KR102547427B1 - 미토 마이신 c 방출 제어기능을 갖는 유착방지용 온도감응형 셀룰로오스 기반 하이드로겔의 제조방법 - Google Patents

미토 마이신 c 방출 제어기능을 갖는 유착방지용 온도감응형 셀룰로오스 기반 하이드로겔의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명의 일 실시예에 따른 미토 마이신 C 방출 제어기능을 갖는 유착방지용 온도감응형 셀룰로오스 기반 하이드로겔의 제조방법은 상기 변형된 템포-산화매개-나노셀룰로오스(Modified tempo oxidized nanocellulose), 메틸 셀룰로오스(Methyl cellulose) 및 미토 마이신 C(Mitomycin C)를 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계; 상기 혼합물을 교반하는 단계 및 상기 교반된 혼합물에 염화나트륨을 첨가하여 겔화시키는 단계를 포함한다.

Description

미토 마이신 C 방출 제어기능을 갖는 유착방지용 온도감응형 셀룰로오스 기반 하이드로겔의 제조방법{Method for producing a temperature-sensitive cellulose-based hydrogel for preventing adhesion with mitomycin C release control function}
본 발명은 미토 마이신 C 방출 제어기능을 갖는 유착방지용 온도감응형 셀룰로오스 기반 하이드로겔의 제조방법에 관한 것으로 구체적으로는 EDC/NHS 촉매를 이용한 미토 마이신 C가 로딩된 셀룰로오스 기반 온도감응형 하이드로겔의 제조방법에 관한 것이다.
수술 후 복막 유착(Post-operative peritoneal tissue adhesion, PPA)은 Bowel loop, Parietal peritoneum 및 실질 기관 사이에 두꺼운 섬유 조직밴드가 형성되는 일반적인 건강 문제 중 하나이다.
PPA는 감염, 장폐색, 자궁외 임신, 불임 및 수십억 환자의 사망을 유발하는 정상적인 치유 과정의 중단에 의해 유발되며, PPA를 형성을 줄이거나 극복하기 위해 약물 전달 및 물리적 격리와 같은 두가지 방법의 약리학적 치료를 진행해왔다. 몇 가지 약리학적 약제는 단독 요법으로 사용되었지만, 변경된 약물 동태학 또는 복강에서의 빠른 약물 제거로 인해 상태를 개선할 수 없는 문제점들이 있어왔다. 또한, 임상에 적용 중 약물의 부작용으로 인한 안전성 문제도 제기되어 왔다.
한편, 장벽 기반 시스템은 중증 유착 기간 동안 수술 부위를 주변의 장기와 물리적으로 분리시켜 독립적으로 치료할 수 있는 장점이 있다. 그러나, 유착 방지에 대한 긍정적인 효과가 있음에도 이들 중 어느 것도 표준으로 채택되지 않았다.
이상적인 장벽은 다음과 같은 몇가지 특징을 가질 수 있다; (a) 개복술 및 복강경 검사 모두에 적용 가능하여야 하며, (b) 조정 가능한 생분해성 및 세포 적합성이 있어야 하고, (c) 적용 후 조직 표면 형상을 덮기에 적합하여야 하며, (d) 임계 접착 기간까지 기계적으로 효과적이여야 하고, (e) 수술 조직 부위의 정상적인 치유를 촉진해야한다.
이와 관련하여 주사용 온도 감응형 하이드로겔 장벽은 상온에서 복강으로 적용할 수 있고, 인체의 온도에서 고체 겔로 전환될 수 있기 때문에 고체 필름 및 액체 용액 기반 장벽보다 장점이 있다.
열감응형 하이드로겔 장벽은 약물 전달 시스템에서 사용되는 약물을 섬유증 유착 방지를 위해 표적 부위에 주입할 수 있으며, 생리학적 온도에서 열-겔을 제조하는 경우 메틸 셀룰로오스가 유망한 폴리머가 될 수 있으며, Mitomycin C(MMC)의 경우 몇 주 동안 섬유증 및 혈관 억제를 통해 유착을 감소시키는 잠재적인 역할을 하는 항생제로 적용할 수 있다.
게다가, 항증식성 MMC의 복강내 투여는 MMC의 cross-link DNA 및 세포 유사분열을 억제하는 능력 때문에 마우스의 1 차 또는 재발성 복강 내 유착을 예방하는데 효과적인 것으로 밝혀졌다.
그러나, 친수성 약물인 MMC의 신속하고 폭발적인 반응성으로 인한 부작용 및 조직 부위의 괴사를 예방하기 위해 반응성을 제어해야한다는 단점이 있다. 이 경우 TEMPO는 약물을 적재하고, 표적부위에 전달하는 효과적인 운반자가 될 수 있으며, TEMPO는 스캐폴드의 기계적 안정성도 향상시킬 수 있다.
또한, EDC는 NHS가 접합 절차를 안정적으로 만드는 아민 및 카르복실 반응의 교차 링커로, EDC/NHS 조합은 무독성이며, 널리 사용되는 촉매로서 투석이나 헹굼으로 쉽게 제거할 수 있는 장점이 있다.
대한민국 등록특허공보 제10-1666792호
본 발명의 목적은 미토 마이신 C 방출 제어기능을 갖는 유착방지용 온도감응형 셀룰로오스 기반 하이드로겔의 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 미토 마이신 C 방출 제어기능을 갖는 유착방지용 온도감응형 셀룰로오스 기반 하이드로겔의 제조방법은 변형된 템포-산화매개-나노셀룰로오스(Modified tempo oxidized nanocellulose), 메틸 셀룰로오스(Methyl cellulose) 및 미토 마이신 C(Mitomycin C)를 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계; 상기 혼합물을 교반하는 단계 및 상기 교반된 혼합물에 염화나트륨을 첨가하여 겔화시키는 단계를 포함한다.
상기 혼합물을 제조하는 단계 전, 상기 변형된 템포-산화매개-나노셀룰로오스를 제조하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 변형된 템포-산화매개-나노셀룰로오스를 제조하는 단계는, 템포-산화매개-나노셀룰로오스 현탁액을 유리 페트리에 붓고 37℃의 인큐베이터에서 6시간 보관하여 매트릭스를 형성시키는 과정, 상기 매트릭스에 N-(3디메틸아미노프로필)-N-에틸 카르보디이드 하이드로클로라이드/N-하이드록시-숙신이미드(N-(3Dimethylaminopropyl)-N-ethyl carbodiimide hydrochloride/N-hydroxy-succinimide) 용액을 투입하고 4℃ 온도에서 6시간 동안 배양하는 과정, 상기 배양된 시트를 세척하는 과정 및 상기 세척된 시트를 분쇄하는 과정을 포함할 수 있다.
상기 템포-산화매개-나노셀룰로오스(Tempo-oxidized nanocellulose)는 침엽수 표백 크라프트 펄프로부터 수득될 수 있다.
상기 혼합물을 제조하는 단계는, 상기 변형된 템포-산화매개-나노셀룰로오스 및 메틸 셀룰로오스를 1:1.5~3.5 중량비로 혼합하고, 상기 미토 마이신 C는 0~0.4 ㎍/100㎕를 포함할 수 있다.
상기 교반하는 단계는, 상기 혼합물을 80~90 ℃의 온도에서 15~25 분 동안 교반할 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 미토 마이신 C 방출 제어기능을 갖는 유착방지용 온도감응형 셀룰로오스 기반 하이드로겔은 상기한 방법에 따라 제조된다.
본 발명에 따르면, 세포적합성, 기계적 안정성, 우수한 주사성, 최적의 분해 및 수술 부위의 약물 방출능이 우수한 미토 마이신 C 방출 제어기능을 갖는 유착방지용 온도감응형 셀룰로오스 기반 하이드로겔을 제공할 수 있는 장점이 있다.
도 1A는 14일 동안 다양한 유형의 하이드로겔에 대한 L929 섬유아세포의 생존력을 평가한 것이고, 도 1B는 Mitomycin C가 다양한 하이드로겔에서 섬유아세포의 생존력에 미치는 영향을 나타낸 것이며, 도 1C는 하이드로겔 원자재의 전외선 분광법을 나타낸 것이다(결과는 평균 ± SD로 표시, ***P < 0.001 **P < 0.01 *P< 0.05).
도 2A는 동결 건조된 하이드로겔의 SEM 이미지 및 다양한 유형의 하이드로겔에서 cTOCN과 mitomycin C 조합의 효율성을 평가한 EDXS 이미지를 나타낸 것이고, 도 2B는 하이드로겔의 점도를 나타낸 것이며, 도 2C는 하이드로겔의 기계적 강도를 나타낸 것이며, 도 2D는 메틸 셀룰로오스 농도가 증가함에 따른 하이드로겔의 강도를 나타낸 것이고, 도 2E는 37℃ 바이알 반전법을 통해 관찰된 하이드로 겔의 겔화시간을 나타낸 것이고, 도 2F는 37℃에서 하이드로겔의 팽창 거동을 나타낸 것이다.
도 3A는 SBF 용액(pH 7.4, 37℃)에 담근 후 체외에서 겔의 무게감소 거동을 비교한 것이고, 도 3B는 SBF 배지(pH 7.4, 37℃)에서 14일 동안 다른 하이드로겔로부터 mitomycin C의 방출율을 나타낸 것이고, 도 3C는 SBF 배지(pH 7.4, 37 ℃)에서 TOCN(촉매없음)을 사용하여 제조된 하이드로겔로부터 Mitomycin C의 방출율을 나타낸 것이며, 도 4D는 37℃에서 유동학을 통해 C2.5T1M0.2의 하이드로겔의 겔화온도를 측정한 것이다(SBF = Simulated body fluid, 유사체액).
도 4A는 37℃에서 유동학을 통해 관찰된 C2.5T1M0.2 하이드로겔의 겔화시간을 나타낸 것이고, 도 4B는 상온(25℃)에서 C2.5T1M0.2 하이드로겔의 주입성 및 신체온도(37℃)에서의 겔화를 나타낸 것이며, 도 4C는 다양한 유형의 하이드로겔(검은색 점선)을 마우스의 피하에 주사하고 생체 내 분해 거동을 나타낸 것이다.
도 5A는 마우스의 측벽 결함 맹장 마모를 수행한 후 하이드로겔을 적용한 이미지를 나타낸 것이고, 도 5B는 다른 유착 점수를 갖는 유착 빈도 백분율을 7일째에 4개의 처리 그룹에 표시한 것이고, 도 5C는 14일째 C2.5T1M0(Mitomycin c 없음) 하이드로겔로 처리된 마우스에서 유착점수를 나타낸 것이다(mitomycin C(C2.5T1M0.2)를 포함하는 하이드로겔은 시험기간 동안 완전히 유착을 방지하는 것을 확인할 수 있다. 양성 대조군은 첫주 동안 유착이 없었지만 수술 후 두번째 주에 유착을 나타내었다. 파란색 원은 7일 후 겔의 존재를 나타낸다).
도 6A는 맹장벽과 복막을 조직학 평가한 것이다(음성 대조군, 양성 대조군, C2.5T1M0 하이드로 겔 처리군에서의 유착 및 C2.5T1M0.2 하이드로 겔 처리군에서의 유착은 14 일 후 헤마톡 실린, 에오신(H&E) 및 Masson의 트리 크롬 (MT) 염색으로 확인하였다; AW = 복벽, CM = 맹장 점막, Me = 상피층, SM = 골격근. 혈관화는 검은 색 점선원으로 표시하였다). 도 6B는 각 샘플 처리된 동물 그룹에서 유착 마커(종양 괴사 인자-α(TNF-α) 및 피브로넥틴)의 유전자 발현은 수술 이후 14일에 실시간 실시간 qPCR에 의해 조사한 것이다(결과는 평균 ± SD로 표시, *** P <0.001 ** P <0.01 * P <0.05).
도 7A는 MMC에 의한 유착 마커의 유전자를 조절하는 방법을 나타낸 것이고, 도 7B는 건강한 마우스와 C2.5T1M0.2 하이드로겔 처리된 마우스에서 세포 독성을 14일 후 대사 기관의 조직학적 검사한 것이며, 도 7C는 C2.5T1M0.2 하이드로겔 처리된 마우스의 복벽 SEM 이미지를 일별로 촬영한 이미지이고, 도 7D는 건강한 마우스의 복벽 이미지를 나타낸 것이다.
도 8A는 EDC/NHC, TOCN, cTOCN, MMC 및 MC의 가교 메커니즘을 나타낸 것이고, 도 8B는 열감응성 겔의 제조과정을 나타낸 것이다.
이하 본 발명에 따르는 실시예 및 본 발명에 따르지 않는 비교예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 따른 미토 마이신 C 방출 제어기능을 갖는 유착방지용 온도감응형 셀룰로오스 기반 하이드로겔의 제조방법은 변형된 템포-산화매개-나노셀룰로오스(Modified tempo oxidized nanocellulose, cTOCN), 메틸 셀룰로오스(Methyl cellulose, MC) 및 미토 마이신 C(Mitomycin C, MMC)를 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계; 상기 혼합물을 교반하는 단계 및 상기 교반된 혼합물에 염화나트륨을 첨가하여 겔화시키는 단계를 포함한다.
상기 혼합물을 제조하는 단계 전, 상기 변형된 템포-산화매개-나노셀룰로오스(TOCN)를 제조하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 변형된 템포-산화매개-나노셀룰로오스(cTOCN)를 제조하는 단계는, 템포-산화매개-나노셀룰로오스(TOCN) 현탁액을 유리 페트리에 붓고 37℃의 인큐베이터에서 6시간 보관하여 매트릭스를 형성시키는 과정, 상기 매트릭스에 N-(3디메틸아미노프로필)-N-에틸 카르보디이드 하이드로클로라이드/N-하이드록시-숙신이미드(N-(3Dimethylaminopropyl)-N-ethyl carbodiimide hydrochloride/N-hydroxy-succinimide, EDC/NHS) 용액을 투입하고 4℃ 온도에서 6시간 동안 배양하는 과정, 상기 배양된 시트를 세척하는 과정 및 상기 세척된 시트를 분쇄하는 과정을 포함할 수 있다.
상기 템포-산화매개-나노셀룰로오스(Tempo-oxidized nanocellulose, TOCN)는 침엽수 표백 크라프트 펄프로부터 수득될 수 있다.
상기 혼합물을 제조하는 단계는, 상기 혼합물을 제조하는 단계는, 상기 변형된 템포-산화매개-나노셀룰로오스 및 메틸 셀룰로오스를 1:1.5~3.5 중량비로 혼합하고, 상기 미토 마이신 C는 0~0.4 ㎍/100㎕를 포함할 수 있다.
상기 교반하는 단계는, 상기 혼합물을 80~90 ℃의 온도에서 15~25 분 동안 교반할 수 있다.
본 발명은 상기한 방법에 따른 미토 마이신 C 방출 제어기능을 갖는 유착방지용 온도감응형 셀룰로오스 기반 하이드로겔을 제공할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예>
1. 재료의 준비
MMC(98% Potency), MC(88,000Da, DS = 1.7), EDC 및 NHS는 미국 Sigma-Aldrich Co.에서 구입하였다. 시험관내(in vitro) 분석은 EZ-CYTOX 세포 생존력 분석 시약(Dogen Seoul, Korea), GibcoTM 소태아 혈청(FBS), HycloneTM RPMI 1640 배지(GE Healthcare Life Sciences, USA)를 사용하였다. L929 섬유 아세포는 ATCC(American Type Culture Collection)를 사용하여 수행하였다.
L929 섬유 아세포 (LFC) 계통은 ATCC(American Type Culture Collection)에서 구입하였다.
2. TOCN의 준비
침엽수 표백 크라프트 펄프로부터 TEMPO 매개 산화에 의해 1% 농축 TOCN을 제조하였다.
3. 변형된 TOCN의 준비(TOCN)
먼저, 12ml의 TOCN 현탁액을 유리 페트리 접시에 부어 얇은 층을 만든 후 37℃의 인큐베이터에서 6시간 동안 보관하였다.
다음으로 가교반응의 효율을 높이기 위해 22 게이지 바늘로 매트릭스에 작은 구멍을 만들었다.
그 후 충분한 양의 EDC/NHS 용액을 가하고 4℃에서 6시간 동안 배양하였다. 다음으로, TOCN 매트릭스를 탈이온수로 6회 세척하고 미반응된 EDC/NHC를 제거하였다.
다음으로, TOCN 매트릭스를 분쇄하고 100 ㎛ 메쉬 체에 여과하였다.
마지막으로, 변형된 TOCN 현탁액(cTOCN)은 4 ℃에 보관하였다.
4. 열 감응성 하이드로겔의 제조
EDC/NHS 의해 MMC 로딩된 하이드로겔은 아미드 결합(-CONH-)을 형성하기 위해 TOCN의 활성화된 카르복실기(-COOH)와 MMC의 1차 아민기(-NH2) 사이의 커플링 반응에 의해 합성된다.
하기의 표 1에 열거된 각 하이드로 겔 샘플은 오토 클레이브된 물에 용해시키고 유리병에 옮긴 후 수조(85 ℃)에 침지시키고 20 분 동안 교반하였다.
교반이 끝난 후 아이스 박스(0℃)에서 냉각하였으며, 이때, 현탁액이 투명한 용액이 될 때까지 교반하였다.
마지막으로 용액을 최종적으로 4 ℃에서 저장한 후 1.25 M 염화나트륨을 첨가하여 겔화하였다.
하기의 표 1은 열 감응성 하이드로겔의 조성 및 바이알 반전방법에 의해 결정된 시험관 내 하이드로겔의 겔화 시간을 나타낸 것이다.
Figure 112021000978629-pat00001
5. 카르복실레이트 함량, TOCN의 결정도 및 MC의 치환도 분석
TOCN의 카르복실레이트(carboxylate) 함량은 전기 전도도 적정을 이용하여 분석하였다.
TOCN의 결정화도(백분율)는 X-선 회절법(XRD, Ni 필터링 된 CuK 방사선을 갖는 Rigaku RINT 2000)을 이용하여 반사 모드로 측정하였다.
MC의 치환도(degree of substitution, DS)는 13C NMR 을 수행하여 분석하였다. 샘플을 80℃에서 DMSO-d6에 용해시키고 (약 10 내지 30 g / L의 농도), Bruker의 Avance III 400 MHz 분광계(프랑스, 위스 부르크)를 이용하여 분석하였다.
6. 시험관 내 세포 독성 평가 및 섬유 아세포 침입 방지 분석
보관하는 동안 오염을 방지하기 위하여 위해 제작된 샘플을 완전히 덮어두었다. 나중에, 자외선 C 방사선(2 시간)에 노출시켜 샘플을 최종 멸균하였으며, 하이드로겔의 시험관 내 세포-물질 상호 작용 및 항-유착능을 평가하기 위해 L929 사용하였다.
7. 구조 분석
원료 중합체 및 하이드겔의 화학적 조성은 저온(4℃)에서 총 반사율- 푸리에 변환 분광법을 이용하여 분석하였다(ATR-FTIR, Thermo Scientific Nicolet iS10, OMNIC 7.3 software).
8. 형태, 점도 및 기계적 강도 분석
SEM(Scanning Electrospinning Microscopy, JSM-6701F, JEOL, Japan, equipped with Energy-dispersive X-ray spectroscopy (EDXS))을 이용하여 표면 형태, 하이드로겔 및 동결건조된 하이드로겔 모두에서 MMC의 존재를 확인하였다.
백금 코팅 후 동결 건조된 하이드로겔을 평가하였다. 하이드로겔의 점도는 25 ℃에서 도포하였으므로, 상온(25 ℃)에서 점도를 확인하였다. 하이드로겔의 기계적 강도는 만능시험기(Unitech, R&B, Korea)를 이용하여 측정하였다.
9. 열감응성 거동 및 주입성 분석
하이드로겔의 열감응성 및 졸-겔 전이는 유동성 및 비유동 원리에 기초한 바이알 반전법(vial inversion method)으로 측정하였으며, 주입성은 25℃에서 측정하였다.
10. 시험관내(In vitro) 분해 및 팽창 분석
적용 후 주변 유체를 흡수하는 능력을확인하기 위해, 하이드로겔의 팽창 거동을 확인하였으며, 이상적인 복막액의 pH는 7.4 내지 8.0이다.
하이드로겔의 분해거동은 37℃에서 혈장과 화학적 조성이 유사한 무세포 용액인 유사체액(SBF, pH 7.4)에서 14일까지 분석하였다.
11. 하이드로겔의 mitomycin C(MMC) 방출 속도 분석
하이드로겔(C1.5T1M0.2, C2.5T1M0.2 and C3.5T1M0.2)에서 mitomycin C 의 방출 효율은 하이드로 겔로부터 약물을 추출하는 방식으로 계산하였다.
12. 생체 하이드로겔 분해 분석
생체내 주사성, 겔안정성 및 생분해성을 확인하였다.
하이드로겔(C1.5T1M0.2, C2.5T1M0.2 and C3.5T1M0.2)을 22- 게이지 바늘을 통해 마우스의 등으로 투여하고 2 주 동안(각 그룹에서 2 마리의 마우스, 매주 6 마우스) 평가 하였다. 특정 주에, 마우스를 안락사 시키고 하이드로겔을 둘러싼 조직을 수집하고 조직학적 관찰을 수행하였다.
조직 몰드의 중간 부분을 절단하여 분해 분석을 확인하였다.
13. 생체내 수술 후 항_유착 분석
13-1. 실험적 설계
생체내(in-vivo) 분석에는 실험 동물 센터(다윤, 한국)로부터 9 주령 Sprague-Dawley 계통의 쥐(Rattus norvegicus))를 구매하여 사용하였다. 각 쥐는 각 200 내지 250g였다. 모든 절차는 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 프로토콜 및 지침에 따라 수행되었으며, 연구계획은 한국 순천향대 학교 동물 윤리위원회의 승인을 받았다.
64마리 수컷 마우스를 4개의 실험으로 나누었다(각 그룹에 16마리, 매주 8마리): 그룹 1은 식염수 세척(장벽 없음)한 음성 대조군, 그룹 2는 긁은 표면에 2ml의 C2.5T1M0.2 하이드로겔(약물 포함)로 덮음, 그룹 3은 2ml의 C2.5T1M0 하이드로겔(약물 미포함)을 적용 그룹 4는 양성대조군이다(covering scratched surface with 2 ml of commercial hydrogel barrier)(HyFence, CHA Bio & Diostech (Seoul, Korea)) (Shin, Paik, & Yang, 2018).
모든 마우스에서 매스 칼날로 복벽(1Ⅹ1 cm2) 및 맹장(1Ⅹ1 cm2)의 표면을 조심스럽게 긁어냈다.
13-2. 수술 후 신규한 유착방지 모델
하이드로겔의 새로운 유착방지 효능은 이전 연구에서 검증된 마우스 측벽-결함-맹장 마모 모델을 사용하여 평가하였다.
초기에는 마우스의 복벽에 있는 백선(linea alba)을 따라 무균 기술을 사용하여 5cm 중간선을 절개한 후 복벽 및 맹장의 표면을 매스 칼날(scalpel blade)로 긁어 냈다. 이후, 손상된 맹장 표면 및 복벽 결함에 2ml의 하이드로겔을 주입하고 30초 동안 완전히 응고시켰다. 봉합사로 결손 부위를 봉합한 후 마우스가 음식 및 물에 자유롭게 접근할 수 있도록 케이지에 감금하였다.
13-4. 생체 내 독성 및 재상피화 분석
하이드로겔에 의해 유발될 수 있는 부작용에 대해 수술 부위의 일반적인 상태(활동, 행동, 에너지, 모발, 대변 및 호홉), 물, 음식 섭취, 사망률, 치유방법을 모니터링 하였다. 14 일째에 주요 기관(폐, 간, 심장 및 신장)을 병리학적으로 시각화, 고정 및 분석하였다(H&E staining). 14 일 후, 하이드로겔로 처리된 마우스의 복부 표면의 상태 및 치유 정도(remesothelialization)를 평가하고 SEM을 통해 정상적인 건강한 마우스와 비교하였다.
<통계 분석>
결과는 평균 ± 표준 편차 (SD)로 표시하였으며, 실험적 특성화(동물 연구 제외)를 위해 각 그룹에 대해 4 개의 샘플이 고려되었다. 그래프 패드 프리즘 5를 사용하여 분산 분석 (ANOVA)을 수행 하였다. 데이터는 **P < 0.05; ***P<에서 통계적으로 유의 한 것으로 간주하였다.
<실험예>
1. 카르복실레이트 함량, TOCN의 결정화도 및 치환도
산화셀룰로오스 내의 카르복실레이트의 함량은 친수성, 세포독성 및 분해를 결정하는 주요 구조적 요소이다. TOCN은 셀룰로오스의 카르복실기 glucopyranose 유닛의 C6을 산화시켜 제조하였다. 반면, 셀룰로오스 물질의 결정도는 물리-기계적 및 화학적 특성에 중요한 역할을 한다. 예를들어, 결정도가 증가하면, 인장강도 및 밀도가 증가하며, 화학적 반응성 및 팽창 특성이 감소한다. TOCN의 측정된 카르복실기 함량은 1.5mmol/g이고, 결정도는 60.23 %이다.
치환도는(degree of substitution, DS)는 용해도 및 폴리머의 안정성을 제어한다. 일반적으로, DS가 1.3 내지 2.5 인 MC는 수용성인 반면, DS> 2.5를 갖는 MC는 유기 용매에 가용성이다.
본 발명에서 MC의 DS 값은 1.7이였으며, 따라서 수용성 열-겔 개발에 이용될 수 있다. 본 발명의 실시예에서 사용된 MC의 DS는 1.7로 측정되었다. 따라서 상기 MC는 물에 쉽게 용해되어 온도감응성(thermo-sensitive) 하이드로겔을 제조할 수 있다.
2. 시험관( In vitro) 내 세포 독성 분석
우수한 생체 재료의 개발의 전제조건은 우수한 생체 적합성이며, 직접 접촉시 세포에 안전해야한다. 그러나 간접적인 세포독성 방법으로는 이현상을 이해하기에 부족하다. 이러한 이유로 웰 플레이트 상에서 씨뿌린 섬유 아세포에 대한 하이드로겔의 직접 접촉에 의해 적합성을 평가하였다. MMC가 없는 모든 하이드로겔 그룹은 cTOCN 및 MC의 비 세포독성을 나타내는 뚜렷한 세포증식을 나타내었다(도 1A). 도 1A에서 확인할 수 있듯이, 배양 5 일 후 C1.5T1M0.4, C2.5T1M0.4 및 C3.5T1M0.4 하이드로 겔의 세포 독성을 보여 주었다. 또한, C1.5T1M0.2, C2.5T1M0.2 및 C3.5T1M0.2 하이드로겔 그룹은 14 일까지 명백하게 성장하였으며, 특히 C2.5T1M0.2는 안전 한계점 내에서 세포 적합성을 나타내었다(***P < 0.001).
다른 종류의 하이드로 겔에 대한 L929 세포의 성장 패턴은 공초점 이미지 분석하여 추가로 평가하였다(도 1B). 하이드로겔 표면에서 성장하는 세포 수의 유의한 차이를 발견하였으며 이는 WST 방법에 의해 결정된 생존력 결과와 일치하였다. Mitomycin C(MMC)는 섬유증 억제를 통한 세포 유착을 감소시키는 잠재적인 역할을 하는 항-대사물질 항생제이다. MMC는 DNA 나선의 구아닌 뉴클레오티드와 가교 결합할 수 있고, DNA 나선의 파도 및 기능에 의해 비특이적 섬유 아세포의 세포주기를 억제할 수 있는 DNA 알킬화제로 알려져있다(Ozerhan et al., 2016) (Urkan et al., 2017). 유착 방지 적용을 위해, 하이드로겔은 신속하고 통제되지 않는 증식을 허용하지 않으며 독성도 없어야 한다. 상기한 결과를 통해 C2.5T1M0.2 및 C3.5T1M0.2가 다른 하이드로겔에 비해 우수한 세포 적합성을 가지는 것을 확인하였다. 따라서, 약물에 로딩된 항-유착 하이드로겔의 적합한 후보를 찾기 위해 추가시험에서는 0.2 ㎍/100㎕ MMC가 로딩된 하이드로겔 (C1.5T1M0.2, C2.5T1M0.2, and C3.5T1M0.2)을 이용하였다.
3. 스펙트럼 분석
도 1C는 C1.5T1M0.2, C2.5T1M0.2 및 C3.5T1M0.2 하이드로겔의 화학 구조를 FI-IR을 통해 확인한 것이다.
상기 3개의 하이드로겔의 3417cm-1 및 2883cm-1에서의 피크는 MC 및 cTOCN의 존재를 나타내는 셀룰로오스 폴리머 CH3 그룹의 C-H 스트레칭 진동 및 COOH 그룹의 -OH 스트레칭 진동에 해당된다. 3417cm-1에서 -OH 피크가 넓어진 이유는 MMC 골격에서 발견되는 특징적인 N-H 그룹의 존재로 인해 MMC가 3 개의 하이드로 겔에 성공적으로 도입되었음을 나타낸다. 1152-1156cm-1의 피크는 모든 샘플에서 발견되는 C-H 링 스트레칭에 해당된다.
게다가, 1615 cm-1 에서의 흡수 밴드 변화는 MMC로드된 하이드로겔의 형성을 성공적으로 나타내는 다른 하이드로겔에서 cTOCN 및 MMC 사이의 아미드 I 결합 형성을 확인했다.
4. 형태학적 관찰
겔의 구조적인 특징은 적용 부위 근처의 조직기능에 직접적으로 영향을 미친다.
도 2A를 참조하면, C3.5T1M0.2 하이드로 겔은 조밀하고 단단한 다공성 구조를 보인 반면, C1.5T1M0.2는 더 크고 비교적 균일한 기공을 가진 스펀지와 같은 조직을 확인할 수 있다. 또한, 동결건조된 하이드로겔에서 MC 농도가 증가할수록 하이드로겔의 기공이 작아지는 것을 확인할 수 있다. 하이드로겔의 MMC는 C 및 O 피크와 별개로 질소 피크의 존재에 의해 EDXS에 기인한다. 게다가 C 및 O 피크의 점진적인 증가는 다른 하이드로겔에 비하여 C3.5T1M0.2 하이드로 겔에서 더 많은 양의 MC를 나타냈다. 일반적으로 다공성이 큰 구조의 경우 구조 전체에서 더 많은 양의 액체 또는 매체를 통과시킬 수 있는 장점이 있으며, 그 반대의 경우도 마찬가지이다.
5. 점도 평가
최적의 주입성을 위한 유착 방지 하이드로겔은 실온에서 도포하는 가능한 우수한 점도를 나타내어야 하며 가장 중요한 것은 유착 기간(3~14일) 동안 도포된 부위에 남아 있어야 한다.
도 2B에서 확인할 수 있듯이, 하이드로겔의 점도는 25℃에서 전단 속도가 증가함에 따라 증가하는 것을 확인할 수 있으며, 이 중 C3.5T1M0.2 하이드로 겔이 가장 높은 점도를 나타냈다. MC의 통합은 나노 셀룰로오스와 수소결합 형성을 촉진한다(도 8). 전단응력이 증가하면 약한 수소 결합이 끊어져 폴리머의 응집을 야시키며, 이러한 이유로 하이드로겔의 점도는 전단 속도가 증가함에 따라 증가한다. 그러나, C1.5T1M0.2 및 C2.5T1M0.2 하이드로겔은 큰 차이가 없었으며, 점도적인 측면에서 두 하이드로겔 모두 적합하지만 세포 적합성 면에서 C2.5T1M0.2가 더 바람직하다. 또한, C3.5T1M0.2와 같은 고점도 겔은 복강경 수술 중 주사기에서 겔을 제한하여 투여하여야 하므로 복잡성을 유발할 수 있어 바람직하지 못하다.
따라서, 전단 속도가 증가하더라도 적당한 점성을 갖는 하이드로겔이 바람직하다.
6. 기계적 강도의 결정
열 감응성 유착 방지 하이드로겔의 기계적 강도 부족은 조직 공학 응용에서 하이드로겔의 주요 한계 중 하나이다.
도 2C 및 도 2D는 상기 3가지 하이드로겔의 기계적 강도를 나타낸 것이다.
하이드로겔은 폴리머의 함량이 높아질수록 압축 탄성률이 향상되어 MC의 함량의 증가는 하이드로겔의 강도 향상에 기여한다는 것을 확인할 수 있다. 또한, 수소결합은 하이드로 겔의 기계적 강도에 직접적으로 영향을 줄 수 있는 요인이다. C3.5T1M0.2 내 다량의 MC는 수소 결합을 촉진하고 궁극적으로 다른 하이드로 겔에 비해 우수한 기계적 강도를 나타낸다.
기계적 안정성 또한 하이드로겔의 생분해성에 영향을 미치는데 인간의 경우 복부는 정상적인 복부 내압이 약 5-14 mmHg (667-1866 Pa)인 유압 시스템으로 작동한다. 본 발명 따른 하이드로겔은 높은 압축률을 유지하기에 충분히 견고하여 신체 내부의 움직이는 복부 표면에 적용하기에 적합하다.
도 2D는 하이드로겔의 스티프니스를 시각적 이미지로 나타낸 것이며, C2.5T1M0.2 하이드로겔은 C3.5T1M0.2 하이드로겔 처럼 너무 강하지도 않으며, C1.5T1M0.2 하이드로겔 처럼 너무 쉽게 부서지지도 않는 최적의 유연성을 나타내는 것을 확인할 수 있다.
7. 겔화 거동 관찰
주사 가능한 하이드로겔의 겔화는 수술 중 처리시간을 결정할 수 있기 때문에 중요하다. 투여 후 보호 장벽이 형성되고 부상 부위의 모양에 맞도록 겔화가 가능한한 빨리 일어나야 하며, 따라서, 하이드로겔의 겔화시간은 바이알 반전법에 의해 결정된 MC 농도비례하는 것을 확인할 수 있다(표 1 및 도 2E).
체온(37℃)에서 C2.5T1M0.2의 겔화시간은 36±4초 였으며, C3.5T1M0.2 하이드로 겔의 경우 가장 빠른(27±1s) 겔화 시간을 확인하였다. C1.5T1M0.2 하이드로 겔이 고체겔로 전환되는 데 가장 긴 시간(56±6초)의 겔화시간을 확인하였다. 이때 3 가지 하이드로겔은 1% cTOCN을 포함한다.
따라서 본 발명에서 열 감응성은 Methoxy가 치환된 MC 분자간의 소수성 상호 작용에 의해 결정된다.
저온 (4℃)에서 이러한 분자들은 수화되며, 폴리머와 폴리머 사이에 상호작용을 하며, 온도가 상승하면 물 분자가 염 이온으로 이동하여 폴리머는 점차적으로 수화수를 잃게 되며 결과적으로 하이드로겔이 고체 불투명한 젤로 형성되는 3차원 네트워크가 형성된다.
8. 시험관(In vitro)내 팽창 거동
하이드로겔은 물 또는 다양한 생물학적 유체를 흡수하고 보유할 수 있는 3차원 고분자 매트릭스 구성 요소이다. 따라서, 하이드로겔의 팽창 거동은 분해, 혈액 흡수 및 상처 부위의 일비물 및 약물 방출 패턴 등에 중요한 역할을 한다.
도 2F는 시간에 따른 팽창비를 나타낸 것이며, 하이드로겔에 MC를 첨가하면 팽창 현상이 감소하는 것을 확인할 수 있다.
하이드로겔의 팽창 거동은 주로 폴리머의 특성, 가교정도 및 다공성 등에 따라 변화된다. 일반적으로 큰 다공성 스캐폴드는 작은 다공성 스캐폴드에 비해 더 많은 약의 액체를 흡수할 수 있다.
SEM 이미지에서 확인할 수 있듯이, C3.5T1M0.2 하이드로 겔은 더 작은 기공을 가지며 24 시간 후 37 ℃에서 pH = 7.4의 PBS에서 더 낮은 팽창 거동을 나타낸다.
또한, MC의 함량 증가는 아미드와의 수소결합 형성을 증가시켜 cTOCN, MC 및 미토 마이신 C의 다당류 사슬 간의 분자 얽힘을 증가시키며, 그 결과 C3.5T1M0.2 하이드로겔 네트워크가 조밀해지며, 용매를 흡수할 수 있는 능력이 낮아지며 팽창 거동이 저하된다.
9. 시험관(In vitro)내 분해 분석
비생분해성 또는 유착 방지제의 신속한 제거를 위해 적합한 생분해성 시스템의 개발이 요구되고 있으며, 최적의 결과를 얻기 위해서는 수술 부위에 적용 후 14일 이내에 장벽 시스템을 저하시켜야 한다.
도 3A는 다양한 유형의 하이드로겔의 체외 정량적 분해 백분율을 나타낸 것이다.
14일 후 페트리 접시에서 C1.5T1M0.2 하이드로겔의 흔적은 발견되지 않았으며(96.54 ± 4.02 %), C2.5T1M0.2 하이드로 겔의 경우 서서히 분해되어 거의 설계된 시점(14 일에 89.47 ± 5.24 %) 내에 침식되었고, C3.5T1M0.2 하이드로 겔의 경우 SBF 세척에 내성이 있었으며 14 일 후에도 모양이 크게 바뀌지 않았다(21.25 ± 2.39 %).
분해 현상을 더 확인하기 위해 MC 겔 (MC1.5, MC2.5 및 MC3.5)과 MC 결합 TOCN 하이드로 겔(MC1.5TOCN1, MC2.5TOCN1 및 MC3.5TOCN1)도 확인하였다. 그 결과 하이드로겔에 나노 셀롤로우스(TOCN)을 첨가하면 MC 하이드로겔에 비해 분해속도가 감소하였다. 반면 수소결합을 통해 상호 작용하는 폴리머의 분해속가 느려졌다(도 8). 이러한 이유로 C3.5T1M0.2 하이드로 겔은 14 일 동안 최소한의 분해를 유지했습니다.
본 발명에서 하이드로겔은 가수분해되며, 분해성은 하이드로겔 MC 농도에 반비례함을 확인하였다.
또한, 하이드로겔의 세척 저항력은 기계적 강도에 의존한다. 따라서, C3.5T1M0.2 하이드로겔은 14 일 동안 세포를 증식시키는 데 적합한 지지력을 제공할 수 있다(도 1A 및 도1B).
10. 하이드로겔에서의 MMC 방출속도
유착 방지를 위해 약물 방출은 임계의 유착 기간(3~14일) 동안 제어할 수 있어야 한다. 도 3B를 참조하면, C1.5T1M0.2 하이드로겔이 하루동안 24.69 ± 3.4 % (0.5㎍/ml)의 미토 마이신을 방출하는 것을 확인할 수 있으며, C2.5T1M0.2 및 C3.5T1M0.2 하이드로겔은 각각 19.25±3.4% (0.39㎍/ml) 및 7.45±2.01%(0.15㎍/ml)를 방출하는 것을 확인할 수 있다. C1.5T1M0.2, C2.5T1M0.2 및 C3.5T1M0.2 하이드로겔의 5일째의 약물 방출은 방출 배지에서 각각 약 61%(1.22 ㎍/ml), 40%(0.8㎍/ml) 및 19.36%(0.38㎍/ml)으로 확인된다. 7일과 14일에서 C2.5T1M0.2 및 C3.5T1M0.2 하이드로겔로부터의 약물 방출은 C1.5T1M0.2 하이드로겔에 비해 훨씬 느려진 것을 확인하였다.
MC의 변형 및 약물 방출에 따른 영향을 확인하였으며, 도 3C를 참조하면, TOCN(EDC/NHC 사용없이)을 사용하여 제조된 하이드로겔의 미토 마이신 C 방출은 1일 내에 폭발적으로 방출하였으며, 방출 패턴은 pH, 분해, 약물의 로딩 정도 및 하이드로겔의 다공성에 따라 설명할 수 있다.
산성 PBS (pH 5.4)에서의 모든 하이드로겔은 장 생리학적 환경(pH 7.4)에서 보다 빠르게 분해되었으며, MMC는 산성 pH(pH <6)에서 빠르게 용해된다.
또한, 산성 pH에서 아미드 가교점은 셀룰로오스 구조의 카르복실기의 양성자화에 의해 파괴되고 고분자 사이에서 분자간 정전기 반발이 발생되어 하이드로겔은 팽창하고 최종적으로 약물방출이 폭발적으로 일어난다(S3).
본 발명의 하이드로겔 내의 MMC는 cTOCN와 공유결합하고 MC는 cTOCN 및 MMC와 수소결합에 의해 부착된다.
MC 함량이 증가하면, 수소 결합수가 많아지므로 분자간 결합 파손이 감소하고 pH 7.4에서 하이드로겔의 분해속도가 저하되며, 다공성이 높은 하이드로겔 일수록 액체 통과를 용이하게 하고 분해속도를 높일 수 있다.
이러한 이유로 C3.5T1M0.2 하이드로겔은 더 느린 방출 프로파일을 나타내었으며, C1.5T1M0.2 하이드로겔은 pH 7.4 환경에서 더 빠르게 나타났다.
본 발명에서 C2.5T1M0.2 하이드로겔은 수술 후 복막 유착의 위험을 감소시킬 수 있으며, MMC의 방출을 제어할 수 있다는 것을 확인할 수 있다. 그리고 7 일과 14 일에 MMC 방출은 cTOCN과 MMC 사이의 아미드 결합을 끊지 않고 하이드로 겔의 분해로 인해 저하되었다.
11. 유동학적 거동(열-감응성, 겔화) 및 주입성 관찰
도 3D 및 4A 및 4B를 참조하면, 최적화된 C2.5T1M0.2 하이드로겔은 온도, 시간에 따른 상전이(G'및 G”의 변화, 저장탄성률 및 손실탄성률의 변화) 및 우수한 주입성을 나타내는 것을 확인할 수 있다.
초기의 G'(저장 탄성률)는 온도에 따라 증가하고 37 ℃에 가까워졌으며, G' 및 G''(손실탄성률)는 서로 교차하여 초기 점성 액체에서 고체로의 전이가 발생했음을 확인할 수 있다. 해당 온도를 겔온도(T-Gel)로 정의된다.
도 4A에서 확인할 수 있듯이, G'와 G”는 30초에서 교차되었다.
본 발명에서는 C2.5T1M0.2 하이드로겔의 겔화시간은 37 ℃에서 30 초로 나타났으며, 이는 더 빠른 겔화를 제공함으로써 복강경에 적용할 수 있다. 겔은 상온(25 ℃)의 조건에서 주사기에 쉽게 압출되고 37 ℃에서 페트리 디쉬에 부착되어 뒤집어도 탈거되지 않고 안정적이였다.
따라서, C2.5T1M0.2 하이드로 겔은 적절한 주입 가능한 장벽이 될 수 있으며, 복강에서 안정적인 겔을 형성할 수 있음을 확인할 수 있다.
12. 생체 내 분석
12-1 하이드로겔의 생체 내 분해
도 4C는 유형별 하이드로겔의 시간에 따른 피하 분해를 나타낸 것이다.
주입하는 동안 모든 중합체는 안정적이고, 1 분 이내에 비-흐름 졸에서 겔로의 전환을 확인하였다. 질량 감소율은 시험관 분해 패턴과 일치하였으며, 증가된 겔의 강도는 가수분해 속도를 감소시켰다. 그 결과 C3.5T1M0.2는 14 일 동안 C2.5T1M0.2 및 C1.5T1M0.2 하이드로겔 보다 낮은 질량 감소를 나타냈다.
12-2. 생체 내(In vivo) 유착 방지 잠재력 평가
거즈, 칼날, 브러쉬 및 기타 도구로 복막을 연마하고 긁으면 상피 표면을 손상시켜 수술 후 유착을 형성하는 일련의 반응을 유발할 수 있다. 형성된 피브린 겔 매트릭스는 섬유 아세포, 기타 물질, 특히 콜라겐 등을 축적함으로써, 손상된 영역을 두꺼운 결합조직으로 전환시킨다. 이러한 이유로 콜라겐은 접착 형성에 있어 중요한 역할을 한다. 일반적으로 접착을 시작하는 데 3시간이 소요되며 복부 접착을 형성하는 데 3-7일 소요된다. 그러나, 유착 재발 위험은 수술 후 최대 14 일까지 지속되기 때문에, 유착 방지제는 도포 부위 내에서 14 일 동안 효과적인 장벽효과가 있어야 한다.
도 5A는 4개의 상이한 처리구에서 마우스의 복막 상태를 시간적 이미지로 나타낸 것이다.
음성대조군(장벽없음) 및 미토 마이신 C가 없는 하이드로겔(C2.5T1M0)로 처리된 그룹은 적용 7일 후 강한 접착을 나타내었다. 이 두 그룹의 경우 복막과 맹장 사이의 섬유 조직들의 가교에 의해 형성된 접착영역은 7일에 비해 14일에 더 치밀해진 것을 확인할 수 있다.
반면, 상용 하이드로겔 처리군은 복막 부위에 일부 하이드로겔 잔존물이 발견되었으나 7일째 접착력이 없었으며, 14일째에 강한 접착을 나타냈다. 이것은 잔존물이 섬유 아세포의 후속 이동역을 역할 때문이다(도 5A).
도 5A를 참조하면, 상용 하이드로겔은 1, 4-butanediol diglycidyl ether(BDDE)에 의해 가교된 히알루론산으로 구성되며, 수 불용성이고 투명 점탄성 겔로써 일반적으로 복부 영역에서 장기간 머무르며, 열 반응성 하이드로겔이 아니다. 또한, 하이드로겔의 장기간 머무름 시간은 안정성 및 효능 문제를 발생시킬 수 있으며, 변경된 지혈을 나타낼 수 있다.
도 5B 및 도 5C는 빈도 백분율(%), 7일 및 14 일에서의 유착 점수를 나타낸 것이다.
SCORE 5의 유착 빈도는 14 일 후 음성 대조군의 백분율보다 C2.5T1M0 하이드로겔로 처리된 마우스에서 더 높게 나타났으며, 양성 대조군의 경우 첫 주에 SCORE 5가 낮았으며, 둘째주에서는 하이드로겔 잔류물에 의한 접착력으로 인해 두드러졌다. 열 감응성 하이드로겔(C2.5T1M0, C2.5T1M0.2)을 투여한 모든 군은 30±3.45초 이내에 액상에서 고체의 불투명한 겔로 전환되었으며 C2.5T1M0.2 하이드로겔(미토 마이신 C 함유 하이드로겔)로 처리된 모든 동물에서 유착 방지 효과를 확인하였다.
도 3B를 참조하면, MMC의 가장 높은 방출은 5일에 달성되었으며, 본 발명에서 2ml의 C2.5T1M0.2 하이드로겔을 복막의 1x1cm2 영역에 처리하고, 방출 결과를 확인할 결과 C2.5T1M0.2 하이드로겔에서 방출된 MMC는 5 일째에 40%( 1.6μg/cm2를 의미하는 0.8μg/ml)로 확인되었다. 또한, 위암 및 췌장암의 환자의 경우, 2 μg/cm2 이상의 용량은 독성을 나타낼 수 있다. 적용 용량은 일반적으로 부상 7 일에 시작되는 상처 치유 캐스케이드에서 섬유 아세포의 초기 침습 및 증식 단계를 성공적으로 감소시켰으며, 이후 하이드로겔로부터 약물의 제어 방출은 조직의 정상적인 치유와 함께 유착을 방지할 수 있는 것을 확인하였다.
도 6A는 H&E 및 Masson의 조직 절편에 대한 삼색 염색으로 서로 다른 치료군의 수술 부위에서 재생된 콜라겐의 면적과 밀도를 나타낸 것이다.
C2.5T1M0 하이드로겔 처리군은 대조군보다 연구 기간 14 일 후에 맹장과 복벽 표면 사이에 날카로운 콜라겐 섬유(파란색 염색) 및 근육(빨간색 염색)을 보였다. 이러한 결과는 C2.5T1M0 하이드로겔이 세포와 호환되는 cTOCN 및 MC를 포함하고 있어, 섬유소 및 ECM의 침착을 위한 강력한 플랫폼을 제공할 수 있기 때문이며, 이것은 차례대로 콜라겐 및 근육 세포의 두꺼운 네트워크를 형성할 수 있다.
콜라겐 침착은 또한 실험 2 주 후에 동물 그룹에서 접착 형성을 확인한 상업적인 겔 처리 조직 영역에서 수득하였다(도 5A).
또한, 최적화된 하이드로겔(C2.5T1M0.2)을 처리한 마우스의 맹장 및 골격근의 콜라겐 침착 및 평활근을 확인하여 14 일째 복강 내부의 완전한 분해와 함께 접착되는 것을 확인하였다.
따라서, C2.5T1M0.2 하이드로겔은 외과적 개입 후 유착을 방지할뿐만 아니라 생체 내 적용 동안 시험관 내 분해 패턴을 유지할 수 있다.
본 발명의 하이드로겔은 MMC(Mitomycin C), MC(methyl cellulose) 및 cTOCN(modified TEMPO-oxidized cellulose nanofiber)을 결합하여 유착 방지 하이드로 겔을 제조할 수 있으며, MMC를 제외하면 유착 방지용 하이드로겔로 적합하지 않다.
TOCN(섬유의 폭 2-50nm)는 나노구조 구성, 넓은 표면적, 무독성 및 생분해성으로 인해 생물의학 및 조직 공학 분야에서 주목받고 있으며, 이상적으로 나노섬유인 TOCN은 하이드로겔에서 3D 환경을 보장하고 후속 세포 증식 및 분화를 촉진할 수 있으며, MC는 수용성 셀룰로오스 유도체로 약물 전달용 바인더, 수분 유지제 역할을 할 수 있다.
열_감응성 메틸 셀룰로오스 하이드로겔은 세포 적합성은 마우스의 전체 두께 피부 화상처 모델에서 상처 치유 능력을 잠재력을 확인함으로써 검증하였다.
따라서 MC 및 TOCN의 조합은 본 발명에서 시험관 내 세포 독성(C1.5T1M0, C2.5T1M0, C3.5T1M0 하이드로겔, 도 1A) 및 생체 내 동물 모델(C2.5T1M0)에서 얻은 결과에 세포에 적합할 수 있으며, 하이드로겔에 미토 마이신 C를 사용하는 이유는 항 종양, 항 유사 분열 효과 때문이다.
MMC는 DNA 나선의 구아닌 뉴클레오티드와 가교 결합할 수 있는 DNA 알킬화제이며, DNA 나선을 파괴하고 기능함으로써 비특이적 섬유 아세포 세포주기를 억제한다. 따라서 본 발명에 따른 C2.5T1M0.2 하이드로 겔은 섬유 아세포의 증식을 억제하여 항_유착효과를 갖는다.
12-3: 염증, 섬유증 및 혈관화 SCORE
도 6A는 음성 대조군, C2.5T1M0, C2.5T1M0.2 및 양성 대조군으로 처리된 복막 조직의 헤마톡실린-에오신(Hematoxylin-eosin) 염색 슬라이드는 흩어진 대식세포, 호중구 및 복부 근육계를 관통하는 혈관을 나타낸 것이다.
섬유 밴드와 접착은 섬유 아세포와 유사한 세포 및 모세 혈관을 포함하는 풍부한 세포 외 섬유질 매트릭스로 구성된 결합 조직에 의해 형성된다.
도 6A 및 표 3S에서 확인할 수 있듯이, C2.5T1M0.2 하이드로겔로 처리된 조직은 혈관화가 나타나지 않는다.
12-4. 실시간 RT-qPCR
상용 하이드로겔 처리군의 경우 실험 중 예상치 못한 유착이 발생되어 추가 생체 내 특성화에서는 제외하였다. 복막 손상 동안 상피 세포는 MMT cascades를 통해 근섬유 아세포로 빠르게 전환될 수 있다. 상기 근섬유 아세포는 피브로넥틴, 콜라겐 I 및 혈관 신생 인자와 같은 세포 외 기질 성분을 지속적으로 합성할 수 있다.
MMT(mesothelial to mesenchymal transition)는 상처 치유 단계에서 자동으로 제어되는 생리적 과정이다. 그러나 비정상적이고 과도한 상처 치유과정에서 이 조절 메커니즘은 정상 조직을 주변 기관 사이의 섬유 조직 밴드로 대체하여 조직 접착을 만드는 변경될 수 있다.
TNF-α는 염증, 아폽토시스, 면역 반응 및 기관 발달을 매개할 수 있는 다기능 전_염증성 사이토 카인이다. 주로 대식세포(고전적인 대식세포 (M1))에 의해 생성되지만 섬유 아세포 내피 및 상피 세포에서도 방출될 수 있다. 저농도의 TNF-α는 콜라겐과 glycosaminoglycan의 증식을 자극함으로써 섬유 아세포에서 성장 유도제로 작용할 수 있으며, 그 반대도 마찬가지이다. 높은 TNF-α는 혈관 신생과 관련된 반대 신호 경로를 유발하여 세포 사멸 또는 세포 생존 및 증식을 유발할 수 있다.
도 6B를 참조하면, MMC 그룹에서 음성 대조군 (p <0.001), 약물 처리되지 않은 하이드로 겔 그룹 (p <0.001)에 비해 피브로넥틴 유전자 발현이 유의하게 감소한 것을 확인할 수 있으며, 도 6B 및 도 7A를 참조하면, MMC 적용(p <0.001)으로 인한 TNF-α 유전자의 높은 세포 사멸 유도는 14 일 후 피브로넥틴의 하향 조절되는 것을 확인할 수 있다.
12-5. 생체 내 급성 독성 분석 및 재상피화
MMC는 조직 손상을 유발하고 정상적인 상처 치유를 방해 할 수 있는 항_종양 항생제이며, MMC는 주로 간에서의 대사에 의해 제거되지만 대사는 특히 폐, 신장뿐만 아니라 다른 조직에서도 발생할 수 있다.
C2.5T1M0.2 하이드로 겔의 세포 독성 부족은 14 일간의 연구 기간 후 처리된 마우스의 대사 기관을 확인하고 정상적인 마우스의 기관과 비교하여 분석하였다.
도 7B를 참조하면, 하이드로겔 처리된 마우스의 대사 기관 H & E 염색 표본에서 두드러진 이상이 없음을 확인하였으며, 복부 표면 형태는 C2.5T1M0.2 하이드로겔 투여 후 치유 패턴을 찾기 위해 SEM에 의해 분석하였다.
SEM 이미지는 복벽의 점진적인 치유를 보여 주었으며, 이는 긁힌 표면에서 Remesothelialization이 발생하여 궁극적으로 치유된다.
도 7C에서는 실험 14 일 후 C2.5T1M0.2 처리에 의해 치유된 복벽이 정상 마우스의 복벽과 유사한 것을 확인할 수 있으며(도 7D), 무독성 및 치유 평가를 통해 유착 방지 응용 분야에 열 감응성 하이드로겔(최적화된 C2.5T1M0.2)의 안정성을 확인하였다.

Claims (7)

  1. 변형된 템포-산화매개-나노셀룰로오스(Modified tempo oxidized nanocellulose), 메틸 셀룰로오스(Methyl cellulose) 및 미토 마이신 C(Mitomycin C)를 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계;
    상기 혼합물을 교반하는 단계 및
    상기 교반된 혼합물에 염화나트륨을 첨가하여 겔화시키는 단계를 포함하는,
    미토 마이신 C 방출 제어기능을 갖는 유착방지용 온도감응형 셀룰로오스 기반 하이드로겔의 제조방법으로서,
    상기 변형된 템포-산화매개-나노셀룰로오스는 템포-산화매개-나노셀룰로오스 현탁액을 유리 페트리에 붓고 37℃의 인큐베이터에서 6시간 보관하여 매트릭스를 형성시키는 과정,
    상기 매트릭스에 N-(3디메틸아미노프로필)-N-에틸 카르보디이드 하이드로클로라이드((N-(3Dimethylaminopropyl)-N-ethyl carbodiimide hydrochloride) 및 N-하이드록시-숙신이미드(N-hydroxy-succinimide) 용액을 투입하고 4℃ 온도에서 6시간 동안 배양하는 과정,
    상기 배양된 매트릭스를 세척하는 과정 및
    상기 세척된 매트릭스를 분쇄하는 과정으로 제조되는 것이고,
    상기 하이드로겔은 체외에서는 졸(sol) 상태이고, 체내에서는 겔(gel) 상태로 전환되는 것인,
    미토 마이신 C 방출 제어기능을 갖는 유착방지용 온도감응형 셀룰로오스 기반 하이드로겔의 제조방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서,
    상기 템포-산화매개-나노셀룰로오스(Tempo-oxidized nanocellulose)는 침엽수 표백 크라프트 펄프로부터 수득된 것을 특징으로 하는,
    미토 마이신 C 방출 제어기능을 갖는 유착방지용 온도감응형 셀룰로오스 기반 하이드로겔의 제조방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 혼합물을 제조하는 단계는,
    상기 변형된 템포-산화매개-나노셀룰로오스 및 메틸 셀룰로오스를 1:1.5~3.5 중량비로 혼합하고,
    상기 미토 마이신 C는 0~0.4 ㎍/100㎕를 포함하는 것을 특징으로 하는,
    미토 마이신 C 방출 제어기능을 갖는 유착방지용 온도감응형 셀룰로오스 기반 하이드로겔의 제조방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 교반하는 단계는,
    상기 혼합물을 80~90 ℃의 온도에서 15~25 분 동안 교반하는 것을 특징으로 하는,
    미토 마이신 C 방출 제어기능을 갖는 유착방지용 온도감응형 셀룰로오스 기반 하이드로겔의 제조방법.
  7. 제1항 및 제4항내지 제6항 중 어느 한 항의 제조방법에 의해 제조된 미토 마이신 C 방출 제어기능을 갖는 유착방지용 온도감응형 셀룰로오스 기반 하이드로겔.
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