CN110087459B - 对在包含纳米原纤纤维素的水凝胶中的细胞进行冷冻干燥的方法以及在包含纳米原纤纤维素的气凝胶中的冷冻干燥的细胞 - Google Patents

Abstract

本公开提供一种用于对在含有纳米原纤纤维素的水凝胶中的细胞进行冷冻干燥的方法，所述方法包括：提供含有纳米原纤纤维素的水凝胶，提供细胞，将细胞与含有纳米原纤纤维素的水凝胶合并以形成细胞体系，并且对细胞体系进行冷冻干燥以获得在含有纳米原纤纤维素中的干燥细胞。本公开还提供冷冻干燥的包含纳米原纤纤维素和细胞的水凝胶。

Description

对在包含纳米原纤纤维素的水凝胶中的细胞进行冷冻干燥的 方法以及在包含纳米原纤纤维素的气凝胶中的冷冻干燥的 细胞

技术领域

本发明涉及用于对细胞进行冷冻干燥的方法以及用所述方法获得的冷冻干燥的细胞。更具体地，本公开涉及对在包含纳米原纤纤维素的水凝胶中的细胞进行冷冻干燥的方法以及在包含纳米原纤纤维素的气凝胶中的冷冻干燥的细胞。

背景

根据目前的知识，复杂或大型哺乳动物细胞的冷冻干燥会对细胞造成不可逆的损害，并且冷冻干燥的细胞在干燥时往往会失去其三维形状。因此，需要找到一种方法，该方法可用于对这些细胞进行冷冻干燥，并且可以在冷冻期间保护细胞。

所获得的干燥产品应该是干燥的，活性的，贮存稳定的，干净和无菌的，伦理上可接受的，药学上精良的，易溶并且易于重建，并且该方法应该是经济上可行的。

发明内容

纳米原纤纤维素是指从纤维素原料中得到的分离的纤维素原纤或原纤束。纳米原纤纤维素是基于自然界中丰富的天然聚合物。纳米原纤纤维素具有在水中形成粘性水凝胶的能力。

纳米原纤纤维素生产技术是基于浆料纤维的水性分散体的研磨。纳米原纤纤维素在分散体中的浓度通常极低，一般约0.3-5％。在研磨或均质化过程后，得到的纳米原纤纤维素材料是稀释的粘弹性水凝胶。

由于其纳米级结构，纳米原纤纤维素具有独特的性质，其能够实现常规纤维素不能提供的功能。发现细胞(尤其是真核细胞)可以在三维培养物中的纳米原纤纤维素基质中生长，其中，细胞可以生长为球状体。该细胞培养物是有效的，因为3D培养物中的细胞可以易于彼此相互相连(communicate)并形成组织样集落。这不能通过使用传统的2D培养物实现。

然而，由于纳米级结构，纳米原纤纤维素也是一种有挑战性的材料。例如，纳米原纤纤维素可能难以进行脱水或处理。此外，在脱水后，通常难以使得干燥的材料再水化或再凝胶化(regel)，以获得具有与脱水或干燥前的原始纳米原纤纤维素相同性质的材料。特别具有挑战性的脱水过程是冷冻干燥。

在本申请中，公开了如何使用纳米原纤纤维素水凝胶作为用于对细胞(例如哺乳动物细胞)进行冷冻干燥的冻干保护基质。这样的纳米原纤纤维素(NFC)水凝胶如何进行冷冻干燥然后再水化而流变性或扩散性没有损失已是一个问题。例如，NFC的干燥促进了相邻NFC纳米纤维之间的不可逆氢键合，其称为角质化(hornification)。然而，当纳米原纤纤维素水凝胶中的细胞冷冻干燥时，发现水凝胶本身提供了冻干保护性质。当即使用海藻糖对2D培养物进行冻干保护时，细胞也不能存活。还发现在冷冻和冻干过程中，可以使用特定的辅助剂来进一步保护水凝胶和细胞。

一个实施方式提供了对在包含纳米原纤纤维素的水凝胶中的细胞进行冷冻干燥的方法，所述方法包括：

-提供包含纳米原纤纤维素的水凝胶，

-提供细胞，

使细胞与含有纳米原纤纤维素的水凝胶合并以形成细胞体系，以及

-对细胞体系进行冷冻干燥以获得在包含纳米原纤纤维素的气凝胶中的干燥细胞。

一个实施方式提供了对在包含纳米原纤纤维素的水凝胶中的胞外囊泡进行冷冻干燥的方法，所述方法包括：

-提供包含纳米原纤纤维素的水凝胶，

-提供胞外囊泡，

-使囊泡与含有纳米原纤纤维素的水凝胶合并以形成囊泡体系，以及

-对囊泡体系进行冷冻干燥以获得在包含纳米原纤纤维素的气凝胶中的干燥的胞外囊泡。

所述方法可以包括：提供一种或多种冷冻保护剂和/或冻干保护剂，并且将一种或多种冷冻保护剂和/或冻干保护剂添加到细胞体系或囊泡体系中。

一个实施方式提供了一种含有纳米原纤纤维素和细胞以任选内的一种或多种冷冻保护剂和/或冻干保护剂的冷冻干燥的气凝胶，其中，冷冻干燥的气凝胶的含水量为10％或更低，优选1–10％(w/w)，如2-8％(w/w)。

一个实施方式提供了一种含有纳米原纤纤维素和胞外囊泡的冷冻干燥的气凝胶，其中，冷冻干燥的气凝胶的含水量为10％或更低，优选1–10％(w/w)，如2-8％(w/w)。

独立权利要求中揭示了主要的实施方式。各种各样的实施方式在从属权利要求中公开。除非另有说明，权利要求中所述的实施方式和实施例可以互相自由组合。

令人惊讶地发现纳米原纤纤维素水凝胶可以在冷冻干燥过程中用作冻干保护基质。在该过程中，成分可包含在水凝胶中。成分可以包括细胞，例如，真核细胞或原核细胞，特别是哺乳动物细胞，而且还包括其它试剂，例如，冷冻保护剂和/或冻干保护剂、药物试剂或治疗剂、营养物、其它化学试剂、活化剂或其它大分子或小分子。然而，令人惊讶地发现，这样的纳米原纤纤维素水凝胶中为细胞提供了有效的冻干保护性质。这是有利的，因为特别是真核细胞、更具体是哺乳动物细胞，对冷冻干燥具有挑战性。其一个原因可能是细胞中存在的线粒体或囊泡，所述线粒体或囊泡在此过程中容易受损。

可以获得干燥的产品，其可以再水化或再分散成使包含纳米原纤纤维素的水凝胶恢复初始性质的形式，即，干燥的产品可以再凝胶化。这些性质包括例如细胞性质、凝胶性质以及活性化合物或药物成分的控释。

发现纳米原纤纤维素用作一种可以承受冷冻和干燥而不会发生机械破裂的冻干保护基质。纳米原纤纤维素也可以用作冻干保护基质。它是惰性的，没有污染物，保持足够的液体以实现高孔隙率，并且可以成形为明确限定的几何单元。此外，纳米原纤纤维素在用再水化液体充满时能够释放所吸收的活性产物。为了释放细胞，通常还需要添加酶来降解凝胶。

发现细胞保持其原始形态并且未检测到破裂或塌陷。此外，再水化的细胞附着在培养瓶的表面上，这表明细胞的活力。在测试中证明了纳米原纤纤维素水凝胶的冻干保护作用。

此外，发现当使用本文所述的方法时，胞外囊泡(例如微囊泡)可以在细胞的冷冻干燥中存活。由于微囊泡在细胞间通讯(intercellular messaging)中起作用，因此在冷冻干燥过程中微泡的保留使得细胞培养物在再水化后立即开始有效生长为3D集落的能力增强。也可以用该方法冷冻干燥来分离微囊泡。

纳米原纤纤维素水凝胶提供了亲水基质，其是无毒、生物相容的，并且也是生物可降解的。例如，基质可以酶促降解，例如通过添加纤维素酶来进行酶促降解。另一方面，水凝胶在生理条件下是稳定的。细胞(尤其是具有挑战性的真核细胞，例如哺乳动物细胞)可以在三维培养物中的纳米原纤纤维素水凝胶中进行培养、冷冻干燥并再水化以使得3D培养物恢复。

水凝胶可被酶促消化的特征是有利的，尤其在细胞的情况下。当对细胞体系进行干燥时，其生物钟停止；当对细胞进行冷冻时也是类似的。因此，可以提供全新一代的“仅加水(just-add-water)”细胞产品，其中，可以在运输后去除支持性干NFC基质。这可能反过来加速细胞研究，因为研究通常需要许多目前不可替代的手工作业。此外，运输和储存干燥的即用型细胞体系将更加经济实惠，因为不需要复杂的冷却系统。例如，可以使研究人员直接获得3D培养的细胞球状体产品，而无需首先接种细胞和使细胞生长。由于3D球状体更好地模拟真实肿瘤，特别是例如如果考虑缺氧，3D球状体的使用在不久的将来可能会增加。之后，可以以更严肃的方式考虑冻干细胞产品的临床应用。

此外，所选择的冷冻保护剂和/或冻干保护剂的存在不会影响试剂从凝胶释放的曲线。通过对水凝胶进行干燥，医疗产品或科学产品可以获得非常长的保质期。特别是，含有在潮湿条件下不稳定的细胞或活性剂(例如，蛋白质、DNA/RNA)以及对水解敏感的其它试剂的凝胶可以成功冷冻干燥成基本不含水或实际不含水且因此具有延长的稳定性和保质期的形式。该冷冻干燥草产品甚至可以在室温下储存，并且可以在使用前通过添加液体(例如，水、稀释的盐水或稀释的细胞培养基)进行再凝胶化。

包含纳米原纤纤维素的水凝胶的某些有利性质包括柔性、弹性和可重塑性。由于水凝胶含有大量水，其还可以显示出良好的渗透性。实施方式的水凝胶还提供了高保水能力和分子扩散速度性质。

本文所述的水凝胶可用于医学和科学应用，其中，包含纳米原纤纤维素的材料与活物质接触。如本文所述的包含纳米原纤纤维素的产品与活物质高度生物相容并且提供若干有利效果。不囿于任意具体理论的束缚，认为含有极其亲水的纳米原纤纤维素的水凝胶具有非常高的比表面积，并因此具有高保水能力，当施用于细胞或组织时，在细胞或组织和包含纳米原纤纤维素的水凝胶之间形成有利的潮湿环境。纳米原纤纤维素中的大量游离羟基在纳米原纤纤维素和水分子之间形成氢键，并实现纳米原纤纤维素的高保水能力和凝胶形成。由于纳米原纤纤维素水凝胶中的大量水，因此水会仅与细胞或组织接触，并且还使流体和/或试剂迁移。

附图说明

下面将结合附图解释一些实施方式，其中:

图1显示在冷冻期前的24小时海藻糖孵育后，在0.8％

水凝胶中培养的第5天的Hep G2细胞球状体。图像(A)、(B)和(C)显示出直径为100-120μm的典型球状体。图像(D)显示出直径超过160μm的较大球状体。

图2显示出液氮灭菌。(A)将污染的液氮倒入干净的桶中。(B)使用70％乙醇对整个体系进行喷雾，并用UV-C光在层流中灭菌。(C)在层流内，将15毫升的管安装在没有盖子的架上。(D)管中装有约5ml无菌液氮，同时管仍浸没在液氮中。

图3显示细胞水凝胶的冷冻并开始冷冻干燥。(A)通过将细胞-水凝胶混合物的小液滴直接移液到液氮中进行快速冷冻。(B)一旦开始施加真空，将液氮中的样品输送到冷冻干燥器，并且管仍然含有液氮。

图4显示(A)快速冷冻后冷冻状态的玻璃化200μl细胞样品；(B)干燥状态下冷冻干燥后的样品。

图5显示了优化冷冻干燥循环，用于使得CHRIST的EPSILON 1-6D的96孔(200μl/孔)中的

中的Hep G2球状体细胞体系以最短的消耗时间产生干燥样品。

图6显示(A)含有96孔板和细胞样品的细胞瓶；(B)用无菌

透气密封带密封的15毫升管。

图7图中显示了在560nm激发波长和590nm发射波长下对Hep G2细胞

的

优化结果所绘制的标准线。

图8显示在冷冻干燥后重建的细胞水凝胶体系。(A)超大细胞球状体在冷冻干燥后存活而没有细胞脱落。(B)再水化后不同尺寸的细胞球状体。(C)再水化后较小的球状体。(D)在再水合后形态没有变化的细胞球状体。

图9显示了3D细胞球状体在再水化后和重新接种后4小时如何开始使其本身附着在细胞培养瓶的2D表面上。

图10显示含有活细胞(A)和死细胞(B)的再水化和双染色后活/死染色细胞球状体的叠加图像(C)。活细胞呈绿色，死细胞呈红色。

图11显示了冷冻干燥和再水化后2D和3D细胞样品的双重染色细胞。(A)发现所有不具有

保护作用的细胞都死亡了。(B)在具有

的样本中评估15-35％的活力。

图12显示再水化后的细胞球状体。双重染色显示酶活性和丧失膜完整性的细胞，而一些细胞两者兼有；部分丧失膜完整性并保持酶活性。

图13显示了冷冻干燥的Hep G2细胞和包封在

气凝胶中的细胞球状体。(A)、(B)、(C)和(D)是典型尺寸和形状的球状体。(E)是微小细胞球状体。(F)单个Hep G2细胞。

发明详述

冷冻干燥(也称为冻干)是一种物理过程，其中通过升华从冷冻物质中可控地去除水。与其它干燥方法(例如烘箱干燥和喷雾干燥)相比，冷冻干燥是一种灵敏的干燥方法，因此特别适用于对蛋白质和其它生物化合物进行干燥。

冷冻干燥是一个多阶段操作，其中，每个步骤的成功对结果都至关重要。在冷冻干燥中，对需要保持其主要性质的活性物质进行干燥，例如，在蛋白质的情况下保持正确的3D结构。该方法包括周围的“介质”，其指的是所添加的填充剂，例如冷冻保护剂和冻干保护剂、稳定剂、乳化剂和抗氧化剂。该方法通常包括七个阶段，其中，在第一阶段中通过添加所需的填充剂来制备物质。接下来，在第二阶段，物质被冷冻至接近其Tg'点(低于转变温度)，所述Tg'点对每种混合物都是独特的。然后在第三步中，将物质在真空中干燥一段延长的时间，并通过升华去除任意的冷冻的水。该阶段称为初级干燥阶段或升华阶段。在常规条件下，干燥将在从液相到气相的相变时发生。然而，在冷冻干燥中，使温度降低直至物质冷冻，然后在升华步骤中使压力降低。迁移过程通过在水的三相点附近的固相进行。

接下来，在冷冻干燥的第四阶段中，通过在降低压力的同时升高温度来提取任何未冷冻的结合水。该步骤被称为次级干燥阶段或解吸阶段。当对物质进行干燥时，必须在第五步中将其从冷冻机器取出；调节并储存。在这个阶段，物质很容易被水、光、氧气和污染物破坏。在冷冻干燥的第六步中，将样品置于最终储存中。应针对各物质单独优化所需的储存参数。最后，在第七步重建阶段，使样品再水化以使原始体系重建以供使用。如果开发的冷冻干燥循环成功，则再水化的物质应具有与原始物质相同或几乎相同的性质。

本申请公开了纳米原纤纤维素水凝胶作为冻干保护基质在冷冻干燥过程中的用途。发现纳米原纤纤维素基质在对细胞、特别是真核细胞(如哺乳动物细胞)进行冷冻干燥时是有利的。当然，可以使用本文公开的方法冷冻干燥所有种类的细胞(例如原核细胞)以及胞外囊泡(例如微囊泡)。在该过程中可以使用冷冻保护剂和/或冻干保护剂。

发现用作基质的纳米原纤纤维素充当冻干保护剂，如本文所公开，通过使用其它冷冻保护剂或冻干保护剂可以增强其效果。因此，获得了增强的冷冻和冻干保护的协同作用。

本公开提供了包含纳米原纤纤维素的水凝胶，其也可以称为纳米原纤纤维素水凝胶。水凝胶可以作为产品提供，其也可以含有其他物质或其他元素，例如增强材料、覆盖材料、活性剂、盐等。水凝胶也可以作为医用水凝胶或医疗产品提供，或称为医用水凝胶或医疗产品。

本申请提供了对在包含纳米原纤纤维素的水凝胶中的细胞进行冷冻干燥的方法，所述方法包括：

-提供包含纳米原纤纤维素的水凝胶，

-提供细胞，

-使细胞与含有纳米原纤纤维素的水凝胶合并以形成细胞体系。可以在水性介质(例如细胞培养基)中提供细胞。也可以将水性介质添加到细胞体系中。当涉及胞外囊泡时，所形成的体系可称为囊泡体系或胞外囊泡体系。具有囊泡的过程在其他方面类似于具有细胞的过程，并且仅用囊泡代替细胞获得类似的产品。该方法和所获得的产品还可包括细胞和囊泡。

在一个实施方式中，所述方法包括在细胞体系中对细胞进行培养。在该情况下，形成细胞培养物。在许多情况下，细胞体系也可以称为细胞培养物。

最初，细胞可以在单独的培养物中进行预培养，并回收和转移到新培养基中，该新培养基可以与所述培养基相似或不同。获得细胞悬浮液。这种或另一种细胞悬浮液可以与纳米原纤纤维素(例如包含纳米原纤纤维素的水凝胶)合并和/或混合，以获得或形成细胞体系。如果在细胞体系中对细胞进行培养，则形成细胞培养物。细胞培养物可以是2D培养物或3D培养物。在一个实施方式中，所述细胞培养物是3D细胞培养物。可以培养或孵育细胞一段时间。在一个实施方式中，所述方法包括：例如，在培养基中提供一种或多种冷冻保护剂和/或冻干保护剂，并且将一种或多种冷冻保护剂和/或冻干保护剂添加到细胞体系或细胞培养物。例如，细胞培养基可以改变成含有一种或多种冷冻保护剂和/或冻干保护剂的培养基。作为替代或者附加的做法，可以将一种或多种冷冻保护剂和/或冻干保护剂添加到细胞培养的细胞培养基。在一个实例中，首先培养基中包含海藻糖，并且在添加任意其它冷冻保护剂和/或冻干保护剂之前用海藻糖对细胞进行一段时间的孵育，例如孵育约12-24小时，例如，用20-100mM的海藻糖培养基进行孵育。最终，所述方法包括：对细胞体系进行冷冻干燥以获得在包含纳米原纤纤维素的水凝胶中的干燥细胞。

一实施方式提供了包含纳米原纤纤维素和一种或多种冷冻保护剂和/或冻干保护剂的水凝胶。如前所述，该水凝胶可以提供用于与细胞合并。

细胞可以是原核细胞，例如细菌细胞，或者其可以是真核细胞。真核细胞可以是植物细胞、酵母细胞或动物细胞。真核细胞的实例包括：可移植细胞，例如，肝细胞，例如，万能(omnipotent)细胞、多潜能(pluripotent)细胞、多能(multipotent)细胞、寡能(oligopotent)细胞或单能(unipotent)细胞。在人胚胎干细胞的情况下，细胞可以来自沉积的细胞系或由未受精的卵[即“孤雌生殖体(parthenote)”卵]制成，或来自孤雌生殖活化的卵，从而不会破坏人胚胎。细胞可以在水凝胶中进行培养，并且其也可以在水凝胶中冷冻干燥。细胞可以维持在水凝胶上或水凝胶中并增殖，而不含源自细胞外的基于动物或人的化学品。细胞可以均匀地分散在水凝胶上或水凝胶中。

细胞的实例包括：干细胞、未分化细胞、前体细胞、以及完全分化的细胞及它们的组合。在一些实例中，细胞包含选自下组的细胞类型：角膜细胞、角化细胞、成纤维细胞、上皮细胞及它们的组合。在一些实例中，细胞选自下组：干细胞、祖细胞、前体细胞、结缔组织细胞、上皮细胞、肌细胞、神经细胞、内皮细胞、成纤维细胞、角化细胞、平滑肌细胞、基质细胞、间充质细胞、免疫系统细胞、造血细胞、树突细胞、毛囊细胞及它们的组合。细胞可以是肿瘤细胞或癌细胞，遗传修饰的细胞，例如，转基因细胞、顺式细胞(cisgenic cell)或敲除细胞(knock-out cell)，或致病细胞。这些细胞可用于例如药物研究。

在一个实施方式中，所述细胞是真核细胞，如哺乳动物细胞。哺乳动物细胞的实例包括：人细胞、小鼠细胞、大鼠细胞、兔细胞、猴细胞、猪细胞、牛细胞、鸡细胞等。值得注意的是：即使本方法的优点最适用于对哺乳动物细胞进行冷冻干燥，该方法也可用于对其它细胞进行冷冻干燥，其它细胞例如非哺乳动物真核细胞、酵母细胞或原核细胞。

当细胞在纳米原纤纤维素水凝胶中的3D培养物中生长时，细胞生长为球状体并且可以彼此连接。这种细胞集落可以被认为是组织。根据一个定义，组织是来自相同来源的相似细胞的集合，其共同执行特定功能。因此，本方法也可用于对组织进行冷冻干燥。可以提供包含所需细胞类型的冷冻干燥产品，其可以用于代替用于科学研究(例如用于药物测试)的真实组织。用本文所公开的方法获得的冷冻干燥的3D细胞培养物或组织培养物能够在再水化后不久就继续生长。

冷冻干燥的水凝胶也称为气凝胶，特别是冷冻干燥的气凝胶。根据一个定义，气凝胶是源自凝胶的多孔超轻材料，其中，凝胶的液体组分被气体替代。尽管其名字叫做气凝胶，但是气凝胶是坚固、刚性、干燥的材料，其物理性质不像凝胶：该名字来源于它们是由凝胶制成的。

由于发现冷冻干燥方法保留胞外囊泡，例如外来体或微囊泡，可以用该方法对胞外囊泡冷冻干燥，以在含有纳米原纤纤维素的水凝胶中获得干燥的胞外囊泡。在将治疗剂靶向靶细胞的方法中使用该胞外囊泡(特别是微囊泡)。

外来体是细胞衍生的囊泡，其存在于大多数真核流体中，包括血液、尿液和细胞培养物的培养基。外来体的直径可以是30nm-100nm。当多囊泡体与质膜融合或者直接从质膜释放时，可以从细胞中释放外来体。外来体含有其细胞来源的各种分子成分，包括蛋白质、RNA、脂质和代谢物。虽然外来体蛋白质组成随细胞和组织来源而变化，但大多数外来体含有进化上保守的常见蛋白质分子组。在给定蛋白质大小和构造以及包装参数的某些假设的情况下，单个外来体的蛋白质含量可以是约20,000个分子。外来体可以通过膜囊泡运输将分子从一个细胞转移到另一个细胞，从而影响免疫系统，例如树突细胞和B细胞，并且可以在介导对病原体和肿瘤的适应性免疫应答中发挥功能性作用。

外来体可用作高效药物载体。包括在其表面上具有多个粘附蛋白的细胞膜，已知外来体专用于细胞与细胞的通讯，并提供将各种治疗剂(例如抗癌药物)递送至靶细胞的专用方法。

微囊泡是一种胞外囊泡。它们是质膜的圆形片段，其直径为100-1000nm。微囊泡在细胞间通讯中起作用，并且可以在细胞之间传递mRNA、miRNA和蛋白质。在癌症、肿瘤免疫抑制、转移、肿瘤-基质相互作用和血管形成中，微囊泡在显著的抗肿瘤逆转效应过程中起作用，并且在组织再生中起主要作用。微囊泡反映了源自其的细胞抗原含量。不同的细胞可以从质膜释放微囊泡，例如巨核细胞、血小板、单核细胞、中性粒细胞、肿瘤细胞和胎盘。

以该方法形成了含有纳米原纤纤维素、细胞以及任选的一种或多种冷冻保护剂和/或冻干保护剂的干燥的水凝胶。该方法中所用或所形成的水凝较可以是医用水凝胶。

术语“医疗/医用”是指产品或其中产品(即，含有实施方式的水凝胶的产品)被用于或适用于医疗目或科学目的(例如研究)的用途。医疗产品可以被灭菌，或者它是可灭菌的，例如通过使用温度、压力、湿度、化学物质、辐射或其组合进行灭菌。产品(优选不含细胞的水凝胶)可以例如进行高压处理，或者可以使用其它利用高温的方法进行处理，在这种情况下，产品应当耐受超过100℃的高温，例如至少121℃或134℃的高温。在一个实例中，产品在121℃下高压灭菌15分钟。还希望医疗产品不含热原，并且它不含有不希望的蛋白质残留物等。医疗产品优选对靶标无毒。也可使用紫外灭菌。

一些实施方式的纳米原纤纤维素(NFC)水凝胶(例如，阴离子NFC水凝胶)能够随时间变化而控释活性剂(例如，细胞分泌的试剂)或治疗剂(药物成分)，特别是当温度和pH恒定时尤为如此。发现NFC水凝胶可以用特定的赋形剂进行冷冻干燥并仍然可以再胶凝化。阴离子水凝胶对于许多应用是优选的。例如，与其它级别不同，阴离子改性的纳米原纤纤维素不容易沉淀。阴离子(aniconic)级别还特别适用于释放某些活性剂。

在测试中，使用由芬欧汇川公司(UPM Kymmene Oyj)制造的名为

的市售产品。

是一种由桦树浆料制成的无菌纳米原纤化纤维素水凝胶产品。天然的

水凝胶具有高粘性，但通过与水基液体(如细胞培养基)混合，可将其粘度调节至所需条件。如果纤维浓度调节至低于1.6％，则可以通过移液来分配水凝胶，同时保持相对高的保水性。水凝胶耐受盐、温度和pH的变化，并且至少在6-8的pH范围内保持其性质。然而，镁和钙可以使得NFC纤维交联，因此应避免在细胞培养基和其它添加剂中的不希望的交联。NFC水凝胶的超微结构类似于细胞外基质(ECM)。

水凝胶是非自发荧光的，因此与细胞染色和成像兼容。在染色剂粘附在NFC纤维上的情况下，可以在成像之前通过添加纤维素酶来酶促分解

水凝胶结构。

在该说明书中，除非另有特别说明，百分数数值是基于重量(w/w)。如果给出任何数值范围，则该范围包括给出的上限值和下限值。

纳米原纤纤维素

通常由植物来源的纤维素原料制备纳米原纤纤维素。原料可以基于含纤维素的任意植物材料。原料也可以源自某些细菌发酵过程。纳米原纤纤维素优选由植物材料制备。在一个例子中，原纤是从非薄壁(non-parenchymal)植物材料获得的。在这种情况下，原纤可以从次生细胞壁获得。这种纤维素原纤的一种丰富来源是木纤维。纳米原纤纤维素是通过对来自木材的纤维状原料进行均质化制得，所述来自木材的纤维状原料可以是化学浆料。使纤维素纤维崩解以产生直径仅为数纳米的原纤，其直径最多为50纳米，例如，1-50μm，并且得到在水中的原纤分散体。原纤的尺寸可以减小到大部分原纤的直径仅在2-20纳米的范围内。来源于次生细胞壁的原纤基本为晶体，其结晶度至少为55％。这种原纤可以具有与源自初生细胞壁的原纤不同的性质，例如源自次生细胞壁的原纤的脱水可能更具挑战性。通常，在来自初生细胞壁的纤维素来源中，例如甜菜、马铃薯块茎和香蕉茎秆(bananarachis)，微纤维比来自木材的原纤更容易从纤维基质中释放出来，并且崩解需要更少的能量。然而，这些材料有些不均匀，并且由大的原纤束组成。

在一个实施方式中，植物材料是木材。木材可以来自软木树如云杉、松树、冷杉、落叶松、花旗松或铁杉，或来自硬木树如桦树、白杨、杨树、桤木、桉树、橡树、山毛榉或刺槐，或者来自软木和硬木的混合物。在一个实施方式中，纳米原纤纤维素从木浆获得。在一个实施方式中，纳米原纤纤维素从硬木浆获得。在一个实例中，硬木是桦木。在一个实施方式中，纳米原纤纤维素从软木浆获得。在一个实施方式中，所述木材浆是化学浆。

如本文所用，术语“纳米原纤纤维素”是指从基于纤维素的纤维原料分离的纤维素原纤或原纤束。这些原纤具有高纵横比(长度/直径)的特征：它们的长度可超过1μm，而直径一般保持小于200nm。最小的原纤处于所谓的初级原纤的级别，直径一般为2至12nm。原纤的尺度和尺寸分布取决于精制方法和效率。纳米原纤纤维素可表征为基于纤维素的材料，其中颗粒(原纤或原纤束)的中值长度不超过50μm，例如1至50μm的范围内，并且颗粒直径小于1μm，合适的范围是2至500nm。在天然纳米原纤纤维素的情况中，在一个实施方式中原纤的平均直径在5至100nm的范围内，例如在10至50nm的范围内。纳米原纤纤维素的特征为大比表面积和强的形成氢键的能力。在水分散体中，纳米原纤纤维素一般呈现为浅色或混浊的凝胶状材料。根据纤维原料，纳米原纤纤维素也可含有少量的其它木质组分，如半纤维素或木质素。该量取决于植物来源。纳米原纤纤维素的常用别名包括纳米原纤化纤维素(NFC)和纳米纤维素。

通常，纤维素纳米材料可根据提供纤维素纳米材料标准术语的TAPPIW13021分为几类。两个主要类别是“纳米物体”和“纳米结构材料”。纳米结构材料包括宽度为10-12μm且L/D<2的“纤维素微晶”(有时称为CMC)，和宽度为10-100nm且长度为0.5-50μm的“纤维素微原纤”。纳米物体包括“纤维素纳米纤维”，其可以分为宽度为3-10nm且L/D>5的“纤维素纳米晶体”(CNC)和宽度为5-30nm且L/D>50的“纤维素纳米原纤”(CNF或NFC)。

不同级别的纳米原纤纤维素可基于三个主要特性分类：(i)尺寸分布、长度和直径，(ii)化学组成，和(iii)流变性质。要充分描述一个级别，可以并行使用这些性质。不同级别的实例包括天然(或未改性)NFC、氧化NFC(高粘度)、氧化NFC(低粘度)、羧甲基化NFC和阳离子化NFC。在这些主要级别中，还存在亚级别，例如：极佳原纤化相比于中度原纤化、高度取代相比于低度取代、低粘度相比于高粘度，等等。原纤化技术和化学预改性对原纤尺寸分布有影响。通常，非离子级别具有更宽的原纤直径(例如10-100nm，或10-50nm)，而化学改性级别则要细很多(例如2-20nm)。改性级别的分布也更窄。某些改性(尤其是TEMPO-氧化)会产生更短的原纤。

根据原料来源不同，例如硬木(HW)和软木(SW)浆料，最终纳米原纤纤维素产品中存在不同的多糖组成。通常，从漂白的桦木浆料制备非离子级别，会产生高含量的二甲苯(25重量％)。从HW或SW浆料制备改性级别。在这些改性级别中，半纤维素与纤维素域一起被改性。最可能地，该改性是不均匀的，即，一些部分相比其它部分改性程度更高。因此，不可能进行详细的化学分析——改性产物通常是不同多糖结构的复杂混合物。

在水性环境中，纤维素纳米纤维的分散体形成粘弹性水凝胶网络。该凝胶由分散和水合的缠结原纤在相对低浓度(例如0.05至0.2％(w/w))下形成。NFC水凝胶的粘弹性可用例如动态振动流变学测量来表征。

纳米原纤纤维素水凝胶呈现出特征性的流变性质。例如，纳米原纤纤维素水凝胶是剪切稀化或假塑性材料，这意味着其粘度取决于使材料变形的速度(或作用力)。当在旋转流变仪中测量粘度时，观察到以下剪切稀化特性：随着剪切速率增加而粘度降低。水凝胶显示出塑性，这意味着在材料开始容易流动之前需要一定的剪切应力(作用力)。该临界剪切应力经常被称作屈服应力。屈服应力可由用应力控制的流变仪测定的稳态流动曲线确定。当将所述粘度绘制为所施加的剪切应力的函数时，可看到在超过临界剪切应力后粘度急剧下降。零剪切粘度和屈服应力是描述材料悬浮能力的最重要流变参数。这两个参数能够非常清楚地区分不同的级别，从而能对级别进行分类。

原纤或原纤束的尺寸取决于原料和崩解方法。可采用任何合适的设备，如精制机、研磨机、分散器、均质机、磨碎机(colloider)、摩擦研磨机、销棒粉碎机(pin mill)、转子-转子解胶机、超声波破碎器、流化器(如微流化器、大流化器(macrofluidizer)或流化器型均质机)来对纤维素原料进行机械崩解。在存在足够的水以防止纤维间形成键的条件下进行崩解处理。

在一个实例中，通过使用具有至少一个转子、桨叶或类似移动机械单元的分散器进行崩解，所述分散器例如是具有至少两个转子的转子-转子解胶机(rotor-rotordispergator)。在分散器中，当桨叶以由半径(到转轴的距离)确定的圆周速度和旋转速度以相反方向旋转时，分散体中的纤维材料被转子的桨叶或拱肋从相反方向反复撞击。由于纤维材料在径向上向外转移，其撞在一个接着一个以高圆周速度从相反方向过来的桨叶(即拱肋)的宽表面上；换而言之，其受到来自相反方向的几次连续冲击。同样，在桨叶的宽表面(即拱肋)的边缘处(其边缘与下一个转子桨叶的相对边缘形成桨叶间隙)，出现剪切力，其有助于纤维的崩解并使原纤脱离。撞击频率取决于转子的旋转速度、转子的数量、各转子中桨叶的数量和分散体通过装置的流速。

在转子-转子解胶机中，纤维材料通过反向旋转的转子被引入，并且按照以下方式沿着相对于转子转轴的径向方向向外移动并籍此而同时发生原纤化：所述材料反复受到由不同的反向旋转转子引起的剪切和撞击力。转子-转子解胶机的一个实例是Atrex装置。

适于崩解的设备的另一实例是销棒粉碎机，例如多重外周销棒粉碎机。该设备的一个实例如US 6202946 B1所述，其包括外壳，且在所述外壳内具有装配有碰撞表面的第一转子；与第一转子同心并装配有碰撞表面的第二转子，该第二转子被设置为以与第一转子相反的方向旋转；或与第一转子同心并装配有碰撞表面的定子。该设备包括位于外壳中的进料孔并向转子或转子和定子的中央开口，和外壳壁上的出料孔并向最外部转子或定子的外周开口。

在一个实施方式中，崩解通过使用均质机进行。在均质机中，纤维材料在压力的作用下均质化。纤维材料分散体均质化成纳米原纤纤维素是由分散体的强制通流引起的，这使得材料崩解为原纤。纤维材料分散体在给定的压力下通过窄通流间隙，其中，分散体线性速度的增加使分散体受到剪切力和撞击力，导致从纤维材料中移去原纤。纤维片段在原纤化步骤中崩解为原纤。

在本文中，术语"原纤化"一般指通过向颗粒作功(work)来机械崩解纤维材料，其中纤维素原纤从纤维或纤维片段中脱离。该功可基于各种作用，例如研磨、碾碎或剪切、或它们的组合，或者能够减小颗粒尺寸的其它相应的作用。精制的功所消耗的能量通常以能量/(处理的原料量)表示，单位例如是千瓦时/千克(kWh/kg)，兆瓦时/吨，或者与这些单位成比例的单位。表述“崩解”或“崩解处理”可与“原纤化”互换使用。

经历原纤化的纤维材料分散体是纤维材料和水的混合物，在本文中也被称为“浆料(pulp)”。纤维材料分散体一般可指整个纤维、从中分离的部分(片段)、原纤束或与水混合的原纤，并且一般地，水性纤维材料分散体是这类元素的混合物，其中组分之间的比例取决于加工程度或处理阶段，例如同一批次纤维材料在处理过程中的运行次数或“通过”次数。

表征纳米原纤纤维素的一种方式是使用含有所述纳米原纤纤维素的水溶液的粘度。粘度可以是例如布氏粘度或零剪切粘度。如本文所述，比粘度区分纳米原纤纤维素与非纳米原纤纤维素。

在一个实例中，用布氏粘度计(布氏粘度)或者其它对应设备来测量纳米原纤纤维素的表观粘度。合适地使用桨式转子(vane spindle)(73号)。有几种市售的布氏粘度计可用于测量表观粘度，它们都基于相同的原理。合适地，在设备中使用RVDV弹簧(RVDVspring)(布氏RVDV-III)。用水将纳米原纤纤维素的样品稀释至0.8重量％的浓度，并混合10分钟。稀释的样品物质添加到250mL烧杯中，将温度调节至20℃±1℃，如果需要的话进行加热，并混合。使用10rpm的低转速。

在该方法中作为原料提供的纳米原纤纤维素可以通过其在水溶液中提供的粘度来表征。粘度描述了例如纳米原纤纤维素的原纤化程度。在一个实施方式中，纳米原纤纤维素在分散于水中时提供在0.8％(w/w)的稠度和10rpm下测得的至少2000mPa·s，例如至少3000mPa·s的布氏粘度。在一个实施方式中，纳米原纤纤维素在分散于水中时提供在0.8％(w/w)的稠度和10rpm下测得的至少10000mPa·s的布氏粘度。在一个实施方式中，纳米原纤纤维素在分散于水中时提供在0.8％(w/w)的稠度和10rpm下测得的至少15000mPa·s的布氏粘度。所述纳米原纤纤维素在分散于水中时在0.8％(w/w)的稠度和10rpm下测得的布氏粘度范围的实例包括2000–20000mPa·s、3000–20000mPa·s、10000–20000mPa·s、15000–20000mPa·s、2000–25000mPa·s、3000–25000mPa·s、10000–25000mPa·s、15000–25000mPa·s、2000–30000mPa·s、3000–30000mPa·s、10000–30000mPa·s和15000–30000mPa·s。

在一个实施方式中，纳米原纤纤维素包含未改性的纳米原纤纤维素。在一个实施方式中，纳米原纤纤维素是未改性的纳米原纤纤维素。发现未改性的纳米原纤纤维素的排液明显比例如阴离子级别更快。未改性的纳米原纤纤维素通常具有在0.8％(w/w)的稠度和10rpm下测得的2000–10000mPa·s范围内的布氏粘度。

崩解的纤维状纤维素原料可以是改性的纤维状原料。改性的纤维状原料是指纤维受处理影响的原料，从而纤维素纳米原纤更易于从纤维上脱离。通常对液体中悬浮物(即浆料)形式存在的纤维状纤维素原料进行改性。

对纤维的改性处理可以是化学或物理性的。在化学改性中，纤维素分子的化学结构通过化学反应(纤维素的“衍生化”)改变，优选使得纤维素分子的长度不受影响但将官能团添加至聚合物的β-D-吡喃葡萄糖单元。纤维素的化学改性在某一转化度发生，该转化度取决于反应物的剂量和反应条件，原则上化学改性是不完全的，以使得纤维素将作为原纤保持固体形式并不溶于水。在物理改性中，阴离子型、阳离子型或非离子型物质或其任意组合物理吸附在纤维素表面上。改性处理也可以是使用酶的。

特别地，在改性之后纤维中的纤维素可以是带离子电荷的，这是因为纤维素的离子电荷减弱了纤维的内部键，之后会有助于崩解至纳米原纤纤维素。可以通过纤维素的化学改性或物理改性实现离子电荷。与起始原料相比，改性之后的纤维可具有较高的阴离子或阳离子电荷。最普遍使用的用于制备阴离子电荷的化学改性方法是氧化(其中羟基被氧化为醛和羧基)、磺化以及羧甲基化。进而，可以通过使得阳离子基团(例如季铵基团)连接至纤维素来进行阳离子化，从而以化学方式产生阳离子电荷。

在一个实施方式中，纳米原纤纤维素包含化学改性的纳米原纤纤维素，例如阴离子改性的纳米原纤纤维素或阳离子改性的纳米原纤纤维素。在一个实施方式中，纳米原纤纤维素是阴离子改性的纳米原纤纤维素。在一个实施方式中，纳米原纤纤维素是阳离子改性的纳米原纤纤维素。在一个实施方式中，阴离子改性的纳米原纤纤维素是氧化的纳米原纤纤维素。在一个实施方式中，阴离子改性的纳米原纤纤维素是磺化的纳米原纤纤维素。在一个实施方式中，阴离子改性的纳米原纤纤维素是羧甲基化的纳米原纤纤维素。化学改性的纳米原纤纤维素可以用于影响某些活性剂的释放曲线。例如，阴离子级别可以用于释放带阳离子电荷的分子以获得延长的释放速率，反之亦可。

纤维素可以被氧化。在纤维素的氧化中，纤维素的伯羟基通过杂环硝酰基化合物(例如2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧基自由基，通常称为“TEMPO”)进行催化氧化。纤维素β-D-吡喃葡萄糖单元的伯羟基(C6-羟基)被选择性地氧化为羧酸基团。还由伯羟基形成一些醛基。关于这一发现，即低氧化程度不能实现足够有效的原纤化而较高的氧化程度造成机械破坏处理之后的纤维素降解，纤维素可以氧化成在氧化的纤维素中通过电导滴定测定的羧酸含量水平为0.6–1.4mmol COOH/g浆料，或0.8-1.2mmol COOH/g浆料，优选为1.0-1.2mmolCOOH/g浆料。当由此得到的氧化的纤维素的纤维在水中崩解时，它们提供个体化纤维素原纤的稳定透明分散体，该个体化纤维素原纤的宽度可以例如为3-5nm。当氧化的浆料作为起始培养基时，可以得到在0.8％(w/w)稠度下测得的布氏粘度至少为10000mPa·s、例如在10000–30000mPa·s范围内的纳米原纤纤维素。

在本发明中无论何时提及催化剂“TEMPO”，很明显所有涉及“TEMPO”的测量和操作都等同地或者类似地适用于TEMPO的任意衍生物或者任意能够选择性催化纤维素中C6碳的羟基基团的氧化的杂环硝酰基自由基。

在一个实施方式中，这些化学改性的纳米原纤纤维素在分散于水中时提供在0.8％(w/w)的稠度和10rpm下测得的至少10000mPa·s的布氏粘度。在一个实施方式中，这些化学改性的纳米原纤纤维素在分散于水中时提供在0.8％(w/w)的稠度和10rpm下测得的至少15000mPa·s的布氏粘度。在一个实施方式中，这些化学改性的纳米原纤纤维素在分散于水中时提供在0.8％(w/w)的稠度和10rpm下测得的至少18000mPa·s的布氏粘度。所用的阴离子纳米原纤纤维素的例子的布氏粘度在13000–15000mPa·s或18000–20000mPa·s范围内，或甚至最高达25000mPa·s，这取决于原纤化的程度。

在一个实施方式中，纳米原纤纤维素是TEMPO氧化的纳米原纤纤维素。该材料在低浓度下提供高粘度，例如在0.8％(w/w)稠度和10rpm下测得的至少20000mPa·s、甚至至少25000mPa·s的布氏粘度。在一个实例中，TEMPO氧化的纳米原纤纤维素在0.8％(w/w)稠度和10rpm下测得的布氏粘度在20000–30000mPa·s的范围内，例如25000–30000mPa·s。

在一个实施方式中，纳米原纤纤维素包含未化学改性的纳米原纤纤维素。在一个实施方式中，这种未化学改性的纳米原纤纤维素在分散于水中时提供在0.8％(w/w)的稠度和10rpm下测得的至少2000mPa·s，或至少3000mPa·s的布氏粘度。

纳米原纤纤维素还可以通过平均直径(或宽度)或平均直径与粘度一起来表征，所述粘度例如是布氏粘度或零剪切粘度。在一个实施方式中，所述纳米原纤纤维素的原纤数均直径范围为1-100nm。在一个实施方式中，所述纳米原纤纤维素的原纤数均直径范围为1-50nm，例如5–30nm。在一个实施方式中，所述纳米原纤纤维素的原纤数均直径范围为2-15nm，例如TEMPO氧化的纳米原纤纤维素。

可用多种技术(例如通过显微镜)测定原纤的直径。可通过对场致发射扫描电子显微镜(FE-SEM)、透射电子显微镜(TEM)(例如低温透射电子显微镜(cryo-TEM))或原子力显微镜(AFM)获得的图像进行图像分析来测量原纤厚度和宽度分布。通常，AFM和TEM最合适具有窄原纤直径分布的纳米原纤纤维素级别。

在一实例中，在22℃，用装配有窄间隙叶片几何结构(直径28mm，长度42mm)的应力受控的旋转流变仪(AR-G2，英国TA仪器公司(TA Instruments,UK))，在直径为30mm的圆筒形样品杯中对纳米原纤纤维素分散体的流变粘度进行测量。在将样品装载到流变仪之后，使它们静止5分钟，之后开始测量。用逐渐增加的剪切应力(其与施加的扭矩成比例)来测量稳态粘度，并测量剪切速率(其与角速度成比例)。在达到恒定剪切速率之后或者在2分钟的最大时间之后，记录某一剪切应力下的报道粘度(＝剪切应力/剪切速率)。当超过1000s^-1的剪切速率时，停止测量。该方法可用于测定零剪切粘度。

在一个实例中，纳米原纤纤维素当分散在水中时提供在1000–100000Pa·s范围内、例如在5000–50000Pa·s范围内的零剪切粘度(在小剪切应力下恒定粘度的“平台”)，和在1–50Pa范围内、例如在3–15Pa范围内的屈服应力(开始剪切稀化时的剪切应力)，这些测量结果是通过旋转流变仪在稠度为0.5重量％(w/w)的条件下在水性介质中测定的。

浊度是通常为肉眼所不可见的个体颗粒(所有的悬浮或溶解固体)导致的流体的浑浊或模糊。有几种测量浊度的实用方式，最直接的是测量光穿过水样品柱时的衰减(即，强度的降低)。备选使用的杰克逊蜡烛法(单位：杰克逊浊度单位或JTU)本质上是反过来测量完全遮蔽穿过水柱所见的蜡烛火焰所需的水柱长度。

可以采用光学浊度测量仪器来定量测定浊度。存在一些市售用于定量测量浊度的浊度计。在本发明中，采用基于比浊法的方法。来自校准比浊计的浊度单位称作比浊法浊度单位(NTU)。用标准校准样品对测量设备(比浊计)进行校准和控制，之后对经稀释的NFC样品的浊度进行测量。

在一种浊度测量方法中，将纳米原纤纤维素样品在水中稀释至低于所述纳米原纤纤维素的胶凝点的浓度，测量稀释样品的浊度。测得纳米原纤纤维素样品的浊度的所述浓度为0.1％。采用具有50mL测量容器的HACH P2100浊度计(Turbidometer)来进行浊度测量。测定纳米原纤纤维素样品的干物质，将0.5g样品(以干物质计算)装载到测量容器中，其用自来水填充至500g，并通过振荡剧烈混合约30秒。立即将水性混合物分入5个测量容器中，将它们插入浊度计中。对每个容器进行3次测量。从所获得的结果计算平均值和标准偏差，最终结果单位为NTU单位。

表征纳米原纤纤维素的一种方式是既限定粘度又限定浊度。低浊度表示原纤的小尺寸，例如小直径，因为小原纤对光的散射很差。一般而言，随着原纤化程度增加，粘度增加并且同时浊度降低。然而，这发生在某个点之前。当继续进行原纤化时，原纤最终开始破裂并且不能再形成牢固的网络。因此，在此点之后，浊度和粘度都开始下降。

在一个实例中，阴离子纳米原纤纤维素的浊度低于90NTU，例如3-90NTU，如5-60NTU，例如8-40NTU，这些数值是通过比浊法在0.1％(w/w)稠度下在水性介质中测量的。在一个实例中，天然纳米原纤的浊度甚至可以高于200NTU，例如10-220NTU，诸如20-200NTU，例如50–200NTU，这些数值是通过比浊法在0.1％(w/w)稠度下在水性介质中测得。为了表征纳米原纤纤维素，可以将这些范围与纳米原纤纤维素的粘度范围合并，例如所述纳米原纤纤维素在分散于水中时提供在0.8％(w/w)的稠度和10rpm下测量的至少2000mPa·s，至少3000mPa·s，至少5000mPa·s、例如至少10000mPa·s，例如至少15000mPa·s的布氏粘度。

用于制备方法的原料通常是直接由上述一些纤维原料的崩解得到的纳米原纤纤维素，它们由于崩解条件以较低浓度均匀地分布在水中。原料可以是浓度为0.2-10％的水性凝胶。

在一个实施方式中，在冷冻干燥前，水凝胶中的纳米原纤纤维素浓度范围可以是10％(w/w)或更低，或者低于10％(w/w)，例如，0.1–10％(w/w)，0.1-5％(w/w)，0.1-2％(w/w)或0.1–1.0％(w/w)。用于细胞培养应用的优选范围为0.1-2％(w/w)，0.1-1％(w/w)或0.5-1％(w/w)。相对于低于0.5％(w/w)的浓度，许多细胞不能在3D培养物中生长为球状体。另一方面，1.0％(w/w)或更高的浓度对于许多细胞而言太高。在由冷冻干燥的凝胶冷冻干燥后，可以重建相同浓度的水凝胶。更特别地，干燥的凝胶可再分散于水中，并且当再分散在水中时，例如，在0.1-10％(w/w)的分散体浓度下，将会提供等于或基本上等于其在相同的分散体浓度下具有的最初粘度曲线的粘度曲线。

冷冻保护剂和冻干保护剂

冷冻保护剂(也可称为赋形剂或冷冻保护试剂)通常有助于在冷冻期间保存蛋白质、脂质体双层和其它物质的结构。冻干保护剂使得这些物质在干燥过程、尤其是冷冻干燥过程中稳定。在冷冻干燥中，冻干保护剂也可以被认为是冷冻保护剂，因此如本文所用的术语“冷冻保护剂”也可以包括冻干保护剂。通常认为保护性添加剂具有两种类型：(i)无定形玻璃形式(amorphous glass forming)，和(ii)共晶结晶盐。冻干保护剂的实例包括多羟基化合物(例如，作为天然的冻干保护剂的糖(单糖、二糖和多糖)、海藻糖和蔗糖)，以及多元醇(例如，甘油)，以及它们的衍生物。这两组属于类型(i)。然而，不是所有的冷冻保护剂都是作为冻干保护剂的合适化合物。例如，在细胞的冷冻保护中，DMSO通常用作冷冻保护剂，最高达5％(v/v)。然而，由于其是有机溶剂，其在冷冻干燥中的使用由于蒸发而受限，因为其在溶液中的凝固点相对较高。因此，在本发明方法中使用DMSO作为冷冻保护剂是不期望的。

在一个实施方式中，所述方法包括：提供一种或多种冷冻保护剂和/或冻干保护剂。在一个实施方式中，所述方法包括：提供至少一种冻干保护剂，优选作为纳米原纤纤维素水凝胶以外的步骤。在一个实施方式中，所述方法包括：提供至少一种冷冻保护剂和冻干保护剂，所述冷冻保护剂和冻干保护剂可以是相同的试剂(例如海藻糖或PEG)或不同的试剂。一组冷冻保护剂包括含有至少两个羟基的醇，例如二醇，例如乙二醇，丙二醇和甘油。发现用于细胞的可用冷冻保护剂包括海藻糖、甘油和聚乙二醇(PEG)。在一个实施方式中，一种或多种冷冻保护剂和/或冻干保护剂选自：海藻糖、甘油和聚乙二醇。在一个实施方式中，冷冻保护剂和/或冻干保护剂包括海藻糖。在一个实施方式中，冷冻保护剂和/或冻干保护剂包括海藻糖和甘油。发现该组合在NFC水凝胶基质中为细胞提供了特别良好的冷冻保护和冻干保护。在一个实施方式中，冷冻保护剂和/或冻干保护剂包括海藻糖和聚乙二醇。在一个实施方式中，冷冻保护剂和/或冻干保护剂包括甘油和聚乙二醇。在一个实施方式中，冷冻保护剂和/或冻干保护剂包括海藻糖、甘油和聚乙二醇。

海藻糖(也称为α,α-海藻糖；α-D-吡喃葡萄糖基-(1→1)-α-D-g吡喃葡糖苷，海藻糖(mycose)或海藻糖(tremalose))是通过在两个α-葡萄糖单元之间的α,α-1,1-葡糖苷键所形成的天然α-连接的二糖。海藻糖在营养上与葡萄糖相当，因为它通过海藻糖酶迅速分解成葡萄糖。海藻糖可以以无水或二水合物的形式存在。在一个实施方式中，海藻糖是D(+)-脱水海藻糖(trehalose dehydrate)，其与纳米原纤纤维素相容。在一实例中，海藻糖是D-(+)-脱水海藻糖。它可以以固体形式提供或溶解在水性介质(例如水)中。发现海藻糖在纳米原纤纤维素水凝胶中用作细胞的冷冻保护剂和冻干保护剂(lyoprotectiveagent)。

甘油是简单的多元醇化合物。其是甜味和无毒性的无色、无味的粘性液体。在称为甘油三酯的所有脂质中发现了甘油骨架。甘油具有三个羟基，这是其在水中的溶解度和吸湿性的原因。发现甘油在纳米原纤纤维素水凝胶中主要用作细胞的冷冻保护剂。

聚乙二醇(PEG)是聚醚化合物，取决于其分子量，也称为聚环氧乙烷(PEO)或聚氧乙烯(POE)。PEG的结构通常写作H-(O-CH₂-CH₂)_n-OH。通常，聚乙二醇通过环氧乙烷的聚合来制备，并且可市售购得300g/mol至10000000g/mol的宽范围分子量。聚乙二醇是水溶性的，并且其具有低毒性。发现聚乙二醇在纳米原纤纤维素水凝胶中用作细胞的冷冻保护剂和冻干保护剂。

在一个实施方式中，聚乙二醇的分子量范围为100–10000kDa，例如1000–10000kDa。在一个实施方式中，聚乙二醇的分子量范围为3000-8000kDa，例如5000-7000kDa，如约6000kDa。本公开中所用的“分子量”可以是指数均分子量。通常，聚合物的数均分子量可以通过如下方法测定：例如凝胶渗透色谱法，由[马克-豪威克(Mark-Houwink)方程]的粘度测定法，依数性方法，如蒸气压渗透压测定法，端基测定法或质子NMR。

制备冷冻干燥产品

所述方法包括：提供成分纳米原纤纤维素、细胞、和所需的冷冻保护剂和/或冻干保护剂，其通常为水性悬浮液或水凝胶。在一个实施方式中，纳米原纤纤维素是在水性悬浮液或水凝胶中的唯一纤维素材料。在一个实施方式中，纳米原纤纤维素是在水性悬浮液或水凝胶中的唯一聚合物凝胶形成材料。在一实例中，水性悬浮液或水凝胶包含一定量的其它纤维状材料(例如，非纳米原纤纤维素)，例如所述量为纤维状材料干水凝胶的量。

所述方法包括：提供包含纳米原纤纤维素的水凝胶。水凝胶中的纳米原纤纤维素浓度范围可以是0.1–10％(w/w)，0.1–10％(w/w)，0.1-5％(w/w)，0.1-2％(w/w)或0.1–1.0％(w/w)。用于细胞培养应用的优选范围为0.1-2％(w/w)，0.1-1％(w/w)或0.5-1％(w/w)。

细胞与含有纳米原纤纤维素的水凝胶结合以形成细胞体系。细胞可以在细胞体系中进行培养。在一实例中，细胞与含有纳米原纤纤维素的水凝胶结合以形成细胞培养物。提供一种合适的细胞培养基。

与细胞一起使用的本文所用的“细胞培养基”、“培养基”、“介质”是指与适合与细胞相容的任何合适的培养基。该培养基通常是液体水溶液，并且含有辅助剂，如营养物质、盐、维生素和/或其它试剂，如激素、生长因子等。可以包括血液血清或合成血清。培养基可用于培养细胞、使得细胞悬浮和/或使干燥的凝胶/细胞再水化。优选地，培养基不含钙或镁。

所述方法包括：例如，在培养基中提供一种或多种冷冻保护剂，例如一种或多种冷冻保护剂和/或冻干保护剂，并且将所述一种或多种冷冻保护剂添加到细胞体系或细胞培养物。例如，细胞培养基可以改变成含有一种或多种冷冻保护剂和/或冻干保护剂的培养基。含有纳米原纤纤维素的水凝胶细胞培养基可以提供为含有一种或多种冷冻保护剂和/或冻干保护剂，例如至少含有海藻糖。

在一个实例中，冷冻保护剂和/或冻干保护剂包括海藻糖和甘油，其中，培养基中海藻糖的浓度范围可以为0.2-0.5％(w/w)，并且培养基中甘油的浓度范围为0.5-1.5％(w/w)，例如，约0.3％(w/w)的海藻糖和1％(w/w)的甘油。凝胶浓度范围可以是0.3-1.0％(w/w)，例如，0.3-0.5％(w/w)。

在甘油和海藻糖作为冷冻保护剂和/或冻干保护剂的情况下，凝胶中的干纳米原纤纤维素与冷冻保护剂(以重量计的NFC:甘油:海藻糖)的比例可以是例如约9.5:3:1至20:3:1。在一些实例中，凝胶中干纳米原纤纤维素与冷冻保护剂(NFC:甘油:海藻糖)以重量计的比例为5–40:2–6:1，9–22:2-6:1，或9.5–20:2–5:1，或9–22:2–4:1，或9.5–20:2–4:1，例如，约10:5:1或约10:5:1，约15:5:1，约10:3:1，约15:3:1或约20:3:1。

作为替代或者附加方式，可以将一种或多种冷冻保护剂和/或冻干保护剂添加到细胞培养的细胞培养基。前文中所述的浓度是在培养基中获得的浓度。在一个实例中，首先培养基中包含海藻糖，并且在添加其它冷冻保护剂之前用海藻糖对细胞进行一段时间的孵育，例如孵育约12-24小时，例如，用20-100mM的海藻糖培养基进行孵育。

所得混合物、凝胶、细胞体系、胞外囊泡体系或细胞培养物是可冷冻干燥的，即，冷冻干燥过程对干燥的纳米原纤凝胶、囊泡和细胞的物理性质没有显著影响。混合物也可以称为可冷冻干燥的水凝胶。该物理性质的一个实例是由水凝胶释放试剂的曲线，例如小分子或大分子，如一种或多种治疗剂。发现具有不同分子量的不同分子(包括相对小的有机分子以及较大的蛋白质)可以类似释放曲线从水凝胶控释。可用的分子量范围非常宽，例如在测试中，可以控释分子量在约170-70000g/mol(道尔顿)范围内的分子。然而，具有高分子量的分子比具有较低分子量的分子释放得慢。细胞的该物理性质的一个实例是细胞的完整性，例如，细胞膜、细胞器，微囊泡和/或细胞的其它部分。细胞的该物理性质的另一个实例是细胞集落的三维形式。

在一个实施方式中，所述方法包括：提供一种或多种治疗剂或其它活性剂，并且混合治疗剂与水凝胶、任选的冷冻保护剂和/或冻干保护剂、以及/或者细胞，例如，将一种或多种试剂加入培养基中。可以在添加冷冻保护剂的同时添加一种或多种试剂，或者可以在此之前或之后添加一种或多种试剂。类似地，提供任意其它添加剂，并且使其与水凝胶或培养基混合，例如，化学品、营养物质、细胞培养剂等。

在获得细胞体系或囊泡体系之后进行冷冻干燥以获得干燥的含有纳米原纤纤维素的水凝胶(特别是气凝胶)。可以使用任意合适的冷冻干燥方法。冷冻干燥(也可称为冻干)是一种使用快速冷却以在体系内产生热力学不稳定性并导致相分离的方法。然后通过在真空下升华来去除溶剂，在其先前占据的区域中留下空隙。升华是指物质直接从固体转变为气相而不经过中间液相。升华是在其相图中低于物质三相点的温度和压力下发生的吸热相变。

在一个实施方式中，冷冻干燥包括首先将细胞体系的温度降至至少-30℃，例如至少-40℃，例如-30–-100℃，或降低至-40–-100℃，或者甚至降低至-200℃或更低，例如，当使用液氮时；然后施加降低的压力以从细胞体系中去除水。通常，应当在施加降低的压力时对细胞体系进行冷冻。在一个实施方式中，在施加降低的压力期间和施加最低压力之后，温度升高，例如温度升高至约-20℃或甚至升至约10℃。可以在施加降低的压力之前升高温度，或者可以在施加降低的压力期间升高温度。

在一实例中，冷冻干燥通过用液氮对细胞体系进行冷冻来实施。例如，将含有细胞体系的小瓶浸入液氮中直至细胞体系冷冻。在测试中产生更好玻璃化的另一实例中，将细胞直接移液到液氮中。此后，向细胞体系施加降低的压力以从细胞体系去除水。降低的压力可以指获得水升华所需的真空。由于水的升华发生在三相点之下，所需的真空压力取决于所用的温度。使用相同的过程可以冷冻干燥囊泡体系。

如本文所用，“干燥”通常是指脱水，这些术语可互换使用，其中，从水凝胶中去除水以获得干燥或脱水的水凝胶。在一个实施方式中，继续冷冻干燥直至水凝胶具有所需的含水量或冷冻干燥持续至最小含水量，所述最小含水量优选低于20％，或更优选低于10％，或甚至低于5％，例如，含水量为1-20％、2-20％或2-10％(w/w)。在一个实施方式中，持续冷冻干燥，直至水凝胶的含水量范围为1-8％，2-8％，2-6％，2-5％或1-5％(w/w)。通常，获得低于2％的含水量可能具有挑战性。在获得低含水量之后，可以在真空或保护气体中将干燥的产品包装成包。这将会防止干燥的水凝胶吸收环境水气，吸收环境水气可能使得含水量范围升高至例如4-8％或5-7％(w/w)。含水量也可以称为水含量。所获得的干燥的水凝胶可以通过添加水性液体(例如培养基)并使得干燥的产品悬浮而再凝胶化。获得再凝胶化或重新悬浮的水凝胶，其可具有与干燥前相同的浓度和水含量。该水凝胶提供了与干燥前的原始水凝胶的特性基本相同的特性。

用本文公开的实施方式的冷冻干燥方法获得了包含纳米原纤纤维素的冷冻干燥的最终水凝胶，更特别是冷冻干燥的气凝胶，所述纳米原纤纤维素包含细胞。冷冻干燥的气凝胶可以存储于密封包装或容器中。可以提供惰性气体，例如，氩气。冷冻干燥的产品可以在较低的温度下储存，例如在冰箱中，例如在0-10℃，例如在约+4℃，或甚至在室温下储存。

一个实施方式提供包含纳米原纤纤维素、细胞和一种或多种冷冻保护剂和/或冻干保护剂的冷冻干燥气凝胶，其中，水凝胶的含水量为10％(w/w)或更低，优选2-10％(w/w)，例如2–8％(w/w)，如前文所述。冷冻干燥的气凝胶还可以包含一种或多种治疗剂和其它活性剂，或如本文所讨论的其它试剂。实际上，这样的产品不再是凝胶形式的，在纳米原纤纤维素的情况下，其含水量通常超过80％(w/w)，或者超过90％(w/w)，甚至超过95％(w/w)。冷冻干燥的(纳米原纤纤维素)气凝胶因此可以称为冷冻干燥的纳米原纤纤维素。

一个实施方式提供了冷冻干燥的包含纳米原纤纤维素的气凝胶，其中，冷冻干燥的气凝胶中的细胞含量范围为0.1–65％(w/w)，例如，0.1–50％(w/w)，例如1–25％(w/w)，或1–20％(w/w)，1–10％(w/w)，1–5％(w/w)，或20–65％(w/w)，10–65％(w/w)，5–65％(w/w)，10–50％(w/w)，5–50％(w/w)，5–25％(w/w)，5–20％(w/w)，或5–15％(w/w)。

一个实施方式提供了冷冻干燥的包含纳米原纤纤维素的气凝胶，其中，冷冻干燥的气凝胶中的胞外囊泡含量范围为0.1–65％(w/w)，例如，0.1–50％(w/w)，例如1–25％(w/w)，或1–20％(w/w)，1–10％(w/w)，1–5％(w/w)，或20–65％(w/w)，10–65％(w/w)，5–65％(w/w)，10–50％(w/w)，5–50％(w/w)，5–25％(w/w)，5–20％(w/w)，或5–15％(w/w)。

一个实施方式提供了冷冻干燥的气凝胶，其中，冷冻干燥的气凝胶中的一种或多种治疗剂或其它或活性剂或其它化学品的含量范围为0.1–65％(w/w)，例如，0.1–50％(w/w)，例如1–25％(w/w)，或1–20％(w/w)，1–10％(w/w)，1–5％(w/w)，或20–65％(w/w)，10–65％(w/w)，5–65％(w/w)，10–50％(w/w)，5–50％(w/w)，5–25％(w/w)，5–20％(w/w)，或5–15％(w/w)。

在一个实施方式中，干燥的水凝胶中甘油的含量范围为1–10％(w/w)，例如，5-10％(w/w)。在一个实施方式中，干燥的水凝胶中海藻糖的含量范围为0.5-8％(w/w)，例如，3-4％(w/w)。在一个实施方式中，干燥的水凝胶中聚乙二醇的含量范围为1–10％(w/w)，例如，5-10％(w/w)。还可以使用这些冷冻保护剂和范围的组合。

在一个实施方式中，在干燥的水凝胶中，甘油含量的范围为1-10％(w/w)，并且/或者海藻糖含量的范围为0.5-8％(w/w)。在一个实施方式中，在干燥的水凝胶中，甘油含量的范围为5-10％(w/w)，并且/或者海藻糖含量的范围为3-4％(w/w)。

在一个实施方式中，在干燥的水凝胶中，聚乙二醇含量范围为1-10％(w/w)，并且/或者海藻糖的含量范围为0.5-8％(w/w)。在一个实施方式中，在干燥的水凝胶中，聚乙二醇含量范围为5-10％(w/w)，并且/或者海藻糖的含量范围为3-4％(w/w)。

干燥的水凝胶可以以通常适合于所需目的片材、块材或其它形状或形式提供，然后可事先再润湿或再水化。干燥的水凝胶也可以粉末或其它粉碎的形式提供。在该情况下，制备产品的方法可以包括形成粉末的步骤，例如通过对冷冻干燥的产品进行研磨或粉碎。

所获得的水凝胶在干燥之前或之后、更具体地在再凝胶化之后可以用于各种应用，例如本文所述的那些，如用于提供、储存和/或培养细胞。例如，可以提供水凝胶作为医疗或科学产品。

再水化或再胶凝化可以通过提供水性再水化液体来进行，所述水性再水化液体可以含有其它试剂，优选经灭菌的液体。在一实例中，再水化液体包含细胞培养基，或者再水化液体是细胞培养基。可以温热的形式提供再水化液体，例如加热至30-40℃的温度，例如约37℃。在任意进一步动作之前，可以使干燥的含有细胞的水凝胶与液体接触，并孵育一段时间，例如，10-60分钟。

实验部分

细胞活力试验

没有简单的体外试验能够在冷冻后预测体内细胞功能。细胞活力测定必须专门针对在特定环境下受损的各体系的组分。表1显示出细胞活力追踪的主要部分。从这些部分中，为这项研究的实验部分选择了六个因素。

表1.活力试验的分类。选择突出显示的方法作为该研究的实验部分的分析手段。

I.物理完整性

1.总体(i)外观

(ii)物理性质

2.微观(i)光学显微镜

(ii)电子显微镜

(iii)CryoEM

II.代谢活性

1.代谢物(metabolite)的摄取

2.分解代谢物(catabolite)的产生

3.不稳定的代谢物

4.酶反应(i)细胞内

(ii)膜转运

III.机械活动

1.运动性

2.吞噬作用

3.收缩

4.附着

5.聚集

IV.有丝分裂活性

1.有丝分裂指数

2.DNA合成

3.“镀覆(plating)”测试

4.生长和发育(i)组织培养

(ii)胚胎

V.完整的体内功能

1.受精和发育

2.移植(i)细胞

(ii)组织

(iii)血管化器官

通常在实验的各步骤用光学纤维镜单元观察细胞的总体外观。也可使用CryoEM对潮湿细胞培养进行成像，然而，由于用SEM成像，样品在该过程中被损耗。

细胞的代谢活动可以用

细胞活力试验(其是无毒、稳定的水溶性染料)进行定量。

试剂的活性成分是刃天青，其颜色为蓝色，是几乎非荧光的。它是一种可透过细胞的化合物，内部的细胞被还原为试卤灵，这是一种颜色为红色且高荧光的化合物。该还原使得细胞周围培养基的整体红色和荧光增加。因此，可以连续监测细胞并测量荧光的增加与时间的关系。因此，认为

试验优于需要杀死细胞的其它几种细胞活力试验，例如细胞氧化还原酶活性测量MTT试验(溴化3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓盐，黄色四唑)。

的活性化合物是刃天青，其颜色为靛蓝色，当添加到细胞培养样品中时其将通过主动摄入进入细胞胞液。线粒体酶活性通过接受来自NADH(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的还原形式)的电子将其转化为试卤灵，如图8所示。除了NADH之外，还通过接受来自如下电子来转化试卤灵：烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)、黄素腺嘌呤二核苷酸的对苯二酚形式(FADH)，黄素单核苷酸的还原形式(FMNH)和细胞色素。氧化还原反应使得培养基的颜色变为荧光粉色，并且该变化可以目视观察到，但更重要的是，其可以通过荧光读数精确测量。

还可以实施

试验来直接测量

中3D细胞球状体培养物的活力。在该研究中，其使用由康宁公司(Corning Inc.)制造的超低附着96孔板来培养水凝胶-细胞体系，然后使用英杰公司(Invitrogen)的

细胞活力试剂作为培养基和水凝胶的共同体积的1/10。作为对照样品，其使用水凝胶体系而不含细胞。

评估细胞活力的另一种更简单的方法是细胞附着。当采用正确的环境时，许多细胞系会使其自身附着到体外的合适表面，例如，聚丙烯或玻璃。细胞通过排泄能够粘附在粗糙表面上的ECM蛋白(如纤连蛋白、胶原蛋白和层连蛋白)来实现这一点。显然，死细胞不会排泄这些蛋白质，因此不会主动将其自身附着在这些表面上。单个细胞通常经历凋亡而不是自身附着，但在癌细胞系的情况下，该功能已失效。因此，可以推导出细胞附着可以用作在相容表面上的癌细胞系活力测定。

评估细胞膜完整性的一种方法是与细胞核染色结合的酶活性试验。钙黄绿素AM(乙酰氧基甲基)酯和碘化丙啶鎓适用于不同微生物的活力评估。钙黄绿素AM本身是一种非荧光和细胞膜可渗透的分子，但在胞液中如果有正确的酶时则会经历酯酶反应并转化为钙黄绿素(其是一种荧光分子)。这样，可以用荧光显微镜或读板器目视观察荧光细胞。

双重染色的另一方面是碘化丙啶鎓(PI)，碘化丙啶鎓(PI)是一种非细胞膜可渗透的化合物，并且因此如果细胞膜已被破坏则其仅进入细胞溶质。因此，只有坏死细胞受到影响，而凋亡细胞和健康细胞则不受影响。一旦进入胞液，PI会与任意可获得的DNA和RNA结合，包括细胞核中的DNA。当用535nm的光激发时，可以在死细胞区域上观察到617nm的发射。

选择快速冷却作为对NFC细胞水凝胶体系进行冷冻的方法。其中NFC细胞水凝胶与液氮直接接触的步骤选择20μl的液滴尺寸。对于冷冻干燥，使用海藻糖和甘油。

选择稀释的培养基作为再水化液。选择四个因素来测定细胞活力。选择细胞附着是由于其提供活力总体情况，同时在各步骤中用光学显微镜检查细胞形态。选择试卤灵氧化作为评估NFC中球状体的线粒体活性的方法，用荧光双重细胞染色剂(fluorescent dualCellstain)通过酶活性和细胞膜完整性来确定细胞的活力。Hep G2细胞在

中培养。

水凝胶在细胞周围形成支持基质，并提供可调节的压力和诱导3D细胞体系生长的支持物。

可通过多种方式进行调节以满足不同细胞类型和当前日期(current date)的要求，已成功将

优化为六种不同类型细胞的3D细胞培养基质；HepaRG，ARPE-19，MUG-Mel2和Hep G2细胞系，以及WA07和iPS(IMR90)-4干细胞系。

材料

1.5％(批号11792)的NFC水凝胶

获自芬兰的芬欧汇川公司。大多数原纤的直径为4-10nm，长度为500-10000nm。所使用的所有其它化合物均为分析级，并且在启用前通过UV光或过滤灭菌。D-(+)-脱水海藻糖、低附着96孔inertGrade普兰德板(BRANDplates)

双染色细胞染色剂试剂盒(Cellstain double staining kit)、胎牛血清和甘油(99％)购自美国西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)。聚乙二醇(Mn 6000)购自瑞士伏路卡公司(Fluka)。青霉素-链霉素溶液(PenStrep，10000U/ml)、不含镁和钙的达氏改良型伊格尔培养基(Dulbecco′s modified eagle media，DMEM)和不含镁和钙的达氏(Dulbecco)磷酸盐缓冲盐水(DPBS)10倍浓缩物购自英国吉布可公司(Gibco)。用于玻璃化的液氮和用于保存的氩气购自芬兰的AGA工业气体公司(AGA Industrial Gases)。MycoAlert^TM支原体检测试剂盒购自瑞士隆撒公司(Lonza)。用于共焦成像的PSSensoPlate^TM96孔玻璃底板购自奥地利的葛莱娜第一生化公司(Greiner Bio-One)。灭菌的

透气密封带聚美国康宁公司(Corning)。人肝细胞癌Hep G2细胞(传代数100，ATCCHB-8065)购自美国

英杰公司(Invitrogen)的TrypLE Express和

细胞活力试剂购自赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)。使用的所有溶液均在双蒸馏超纯水中制备。

在生产

水凝胶时，使用从桦树获得的浆料作为材料。首先，对浆料进行纯化并漂白。接下来，将纤维素纤维分散在双蒸馏超纯水中并分离以形成均匀的水凝胶。最后，所获得的水凝胶通过在121℃下高压灭菌20分钟来灭菌。

方法

由Hep G2肝癌细胞系来培养3D细胞球状体

选择Hep G2癌细胞系用于实验，因为它是充分表征的并且是强细胞系，并且在之前的关于在NFC水凝胶中培养的研究中已经提供了可重复且可靠的结果。在研究期间，在使用和不使用

的情况下对细胞系进行培养，以获得对照样品，从而区分在存活率中NFC的作用。在0.8％(w/w)

中生长的3D细胞球状体显示在图1中。图像(A)、(B)和(C)显示出直径为100-120μm的典型球状体。然而，图像(D)显示出直径超过160μm的较大球状体。通常，球状体在5天内不会长到这么大的尺寸，这意味着在接种阶段存在细胞聚集物。为了避免过大的球状体，生长被限制在5天，因为一旦其到达足够大的尺寸，营养物和氧气就不能扩散到球状体的芯部。

在2D和3D培养物顶上，在细胞培养瓶(cell flask)中培养维持系(upkeep line)作为新鲜细胞的来源用于各新的2D和3D接种。维持瓶(upkeep bottle)每周两次分开传代数100至152。已经对Hep G2细胞的性质进行了研究以使得在通过ATCC的高传代数下不可改变。当将维持瓶分开进行传代时，首先用1x DPBS洗涤细胞两次，用4ml的胰酶替代物(tryple)分离并重新接种到具有11-14ml新鲜培养基的75cm²烧瓶中。该培养基含有90％(v/v)的不含钙和镁的DMEM和10％(v/v)的FBS用于生长因子。在3D接种阶段，使细胞在200RCF(相对离心力)的离心机中离心6分钟，并去除所形成的上清液。添加新鲜培养基，并将细胞与

混合以产生含有0.8％(w/w)NFC的3D细胞体系。加入等量的新鲜培养基作为单独的层以提供营养和水分。然后将细胞板在+37℃和5％CO₂的孵育器中储存4天。

细胞培养基(DMEM)含有酚红，其为培养基提供红色。图1中的样品(B)和(C)在没有培养基层的情况下进行成像(因为其玻璃化而无需培养基)，导致变得更黄的背景。

冻干保护剂的优化

选择三种冻干保护剂用

进行测试。首先，用0.8％(w/w)的

在2D或3D中定期培养细胞4天，然后更换培养基。对于一些样品，所述培养基用含有50mM海藻糖二水合物和可能的甘油或PEG 6000的培养基进行替换，而其它样品仅接受常规培养基。在第5天，通过用水凝胶层移液使培养基层混合，以形成0.4％(w/w)水凝胶。在2D细胞的情况下，细胞在冷冻之前将与三倍体(triple)分离。通过将混合物以20μl液滴的形式注入液氮中使得所有体系快速冷冻。然后，对体系进行冷冻干燥并再水化，并用双染色细胞染色剂(Cellstain double staining)和荧光显微镜评估活力。表2证明了所有的优化组合及其评估的可行性。

表2.基于双染色细胞染色剂(Cellstain double staining)的再水化后的冻干保护剂和活力的优化图表

来自两种组合的细胞染色剂(Cellstain)获得了很好的结果。第一种混合物含有0.4％(w/w)的

1％(w/w)的甘油、0.3％(w/w)的海藻糖，并将其暴露于50mM海藻糖培养基中24小时。下一种混合物含有相同的物质，但另外含有PEG6000(0.7％(w/w))。因此，可以得出结论：PEG6000很可能在混合物的冻干保护作用中没作用有或几乎没有作用。此处的所有实验均使用(0.4％(w/w)的

1％(w/w)的甘油、0.3％(w/w)的海藻糖的第一混合物以及24小时的海藻糖孵育来进行。

添加冻干保护剂和海藻糖孵育

在0.8％(w/w)

中培养细胞4天后，更换上述培养基层。首先，使细胞体系在200RCF下直接在96孔培养板中离心6分钟。接下来，从各孔中吸取上清液。然后，加入含有50mM海藻糖二水合物、2％(w/w)甘油和1％(v/v)PenStrep抗生素混合物的新培养基混合物。甘油的量由于与培养基层成比例而是双倍的，其仅为孔的一半。然后将细胞在+37℃和5％CO₂下孵育24小时。在孵育期间，细胞吸收一部分海藻糖，同时甘油保留在细胞外空间。孵育后，用LeicaAF光学显微镜测量生长的球状体直径，如10所示。最后，通过对每个样品孔来回移液，将培养基层与水凝胶层机械混合。这确保了NFC含量从0.8％彻底降低至约0.4％，我们已经将其优化为用于冻干保护基质作用的最适合NFC量(较低的纤维浓度使得样品的总孔隙率下降)。

差式扫描量热法

用差示扫描量热法(DSC)由水凝胶-细胞混合物测量凝固点(FP)和玻璃化转变点(Tg)。用DSC模拟图5中的冷冻干燥循环，冷却速率为1℃/分钟，加热速率为1℃/10分钟。此外，使用5℃/分钟的冷却速率来更清楚地指出Tg温度。具有冷冻保护剂的细胞水凝胶导致-24.75℃的FP且在-23.75℃没有细胞(对照)。不含冷冻保护剂的体系导致-22.77℃有细胞和-22.35℃没有细胞。甚至0.2mW的精确度也无法检测到海藻糖的Tg'，但这很可能是由于样品中海藻糖的总量低。

液氮灭菌

芬兰AGA公司提供的液氮含有冷冻状态的污染物，并且由于将细胞样品直接移液到液氮中以在玻璃化步骤中达到最大冷冻速率，在使用前必须对液氮进行灭菌。首先，如图2(A)所示，将液氮倒入干净的桶中，并置于ESCO层(DDTC/AU550305054)内。这里，(B)用紫外(UV)光对其进行18分钟灭菌，UV-C辐射的剂量为20,000μW/cm²。然后，将定制的金属架浸没在无菌氮中，然后将15ml无菌开口管(C)无菌地连接到架上，并因此浸没在无菌液氮中。然后，使用金属勺(D)用约5ml无菌液氮填充管。由于含有液氮的管浸没在氮的桶中，在整个运行和运输过程中蒸发不明显，为玻璃化步骤提供了理想的工作环境，玻璃化步骤也是在细胞层内进行的。管周围过量的液氮还便于将细胞管运输到冷冻干燥器，因为其保持了良好的温度。

玻璃化

在下一步骤中，将细胞板置于层内。通过用低附着移液管尖端进行移液，将含有3D细胞球状体水凝胶的各96孔进行适当混合。通过将各孔中的培养基层与水凝胶层混合，形成具有0.4％(w/w)纤维含量的新水凝胶混合物。接下来，如图3(A)所示，将新水凝胶以微小液滴小心地直接移液到15ml管内的液氮中。这导致液滴冷冻成直径约2-5ml的小球体。可以在一定程度上目视观察冷冻速率，因为所用的培养基含有酚红，酚红是一旦没有液态水存在颜色就会从粉色变为黄色的化合物。观察到的从粉色到黄色的颜色变化是瞬时的，表明快速冷冻。最后，将有细胞管的支架放置在冷冻干燥室(B)内，同时仍含有一些液氮以保护样品免受过多的热能。

冷冻干燥

玻璃化后，立即进行冷冻干燥过程。其在赫尔辛基的生物中心2(Biocenter2)中用Labogene公司制造的ScanVac CoolSafe进行。该型号没有单独的样品冷却系统，也没有可编程主机，因此无法跟踪每次的温度。然而，由于细胞培养基中的酚红，我们可以在冷冻干燥循环开始时排除样品中存在任何游离水，如图4(A)中黄色样品的情况。整个过程中冷凝器保持在-106℃。

在玻璃化后将样品运输并置于冷冻干燥器内，使得15ml管仍含有2-3ml的液氮，如图3(B)所示。立即开始冷冻干燥循环，从而通过真空泵收集仍然形成的氮气。这确保了我们的样品的最低起始温度，因为样品通常在真空初始化阶段升温。真空室在约15分钟内达到0.001毫巴的真空水平。冷冻干燥循环持续72小时，在此期间样品以未知的速率加热，因为仪器并没有温度传感器。使用热成像相机穿过室玻璃，然而，其仅测量室的表面温度而不是样品的温度。然而，观察到的酚红的黄色色调确保了在结束时样品干燥，如图4(B)所示。用室内空气缓慢释放真空5分钟。

存储和重建(recreation)

将干燥的样品储存在用

固定的封闭塑料管中，并置于具有干燥的二氧化硅球的干燥器内并填充氩气，储存在+4℃。储存一天后，用设计的再水化液体无菌重建样品，该再水化液体是专门为干燥的NFC体系再润湿而设计的。为了避免高浓度差异引起的冲击，将新型的再水化液体设计成除了超纯水外还含有额外的培养基，因此当过量加入时，可以达到体系的原始渗透压。新型重建液体含有1％(v/v)的PenStrep混合物、79％(v/v)的高压灭菌超纯水和20％(v/v)培养基。将再水化液体加入干燥的样品中，以使得液体体积等于干燥样品原始湿体积的125％(v/v)，不同的是减少了2.5％(v/v)以对应于样品的干体积。因此，通过添加122.5％(v/v)的重建液体实现了原始渗透压，同时添加了20％(v/v)的新鲜的额外培养基。在加入再水化液体之前，使其升温至+37℃以确保与细胞温和接触。通过在15ml管内插入加载的1000μl低粘附尖端将液体加入样品中，并通过移液快速混合。然后将细胞立即置于+37℃和5％CO₂的孵育器中15分钟，随后进行任何其它处理。

新型冷冻干燥循环保持无菌

在研究期间，产生了两种新型的无菌冷冻干燥方法。在图尔库应用科学大学对第一冷冻干燥循环进行了优化，用于细胞水凝胶体系的200μl冷冻干燥剂量。该仪器是图尔库的克比塔(Kupittaa)的另一种带有可编程操作系统的通用干燥机。操作的型号是EPSILON1-6D并由CHRIST制造。该仪器具有自动化和可编程的油基冷却架子和可控的真空泵。因此，我们能够为96孔中的3D细胞水凝胶样品设计独特的冷冻干燥循环。最终的优化循环如图5所示。

然而，该研究后来搬到赫尔辛基维埃基的第二冷冻干燥机。该模型是Labogene公司的ScanVac CoolSafe。该型号没有单独的冷却系统，也没有可编程的主单元，因此，无法为其优化循环。然而，它被用于产生本研究的所有结果。将样品用液氮玻璃化并在0.001毫巴压力下干燥72小时。

由于两种使用的仪器都位于受污染的室内空气中，因此本研究开发了两种新的无菌干燥方法。图6(A)中的第一系统显示切成两块的235cm²细胞培养瓶(由

制造)，其在插入96孔板后已经灭菌并且在无菌细胞层中重新连接，其已用箭头标记。瓶盖已经用层流内的新鲜无菌包装的盖进行替换。接下来，将重新连接的瓶子部件之间的连接部用经70％乙醇擦拭的

进行气密密封，并在从层中取出后，用常规空气调节胶带进行气密密封。然后将整个烧瓶小心地放入冷冻干燥室内，以受控方式以1℃/分钟进行冷冻并冷冻干燥。96孔板含有细胞水凝胶体系，并且只能通过盖的大量过滤器来交换气体分子。然后，用MycoAlert^TM支原体检测试剂盒检测干燥样品的污染物和支原体。没有检测到污染物或支原体。

在图6(B)中，显示聚丙烯管用无菌

透气密封胶带紧密封闭。由于市场上没有防冷冻干燥的密封胶带，因此联系了该胶带的制造商(美国康宁公司)并收到了免费样品。测试结果表明：液氮对胶带的粘附性质没有影响，并且其对空气进行过滤，因为之后并未检测到污染物和支原体。

支原体和无菌测试

在玻璃化，冷冻干燥、储存和重建之后，对样品进行支原体测试。收集重建的细胞水凝胶体系并将其接种到具有5ml培养基的25cm²培养瓶中，然后培养8天。在此期间，每天观察细胞瓶，观察培养基颜色、气味和任何微观活动外观的任何变化。没有发现微生物活动或培养基pH或气味的变化。然后，用MycoAlert^TM支原体检测试剂盒检测培养基样品的支原体。其也产生了阴性结果，因此得出结论：

透气密封胶带和细胞瓶软木塞过滤器设法在冷冻干燥过程中保持样品的无菌。

细胞活力的活/死细胞双染色(Live/Dead double staining)

使用用于哺乳动物细胞的活/死细胞双染色试剂盒测试重建的细胞体系的活力。首先用健全的3D Hep G2细胞培养和经70％乙醇杀伤的细胞对照样品来优化钙黄绿素AM和碘化丙定鎓的量。接下来，用DPBS(不含钙和镁)缓冲液稀释冷冻干燥并的样品，使得最终的NFC浓度为0.1％，因为在优化期间观察到该NFC浓度或更低会干扰用染料的最小值，但需要一些NFC的存在来稳定细胞进行成像。将球状体悬浮于含有钙黄绿素-AM 1：500(双染色细胞染色剂试剂盒；西格玛-奥德里奇公司)和50μg/ml的DAPI(英杰公司，加利福尼亚州卡尔斯巴德(Invitrogen,Carlsbad,CA))的染色溶液中，在37℃下保持15分钟，并转移至Greiner Sensoplate^TM玻璃底96孔板(西格玛-奥德里奇公司)上。使用HC PL APO 10x/0,4(空气)和HC PL APO 20x/0,7 CS(空气)物镜，用Leica SP5II HCA显微镜拍摄荧光图像。将Imaris 8.4.1软件用于获取图像。通过死对照样品排除了自发荧光的可能性。首先，在30分钟的孵育内，用70％乙醇杀伤冷冻干燥和重建的对照体系，然后用与样品相同的染料进行染色。在对照样品中未观察到绿色荧光。

细胞活力试验

在用氧化还原指示剂刃天青(

细胞活力试剂，英杰公司制造)进行冷冻干燥之前和之后测定Hep G2细胞球状体的线粒体代谢活性。首先，以培养基和水凝胶混合物的共体积的1/10施加

然后，在37℃，5％CO₂中，使细胞暴露于刃天青4小时。随后，将培养板以200rcf离心7分钟，并将50ml的所形成上清液(培养基)从各培养孔转移至黑色96孔板。最后，使用560nm处的激发和590nm处的发射，用板读数器(VarioskanFlash，赛默飞世尔公司)记录刃天青(荧光试卤灵)的代谢物。

然后通过将测量值与具有已知细胞量的类似样品进行比较，使用测量的吸光度来确定活细胞的数量。从该数据绘制线性标准线(y＝0.004x+32.364,R²＝0.98211)，如图7所示。

结果

在冷冻干燥过程中细胞的形态保持不变

重建的细胞体系用具有x5物镜(图8A)、x10物镜(B)和x20物镜(C和D)的LecaAF光学显微镜进行成像。此外，用相同的显微镜对重新接种至细胞瓶中的再水化体系进行成像。再生的体系非常类似于原始的细胞培养体，没有观察到破裂的球状体。此外，细胞形态似乎与Hep G23D细胞培养物相同。在图8(A)中，可以观察到具有约300μm直径的超大细胞球状体，并且在图8(B)中，可以观察到通常尺寸和形状的球状体，并且图8(C)总可以观察到红色球状体。所有不同尺寸的球状体都存活下来，没有明显的破裂也没有坍塌。在图8(D)中，可以观察到单个细胞的形态。还检测到Hep G2细胞的冻干3D细胞球状体上的微囊泡。

气凝胶的SEM图像

冷冻干燥后，用SEM(扫描电子显微镜)型号FEI Quanta 250场发射扫描枪(FieldEmission GunScanning)对干燥的样品成像(图13A-F)。

的气凝胶结构类似于典型的非常多孔的纤维素气凝胶。可以观察到包封在气凝胶中的不同尺寸的细胞球状体(在图13(A)、图13(C)和图13(E)中用箭头标记)。

细胞的附着

在再水合后，将一些3D细胞球状体重新接种到具有新鲜培养基的75cm²细胞培养瓶中。4小时后，观察到细胞球状体附着在烧瓶的聚丙烯表面上，如图9所示。附着足够坚固以锚定球状体，使其在4小时时的培养基更换中存活，在所述培养基更换中旧培养基被吸取并且将新培养基移液到烧瓶中。由于来自NFC纤维网络的支持性ECM模拟压力消失，观察到形态变化回2D状结构。然而，大多数球状体在4小时孵育期间没有附着到表面，表明细胞活力丧失。

用于细胞活力的双染色细胞染色剂试剂盒(Cellstain double staining kit)

西格玛-奥德里奇公司的双染色细胞染色剂试剂盒(也称为活/死双重染色)用于测定细胞活力。在实际测量之前的试验组中首先优化所需活性化合物、钙黄绿素AM和碘化丙锭的量。确定在37℃和5％CO₂下用15分钟孵育得到每孔5万个细胞的情况下，以1×DPBS稀释的0.2％(v/v)的所提供钙黄绿素AM溶质和0.1％(v/v)的碘化丙啶溶质得到了清晰的图像。

再水化和双重染色的细胞样品用具有以下设置的共聚焦显微镜Leica SP5 IIHCA成像：针孔420μm，增益480和氩激光25％。使用的激光器是HeNe 633nm/12mW和DPSS561nm/20mW，使用的物镜是HC PL APO 10x/0,4(空气)和HC PL APO 20x/0,7CS(空气)。图10显示了再水化后1小时的细胞球状体，其中，图10(A)显示来自PDSS 561激光器的通道并且图(B)显示了来自HeNe633激光器的通道。图10(C)显示了具有更高捕获分辨率的这两个通道的叠加。

通过经杀伤的对照样品排除自发荧光，所述对照样品被同时染色并以相同的设置成像，没有显示绿色荧光。从相同的再水合细胞批次中取出经杀伤的对照样品，但在染色和成像之前用70％乙醇处理30分钟。使用共聚焦显微镜捕获堆叠图像，并且创建3D模型以分析存活的细胞球状体的活力。基于这些模型，结果得出25％(±10)细胞活力。

创建另一种对照样品以区分

的冻干保护作用；没有

的样品，其以相同的方式处理，包括24小时海藻糖孵育、相同量的冻干保护剂和用液氮进行冷冻。将这些对照样品同时与主要样品一起冷冻干燥，以排除批次之间的差异。结果显示在图11中，其中，发现图11(A)中的所有对照样品均死亡，但在图11(B)中的主要样品中观察到活细胞。

在某些情况下，最大的细胞球状体似乎是中空的。这可能是由于这样的事实：染色剂仅在15分钟时间内对球状体进行染色，并且染色剂需要通过外部细胞层向芯部扩散。这可能会产生中空球状体的错觉，实际上应当增加染色孵育时间，或者在染色前将球状体切成两半。图12显示了中空显示的球状体的中间部分。

使用活/死图像，确切分类为死亡和活着是具有挑战性的。一些个体细胞既有染色剂，也有细胞膜上的孔，但细胞内有酶活性。不过，该实验清楚地证明了

的冻干保护作用。

试验

冷冻干燥后，用

试验测量Hep G2细胞的活力，得到3.7％(±0.03)的活力，这相当低。然而，在几个测量组中检测到了活力，

试剂盒的灵敏度足以检测甚至每孔50个活细胞。对于双染色细胞染色剂(Cellstain double staining)的结果，这仍然存在争议。一种理论认为，冷冻干燥改变了

的性质，使其对刃天青具有粘性。然而，对照样品组排除了这一点，其中，

首先与培养基和冻干保护剂进行冷冻干燥(但不含细胞)，在再水化后接种健康细胞。虽然如此，但这些细胞显示出了正常的活力。

活性测量中缺乏活力证明在冷冻干燥过程中细胞线粒体发生了某些事。然而，细胞膜保持完整，并且细胞酶蛋白保持活性，如通过双染色细胞染色剂的多次重复测量组所证明。在问题讨论期间，我们将细胞称为薛定谔细胞。由于两种试验都实施了许多次，并且结果总是相似，通过综合对照测量排除了所有其它情况，我们最终得出结论：细胞膜保持相关完整，因为绿色染料并没有泄漏，而细胞内的线粒体在某种程度上受损。有人可能会争辩说NFC可以防止绿色染色剂泄漏，但事实并非如此，因为绿色染色剂会首先从NFC扩散到细胞。

的这种困境将在下一节中进行详细讨论。

纳米原纤纤维素水凝胶可用作冻干保护基质，其可经受冷冻和干燥而无机械破裂，其是惰性的，清洁污染物，保持足够的液体以实现高孔隙率并且可成形为明确限定的几何单元。根据测试，芬欧汇川公司生产的纳米原纤纤维素满足所有这些要求。当用再水化液体充满时，NFC基质确实释放了所吸收的活性产物。如果加入正确量的纤维素酶混合物(GrowDaseTM)，则纳米原纤维纤维素的纤维结构被消化成小的糖。然而，在冷冻干燥的3D细胞球状体水凝胶体系的情况下，培养很可能在水凝胶环境中继续，因此通常不需要首先消化水凝胶。

相对于冷冻干燥产品的要求，干燥产品应该是干燥的，活性的，贮存稳定的，干净和无菌的，伦理上可接受的，药学上精良的，易溶并且易于重建，并且该方法应该是经济上可行的，而且这些要求都满足。根据研究结果，干燥的

Hep G2体系中没有游离水留在其中，重建后保持其活性，其是无菌的，精良的且易溶解的。由于

和所有其他组分完全包括动物，只要所使用的细胞没有道德问题，该过程应被视为伦理上可接受的。如果可以获得所需的机器，则该过程中使用的所有材料相对便宜(糖、纤维素、甘油)，但最终产品可能具有高价值。如果以工厂设置进一步优化该过程，则可以认为它在经济上是可行的。由于时间紧迫，未在数日后研究产品的货架稳定性(shelf stableness)。而且，冷冻干燥的样品以包封在NFC中的干燥状态在高速公路上的汽车后备箱中从西芬兰转移到赫尔辛基，但样品仍然显示出活性。这可能是由于NFC纤维的刚性干燥结构阻止了中空细胞的坍塌。

Claims (60)

1.一种对在包含纳米原纤纤维素的水凝胶中的细胞进行冷冻干燥的方法，所述方法包括：

- 提供包含纳米原纤纤维素的水凝胶，

- 提供细胞，所述细胞是真核细胞，

-将细胞与含有纳米原纤纤维素的水凝胶合并以形成细胞体系，以及

- 对细胞体系进行冷冻干燥以获得在包含纳米原纤纤维素的气凝胶中的干燥细胞。

2.如权利要求1所述的方法，所述方法包括：提供一种或多种冷冻保护剂和/或冻干保护剂，并且将所述一种或多种冷冻保护剂和/或冻干保护剂添加到细胞体系中。

3.如权利要求1所述的方法，所述方法包括：对细胞体系中的细胞进行培养。

4.如权利要求1所述的方法，其中，所述细胞是哺乳动物细胞。

5.如权利要求4所述的方法，其中，所述细胞是癌细胞。

6.如权利要求2所述的方法，其中，所述一种或多种冷冻保护剂和/或冻干保护剂选自海藻糖、甘油和聚乙二醇。

7.如权利要求2所述的方法，其中，所述一种或多种冷冻保护剂和/或冻干保护剂包括海藻糖和甘油。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，纳米原纤纤维素在分散于水中时提供在0.8％(w/w)的稠度和10rpm下测得的至少2000mPa·s的布氏粘度。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，纳米原纤纤维素在分散于水中时提供在0.8％(w/w)的稠度和10rpm下测得的至少3000 mPa·s的布氏粘度。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，纳米原纤纤维素在分散于水中时提供在0.8％(w/w)的稠度和10rpm下测得的至少10000 mPa·s的布氏粘度。

11.如权利要求1所述的方法，其中，冷冻干燥前，所述水凝胶中的纳米原纤纤维的浓度范围为0.1–10%(w/w)。

12.如权利要求1所述的方法，其中，冷冻干燥前，所述水凝胶中的纳米原纤纤维的浓度范围为0.1-5% (w/w)。

13.如权利要求1所述的方法，其中，冷冻干燥前，所述水凝胶中的纳米原纤纤维的浓度范围为0.1-2% (w/w)。

14.如权利要求1所述的方法，其中，冷冻干燥前，所述水凝胶中的纳米原纤纤维的浓度范围为0.1–1.0% (w/w)。

15.如权利要求1所述的方法，其中，纳米原纤纤维素选自阴离子改性的纳米原纤纤维素，阳离子改性的纳米原纤纤维素，未改性的纳米原纤纤维素，TEMPO氧化的纳米原纤纤维素。

16.如权利要求1所述的方法，其中，持续进行冷冻干燥，直至干燥的水凝胶的含水量为10%(w/w)或更低。

17.如权利要求1所述的方法，其中，冷冻干燥包括首先将细胞体系的温度至少降至-20℃，然后施加降低的压力以从细胞体系中去除水。

18.如权利要求1所述的方法，其中，冷冻干燥包括首先将细胞体系的温度至少降至-30℃，然后施加降低的压力以从细胞体系中去除水。

19.如权利要求1所述的方法，其中，冷冻干燥包括首先将细胞体系的温度至少降至-40℃，然后施加降低的压力以从细胞体系中去除水。

20.一种含有纳米原纤纤维素和真核细胞的冷冻干燥的气凝胶，其通过如权利要求1-19中任一项所述的方法得到，其中，冷冻干燥的气凝胶的含水量为10%(w/w)或更低。

21.如权利要求20所述的冷冻干燥的气凝胶，所述冷冻干燥的气凝胶包含一种或多种冷冻保护剂和/或冻干保护剂。

22.如权利要求20所述的冷冻干燥的气凝胶，其中，所述细胞是哺乳动物细胞。

23.如权利要求22所述的冷冻干燥的气凝胶，其中，所述细胞是癌细胞。

24.如权利要求21所述的冷冻干燥的气凝胶，其中，所述一种或多种冷冻保护剂和/或冻干保护剂选自海藻糖、甘油和聚乙二醇。

25.如权利要求21所述的冷冻干燥的气凝胶，其中，所述一种或多种冷冻保护剂和/或冻干保护剂包括海藻糖和甘油。

26.如权利要求20所述的冷冻干燥的气凝胶，其中，所述冷冻干燥的气凝胶中细胞的含量为0.1-65%(w/w)。

27.如权利要求20所述的冷冻干燥的气凝胶，其中，所述冷冻干燥的气凝胶中细胞的含量为0.1-50% (w/w)。

28.如权利要求20所述的冷冻干燥的气凝胶，其中，所述冷冻干燥的气凝胶中细胞的含量为1–25% (w/w)。

29.如权利要求24或25所述的冷冻干燥的气凝胶，其中，在冷冻干燥的气凝胶中，所述一种或多种冷冻保护剂和/或冻干保护剂含量为1-10%(w/w)，并且/或者所述冷冻保护剂和/或冻干保护剂中所述海藻糖的含量为0.5-50%(w/w)。

30.如权利要求20所述的冷冻干燥的气凝胶，其中，纳米原纤纤维素在分散于水中时提供在0.8％(w/w)的稠度和10rpm下测得的至少2000mPa·s的布氏粘度。

31.如权利要求20所述的冷冻干燥的气凝胶，其中，纳米原纤纤维素在分散于水中时提供在0.8％(w/w)的稠度和10rpm下测得的至少3000 mPa·s的布氏粘度。

32.如权利要求20所述的冷冻干燥的气凝胶，其中，纳米原纤纤维素在分散于水中时提供在0.8％(w/w)的稠度和10rpm下测得的至少10000 mPa·s的布氏粘度。

33.如权利要求20所述的冷冻干燥的气凝胶，其中，所述纳米原纤纤维素选自：阴离子改性的纳米原纤纤维素，阳离子改性的纳米原纤纤维素，未改性的纳米原纤纤维素，TEMPO氧化的纳米原纤纤维素。

34.一种对在包含纳米原纤纤维素的水凝胶中的胞外囊泡进行冷冻干燥的方法，所述方法包括：

- 提供包含纳米原纤纤维素的水凝胶，

-提供胞外囊泡，

-将囊泡与含有纳米原纤纤维素的水凝胶结合以形成囊泡体系，以及

- 对囊泡体系进行冷冻干燥以获得在包含纳米原纤纤维素的气凝胶中的干燥的胞外囊泡。

35.如权利要求34所述的方法，所述方法包括：提供一种或多种冷冻保护剂和/或冻干保护剂，并且将这一种或多种冷冻保护剂和/或冻干保护剂添加到囊泡体系中。

36.如权利要求34所述的方法，其中，所述胞外囊泡包括微囊泡。

37.如权利要求35所述的方法，其中，所述一种或多种冷冻保护剂和/或冻干保护剂选自海藻糖、甘油和聚乙二醇。

38.如权利要求35所述的方法，其中，所述一种或多种冷冻保护剂和/或冻干保护剂包括海藻糖和甘油。

39.如权利要求34所述的方法，其中，纳米原纤纤维素在分散于水中时提供在0.8％(w/w)的稠度和10rpm下测得的至少2000mPa·s的布氏粘度。

40.如权利要求34所述的方法，其中，纳米原纤纤维素在分散于水中时提供在0.8％(w/w)的稠度和10rpm下测得的至少3000 mPa·s的布氏粘度。

41.如权利要求34所述的方法，其中，纳米原纤纤维素在分散于水中时提供在0.8％(w/w)的稠度和10rpm下测得的至少10000 mPa·s的布氏粘度。

42.如权利要求34所述的方法，其中，冷冻干燥前，所述水凝胶中的纳米原纤纤维的浓度为0.1–10%(w/w)。

43.如权利要求34所述的方法，其中，冷冻干燥前，所述水凝胶中的纳米原纤纤维的浓度为0.1-5% (w/w)。

44.如权利要求34所述的方法，其中，冷冻干燥前，所述水凝胶中的纳米原纤纤维的浓度为0.1-2% (w/w)。

45.如权利要求34所述的方法，其中，冷冻干燥前，所述水凝胶中的纳米原纤纤维的浓度为0.1–1.0% (w/w)。

46.如权利要求34所述的方法，其中，所述纳米原纤纤维素选自阴离子改性的纳米原纤纤维素，阳离子改性的纳米原纤纤维素，未改性的纳米原纤纤维素，TEMPO氧化的纳米原纤纤维素。

47.如权利要求34所述的方法，其中，持续进行冷冻干燥，直至干燥的水凝胶的含水量为10%(w/w)或更低。

48.一种含有纳米原纤纤维素和胞外囊泡的冷冻干燥的气凝胶，其通过如权利要求34-47中任一项所述的方法得到，其中，水凝胶的含水量为10%(w/w)或更低。

49.如权利要求48所述的冷冻干燥的气凝胶，其中，所述胞外囊泡包括微囊泡。

50.如权利要求48所述的冷冻干燥的气凝胶，所述冷冻干燥的气凝胶包含一种或多种冷冻保护剂和/或一种或多种冻干保护剂。

51.如权利要求50所述的冷冻干燥的气凝胶，其中，所述一种或多种冷冻保护剂和/或冻干保护剂选自海藻糖、甘油和聚乙二醇。

52.如权利要求50所述的冷冻干燥的气凝胶，其中，所述一种或多种冷冻保护剂和/或冻干保护剂包括海藻糖和甘油。

53.如权利要求48所述的冷冻干燥的气凝胶，其中，所述干燥的气凝胶中胞外囊泡的含量为0.1-65%(w/w)。

54.如权利要求48所述的冷冻干燥的气凝胶，其中，所述干燥的气凝胶中胞外囊泡的含量为0.1-50%(w/w)。

55.如权利要求48所述的冷冻干燥的气凝胶，其中，所述干燥的气凝胶中胞外囊泡的含量为1–25% (w/w)。

56.如权利要求51或52所述的冷冻干燥的气凝胶，其中，在冷冻干燥的气凝胶中，所述一种或多种冷冻保护剂和/或冻干保护剂含量为1-10%(w/w)，并且/或者所述冷冻保护剂和/或冻干保护剂中所述海藻糖的含量为0.5-50%(w/w)。

57.如权利要求48所述的冷冻干燥的气凝胶，其中，纳米原纤纤维素在分散于水中时提供在0.8％(w/w)的稠度和10rpm下测得的至少2000mPa·s的布氏粘度。

58.如权利要求48所述的冷冻干燥的气凝胶，其中，纳米原纤纤维素在分散于水中时提供在0.8％(w/w)的稠度和10rpm下测得的至少3000 mPa·s的布氏粘度。

59.如权利要求48所述的冷冻干燥的气凝胶，其中，纳米原纤纤维素在分散于水中时提供在0.8％(w/w)的稠度和10rpm下测得的至少10000 mPa·s的布氏粘度。

60.如权利要求48所述的冷冻干燥的气凝胶，其中，所述纳米原纤纤维素选自：阴离子改性的纳米原纤纤维素，阳离子改性的纳米原纤纤维素，未改性的纳米原纤纤维素，TEMPO氧化的纳米原纤纤维素。

Images