CN105451745A

CN105451745A - 含有阳离子化壳聚糖的药物

Info

Publication number: CN105451745A
Application number: CN201480045360.1A
Authority: CN
Inventors: 太田直树; 宗村裕一; 大塚昭
Original assignee: Seikagaku Corp
Current assignee: Seikagaku Corp
Priority date: 2013-08-13
Filing date: 2014-08-07
Publication date: 2016-03-30
Anticipated expiration: 2034-08-07
Also published as: CN105451745B; US20160193244A1; US20180318334A1; JP2019042527A; JPWO2015022907A1; EP3034085A1; EP3034085B1; JP6437916B2; EP3034085A4; WO2015022907A1

Abstract

本发明的课题在于提供：抑制硫酸化糖胺聚糖所具有的出血活性的技术；以及利用硫酸化糖胺聚糖而不会造成由此引起的出血问题并且可发挥优异的生物体组织治疗效果的原材料、医疗材料、药物。本发明涉及一种以阳离子化壳聚糖作为有效成分的抑制来自硫酸化糖胺聚糖的出血活性的抑制剂。

Description

含有阳离子化壳聚糖的药物

技术领域

本发明涉及阳离子化壳聚糖的新型用途。

背景技术

专利文献1中记载了：将壳聚糖与肝素、硫酸乙酰肝素等多糖组合而成的皮肤创伤治疗剂；该治疗剂中的多糖通过离子键被固定化于壳聚糖；该治疗以散剂、软膏、糊剂、凝胶、悬浊液、溶液或薄膜的形态提供等。然而，该文献中对于使用了对壳聚糖导入了阳离子基团的“阳离子化壳聚糖”；阳离子化壳聚糖抑制来自硫酸化糖胺聚糖的出血活性等既没有记载也没有启示。

另一方面，已知阳离子化壳聚糖用于毛发化妆品(专利文献2)、木材保存剂(专利文献3)、用于提高金属材料的耐腐蚀性的基底处理剂(专利文献4)、电子部件盒用包装材料(专利文献5)、抗菌性纤维(专利文献6)等。另外，还可知将其用于免疫佐剂(专利文献7)。然而，在这些文献中均没有记载也没有启示阳离子化壳聚糖抑制来自硫酸化糖胺聚糖的出血活性；以由阳离子化壳聚糖与硫酸化糖胺聚糖形成的复合体作为有效成分用于生物体组织治疗用的药物等。

另外，硫酸软骨素B(硫酸皮肤素)、硫酸软骨素E、硫酸角质素低分子化合物等的创伤治疗用途分别记载于专利文献8～10中。然而，这些文献中对于使用阳离子化壳聚糖；以由这些硫酸化糖胺聚糖与阳离子化壳聚糖形成的复合体作为有效成分用于生物体组织治疗的药物等均没有记载也没有启示。另外，如本说明书的参考例所示，单独用阳离子化壳聚糖时未发现促进创伤愈合的效果。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特表平10-502665号公报

专利文献2：日本专利第4632040号公报

专利文献3：日本专利第2564466号公报

专利文献4：日本专利第4081276号公报

专利文献5：日本专利第5010097号公报

专利文献6：日本特开2000-219605号公报

专利文献7：国际公开第2009/013972号

专利文献8：日本特开2001-187740号公报

专利文献9：日本特开2004-18390号公报

专利文献10：国际公开第96/016973号

发明内容

发明要解决的问题

专利文献1中没有进行体内(invivo)的评价，本发明人等在体内进行了追加试验的结果发现，如下所述该试剂用于创伤部位时大量出血，不适合实际使用。

本发明的课题在于提供：抑制硫酸化糖胺聚糖所具有的出血活性的技术；以及利用硫酸化糖胺聚糖而不会造成由此引起的出血问题并且能够发挥优异的生物体组织治疗效果的原材料、医疗材料、药物。

本发明人为了解决上述问题而进行了广泛研究，结果发现，阳离子化壳聚糖抑制来自硫酸化糖胺聚糖的出血活性，而且在制造由阳离子化壳聚糖与硫酸化糖胺聚糖形成的复合体并将其应用于生物体后，显著地抑制了出血活性并且发挥了优异的生物体组织治疗效果，从而完成了本发明。

用于解决问题的方案

即，上述课题通过下述示例的本发明而得以解決。

[1]一种抑制剂，其为以阳离子化壳聚糖作为有效成分的、抑制来自硫酸化糖胺聚糖的出血活性的抑制剂(以下称为“本发明抑制剂”。)。该阳离子化壳聚糖优选具有季铵基。该硫酸化糖胺聚糖优选为肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸角质素、硫酸软骨素或硫酸化透明质酸。

[2]一种复合体，其为由阳离子化壳聚糖与硫酸化糖胺聚糖形成的复合体(以下称为“本发明复合体”。)。这两者优选进行离子结合。

[3]一种创伤覆盖材料(以下称为“本发明覆盖材料”。)，其含有本发明复合体。

[4]一种生物体组织治疗用的药物(以下称为“本发明药物”。)，其以本发明复合体作为有效成分。本发明药物优选为创伤治疗剂。

发明的效果

本发明抑制剂在维持来自硫酸化糖胺聚糖的生物体组织治疗效果的同时，能够显著地抑制出血活性，是极为有用的。

本发明覆盖材料具有优异的伤口覆盖特性、生物相容性也高而且能够简单、卫生地去除，是极为有用的。另外，本发明覆盖材料及本发明药物均显著地抑制由硫酸化糖胺聚糖引起的出血并且可发挥优异的生物体组织治疗效果，所以是极为有用的。

本发明复合体能够制成为这样的本发明覆盖材料、本发明药物的原材料，所以是极为有用的。

需要说明的是，本说明书中使用的简写如下所述。

CT⁺：阳离子化壳聚糖

Hep/CT：由壳聚糖与肝素形成的复合体

Hep/CT⁺：由阳离子化壳聚糖与肝素形成的复合体

CS-E/CT：由壳聚糖与硫酸软骨素E形成的复合体

CS-E/CT⁺：由阳离子化壳聚糖与硫酸软骨素E形成的复合体

CS-A/CT⁺：由阳离子化壳聚糖与硫酸软骨素A形成的复合体

CS-B/CT⁺：由阳离子化壳聚糖与硫酸软骨素B形成的复合体

CS-C/CT⁺：由阳离子化壳聚糖与硫酸软骨素C形成的复合体

CS-D/CT⁺：由阳离子化壳聚糖与硫酸软骨素D形成的复合体

KPS/CT⁺：由阳离子化壳聚糖与多硫酸角质素形成的复合体

附图说明

图1表示使用了由壳聚糖与各种硫酸化糖胺聚糖形成的复合体、或者由阳离子化壳聚糖与各种硫酸化糖胺聚糖形成的复合体时的出血情况(照片)。

图2表示使用了由壳聚糖与各种硫酸化糖胺聚糖形成的复合体、或者由阳离子化壳聚糖与各种硫酸化糖胺聚糖形成的混合物(复合体)时的出血评价。通过将Hep/CT制成Hep/CT⁺，从而降低了出血或失血导致的死亡率。另外，通过将CSE/CT制成CSE/CT⁺，从而完全抑制了出血。

图3表示由阳离子化壳聚糖与各种硫酸化糖胺聚糖形成的复合体的生物体组织修复效果。发现用Hep/CT⁺、CSE/CT⁺、CSE/CT处理过的创伤促进了愈合。Hep/CT由于动物死亡，所以没有进行评价。

图4表示由阳离子化壳聚糖与各种硫酸化糖胺聚糖形成的复合体的生物体组织修复效果。发现Hep/CT⁺、CS-A/CT⁺、CS-B/CT⁺、CS-C/CT⁺、CS-D/CT⁺、CS-E/CT⁺、KPS/CT⁺促进了创伤治疗而没有显著的出血。

图5表示阳离子化壳聚糖的创伤愈合效果。仅CT⁺时未能获得创伤愈合的促进效果，反而延迟了愈合(未发现创部的出血)。

具体实施方式

[1]本发明抑制剂

本发明抑制剂是以阳离子化壳聚糖作为有效成分的、抑制来自硫酸化糖胺聚糖的出血活性的抑制剂。

作为本发明抑制剂的有效成分的阳离子化壳聚糖只要是在壳聚糖分子中具有正电荷的物质则没有特别限定。例如，可以导入具有正电荷的官能团以对壳聚糖赋予正电荷。关于具有正电荷的官能团的导入，例如可通过下述方式进行：向壳聚糖分子中的氨基、羟基中导入伯氨基、仲氨基、叔氨基或季铵基；或者用烃基取代壳聚糖分子中的氨基中的氢原子而成为仲氨基、叔氨基或季铵基。例如，通过导入乙二胺、亚精胺等而得到具有正电荷的壳聚糖。通过共价键进行导入时，该方法只要是通过化学反应可形成共价键则没有特别限定。

需要说明的是，对于仲氨基、叔氨基或季铵基没有特别限定。即，为了能够发挥抑制来自硫酸化糖胺聚糖的出血活性的效果，只要是能够维持与硫酸化糖胺聚糖的复合体的物质即可。关于来自硫酸化糖胺聚糖的出血活性的抑制效果，可根据本说明书的实施例所述的方法进行确认。例如，作为仲氨基、叔氨基或季铵基中的烃基，可举出：碳原子数为1～4的直链或支链状的烷基；碳原子数为2～4的直链或支链状的烯基；碳原子数为2～4的直链或支链状的炔基；碳原子数为6～10的芳基等烃基。

本发明中可以组合使用这些中的1种或2种以上的阳离子化壳聚糖。

例如，通过导入季铵基能够获得永久具有正电荷的壳聚糖(壳聚糖季铵盐)。“永久具有正电荷”是指例如可不受周围的pH的影响而具有正电荷。作为壳聚糖季铵盐，可示例出季烷铵基与壳聚糖分子共价结合的物质；使卤代烃等作用于壳聚糖分子中的氨基而使该氨基季铵化而成的物质。关于季烷铵基的导入，例如可通过使失水甘油基三甲基氯化铵、失水甘油基三乙基氯化铵等反应来进行。另外，关于壳聚糖分子中的氨基的季铵化，可通过使碘甲烷等反应来进行。作为这样的壳聚糖季铵盐，例如可举出N-(2-羟丙基)-3-三甲基壳聚糖氯化铵；(N,N,N)-三甲基壳聚糖盐酸盐等。

这样的阳离子化壳聚糖可直接使用市售的物质，还可将壳聚糖作为原料利用本身已知的方法来制造。例如，如为上述的N-(2-羟丙基)-3-三甲基壳聚糖氯化铵，可利用Biomaterials24,2003,5015、CarbohydrateResearch339,2004,313、ColorationTechnology120,2004,108、ColloidsandSurfacesA:PhysicochemicalEngineeringAspects242,2004,1、PolymerJournal32,2000,334、InternationalJournalofBiologicalMacromolecules34,2004,121-126等所记载的方法制造。另外，如为(N,N,N)-三甲基壳聚糖盐酸盐，可利用CarbohydratePolymers5,1985,297、InternationalJournalofBiologicalMacromolecules8,1986,105、CarbohydratePolymers24,1994,209、CarbohydratePolymers36,1998,157、DrugDevelopmentandIndustrialPharmacy27,2001,373等所记载的方法制造。

由壳聚糖制造阳离子化壳聚糖时，对于可作为其原料的壳聚糖的表观粘度也没有特别限定，例如在将0.5％乙酸水溶液作为溶剂制成0.5w/v％的溶液时，可示例出2000mPa·s以下的物质，可示例出优选为1000mPa·s以下的物质。

可以用这样的阳离子化壳聚糖直接制造本发明抑制剂，或根据需要适宜配合不损害本发明的效果的其它成分而制造本发明抑制剂。另外，对于本发明抑制剂的剂型也没有特别限定，可制成所期望的形态。

以此方式制造的本发明抑制剂用于抑制来自硫酸化糖胺聚糖的出血活性。

关于通过本发明抑制剂出血活性得到抑制的硫酸化糖胺聚糖，只要其为具有硫酸基的糖胺聚糖则没有特别限定。作为硫酸化糖胺聚糖，例如可示例出肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸角质素、硫酸软骨素、硫酸化透明质酸等。

在这些中优选肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸角质素或硫酸软骨素。作为硫酸角质素优选多硫酸角质素。本发明中可以组合使用这些中的1种或2种以上。

另外，作为硫酸软骨素，可示例出硫酸软骨素A、硫酸软骨素B(也称为硫酸皮肤素。)、硫酸软骨素C、硫酸软骨素D、硫酸软骨素E、过硫酸化硫酸软骨素。

在这些硫酸化糖胺聚糖中，优选肝素或硫酸软骨素E。

对于硫酸化糖胺聚糖的重均分子量也没有特别限定，可示例出通常为500～10000000左右的，优选为1000～8000000左右的。

这些硫酸化糖胺聚糖既可是天然的物质，也可是合成的物质。这些硫酸化糖胺聚糖均有市售，它的制造方法是已知的且可以容易获得。

为了抑制硫酸化糖胺聚糖的出血活性，只要使本发明抑制剂与该硫酸化糖胺聚糖接触即可。关于该接触，只要是本发明抑制剂中的阳离子化壳聚糖分子与该硫酸化糖胺聚糖分子接触的方式则没有特别限定。例如可示例出制造各自的溶液并对这两者进行混合的方式。或者也可为对存在硫酸化糖胺聚糖的、需要治疗的生物体组织施用阳离子化壳聚糖的方式。优选例如通过充分地进行这样的接触，从而使阳离子化壳聚糖分子与硫酸化糖胺聚糖分子之间形成离子键。其中优选形成两分子的聚离子复合物。

通过该本发明抑制剂，在维持硫酸化糖胺聚糖所具有的创伤愈合活性的同时，能够抑制硫酸化糖胺聚糖所具有的出血活性。

[2]本发明复合体

本发明复合体是由阳离子化壳聚糖与硫酸化糖胺聚糖形成的复合体。构成该复合体的阳离子化壳聚糖、硫酸化糖胺聚糖与上述“本发明抑制剂”中说明的物质相同。

该复合体可以通过使阳离子化壳聚糖与硫酸化糖胺聚糖接触来制造。关于该接触，只要是阳离子化壳聚糖分子与硫酸化糖胺聚糖分子接触形成复合体的方式则没有特别限定。例如可示例出：既可制成各自的溶液优选为水溶液并将这两者混合而直接形成复合体；或通过使这两者在盐存在下接触后，用透析等方法去除该盐，从而形成两者的复合体的方式。需要说明的是，可以在能够形成由阳离子化壳聚糖与硫酸化糖胺聚糖形成的复合体的范围内适宜调节混合方法、条件等。具体可参照本说明书的实施例中所述的方法。根据这样的方法，能够在两分之间形成离子键而形成聚离子复合物。如上所述制造本发明复合体后也可进行分离、干燥、精制等。

对于该复合体中的阳离子化壳聚糖与硫酸化糖胺聚糖的构成比也没有限定，例如可示例出1：0.001～1：1000(摩尔比)左右。

以此方式制造的本发明复合体可以被用作下面说明的本发明覆盖材料、本发明药物的原材料。

[3]本发明覆盖材料

本发明覆盖材料为含有本发明复合体的创伤覆盖材料。构成本发明覆盖材料中所含的本发明复合体的分子(阳离子化壳聚糖、硫酸化糖胺聚糖)、复合体中的阳离子化壳聚糖分子与硫酸化糖胺聚糖分子之间优选的结合方式等如上述“本发明复合体”中的说明所述。可以通过将该本发明复合体直接制成本发明覆盖材料，或者根据需要适宜配合不损害本发明的效果的其它成分例如药物上可接受的载体等而制成本发明覆盖材料。

关于本发明覆盖材料的形态，只要能够覆盖创伤部位则没有限定，可以根据所期望的形态利用已知的方法来制造。例如，在以溶液、悬浊液、凝胶的形态提供本发明复合体时，可以直接制成溶液、悬浊液、凝胶形态的本发明覆盖材料。另外，例如也可通过利用冷冻干燥等方法对以溶液、悬浊液、凝胶形态提供的本发明复合体进行干燥而得到的干燥物的形态制成本发明覆盖材料。也可将本发明复合体与常规的创伤覆盖材料组合而制成本发明覆盖材料。加工·成形等也可采用已知的方法。

作为本发明覆盖材料的形状，其它可举出粉末状、颗粒状、片状、海绵状、网状等。另外也可示例出软膏、糊状、凝胶等形状。

用以此方式制造的本发明覆盖材料覆盖创伤部位时，由于维持了硫酸化糖胺聚糖的创伤愈合活性并且抑制了硫酸化糖胺聚糖的出血活性，所以能够抑制创伤部位的出血且促进了创伤愈合。

[4]本发明药物

本发明药物是将本发明复合体作为有效成分的生物体组织治疗用药物。构成作为本发明药物的有效成分的本发明复合体的分子(阳离子化壳聚糖、硫酸化糖胺聚糖)、复合体中的阳离子化壳聚糖分子与硫酸化糖胺聚糖分子之间优选的结合方式等如上述“本发明复合体”中的说明所述。可以通过将该本发明复合体直接制成本发明药物，或者根据需要适宜配合不损害本发明的效果的其它成分而制成本发明药物。

关于本发明药物的施用对象，只要是生物体组织需要治疗的动物则没有特别限定，优选为哺乳类，其中优选为人。

关于本发明药物所施用的生物体组织，只要是需要治疗、组织修复等的生物体组织则没有特别限定，例如可示例出皮肤、脏器、骨等。其中优选施用于生物体组织中存在大量血管且出血风险高的皮肤、脏器，优选施用于皮肤。另外，对于生物体组织中需要进行治疗、组织修复等的状态也没有特别限定，可举出创伤、溃疡等。其中优选应用于创伤。即，本发明药物优选为创伤治疗剂，更优选为皮肤的创伤治疗剂。

在应用于创伤时，对于受伤的原因也没有特别限定，可用于急性创伤、慢性创伤的治疗。作为创伤的种类，可示例出刀伤、裂伤、割伤、擦伤、粉碎伤、挫创、挫伤、枪伤、爆破伤、刺伤、穿刺伤、咬伤、烫伤、冻伤、化学烧伤、手术创伤、褥疮、溃疡、自发产生的创伤等。

关于本发明药物的使用方法，只要是本发明药物在需要进行生物体组织中的治疗、组织修复等的部位发挥治疗效果的方式则没有特别限定。例如可示例出直接施用于该部位(例如，创伤时为创伤部位)的方法。作为这样的应用方法，例如可示例出用本发明药物覆盖该部位的方法。作为覆盖时的方法，例如可示例出粘贴、涂布、喷洒等方法。

关于本发明药物的剂型，本领域技术人员也可根据本发明药物的使用方法从已知的各种剂型中进行适宜选择。例如，既可与上述本发明覆盖材料相同地，本发明药物的有效成分即本发明复合体制成为溶液、悬浊液的形态用作本发明药物；也可以通过用冷冻干燥等方法使其干燥而得到的干燥物的形态进行适宜成形用作本发明药物。也可将上述本发明覆盖材料直接转用作本发明药物。

本发明药物既可仅施用于生物体组织1次，也可根据需要在施用后进行追加、更换、去除等。另外也可连续应用。

实施例1

以下，通过实施例具体说明本发明。但本发明的技术范围并不限定于这些。

＜实施例1＞阳离子化壳聚糖的制造

(1)壳聚糖

壳聚糖使用了市售的壳聚糖(和光纯药工业株式会社制，CT300，片状，将0.5％乙酸水溶液作为溶剂制成浓度为0.5w/v％时的表观粘度为257mPa·s)。

(2)细颗粒化壳聚糖的制造

作为制造阳离子化壳聚糖的原料，根据日本特开平9-143203号公报所述的方法制造了细颗粒化壳聚糖。具体而言，在上述10.0g壳聚糖中添加600mL离子交换水，接着添加了10mL乙酸。在室温下搅拌使其溶解后，用玻璃滤器过滤该溶液。对滤液添加20.0g硫酸铵并进行搅拌、混合，从而使壳聚糖的细颗粒析出。

为了在析出结束时中和乙酸，添加5MNaOH直至使pH成为8～9左右。其后，用玻璃滤器分离从溶剂中析出的细颗粒化壳聚糖。通过对分离的细颗粒化壳聚糖用含水乙醇进行清洗，从而去除了其中所含的盐类。重复数次该清洗后，用丙酮清洗而去除了附着于细颗粒化壳聚糖的水分。其后，通过在40℃、减压下进行干燥，从而得到9.8g细颗粒化壳聚糖(粉末状)。

(3)阳离子化壳聚糖的制造

根据上述专利文献3所述的方法制造了阳离子化壳聚糖。具体而言，在上述(2)中得到的9.0g细颗粒化壳聚糖中添加150mL80v/v％异丙醇，在60℃下进行搅拌。其后，添加9.0mL失水甘油基三甲基氯化铵(阪本药品工业株式会社制：SY-GTA80)，在60℃下搅拌7小时使其反应。反应结束后，用玻璃滤器从反应溶剂中分离出了反应产物。用20倍量的乙醇、丙酮清洗分离的反应产物。其后，通过在40℃、减压下对反应产物进行干燥，从而得到14.2g阳离子化壳聚糖(作为壳聚糖季铵盐的N-(2-羟丙基)-3-三甲基壳聚糖氯化铵)。

＜实施例2＞由阳离子化壳聚糖与硫酸化糖胺聚糖形成的复合体的制造

(1)由阳离子化壳聚糖与肝素形成的复合体的制造

制造了由阳离子化壳聚糖与作为硫酸化糖胺聚糖的一种的肝素(和光纯药工业株式会社制，重均分子量约为10000)形成的复合体(Hep/CT⁺)。具体而言，将实施例1(3)中制造的220mg阳离子化壳聚糖和150mg肝素同时溶解于8mL5.0w/v％氯化钠溶液中，充分混合直至使两成分均匀化。将该混合液流入至用特氟隆(注册商标)表面加工过的模具中，进行静置直至混合液充分地平滑化。接着，按各模具将该混合液投入至大量的离子交换水中，由混合液与离子交换水的接触面进行脱盐透析(20小时左右)，从而使其形成阳离子化壳聚糖与肝素的复合体(阳离子化壳聚糖分子与肝素分子离子结合而成的聚离子复合物)，成形而得到凝胶。该凝胶均为白色状。进而对该凝胶进行冷冻干燥，从而得到海绵状的干燥物。该干燥物均为白色。所得到的干燥物的重量约为270mg。

(2)由阳离子化壳聚糖与其它硫酸化糖胺聚糖形成的复合体的制造

代替上述(1)中的肝素，使用其它的硫酸化糖胺聚糖(硫酸软骨素A、硫酸软骨素B(硫酸皮肤素)、硫酸软骨素C、硫酸软骨素D、硫酸软骨素E、多硫酸角质素。均为生化学工业株式会社制，重均分子量分别为约10000；约30000；约40000；约30000；约70000；约10000)，与上述(1)相同地制造由阳离子化壳聚糖与硫酸化糖胺聚糖形成的复合体(两分子进行离子结合而成的聚离子复合物)，得到了海绵状的干燥物。关于所得到的干燥物的重量，与硫酸软骨素A的复合体(CS-A/CT⁺)、与硫酸软骨素B的复合体(CS-B/CT⁺)、与硫酸软骨素C的复合体(CS-C/CT⁺)、与硫酸软骨素E的复合体(CS-E/CT⁺)以及与多硫酸角质素的复合体(KPS/CT⁺)均为约310mg，与硫酸软骨素D的复合体(CS-D/CT⁺)约为300mg。

＜实施例3＞创伤覆盖材料、生物体组织治疗用药物的制造

将实施例2中制造的由阳离子化壳聚糖与硫酸化糖胺聚糖形成的复合体的干燥物切成约1cm²，用于后述的实施例4。

＜参考例1＞对照物质的制造

(1)海绵状的壳聚糖的制备

根据上述专利文献1所述的方法，如下所述得到了海绵状的壳聚糖。

将壳聚糖添加至2.0v/v％乙酸水溶液中，充分搅拌而制备了2w/v％的壳聚糖溶液。

将10.00g上述壳聚糖溶液(含有200mg壳聚糖)流延在聚丙烯制培养皿(直径：85mm)中，进行静置直至壳聚糖溶液充分平滑化。接着，对壳聚糖溶液进行冷冻后，向冷冻状态的壳聚糖溶液中添加2MNaOH(10mL)，在室温下静置约3小时。确认溶液成为白色凝胶状之后，将该凝胶从培养皿的底面剥离，将凝胶整体浸渍于2MNaOH溶液中，在室温下静置4天。接着，用离子交换水清洗该白色的凝胶的表面后，将凝胶浸渍于大量的离子交换水中，用磁力搅拌器(600rpm)搅拌离子交换水，去除了剩余的NaOH。重复数次该操作直至离子交换水的pH稳定在中性附近(最终pH6.5)。其后，冷冻干燥该白色的凝胶，得到了海绵状的壳聚糖。其重量为180mg。

(2)由壳聚糖与硫酸化糖胺聚糖形成的复合体的制造

将1067mg肝素溶解于220ml0.2M磷酸盐缓冲液(pH6.4)中，制备了肝素溶液(pH6.6)。

将20ml该肝素溶液(含有97mgHep)与上述海绵状的壳聚糖混合，在室温下静置约24小时。其后，取出该混合物并用离子交换水清洗后，将凝胶浸渍于大量的离子交换水中，用磁力搅拌器(600rpm)搅拌离子交换水，去除了剩余的肝素和磷酸无机盐类。重复进行该操作直至离子交换水的导电率充分降低且稳定为止。其最终的导电率为100μS/cm。对清洗后的混合物进行冷冻干燥，得到了由壳聚糖与肝素形成的复合体(Hep/CT)的海绵状的干燥物。其重量约为250mg。

另外，代替肝素使用硫酸软骨素E，相同地得到了由壳聚糖与硫酸软骨素E形成的复合体(CS-E/CT)的海绵状的干燥物。其重量约为240mg。

分别将这些干燥物切割成约1cm²，用于后述的实施例4。

＜实施例4＞药效药理试验

(1)全层皮肤切除创面模型的制作

对7～10周龄的雄性Wistar(Crlj：WI)大鼠或Sprague‐Dawley(SD)大鼠的背部进行脱毛，用切刀切开约1cm²的范围，切除全层皮肤(表皮层、真皮层、皮下组织)而制成全层切除创面。该全层切除创面模型通常作为评价组织修复的模型而被广泛使用。在该全层切除创面部分(以下称为“患部”。)粘贴被检测物质，用薄膜敷料(Tegaderm)和伸缩性绷带进行了固定。

另外，将未粘贴被检测物质而仅用薄膜敷料和伸缩性绷带处理过的作为对照(Control)。

(2)出血的评价

在患部粘贴被检测物质后的第二天，对患部进行拍摄并进行肉眼观察，发现从创部有溢出程度的出血的为“++”、发现有洇出程度的出血的为“+”、未发现出血的为“-”，对各被检测物质所致的出血性进行了评价。

作为被检测物质，将使用了参考例1中制造的Hep/CT、CS-E/CT和实施例3中制造的Hep/CT⁺、CS-E/CT⁺的结果示于图1(照片)和图2。

其结果，粘贴了Hep/CT(相当于上述专利文献1所述的物质)的情况，在12处中的12处出血为“++”，在粘贴被检测物质后的第二天所有的动物死亡。

与此相反，粘贴了Hep/CT⁺的情况，没有显著的出血(++)，“+”为3处，“-”为9处，也未发现死亡例。

另外，对于使用了作为其它的硫酸化糖胺聚糖的硫酸软骨素E的情况而言，在粘贴了CS-E/CT的患部中，12处中“++”为0处，“+”为6处，“-”为6处，在约半数的患部发现了出血，但在粘贴了CS-E/CT⁺的患部的8处中，8处为“-”，明显地抑制了出血。

基于上述结果，显示出通过使用阳离子化壳聚糖，能够显著地抑制起因于硫酸化糖胺聚糖的出血活性。另外，由阳离子化壳聚糖与硫酸化糖胺聚糖形成的复合体、含有该复合体的创伤覆盖材料及以该复合体作为有效成分的生物体组织治疗用药物也显示出出血抑制效果。另外，由于使用这些阳离子化壳聚糖、复合体、创伤覆盖材料、生物体治疗用药物也不再观察到有死亡例，所以也可以确认它能够安全地用于生物体组织。

(3)生物体组织修复促进效果的评价

在将被检测物质粘贴至患部后的第7天对表皮伸展的程度(表皮面积)进行了计测。表皮伸展通常用于评价全层皮肤切除创面，是反映组织修复程度的评价指标。表皮面积通过如下方式计测：将由所制作的全层切除创面的边缘面向中央部伸展的表皮的部分复写(trace)在透明片上，用图像分析软件对面积进行数值化。

首先，使用试验例中制造的Hep/CT、CS-E/CT以及实施例3中制造的Hep/CT⁺、CS-E/CT⁺进行了评价。结果示于图3。

关于进行Hep/CT(相当于上述专利文献1所述的物质)给药后的动物，如上述(2)所述那样，在给予被检测物质的第二天全部死亡，所以无法进行表皮面积的测定。

Control中的表皮面积为20±9.4(SD)mm²，而Hep/CT⁺为39.3±8.6(SD)mm²、CS-E/CT⁺为34.9±6.2(SD)mm²，两者均发现表皮面积的显著增加。另外，虽然CS-E/CT如上所述那样观察到出血，但在组织修复这点上发现表皮面积的显著增加、为30.9±10.1(SD)mm²。

基于上述结果，显示出即使使用阳离子化壳聚糖，也不会对硫酸化糖胺聚糖所具有的生物体组织的修复(创伤愈合)促进效果产生任何损害。由此可见，由阳离子化壳聚糖与硫酸化糖胺聚糖形成的复合体、含有该复合体的创伤覆盖材料及以该复合体作为有效成分的生物体组织治疗用药物显示出抑制出血且发挥了优异的生物体组织修复(创伤愈合)促进效果。

另外，对于实施例3中制造的由阳离子化壳聚糖与硫酸化糖胺聚糖形成的各种复合体(Hep/CT⁺、CS-A/CT⁺、CS-B/CT⁺、CS-C/CT⁺、CS-D/CT⁺、CS-E/CT⁺、KPS/CT⁺)而言，也相同地进行了生物体组织修复效果的评价。计算出表皮面积相对于全层切除创面整体面积的比率(％)，得到了表皮面积率。结果示于图4。

关于表皮面积率，相对于对照(Control)为20.0±5.3(SD)％，Hep/CT⁺为51.5±14.3(SD)％、CS-A/CT⁺为49.4±7.3(SD)％、CS-B/CT⁺为57.1±10.8(SD)％、CS-C/CT⁺为29.2±7.7(SD)％、CS-D/CT⁺为38.1±11.6(SD)％、CS-E/CT⁺为47.6±11.4(SD)％、KPS/CT⁺为48.8±7.0(SD)％，均确认到表皮面积率的显著增加。

在这些试验中未发现患部的出血、死亡例。

基于上述结果也显示出：即使使用阳离子化壳聚糖也不会对硫酸化糖胺聚糖所具有的生物体组织的修复(创伤愈合)促进效果产生任何损害。另外，由阳离子化壳聚糖与硫酸化糖胺聚糖形成的复合体、含有该复合体的创伤覆盖材料及以该复合体作为有效成分的生物体组织治疗用药物也显示出抑制出血且发挥了优异的生物体组织修复(创伤愈合)促进效果。

＜参考例2＞阳离子化壳聚糖海绵的制造

(1)阳离子化壳聚糖的制造

根据上述专利文献3所述的方法制造了阳离子化壳聚糖。具体而言，向与实施例1相同的方法所制造的7.5g细颗粒化壳聚糖中添加105mL80v/v％异丙醇，在60℃下进行搅拌。其后，添加10.5mL失水甘油基三甲基氯化铵(Sigma-Aldrich社制)，在60℃下搅拌7小时使其反应。反应结束后，用玻璃滤器从反应溶剂中分离反应产物。用20倍量的乙醇、丙酮对分离的反应产物进行清洗。其后，通过使反应产物在40℃、减压下进行干燥，从而得到了12.5g阳离子化壳聚糖(作为壳聚糖季铵盐的N-(2-羟丙基)-3-三甲基壳聚糖氯化铵)。

(2)阳离子化壳聚糖海绵的制造

通过将上述(1)中制造的250mg阳离子化壳聚糖均匀地溶解于8mL注射用水中，对所得到的溶液进行冷冻干燥，从而得到了海绵状的干燥物。该干燥物为白色，重量约为240mg。适宜切割该干燥物并用于后述的参考例3。

＜参考例3＞药效药理试验

(1)烫伤创面模型的制作

对10周龄的雄性Sprague‐Dawley(SD)大鼠的腹部进行脱毛，对约7cm²的范围用100℃的热水处理3秒钟。在烫伤处理的3天后，去除处理部的坏死组织并制作了皮肤切除创面。该烫伤创面模型通常作为评价组织修复的模型而被广泛使用。在该烫伤创面部分粘贴被检测物质，用薄膜敷料(Tegaderm)和伸缩性绷带进行了固定。另外，未粘贴被检测物质而仅用薄膜敷料和伸缩性绷带处理的用作对照(Control)。

在粘贴被检测物质后的第10天对表皮伸展的程度(表皮面积、表皮面积率)进行了计测。表皮伸展通常用于评价全层皮肤切除创面，是反映组织修复程度的评价指标。表皮面积通过如下方式测量：将由所制作的切除创面的边缘面向中央部伸展的表皮的面积复写在透明片上，用图像分析软件对面积进行数值化。表皮面积率是利用表皮所覆盖的部分的面积相对于创面整体的面积的比率(％)计算出的。

(2)烫伤创面的生物体组织修复效果的评价

相对于对照(Control)，对CT⁺是否显示出创伤愈合效果进行了评价。

关于表皮面积率，相对于Control为17.9±3.2(SD)％，仅阳离子化壳聚糖(CT⁺)时为2.0±1.3(SD)％，可见显著的降低(图5)。

基于上述结果，显示出仅CT⁺时没有发挥创伤愈合效果，反而会导致愈合延迟。由于硫酸化糖胺聚糖有出血风险所以不适用于创伤愈合，由于CT⁺延迟创伤愈合所以不适用于创伤愈合。本发明中，显示出通过组合这两者而抑制了出血风险，进而发挥了创伤愈合的促进效果。

产业上的可利用性

本发明可应用于药物等。

参照日本专利申请2013-168324号(申请日：2013年8月13日)的公开内容并将其全部内容引入本说明书。

关于本说明书所记载的所有文献、专利申请和技术标准，用于参照将各个文献、专利申请和技术标准与具体且逐个记载时同等程度地引入本说明书。

Claims

1.一种抑制剂，其为以阳离子化壳聚糖作为有效成分的、抑制来自硫酸化糖胺聚糖的出血活性的抑制剂。

2.根据权利要求1所述的抑制剂，其中，阳离子化壳聚糖具有季铵基。

3.根据权利要求1或2所述的抑制剂，其中，硫酸化糖胺聚糖为肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸角质素、硫酸软骨素或硫酸化透明质酸。

4.一种复合体，其为由阳离子化壳聚糖与硫酸化糖胺聚糖形成的复合体。

5.根据权利要求4所述的复合体，其中，阳离子化壳聚糖与硫酸化糖胺聚糖进行离子结合。

6.根据权利要求4或5所述的复合体，其中，阳离子化壳聚糖具有季铵基。

7.根据权利要求4～6中任一项所述的复合体，其中，硫酸化糖胺聚糖为肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸角质素、硫酸软骨素或硫酸化透明质酸。

8.一种创伤覆盖材料，其含有权利要求4～7中任一项所述的复合体。

9.一种生物体组织治疗用药物，其以权利要求4～7中任一项所述的复合体作为有效成分。

10.根据权利要求9所述的药物，其为创伤治疗剂。