノファイバーの０．５質量％スラリーを６０ｍＬ調製し、０．１Ｍ塩酸水溶液を加えてｐＨ２．５とした後、０．０５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を滴下してｐＨが１１になるまで電気伝導度を測定し、電気伝導度の変化が穏やかな弱酸の中和段階において消費された０．０５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液の量（ａ）から、下記式を用いて算出した。
　カルボキシ基導入量（ｍｍｏｌ／ｇ）＝ａ（ｍＬ）×０．０５／セルロースナノファイバー質量（ｇ）
（培養液の調製）
　調製したＴＥＭＰＯ化ＣＮＦ１を純水と混合して０．３質量％水分散液（以下「ＣＮＦ分散液」という場合がある。）を得た。このＣＮＦ分散液を、１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌し、滅菌後、室温まで冷却した。
　粉末培地（ダルベッコ変法イーグル培地２，日水製薬（株）製）に加水し、３０分程マグネティックスターラーで撹拌してダルベッコ変法イーグル培地２溶液（以下「ＤＭＥＭ２溶液」という場合がある。）を調製した。ＤＭＥＭ２溶液を、１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌し、滅菌後、室温まで冷却した。
　オートクレーブ滅菌後、室温まで冷却したＤＭＥＭ２溶液に、滅菌したＣＮＦ分散液を、表１記載の濃度になるように無菌条件下で滴下した。滴下後、ＣＮＦ分散液を添加したＤＭＥＭ２溶液を、ホモミキサーを用いて、１００００ｒｐｍで５分間撹拌処理し、ＣＮＦ添加ＤＭＥＭ２溶液を得た。
　このＣＮＦ添加ＤＭＥＭ２溶液を室温まで冷却した後に、ろ過滅菌したＬ－グルタミン溶液（Ｌ－グルタミン溶液（×１００），和光純薬工業（株）製；２００ｍｍｏｌ／Ｌ）を終濃度２ｍＭとなるように添加し、さらに滅菌した１０質量％炭酸水素ナトリウム水溶液を１ｍＬ加え、アミノ酸添加ＤＭＥＭ２溶液を得た。このアミノ酸添加ＤＭＥＭ２溶液の少量を採取し、ｐＨ試験紙を使用して溶液のｐＨがｐＨ７．０～８．０の範囲内であることを確認した。少量を採取して残ったアミノ酸添加ＤＭＥＭ２溶液に、使用前に１０体積％となるようにＦＢＳ（fetal bovine serum；ウシ胎児血清）を加え、細胞の培養に使用する培養液を得た。
　培養容器として、親水化処理したポリスチレン製培養容器（浮遊細胞培養用フラスコ　ＭＳ－２１８００，住友ベークライト社製；培養面積２２５ｃｍ２；容量８００ｍＬ）を準備した。なお、培養容器は、培養液を注入した際の培養液の高さが４．０～５．０ｃｍとなる培養面積（底面積）を有するものを選定した。
　準備した培養容器に、調製した培養液を表１に示す量、無菌的に注入した。
《播種工程》
　培養液を注入した培養容器に、ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ（human mesenchymal stem cells），Ｌｏｎｚａ社製；カタログ番号　ＰＴ－２５０１）（以下「ヒト間葉系幹細胞ＰＴ－２５０１」という場合がある。）を種細胞として播種した（培養容器内の培養液に種細胞を播種したものを、以下「播種細胞分散液」という場合がある。）。具体的には、ヒト間葉系幹細胞ＰＴ－２５０１を培養液に分散して調製した懸濁液（以下「ＰＴ－２５０１懸濁液」という。）を培養液に注入した。
　この結果、下記細胞数分布の算出方法従って算出した細胞数分布は表１に示すとおりであった。
・細胞数分布の算出方法
　細胞を播種した直後に２ｍＬサンプリングし、これを直径２０ｍｍの培養ウェルに注入し、光学顕微鏡を用いて倍率２００倍で１０視野観察し、細胞数を計測して、このサンプリングにおける細胞数の平均値（算術平均値）を算出した。サンプリングから平均値の算出までを１０回繰返し、サンプリングごとの細胞数の平均値Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、・・・、Ｎ１０を算出した。これらの細胞数の平均値から、下記式によって細胞数分布を算出した。
　細胞数分布（％）＝｛（Ｎｍａｘ－Ｎｍｉｎ）／Ｎａｖｇ｝×１００（％）
　ただし、ＮｍａｘおよびＮｍｉｎは、それぞれ、Ｎ１からＮ１０までの最大値および最小値を表し、ＮａｖｇはＮ１からＮ１０までの算術平均値を表す。
《培養工程》
　細胞を播種した培養容器を、温度３７℃に設定したインキュベーター（Ｈｅｒａｃａｌｌ　ＶＩＯＳ　ＣＯ２インキュベーター，サーモフィッシャー株式会社製）の中に入れ、細胞の培養を開始した（培養工程における、浮遊培養中の細胞および培養液からなる細胞分散液を「浮遊細胞分散液」という。）。
　培養条件は、二酸化炭素濃度５．０体積％、および湿度９５％ＲＨとした。
　培養開始から１日後、培養容器に接着した細胞を取り除くため、培養容器中の浮遊細胞分散液を新しいアズノール滅菌容器（アズノール滅菌シャーレ　ＧＤ９０－１５，アズワン社製）に移し、さらに４日間、培養を継続して、スフェロイドを形成した。
《沈降工程》
　培養細胞分散液（沈降工程における、培養終了した培養容器中の培養された細胞および培養液からなる細胞分散液をいう。）中の総細胞数、スフェロイドの平均直径および直径の分布、細胞増殖率、細胞沈降率、ならびに細胞死亡率を以下に記載する方法に従って求めた。
　その結果、表１に示すとおり、細胞増殖率４．５倍であり、細胞沈降率６５％であり、細胞死亡率３．０％であった。
・細胞総数の算出方法
　培養細胞分散液を２ｍＬサンプリングし、トリプシン処理によってスフェロイドを形成している細胞をばらばらにした後、光学顕微鏡を用いて、培養細胞分散液１ｍＬあたりの細胞数を計測し、これに培養細胞分散液量をかけて培養細胞分散液中の細胞総数を算出した。
・スフェロイドの平均直径および直径の分布の算出方法
　培養細胞分散液を２ｍＬサンプリングし、これを直径２０ｍｍの培養ウェルに注入した。培養ウェルの中央部を、光学顕微鏡を用いて、倍率２００倍で観察し、スフェロイドの直径を任意に２０点計測した。直径の計測は、２０点のスフェロイドのそれぞれについて長辺および短辺を測定し、これらの算術平均値を各スフェロイドの直径Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３・・・Ｄ２０とした。こうして測定したスフェロイドの直径から、下記式によって２０点のスフェロイドの直径の算術平均値Ｄａｖｇおよびスフェロイドの直径の分布Ｄｄｉｓｔを算出した。
　Ｄａｖｇ＝（Ｄ１＋Ｄ２＋Ｄ３＋・・・＋Ｄ２０）／２０
　Ｄｄｉｓｔ＝（Ｄｍａｘ－Ｄｍｉｎ）／Ｄａｖｇ
　ただし、ＤｍａｘおよびＤｍｉｎは、それぞれ、スフェロイドの直径の最大値および最小値である。
・細胞増殖率の算出方法
　培養細胞分散液中の細胞総数をＮ個、播種した細胞数をＮｆ個として、細胞増殖率を下記式により算出した。
　細胞増殖率＝Ｎ／Ｎｆ　（倍）
　細胞増殖率は高いほどよく、特に７．３倍以上であることが望ましい。
・細胞沈降率の算出方法
１）沈降操作前の全スフェロイド数（Ｎ）の計測：
　培養細胞分散液を２ｍＬサンプリングし、これを３７℃に保った直径２０ｍｍのポリスチレン製培養ウェルに注入した。培養ウェルの中央部を、光学顕微鏡を用いて、倍率２００倍で１０視野観察し、各視野についてスフェロイド数を測定した。この平均値をＮ１とした。これを１０個の培養ウェルの培養液に対して繰返し実施し、Ｎ２、Ｎ３、・・・、Ｎ１０を求めた。Ｎ１～Ｎ１０の平均値から培養細胞分散液１ｍＬあたりのスフェロイド数Ｎ（個／ｍＬ）を算出した。なお、直径５０μｍ以上の細胞塊をスフェロイドとして扱った。
２）沈降操作後の浮遊（非沈降性）スフェロイド数（ｎ）の計測：
　上記培養ウェルに沈降処理を行った後、ウェル中の培養液の上澄みを静かに採取した。採取した上澄みを、同様に顕微鏡を用いて倍率２００倍で１０視野観察し、各視野について浮遊しているスフェロイド数を測定した。この平均値をｎ１とした。これを１０個の培養ウェルの培養液に対して繰り返し測定し、ｎ２、ｎ３、・・・、ｎ１０を求めた。ｎ１～ｎ１０の平均値から上澄み１ｍＬあたりの浮遊スフェロイド数ｎ（個／ｍＬ）を算出した。なお、直径５０μｍ以上の細胞塊をスフェロイドとして扱った。
３）細胞沈降率の算出：
　下記式により細胞沈降率（％）を算出した。
　細胞沈降率（％）＝｛（Ｎ－ｎ）／Ｎ｝×１００　（％）
　細胞沈降率は高いほどよく、特に７０％以上であることが望ましい。
・細胞死亡率の算出方法
　沈降操作前の細胞について、特表２０１３－５４１９５６号公報（［００８２］）に記載の方法に従って、生細胞と死細胞とを染め分け、沈降操作前の細胞生存率Ｘａ（％）を算出した。
　次に、沈降操作後の細胞について、同様にして、沈降操作後の細胞生存率Ｘｂ（％）を算出した。
　沈降操作による細胞死亡率を下記式により算出した。
　細胞死亡率（％）＝Ｘａ（％）－Ｘｂ（％）
　細胞死亡率は低いほどよく、特に５．０％以下であることが望ましい。
〈実施例１〉
《培養液調製工程》
　比較例１と同様にして培養液を調製した。
《播種工程》
　ヒト間葉系幹細胞ＰＴ－２５０１を培養液に分散して調製した懸濁液（以下「ＰＴ－２５０１懸濁液」という。）を、播種細胞分散液中の細胞濃度（播種時細胞濃度）が表１に示す値となるように培養液に注入した点、および、この際、ＰＴ－２５０１懸濁液の培養液への注入は、３０回に分けて行い、注入時間間隔を変更しながら、注入時間変動が表１に示す値となるように、かつ、平均注入時間間隔が５．０秒となるように行った点を除いて、比較例１と同様にして細胞を播種した。
　なお、注入時間変動は、下記式によって算出した。
　注入時間変動＝（注入時間間隔の最大値（秒）－注入時間間隔の最小値（秒））／平均注入時間間隔（秒）
《培養工程》
　細胞を播種した培養容器をプレートヒーター（プレートヒーターＭＰＨＫ型，株式会社ミスミ製；サイズ１５０×１５０ｍｍ）上に設置し、プレートヒーターごと、温度３７℃に設定したインキュベーター（Ｈｅｒａｃａｌｌ　ＶＩＯＳ　ＣＯ２インキュベーター，サーモフィッシャー株式会社製）の中に入れ、細胞の培養を開始した（培養工程における、浮遊培養中の細胞および培養液からなる細胞分散液を「浮遊細胞分散液」という。）点、プレートヒーターの出力を調整することによって、浮遊細胞分散液の上面および底部との間に表１の「温度分布（℃）」の欄に記載した温度差（浮遊細胞分散液の上面および底部に設置した熱電対で測定した温度の差をいう。）を設けた点、および、培養容器中の浮遊細胞分散液を新しいアズノール滅菌容器（アズノール滅菌シャーレ　ＧＤ９０－１５，アズワン株式会社製）に移した後、さらに４日間培養を継続した際に、表１の「温度分布（℃）」の欄に記載した温度差を設けた点を除いて、比較例１と同様にして、細胞の培養を行ってスフェロイドを形成した。
《沈降工程》
　比較例１と同様にして沈降操作を行った。
　その結果、表１に示すとおり、細胞増殖率９．２倍であり、細胞沈降率７５％であり、細胞死亡率４．０％であった。
〈実施例２〉
　播種工程において、播種時細胞濃度を表１に示す濃度とした点を除いて、実施例１と同様にして、培養液調製工程、播種工程、培養工程、および沈降工程を行った。
　その結果、表１に示すとおり、細胞増殖率９．３倍であり、細胞沈降率８０％であり、細胞死亡率３．０％であった。
〈実施例３〉
　播種工程において、播種時細胞濃度を表１に示す濃度とした点を除いて、実施例１と同様にして、培養液調製工程、播種工程、培養工程、および沈降工程を行った。
　その結果、表１に示すとおり、細胞増殖率９．５倍であり、細胞沈降率９６％であり、細胞死亡率２．０％であった。
〈実施例４〉
　播種工程において、播種時細胞濃度を表１に示す濃度とした点を除いて、実施例１と同様にして、培養液調製工程、播種工程、培養工程、および沈降工程を行った。
　その結果、表１に示すとおり、細胞増殖率８．６倍であり、細胞沈降率９５％であり、細胞死亡率３．０％であった。
〈比較例２〉
　播種工程において、播種時細胞濃度を表１に示す濃度とした点を除いて、実施例１と同様にして、培養液調製工程、播種工程、培養工程、および沈降工程を行った。
　その結果、表１に示すとおり、細胞増殖率７．２倍であり、細胞沈降率９５％であり、細胞死亡率４．０％であった。
〈比較例１、実施例１～４、および比較例２の結果の解説〉
　実施例１～４では、播種工程において播種時細胞濃度を変えることにより、培養終了した培養容器中の培養細胞分散液中のスフェロイドの直径の分布を変化させ、細胞増殖率および細胞沈降率に影響を与えた。
　実施例１～４のスフェロイドの直径の分布は０．１０以上３．０未満の範囲内であり、高い細胞増殖率（８．６倍以上）、および、高い細胞沈降率（７５％以上）を示した。
　また、実施例２～４のスフェロイドの直径の分布は０．２０以上２．１以下の範囲内であり、高い細胞増殖率（８．６倍以上）、および、より高い細胞沈降率（８０％以上）を示した。
　さらに、実施例３のスフェロイドの直径の分布は０．３０以上１．０以下の範囲内であり、より高い細胞増殖率（９．５倍）、および、さらに高い細胞沈降率（９６％）を示した。
　比較例１は、スフェロイドの直径の分布が本発明の規定する範囲を下回った例である。
　スフェロイドの平均直径が７５０μｍであり、直径の分布が０であったことから、直径がより大きなスフェロイドが形成されておらず、僅かな衝撃によってセルロースナノファイバーのネットワークを大規模に破壊することができず、細胞沈降率が低い結果となったと考えられる。
　また、比較例１は、スフェロイドの中心部まで細胞増殖に必要な酸素および栄養が十分に届く、直径がより小さなスフェロイドが形成されておらず、細胞増殖率が低い結果となった。
　比較例２は、スフェロイドの直径の分布が本発明の規定する範囲を超えた例である。
　スフェロイドの平均直径が７７０μｍであり、直径の分布が３．０であったことから、直径が大きなスフェロイドが形成された割合が大きく、培養中にセルロースナノファイバーのネットワークが破壊されてしまって浮遊培養できず、細胞増殖率が低い結果となった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
［実施例５～９］
　実施例５～９について、以下に説明する。
　実施例５～９は、セルロースナノファイバーの添加量が細胞増殖率および細胞沈降率に与える影響を比較する例である。
〈実施例５〉
《培養液調製工程》
（セルロースナノファイバーの調製）
　表２に示す平均直径およびカルボキシ基含有量となるように酸化剤の使用量および超高圧ホモジナイザーの圧力を調整した点を除いて、実施例１と同様にしてＴＥＭＰＯ化セルロースナノファイバー（以下「ＴＥＭＰＯ化ＣＮＦ２」という場合がある。）を調製した。
（培養液の調製）
　ＴＥＭＰＯ化ＣＮＦ１に代えて、調製したＴＥＭＰＯ化ＣＮＦ２を表２に示す添加量で使用した点を除いて、実施例１と同様にして培養液を調製した。
　調製した培養液を表２に示す量、培養容器に注入して、以降の工程に用いた。
《播種工程》
　ヒト間葉系幹細胞ＰＴ－２５０１に代えて、ヒト胚性幹細胞Ｈ９（WiCell Research Institute, Inc., Madison, WI, USA）を使用して、表２に示す細胞濃度および注入時間変動になるように培養液に注入した点を除いて、実施例１と同様にして細胞を播種した。これにより、播種細胞分散液（播種工程における、播種した細胞および培養液からなる細胞分散液をいう。）に、表２に示す細胞数分布を付与した。
《培養工程》
　プレートヒーターの出力を調整することによって、浮遊細胞分散液（培養工程における、浮遊培養中の細胞および培養液からなる細胞分散液をいう。）に、表２に示す温度分布を付与した点を除いて、実施例１と同様にして細胞を浮遊培養した。
《沈降工程》
（細胞、スフェロイド）
　培養が終了した培養容器内の培養細胞分散液（沈降工程における、培養された細胞および培養液からなる細胞分散液をいう。）中の細胞の総数、スフェロイドの平均直径、およびスフェロイドの直径の分布は、表２に示すとおりであった。
（沈降操作）
　培養細胞分散液の入った培養容器を左右に振ることで、培養容器中の培養細胞分散液に表２に示す強度の振動を与えた。
(結果）
　表２に示すとおり、細胞増殖率８．１倍であり、細胞沈降率９１％であり、細胞死亡率３．０％であった。
〈実施例６〉
　培養液調製工程において、ＴＥＭＰＯ化ＣＮＦ２の添加量を表２に示す添加量とした点を除いて、実施例５と同様にして、培養液調製工程、播種工程、培養工程、および沈降工程を行った。
　その結果、表２に示すとおり、細胞増殖率８．８倍であり、細胞沈降率９２％であり、細胞死亡率４．０％であった。
〈実施例７〉
　培養液調製工程において、ＴＥＭＰＯ化ＣＮＦ２の添加量を表２に示す添加量とした点を除いて、実施例５と同様にして、培養液調製工程、播種工程、培養工程、および沈降工程を行った。
　その結果、表２に示すとおり、細胞増殖率９．５倍であり、細胞沈降率９５％であり、細胞死亡率２．０％であった。
〈実施例８〉
　培養液調製工程において、ＴＥＭＰＯ化ＣＮＦ２の添加量を表２に示す添加量とした点を除いて、実施例５と同様にして、培養液調製工程、播種工程、培養工程、および沈降工程を行った。
　その結果、表２に示すとおり、細胞増殖率９．４倍であり、細胞沈降率８５％であり、細胞死亡率３．０％であった。
〈実施例９〉
　培養液調製工程において、ＴＥＭＰＯ化ＣＮＦ２の添加量を表２に示す添加量とした点を除いて、実施例５と同様にして、培養液調製工程、播種工程、培養工程、および沈降工程を行った。
　その結果、表２に示すとおり、細胞増殖率９．５倍であり、細胞沈降率７４％であり、細胞死亡率４．０％であった。
〈実施例５～９の結果の解説〉
　実施例５～９では、培養液中のセルロースナノファイバーの含有量を変えることにより、細胞増殖率および細胞沈降率に影響を与えた。
　また、実施例５～９のセルロースナノファイバーの含有量は培養細胞分散液の０．０１０質量％以上１．０質量％以下の範囲内であり、高い細胞増殖率（８．１倍以上）、および、高い細胞沈降率（７４％以上）を示した。
　さらに、実施例６～８のセルロースナノファイバーの含有量は培養細胞分散液の０．０２０質量％以上０．５０質量％以下の範囲内であり、より高い細胞増殖率（８．８倍以上）、および、より高い細胞沈降率（８５％以上）を示した。
　実施例７のセルロースナノファイバーの含有量は培養細胞分散液の０．０３質量％以上０．１０質量％以下の範囲内であり、さらに高い細胞増殖率（９．５倍）、および、さらに高い細胞沈降率（９５％）を示した。
　セルロースナノファイバーの含有量が、培養細胞分散液の０．０１０質量％以上１．０質量％以下の範囲内であると、高い細胞増殖率、および、高い細胞沈降率を得ることができ、培養細胞分散液の０．０２０質量％以上０．５０質量％以下の範囲内であると、より高い細胞増殖率、および、より高い細胞沈降率を得ることができ、培養細胞分散液の０．０３質量％以上０．１０質量％以下の範囲内であると、さらに高い細胞増殖率、および、さらに高い細胞沈降率を得ることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
［実施例１０～１４］
　実施例１０～１４について、以下に説明する。
　実施例１０～１４は、培養液に細胞を播種する際の注入（滴下）間隔に変動を付与し、播種細胞分散液（播種工程における、播種した細胞および培養液からなる細胞分散液をいう。）に付与する細胞数分布がスフェロイドの直径の分布に与える影響を比較する例である。
〈実施例１０〉
《培養液調製工程》
（セルロースナノファイバーの調製）
　国際公開第２０１５／１０７９９５号（［００５６］）に記載された方法に従って、アルカリ触媒存在下で、ＣＭ化剤であるモノクロロ酢酸を用いてＣＭ化処理されたセルロース系原料を、高圧ホモジナイザーを用いて湿式微粒化処理して解繊することにより、ＣＭ化セルロースナノファイバー（以下「ＣＭ化ＣＮＦ１」という場合がある。）を調製した。調製したＣＭ化ＣＮＦ１の平均直径およびカルボキシ基導入量は、表３に示すとおりであった。
（培養液の調製）
　ＴＥＭＰＯ化ＣＮＦ１に代えて、調製したＣＭ化ＣＮＦ１を表３に示す添加量で使用した点を除いて、実施例１と同様にして培養液を調製した。
　調製した培養液を表３に示す量、培養容器に注入して、以降の工程に用いた。
《播種工程》
　ヒト間葉系幹細胞ＰＴ－２５０１に代えて、ヒトｉＰＳ細胞ＩＭＲ９０－１（WiCell Research Institute, Inc., Madison, WI, USA）、を使用して、表３に示す細胞濃度および注入時間変動になるように培養液に注入した点を除いて、実施例１と同様にして細胞を播種した。これにより、播種細胞分散液（播種工程における、播種した細胞および培養液からなる細胞分散液をいう。）に、表３に示す細胞数分布を付与した。
《培養工程》
　プレートヒーターの出力を調整することによって、浮遊細胞分散液（培養工程における、浮遊培養中の細胞および培養液からなる細胞分散液をいう。）に、表３に示す温度分布を付与した点を除いて、実施例１と同様にして細胞を浮遊培養した。
《沈降工程》
（細胞、スフェロイド）
　培養が終了した培養容器内の培養細胞分散液（沈降工程における、培養された細胞および培養液からなる細胞分散液をいう。）中の細胞の総数、スフェロイドの平均直径、およびスフェロイドの直径の分布は、表３に示すとおりであった。
（沈降操作）
　培養細胞分散液に撹拌子を入れ、マグネティックスターラーを用いて撹拌子を表３記載の回転数で５分間撹拌した。
(結果）
　表３に示すとおり、細胞増殖率９．０倍であり、細胞沈降率７３％であり、細胞死亡率４．０％であった。
〈実施例１１〉
　播種工程において、表３に示す細胞数分布を付与した点を除いて、実施例１０と同様にして、培養液調製工程、播種工程、培養工程、および沈降工程を行った。
　その結果、表３に示すとおり、細胞増殖率９．２倍であり、細胞沈降率８３％であり、細胞死亡率５．０％であった。
〈実施例１２〉
　播種工程において、表３に示す細胞数分布を付与した点を除いて、実施例１０と同様にして、培養液調製工程、播種工程、培養工程、および沈降工程を行った。
　その結果、表３に示すとおり、細胞増殖率９．２倍であり、細胞沈降率９３％であり、細胞死亡率２．０％であった。
〈実施例１３〉
　播種工程において、表３に示す細胞数分布を付与した点を除いて、実施例１０と同様にして、培養液調製工程、播種工程、培養工程、および沈降工程を行った。
　その結果、表３に示すとおり、細胞増殖率８．６倍であり、細胞沈降率９５％であり、細胞死亡率３．０％であった。
〈実施例１４〉
　播種工程において、表３に示す細胞数分布を付与した点を除いて、実施例１０と同様にして、培養液調製工程、播種工程、培養工程、および沈降工程を行った。
　その結果、表３に示すとおり、細胞増殖率８．１倍であり、細胞沈降率９４％であり、細胞死亡率４．０％であった。
〈実施例１０～１４の結果の解説〉
　実施例１０～１４では、播種工程において注入時時間変動を付与することにより、培養終了した培養容器中の培養細胞分散液中のスフェロイドの直径の分布を変化させ、細胞増殖率および細胞沈降率に影響を与えた。
　０．１０～１０の注入時間変動を付与した実施例１０～１４は、細胞総数が８．１×１０９個～９．０×１０９個で、スフェロイドの直径の分布は０．１０～２．９であり、高い細胞増殖率（８．６倍以上）、および、高い細胞沈降率（７３％以上）を示した。
　０．２０～８．０の注入時間変動を付与した実施例１１および１２は、細胞総数が８．６×１０９個～９．２×１０９個で、スフェロイドの直径の分布は０．２０～２．１であり、より高い細胞増殖率（９．２倍）、および、より高い細胞沈降率（８３％以上）を示した。
　１．０の注入時間変動を付与した実施例１２は、細胞総数が９．２×１０９個で、スフェロイドの直径の分布は０．８０であり、高い細胞増殖率（９．２倍）、および、より高い細胞沈降率（９３％）を示した。
　以上より、注入時間変動が小さいほどスフェロイドの直径の分布が小さくなり、注入時間変動が大きいほどスフェロイドの直径の径分布が大きくなることがわかる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
［実施例１５～１９］
　実施例１５～１９について、以下に説明する。
　実施例１５～１９は、浮遊細胞分散液（培養工程における、浮遊培養中の細胞および培養液からなる細胞分散液をいう。）に付与する温度分布が細胞増殖率に与える影響を比較する例である。
〈実施例１５〉
《培養液調製工程》
（セルロースナノファイバーの調製）
　表４に示す平均直径およびカルボキシ基含有量となるように酸化剤の使用量および超高圧ホモジナイザーの圧力を調整した点を除いて、実施例１と同様にしてＴＥＭＰＯ化セルロースナノファイバー（以下「ＴＥＭＰＯ化ＣＮＦ３」という場合がある。）を調製した。
（培養液の調製）
　ＴＥＭＰＯ化ＣＮＦ１に代えて、調製したＴＥＭＰＯ化ＣＮＦ３を表４に示す添加量で使用した点を除いて、実施例１と同様にして培養液を調製した。
　調製した培養液を表４に示す量、培養容器に注入して、以降の工程に用いた。
《播種工程》
　ヒト間葉系幹細胞ＰＴ－２５０１に代えて、ヒトＥＳ細胞ＫｈＥＳ－１（京都大学再生医療科学研究所附属幹細胞医学研究センター）を使用して、表４に示す細胞濃度および注入時間変動になるように培養液に注入した点を除いて、実施例１と同様にして細胞を播種した。これにより、播種細胞分散液（播種工程における、播種した細胞および培養液からなる細胞分散液をいう。）に、表４に示す細胞数分布を付与した。
《培養工程》
　プレートヒーターの出力を調整することによって、浮遊細胞分散液（培養工程における、浮遊培養中の細胞および培養液からなる細胞分散液をいう。）に、表４に示す温度分布を付与した点を除いて、実施例１と同様にして細胞を浮遊培養した。
《沈降工程》
（細胞、スフェロイド）
　培養が終了した培養容器内の培養細胞分散液（沈降工程における、培養された細胞および培養液からなる細胞分散液をいう。）中の細胞の総数、スフェロイドの平均直径、およびスフェロイドの直径の分布は、表４に示すとおりであった。
（沈降操作）
　培養細胞分散液の入った培養容器を持ち上げ、これを机上に落とすことで、培養容器中の培養細胞分散液に表４に示す強度の衝撃を与えた。
(結果）
　表４に示すとおり、細胞増殖率８．１倍であり、細胞沈降率９１％であり、細胞死亡率３．０％であった。
〈実施例１６〉
　培養工程において、表４に示す温度分布を付与した点を除いて、実施例１５と同様にして、培養液調製工程、播種工程、培養工程、および沈降工程を行った。
　その結果、表４に示すとおり、細胞増殖率９．０倍であり、細胞沈降率９３％であり、細胞死亡率４．０％であった。
〈実施例１７〉
　培養工程において、表４に示す温度分布を付与した点を除いて、実施例１５と同様にして、培養液調製工程、播種工程、培養工程、および沈降工程を行った。
　その結果、表４に示すとおり、細胞増殖率９．５倍であり、細胞沈降率９５％であり、細胞死亡率２．０％であった。
〈実施例１８〉
　培養工程において、表４に示す温度分布を付与した点を除いて、実施例１５と同様にして、培養液調製工程、播種工程、培養工程、および沈降工程を行った。
　その結果、表４に示すとおり、細胞増殖率９．１倍であり、細胞沈降率９３％であり、細胞死亡率３．０％であった。
〈実施例１９〉
　培養工程において、表４に示す温度分布を付与した点を除いて、実施例１５と同様にして、培養液調製工程、播種工程、培養工程、および沈降工程を行った。
　その結果、表４に示すとおり、細胞増殖率８．０倍であり、細胞沈降率９０％であり、細胞死亡率４．０％であった。
〈実施例１５～１９の結果の解説〉
　実施例１５～１９では、培養工程において浮遊細胞培養液に付与する温度分布を変えることにより、培養終了した培養容器中の培養細胞分散液中のスフェロイドの直径の分布を変化させ、細胞増殖率および細胞沈降率に影響を与えた。
　０．１℃以上３．０℃以下の温度分布を付与した実施例１５～１９は、細胞総数が８．１×１０１１個～９．２×１０１１個であり、スフェロイドの直径の分布は０．１０以上２．９以下の範囲内であり、高い細胞増殖率（８．０倍以上）、および、高い細胞沈降率（９０％以上）を示した。
　０．２℃以上２℃以下の温度分布を付与した実施例１６～１８は、細胞総数が８．６×１０１１個～９．２×１０１１個であり、スフェロイドの直径の分布は０．２０以上１．８以下の範囲内であり、より高い細胞増殖率（９．０倍以上）、および、より高い細胞沈降率（９３％以上）を示した。
　０．３．０℃以上１℃以下の温度分布を付与した実施例１７は、細胞総数が９．２×１０１１個であり、スフェロイドの直径の分布が０．５０であり、さらに高い細胞増殖率（９．５倍以上）、および、さらに高い細胞沈降率（９５％以上）を示した。
　以上より、浮遊細胞分散液に０．１℃以上３．０℃以下の温度分布を付与することにより、細胞総数が多い状況でも高い増殖率を確保することができることがわかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
［実施例２０～２２］
　実施例２０～２２について、以下に説明する。
　実施例２０～２２は、セルロースナノファイバーのカルボキシ基含有量の相違および化学修飾方法の相違がスフェロイドの平均直径およびスフェロイドの直径の分布に与える効果を比較する例である。
〈実施例２０〉
《培養液調製工程》
（セルロースナノファイバーの調製）
　表５に示す平均直径およびカルボキシ基含有量となるように酸化剤の使用量および超高圧ホモジナイザーの圧力を調整した点を除いて、実施例１と同様にしてＴＥＭＰＯ化セルロースナノファイバー（以下「ＴＥＭＰＯ化ＣＮＦ４」という場合がある。）を調製した。
（培養液の調製）
　ＴＥＭＰＯ化ＣＮＦ１に代えて、調製したＴＥＭＰＯ化ＣＮＦ４を表５に示す添加量で使用した点を除いて、実施例１と同様にして培養液を調製した。
　調製した培養液を表５に示す量、培養容器に注入して、以降の工程に用いた。
《播種工程》
　ヒト間葉系幹細胞ＰＴ－２５０１に代えて、ヒト胚性幹細胞Ｈ９（WiCell Research Institute, Inc., Madison, WI, USA）を使用して、表５に示す細胞濃度および注入時間変動になるように培養液に注入した点を除いて、実施例１と同様にして細胞を播種した。これにより、播種細胞分散液（播種工程における、播種した細胞および培養液からなる細胞分散液をいう。）に、表５に示す細胞数分布を付与した。
《培養工程》
　プレートヒーターの出力を調整することによって、浮遊細胞分散液（培養工程における、浮遊培養中の細胞および培養液からなる細胞分散液をいう。）に、表５に示す温度分布を付与した点を除いて、実施例１と同様にして細胞を浮遊培養した。
《沈降工程》
（細胞、スフェロイド）
　培養が終了した培養容器内の培養細胞分散液（沈降工程における、培養された細胞および培養液からなる細胞分散液をいう。）中の細胞の総数、スフェロイドの平均直径、およびスフェロイドの直径の分布は、表５に示すとおりであった。
（沈降操作）
　培養細胞分散液の入った培養容器を持ち上げ、これを机上に落とすことで、培養容器中の培養細胞分散液に表５に示す強度の衝撃を与えた。
(結果）
　表５に示すとおり、細胞増殖率９．６倍であり、細胞沈降率９８％であり、細胞死亡率１．０％であった。
〈実施例２１〉
　表５に示す平均直径およびカルボキシ基含有量となるようにＣＭ化剤の使用量および高圧ホモジナイザーの圧力を調整した点を除いて、実施例１０と同様にしてＣＭ化セルロースナノファイバー（以下「ＣＭ化ＣＮＦ２」という場合がある。）を調製した。
　培養液調製工程において、ＴＥＭＰＯ化ＣＮＦ４に代えて、調製したＣＭ化ＣＮＦ２を表５に示す添加量で使用して培養液を調製した点を除いて、実施例２０と同様にして、播種工程、培養工程、および沈降工程を行った。
　その結果、表５に示すとおり、細胞増殖率９．２倍であり、細胞沈降率９５％であり、細胞死亡率３．０％であった。
〈実施例２２〉
　国際公開第２０１５／１１１７３４号（［００３９］）に記載された方法に従って、セルロース系原料を、高圧ホモジナイザーを用いて湿式微粒化処理して解繊することにより、機械解砕セルロースナノファイバー（以下「機械解砕ＣＮＦ１」という場合がある。）を調製した。調製した機械解砕ＣＮＦ１の平均直径およびカルボキシ基導入量は、表５に示すとおりであった。機械解砕ＣＮＦ１は酸化処理等のカルボキシ基導入処理を行っていないことから、カルボキシ基導入量は０ｍｍｏｌ／ｇである。
　培養液調製工程において、ＴＥＭＰＯ化ＣＮＦ４に代えて、調製した機械解砕ＣＮＦ１を表５に示す添加量で使用して培養液を調製した点を除いて、実施例２０と同様にして、播種工程、培養工程、および沈降工程を行った。
　その結果、表５に示すとおり、細胞増殖率８．４倍であり、細胞沈降率８４％であり、細胞死亡率５．０％であった。
〈実施例２０～２２の結果の解説〉
　セルロースナノファイバーがカルボキシ基を含有する実施例２０および２１と、セルロースナノファイバーがカルボキシ基を含有しない実施例２２とを対比すると、実施例２０および実施例２１の方が、実施例２２よりも、細胞増殖率および細胞沈降率が高く、細胞死亡率が低かった。すなわち、実施例２０および実施例２１の方が、実施例２３よりも優れた効果を示した。
　ＴＥＭＰＯ化セルロースナノファイバーを使用した実施例２０とＣＭ化セルロースナノファイバーを使用した実施例２１とを対比すると、実施例２０の方が、実施例２１よりも、細胞増殖率および細胞沈降率が高く、細胞死亡率が低かった。すなわち、実施例２０方が、実施例２１よりも優れた効果を示した。
　また、スフェロイドの平均直径は、実施例２０および２１では３５０μｍであったのに対し、実施例２２では５０μｍであった。
　これは、セルロースナノファイバーがカルボキシ基を含有することにより、セルロースナノファイバーと細胞とが相互作用しやすくなり、細胞を凝集させて直径の大きなスフェロイドの形成を促進したことによると考えられる。
　また、スフェロイドの直径の分布は、実施例２０では０．７０であったが、実施例２１では０．５０であった。セルロースナノファイバーのカルボキシ基含有量が同じであっても、スフェロイドの直径の分布に相違が認められた。
　さらに、細胞増殖率、細胞沈降率および細胞死亡率をみると、スフェロイドの直径の分布が大きい順に、優れた結果を示している。
　以上より、セルロースナノファイバーとしては、ＴＥＭＰＯ化ＣＮＦが最も優れ、ＣＭ化ＣＮＦがその次に優れ、機械解砕ＣＮＦがさらにその次に優れると考えられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
［実施例２３、比較例３および４］
　実施例２３、比較例３および４について、以下に説明する。
　実施例２３、比較例３および４は、セルロースナノファイバーとゲランガムとの効果を比較した例である。
〈実施例２３〉
《培養液調製工程》
（セルロースナノファイバーの調製）
　表６に示す平均直径およびカルボキシ基含有量となるように酸化剤の使用量および超高圧ホモジナイザーの圧力を調整した点を除いて、実施例１と同様にしてＴＥＭＰＯ化セルロースナノファイバー（以下「ＴＥＭＰＯ化ＣＮＦ５」という場合がある。）を調製した。
　また、ＴＥＭＰＯ化ＣＮＦ５の平均繊維長を特表２０１３－５４１９５６号公報に記載された方法に従って測定したところ、０．５０μｍであった。
　なお、セルロースナノファイバーの平均繊維長の測定は、具体的には、以下に記載する方法によって行った。
　セルロースナノファイバーの分散液を、セルロースナノファイバー濃度が０．００１質量％となるようにＤＭＳＯ（ｄｉｍｅｔｈｙｌ　ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ；ジメチルスルホキシド）により希釈し、セルロースナノファイバーを分散させた。これを予め濃硫酸を用いて表面を親水化処理したシリコンウェハー上へキャストし、１１０℃にて１時間乾燥させて試料とした。得られた試料を、走査型電子顕微鏡（ＪＳＭ－７４００Ｆ，日本電子株式会社製）を用いて倍率２，０００倍で観察し、標本数１５０～２００本のセルロースナノファイバーについて、各々の繊維長を測定し、その算術平均値を平均繊維長とした。
（培養液の調製）
　ＴＥＭＰＯ化ＣＮＦ１に代えて、調製したＴＥＭＰＯ化ＣＮＦ５を表６に示す添加量で使用した点を除いて、実施例１と同様にして培養液を調製した。
　調製した培養液を表６に示す量、培養容器に注入して、以降の工程に用いた。
《播種工程》
　ヒト間葉系幹細胞ＰＴ－２５０１に代えて、ヒト胚性幹細胞Ｈ９（WiCell Research Institute, Inc., Madison, WI, USA）を使用して、表６に示す細胞濃度および注入時間変動になるように培養液に注入した点を除いて、実施例１と同様にして細胞を播種した。これにより、播種細胞分散液（播種工程における、播種した細胞および培養液からなる細胞分散液をいう。）に、表６に示す細胞数分布を付与した。
《培養工程》
　プレートヒーターの出力を調整することによって、浮遊細胞分散液（培養工程における、浮遊培養中の細胞および培養液からなる細胞分散液をいう。）に、表６に示す温度分布を付与した点を除いて、実施例１と同様にして細胞を浮遊培養した。
《沈降工程》
（細胞、スフェロイド）
　培養が終了した培養容器内の培養細胞分散液（沈降工程における、培養された細胞および培養液からなる細胞分散液をいう。）中の細胞の総数、スフェロイドの平均直径、およびスフェロイドの直径の分布は、表６に示すとおりであった。
（沈降操作）
　培養細胞分散液の入った培養容器を持ち上げ、これを机上に落とすことで、培養容器中の培養細胞分散液に表６に示す強度の衝撃を与えた。
（結果）
　表６に示すとおり、細胞増殖率９．５倍であり、細胞沈降率９０％であり、細胞死亡率４．０％であった。
〈比較例３〉
《培養液調製工程》
　セルロースナノファイバーに代えてゲランガム（脱アシル化ジェランガム　ＫＥＬＣＯＧＥＬ　ＣＧ－ＬＡ，三晶株式会社製）を表６に示す添加量で使用した点を除いて、実施例２３と同様にして培養液を調製した。
　調製した培養液を表６に示す量、培養容器に注入して、以降の工程に用いた。
　また、実施例２３と同様に、ゲランガムの平均繊維長を特表２０１３－５４１９５６号公報に記載された方法に従って測定したところ、５．０μｍであった。
《播種工程》
　実施例２３と同様にして細胞を播種した。これにより、播種細胞分散液（播種工程における、播種した細胞および培養液からなる細胞分散液をいう。）に、表６に示す細胞数分布を付与した。
《培養工程》
　実施例２３と同様にして細胞を浮遊培養した。
《沈降工程》
（細胞、スフェロイド）
　培養が終了した培養容器内の培養細胞分散液（沈降工程における、培養された細胞および培養液からなる細胞分散液をいう。）中の細胞の総数、スフェロイドの平均直径、およびスフェロイドの直径の分布は、表６に示すとおりであった。
（沈降操作）
　実施例２３と同様にして、培養容器中の培養細胞分散液に表６に示す強度の衝撃を与えた。
（結果）
　表６に示すとおり、細胞増殖率８．９倍であり、細胞沈降率３５％であり、細胞死亡率１１％であった。
〈比較例４〉
《培養液調製工程》
　ゲランガム（脱アシル化ジェランガム　ＫＥＬＣＯＧＥＬ　ＣＧ－ＬＡ，三晶株式会社製）を、水中衝突型超高圧ホモジナイザー（スターバースト，スギノマシン株式会社製）を用いて、圧力１２ＭＰａで５回処理することにより、平均繊維長０．５μｍのゲランガムを調製した。
　調製したゲランガムを表６に示す添加量で使用した点を除いて、実施例２３と同様にして培養液を調製した。
　調製した培養液を表６に示す量、培養容器に注入して、以降の工程に用いた。
《播種工程》
　実施例２３と同様にして細胞を播種した。これにより、播種細胞分散液（播種工程における、播種した細胞および培養液からなる細胞分散液をいう。）に、表６に示す細胞数分布を付与した。
《培養工程》
　実施例２３と同様にして細胞を浮遊培養した。
《沈降工程》
（細胞、スフェロイド）
　培養が終了した培養容器内の培養細胞分散液（沈降工程における、培養された細胞および培養液からなる細胞分散液をいう。）中の細胞の総数、スフェロイドの平均直径、およびスフェロイドの直径の分布は、表６に示すとおりであった。
（沈降操作）
　実施例２３と同様にして、培養容器中の培養細胞分散液に表６に示す強度の軽衝撃を与えた。
（結果）
　表６に示すとおり、細胞増殖率８．９倍であり、細胞沈降率３５％であり、細胞死亡率１１％であった。
〈実施例２３、比較例３および４の結果の解説〉
　ＣＮＦを用いた実施例２３が９．５倍という高い細胞沈降率および９０％という高い細胞沈降率を達成することができたのに対し、ＣＮＦの代わりにゲランガムを用いた比較例３および４は、いずれも、８．９倍という高い細胞増殖率を達成したものの、３５％という低い細胞沈降率しか達成できなかった。
　この原因のひとつとしては、ゲランガムは架橋構造を形成するため、繊維の絡み合いが強く、ハイドロゲルが崩れ難いということが考えられる。
　なお、ゲランガムの繊維長は比較例３と比較例４との間で異なるが、細胞沈降率に差異はなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
［実施例２４、比較例５および６］
　実施例２４、比較例５および６は、沈降操作の違いによる細胞死亡率を比較した例である。
〈実施例２４〉
《培養液調製工程》
（セルロースナノファイバーの調製）
　表５に示す平均直径およびカルボキシ基含有量となるように酸化剤の使用量および超高圧ホモジナイザーの圧力を調整した点を除いて、実施例１と同様にしてＴＥＭＰＯ化セルロースナノファイバー（以下「ＴＥＭＰＯ化ＣＮＦ６」という場合がある。）を調製した。
（培養液の調製）
　ＴＥＭＰＯ化ＣＮＦ１に代えて、調製したＴＥＭＰＯ化ＣＮＦ６を表７に示す添加量で使用した点を除いて、実施例１と同様にして培養液を調製した。
　調製した培養液を表７に示す量、培養容器に注入して、以降の工程に用いた。
《播種工程》
　表７に示す細胞濃度および注入時間変動になるように培養液に注入した点を除いて、実施例１と同様にして細胞を播種した。これにより、播種細胞分散液（播種工程における、播種した細胞および培養液からなる細胞分散液をいう。）に、表７に示す細胞数分布を付与した。
《培養工程》
　浮遊細胞分散液（培養工程における、浮遊培養中の細胞および培養液からなる細胞分散液をいう。）に、実施例１と同様、表７に示す温度分布を付与して、細胞を浮遊培養した。
《沈降工程》
（細胞、スフェロイド）
　培養が終了した培養容器内の培養細胞分散液（沈降工程における、培養された細胞および培養液からなる細胞分散液をいう。）中の細胞の総数、スフェロイドの平均直径、およびスフェロイドの直径の分布は、表７に示すとおりであった。
（沈降操作）
　培養細胞分散液に撹拌子を入れ、マグネティックスターラーを用いて撹拌子を表７記載の回転数で５分間撹拌した。
(結果）
　表７に示すとおり、細胞増殖率９．３倍であり、細胞沈降率９３％であり、細胞死亡率３．０％であった。
〈比較例５〉
　培養液調製工程において、培養容器に注入した培養液量を表７に示す量とした点、播種工程において、播種時細胞濃度を表７に示す濃度とした点、および、沈降工程において、沈降操作を表７に示す強度の遠沈処理により行った点を除いて、実施例２４と同様にして培養液調製工程、播種工程、培養工程、および沈降工程を行った。
　その結果、表７に示すとおり、細胞増殖率４．７倍であり、細胞沈降率６８％であり、細胞死亡率２５％であった。
〈比較例６〉
　培養液調製工程において、培養容器に注入した培養液量を表７に示す量とした点、および、播種工程において、播種時細胞濃度を表７に示す濃度とした点を除いて、実施例２４と同様にして培養液調製工程、播種工程、培養工程、および沈降工程を行った。
　なお、比較例５とは、沈降操作を実施例２４と同様の軽撹拌により行った点のみが異なる。
　その結果、表７に示すとおり、細胞増殖率４．７倍であり、細胞沈降率６８％であり、細胞死亡率１２％であった。
〈実施例２４、比較例５および６の解説〉
　実施例２４は軽衝撃で細胞を沈降させた例であり、比較例５および比較例６は遠沈処理により沈降させた例である。
　実施例２４は３．０％という低い細胞死亡率を達成していた。
　一方、比較例５および比較例６は、それぞれ、２５％および１２％という高い細胞死亡率を示したが、遠沈操作を実施例２４と同様の軽撹拌（６０ｒｐｍ）により行った比較例６は、沈降操作を遠沈（３３５×ｇ）により行った比較例５と比べて、１／２以下の細胞死亡率を示した。
　比較例５と比較例６との間の細胞死亡率の相違は、沈降操作の相違によるものであり、軽撹拌により細胞を沈降させると、遠沈により細胞を沈降させる場合に比べて、細胞に与えるダメージが小さく、細胞死亡率が大幅に改善することを示唆する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007

Claims (10)

  1. 　培養終了した単一培養容器中の培養細胞分散液から培養された細胞を沈降させる沈降工程を備える、培養細胞の回収方法であって、
    　前記培養細胞分散液は、前記培養された細胞と、基礎培地成分と、平均直径２．０ｎｍ以上１００ｎｍ以下のセルロースナノファイバーと、を含み、
    　前記培養細胞分散液中の前記培養された細胞の総数が５．０×１０７個以上であり、
    　前記培養細胞分散液中の前記セルロースナノファイバーの含有量が前記培養細胞分散液の０．０１０質量％以上１．０質量％以下であり、かつ、
    　前記培養された細胞からなるスフェロイドの直径の分布が０．１０以上３．０未満である、培養細胞の回収方法。
    　ここで、スフェロイドの直径の分布Ｄｄｉｓｔは、２０個のスフェロイドの直径を測定して求めたスフェロイドの直径の最大値Ｄｍａｘ、最小値Ｄｍｉｎおよび算術平均値Ｄａｖｇから、下記式（１）によって求めた割合である。
    　Ｄｄｉｓｔ＝（Ｄｍａｘ－Ｄｍｉｎ）／Ｄａｖｇ　　　　　　（１）
  2. 　前記スフェロイドの平均直径が５０μｍ以上８００μｍ以下である、請求項１に記載の培養細胞の回収方法。
  3. 　前記沈降工程の前に、さらに、
    　種細胞として細胞を播種する播種工程と、
    　前記種細胞から細胞を浮遊培養する培養工程と、
    を備え、
    　前記播種工程において、播種された細胞と、基礎培地成分と、平均直径２．０ｎｍ以上１００ｎｍ以下のセルロースナノファイバーと、を含む播種細胞分散液の細胞数分布が１．０％以上５０％以下である、請求項１または２に記載の培養細胞の回収方法。
    　ここで、細胞数分布Ｎｄｉｓｔ（％）は、前記播種細胞分散液から１０箇所サンプリングして測定した播種細胞分散液１ｍＬあたりの細胞数の最大値Ｎｍａｘ（個）、最小値Ｎｍｉｎ（個）および算術平均値Ｎａｖｇ（個）から、下記式（２）によって求めたパーセンテージである。
    　Ｎｄｉｓｔ（％）＝｛（Ｎｍａｘ－Ｎｍｉｎ）／Ｎａｖｇ｝×１００（％）　　　　　（２）
  4. 　前記沈降工程の前に、さらに、
    　種細胞として細胞を播種する播種工程と、
    　前記種細胞から細胞を浮遊培養する培養工程と、
    を備え、
    　前記培養工程において、浮遊培養される細胞と、基礎培地成分と、平均直径２．０ｎｍ以上１００ｎｍ以下のセルロースナノファイバーとを含む浮遊細胞分散液に０．１℃以上３．０℃以下の温度分布を付与する、請求項１～３のいずれか１項に記載の培養細胞の回収方法。
    　ここで、温度数分布Ｔｄｉｆｆ（℃）は、浮遊細胞分散液の液温の最高値Ｔｍａｘ（℃）および最低値Ｔｍｉｎ（℃）から、下記式（３）によって求めた温度差である。
    　Ｔｄｉｆｆ（℃）＝Ｔｍａｘ－Ｔｍｉｎ（℃）　　　　　（３）
  5. 　前記セルロースナノファイバーがカルボキシ基を０．６０ｍｍｏｌ／ｇ以上２．０ｍｍｏｌ／ｇ以下含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の培養細胞の回収方法。
  6. 　前記細胞が幹細胞である、請求項１～５のいずれか１項に記載の培養細胞の回収方法。
  7. 　培養された細胞と、基礎培地成分と、平均直径２．０ｎｍ以上１００ｎｍ以下のセルロースナノファイバーと、を含む培養細胞分散液であって、
    　前記培養細胞分散液中の前記細胞の総数が５．０×１０７個以上であり、
    　前記培養細胞分散液中の前記セルロースナノファイバーの含有量が前記培養細胞分散液の０．０１０質量％以上１．０質量％以下であり、かつ、
    　前記細胞からなるスフェロイドの直径の分布が０．１０以上３．０未満である、培養細胞分散液。
    　ここで、前記スフェロイドの直径の分布は、２０個のスフェロイドの直径を測定して求めたスフェロイドの直径の最大値Ｄｍａｘ、最小値Ｄｍｉｎおよび算術平均値Ｄａｖｇから、下記式（１）によって求めた値Ｄｄｉｓｔである。
    　Ｄｄｉｓｔ＝（Ｄｍａｘ－Ｄｍｉｎ）／Ｄａｖｇ　　　　　　（１）
  8. 　前記スフェロイドの平均直径が５０μｍ以上８００μｍ以下である、請求項７に記載の培養細胞分散液。
  9. 　前記セルロースナノファイバーがカルボキシ基を０．６０ｍｍｏｌ／ｇ以上２．０ｍｍｏｌ／ｇ以下含む、請求項７または８に記載の培養細胞分散液。
  10. 　前記細胞が幹細胞である、請求項７～９のいずれか１項に記載の培養細胞分散液。
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