JP2019042527A - カチオン化キトサンを含有する医薬 - Google Patents

Abstract

【課題】硫酸化グリコサミノグリカンが有する出血活性を抑制する技術、硫酸化グリコサミノグリカンを利用しつつこれに起因する出血の問題がなく、かつ優れた生体組織治療効果を発揮しうる素材、医療材料、医薬を提供することを課題とする。【解決手段】本発明は、カチオン化キトサンを有効成分とする、硫酸化グリコサミノグリカンに由来する出血活性の抑制剤に関する。【選択図】図１

Description

本発明は、カチオン化キトサンの新規な用途に関する。

特許文献１には、キトサンをヘパリンやヘパラン硫酸などの多糖と組合せた皮膚創傷治療剤、この治療剤における多糖はイオン結合によってキトサンに固定化されること、この治療が散剤、軟膏、ペースト、ゲル、懸濁液、溶液またはフィルムの形態で提供されることなどが記載されている。しかしこの文献には、キトサンにカチオン基が導入されている「カチオン化キトサン」を用いることや、カチオン化キトサンが硫酸化グリコサミノグリカンに由来する出血活性を抑制することなどの記載も示唆もない。

一方、カチオン化キトサンは、毛髪化粧料（特許文献２）、木材保存剤（特許文献３）、金属材料の耐食性を向上させるための下地処理剤（特許文献４）、電子部品ケース用包材（特許文献５）、抗菌性繊維（特許文献６）などに用いられることが知られている。またこれを免疫アジュバントに用いることも知られている（特許文献７）。しかしこれらいずれの文献にも、カチオン化キトサンが硫酸化グリコサミノグリカンに由来する出血活性を抑制することや、カチオン化キトサンと硫酸化グリコサミノグリカンとからなる複合体を有効成分として生体組織治療用の医薬に用いることなどの記載も示唆もない。

また、コンドロイチン硫酸Ｂ（デルマタン硫酸）、コンドロイチン硫酸Ｅ、ケラタン硫酸低分子化物などの創傷治療用途がそれぞれ特許文献８〜１０に記載されている。しかし、いずれの文献にもカチオン化キトサンを用いることや、これらの硫酸化グリコサミノグリカンとカチオン化キトサンとの複合体を有効成分として生体組織治療用の医薬に用いることなどの記載も示唆もない。また本明細書の参考例に示す通り、カチオン化キトサン単独では創傷治癒を促進する効果はみられなかった。

特表平１０−５０２６６５号公報 特許第４６３２０４０号公報 特許第２５６４４６６号公報 特許第４０８１２７６号公報 特許第５０１００９７号公報 特開２０００−２１９６０５号公報 国際公開第２００９／０１３９７２号 特開２００１−１８７７４０号公報 特開２００４−１８３９０号公報 国際公開第９６／０１６９７３号

特許文献１ではイン・ビボでの評価がなされておらず、本発明者らがイン・ビボで追試したところ、後述のとおりこの剤を創傷部位に適用すると大量に出血し、実用に耐えないことが判明した。
本発明は、硫酸化グリコサミノグリカンが有する出血活性を抑制する技術、硫酸化グリコサミノグリカンを利用しつつこれに起因する出血の問題がなく、かつ優れた生体組織治療効果を発揮しうる素材、医療材料、医薬を提供することを課題とする。

本発明者は上記課題を解決すべく鋭意検討したところ、カチオン化キトサンが硫酸化グリコサミノグリカンに由来する出血活性を抑制し、また、カチオン化キトサンと硫酸化グリコサミノグリカンとからなる複合体を製造しこれを生体に適用したところ、出血活性が顕著に抑制され、かつ優れた生体組織治療効果が発揮されることを見出し、本発明を完成した。

すなわち上記課題は、以下に例示する本発明によって解決される。
[１]カチオン化キトサンを有効成分とする、硫酸化グリコサミノグリカンに由来する出血活性の抑制剤（以下、「本発明抑制剤」という。）。このカチオン化キトサンは、４級アンモニウム基を有することが好ましい。この硫酸化グリコサミノグリカンは、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸、コンドロイチン硫酸又は硫酸化ヒアルロン酸であることが好ましい。
[２]カチオン化キトサンと硫酸化グリコサミノグリカンとからなる複合体（以下「本発明複合体」という。）。この両者はイオン結合していることが好ましい。
[３]本発明複合体を含有する創傷被覆材（以下「本発明被覆材」という。）。
[４]本発明複合体を有効成分とする、生体組織治療用の医薬（以下「本発明医薬」という。）。本発明医薬は、創傷治療剤であることが好ましい。

本発明抑制剤は、硫酸化グリコサミノグリカンに由来する生体組織治療効果を維持しながら、出血活性を顕著に抑制することができ、極めて有用である。
本発明被覆材は、優れた創傷被覆特性を有し、生体適合性も高く、しかも簡単かつ衛生的に除去することができ、極めて有用である。また本発明被覆材及び本発明医薬ともに、硫酸化グリコサミノグリカンに由来する出血を顕著に抑制しつつ、優れた生体組織治療効果を発揮することから極めて有用である。
本発明複合体は、このような本発明被覆材や本発明医薬の素材とすることができることから、極めて有用である。

キトサンと各種硫酸化グリコサミノグリカンとの複合体、又はカチオン化キトサンと各種硫酸化グリコサミノグリカンとの複合体を用いた場合の出血の様子を示す（写真）。 キトサンと各種硫酸化グリコサミノグリカンとの複合体、又はカチオン化キトサンと各種硫酸化グリコサミノグリカンとの混合物（複合体）を用いた場合の出血評価を示す。Ｈｅｐ／ＣＴをＨｅｐ／ＣＴ⁺とすることにより、出血、および失血による死亡率が軽減した。また、ＣＳＥ／ＣＴをＣＳＥ／ＣＴ⁺とすることにより、出血が完全に抑制された。 カチオン化キトサンと各種硫酸化グリコサミノグリカンとの複合体の生体組織修復効果を示す。Ｈｅｐ／ＣＴ⁺、ＣＳＥ／ＣＴ⁺、ＣＳＥ／ＣＴで処置した創傷で治癒の促進がみられた。Ｈｅｐ／ＣＴは動物死亡のため、評価できなかった。 カチオン化キトサンと各種硫酸化グリコサミノグリカンとの複合体の生体組織修復効果を示す。Ｈｅｐ／ＣＴ⁺、ＣＳ−Ａ／ＣＴ⁺、ＣＳ−Ｂ／ＣＴ⁺、ＣＳ−Ｃ／ＣＴ⁺、ＣＳ−Ｄ／ＣＴ⁺、ＣＳ−Ｅ／ＣＴ⁺、ＫＰＳ／ＣＴ⁺において顕著な出血はなく、創傷治癒の促進がみられた。 カチオン化キトサンの創傷治癒効果を示す。ＣＴ⁺単独では創傷治癒の促進効果は得られず、むしろ治癒が遅延していた（創部からの出血はみられなかった）。

本明細書において使用する略語は以下の通りである。
ＣＴ⁺：カチオン化キトサン
Ｈｅｐ／ＣＴ：キトサンとヘパリンとの複合体
Ｈｅｐ／ＣＴ⁺：カチオン化キトサンとヘパリンとの複合体
ＣＳ−Ｅ／ＣＴ：キトサンとコンドロイチン硫酸Ｅとの複合体
ＣＳ−Ｅ／ＣＴ⁺：カチオン化キトサンとコンドロイチン硫酸Ｅとの複合体
ＣＳ−Ａ／ＣＴ⁺：カチオン化キトサンとコンドロイチン硫酸Ａとの複合体
ＣＳ−Ｂ／ＣＴ⁺：カチオン化キトサンとコンドロイチン硫酸Ｂとの複合体
ＣＳ−Ｃ／ＣＴ⁺：カチオン化キトサンとコンドロイチン硫酸Ｃとの複合体
ＣＳ−Ｄ／ＣＴ⁺：カチオン化キトサンとコンドロイチン硫酸Ｄとの複合体
ＫＰＳ／ＣＴ⁺ ：カチオン化キトサンとケラタンポリ硫酸との複合体
[１]本発明抑制剤
本発明抑制剤は、カチオン化キトサンを有効成分とする、硫酸化グリコサミノグリカンに由来する出血活性の抑制剤である。
本発明抑制剤の有効成分であるカチオン化キトサンは、キトサン分子中に正の電荷を有しているものであれば特に限定されない。例えば、キトサンに正の電荷を与えるよう、正電荷を有した官能基を導入したものでもよい。正電荷を有した官能基の導入は、例えばキトサン分子中のアミノ基や水酸基に１級、２級もしくは３級のアミノ基、または、４級アンモニウム基を導入すること、又はキトサン分子中のアミノ基における水素原子を炭化水素基で置換して２級もしくは３級のアミノ基、または、４級アンモニウム基とすることによって行うことができる。例えば、エチレンジアミンやスペルミジン等を導入することによって正電荷を有したキトサンが得られる。共有結合によって導入する場合、その方法は、化学的な反応によって共有結合が形成されるものであれば特に限定されない。
なお、２級もしくは３級のアミノ基、または、４級アンモニウム基は、特に限定されない。すなわち、硫酸化グリコサミノグリカンに由来する出血活性の抑制効果を発揮し得るように、硫酸化グリコサミノグリカンとの複合体が維持されるものであればよい。硫酸化グリコサミノグリカンに由来する出血活性の抑制効果については、本明細書の実施例に記載の方法により、確認することができる。例えば、２級もしくは３級のアミノ基、または、４級アンモニウム基における炭化水素基としては、炭素数１〜４の直鎖又は分岐状のアルキル基、炭素数２〜４の直鎖又は分岐状のアルケニル基、炭素数２〜４の直鎖又は分岐状のアルキニル基、炭素数６〜１０のアリール基等の炭化水素基を挙げることができる。
本発明には、これらの１種類又は２種以上のカチオン化キトサンを組み合わせて、用いることができる。

例えば、４級アンモニウム基の導入により、永続的に正電荷を有したキトサン（第４級キトサン）を得ることができる。「永続的に正電荷を有する」とは、例えば周囲のｐＨによる影響を受けず、正電荷を有することであり得る。第４級キトサンとしては、キトサン分子に第４級アルキルアンモニウム基が共有結合したものや、キトサン分子中のアミノ基にアルキルハライド等を作用させ、このアミノ基を４級化したものを例示することができる。第４級アルキルアンモニウム基の導入は、例えばグリシジルトリメチルアンモニウムクロリドや、グリシジルトリエチルアンモニウムクロリドなどを反応させることによって行うことができる。またキトサン分子中のアミノ基の４級化は、ヨードメタン等を反応させることによって行うことができる。このような第４級キトサンとしては、例えば、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）−３−トリメチルアンモニウムキトサンクロリドや、（Ｎ, Ｎ, Ｎ）−トリメチルキトサンクロリドなどを挙げることができる。

このようなカチオン化キトサンは、市販されているものをそのまま用いてもよく、またキトサンを原料としてそれ自体公知の方法で製造することができる。例えば、前記のＮ−（２−ヒドロキシプロピル）−３−トリメチルアンモニウムキトサンクロリドであれば、Biomaterials 24, 2003, 5015、Carbohydrate Research 339, 2004, 313、Coloration Te
chnology 120, 2004, 108、Colloids and Surfaces A：Physicochemical Engineering Aspects 242, 2004, 1、Polymer Journal 32, 2000, 334、International Journal of Biological Macromolecules 34, 2004, 121−126などに記載されている方法で製造することができる。また（Ｎ, Ｎ, Ｎ）−トリメチルキトサンクロリドであれば、Carbohydrate Polymers 5,1985, 297、International Journal of Biological Macromolecules 8, 1986, 105、Carbohydrate Polymers 24, 1994, 209、Carbohydrate Polymers 36, 1998, 157、Drug Development and Industrial Pharmacy 27, 2001, 373などに記載されている方法で製造することができる。

キトサンからカチオン化キトサンを製造する場合、その原料とすることができるキトサンの見かけ粘度も特に限定されず、例えば０．５％酢酸水溶液を溶媒として０．５ｗ／ｖ％の溶液としたときに、２，０００ｍＰａ・ｓ 以下のものを例示することができ、好ましくは１，０００ｍＰａ・ｓ以下のものを例示することができる。

このようなカチオン化キトサンをそのまま、又は必要に応じこれに本発明の効果を損なわない他の成分を適宜配合することによって、本発明抑制剤を製造することができる。また本発明抑制剤の剤形も特に限定されず、所望の形態のものとすることができる。
このようにして製造された本発明抑制剤は、硫酸化グリコサミノグリカンに由来する出血活性を抑制するために用いられる。

本発明抑制剤によって出血活性が抑制される硫酸化グリコサミノグリカンは、硫酸基を保持しているグリコサミノグリカンである限りにおいて特に限定されない。硫酸化グリコサミノグリカンとしては、例えばヘパリン、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸、コンドロイチン硫酸、硫酸化ヒアルロン酸などが例示できる。
これらのなかでも、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸又はコンドロイチン硫酸が好ましい。ケラタン硫酸としては、ケラタンポリ硫酸が好ましい。本発明には、これらの１種類又は２種以上を組み合わせて、用いることができる。
またコンドロイチン硫酸としては、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｂ（デルマタン硫酸ともいう。）、コンドロイチン硫酸Ｃ、コンドロイチン硫酸Ｄ、コンドロイチン硫酸Ｅ、過硫酸化コンドロイチン硫酸を例示することができる。
これらの硫酸化グリコサミノグリカンのなかでも、ヘパリン又はコンドロイチン硫酸Ｅが好ましい。
硫酸化グリコサミノグリカンの重量平均分子量も特に限定されないが、通常５００〜１０，０００，０００程度のもの、好ましくは１，０００〜８，０００，０００程度のものを例示することができる。

これらの硫酸化グリコサミノグリカンは、天然のものであっても、合成されたものであってもよい。これらの硫酸化グリコサミノグリカンは、いずれも市販されているか、その製造方法は公知であり、容易に入手することができる。

硫酸化グリコサミノグリカンの出血活性を抑制するためには、本発明抑制剤を、当該硫酸化グリコサミノグリカンと接触させればよい。この接触は、本発明抑制剤中のカチオン化キトサン分子が、当該硫酸化グリコサミノグリカン分子に接触することとなる態様である限りにおいて特に限定されない。例えば各々の溶液を製造し、この両者を混合する態様が例示できる。あるいは、硫酸化グリコサミノグリカンが存在する、治療が必要な生体組織において、カチオン化キトサンを適用する態様でもよい。例えばこのような接触を十分に行うことによって、カチオン化キトサン分子と硫酸化グリコサミノグリカン分子との間にイオン結合を形成させることが好ましい。なかでも、両分子のポリイオンコンプレックスを形成させることが好ましい。
この本発明抑制剤によって、硫酸化グリコサミノグリカンが有する創傷治癒活性を維持
したまま、硫酸化グリコサミノグリカンが有する出血活性を抑制することができる。

[２]本発明複合体
本発明複合体は、カチオン化キトサンと硫酸化グリコサミノグリカンとからなる複合体である。この複合体を構成するカチオン化キトサン、硫酸化グリコサミノグリカンは、前記の「本発明抑制剤」において説明されたものと同じである。
この複合体は、カチオン化キトサンを、硫酸化グリコサミノグリカンと接触させることにより製造することができる。この接触は、カチオン化キトサン分子が、硫酸化グリコサミノグリカン分子に接触し、複合体を形成することとなる態様である限りにおいて特に限定されない。例えば各々の溶液、好ましくは水溶液を製造し、この両者を混合して直接複合体を形成させてもよく、またこの両者を塩の存在下で接触させた後、この塩を透析その他の方法で除去することによって両者の複合体を形成する態様が例示できる。なお、混合手法、条件等は、カチオン化キトサンと硫酸化グリコサミノグリカンとからなる複合体が形成し得る範囲で、適宜調整され得る。具体的には、本明細書の実施例に記載の方法を参照することができる。このような方法により、両分子間にイオン結合が形成され、ポリイオンコンプレックスを形成させることができる。本発明複合体は、上記のように製造された後、単離、乾燥、精製等を行ってもよい。
この複合体におけるカチオン化キトサンと硫酸化グリコサミノグリカンとの構成比も限定されず、例えば１：０．００１〜１：１０００（モル比）程度を例示することができる。
このように製造された本発明複合体は、以下に説明する本発明被覆材や、本発明医薬の素材として利用することができる。

[３]本発明被覆材
本発明被覆材は、本発明複合体を含有する創傷被覆材である。本発明被覆材に含有される本発明複合体を構成する分子（カチオン化キトサン、硫酸化グリコサミノグリカン）や、複合体におけるカチオン化キトサン分子と硫酸化グリコサミノグリカン分子間の好ましい結合態様などは、前記の「本発明複合体」における説明のとおりである。この本発明複合体をそのまま、又は必要に応じこれに本発明の効果を損なわない他の成分、例えば医薬上許容可能な担体等を適宜配合することによって、本発明被覆材とすることができる。

本発明被覆材の形態は、創傷部位を被覆できる限りにおいて限定されず、所望の形態に応じて公知の方法で製造することができる。例えば、本発明複合体が溶液、懸濁液、ゲルの形態で提供される場合には、そのまま溶液、懸濁液、ゲル形態の本発明被覆材とすることができる。また例えば、溶液、懸濁液、ゲル形態で提供された本発明複合体を凍結乾燥等の方法で乾燥させることによって得られる乾燥物の形態で本発明被覆材としてもよい。本発明複合体を、通常の創傷被覆材と組み合わせて、本発明被覆材としてもよい。加工・成形なども公知の方法を採用することができる。
本発明被覆材の形状としては、その他、粉末状、顆粒状、シート状、スポンジ状、メッシュ状などを挙げることができる。また軟膏、ペースト、ゲルなどの形状を例示することもできる。
このようにして製造された本発明被覆材で創傷部位を被覆すると、硫酸化グリコサミノグリカンの創傷治癒活性が維持されたまま、硫酸化グリコサミノグリカンの出血活性が抑制されることから、創傷部位からの出血を抑制しつつ創傷治癒を促進することができる。

[４]本発明医薬
本発明医薬は、本発明複合体を有効成分とする生体組織治療用医薬である。本発明医薬の有効成分である本発明複合体を構成する分子（カチオン化キトサン、硫酸化グリコサミノグリカン）や、複合体におけるカチオン化キトサン分子と硫酸化グリコサミノグリカン分子間の好ましい結合態様などは、前記の「本発明複合体」における説明のとおりである
。この本発明複合体をそのまま、又は必要に応じこれに本発明の効果を損なわない他の成分を適宜配合することによって、本発明医薬とすることができる。
本発明医薬が適用される対象は、生体組織の治療が必要な動物である限りにおいて特に限定されないが、哺乳類が好ましく、なかでもヒトが好ましい。
本発明医薬が適用される生体組織は、治療、組織修復などが必要な生体組織である限りにおいて特に限定されず、例えば皮膚、臓器、骨などを例示することができる。なかでも、生体組織中に血管が多く存在し出血リスクの高い、皮膚や臓器に適用されることが好ましく、皮膚に適用されることが好ましい。また、生体組織において治療、組織修復などが必要な状態も特に限定されないが、創傷、潰瘍などを挙げることができる。なかでも創傷に適用されることが好ましい。すなわち、本発明医薬は創傷治療剤であることが好ましく、皮膚の創傷治療剤であることがより好ましい。

創傷に適用する場合、受傷の原因も特に限定されず、急性創傷や慢性創傷の治療に使用することができる。創傷の種類としては、切創、裂創、割創、擦過傷、挫滅創、挫創、挫傷、銃創、爆傷、刺創、杙創、咬創、熱傷、凍傷、化学熱傷、手術創、褥瘡、潰瘍、自然発生的に生じた創傷等を例示することができる。

本発明医薬の使用方法は、本発明医薬が、生体組織における治療や組織修復などが必要とされている部位において治療効果を発揮する態様である限り特に限定されない。例えば直接当該部位（例えば、創傷の場合には創傷部位）に適用する方法が例示できる。このような適用方法としては、例えば、当該部位を本発明医薬で被覆する方法が例示できる。被覆する場合の方法としては、例えば、貼付、塗布、散布その他の方法を例示することができる。
本発明医薬の剤形も、本発明医薬の使用方法に応じて、公知の種々の剤形のなかから当業者が適宜選択することができる。例えば、前記の本発明被覆材と同様に、本発明医薬の有効成分である本発明複合体の溶液や懸濁液の形態での本発明医薬としてもよく、これを凍結乾燥等の方法で乾燥させることによって得られる乾燥物の形態で適宜成形して、本発明医薬としてもよい。前記の本発明被覆材を、そのまま本発明医薬として転用することもできる。
本発明医薬は、生体組織に１回適用するのみでもよく、適用後必要に応じて追加、交換、除去などをしてもよい。また継続的に適用してもよい。

以下、本発明を実施例により具体的に詳説する。しかしながら、これにより本発明の技術的範囲が限定されるものではない。

＜実施例１＞カチオン化キトサンの製造
（１）キトサン
キトサンは、市販のもの（和光純薬工業株式会社製、ＣＴ３００、フレーク状、０．５％酢酸水溶液を溶媒として濃度０．５ｗ／ｖ％としたときの見かけ粘度２５７ｍＰａ・ｓ）を使用した。

（２）微粒子化キトサンの製造
カチオン化キトサンを製造する原料として、特開平９−１４３２０３号公報に記載の方法にしたがって微粒子化キトサンを製造した。具体的には、上記キトサン１０．０ｇにイオン交換水６００ｍＬを添加し、次いで酢酸１０ｍＬを添加した。室温で撹拌して溶解させた後、この溶液をグラスフィルターでろ過した。ろ液に対して硫酸アンモニウム２０．０ ｇを添加し、撹拌して混合することによってキトサンの微粒子を析出させた。
析出が完了した時点で、酢酸を中和するため、５Ｍ ＮａＯＨをｐＨが８〜９程度となるまで添加した。その後、溶媒から、析出した微粒子化キトサンをグラスフィルターで分
離した。分離した微粒子化キトサンを含水エタノールで洗浄することによって、これに含まれる塩類を除去した。この洗浄を数回繰り返した後、微粒子化キトサンに付着した水分をアセトンで洗浄することによって除去した。その後、４０℃、減圧下で乾燥させることによって、微粒子化キトサン９．８ｇ（粉末状）を得た。

（３）カチオン化キトサンの製造
前記の特許文献３に記載の方法にしたがって、カチオン化キトサンを製造した。具体的には、上記（２）で得た微粒子化キトサン９．０ｇに、８０ｖ／ｖ％イソプロピルアルコール１５０ｍＬを添加し、６０℃で撹拌した。その後、グリシジルトリメチルアンモニウムクロリド（阪本薬品工業株式会社製：ＳＹ−ＧＴＡ８０）を９．０ｍＬ添加し、６０℃で７時間撹拌して反応させた。反応終了後、反応溶媒から、反応物をグラスフィルターで分離した。分離した反応物を、２０倍量のエタノール、アセトンで洗浄した。その後、反応物を４０℃、減圧下で乾燥させることによって、カチオン化キトサン（第４級キトサンである、Ｎ−(２−ヒドロキシプロピル)−３−トリメチルアンモニウムキトサンクロリド）１４．２ ｇを得た。

＜実施例２＞カチオン化キトサンと硫酸化グリコサミノグリカンとからなる複合体の製造（１）カチオン化キトサンとヘパリンとからなる複合体の製造
カチオン化キトサンと、硫酸化グリコサミノグリカンの一種であるヘパリン（和光純薬工業株式会社製、重量平均分子量約１０，０００）とからなる複合体（Ｈｅｐ／ＣＴ⁺）を製造した。具体的には、実施例１（３）で製造したカチオン化キトサン２２０ｍｇと、ヘパリン１５０ｍｇとを、５．０ ｗ／ｖ％塩化ナトリウム溶液８ｍＬに同時に溶解し、両成分が均一化するまで十分混合した。この混合液をテフロン（登録商標）で表面加工された型に流し込み、混合液が十分に平滑化するまで静置した。次いで、この混合液を型ごと多量のイオン交換水中に投入し、混合液とイオン交換水の接触面から脱塩透析（２０時間程度）することで、カチオン化キトサンとヘパリンとの複合体（カチオン化キトサン分子とヘパリン分子とがイオン結合したポリイオンコンプレックス）を形成させ、成形されたゲルを得た。このゲルはいずれも白色状であった。さらにこのゲルを凍結乾燥することで、スポンジ状の乾燥物を得た。この乾燥物はいずれも白色であった。得られた乾燥物の重量は、約２７０ｍｇであった。

（２）カチオン化キトサンと他の硫酸化グリコサミノグリカンとからなる複合体の製造
上記（１）におけるヘパリンに替え、他の硫酸化グリコサミノグリカン（コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｂ（デルマタン硫酸）、コンドロイチン硫酸Ｃ、コンドロイチン硫酸Ｄ、コンドロイチン硫酸Ｅ、ケラタンポリ硫酸。いずれも生化学工業株式会社製、重量平均分子量はそれぞれ約１０，０００；約３０，０００；約４０，０００；約３０，０００；約７０，０００；約１０，０００）を用いて、上記（１）と同様に、カチオン化キトサンと硫酸化グリコサミノグリカンとからなる複合体（両分子がイオン結合したポリイオンコンプレックス）を製造し、スポンジ状の乾燥物を得た。得られた乾燥物の重量は、コンドロイチン硫酸Ａとの複合体（ＣＳ−Ａ／ＣＴ⁺）、コンドロイチン硫酸Ｂとの複合体（ＣＳ−Ｂ／ＣＴ⁺）、コンドロイチン硫酸Ｃとの複合体（ＣＳ−Ｃ／ＣＴ⁺）、コンドロイチン硫酸Ｅとの複合体（ＣＳ−Ｅ／ＣＴ⁺）およびケラタンポリ硫酸との複合体（ＫＰＳ／ＣＴ⁺）がいずれも約３１０ｍｇ、コンドロイチン硫酸Ｄとの複合体（ＣＳ−Ｄ／ＣＴ⁺）が約３００ｍｇであった。

＜実施例３＞創傷被覆材、生体組織治療用医薬の製造
実施例２で製造した、カチオン化キトサンと硫酸化グリコサミノグリカンとからなる複合体の乾燥物を約１ｃｍ²に切断して、後述の実施例４に用いた。

＜参考例１＞対照物質の製造
（１）スポンジ状のキトサンの調製
前記特許文献１に記載の方法に準じ、以下のとおりスポンジ状のキトサンを得た。
キトサンを２．０ｖ／ｖ％ 酢酸水溶液に添加し、十分に撹拌して、２ｗ／ｖ％のキトサン溶液を調製した。
上記キトサン溶液の１０．００ｇ（キトサンを２００ｍｇ含有）を、ポリプロピレン製シャーレ（直径：８５ｍｍ）に流延し、キトサン溶液が十分平滑化するまで静置した。次いで、キトサン溶液を凍結後、凍結状態のキトサン溶液に２Ｍ ＮａＯＨ（１０ｍＬ）を添加して、室温下で約３時間静置した。溶液が白色ゲル状となったことを確認後、このゲルをシャーレの底面から剥離して、ゲル全体を２Ｍ ＮａＯＨ溶液に浸漬させ、室温下で４日間静置した。次いでこの白色のゲルの表面をイオン交換水で洗浄後、ゲルを多量のイオン交換水に浸漬し、マグネチックスターラー（６００ｒｐｍ）でイオン交換水を攪拌して、余剰のＮａＯＨを除去した。この操作は、イオン交換水のｐＨが中性付近で安定化するまで数回繰り返した（最終ｐＨ ６．５）。その後、この白色のゲルを凍結乾燥して、スポンジ状のキトサンを得た。この重量は１８０ｍｇであった。

（２）キトサンと硫酸化グリコサミノグリカンとからなる複合体の製造
ヘパリン１０６７ｍｇを０．２Ｍ リン酸緩衝液２２０ｍｌ（ｐＨ ６．４）に溶解し、ヘパリン溶液（ｐＨ ６．６）を調製した。
このヘパリン溶液２０ｍｌ（Ｈｅｐ ９７ｍｇを含有）を前記のスポンジ状のキトサンと混合し、室温下で約２４時間静置した。その後この混合物を取り出し、イオン交換水で洗浄後、ゲルを多量のイオン交換水に浸漬し、マグネチックスターラー（６００ｒｐｍ）でイオン交換水を攪拌して、余剰のヘパリンおよびリン酸無機塩類を除去した。この操作は、イオン交換水の導電率が十分に低下して安定するまで繰り返し行った。この最終的な導電率は１００μＳ／ｃｍであった。洗浄後の混合物を凍結乾燥し、キトサンとヘパリンとからなる複合体（Ｈｅｐ／ＣＴ）のスポンジ状の乾燥物を得た。この重量は約２５０ｍｇであった。
またヘパリンに替えてコンドロイチン硫酸Ｅを用い、同様に、キトサンとコンドロイチン硫酸Ｅとからなる複合体（ＣＳ−Ｅ／ＣＴ）のスポンジ状の乾燥物を得た。この重量は約２４０ｍｇであった。
これらそれぞれの乾燥物を約１ｃｍ²に切断して、後述の実施例４に用いた。

＜実施例４＞薬効薬理試験
（１）全層皮膚欠損創モデルの作成
７〜１０週齢の雄性Ｗｉｓｔａｒ（Ｃｒｌｊ：ＷＩ）ラット、またはＳｐｒａｇｕｅ‐Ｄａｗｌｅｙ （ＳＤ）ラットの背部を除毛し、約１ｃｍ²の範囲をメスで切開することで、全層皮膚（表皮層、真皮層、皮下組織）を欠く、全層欠損創を作成した。この全層欠損創モデルは、組織修復を評価するモデルとして一般的であり、広く用いられている。この全層欠損創部分（以下「患部」という。）に被験物質を貼付し、フィルムドレッシング材（テガダーム）と伸縮性包帯で固定した。
また被験物質を貼付せず、フィルムドレッシング材と伸縮性包帯のみで処置したものを対照（Ｃｏｎｔｒｏｌ）とした。

（２）出血の評価
患部に被験物質を貼付した翌日に、患部を写真撮影するとともに、肉眼的に観察し、創部からあふれる程度の出血がみられたものを「＋＋」、滲む程度の出血がみられたものを「＋」、出血がみられなかったものを「−」として、各被験物質による出血性を評価した。
被験物質として、参考例１で製造したＨｅｐ／ＣＴ、ＣＳ−Ｅ／ＣＴ、および実施例３で製造したＨｅｐ／ＣＴ⁺、ＣＳ−Ｅ／ＣＴ⁺を用いた結果を図１（写真）及び図２に示す。
その結果、Ｈｅｐ／ＣＴ（前記特許文献１に記載のものに相当）を貼付した場合、１２箇所中１２箇所で出血が「＋＋」であり、被験物質を貼付した翌日に全ての動物が死亡した。
これに対し、Ｈｅｐ／ＣＴ⁺を貼付した場合には、顕著な出血（＋＋）はなく、「＋」が３箇所、「−」が９箇所で、死亡例もみられなかった。
また、他の硫酸化グリコサミノグリカンであるコンドロイチン硫酸Ｅを用いた場合についても、ＣＳ−Ｅ／ＣＴを貼付した患部では１２箇所中「＋＋」が０箇所、「＋」が６箇所、「−」が６箇所というように、約半数の患部に出血が見られたものの、ＣＳ−Ｅ／ＣＴ⁺を貼付した患部では８箇所中８箇所が「−」となり、明らかに出血を抑制した。
以上の結果から、カチオン化キトサンを用いることにより、硫酸化グリコサミノグリカンに起因する出血活性を顕著に抑制できることが示された。また、カチオン化キトサンと硫酸化グリコサミノグリカンとからなる複合体、これを含有する創傷被覆材及びこれを有効成分とする生体組織治療用医薬には、出血抑制効果があることも示された。またこれらカチオン化キトサン、複合体、創傷被覆材、生体治療用医薬を用いることで死亡例もみられなくなったことから、生体組織に対し安全に使用できることも確認された。

（３）生体組織修復促進効果の評価
患部への被験物質の貼付後７日目に表皮伸展の程度（表皮面積）を計測した。表皮伸展は全層皮膚欠損創の評価において一般的に用いられるものであり、組織修復の程度を反映する評価指標である。表皮面積は、作成した全層欠損創の辺縁から中央部に向かって伸びた表皮の部分を透明シートにトレースし、画像解析ソフトで面積を数値化することにより計測した。
まず、試験例で製造したＨｅｐ／ＣＴ、ＣＳ−Ｅ／ＣＴと、実施例３で製造したＨｅｐ／ＣＴ⁺、ＣＳ−Ｅ／ＣＴ⁺を用いて評価した。結果を図３に示す。
Ｈｅｐ／ＣＴ（前記特許文献１に記載のものに相当）を投与した動物については、前記（２）に記載のとおり被験物質投与の翌日に全て死亡したため、表皮面積を測定することができなかった。
Ｃｏｎｔｒｏｌにおける表皮面積は２０±９．４（ＳＤ）ｍｍ²であったのに対し、Ｈｅｐ／ＣＴ⁺では３９．３±８．６（ＳＤ）ｍｍ²、ＣＳ−Ｅ／ＣＴ⁺では３４．９±６．２（ＳＤ）ｍｍ²と、いずれも有意な表皮面積の増加が認められた。またＣＳ−Ｅ／ＣＴは前記のとおり出血が見られたが、組織修復の点では３０．９±１０．１（ＳＤ）ｍｍ²と有意な表皮面積の増加がみられた。
以上の結果から、カチオン化キトサンを用いても硫酸化グリコサミノグリカンが有する生体組織の修復（創傷治癒）促進効果は何ら損なわれないことが示された。このように、カチオン化キトサンと硫酸化グリコサミノグリカンとからなる複合体、これを含有する創傷被覆材及びこれを有効成分とする生体組織治療用医薬は、出血を抑制しつつ、優れた生体組織修復（創傷治癒）促進効果を発揮することが示された。

また、実施例３で製造したカチオン化キトサンと硫酸化グリコサミノグリカンとからなる各種複合体（Ｈｅｐ／ＣＴ⁺、ＣＳ−Ａ／ＣＴ⁺、ＣＳ−Ｂ／ＣＴ⁺、ＣＳ−Ｃ／ＣＴ⁺、ＣＳ−Ｄ／ＣＴ⁺、ＣＳ−Ｅ／ＣＴ⁺、ＫＰＳ／ＣＴ⁺）についても、同様に生体組織修復効果を評価した。全層欠損創全体の面積に対する表皮面積の割合（％）を算出し、表皮面積率とした。結果を図４に示す。
表皮面積率は、Ｃｏｎｔｒｏｌが２０．０±５．３（ＳＤ）％であったのに対して、Ｈｅｐ／ＣＴ⁺は５１．５±１４．３（ＳＤ）％、ＣＳ−Ａ／ＣＴ⁺は４９．４±７．３（ＳＤ）％、ＣＳ−Ｂ／ＣＴ⁺は５７．１±１０．８（ＳＤ）％、ＣＳ−Ｃ／ＣＴ⁺は２９．２±７．７（ＳＤ）％、ＣＳ−Ｄ／ＣＴ⁺は３８．１±１１．６（ＳＤ）％、ＣＳ−Ｅ／ＣＴ⁺は４７．６±１１．４（ＳＤ）％、ＫＰＳ／ＣＴ⁺は４８．８±７．０（ＳＤ）％であり、いずれも顕著な表皮面積率の増加が確認された。
これらの試験において、患部からの出血、死亡例は確認されなかった。
以上の結果からも、カチオン化キトサンを用いても硫酸化グリコサミノグリカンが有する生体組織の修復（創傷治癒）促進効果は何ら損なわれないことが示された。またカチオン化キトサンと硫酸化グリコサミノグリカンとからなる複合体、これを含有する創傷被覆材及びこれを有効成分とする生体組織治療用医薬は、出血を抑制しつつ、優れた生体組織修復（創傷治癒）促進効果を発揮することが示された。

＜参考例２＞カチオン化キトサンスポンジの製造
（１）カチオン化キトサンの製造
前記の特許文献３に記載の方法にしたがって、カチオン化キトサンを製造した。具体的には、実施例１と同様の方法で製造した微粒子化キトサン７．５ｇに、８０ｖ／ｖ％イソプロピルアルコール１０５ｍＬを添加し、６０℃で撹拌した。その後、グリシジルトリメチルアンモニウムクロリド（アルドリッチ社製）を１０．５ｍＬ添加し、６０℃で７時間撹拌して反応させた。反応終了後、反応溶媒から、反応物をグラスフィルターで分離した。分離した反応物を、２０倍量のエタノール、アセトンで洗浄した。その後、反応物を４０℃、減圧下で乾燥させることによって、カチオン化キトサン（第４級キトサンである、Ｎ−(２−ヒドロキシプロピル)−３−トリメチルアンモニウムキトサンクロリド）１２．５ｇを得た。

（２）カチオン化キトサンスポンジの製造
上記（１）で製造した、カチオン化キトサン２５０ｍｇを注射用水８ｍLに均一に溶解し、得られた溶液を凍結乾燥することにより、スポンジ状の乾燥物を得た。この乾燥物は白色であり重量は約２４０ｍｇであった。この乾燥物を適宜切断して、後述の参考例３に用いた。

＜参考例３＞薬効薬理試験
（１）熱傷創モデルの作成
１０週齢の雄性Ｓｐｒａｇｕｅ‐Ｄａｗｌｅｙ （ＳＤ）ラットの腹部を除毛し、約７ｃｍ²の範囲に１００℃の熱湯を３秒間処置した。熱傷処置の３日後に処置部の壊死組織を除去して皮膚欠損創を作成した。この熱傷創モデルは組織修復を評価するモデルとして一般的であり、広く用いられている。この熱傷創部分に被験物質を貼付し、フィルムドレッシング材（テガダーム）と伸縮性包帯で固定した。また被験物質を貼付せず、フィルムドレッシング材と伸縮性包帯のみで処置したものを対照（Ｃｏｎｔｒｏｌ）とした。
被験物質の貼付後１０日目に表皮伸展の程度（表皮面積、表皮面積率）を計測した。表皮伸展は全層皮膚欠損創の評価において一般的に用いられるものであり、組織修復の程度を反映する評価指標である。表皮面積は、作成した欠損創の辺縁から中央部に向かって伸びた表皮の面積を透明シートにトレースし、画像解析ソフトで面積を数値化することにより計測した。表皮面積率は、創全体の面積に対する表皮で覆われた部分の面積の割合（％）として算出した。

（２）熱傷創の生体組織修復効果の評価
Ｃｏｎｔｒｏｌに対して、ＣＴ⁺が創傷治癒効果を示すか評価した。
表皮面積率は、Ｃｏｎｔｒｏｌでは１７．９±３．２（ＳＤ）％であったのに対して、カチオン化キトサン（ＣＴ⁺）単独では２．０±１．３（ＳＤ）％と有意な低下がみられた（図５）。

以上の結果から、ＣＴ⁺は単独では創傷治癒効果を発揮せず、むしろ治癒遅延を起こすことが示された。硫酸化グリコサミノグリカンは出血リスクのために創傷治癒には適応できず、ＣＴ⁺は創傷治癒を遅延するために創傷治癒には適応できない。本発明では、この両者を組み合わせることにより出血リスクを抑制し、さらに創傷治癒の促進効果を発揮することが示された。

本発明は、医薬等に応用することができる。

日本国特許出願２０１３−１６８３２４号（出願日：２０１３年８月１３日）の開示はその全体が参照により本明細書に取り込まれる。
本明細書に記載された全ての文献、特許出願、及び技術規格は、個々の文献、特許出願、及び技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書に参照により取り込まれる。

本明細書において使用する略語は以下の通りである。
ＣＴ⁺：カチオン化キトサン
Ｈｅｐ／ＣＴ：キトサンとヘパリンとの複合体
Ｈｅｐ／ＣＴ⁺：カチオン化キトサンとヘパリンとの複合体
ＣＳ−Ｅ／ＣＴ：キトサンとコンドロイチン硫酸Ｅとの複合体
ＣＳ−Ｅ／ＣＴ⁺：カチオン化キトサンとコンドロイチン硫酸Ｅとの複合体
ＣＳ−Ａ／ＣＴ⁺：カチオン化キトサンとコンドロイチン硫酸Ａとの複合体
ＣＳ−Ｂ／ＣＴ⁺：カチオン化キトサンとコンドロイチン硫酸Ｂとの複合体
ＣＳ−Ｃ／ＣＴ⁺：カチオン化キトサンとコンドロイチン硫酸Ｃとの複合体
ＣＳ−Ｄ／ＣＴ⁺：カチオン化キトサンとコンドロイチン硫酸Ｄとの複合体
ＫＰＳ／ＣＴ⁺ ：カチオン化キトサンとケラタンポリ硫酸との複合体
[１]本発明抑制剤
本発明抑制剤は、カチオン化キトサンを有効成分とする、硫酸化グリコサミノグリカンに由来する出血活性の抑制剤である。
本発明抑制剤の有効成分であるカチオン化キトサンは、キトサン分子中に正の電荷を有しているものであれば特に限定されない。例えば、キトサンに正の電荷を与えるよう、正電荷を有した官能基を導入したものでもよい。正電荷を有した官能基の導入は、例えばキトサン分子中のアミノ基や水酸基に１級、２級もしくは３級のアミノ基、または、４級アンモニウム基を導入することによって行うことができる。例えば、エチレンジアミンやスペルミジン等を導入することによって正電荷を有したキトサンが得られる。共有結合によって導入する場合、その方法は、化学的な反応によって共有結合が形成されるものであれば特に限定されない。
なお、２級もしくは３級のアミノ基、または、４級アンモニウム基は、特に限定されない。すなわち、硫酸化グリコサミノグリカンに由来する出血活性の抑制効果を発揮し得るように、硫酸化グリコサミノグリカンとの複合体が維持されるものであればよい。硫酸化グリコサミノグリカンに由来する出血活性の抑制効果については、本明細書の実施例に記載の方法により、確認することができる。例えば、２級もしくは３級のアミノ基、または、４級アンモニウム基における炭化水素基としては、炭素数１〜４の直鎖又は分岐状のアルキル基、炭素数２〜４の直鎖又は分岐状のアルケニル基、炭素数２〜４の直鎖又は分岐状のアルキニル基、炭素数６〜１０のアリール基等の炭化水素基を挙げることができる。
本発明には、これらの１種類又は２種以上のカチオン化キトサンを組み合わせて、用いることができる。

例えば、４級アンモニウム基の導入により、永続的に正電荷を有したキトサン（第４級キトサン）を得ることができる。「永続的に正電荷を有する」とは、例えば周囲のｐＨによる影響を受けず、正電荷を有することであり得る。第４級キトサンとしては、キトサン分子に第４級アルキルアンモニウム基が共有結合したものを例示することができる。第４級アルキルアンモニウム基の導入は、例えばグリシジルトリメチルアンモニウムクロリドや、グリシジルトリエチルアンモニウムクロリドなどを反応させることによって行うことができる。このような第４級キトサンとしては、例えば、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）−３−トリメチルアンモニウムキトサンクロリドを挙げることができる。

このようなカチオン化キトサンは、市販されているものをそのまま用いてもよく、またキトサンを原料としてそれ自体公知の方法で製造することができる。例えば、前記のＮ−（２−ヒドロキシプロピル）−３−トリメチルアンモニウムキトサンクロリドであれば、Biomaterials 24, 2003, 5015、Carbohydrate Research 339, 2004, 313、Coloration Technology 120, 2004, 108、Colloids and Surfaces A：Physicochemical Engineering Aspects 242, 2004, 1、Polymer Journal 32, 2000, 334、International Journal of Biological Macromolecules 34, 2004, 121−126などに記載されている方法で製造することができる。

Claims (6)

1. カチオン化キトサンと硫酸化グリコサミノグリカンとの複合体を含有する創傷被覆材であって、
   前記カチオン化キトサンは、キトサン分子中のアミノ基に、２級もしくは３級アミノ基、または４級アンモニウム基が共有結合したキトサン分子である、創傷被覆材。
2. 前記カチオン化キトサンが、キトサン分子中のアミノ基に４級アルキルアンモニウム基が共有結合したキトサン分子である、請求項１に記載の創傷被覆材。
3. 前記硫酸化グリコサミノグリカンが、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸、コンドロイチン硫酸または硫酸化ヒアルロン酸である、請求項１または２に記載の創傷被覆材。
4. カチオン化キトサンと硫酸化グリコサミノグリカンとの複合体を含有する創傷治療剤であって、
   前記カチオン化キトサンは、キトサン分子中のアミノ基に２級もしくは３級アミノ基、または４級アンモニウム基が共有結合したキトサン分子である、創傷治療剤。
5. 前記カチオン化キトサンが、キトサン分子中のアミノ基に４級アルキルアンモニウム基が共有結合したキトサン分子である、請求項４に記載の創傷治療剤。
6. 前記硫酸化グリコサミノグリカンが、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸、コンドロイチン硫酸または硫酸化ヒアルロン酸である、請求項４または５に記載の創傷治療剤。