CN111345281B - 细胞系统和用于储存细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本公开提供了一种细胞系统，该细胞系统包含在0‑25℃范围内的温度下在水凝胶中的真核细胞，所述水凝胶包含位于细胞储存介质中的纳米原纤纤维素。本公开还提供了一种用于储存真核细胞的方法，该方法包括提供真核细胞，提供纳米原纤纤维素，将细胞和纳米原纤纤维素组合以形成细胞系统，以及在0‑25℃范围内的温度下储存细胞系统。

Description

细胞系统和用于储存细胞的方法

发明领域

本申请涉及用于储存细胞的包含纳米原纤纤维素的细胞系统。本申请还涉及在低温下储存细胞的方法。本申请还涉及细胞系统的用途。

背景技术

干细胞，例如人胚胎干细胞(hESCs)或人诱导多能干细胞(hiPSC)，是能够自我更新的多能细胞，其能够在体内分化为多种细胞类型。它们被寄予厚望，例如用于细胞疗法，药物研究和组织工程。此外，可以预见，在将来，人诱导多能干细胞，多潜能细胞和其他未分化细胞将被增殖并定向分化成特定的谱系，从而发展出可移植到人体中用于治疗目的的分化细胞或组织。人多能干细胞和可能衍生自它们的分化细胞也是研究人细胞和发育系统的强大科学工具。

基于细胞的疗法的医学应用正在迅速增加。因此，期望开发一种系统，其使得能够将细胞治疗产品从制造场所储存并运输到使用场所。冷冻和解冻细胞可能会损坏细胞，降低活细胞的数量，并且耗时，复杂且昂贵。需要用于在短期内(例如在运输期间)储存细胞的更简单且便宜的方法。

发明内容

在本发明中，发现可以将细胞，特别是干细胞在低温下储存在纳米原纤纤维素水凝胶中数天。这可以用于稳定细胞以用于运输。本文公开了如何使用纳米原纤纤维素水凝胶作为细胞的基质。基质为细胞提供了支持，但它也提供了细胞保护特性，即细胞保持稳定和存活的条件。

一般而言，低温储存可能会对细胞产生不良影响，例如低氧应激，局部缺血和再灌注损伤，膜电位(氧化还原平衡)破坏，细胞离子失衡(例如Na⁺、Ca²⁺和Fe²⁺体内稳态的紊乱)，活性氧物质的产生，细胞骨架坍塌和超微结构损害。特别是增加的低温储存间隔可能导致坏死或凋亡细胞死亡途径的激活。本公开中提出的解决方案旨在防止或减轻这些负面影响。

本公开提供了一种细胞系统，该细胞系统包含在0-25℃范围内的温度下在水凝胶中的真核细胞，所述水凝胶包含在细胞储存介质中的纳米原纤纤维素。

本公开还提供了用于储存真核细胞的方法，该方法包括：

-提供真核细胞，

-提供纳米原纤纤维素，

-提供细胞储存介质，

-将细胞、纳米原纤纤维素和细胞储存介质混合以形成细胞系统，以及

-在0–25℃范围内的温度下储存细胞系统。

用于储存和/或运输细胞的温度是低温，其可以包括环境温度。本文所用的低温可以指低于体温或用于培养细胞的温度的温度。低温可指低于37℃，或30℃或更低，或25℃或更低，甚至更低的温度。但是，不需要低于0℃的温度，这可以防止细胞因冷冻而损坏。由于不进行冷冻，因此该过程更简单，并且不需要特别的冷冻设备，解冻或例如使用液氮。同样，不需要冷冻保护剂或冻干保护剂。细胞和材料无需干燥(如冻干)，因此无需重新水化。当使用低温时，细胞保持活力，可以从基质中释放后立即使用，或者在与基质结合时准备使用，例如进行质量控制测试。细胞可以进入暂停状态，这有助于将它们维持在细胞系统中，尤其是将它们维持在所需状态。

本公开还提供了一种用于提供真核细胞的方法，该方法包括：

-提供细胞系统，和

-从水凝胶中提取细胞，例如通过酶促消化水凝胶或通过稀释水凝胶来从水凝胶中提取细胞，以提供细胞。

主要实施方式在独立权利要求中限定。在从属权利要求中公开了各种实施方式。除非另有明确说明，否则权利要求书和说明书中记载的实施方式和实施例可以相互自由组合。

形成的细胞系统能够获得可扩展的，可再现的和节约成本的细胞储存系统，从中可以容易地释放和收获细胞。

形成的细胞系统还能够提供用于储存未分化状态的细胞的组合物，即，防止细胞，特别是干细胞的自发分化或诱导的分化。细胞的增殖也可以被暂停或明显降低。例如，要求将干细胞保持在多能或多潜能状态，并且需要仔细控制细胞的储存条件，材料和处理。

纳米原纤纤维素水凝胶提供亲水性基质，其是无毒的，生物相容的并且还可生物降解。基质可以酶促降解，例如通过添加纤维素酶来降解。另一方面，水凝胶在生理条件下是稳定的，不需要通过使用其他试剂进行交联。也可以稀释水凝胶，例如以获得不再处于凝胶状态的分散体，这使得能够释放和收获细胞，例如通过离心或过滤来进行。可以避免使用反应性试剂，这些试剂会影响细胞。细胞，特别是具有挑战性和/或敏感性的细胞，可以在保护性纳米原纤纤维素水凝胶中储存和运输，并回收以获得活细胞。

水凝胶可以酶促消化的特征是有利的，特别是在干细胞的情况下。当细胞系统暂停时，其生物钟停止；类似地，冷冻时也是如此。因此，可以提供全新一代的“仅需加水”细胞产品，在运输后可以去除支持性NFC基质。这反过来又加快了细胞研究，因为该研究通常需要大量当前无法替代的手工操作。另外，运输和储存即用型细胞系统更为经济，因为不需要复杂的冷却系统。例如，研究人员可以直接使用3D培养细胞球体产品，而无需对其先进行接种和生长。由于3D球体可以更好地模仿真实的肿瘤，特别是例如考虑到缺氧时，在不久的将来它们的使用可能会增加。之后，可以更认真地考虑细胞产品的临床应用。

包含纳米原纤纤维素的水凝胶的某些有利性质包括柔韧性，弹性和可重塑性。由于水凝胶包含大量水，因此它也可能显示出良好的渗透性。实施方式的水凝胶还提供高的保水能力和分子扩散速度性质。

本文所述的水凝胶可用于医学和科学应用，其中包含纳米原纤纤维素的材料与生活物质接触。如本文所述的包含纳米原纤纤维素的产品与生活物质具有高度生物相容性，并提供多种有益效果。不受任何特定理论的束缚，据信包含非常亲水的纳米原纤纤维素的水凝胶具有非常高的比表面积，因此在针对细胞和/或组织施用时具有高保水能力，从而在细胞和/或组织与包含纳米原纤纤维素的水凝胶之间提供了有利的潮湿环境。纳米原纤纤维素中的大量游离羟基在纳米原纤纤维素和水分子之间形成氢键，并且能够形成凝胶和产生纳米原纤纤维素的高保水能力。由于纳米原纤纤维素水凝胶中的水量很高，因此认为仅水会与细胞或组织接触，并且如果需要的话，还可以使流体和/或试剂迁移。

用作细胞基质的纳米原纤纤维素提供了一种环境，该环境可以保护细胞并帮助它们在具有挑战性的条件下(例如在无法获得营养的情况下)维持其活力。纳米原纤纤维素材料的一个优点是，纤维素纳米纤维的原纤网络的尺寸非常接近胶原纳米纤维的天然ECM网络。此外，纤维素纳米纤维是非动物性材料，因此没有疾病传播的风险。当前，大多数商业产品是从动物中分离出来的。使用本发明的材料，可以获得用于细胞的透明且多孔的基质，并且与替代方案相比，该材料的处理容易。纤维素纳米纤维的荧光背景可以忽略不计。纤维素纳米纤维水凝胶具有最佳的弹性、刚度、剪切应力、机械附着性和孔隙率，可用作3D和2D细胞储存基质。

附图说明

图1显示了在环境条件或冷藏条件下在0.4％凝胶中最多暂停7天，并使用优化的Growdase方案(2小时，1300μg/mg)回收的MSC。计算细胞活力(a)和产率(b)。N＝3。

图2显示了在环境A)条件或冷藏(Ch)条件下暂停最多72小时，然后涂覆在组织培养塑料上的MSC在3个测试通道中保持了生长的能力。对照(Co)是根据标准培养条件维持的细胞。

图3显示了在环境温度下以不同细胞密度在0.4％(A)和0.9％(B)Growdex中暂停24小时然后消化24小时(300μg/mg Growdase)的MSC的代表性图像。

图4显示了通过Presto Blue评估的暴露于酶的MSC的活力，表明细胞能够保持代谢功能，而不仅仅是保持膜完整性。

具体实施方式

在该说明书中，除非另有特别说明，否则百分数值是基于重量(w/w)。如果给出任何数值范围，则该范围也包括上限值和下限值。开放式术语“包括”还包括封闭式术语“由……组成”作为一种选择。

本文所述的材料和产品可以是医学和/或科学材料和产品，例如生命科学材料和产品，并且可以用于涉及活细胞和/或生物活性材料或物质的方法和应用中，例如本文所述。所述材料或产品可以是细胞培养、细胞储存和/或细胞输送材料或产物，并且可以用于其中将细胞进行培养、储存、维持、运输、提供、修饰、测试和/或用于医学或科学目的的方法，或用于其他相关且适用的方法。

在本文公开的方法和产品中，提供了特定的细胞，并将其与纳米原纤纤维素材料组合。所述材料或产品可用于形成本文所述的细胞系统。最终产品可以包含细胞，因此形成细胞系统。该细胞系统可以在包含纳米原纤纤维素的水凝胶中包含真核细胞，但是也可以应用其他细胞。水凝胶可以是多种形式，例如连续的，部分不连续的或完全不连续的，例如包括多个不连续形式的珠或类似实体，这些实体可以是分开的或相互连接的。但是，实体的结构是均匀的。水凝胶中纳米原纤纤维素的浓度可以在0.1–10％的范围内，例如0.2–5％(w/w)，0.4–2％(w/w)或0.8–1.5％(w/w)。

本公开还提供了用于储存真核细胞的方法，以及用于将细胞维持在期望状态(例如未分化状态和/或暂停状态)的方法，以及用于运输或移动细胞的方法，以及用于提供细胞的方法。

细胞

在本发明方法和产品中，提供了细胞。这些细胞可以是原核细胞，例如细菌细胞，或者它们可以是真核细胞。真核细胞可以是植物细胞，酵母细胞或动物细胞。真核细胞的例子包括可移植细胞，例如干细胞。细胞可以是动物细胞或人细胞。

细胞的具体实例包括干细胞，未分化细胞，前体细胞以及全分化细胞及其组合。在一些实例中，细胞包括选自下组的细胞类型：角膜基质细胞，角质形成细胞，成纤维细胞，上皮细胞及其组合。在一些实例中，细胞选自下组：干细胞，祖细胞，前体细胞，结缔组织细胞，上皮细胞，肌肉细胞，神经元细胞，内皮细胞，成纤维细胞，角质形成细胞，平滑肌细胞，基质细胞，间充质细胞，免疫系统细胞，造血细胞，树突状细胞，毛囊细胞及其组合。所述细胞可以是肿瘤或癌细胞，基因修饰的细胞，例如转基因细胞，顺基因细胞或敲除细胞或病原细胞。这样的细胞可以用于例如药物研究或治疗。特别地，干细胞可以用于治疗应用中，例如提供给患者。

在一实施方式中，细胞是真核细胞，例如哺乳动物细胞。哺乳动物细胞的实例包括人细胞，小鼠细胞，大鼠细胞，兔细胞，猴细胞，猪细胞，牛细胞，鸡细胞等。应当注意，即使本发明方法和产品的优点对于储存哺乳动物细胞得到了最好的证明，但是该方法和产品也可以用于储存其他细胞，例如非哺乳动物的真核细胞、酵母细胞或原核细胞。

在一个实施方式中，细胞是干细胞，例如全能、多能、多潜能、寡能或单能干细胞。干细胞是能够通过细胞分裂来更新自身的细胞，并且可以分化为多谱系细胞。这些细胞可分为胚胎干细胞(ESC)，诱导多能干细胞(iPSC)和成体干细胞，也称为组织特异性或体干细胞。干细胞可以是人干细胞，其可以是非胚胎来源的，例如成体干细胞。这些是分化后遍布全身的未分化细胞。它们负责例如器官再生，能够分裂为多能或多潜能状态，并分化为分化细胞谱系。干细胞可以是在没有胚胎破坏的情况下产生的人胚胎干细胞系，例如在《细胞&干细胞》(Cell Stem Cell，2008年2月7日；2(2):113–7)中描述的。干细胞可获自自体成体干细胞，例如骨髓，脂肪组织或血液。

干细胞的例子包括间充质干细胞(MSC)，多潜能成体祖细胞

诱导多能干细胞(iPS)和造血干细胞。

对于人干细胞，细胞可以是非胚胎细胞或诸如hESC的细胞，它们可以在不破坏胚胎的情况下获得。对于人胚胎干细胞，细胞可以来自沉积的细胞系，或者由未受精的卵(即“孤雌生殖”卵)或由孤雌生殖性激活卵制成，因此不会破坏人胚胎。

在一个实施方式中，细胞是间充质干细胞(MSC)。间充质干细胞(MSC)是成体干细胞，可以从人和动物来源(例如哺乳动物)中分离出来。间充质干细胞是能分化为多种细胞类型的多潜能基质细胞，所述多种细胞类型包括成骨细胞、软骨细胞、肌细胞和脂肪细胞。间充质本身是源自中胚层的胚胎结缔组织，其分化为造血组织和结缔组织。然而，间充质干细胞不能分化为造血细胞。间充质干细胞和骨髓基质细胞这两个术语已经互换使用了很多年，但没有一个术语的描述是充分的。基质细胞是结缔组织细胞，其形成组织功能细胞所依靠的支持结构。尽管这是对MSC的一种功能的准确描述，但该术语未能传达新近发现的MSC在组织修复中的作用。该术语包括源自其他非骨髓组织的多潜能细胞，例如源自胎盘、脐带血、脂肪组织、成人肌肉、角膜基质或乳牙牙髓的多能细胞。这些细胞没有能力重建整个器官。

国际细胞治疗协会(International Society for Cellular Therapy)提出了定义MSC的最低标准。这些细胞(a)应该表现出塑性粘附，(b)具有特定的细胞表面标记集，即分化簇(CD)73、D90、CD105，并且缺乏CD14、CD34、CD45和人白细胞抗原-DR(HLA-DR)的表达，以及(c)具有体外分化为脂肪细胞、软骨细胞和成骨细胞的能力。这些特征对所有MSC均有效，尽管从各种组织来源分离的MSC中存在很少的差异。MSC不仅存在于胎儿组织中，而且也存在于许多成人组织中，几乎没有例外。据报道，骨髓中具有有效的MSC群。已从脂肪组织、羊水、羊膜、牙体组织、子宫内膜、肢芽、经血、外周血、胎盘和胎膜、唾液腺、皮肤和包皮、羊膜下脐带内膜、滑液和华通氏胶中分离出了具有MSC特征的细胞。

人间充质干细胞(hMSC)表现出很高的可塑性，并几乎在所有器官中都有，在骨髓中密度最高。hMSCs可作为间充质细胞的可再生来源，并具有多能分化成多种细胞谱系的能力，包括成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、骨骼和心肌细胞、内皮细胞和神经元，在适当的刺激下在体外以及在移植后在体内均可分化。

在一个实例中，细胞是多潜能成体祖细胞(MAPC)，其衍生自可从骨髓、肌肉和脑中收获的原始细胞群。MAPC是比间充质干细胞更原始的细胞群，尽管它们模仿胚胎干细胞的特性，但它们仍保留了成体干细胞在细胞治疗中的潜力。在体外，MAPC具有成脂、成骨、神经生成、肝生成、造血、生肌、软骨生成、上皮和内皮细胞谱系的巨大分化潜力。MAPC的一个关键特征是它们在体外显示出巨大的增殖潜力而不会丢失其表型。MAPC可用于治疗多种疾病，例如缺血性脑卒中、移植物抗宿主病、急性心肌梗死、器官移植、骨修复和骨髓增生异常。MAPC还可以增强骨形成，促进新血管形成并具有免疫调节作用。

诱导多能干细胞(iPS)是一类多能干细胞，可以直接从成体细胞中产生。它们几乎可以无限地繁殖，并且可以在体内产生其他所有细胞类型，包括神经元、心脏、胰腺和肝细胞。诱导多能干细胞可以直接来自成人组织，并且可以以患者匹配的方式制备，因此可以为它们提供移植而没有免疫排斥的风险。人诱导多能干细胞是特别令人感兴趣的，并且它们可以由例如人成纤维细胞、角质形成细胞、外周血细胞、肾上皮细胞或其他合适的细胞类型产生。

造血干细胞(HSC)，也称为血干细胞，是可以发育成所有类型的血细胞的细胞，所述所有类型的血细胞包括白细胞、红细胞和血小板。在外周血和骨髓中发现造血干细胞。HSC同时引起血细胞的髓系和淋巴系。髓系和淋巴系都参与树突状细胞的形成。髓样细胞包括单核细胞，巨噬细胞，嗜中性粒细胞，嗜碱性粒细胞，嗜酸性粒细胞，红细胞和巨核细胞至血小板。淋巴样细胞包括T细胞、B细胞和自然杀伤细胞。造血干细胞移植可用于治疗癌症和其他免疫系统疾病。

通常，细胞可以在水凝胶中培养，也可以将细胞储存在水凝胶中。可以将细胞维持在水凝胶上或水凝胶中并在水凝胶上或水凝胶中增殖，而无需来源于细胞外的基于动物或人的试剂或培养基。细胞可以均匀地分散在水凝胶上或水凝胶中。

最初，可以在单独的培养物中对细胞进行预培养，然后将其回收并转移到新培养基中，该新培养基可以与所述单独的培养基相似或不同。获得细胞悬液。该细胞悬液或另一种细胞悬液可以与纳米原纤纤维素(例如包含纳米原纤纤维素的水凝胶)组合和/或混合，以获得或形成细胞系统。如果在细胞系统中培养细胞，则会形成细胞培养物。细胞系统或培养物可以是2D系统或培养物或者3D系统或培养物。2D系统或培养物是指以膜的形式和/或作为层的系统或培养物。3D系统或培养物是指纳米原纤纤维素中的系统或培养物，其中允许细胞在所有三个维度上生长和/或相互作用。NFC水凝胶基质模仿天然的细胞外基质结构，并提供营养物质、气体等的有效运输。在一个实例中，细胞系统是3D细胞系统。

纳米原纤纤维素

用于形成细胞系统的原料是纳米原纤纤维素，也称为纳米纤维素，是指分离的纤维素原纤或衍生自纤维素原料的原纤束。纳米原纤纤维素是基于自然界中丰富的天然聚合物。纳米原纤纤维素具有在水中形成粘性水凝胶的能力。纳米原纤纤维素的生产技术可以基于使纤维原料崩解，例如研磨纸浆纤维的水性分散体以获得纳米原纤化的纤维素。在研磨或均质化过程后，得到的纳米原纤纤维素材料是稀释的粘弹性水凝胶。

由于崩解条件，所获得的材料通常以相对低的浓度均匀地分布在水中的形式存在。原料可以是浓度为0.2-10％(w/w)，例如0.2–5％(w/w)的水性凝胶。纳米原纤纤维素可以直接由纤维原料的崩解获得。

由于其纳米级结构，纳米原纤纤维素具有独特的性质，该性质使得常规纤维素无法提供的功能成为可能。然而，由于纳米级结构，纳米原纤纤维素也是具有挑战性的材料。例如，纳米原纤纤维素的脱水或处理可能是困难的。

纳米原纤纤维素可以由植物来源的纤维素原料制备，或者也可以源自某些细菌发酵过程。纳米原纤纤维素优选由植物材料制备。该原料可以基于含纤维素的任何植物材料。在一个例子中，原纤是从非薄壁(non-parenchymal)植物材料获得的。在这种情况下，原纤可以从次生细胞壁获得。这种纤维素原纤的一种丰富来源是木纤维。纳米原纤纤维素可以通过对来自木材的纤维原料进行均质化制得，所述纤维原料可以是化学浆。纤维素纤维崩解以产生平均直径仅为数纳米的原纤，在大多数情况下该平均直径可以为200nm或更小，得到在水中的原纤分散体。来源于次级细胞壁的原纤基本为晶体，其结晶度至少为55％。这种原纤可以具有与源自初级细胞壁的原纤不同的性质，例如源自次级细胞壁的原纤的脱水可能更具挑战性。通常，在来自初级细胞壁的纤维素来源中，例如在甜菜、马铃薯块茎和香蕉轴(banana rachis)来源，微原纤比来自木材的原纤更容易从纤维基质中释放出来，并且崩解所需的能量更少。然而，这些材料仍然有些不均匀，并且由大的原纤束组成。

非木材材料可以来自农业残留物、草或其他植物物质，例如从棉花、玉米、小麦、燕麦、黑麦、大麦、稻、亚麻、大麻、马尼拉麻、剑麻、黄麻、苎麻、洋麻、西沙尔麻落麻(bagasse)、竹或芦苇得到的秸秆、树叶、树皮、种子、壳、花、蔬菜或果实。纤维素原料还可以源自产生纤维素的微生物。微生物可以是醋酸杆菌属(Acetobacter)，农杆菌属(Agrobacterium)，根瘤菌属(Rhizobium)，假单胞菌属(Pseudomonas)或产碱杆菌属(Alcaligenes)，优选是醋酸杆菌属，更优选是木醋杆菌(Acetobacter xylinumor)或巴氏醋杆菌(Acetobacterpasteurianus)。

已经发现，从木纤维素获得的纳米原纤纤维素优选用于本文所述的医学或科学产品。木纤维素可大量获得，并且针对木纤维素开发的制备方法使得能够生产适用于该产品的纳米原纤材料。通过使植物纤维，特别是木纤维原纤化而获得的纳米原纤纤维素在结构上与从微生物获得的纳米原纤纤维素不同，并且具有不同的性质。例如，与细菌纤维素相比，纳米原纤化的木纤维素是均匀且更为多孔和疏松的材料，这在涉及活细胞的应用中是有利的。通常使用细菌纤维素时不会像在植物纤维素中那样进行类似的原纤化，因此材料有所不同。细菌纤维素是致密材料，容易形成小球体，因此该材料的结构是不连续的，因此不希望在与活细胞有关的应用中使用这种材料。

木材可以来自软木树如云杉、松树、冷杉、落叶松、花旗松或铁杉，或来自硬木树如桦树、白杨、杨树、桤木、桉树、橡树、山毛榉或刺槐，或者来自软木和硬木的混合物。在一个实例中，纳米原纤纤维素从木浆获得。纳米原纤纤维素可以从硬木浆获得。在一个实例中，硬木是桦木。纳米原纤纤维素可以从软木浆获得。在一个实例中，所述木浆是化学浆。产品可能需要化学浆。化学浆是纯材料，可用于多种应用。例如，化学浆缺少机械浆中存在的沥青和树脂酸，并且它无菌程度更高或更容易灭菌。此外，化学浆柔性更高，例如在可施用于活组织的医用材料、膜、贴片、敷料和其他材料中提供有利的性质。

如本文所用，术语“纳米原纤纤维素”是指从基于纤维素的纤维原料分离的纤维素原纤和/或原纤束。这些原纤的特征在于具有高纵横比(长度/直径)。纳米原纤纤维素的平均长度(如原纤或原纤束之类的颗粒的中值长度)可能超过1μm，在大多数情况下为50μm或更小。如果初级原纤维没有完全彼此分离，则缠结原纤的平均总长度可以例如在1–100μm，1–50μm或1–20μm的范围内。但是，如果纳米原纤材料高度原纤化，则初级原纤可能完全或几乎完全分离，平均原纤长度会更短，例如在1–10μm或1-5μm的范围内。这尤其适用于天然级别的原纤，这些原纤不会例如在化学、酶促或机械作用下被缩短或消化。但是，强衍生的纳米原纤纤维素的平均原纤长度可以更短，例如在0.3–50μm，例如0.3–20μm，例如0.5–10μm或1–10μm的范围内。特别是较短的原纤，例如酶促消化或化学消化的原纤，或经过机械处理的材料所具有的平均原纤长度可以小于1μm，例如0.1–1μm，0.2–0.8μm或0.4–0.6μm。可以例如使用CRYO-TEM、SEM或AFM图像在显微镜下估计原纤的长度和/或直径。

对于高度原纤化的材料，纳米原纤纤维素的平均直径(宽度)小于1μm，或小于或等于500nm，例如在1-500nm的范围内，但优选小于或等于200nm，甚至小于或等于100nm或者小于或等于50nm，例如，在1–200nm，2–200nm，2–100nm或2–50nm，甚至2–20的范围内。本文公开的直径可以指原纤和/或原纤束的直径。最小的原纤在初级原纤的级别上，平均直径通常一般在2-12nm的范围内。原纤的尺度和尺寸分布取决于精制方法和效率。在高度精制的天然纳米原纤纤维素的情况中，平均原纤直径可以在2–200nm或5–100nm的范围内，例如在10–50nm的范围内。纳米原纤纤维素的特征在于具有大的比表面积和强的形成氢键的能力。在水分散体中，纳米原纤纤维素一般呈现为浅色或混浊的凝胶状材料。根据纤维原料，从植物(特别是木材)获得的纳米原纤纤维素也可含有少量的其它植物成分，特别是木成分，如半纤维素或木质素。其量取决于植物来源。

通常，根据TAPPI W13021，纤维素纳米材料可以分为几类，TAPPI W13021提供了纤维素纳米材料的标准术语。并非所有这些材料都是纳米原纤纤维素。两个主要类别是“纳米物体”和“纳米结构化材料”。纳米结构化材料包括直径为10–12μm且长径比(L/D)<2的“纤维素微晶”(有时称为CMC)，以及直径为10–100nm且长度为0.5–50μm的“纤维素微原纤”。纳米物体包括“纤维素纳米纤维”，其可以分为直径为3-10nm且L/D>5的“纤维素纳米晶体”(CNC)和直径为5–30nm且L/D>50的“纤维素纳米原纤”(CNF或NFC)。

可以基于三个主要特性对不同级别的纳米原纤纤维素进行分类：(i)尺寸分布，长度和直径；(ii)化学组成；和(iii)流变性质。为了完全描述级别，可以平行使用这些性质。不同级别的实例包括天然(或未改性)NFC、氧化NFC(高粘度)、氧化NFC(低粘度)、羧甲基化NFC和阳离子化NFC。在这些主要级别中，还存在一些子级别，例如：极好的原纤化与中等原纤化，高取代度与低取代度，低粘度与高粘度等。原纤化技术和化学预改性对原纤尺寸分布有影响。通常，非离子级别具有更宽的平均原纤直径(例如在10-100nm或10-50nm的范围内)，而化学改性级别则要细很多(例如在2-20nm的范围内)。改性级别的分布也更窄。某些改性，特别是TEMPO氧化，可产生较短的原纤。

取决于原料来源，例如硬木浆与软木浆相比，最终纳米原纤纤维素产品中存在不同的多糖组成。通常，从漂白的桦木浆制备非离子级别，会产生高二甲苯含量(25重量％)。从硬木浆或软木浆制备改性级别。在这些改性级别中，半纤维素也与纤维素结构域一起被改性。该改性很可能是不均匀的，即，一些部分相比其他部分改性程度更高。因此，通常无法进行详细的化学分析，因为改性产物是不同多糖结构的复杂混合物。

在水性环境中，纤维素纳米纤维的分散体形成粘弹性水凝胶网络。该凝胶由分散和水合的缠结原纤在相对低浓度(例如0.05至0.2％(w/w))下就已经形成。NFC水凝胶的粘弹性可用例如动态振动流变学测量来表征。

纳米原纤纤维素水凝胶表现出特有的流变性质。例如，它们是剪切稀化或假塑性材料，这意味着其粘度取决于使材料变形的速度(或力)。当在旋转流变仪中测量粘度时，观察到以下剪切稀化特性：随着剪切速率增加而粘度降低。水凝胶显示出塑性行为，这意味着在材料开始容易地流动之前需要一定的剪切应力(力)。该临界剪切应力经常被称作屈服应力。屈服应力可由用应力控制流变仪测定的稳态流动曲线确定。当将粘度相对于施加的剪切应力作图时，可看到在超过临界剪切应力后粘度急剧下降。零剪切粘度和屈服应力是描述材料悬浮能力的最重要流变参数。这两个参数能够非常清楚地区分不同的级别，从而能对级别进行分类。

原纤或原纤束的尺寸取决于例如原料，崩解方法和崩解运行的次数。可采用任何合适的设备，如精制机、研磨机、分散器、均质机、磨碎机(colloider)、摩擦研磨机、销棒粉碎机(pin mill)、转子-转子解胶机、超声波破碎器、流化器(如微流化器、大流化器(macrofluidizer)或流化器型均质机)来对纤维素原料进行机械崩解。在存在足够的水以防止纤维间形成键的条件下进行崩解处理。

在一个实例中，通过使用具有至少一个转子、桨叶或类似移动机械构件的分散器进行崩解，所述分散器例如是具有至少两个转子的转子-转子解胶机(rotor-rotordispergator)。在分散器中，当桨叶以由半径(到转轴的距离)确定的圆周速度和旋转速度以相反方向旋转时，分散体中的纤维材料被转子的桨叶或拱肋从相反方向反复撞击。由于纤维材料在径向上向外转移，其撞在一个接着一个以高圆周速度从相反方向过来的桨叶(即拱肋)的宽表面上；换而言之，其受到来自相反方向的多次连续冲击。同样，在桨叶的宽表面(即拱肋)的边缘处(其边缘与下一个转子桨叶的相对边缘形成桨叶间隙)，出现剪切力，其有助于纤维的崩解并使原纤脱离。撞击频率取决于转子的旋转速度、转子的数量、各转子中桨叶的数量和分散体通过装置的流速。

在转子-转子解胶机中，纤维材料通过反向旋转的转子被引入，并且按照以下方式沿着相对于转子转轴的径向方向向外移动并籍此而同时发生原纤化：所述材料反复受到由不同的反向旋转转子引起的剪切和撞击力。转子-转子解胶机的一个实例是Atrex设备。

适于崩解的设备的另一实例是销棒粉碎机，例如多重外周销棒粉碎机。该设备的一个示例包括外壳，且在所述外壳内具有装配有碰撞表面的第一转子；与第一转子同心并装配有碰撞表面的第二转子，该第二转子被设置为以与第一转子相反的方向旋转；或与第一转子同心并装配有碰撞表面的定子。该设备包括位于外壳中并向转子或转子和定子的中央开放的进料孔，和外壳壁上并向最外部转子或定子的外周开放的出料孔。

在一个实例中，崩解通过使用均质机进行。在均质机中，纤维材料在压力的作用下进行均化。纤维材料分散体向纳米原纤纤维素的均化是由分散体的强制通流引起的，这使得材料崩解为原纤。纤维材料分散体在给定的压力下通过窄通流间隙，其中，分散体线性速度的增加使分散体受到剪切力和撞击力，导致从纤维材料中移去原纤。纤维片段在原纤化步骤中崩解为原纤。

在本文中，术语"原纤化"一般指通过向颗粒作功(work)来机械崩解纤维材料，其中纤维素原纤从纤维或纤维片段中脱离。该功可基于各种作用，例如研磨、碾碎或剪切、或它们的组合，或者能够降低颗粒尺寸的其他相应的作用。表述“崩解”或“崩解处理”可与“原纤化”互换使用。

经历原纤化的纤维材料分散体是纤维材料和水的混合物，在本文中也被称为“浆(pulp)”。纤维材料分散体一般可指与水混合的整个纤维、从中分离的部分(片段)、原纤束或原纤，并且一般地，水性纤维材料分散体是这类物质的混合物，其中组分之间的比例取决于加工程度或处理阶段，例如取决于同一批次纤维材料在处理过程中的进行处理地次数或“经历”次数。

表征纳米原纤纤维素的一种方式是使用含有所述纳米原纤纤维素的水性溶液的粘度。粘度可以是例如布氏粘度或零剪切粘度。如本文所述，比粘度用来区分纳米原纤纤维素与非纳米原纤纤维素。

在一个实例中，用布氏粘度计(布氏粘度)或者其他对应设备来测量纳米原纤纤维素的表观粘度。合适地，使用桨式转子(vane spindle)(73号)。有几种市售的布氏粘度计可用于测量表观粘度，它们都基于相同的原理。合适地，在设备中使用RVDV弹簧(RVDVspring)(布氏RVDV-III)。用水将纳米原纤纤维素的样品稀释至0.8重量％的浓度，并混合10分钟。稀释的样品物质添加到250mL烧杯中，将温度调节至20℃±1℃，如果需要的话进行加热并混合。使用10rpm的低转速。通常，布氏粘度可以在20℃±1℃，0.8％(w/w)的稠度和10rpm的条件下测量。

在该方法中作为原料提供的纳米原纤纤维素可以通过其在水溶液中提供的粘度来表征。粘度描述了例如纳米原纤纤维素的原纤化程度。在一个实例中，纳米原纤纤维素在分散于水中时提供在20℃±1℃，0.8％(w/w)的稠度和10rpm条件下测得的至少2000mPa·s，例如至少3000mPa·s的布氏粘度。在一个实例中，纳米原纤纤维素在分散于水中时提供在20℃±1℃，0.8％(w/w)的稠度和10rpm条件下测得的至少10000mPa·s的布氏粘度。在一个实例中，纳米原纤纤维素在分散于水中时提供在20℃±1℃，0.8％(w/w)的稠度和10rpm条件下测得的至少15000mPa·s的布氏粘度。所述纳米原纤纤维素在分散于水中时在20℃±1℃，0.8％(w/w)的稠度和10rpm条件下测得的布氏粘度范围的实例包括2000–20000mPa·s，3000–20000mPa·s，10000–20000mPa·s，15000–20000mPa·s，2000–25000mPa·s，3000–25000mPa·s，10000–25000mPa·s，15000–25000mPa·s，2000–30000mPa·s，3000–30000mPa·s，10000–30000mPa·s和15000–30000mPa·s。

纳米原纤纤维素可以是未改性的纳米原纤纤维素或包含未改性的纳米原纤纤维素。未改性的纳米原纤纤维素的排液明显比例如阴离子级别更快。未改性的纳米原纤纤维素通常具有在0.8％(w/w)的稠度和10rpm下测得的2000–10000mPa·s范围内的布氏粘度。然而，在本发明方法中，未改性的纳米原纤纤维素不能有效地交联，因为其含有的与多价离子交联所需的游离羧基的量较低。纳米原纤纤维素优选具有合适的羧酸含量，例如在0.6-1.4毫摩尔COOH/克的范围内，例如在0.7-1.2毫摩尔COOH/克的范围内，或在0.7-1.0毫摩尔COOH/克的范围内，或在0.8–1.2毫摩尔COOH/克的范围内，该羧酸含量通过电导滴定法测定。

崩解的纤维类纤维素原料可以是改性的纤维原料。改性的纤维原料是指纤维受处理影响从而使纤维素纳米原纤更易于从纤维上脱离的原料。通常对液体中悬浮物(即浆料)形式存在的纤维类纤维素原料进行改性。

对纤维的改性处理可以是化学、酶促或物理改性处理。在化学改性中，纤维素分子的化学结构通过化学反应(纤维素的“衍生化”)改变，优选使得纤维素分子的长度不受影响，但官能团添加至聚合物的β-D-吡喃葡萄糖单元。纤维素的化学改性以某一转化度发生，该转化度取决于反应物的剂量和反应条件，原则上化学改性不完全，这样纤维素将保持为原纤的固体形式并且不溶于水。在物理改性中，阴离子型、阳离子型或非离子型物质或其任意组合物理性地吸附在纤维素表面上。

改性后，纤维中的纤维素尤其可以带离子电荷。纤维素的离子电荷削弱了纤维的内部键，随后将促进其崩解为纳米原纤纤维素。可以通过对纤维素进行化学或物理改性来获得离子电荷。与起始原料相比，改性后的纤维可以具有更高的阴离子或阳离子电荷。用于形成阴离子电荷的最常用化学改性方法是氧化(其中羟基被氧化为醛基和羧基)，磺化和羧甲基化。可能需要化学改性引入基团，例如羧基，其可以参与纳米原纤纤维素和生物活性分子之间共价键的形成。进而，可以通过使阳离子基团(例如季铵基团)连接至纤维素来进行阳离子化，从而以化学方式产生阳离子电荷。

纳米原纤纤维素可包括化学改性的纳米原纤纤维素，例如阴离子改性的纳米原纤纤维素或阳离子改性的纳米原纤纤维素。在一个实例中，纳米原纤纤维素是阴离子改性的纳米原纤纤维素。在一个实例中，阴离子改性的纳米原纤纤维素是氧化的纳米原纤纤维素。在一个实例中，阴离子改性的纳米原纤纤维素是磺化的纳米原纤纤维素。在一个实例中，阴离子改性的纳米原纤纤维素是羧甲基化的纳米原纤纤维素。通过纤维素的阴离子改性获得的材料可以称为阴离子纤维素，其是指与未改性的材料相比，通过改性增加了阴离子基团(例如羧基)的量或比例的材料。作为羧基的替代或者补充，还可以将其他阴离子基团引入纤维素，例如磷酸根基团或硫酸根基团。这些基团的含量可以在与本文关于羧酸公开的范围相同的范围内。

纤维素可以被氧化。在纤维素的氧化中，纤维素的伯羟基可以通过杂环硝酰基化合物，例如通过N-氧基介导的催化氧化(例如2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧基自由基，通常称为“TEMPO”)进行催化氧化。纤维素β-D-吡喃葡萄糖单元的伯羟基(C6-羟基)被选择性地氧化为羧酸基团。还从伯羟基形成一些醛基。关于这一发现，即低的氧化程度不能实现足够有效的原纤化而较高的氧化程度在机械破坏处理之后影响纤维素的降解，纤维素可氧化到一定的水平，即通过电导滴定测定的氧化纤维素中的羧酸含量为0.5–2.40毫摩尔/克浆料，或0.6–1.4毫摩尔COOH/克浆料，或0.8–1.2毫摩尔COOH/克浆料，优选1.0–1.2毫摩尔COOH/克浆料。当由此得到的氧化的纤维素的纤维在水中崩解时，它们提供个体化纤维素原纤的稳定透明分散体，该个体化纤维素原纤的宽度可以例如为3-5nm。当氧化的浆料作为起始介质时，可以得到在0.8％(w/w)稠度下测得的布氏粘度至少为10000mPa·s、例如在10000–30000mPa·s范围内的纳米原纤纤维素。

在本公开中无论何时提及催化剂“TEMPO”，很明显所有涉及“TEMPO”的测量和操作都等同地或者类似地适用于TEMPO的任意衍生物或者任意能够选择性催化纤维素中C6碳的羟基基团的氧化的杂环硝酰基自由基。

本文公开的纳米原纤纤维素的改性也可以应用于本文描述的其他原纤纤维素级别。例如，高度精制的纤维素或微原纤纤维素也可以被类似地化学改性或酶改性。但是，例如,材料的最终原纤化程度存在差异。

在一个实例中，这些化学改性的纳米原纤纤维素在分散于水中时提供在20℃±1℃，0.8％(w/w)的稠度和10rpm条件下测得的至少10000mPa·s的布氏粘度。在一个实例中，这些化学改性的纳米原纤纤维素在分散于水中时提供在20℃±1℃，0.8％(w/w)的稠度和10rpm条件下测得的至少15000mPa·s的布氏粘度。在一个实例中，这些化学改性的纳米原纤纤维素在分散于水中时提供在0.8％(w/w)的稠度和10rpm条件下测得的至少18000mPa·s的布氏粘度。所用的阴离子纳米原纤纤维素的例子的布氏粘度在13000–15000mPa·s或18000–20000mPa·s的范围内，或甚至最高达25000mPa·s，这取决于原纤化的程度。

在一个实例中，纳米原纤纤维素是TEMPO氧化的纳米原纤纤维素。该材料在低浓度下提供高粘度，例如在0.8％(w/w)稠度和10rpm条件下测得的至少20000mPa·s、甚至至少25000mPa·s的布氏粘度。在一个实例中，TEMPO氧化的纳米原纤纤维素在20℃±1℃，0.8％(w/w)稠度和10rpm条件下测得的布氏粘度在20000–30000mPa·s的范围内，例如25000–30000mPa·s。

在一个实例中，纳米原纤纤维素包含未化学改性的纳米原纤纤维素。在一个实例中，这种未化学改性的纳米原纤纤维素在分散于水中时提供在20℃±1℃，0.8％(w/w)的稠度和10rpm条件下测得的至少2000mPa·s，或至少3000mPa·s的布氏粘度。

纳米原纤纤维素还可以通过平均直径(或宽度)、或平均直径与粘度一起来表征，所述粘度例如是布氏粘度或零剪切粘度。在一个实例中，适用于本文所述产品的纳米原纤纤维素具有在1-200nm或1-100nm范围内的平均原纤直径。在一个实例中，所述纳米原纤纤维素具有在1-50nm范围内，诸如2-20nm或5-30nm的平均原纤直径。在一个实例中，所述纳米原纤纤维素具有在2-15nm范围内的平均原纤直径，例如在TEMPO氧化的纳米原纤纤维素的情况便是如此。

可用多种技术，例如使用显微镜来确定原纤的直径。可通过对场发射扫描电子显微镜(FE-SEM)、透射电子显微镜(TEM)(例如低温透射电子显微镜(cryo-TEM))或原子力显微镜(AFM)获得的图像进行图像分析来测定原纤厚度和宽度分布。通常，AFM和TEM最合适具有窄原纤直径分布的纳米原纤纤维素级别。

在一个实例中，在22℃，用装配有窄间隙叶片几何结构(直径28mm，长度42mm)的应力受控的旋转流变仪(AR-G2，英国TA仪器公司(TA Instruments,UK))，在直径为30mm的圆筒形样品杯中对纳米原纤纤维素分散体的流变粘度进行测量。在将样品装载到流变仪之后，使它们静止5分钟，之后开始测量。用逐渐增加的剪切应力(其与施加的扭矩成比例)来测量稳态粘度，并测量剪切速率(其与角速度成比例)。在达到恒定剪切速率之后或者在2分钟的最大时间之后，记录某一剪切应力下的报道粘度(＝剪切应力/剪切速率)。当超过1000s^-1的剪切速率时，停止测量。该方法可用于确定零剪切粘度。

在一个实例中，纳米原纤纤维素当分散在水中时提供在1000–100000Pa·s范围内、例如在5000–50000Pa·s范围内的零剪切粘度(在小剪切应力下恒定粘度的“平台”)，和在1–50Pa范围内、例如在3–15Pa范围内的屈服应力(剪切稀化开始时的剪切应力)，这些测量结果是通过旋转流变仪在20℃±1℃，0.5重量％(w/w)的稠度条件下在水性介质中确定的。这种纳米原纤纤维素还可以具有200nm或更小的平均原纤直径，例如在1-200nm的范围内。

浊度是通常为肉眼不可见的个体颗粒(所有的悬浮或溶解固体)导致的流体的混浊或模糊。有几种测量浊度的实用方式，最直接的是测量光穿过水样柱时的衰减(即，强度的降低)。可以替代使用的杰克逊蜡烛法(单位：杰克逊浊度单位或JTU)本质上是反过来测量完全遮蔽穿过水柱所见的蜡烛火焰所需的水柱长度。

可以采用光学浊度测量仪器来定量测定浊度。存在一些市售用于定量测量浊度的浊度计。在本发明中，采用基于比浊法的方法。来自校准比浊计的浊度单位称作比浊法浊度单位(NTU)。用标准校准样品对测量设备(浊度计)进行校准和控制，之后对经稀释的NFC样品的浊度进行测量。

在一种浊度测量方法中，将纳米原纤纤维素样品在水中稀释至低于所述纳米原纤纤维素的胶凝点的浓度，测量稀释样品的浊度。测得纳米原纤纤维素样品的浊度的所述浓度为0.1％。采用具有50mL测量容器的HACH P2100浊度计(Turbidometer)来进行浊度测量。确定纳米原纤纤维素样品的干物质，将0.5g样品(以干物质计算)装载到测量容器中，其用自来水填充至500g，并通过振荡剧烈混合约30秒。立即将水性混合物分入5个测量容器中，将它们插入浊度计中。对每个容器进行3次测量。从所获得的结果计算平均值和标准偏差，最终结果单位为NTU单位。

表征纳米原纤纤维素的一种方式是既限定粘度又限定浊度。低浊度表示原纤的小尺寸，例如小直径，因为小原纤对光的散射很差。一般而言，随着原纤化程度增加，粘度增加并且同时浊度降低。然而，这种情况发生直到达到某个点为止。当进一步进行原纤化时，原纤最终开始破裂并且不能再形成牢固的网络。因此，在此点之后，浊度和粘度都开始下降。

在一个实例中，阴离子纳米原纤纤维素的浊度低于90NTU，例如3-90NTU，诸如5-60NTU，例如8-40NTU，这些数值是通过比浊法在0.1％(w/w)稠度下在水性介质中测得。在一个实例中，天然纳米原纤的浊度甚至可以高于200NTU，例如10-220NTU，诸如20-200NTU，例如50–200NTU，这些数值是通过比浊法在20℃±1℃，0.1％(w/w)稠度条件下在水性介质中测得。为了表征纳米原纤纤维素，可以将这些范围与纳米原纤纤维素的粘度范围组合，例如所述纳米原纤纤维素在分散于水中时提供在20℃±1℃，0.8％(w/w)的稠度和10rpm条件下测量的至少2000mPa·s，至少3000mPa·s，至少5000mPa·s、例如至少10000mPa·s，例如至少15000mPa·s的布氏粘度。

用于增强制造工艺或者改进或调节产品性质的助剂可包含在纳米原纤纤维素分散体中。这些助剂可以溶于分散体的液相中，它们可以形成乳液或者它们可以是固体。助剂可以在制造纳米原纤纤维素分散体的过程中已经添加到原料中，或者添加到形成的纳米原纤纤维素分散体或凝胶中。助剂也可以添加到最终产品中，例如通过浸渍、喷洒，浸没，浸泡等方法添加到最终产品中。助剂通常不与纳米原纤纤维素共价结合，因此它们可以从纳米纤维素基质中释放出来。当使用NFC作为基质时，可以制释和/或缓释这些试剂。助剂的实例包括治疗剂(药剂)和美容剂以及影响产品性质或活性剂性质的其它试剂，例如缓冲剂、表面活性剂、增塑剂、乳化剂等。在一个实例中，分散体含有一种或多种盐，其可以加入以增强最终产品的性质或促进在制造过程中从产品中除去水。盐的一个例子是氯化钠。盐的含量可以为分散体中干物质的0.01-1.0％(w/w)。也可将最终产品浸入或浸泡在氯化钠溶液中，例如浸入或浸泡在约0.9％的氯化钠水溶液中。最终产品中所需的氯化钠含量可以是湿产品体积的0.5-1％，例如约0.9％。可以提供盐、缓冲剂和类似试剂以获得生理条件。

纳米原纤纤维素材料可以水凝胶的形式提供，细胞将与之结合。水凝胶可以本文所述的任何形式存在。

水凝胶

纳米原纤纤维素未完全脱水时，其水分含量可以在80-99.9％(w/w)或50-99.8％(w/w)的范围内。当纳米原纤纤维素以凝胶形式存在时，其水分含量可以在90-99.8％(w/w)的范围内。该凝胶可以称为水凝胶。

纳米原纤纤维素可以以凝胶形式提供，更特别地作为医用水凝胶提供。凝胶可以是可模制的，并且可以将其施加或形成在目标上，例如附着到细胞培养板、多孔板、小瓶或其他容器上。通过使用包含或封装在水凝胶中的细胞，例如干细胞，目标也可以是需要治疗的个体。

一个实例提供了制备这种水凝胶的方法，所述方法包括：

-提供浆料，

-使浆料崩解直至获得纳米原纤纤维素，

-使得纳米原纤纤维素形成为水凝胶。

可以将纳米原纤纤维素原纤化到所需的原纤化程度，并调节至所需的水含量，或进行其他改性，以使其形成具有如本文所述的所需性质的凝胶。在一个实例中，水凝胶中的纳米原纤纤维素是阴离子改性的纳米原纤纤维素。

用作医用或科学水凝胶的水凝胶需要是均匀的。因此，制备水凝胶的方法可以包括使包含纳米原纤纤维素的水凝胶均质化，优选用均质化装置如本文所述的那些进行均质化。利用这种优选的非原纤化均质化步骤，可以从凝胶中除去不连续区域。获得具有用于应用的更好性质的均匀凝胶。水凝胶可以进一步灭菌，例如通过使用加热和/或辐射，和/或通过添加灭菌剂，例如抗微生物剂来进行灭菌。

用于制备细胞系统的纳米原纤纤维素的初始水含量可以在80–99.9％(w/w)或50–99.8％(w/w)的范围内，例如90–99.8％(w/w)。该材料可以是凝胶形式或可以不是凝胶形式。可以提供脱水程度更高的材料，这有利于储存，这种材料通常在使用前需要再水化。可以添加水或细胞储存介质。

细胞系统

可以通过将细胞与纳米原纤纤维素(例如包含纳米原纤纤维素的水凝胶)组合来形成细胞系统。细胞可以被包含或封装在水凝胶中，并且这两个术语可以互换使用。可将细胞以悬液形式提供，并与纳米原纤纤维素组合以形成包含细胞的水凝胶。

水凝胶也可以称为细胞储存材料。细胞系统是指包含细胞和基质的实体，所述基质包含适当形式的纳米原纤纤维素，其中可以将细胞系统储存和/或从第一位置转移到第二位置。细胞系统可以被包括在容器和/或包装中。例如，细胞系统可以被施加或提供在小瓶、板、多孔板、试管、瓶或其他合适的容器中。容器可以是密封的，例如用密封膜覆盖或包装在塑料袋，包裹物等中。可以通过密封件或包装来保护细胞系统免受光照，特别是如果在细胞储存介质中使用了任何光敏剂时。细胞系统包含液体细胞储存介质。通常，纳米原纤纤维素包含大量液体，并且也可以提供基质作为单独的实体，其进一步悬浮在液体介质中。

可以制备和提供不同的细胞系统材料。这些材料可以用于以不同方法储存，运输和提供不同类型的细胞。储存细胞还可以进行质量控制，尤其是在细胞等待批准以释放时。

细胞系统包括细胞储存介质，其也可以称为暂停介质，其可以不同于细胞培养基。细胞储存介质包含一种或多种缓冲剂。在一个实施方式中，细胞储存介质包含两性离子缓冲剂，例如4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)，发现其在测试中是有利的。缓冲剂的pK_a值优选在6-8的范围内。

细胞可以在NFC水凝胶中长期储存和/或控制，例如储存和/或控制2-7天，甚至长达14或21天。如本文所公开的，可以在低温下提供细胞系统。

优选地，在0-30℃，例如0-25℃范围内的温度下提供细胞系统。当形成细胞系统时，可以在所需温度下以水凝胶和/或分散体的形式提供纳米原纤纤维素材料，和/或可以在所需温度下提供以悬液形式存在的细胞。用于制备细胞系统的方法可以包括将纳米原纤纤维素水凝胶和/或分散体冷却至所需温度和/或将细胞悬液冷却至所需温度。该方法还可以包括将形成的细胞系统冷却到期望的温度。

对温度加以选择，使得细胞不被冷冻，该温度优选地至少为0℃，1℃或2℃，例如在1-25℃或2-25℃的范围内。此外，还应避免过高的温度，特别是在敏感细胞(例如干细胞)的情况下，这些细胞需要保持未分化的状态。可以使用冷藏温度，例如在1–10℃的范围内，例如大约4℃。然而，在通过邮递等方式运输细胞的情况下，可能难以维持这种温度。已经发现，这些细胞，甚至干细胞，在环境温度(例如甚至高达25℃的室温)下仍能存活。在一个实施方式中，温度在10-25℃或15-25℃的范围内，例如18-23℃。可以通过简单地使用隔离包装(优选地包含冰)，例如聚苯乙烯泡沫塑料(Styrofoam)包装，或者通过使用冷藏箱等，来在储存和运输期间保持期望的温度。在储存过程中，细胞系统可储存在冰箱中，或者甚至储存在室温下。

本公开提供了包含纳米原纤纤维素产品的细胞储存或细胞递送组合物、材料或基质，所述纳米原纤纤维素产品例如为处于湿态的水凝胶、主体或膜的形式。可以以第一水含量提供细胞储存材料，并且可以将水性液体添加到该材料中以获得第二水含量。湿态可以指第一或第二水含量。第二水含量可以是细胞系统的水含量，例如在储存或递送细胞期间的水含量。第一水含量可以是本文所述的产品或材料的水含量，例如低于20％的水含量。第二水含量可以是90％或更高，例如95％或更高，98％或更高，或者99％或更高的水含量，其可以被认为是水凝胶。添加的水性液体可以是细胞储存介质。细胞培养基是细胞培养中使用的水性介质。细胞储存介质优选不同于细胞培养基。当将细胞施加到细胞储存材料上，即施加到水凝胶上时，可以将细胞培养基更换成细胞储存介质。细胞储存材料可能已经包含细胞储存介质，更特别地，水凝胶可以基于细胞储存介质。在将细胞施加到细胞储存材料上之前，可以用细胞储存介质洗涤细胞。可以在水凝胶中培养细胞，并且当细胞存在于水凝胶中时，将细胞培养基更换为细胞储存介质。这可以例如通过将水凝胶浸泡在细胞储存介质中来进行。

细胞储存介质可以包含或可以不包含通常含于细胞培养基中的试剂，例如血清或其组分。细胞储存介质旨在维持离子和渗透平衡，抑制酸中毒和/或防止细胞在低温下膨胀。这些特征促进了细胞稳态的保持，而仅使用培养基作为保存制剂是无法实现这种保持的。细胞储存介质的一个例子是缓冲溶液，特别是缓冲盐溶液，例如等渗缓冲液，例如磷酸盐缓冲盐水。简单地说，细胞储存介质仅包含一种或多种缓冲剂和任选的一种或多种盐。细胞储存介质还可包含一种或多种渗透/肿胀稳定剂，自由基清除剂/抗氧化剂，离子螯合剂，膜稳定剂和/或能量底物。

除了可能的缓冲剂，细胞储存介质可以还包含或可以不包含任何有机分子，例如营养物，血清或生物活性剂。细胞储存介质可以是无蛋白质和/或无血清的介质，例如不含动物或人血清的介质。

缓冲溶液是包含弱酸及其共轭碱(反之亦可)的混合物的水溶液。可以使用缓冲溶液将pH值保持在基本恒定或接近恒定的值。细胞储存介质的pH值可以在6-8的范围内，例如7.0-7.7。特别是干细胞可能需要7.4左右的pH范围，例如7.2–7.6。

可用于生物学应用的缓冲剂的例子包括TAPS([三(羟甲基)甲基氨基]丙磺酸)，Bicine(2-(双(2-羟乙基)氨基)乙酸)，Tris(三(羟甲基)氨基甲烷)或(2-氨基-2-(羟甲基)丙烷-1,3-二醇)，Tricine(3-[N-三(羟甲基)甲基氨基]-2-羟基丙磺酸)，TAPSO(3-[N-三(羟甲基)甲基氨基]-2-羟基丙磺酸)，HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)，TES(2-[[1,3-二羟基-2-(羟甲基)丙烷-2-基]氨基]乙磺酸)，MOPS(3-(N-吗啉代)丙磺酸)，PIPES(哌嗪-N,N′-双(2-乙磺酸))，卡可基酸盐(Cacodylate，二甲基砷酸)和MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸)。

通用缓冲溶液的一个具体示例是磷酸盐缓冲盐水(PBS)，通常其pH值为7.4。这是一种水性盐溶液，包含磷酸氢二钠和氯化钠，在某些配方中还包含氯化钾和磷酸二氢钾。溶液的渗透压和离子浓度与人体的渗透压和离子浓度匹配，因此是等渗的。

通常，细胞储存介质包含一种或多种缓冲剂。在一个实施方式中，细胞储存介质包含两性离子缓冲剂，例如4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)，发现其在测试中是有利的。缓冲剂的pK_a值优选在6-8的范围内。细胞储存介质中的缓冲剂含量可以小于100mM，例如10–50mM，或20–30mM，例如20–25mM。

两性离子缓冲剂的其他实例包括3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)，2-[(2-羟基-1,1-双(羟甲基)乙基)氨基]乙磺酸(TES)和N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙磺酸(ACES)。

细胞储存介质可以包含一种或多种渗透剂，其也称为渗透稳定剂，其用于调节介质的渗透压力或渗透浓度(渗透压)，优选用于提供等渗溶液和/或获得所需的渗透压。渗透剂的实例包括葡萄糖，基于葡萄糖的聚合物，淀粉，葡聚糖，明胶，白蛋白，氨基酸例如谷氨酰胺，多肽，寡肽，二肽(例如超谷氨酰胺)，甘油或其组合，例如基于葡萄糖的聚合物和氨基酸，或氨基酸和甘油。这些试剂也可以充当能量底物。渗透剂的浓度可以在0.5-2％(w/w)的范围内，例如在1-1.5％(w/w)的范围内。也可以提供诸如盐的离子化合物，例如氯化钠作为渗透剂。介质的渗透压可以在250-350mOsm/kg的范围内，例如260-320mOsm/kg。细胞储存介质可包含一种或多种肿胀剂(oncotic agent)，也称为肿胀稳定剂(oncotic stabilizer)。肿胀压或胶体渗透压是蛋白质施加的渗透压的一种形式。

细胞储存介质还可包含一种或多种螯合剂，例如乙二胺四乙酸(EDTA)，维生素E，超谷氨酰胺，碳酸氢钠和/或一种或多种蛋白酶抑制剂。

细胞储存介质还可以包含其他成分，例如必需培养基，例如基本必需培养基(MEM)等。这种必需培养基或基本必需培养基可以是合成的，并且可以包含氨基酸、盐、葡萄糖和维生素，并且还可以包含例如丙酮酸钠、碳酸氢钠和/或谷氨酰胺。例如，伊氏(Eagle)基本必需培养基(EMEM)包含氨基酸、盐(氯化钙、氯化钾、硫酸镁、氯化钠和磷酸一钠)、葡萄糖和维生素(叶酸、烟酰胺、核黄素、B₁₂)。基本必需培养基的其他实例包括DMEM，α-MEM和GMEM。达氏(Dulbecco)改良伊氏培养基(DMEM)可包含氨基酸(精氨酸、胱氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸)，无机盐(CaCl₂、Fe(NO₃)_3·9H₂O、KCl、NaHCO₃、NaH₂PO_4·H₂O)，维生素(胆碱、叶酸、肌醇、烟酰胺、泛酸、吡哆醇、核黄素、硫胺素)，葡萄糖和丙酮酸钠。细胞储存介质的一个实例包含MEM(例如DMEM)和HEPES。细胞储存介质的一个实例包含MEM，例如DMEM，碳酸氢钠，HEPES和超谷氨酰胺。细胞储存介质的一个实例包含MEM，例如DMEM，碳酸氢钠，HEPES，胎牛血清(FBS)和超谷氨酰胺。

本公开提供了用于储存真核细胞的方法，该方法包括：

-提供真核细胞，

-提供纳米原纤纤维素，例如包含纳米原纤纤维素的水凝胶，该纳米原纤纤维素可以处于第一浓度，

-将细胞和纳米原纤纤维素组合以形成细胞系统，其可以包含水凝胶，其中纳米原纤纤维素处于第二浓度，和

-在0–25℃范围内的温度下储存细胞系统。在细胞系统中包含细胞储存介质。细胞系统可以是本文描述的任何细胞系统。

第一浓度和第二浓度，也可以表示为稠度，是指纳米原纤纤维素的浓度或稠度，第一浓度和第二浓度可以基本上相同或不同。例如，如果细胞以悬液形式提供，则第二浓度可以低于第一浓度。第一浓度可以例如在0.1-20％(w/w)的范围内，例如0.1-10％(w/w)，0.1-5％(w/w)或0.1-2.0％(w/w)。

可以以这样的第一浓度提供水凝胶：当将细胞以悬液或类似的水性制剂的形式与水凝胶组合时，获得所需的第二浓度，该第二浓度可以在0.1-10％(w/w)的范围内，例如0.2–5％(w/w)，0.4–2％(w/w)。浓度超过0.7％(w/w)，例如在0.8-1.5％(w/w)范围内，可增强干细胞的活力。在许多情况下，浓度在0.5-1.5％(w/w)的范围内是合适的。

所述细胞可以是哺乳动物细胞，例如人或动物细胞。所述细胞可以是干细胞，例如人或动物干细胞。干细胞可以是非胚胎干细胞，例如间充质干细胞，或其他干细胞系，例如人胚胎干细胞系，其产生而没有破坏胚胎。

细胞系统可以包含各种细胞，例如，在10万–1000万个细胞/ml凝胶的范围内，例如50万–500万个细胞/ml或100万–1000万个细胞/ml，例如100万-300万个细胞/毫升。凝胶浓度可以是本文所述的任何浓度，例如0.1-10％，例如0.2-5％(w/w)，0.4-2％(w/w)或0.8-1.5％(w/w)。

该方法可以包括将细胞系统储存在可以在冰箱中获得的1–25℃，例如1–10℃的温度下，或储存在环境温度的15–25℃，例如13–23℃或18–20℃的温度下。还可以将细胞储存在大气条件下，例如在大气压下，以及在大气CO₂或O₂浓度下。

该方法可以包括将细胞在细胞系统中储存至少24小时，或至少56或72小时，例如24–52、24–72或24–168小时，甚至1–21天，例如1–14天或1–7天。此类储存可归类为短期存储，并且适用于例如当细胞需要运输到另一个位置时，或者如果细胞使用暂停，例如在周末或其他非工作日期间。在运输和/或释放之前，可能还需要储存以进行质量控制。

可以提供水性细胞储存介质，并且可以将细胞和纳米原纤纤维素与细胞储存介质组合。在一个实施方式中，该方法包括提供包含两性离子缓冲剂(例如4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)的细胞储存介质，并将细胞和纳米原纤纤维素与细胞储存介质组合。

本公开提供了用于提供真核细胞的方法，该方法包括：

-提供文中所述的细胞系统，

-从水凝胶中释放细胞，例如通过酶促消化水凝胶或通过稀释水凝胶来进行，以提供细胞。

该方法可以包括用一种或多种纤维素酶来酶促消化水凝胶，优选纤维素酶的使用剂量为500-1500μg酶/mg凝胶，更优选1000-1300μg/mg，进行例如1-4小时，优选1.5–2.5小时。也可以使用较低的剂量，例如在300μg/mg以上，例如300–1500μg/mg或300–1000μg/mg。但是，使用较低剂量的酶可能需要更长的时间，这可能会危及细胞的活力。

一个实例提供了一种用于制备细胞储存或细胞递送材料的方法，该方法包括提供可以为脱水材料的纳米原纤纤维素材料，并与水性液体例如细胞储存介质混合。获得包含该材料的混合物。该混合物可以进一步与一种或多种助剂，例如盐，pH调节剂等组合和/或混合。

一个实例提供了一种试剂盒，其包括第一容器和第二容器，该第一容器包含纳米原纤纤维素或脱水形式的纳米原纤纤维素，例如干粉，浓缩颗粒或浓缩水凝胶体，该第二容器包含纤维素酶。

一个实例提供了三维不连续实体，用于储存包含水性介质的细胞和包含悬浮在水性介质中的纳米原纤纤维素产品的水凝胶体。水性介质可以是细胞储存介质。在一个实例中，水凝胶体是相互连接的。水凝胶体的水含量可以在1–90％的范围内，更特别是1–50％或1–20％。如果该材料高度脱水，则其水含量可以在0–20％，0–10％或1–10％的范围内，并且可以纳米原纤纤维素体形式代替水凝胶体形式来提供该材料。

三维不连续实体可通过包括以下步骤的方法获得：在第一水性介质中提供纳米原纤纤维素产品以提供水凝胶，并将所述水凝胶与第二水性介质混合以获得在第二水性介质中的水凝胶体的悬浮液。第一水性介质和第二水性介质可以是相同的介质类型，但是它们也可以是不同的，例如第一介质例如是细胞储存介质，第二介质是细胞培养基。三维不连续实体也可以由浓缩的纤维素纳米原纤水凝胶或干燥的纤维素纳米原纤制成，该制备通过以下方式进行：将浓缩的水凝胶或干燥的纤维素纳米原纤制粒以获得颗粒，将颗粒在水性介质中水合，并将水合的颗粒混合，任选地添加水性介质，以获得水凝胶体的悬浮液。水凝胶的不连续结构可以例如通过简单的显微镜分析或屈服应力测定并与具有相应NFC浓度的均质水凝胶进行比较来加以证实。

不连续的凝胶结构也可以由浓缩(例如10–30％w/w)纤维素纳米纤维产品或者甚至干纤维素纳米纤维产品制成。当使用干燥或浓缩的材料时，首先将样品制粒成合适的大小(例如0.1–2mm)，在水中或在细胞培养基中水合，然后使用合适的方法活化成连续或不连续的形式。平均直径在2到20微米范围内的喷雾干燥的颗粒也可以用作起始材料。在这些不连续的凝胶种类中，受控的孔隙率取决于颗粒尺寸和总浓度，即溶胀的凝胶结构域或凝胶体之间的距离。

本文描述的产品可以包装在包含一种或多种产品的包装中提供。可以将产品包装在密封的包装中，例如以使其保持不受污染并保持水分含量，例如，当产品以干燥或一定的水含量提供时。当使用以干燥或脱水形式提供的产品时，可在使用前将其润湿至所需的水分含量。

在一个实例中，三维不连续实体的总体积中水凝胶体的总体积在10–99％(v/v)的范围内，例如50–95％(v/v)。

在相同条件下三维不连续实体的屈服应力低于相应的连续水凝胶的屈服应力，例如在相同条件下是相应连续水凝胶的屈服应力的1–95％。

一个实例提供了不连续的三维实体及其制备方法，其中制备用于储存细胞的三维不连续实体的方法包括：

-提供以下形式的纳米原纤纤维素产品：

i)均匀水凝胶；

ii)均质水凝胶与水性介质的组合；和/或

iii)在水性介质中水合的脱水凝胶体或干燥的颗粒状纳米原纤纤维素产品；和

-在有利于机械破坏水凝胶的均匀结构的条件下混合，以获得作为三维不连续实体的水凝胶体的悬浮液。

一个实例提供了一种细胞储存基质。一个实例提供了一种细胞系统和一种用于制备细胞系统的方法，其包括提供本文公开的细胞储存材料，提供细胞，提供水性细胞储存介质，并将它们混合以获得细胞系统。

一个实例提供了一种制品以及该制品在细胞储存中的用途，该制品包括：

-具有表面的基材；

-三维不连续实体，其包含水性介质和水凝胶体，该水凝胶体包含悬浮在水性介质中的纳米原纤纤维素产品，或三维不连续实体，其包含水性介质和水凝胶体，该水凝胶体包含悬浮在水性介质中的纳米原纤纤维素产品，其为脱水形式。包含三维不连续实体的制品可以是适合于储存细胞的任何制品，例如细胞培养瓶，板和皿，多孔培养板，微量滴定板，高通量板等。

构成三维不连续实体的凝胶体的分数体积可以在三维不连续实体的总体积的50％到99％之间变化，因此，局部CNF浓度可以高于或低于整个实体的CNF浓度。凝胶体的分数可以容易地定性地确定，例如通过显微镜检查或沉淀分析。

一个实例提供了一种包括第一容器和第二容器的试剂盒，该第一容器包括三维不连续实体或脱水形式的三维不连续实体，例如干粉，浓缩颗粒或浓缩水凝胶体，该第二容器包含纤维素酶。

术语“三维不连续实体”是指具有三维不连续结构的系统。所述实体包括水性介质和包含悬浮在水性介质中的纤维素纳米原纤和/或其衍生物的水凝胶体。

“不连续的”是指实体的不均匀结构或实体内的物理连续性的中断，例如水凝胶体导致的水性介质中的中断或水性介质导致的水凝胶体中和/或水凝胶体之间的中断。通常，不连续材料可以包括多个分离的(包括部分分离的)主体、区域、微粒、颗粒等，其可以具有基本上球形、椭圆形等形状或不规则的形状。多个主体、区域、微粒、颗粒等也可以在不连续材料中部分互连。不连续是指基本上不均匀的材料。例如，水凝胶的块或膜不是不连续的，但是悬浮在液体介质中的多个珠、球或类似的分开的主体形成不连续的实体，即使一些主体彼此连接。在一个实施方式中，纳米原纤纤维素为分离的主体的形式，其可以是水凝胶体，例如珠。

“水凝胶体”和“水凝胶结构域”是指水凝胶的等分体、划分体、结构域、小部分、部分或剂量，优选具有连续的内部结构。水凝胶体可以具有明确定义的，不明确的，对称或不对称的形状。

当在三维不连续实体或水凝胶体的上下文中使用时，“悬浮的”或“悬浮液”是指水性介质和水凝胶的非均匀混合物，其中水凝胶可以作为分离的和/或互连的水凝胶体存在。

当在水凝胶体的上下文中使用时，“互连的”和“互连”是指水凝胶体彼此接触的系统。接触可以是水凝胶体之间的直接连接，或者水凝胶体可以松散地连接。当水凝胶的均匀结构被破坏时，例如通过混合破坏了均匀结构，得到的不连续结构的特征在于不同大小和形式的水凝胶体。所得系统可以在互连的凝胶体之间包含水腔，或者松散连接的水凝胶体可以“漂浮”在水性介质中，彼此之间具有接触。水凝胶体可以通过例如系统中存在的细胞或其他组分而间接连接。

“脱水的”或“去水的”形式是指一些水但不一定是所有的水从所讨论的材料中去除的材料形式。因此，术语“脱水的”包括例如浓缩浆液，颗粒，薄片和粉末。脱水的材料的水含量可以在0–90％(w/w)的范围内，例如0–80％(w/w)，0–50％(w/w)，1–50％(w/w)，1–40％(w/w)，1–30％(w/w)，1–20％(w/w)，10–50％(w/w)，10–40％(w/w)，10–30％(w/w)或1–10％(w/w)。

术语“试剂盒”是指制品或容器的组合，所述制品或容器的组合有助于使用该组合的用于细胞储存的三维不连续实体或制品的方法、测定或操作。试剂盒可以包含描述如何使用试剂盒的说明书(例如，描述本发明方法的说明书)，药筒，混合器，化学试剂以及其他组件。试剂盒组件可以一起包装在一个容器(例如，盒子，包装物等)中，以进行运输、储存或使用，或者可以包装在两个或更多个容器中。

细胞的使用

可以将包含在细胞系统中的细胞运输到使用地点并提供使用。可以在第一位置制备、培养和/或提供细胞，将细胞储存在本文所述的细胞系统中，并将细胞系统中的细胞运输至第二位置，在该第二位置可以使用、研究、测试、释放、管理细胞或以其他方式使用细胞。

本公开提供了用于提供真核细胞的方法，该方法包括：

-提供文中所述的细胞系统，和

-从水凝胶释放细胞以提供细胞。

一个实例提供了一种用于运输细胞的方法，其包括提供细胞系统并对处于本文公开的细胞系统中的细胞进行运输。

可以通过使用任何合适的方法从水凝胶中释放细胞。在一个实施方式中，通过酶促消化水凝胶来释放细胞。在一个实施方式中，通过稀释水凝胶来释放细胞。在一个实例中，通过对水凝胶进行离心来释放细胞，例如通过过滤材料来进行。在一个实施方式中，通过过滤水凝胶来释放细胞。可以使用这些方法的组合，例如可以首先酶促消化水凝胶以减弱凝胶结构，然后将凝胶离心和/或过滤。可以将水凝胶稀释到一个浓度，在该浓度下，纳米原纤材料不再以水凝胶形式存在，或者水凝胶的粘度大大降低，从而使细胞不再牢固地保留在材料中，可以轻松地释放和回收细胞，例如通过离心和/或过滤来释放和回收细胞。细胞储存介质或其他合适的水性介质可用于稀释水凝胶。可以将纳米原纤纤维素稀释至低于0.1％(w/w)，低于0.05％(w/w)，低于0.03％(w/w)或低于0.01％(w/w)的浓度，在该浓度下材料不再是凝胶形式，至少不是强凝胶形式。

纤维素纳米纤维的去除可以例如用包含一种或多种酶的酶混合物进行，例如使纤维素分子以及其中的其他木质衍生成分(例如半纤维素)部分或全部降解所需的一些酶或全部所需的酶。酶的实例包括外切纤维素酶，例如外切葡聚糖酶，和内切纤维素酶，例如内切葡聚糖酶。其他实例包括所设计的用于所述NFC的酶混合物和可商购的纤维素酶-半纤维素酶制剂。混合物的组成可以根据用于生产该NFC的原料的化学组成而变化。例如，当桦木浆用于生产NFC时，混合物至少包括完整的内切和外切纤维素酶或其部分，内切木聚糖酶以及13-D-糖苷酶和13-D-木糖苷酶。为了水解源自软木的NFC，需要至少向混合物中补充内切甘露聚糖酶和13-D-甘露糖苷酶。从纯化的酶成分中收集设计混合物的好处是，它们不包含其他蛋白质或其他不需要的成分，例如副活性物，培养生物的碎屑或培养液的残留物，这通常是商业酶制剂的情况。如果制剂中含有蛋白酶，则可能对细胞表面造成攻击，因此尤其有害。指定用于植物基材料的完全水解的商业酶混合物也可以用于NFC的水解，但更优选至少在粗纯化步骤(例如凝胶过滤或渗析)之后进行。无论酶制剂是设计的还是商购的混合物，都选择组分以使得它们可以例如在pH，温度和离子强度方面最佳地水解NFC。可以使用市售制剂，它们可以在酸性pH值(pH 3.5-5)或碱性pH值(pH 6-8)以及从室温到60-80℃的温度下起作用。细胞通常在37℃下生长，这是大多数纤维素酶和半纤维素酶的最佳温度。还可以对细胞系进行基因工程改造，以将所需的酶蛋白产生到储存系统中。

一个例子提供了一种从细胞系统中去除纳米原纤纤维素产品的方法，该方法包括：

-提供细胞系统，例如包含细胞的细胞储存材料；

-用水性或非水性液体稀释所述细胞系统；

-任选地，对细胞系统进行离心以沉淀细胞和细胞聚集体；

-例如通过倾析除去纳米原纤纤维素产品。

一个例子提供了一种从细胞系统中去除纳米原纤纤维素产品的方法，该方法包括：

-提供细胞系统，

-使细胞系统与能够降解纳米原纤纤维素材料的酶接触；

-任选地，对细胞系统进行离心以沉淀细胞和细胞聚集体；

-例如通过倾析除去纳米原纤纤维素产品。优选地，将要去除的纳米原纤纤维素产品经酶促降解以获得至少部分并且优选大部分降解的纳米原纤纤维素产品。

从细胞系统释放的细胞可以被回收和使用。细胞的用途可以是医学用途，例如可以将细胞用于治疗方法中，包括将细胞给予需要治疗的患者。该用途也可以是科学，研究或测试用途。所述细胞可以例如应用于测试系统和/或细胞培养。不同的用途可能需要不同的介质。例如，无血清介质，诸如不含胎牛血清(FBS)的介质可以用于治疗用途的细胞。

尤其是干细胞可用于治疗方法，例如用于基于细胞的治疗。该治疗方法可包括干细胞移植。可以提供细胞以释放试剂，例如可以促进伤口愈合和组织再生的旁分泌因子，或者可以提供细胞以在目标处分化为所需细胞。在储存期间，细胞维持在未分化状态，并且当释放并施加至可能在患者体内的目标时，细胞开始分化和/或被施加操作以分化。可以提供其他试剂来引发此过程。

本申请提供了包括细胞的医疗产品，其可以被施加到目标或对象的皮肤或其他组织上，所述目标或对象例如是患者或患有病症的个体、人或动物。所述医疗产品可以凝胶、贴剂、膏药、绷带等形式提供，其可以施用于伤口或受损区域或需要治疗的区域或目标上。这样的产品还可以包括其他材料，例如一种或多种纱布或类似的增强材料。

所述医疗产品可以仅包含一层纳米原纤纤维素，或者它们可以包含一层或多层另外的层，其可以是纳米原纤纤维素层和/或其他层。可以将纳米原纤纤维素掺入纱布，例如无纺布中。在一个实施方式中，医疗产品包括纱布，例如无纺布。纱布可以本文所述的任何合适方式包括或掺入产品中。组合的水分含量可以在之前讨论的相同范围内。在一个实例中，层中的纳米原纤纤维素的水分含量可以在80–99.9％(w/w)或50–99.8％(w/w)的范围内，例如在90–99.8％(w/w)的范围内，尤其是与纱布一起使用时。

可以使用干细胞的治疗方法多种多样，包括例如组织再生，心血管疾病治疗，脑部疾病治疗，例如帕金森病和阿尔茨海默病治疗，细胞缺乏症治疗，例如I型糖尿病，血液疾病治疗，例如提供造血干细胞来治疗白血病，镰状细胞贫血和其他免疫缺陷问题。

本公开还提供了本文公开的纳米原纤纤维素基质和细胞系统用于本文公开的方法的用途。

一个实施方式提供了本文公开的细胞系统用于运输，递送和/或给予细胞的用途。一个例子提供了本文公开的细胞储存材料或细胞系统用于储存细胞的用途。一个例子提供了本文公开的细胞储存材料或细胞系统用于细胞质量控制的用途。

本公开提供了本文公开的细胞系统用于治疗方法，例如本文公开的方法，例如用于包括给予细胞的治疗方法。

实施例

制备细胞系统

储存前：

人间充质干细胞(MSC)正常生长，然后储存在含FBS的介质中的组织培养塑料上，并根据Rafiq等人在以下文献中公开的方案使用胰蛋白酶/EDTA传代：“一种了解小规模人间充质干细胞培养的定量方法-对大规模生物过程发展的意义(A quantitative approachfor understanding small-scale human mesenchymal stem cell culture–implications for large-scale bioprocess development)”，《生物技术杂志》(Biotechnology Journal)，特刊：干细胞工程(Stem cell engineering)，2013年4月，第459–471页(https://doi.org/10.1002/biot.201200197)。

用于储存：

使用的板是超低附着(ULA)孔板，通常为24孔板

使用的温度：

冷藏：4℃(范围3–6℃)。普通实验室冰箱，板储存在塑料盒中，因此无大气控制

环境：18–22℃。储存在储藏柜中，同样放入塑料盒中，因此无大气控制

37℃：用作对照，处于含5％CO₂并加湿的标准组织培养箱中。

使用的暂停介质：

50ml的10X DMEM

425ml的蒸馏水/无菌水。

14.75ml的7.5％碳酸氢钠溶液

12.5ml的1M HEPES溶液

55ml的FBS

5.5ml的超谷氨酰胺。

将其无菌过滤并储存在冰箱中。

纳米原纤纤维素

和纤维素酶制剂

由UPM提供。按照UPM的说明，通过用暂停介质稀释直至达到所需的凝胶浓度来制备Growdex。尝试的浓度范围为0.4–0.9％(w/w)，这对使用纤维素酶的回收率有影响。

细胞：使用了hMSC(原始来源隆萨公司(Lonza)，骨髓来源的单核细胞)。测试了接种密度范围。

用细胞接种Growdex。接种一百万个细胞/ml稀释水凝胶(凝胶％0.8)。所有工作均在环境温度下的生活物质安全柜中完成。1x 10⁶*0.380＝3.8x10⁵个细胞/孔。

与0.8％Growdex混合的细胞总数＝6孔*3.8x 10⁵个细胞＝2.28x 10⁶个细胞。

在2.28ml的Growdex介质中中重新悬浮2.28x 10⁶个细胞。

在板：24孔ULA板中，将380μl细胞/Growdex施加到3个孔的每一个孔中。每个孔中加满介质至1ml，并转移至适当的储存条件(与冷冻不同，该冷却过程不受控制)。

细胞回收：

按照UPM提供的规程(

的使用说明)来使水凝胶消化。将酶稀释至合适的浓度，添加到水凝胶的顶部，并在静态条件下于37℃温育一段时间。测试了不同浓度的酶和不同的时间。一旦细胞被回收和洗涤后，将其在正常培养基中稀释，然后接种到正常组织培养板中进行进一步分析。回收阶段未控制细胞从环境温度/冷藏温度转变至37℃。

细胞系统的评估

进行了测试以调查该细胞系统是否能够支持在环境和冷藏条件下长期(例如≥1周)储存和运输间充质干细胞(MSC)，从而提供储存和运输临床相关细胞类型的冷冻保存的替代方法。

测试了GrowDex水凝胶是否支持在环境或冷藏条件下对MSC进行低温储存。已经发现，GrowDex是用于在冷藏或环境温度下储存细胞的合适的水凝胶结构。

MSC可以在环境温度(～18–20℃)和冷藏温度下在GrowDex中至少储存长达72小时。在环境温度和冷藏温度下储存72小时后，从凝胶中回收的细胞分别显示出～90％或～70％的活力(图1)，并保留了重新铺板后能够生长的能力(图2)。但是，总收率(活细胞/原始接种密度的百分比)为～50％，当测试延长至7天时，在冷藏条件下下降至20％。

还测试了细胞密度对方案成功的影响。已经发现，GrowDex可以以足够高的密度储存细胞，以用于临床或种子培养生物反应器接种。

最初的实验表明，GrowDex能够以96孔板中每孔最多3x10⁶个细胞的密度支持细胞至少24小时，尽管这取决于凝胶的硬度(表1)。这表明MSC优选较硬的凝胶。

表1：使用Nucleocounter自动细胞计数器评估在环境温度下暂停24小时，然后从凝胶中回收的MSC的活力。

测试了细胞回收期对细胞活力的影响。重点仍在凝胶消化阶段。最初用0.4-0.9％的凝胶进行消化产生了较差的细胞活力(<85％)和较低的收率(低至<15％)，并且需要长时间(24小时，300μg/mg Growdase)消化才能使凝胶消化。尽管回收的细胞能够在正常组织培养塑料上生长，但注意到有些细胞似乎从集落中生长出来，几乎就像外植体一样，而不是预期的均匀单层，这很可能是在24小时的最后细胞聚集的结果，尤其是在较高的凝胶浓度下(图3)。

图3显示了在环境温度下以不同细胞密度在0.4％(A)和0.9％(B)GrowDex中暂停24小时然后消化24小时(300μg/mg Growdase)的MSC的图像。

使用较高的Growdase浓度和较短的消化时间进行的实验导致较高的活细胞收率(表2)，并且细胞长成更均匀的单层。所有结果都是相似的，表明根据成本或时间是决定性因素，可以用500–1300μg/mg(mg/g)Growdase消化2或4小时。图4显示细胞活力不受较高酶浓度的影响。

表2：使用较高的Growdase浓度和较短的消化时间进行的实验的数据。N＝3。

MSC可以在环境温度(～18–20℃)和冷藏温度下在GrowDex中储存长达72小时。在环境温度和冷藏温度下储存72小时后，从凝胶中回收的细胞分别显示出～90％或～70％的活力，并保留了重新铺板后能够生长的能力。

Claims (29)

1.一种细胞系统，其包含在1-25℃范围内的温度下以未分化和暂停状态处在水凝胶中的真核非胚胎干细胞，所述水凝胶包含在细胞储存介质中的纳米原纤纤维素。

2.如权利要求1所述的细胞系统，其中，所述真核非胚胎干细胞是哺乳动物细胞。

3.如权利要求1所述的细胞系统，其中，所述细胞储存介质包含两性离子缓冲剂。

4.如权利要求3所述的细胞系统，其中，所述两性离子缓冲剂是4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸。

5.如权利要求1所述的细胞系统，其中，所述细胞储存介质包含一种或多种渗透剂。

6.如权利要求5所述的细胞系统，其中，所述所述一种或多种渗透剂包括葡萄糖，基于葡萄糖的聚合物，淀粉，葡聚糖，明胶，白蛋白，氨基酸，多肽，甘油或其组合。

7.如权利要求5所述的细胞系统，其中，介质的渗透压在250-350mOsm/kg的范围内。

8.如权利要求5所述的细胞系统，其中，所述一种或多种渗透剂包括谷氨酰胺。

9.如权利要求1所述的细胞系统，其中，细胞是间充质干细胞。

10.如权利要求1所述的细胞系统，其中，所述纳米原纤纤维素是分离体的形式。

11.如权利要求10所述的细胞系统，其中，所述纳米原纤纤维素是珠的形式。

12.如权利要求1所述的细胞系统，其中，当分散在水中时，所述纳米原纤纤维素提供在1-50Pa范围内的屈服应力，该屈服应力通过旋转流变仪在20℃±1℃下，在水性介质中0.5重量％(w/w)的稠度条件下确定，并且/或者所述纳米原纤纤维素具有200nm或更小的平均原纤直径。

13.如权利要求1所述的细胞系统，其中，当分散在水中时，所述纳米原纤纤维素提供在3-15Pa范围内的屈服应力，该屈服应力通过旋转流变仪在20℃±1℃下，在水性介质中0.5重量％(w/w)的稠度条件下确定，并且/或者所述纳米原纤纤维素具有200nm或更小的平均原纤直径。

14.如权利要求1所述的细胞系统，其中，所述水凝胶中纳米原纤纤维素的浓度在0.1–10％(w/w)的范围内。

15.如权利要求1所述的细胞系统，其中，所述水凝胶中纳米原纤纤维素的浓度在0.2–5％(w/w)的范围内。

16.如权利要求1所述的细胞系统，其中，所述水凝胶中纳米原纤纤维素的浓度在0.4–2％(w/w)的范围内。

17.如权利要求1所述的细胞系统，其中，所述纳米原纤纤维素选自阴离子改性的纳米原纤纤维素，阳离子改性的纳米原纤纤维素，未改性的纳米原纤纤维素和氧化的纳米原纤纤维素。

18.如权利要求17所述的细胞系统，其中，所述纳米原纤纤维素是TEMPO氧化的纳米原纤纤维素。

19.如权利要求1所述的细胞系统，其中，所述水凝胶中纳米原纤纤维素的浓度在0.8–1.5％(w/w)的范围内。

20.一种用于储存真核细胞的方法，所述方法包括：

-提供真核非胚胎干细胞，

-提供纳米原纤纤维素，

-提供细胞储存介质，

-将细胞、纳米原纤纤维素和细胞储存介质组合，以及

-在1–25℃范围内的温度下储存细胞系统，以形成如权利要求1-19中任一项所述的细胞系统。

21.如权利要求20所述的方法，所述真核非胚胎干细胞是哺乳动物细胞。

22.如权利要求20所述的方法，所述真核非胚胎干细胞是间充质干细胞。

23.如权利要求20所述的方法，其包括在15–25℃范围内的温度下储存细胞系统。

24.如权利要求20所述的方法，其包括在18–23℃范围内的温度下储存细胞系统。

25.如权利要求20所述的方法，其包括将细胞在细胞系统中储存至少24小时。

26.一种用于提供真核细胞的方法，所述方法包括：

-提供如权利要求1-19中任一项所述的细胞系统，

-从水凝胶中释放细胞，以提供细胞。

27.如权利要求26所述的方法，所述从水凝胶中释放细胞包括通过酶促消化水凝胶或通过稀释水凝胶来从水凝胶中释放细胞，以提供细胞。

28.如权利要求1-19中任一项所述的细胞系统用于运输细胞的用途。

29.纳米原纤纤维素通过权利要求20-25中任一项所述的方法储存真核非胚胎干细胞的用途。

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